CN101575361B

CN101575361B - 新型特异性多肽及其在制备诊断和防治冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征药物中的应用

Info

Publication number: CN101575361B
Application number: CN 200910047892
Authority: CN
Inventors: 赵树民; 威廉·坎贝尔; 贾伟国; 黄冬
Original assignee: Individual
Current assignee: Dalian Hongyi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2029-03-20
Also published as: CN101575361A

Abstract

本发明公开了一种新型特异性多肽，包括114种新型特异性多肽，具有长度约8至20个氨基酸、可建SARS病毒多肽序列的模型、能与SARS病毒刺激产生的人体血清中抗体起反应等特征。所述新型特异性多肽可用于制备诊断、治疗和预防冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征疾病药物。

Description

新型特异性多肽及其在制备诊断和防治冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物多肽，具体涉及新型特异性多肽，以及该多肽在制备诊断、治疗和预防冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征(SARS)疾病药物中的应用。

背景技术

冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征(SARS)是一种对病人生命和社会经济上具有很强破坏性的严重传染疾病。美国疾病控制中心提供了关于SARS病毒诊断(http://www.cdc.gov/ncidod/sars/diagnosis.htm)和冠状病毒抗体检(http://www.cdc.gov/ncidod/sars/lab/eia/index.htm)的信息。多肽是多种氨基酸通过共价键连接成的链状分子组合物。可以使用计算机软件设计一组氨基酸序列，并通过多肽合成仪合成一系列多肽。多肽氨基酸序列可直接原位合成在一片经过特别处理的纤维素薄膜上，从而能通过蛋白-蛋白相互结合位点快速检测生物活性多肽。例如在一片6×9cm薄膜上，可合成超过1500个不同序列的多肽。根据特殊需要，这些多肽链长度可以达到15个氨基酸片段。目前市场上有多种关于DNA、蛋白阵列及多肽微点阵芯片，如Petscan，Ink-jet多肽阵列芯片，Xeotron的多肽微点阵芯片技术(http://198.65.244.205/data/images/LinkableContent/6.％2007-19-02，％20PR％20NatureBiotechPaper-Final.pdf)等等，这些已被报道的或其中的大部分都可在“Protein and Peptide Array(《蛋白和肽阵列》)”杂志中找到(http://www.healthtech.com/2002/pce/)。

对抗SARS最有效的方法是保护人们不被病毒感染，一般可以通过接种有效的疫苗来实现，疫苗被接种入人体后，可刺激人体免疫系统产生特异性抗体而获得对病毒的免疫。目前制造疫苗的方法主要有如下几种：

a)使用滤过性病毒的核苷酸作疫苗，

b)使用活性衰减或灭活的病毒作疫苗，

c)使用病毒蛋白质来制造疫苗。

通常，疫苗应对特定病毒有高度特异性、有很强的免疫刺激性、没有毒性或副作用。疫苗的种类大致有核苷酸疫苗、弱活或失活病毒疫苗和基于病毒蛋白的疫苗。对于核苷酸疫苗来讲，它的免疫刺激性不够强，特异性不太好。而弱活或失活病毒疫苗，虽然可以刺激机体产生抗体，但许多病毒携带有毒性蛋白，这些蛋白会带来安全性问题。基于病毒蛋白的疫苗是比较有效和安全的，但要在多种病毒蛋白中，鉴别一种病毒蛋白却是很困难的，因为病毒蛋白均具有强烈的免疫刺激性和对机体的非毒性作用。另一方面，几乎所有筛选疫苗的方法都是在基于前期试验的基础上，进行随机试验的，该方法不仅浪费大量时间并且起效的很少。因此，对于识别SARS抗体、开发抗SARS疫苗、诊断SARS疾病更快速更有效的新方法有着迫切的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究开发防治SARS的药物。

本发明提供了新型特异性多肽。所述多肽包括114种新型特异性多肽，具有下列特征：

1)长度8至20个氨基酸；

2)可建SARS病毒多肽序列的模型；并且

3)能与SARS病毒刺激产生的人体血清中抗体起反应。

本发明新型特异性多肽的氨基酸序列如下：

(1)Gly Tyr Pro Leu Asp Cys Ile Lys Asp Phe；(2)Glu Lys Lys Lys Thr Glu Gly Phe Met Gly；(3)Asp GluVal Ser Trp Gln Thr Cys Asp Phe；(4)Leu Arg Lys Gly Gly Arg Thr Arg Cys Phe；(5)Asp Asn Ile Lys AspCys Val Lys Cys Phe；(6)Glu Val Val Leu Lys Asn Gly Glu Leu Glu；(7)Glu Thr Lys Phe Leu Thr Asn LysLeu Leu；(8)Glu Gly Ile Val Asp Tyr Gly Val Arg Phe Phe Phe；(9)Val Thr His Gly Phe Asn Leu Glu GluAla；(10)Val Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Arg Asp Trp；(11)Glu Gly Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Ser；(12)AlaAsn Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Gln Cys；(13)Glu Tyr Lys Gly Pro Val Thr Asp Val Phe；(14)Tyr Lys Lys AspAsn Ala Tyr Tyr Thr Glu；(15)Pro Ala Ser Arg Glu Leu Ser Val Thr Phe；(16)Gly Ile Ala Ala Ile Asn SerVal Pro Trp；(17)Ala Ala Phe Gly Val Leu Leu Ser Asn Phe；(18)Val Leu Leu Ser Ash Phe Gly Ala Pro TyrSer Tyr；(19)Asn Ser Ser Asn Val Thr Thr Met Asp Phe；(20)Pro Ala Leu Glu Thr Ile Gln Val Thr Ile SerSer；(21)Tyr Lys Leu Asp Leu Thr Ile Leu Gly Leu Ala Ala Glu Trp；(22)Gly Leu Ser Ala Ile Met Gln ValPhe Phe；(23)Phe Ile Ser Asn Ser Trp Leu Met Trp Phe；(24)Thr Tyr Glu Arg His Pro Leu Ser His Phe；(25)Asp Glu Ser Ala Ser Lys Ser Ala Ser Val；(26)Arg Asp Ile Ile Ser Thr Asp Asp Cys Phe；(27)Thr ValLeu Arg Ala Ile Asn Gly Asp Phe；(28)Val Ser Phe Leu Ala His Leu Gln Trp Phe；(29)Trp Phe Ala Met PheSer Pro Ile Val Pro Phe Trp；(30)Phe Cys Ile Ser Leu Lys His Cys His Trp Phe Phe；(31)Cys His Leu AlaLys Ala Leu Asn Asp Phe；(32)Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp；(33)Asn Arg Phe Thr Thr Thr LeuAsn Asp Phe；(34)Leu Gln Cys Ile Met Leu Val Tyr Cys Phe；(35)Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr His Gly IleAla Ala Ile Asn；(36)Lys Ile Phe Val Asp Gly Val Pro Phe Val Val Ser；(37)Asn Pro Thr Asp Gln Ser SerTyr Ile Val Asp Ser Val Ala；(38)Gly Thr Glu Asn Leu Val Ile Glu Gly Pro Thr Thr；(39)Gln Val Cys Val Gln Thr Val Arg Thr Gln Val Tyr Ile Ala；(40)Tyr Tyr Pro Ser Ala Arg Ile Val Tyr Thr Ala Cys；(41)Ala Asp ValLeu Tyr Gln Pro Pro Gln Thr Ser Ile；(42)Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val；(43)Val LeuAsp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu；(44)Glu Gln Leu Gln Leu Leu Met Pro Leu Lys Ala Pro；(45)AlaIle Thr Thr Ser Asn Cys Ala Lys Arg Leu Ala；(46)Lys Thr Ile Lys Val Phe Thr Thr Val Asp Asn Thr；(47)Leu Pro PheThr Leu Gly Ile Met Ala Ile Ala Ala；(48)Val Phe Thr Leu Leu Phe Gln Leu Cys Thr Phe Thr；(49)Ser Ile Lys Trp Ala Asp Asn Asn Cys Tyr Leu Ser；(50)Asp Leu Met Ala Ala Tyr Val Glu Asn Thr SerIle；(51)Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp；(52)Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe；(53)Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly；(54)Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe；(55)ValVal Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe；(56)Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe；(57)Gln Gln Phe GlyArg Asp Val Ser Asp Phe；(58)Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe；(59)Val Tyr Asp Pro Leu Gln ProGlu Leu Asp；(60)Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile；(61)Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu；(62)Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu；(63)Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu ThrPro；(64)Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp；(65)Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu LeuLys Cys Ser Val；(66)Arg His Phe Asp Glu Gly Asn Cys Asp Thr；(67)Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp TyrAsp Phe；(68)Ile Lys Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Asp Phe；(69)Val Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val Ala Phe；(70)Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe；(71)Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys Asp Phe；(72)GlySer Ser Val Glu Leu Lys His Phe Phe；(73)Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys His Phe；(74)Pro Ser Arg IleLeu Gly Ala Gly Cys Phe；(75)Thr Tyr Lys Leu Asn Val Gly Asp Tyr Phe；(76)Gly Pro Pro Gly Thr Gly LysSer His Phe；(77)Ile Pro Ala Arg Ala Arg Val Glu Cys Phe；(78)Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Arg Glu Phe；(79)Ala ValHis Glu Cys Phe Val Lys Arg Phe；(80)Val Lys Arg Val Asp Trp Ser Val Glu Tyr；(81)Val AsnVal Lys Gly His Phe Asp Gly His；(82)Tyr Phe Lys Lys Val Asp Gly Ile Ile Gln Gln Leu Pro Glu Thr Tyr；(83)Arg Asp Leu Glu Asp Lys Phe Pro Arg Ser；(84)Gln Met Glu Thr Asp Phe Leu Glu Leu Ala；(85)Lys LeuGlu Asp Phe Ile Pro Met Asp Ser；(86)Ile Gln Gln Leu Pro Glu Thr Tyr Phe Thr Gln Ser；(87)Tyr Ser AspVal Glu Thr Pro His Leu Met Gly Trp；(88)Ser Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Leu Val Tyr Ala Ala Asp；(89)Leu His Cys Ala Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr；(90)Ser Thr Leu Glu Gln Tyr Val Phe Cys Thr Val Asn；(91)Glu Thr Leu Lys Ala Thr Glu Glu Thr Phe Lys Leu；(92)Arg Arg Cys Pro Ala Glu Ile Val Asp Thr ValSer；(93)Asn Cys Cys Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys Asp；(94)Ala Ser Lys Ile Leu Gly Leu Pro Thr GlnThr Val；(95)Cys Asp Trp Thr Asn Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Ala Asn Thr Cys Thr；(96)Ala Pro Ala His ValSer Thr Ile Gly Val Cys Thr Met Thr；(97)Arg Val Asp Trp Ser Val Glu Tyr Pro Ile Ile Gly；(98)Leu GluAsp Phe Lys Pro Arg Ser Gln Met Glu Thr；(99)Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu；(100)Leu Ile Gly Ala Asn Tyr Leu Gly Lys Pro Lys Glu；(101)Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr；(102)Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser；(103)Asp Asn Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile AspAla；(104)Gln Leu Pro Gln GlyThr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala；(105)Tle Arg Gln Gly Thr Asp TyrLys His Trp；(106)Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe；(107)Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr LeuLeu Pro Ala Ala Asp Met Asp Asp Phe；(108)Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn；(109)Leu Val IleGly Phe Leu PheLeu Ala Trp；(110)Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser；(111)Ala Ser PheArg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met；(112)Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Ile；(113)Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser；(114)Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly。

本发明人通过SARS全基因组编码的蛋白质序列，应用自动化设备(AutoSpot，Intavis，Model：ASP222，Germany)和其自带软件系统(DIGEN，Jerini Biotools GmbH，Beilin，Germany)，按氨基酸序列漂移原则(Amino Acid Frameshift，即下一个多肽的起始点为前一个多肽起始点的下游1～2位氨基酸，在本实验中，相邻两个氨基酸序列相差2位氨基酸)，以24×18的密度直接在纤维素膜上原位合成多肽氨基酸序列。由于相邻的多肽序列有80％以上的相似性，因此成为重叠多肽阵列(Overlapping Peptide Array)技术。这些编码完全是依据于已公布的SARS病毒蛋白序列(图1)，该序列是世界上首个包含完整SARS病毒蛋白多肽片段的蛋白序列。SARS多肽阵列中有4942个多肽链，这些多肽链包含了全部的SARS病毒蛋白表达(表1)，每一个多肽链含10-18个氨基酸残基，多肽链的N-端和其先前多肽链的C-端通过一个8-残基序列实现重叠(每个通过两个氨基酸移位，见图2)。

表1SARS多肽阵列中包含的重叠多肽片段概况

膜上序列	ORF’sNtoC SARS	氨基酸个数	多肽合成位点数
				1	ORF1a	4382	2187
2	X₁	274	133
				3	X₂	154	73
4	S	1255	624
				5	X₃	63	28
6	X₄	122	57
				7	ORF₉	44	18
8	ORF₁₀	39	16
				9	ORF1b	2695	1344
10	X₅	84	38
				11	N	422	207
12	E	76	34
				13	M	221	107
14	ORF₁₃	70	31
				15	ORF₁₄	70	31

					总计	9999	4942

[0018] 表2114种新型特异性多肽序列

特异性多肽序号	多肽序列	蛋白名称
			1	GYPLDCIKDF	ORF1a(编码蛋白)
2	EKKKTEGFMG	ORF1a(编码蛋白)
			3	DEVSWQTCDF	ORF1a(编码蛋白)
4	LRKGGRTRCF	ORF1a(编码蛋白)
			5	DNIKDCVKCF	ORF1a(编码蛋白)
6	EVVLKNGELE	ORF1a(编码蛋白)
			7	ETKFLTNKLL	ORF1a(编码蛋白)
8	EGIVDYGVRFFF	ORF1a(编码蛋白)
			9	VTHGFNLEEA	ORF1a(编码蛋白)
10	VSLAGSYRDW	ORF1a(编码蛋白)
			11	EGKTFFVLPS	ORF1a(编码蛋白)
12	ANEYTGNYQC	ORF1a(编码蛋白)
			13	EYKGPVTDVF	ORF1a(编码蛋白)
14	YKKDNAYYTE	ORF1a(编码蛋白)
			15	PASRELSVTF	ORF1a(编码蛋白)
16	GIAAINSVPW	ORF1a(编码蛋白)
			17	AAFGVLLSNF	ORF1a(编码蛋白)
18	VLLSNFGAPYSY	ORF1a(编码蛋白)
			19	NSSNVTTMDF	ORF1a(编码蛋白)
20	PALETIQVTISS	ORF1a(编码蛋白)
			21	YKLDLTILGLAAEW	ORF1a(编码蛋白)
22	GLSAIMQVFF	ORF1a(编码蛋白)
			23	FISNSWLMWF	ORF1a(编码蛋白)
24	TYERHPLSHF	ORF1a(编码蛋白)
			25	DESASKSASV	ORF1a(编码蛋白)
26	RDIISTDDCF	ORF1a(编码蛋白)
			27	TVLRAINGDF	ORF1a(编码蛋白)
28	VSFLAHLQWF	ORF1a(编码蛋白)
			29	WFAMFSPIVPFW	ORF1a(编码蛋白)
30	FCISLKHCHWFF	ORF1a(编码蛋白)
			31	CHLAKALNDF	ORF1a(编码蛋白)
32	YAAVINGDRW	ORF1a(编码蛋白)
			33	NRFTTTLNDF	ORF1a(编码蛋白)
34	LQCIMLVYCF	ORF1a(编码蛋白)
			35	GLKTIATHGIAAIN	ORF1a(编码蛋白)
36	KIFVDGVPFVVS	ORF1a(编码蛋白)
			37	NPTDQSSYIVDSVA	ORF1a(编码蛋白)
38	GTENLVIEGPTT	ORF1a(编码蛋白)
			39	QVCVQTVRTQVYIA	ORF1a(编码蛋白)
40	YYPSARIVYTAC	ORF1a(编码蛋白)
			41	ADVLYQPPQTSI	ORF1a(编码蛋白)
42	SKMSDVKCTSVV	ORF1a(编码蛋白)
			43	VLDMCAALKELL	ORF1a(编码蛋白)
44	EQLQLLMPLKAP	ORF1a(编码蛋白)

[0020]

45	AITTSNCAKRLA	ORF1a(编码蛋白)
			46	KTIKVFTTVDNT	ORF1a(编码蛋白)
47	LPFTLGIMAIAA	ORF1a(编码蛋白)
			48	VFTLLFQLCTFT	ORF1a(编码蛋白)
49	SIKWADNNCYLS	ORF1a(编码蛋白)
			50	DLMAAYVENTSI	ORF1a(编码蛋白)
51	NACRIIMRCW	X1蛋白
			52	NPLLYDANYF	X1蛋白
53	TPKLKEDYQIGG	X1蛋白
			54	NFELCDNPFF	S(刺突糖蛋白)
55	VVPSGDVVRF	S(刺突糖蛋白)
			56	DYNYKLPDDF	S(刺突糖蛋白)
57	QQFGRDVSDF	S(刺突糖蛋白)
			58	VLGQSKRVDF	S(刺突糖蛋白)
59	VYDPLQPELD	S(刺突糖蛋白)
			60	VAKNLNESLI	S(刺突糖蛋白)
61	CCKFDEDDSE	S(刺突糖蛋白)
			62	MIFDNAFNCTFE	S(刺突糖蛋白)
63	FNGLTGTGVLTP	S(刺突糖蛋白)
			64	IYQTSNFRVVPSGD	S(刺突糖蛋白)
65	SQNPLAELKCSV	S(刺突糖蛋白)
			66	RHFDEGNCDT	ORF1b(编码蛋白)
67	QDLNGNWYDF	ORF1b(编码蛋白)
			68	IKWDLLKYDF	ORF1b(编码蛋白)
69	VAALTNNVAF	ORF1b(编码蛋白)
			70	AFQTVKPGNF	ORF1b(编码蛋白)
71	VKPGNFNKDF	ORF1b(编码蛋白)
			72	GSSVELKHFF	ORF1b(编码蛋白)
73	EFYAYLRKHF	ORF1b(编码蛋白)
			74	PSRILGAGCF	ORF1b(编码蛋白)
75	TYKLNVGDYF	ORF1b(编码蛋白)
			76	GPPGTGKSHF	ORF1b(编码蛋白)
77	IPARARVECF	ORF1b(编码蛋白)
			78	RPQIGVVREF	ORF1b(编码蛋白)
79	AVHECFVKRF	ORF1b(编码蛋白)
			80	VKRVDWSVEY	ORF1b(编码蛋白)
81	VNVKGHFDGH	ORF1b(编码蛋白)
			82	YFKKVDGIIQQLPETY	ORF1b(编码蛋白)
83	RDLEDKFPRS	ORF1b(编码蛋白)
			84	QMETDFLELA	ORF1b(编码蛋白)
85	KLEDFIPMDS	ORF1b(编码蛋白)
			86	IQQLPETYFTQS	ORF1b(编码蛋白)
87	YSDVETPHLMGW	ORF1b(编码蛋白)
			88	SRLSFKELLVYAAD	ORF1b(编码蛋白)
89	LHCANFNVLFST	ORF1b(编码蛋白)
			90	STLEQYVFCTVN	ORF1b(编码蛋白)
91	ETLKATEETFKL	ORF1b(编码蛋白)

[0021]

92	RRCPAEIVDTVS	ORF1b(编码蛋白)
			93	NCCDDDYFNKKD	ORF1b(编码蛋白)
94	ASKILGLPTQTV	ORF1b(编码蛋白)
			95	CDWTNAGDYILANTCT	ORF1b(编码蛋白)
96	APAHVSTIGVCTMT	ORF1b(编码蛋白)
			97	RVDWSVEYPIIG	ORF1b(编码蛋白)
98	LEDFKPRSQMET	ORF1b(编码蛋白)
			99	YDFAVSKGFFKE	ORF1b(编码蛋白)
100	LIGANYLGKPKE	N(核衣壳蛋白)
			101	SRIGMEVTPSGT	N(核衣壳蛋白)
102	VRGGDGKMKELS	N(核衣壳蛋白)
			103	DNVILLNKHIDA	N(核衣壳蛋白)
104	QLPQGTTLPKGFYA	N(核衣壳蛋白)
			105	IRQGTDYKHW	N(核衣壳蛋白)
106	QFAPSASAFF	N(核衣壳蛋白)
			107	QKKQPTVTLLPAADMDDF	N(核衣壳蛋白)
108	TVYVYSRVKN	E蛋白
			109	LVIGFLFLAW	M(膜蛋白)
110	FRLFARTRSMWS	M(膜蛋白)
			111	ASFRLFARTRSM	M(膜蛋白)
112	NWVTGGIAIAMACI	M(膜蛋白)
			113	KEITVATSRTLS	M(膜蛋白)
114	TRPLMESELVIG	M(膜蛋白)

本发明的另一目的是提供了新型特异性多肽在制备诊断、治疗和预防冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征(SARS)疾病药物中的应用。

本发明人在上述4942种多肽中，发现有114种新型特异性多肽能和SARS血清产生强烈反应。这些新型特异性多肽可在后期多种病人血清测试中使用(表2)。这些多肽以10个氨基酸长度的形式存在，并且也有可能包含有10个氨基酸之外的旁侧序列。虽然通过和对照组比较试验，所列出的多肽已经显示了较强的检测信号，但具有两到三个多肽位点重叠的更长的肽则会更好。以上结果是用一名康复患者与一名正常对照患者的初步试验中显示的，全部114个多肽位点在空白血清中均未检测到。

本发明所述SARS重叠多肽阵列的应用，即可用于诊断由冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征(SARS)，可检测由SARS病毒抗原引起的特异性抗体，可开发抗SARS疫苗和药物。

本发明提供了一种用于临床诊断的可行性，可以使用如上经过鉴定的多肽片段和/或其衍生产物用于检测SARS患者生物样本中的抗体。

本发明也提供了一种开发疫苗的可行性方法，可以使用如上经过鉴定的多肽片段和/或其衍生产物(有不同的表位)产生单一或多抗原肽(MAP)疫苗获得免疫以预防冠状病毒引起的SARS疾病。

本发明又提供了一种生产SARS相关冠状病毒抑制剂的可行性方法，可以使用如上经过鉴定的多肽片段和/或其衍生产物来设计和生产能与SARS冠状病毒特异性靶点结合的多肽化合物和/或其它小分子物质。这些多肽或小分子物质可能通过抑制病毒复制，异化和/或病原反应应用于SARS病人的临床治疗。

本发明还提供了一种生产抗SARS病毒抗体方法的可行性，可以使用如上经过鉴定的多肽片段来筛选SARS患者的生物样本，以分离抗SARS病毒特异性抗体，并使用该抗体和其衍生物来治疗SARS患者。

本发明的应用主要有以下方面：

1.诊断试剂。使用该组新型特异性多肽(SARS多肽阵列)，专业技术人员可以通过SARS多肽阵列芯片或传统的ELISA方法与SARS患者的抗血清反应，从而发现与特异性抗体结合的病毒多肽片段。含有这些多肽的试剂盒可用来筛选和诊断被感染的患者。健康人群中，有人可能携带抗其它冠状病毒(非SARS致病源)抗体。由于这些病毒和SARS病毒具有高度的相似性，普通的检测方法可能因这些抗体的存在而被干扰，使得检测结果不准确。而SARS多肽阵列包含了SARS病毒的全部蛋白，该检测试剂盒是通过选择那些具有高度特异性的SARS抗体多肽片段开发出的，可以显著的降低检测结果的假阳性。同时，全部可和抗SARS病毒抗体反应的多肽片段组合到一个检测试剂盒中，以此来鉴别每一个抗SARS的抗体。

2.识别SARS抗体。使用该SARS多肽阵列从SARS感染者中寻找和分离SARS抗体，从而鉴定SARS的中和抗体。通过该方法鉴定的抗体可通过基因工程学方法进行大量生产，以供给患者治疗使用。

3.抗SARS疫苗。使用该SARS多肽阵列开发的疫苗可以更有效的刺激机体产生抗体，且无毒性。通过康复患者血清反应后，能够获得与抗SARS病毒中和抗体反应的病毒氨基酸多肽，这些病毒氨基酸多肽是从痊愈的患者血清中筛出的，其免疫刺激性更强。因为这些多肽只是全部病毒蛋白的一部分，其通常没有和病毒蛋白相似的对机体毒性作用。因此，可以通过本发明开发出安全高效的抗SARS疫苗。而且，这些多肽疫苗可以用于产生多抗原肽(MAP)，这些多抗原肽具有多重免疫刺激作用，可以促进机体产生多种抗SARS抗体，进而产生更有效的抗病毒保护作用。

4.抗SARS药物。SARS多肽阵列可应用于设计多肽抗SARS药物。使用本发明，在这些病毒蛋白中对于传染、复制或致病性具有决定性作用的多肽片段可被鉴别出来。根据目标多肽/蛋白质序列和结构，通过计算机拟合设计出能与目标蛋白质/多肽反应的多肽序列；可依据计算机程序设计的多肽序列进行相关的多肽合成。这些多肽能满足药物设计的需求，且与蛋白靶点具有很强的亲和力。这些多肽能有效隔离靶蛋白，具有抑制SARS病毒的作用。

附图说明

图1SARS病毒多肽链。

图2SARS重叠多肽阵列(SARS Overlapping Peptide Array)

1.ORF1a 4.S蛋白 7.ORF9 10.ORF11 13.M蛋白

2.ORF3 5.ORF7 8.ORF10 11.N蛋白 14.ORF13

3.ORF4 6.ORF8 9.ORF1b 12.E蛋白 15.ORF14

图3SARS重叠多肽阵列生物探针检测结果示意

图4SARS恢复期专属特征性多肽序列

1急性期 2恢复期 3急性期 4恢复期 5死亡病人

图5急性期和恢复期共有的专属特征性序列(急性期)

4728，4729区域对应SARS核衣壳蛋白(N蛋白)的VRGGDGKMKELS序列被IgM识别且质量最高。

70％的急性期病人血清对该区域多肽序列显示较强的阳性反应概率。

图6急性期和恢复期共有的专属特征性序列(恢复期)

40％的恢复期病人对该区域多肽序列显示较强的阳性反应概率，表明该多肽片段是非常特征性的SARS指征。

本发明新型特异性多肽的氨基酸序列表

<110>北京健诺威生物科技有限公司

<120>新型特异性多肽及其在制备诊断、治疗和预防冠状病毒引起的严重急性呼吸

综合征疾病药物中的应用

<130>20090312

<160>114

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>1

Gly Tyr Pro Leu Asp Cys Ile Lys Asp Phe

1 5 10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>2

Glu Lys Lys Lys Thr Glu Gly Phe Met Gly

1 5 10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>3

Asp Glu Val Ser Trp Gln Thr Cys Asp Phe

1 5 10

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>4

Leu Arg Lys Gly Gly Arg Thr Arg Cys Phe

1 5 10

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>5

Asp Asn Ile Lys Asp Cys Val Lys Cys Phe

1 5 10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>6

Glu Val Val Leu Lys Asn Gly Glu Leu Glu

1 5 10

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>7

Glu Thr Lys Phe Leu Thr Asn Lys Leu Leu

1 5 10

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>8

Glu Gly Ile Val Asp Tyr Gly Val Arg Phe Phe Phe

1 5 10

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>9

Val Thr His Gly Phe Asn Leu Glu Glu Ala

1 5 10

<210>10

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>10

Val Ser Leu Ala Gly Ser Tyr Arg Asp Trp

1 5 10

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>11

Glu Gly Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Ser

1 5 10

<210>12

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>12

Ala Asn Glu Tyr Thr Gly Asn Tyr Gln Cys

1 5 10

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>13

Glu Tyr Lys Gly Pro Val Thr Asp Val Phe

1 5 10

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>14

Tyr Lys Lys Asp Asn Ala Tyr Tyr Thr Glu

1 5 10

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>15

Pro Ala Ser Arg Glu Leu Ser Val Thr Phe

1 5 10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>16

Gly Ile Ala Ala Ile Asn Ser Val Pro Trp

1 5 10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>17

Ala Ala Phe Gly Val Leu Leu Ser Asn Phe

1 5 10

<210>18

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>18

Val Leu Leu Ser Asn Phe Gly Ala Pro Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>19

Asn Ser Ser Asn Val Thr Thr Met Asp Phe

1 5 10

<210>20

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>20

Pro Ala Leu Glu Thr Ile Gln Val Thr Ile Ser Ser

1 5 10

<210>21

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>21

Tyr Lys Leu Asp Leu Thr Ile Leu Gly Leu Ala Ala Glu Trp

1 5 10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>22

Gly Leu Ser Ala Ile Met Gln Val Phe Phe

1 5 10

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>23

Phe Ile Ser Asn Ser Trp Leu Met Trp Phe

1 5 10

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>24

Thr Tyr Glu Arg His Pro Leu Ser His Phe

1 5 10

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>25

Asp Glu Ser Ala Ser Lys Ser Ala Ser Val

1 5 10

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>26

Arg Asp Ile Ile Ser Thr Asp Asp Cys Phe

1 5 10

<210>27

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>27

Thr Val Leu Arg Ala Ile Asn Gly Asp Phe

1 5 10

<210>28

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>28

Val Ser Phe Leu Ala His Leu Gln Trp Phe

1 5 10

<210>29

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>29

Trp Phe Ala Met Phe Ser Pro Ile Val Pro Phe Trp

1 5 10

<210>30

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>30

Phe Cys Ile Ser Leu Lys His Cys His Trp Phe Phe

1 5 10

<210>31

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>31

Cys His Leu Ala Lys Ala Leu Asn Asp Phe

1 5 10

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>32

Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp

1 5 10

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>33

Asn Arg Phe Thr Thr Thr Leu Asn Asp Phe

1 5 10

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>34

Leu Gln Cys Ile Met Leu Val Tyr Cys Phe

1 5 10

<210>35

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>35

Gly Leu Lys Thr Ile Ala Thr His Gly Ile Ala Ala Ile Asn

1 5 10

<210>36

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>36

Lys Ile Phe Val Asp Gly Val Pro Phe Val Val Ser

1 5 10

<210>37

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>37

Asn Pro Thr Asp Gln Ser Ser Tyr Ile Val Asp Ser Val Ala

1 5 10

<210>38

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>38

Gly Thr Glu Asn Leu Val Ile Glu Gly Pro Thr Thr

1 5 10

<210>39

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>39

Gln Val Cys Val Gln Thr Val Arg Thr Gln Val Tyr Ile Ala

1 5 10

<210>40

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>40

Tyr Tyr Pro Ser Ala Arg Ile Val Tyr Thr Ala Cys

1 5 10

<210>41

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>41

Ala Asp Val Leu Tyr Gln Pro Pro Gln Thr Ser Ile

1 5 10

<210>42

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>42

Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val

1 5 10

<210>43

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>43

Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu

1 5 10

<210>44

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>44

Glu Gln Leu Gln Leu Leu Met Pro Leu Lys Ala Pro

1 5 10

<210>45

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>45

Ala Ile Thr Thr Ser Asn Cys Ala Lys Arg Leu Ala

1 5 10

<210>46

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>46

Lys Thr Ile Lys Val Phe Thr Thr Val Asp Asn Thr

1 5 10

<210>47

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>47

Leu Pro Phe Thr Leu Gly Ile Met Ala Ile Ala Ala

1 5 10

<210>48

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>48

Val Phe Thr Leu Leu Phe Gln Leu Cys Thr Phe Thr

1 5 10

<210>49

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>49

Ser Ile Lys Trp Ala Asp Asn Asn Cys Tyr Leu Ser

1 5 10

<210>50

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>50

Asp Leu Met Ala Ala Tyr Val Glu Asn Thr Ser Ile

1 5 10

<210>51

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>51

Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp

1 5 10

<210>52

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>52

Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn Tyr Phe

1 5 10

<210>53

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>53

Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly

1 5 10

<210>54

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>54

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe

1 5 10

<210>55

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>55

Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe

1 5 10

<210>56

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>56

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

1 5 10

<210>57

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>57

Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe

1 5 10

<210>58

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>58

Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe

1 5 10

<210>59

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>59

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp

1 5 10

<210>60

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>60

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile

1 5 10

<210>61

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>61

Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu

1 5 10

<210>62

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>62

Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr Phe Glu

1 5 10

<210>63

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>63

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro

1 5 10

<210>64

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>64

Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp

1 5 10

<210>65

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>65

Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val

1 5 10

<210>66

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>66

Arg His Phe Asp Glu Gly Asn Cys Asp Thr

1 5 10

<210>67

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>67

Gln Asp Leu Asn Gly Asn Trp Tyr Asp Phe

1 5 10

<210>68

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>68

Ile Lys Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Asp Phe

1 5 10

<210>69

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>69

Val Ala Ala Leu Thr Asn Asn Val Ala Phe

1 5 10

<210>70

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>70

Ala Phe Gln Thr Val Lys Pro Gly Asn Phe

1 5 10

<210>71

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>71

Val Lys Pro Gly Asn Phe Asn Lys Asp Phe

1 5 10

<210>72

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>72

Gly Ser Ser Val Glu Leu Lys His Phe Phe

1 5 10

<210>73

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>73

Glu Phe Tyr Ala Tyr Leu Arg Lys His Phe

1 5 10

<210>74

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>74

Pro Ser Arg Ile Leu Gly Ala Gly Cys Phe

1 5 10

<210>75

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>75

Thr Tyr Lys Leu Asn Val Gly Asp Tyr Phe

1 5 10

<210>76

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>76

Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Ser His Phe

1 5 10

<210>77

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>77

Ile Pro Ala Arg Ala Arg Val Glu Cys Phe

1 5 10

<210>78

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>78

Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Arg Glu Phe

1 5 10

<210>79

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>79

Ala Val His Glu Cys Phe Val Lys Arg Phe

1 5 10

<210>80

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>80

Val Lys Arg Val Asp Trp Ser Val Glu Tyr

1 5 10

<210>81

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>81

Val Asn Val Lys Gly His Phe Asp Gly His

1 5 10

<210>82

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(16)

<400>82

Tyr Phe Lys Lys Val Asp Gly Ile Ile Gln Gln Leu Pro Glu Thr Tyr

1 5 10 15

<210>83

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>83

Arg Asp Leu Glu Asp Lys Phe Pro Arg Ser

1 5 10

<210>84

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>84

Gln Met Glu Thr Asp Phe Leu Glu Leu Ala

1 5 10

<210>85

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>85

Lys Leu Glu Asp Phe Ile Pro Met Asp Ser

1 5 10

<210>86

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>86

Ile Gln Gln Leu Pro Glu Thr Tyr Phe Thr Gln Ser

1 5 10

<210>87

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>87

Tyr Ser Asp Val Glu Thr Pro His Leu Met Gly Trp

1 5 10

<210>88

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>88

Ser Arg Leu Ser Phe Lys Glu Leu Leu Val Tyr Ala Ala Asp

1 5 10

<210>89

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>89

Leu His Cys Ala Asn Phe Asn Val Leu Phe Ser Thr

1 5 10

<210>90

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>90

Ser Thr Leu Glu Gln Tyr Val Phe Cys Thr Val Asn

1 5 10

<210>91

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>91

Glu Thr Leu Lys Ala Thr Glu Glu Thr Phe Lys Leu

1 5 10

<210>92

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>92

Arg Arg Cys Pro Ala Glu Ile Val Asp Thr Val Ser

1 5 10

<210>93

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>93

Asn Cys Cys Asp Asp Asp Tyr Phe Asn Lys Lys Asp

1 5 10

<210>94

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>94

Ala Ser Lys Ile Leu Gly Leu Pro Thr Gln Thr Val

1 5 10

<210>95

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(16)

<400>95

Cys Asp Trp Thr Asn Ala Gly Asp Tyr Ile Leu Ala Asn Thr Cys Thr

1 5 10 15

<210>96

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>96

Ala Pro Ala His Val Ser Thr Ile Gly Val Cys Thr Met Thr

1 5 10

<210>97

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>97

Arg Val Asp Trp Ser Val Glu Tyr Pro Ile Ile Gly

1 5 10

<210>98

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>98

Leu Glu Asp Phe Lys Pro Arg Ser Gln Met Glu Thr

1 5 10

<210>99

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>99

Tyr Asp Phe Ala Val Ser Lys Gly Phe Phe Lys Glu

1 5 10

<210>100

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>100

Leu Ile Gly Ala Asn Tyr Leu Gly Lys Pro Lys Glu

1 5 10

<210>101

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>101

Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

1 5 10

<210>102

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>102

Val Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser

1 5 10

<210>103

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>103

Asp Asn Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala

1 5 10

<210>104

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>104

Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala

1 5 10

<210>105

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>105

Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp

1 5 10

<210>106

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>106

Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe

1 5 10

<210>107

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(18)

<400>107

Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Met Asp

1 5 10 15

Asp Phe

<210>108

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>108

Thr Val Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

1 5 10

<210>109

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(10)

<400>109

Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Ala Trp

1 5 10

<210>110

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>110

Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser

1 5 10

<210>111

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>111

Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met

1 5 10

<210>112

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(14)

<400>112

Asn Trp Val Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Ile

1 5 10

<210>113

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>113

Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser

1 5 10

<210>114

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(12)

<400>114

Thr Arg Pro Leu Met Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly

1 5 10

具体实施方式

实例1：SARS多肽阵列芯片构建和生物探针检测

1.1构建SARS多肽阵列芯片

SARS全基因组编码的15ORFs蛋白质序列，通过软件系统设计(DIGEN，JeriniBiotools GmbH，Beilin，Germany)和自动化设备(AutoSpot，Intavis Bioanalytical Instruments，Lagenfeld，Germany)，按序列漂移原则直接在纤维素膜上原位合成多肽氨基酸序列，并将这些重叠蛋白多肽片段以24×18的密度排列在芯片上，即重叠多肽阵列(OverlappingPeptide Array)技术。带一级氨基的PEG改性纤维素膜也购自德国Intavis公司。每次氨基酸点样后，至少与经HOBT和DIPC化学活化的0.5M氨基保护剂(fmoc)反应15分钟。在20％氢化吡啶的二甲基甲酰胺(DMF)溶液去保护基团后，依次用DMF、甲醇清洗，风干，再开始下一次的偶合反应。经过12次原位反应后，用含有5mL三氟乙酸(TFA)、5mL二氯甲烷(DCM)、300μL三异丙基硅烷和200μL水的溶液去除侧链保护基团。然后，多肽阵列芯片用二氯甲烷和甲醇清洗。风干后，多肽阵列膜于-20℃储存在密封袋中待用。

1.2SARS多肽阵列芯片生物探针检测

上述多肽阵列芯片经以下程序重新活化，即用甲醇、50％甲醇再用50mM Tris缓冲液/0.2％吐温20溶液(TBS-T)洗三遍。再用5％低脂牛奶的TBS-T阻断缓冲液在4℃放置过夜。在TBS-T溶液清洗三次后，多肽阵列芯片与SARS感染病人和正常人血清在室温下共培养4小时。清洗后的多肽阵列芯片用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人IgA，IgG和IgM抗体(0.2μg)处理。用TBS-T溶液清洗后，多肽阵列芯片用增强型化学发光显色试剂盒(Amersham Pharmacia)显色，用X光放射自显影胶片(KodakBioMaxLight)曝光，定影和显影。图片扫描后储存供后续阵列分析软件分析。多肽阵列芯片置于8％尿素/1％SDS溶液过夜，然后置于50％乙醇/10％乙酸溶液60分钟后再生。再生芯片以TBS-T溶液清洗三次，以蒸馏水清洗两次后，多肽阵列芯片于-20℃储存在密封袋中待用。

该多肽阵列芯片包含了SARS全基因组编码的15ORFs蛋白质序列(图3)，并且用所述的多肽阵列芯片获得了特异性的结果(图4)。SARS多肽阵列中有4942个多肽链，这些多肽链包含了全部的SARS病毒蛋白表达(表1)。使用上述重叠多肽阵列(Overlapping Peptide Array)技术，这些多肽序列分别在四张多肽阵列芯片实现。

实例2：多肽阵列芯片(膜)质量检测

多个备份的M蛋白序列阵列分别在一套膜上合成制备。这些复制膜用于质量控制监测并评价结果的重现性和可靠性。SARS病人急性期和恢复期与对照组的多肽阵列检测结果用于验证多肽阵列芯片的质量。随机选择了9个多肽序列位点，并测定其荧光强度。结果表明3个复制的M蛋白序列阵列(膜)的特征和荧光强度非常相似，多个备份的M蛋白序列阵列的相对荧光强度的平均标准偏差(SD)也非常接近。在本研究中，所有的多肽阵列芯片(膜)同法验证，都显示一致的结果。

实例3：应用多肽阵列芯片分析SARS病人血清和正常人血清

3.1病人血清和正常人血清采集

10个感染SARS的病人血清和10个正常人对照血清用于SARS多肽阵列芯片生物探针检测。分别采集血清(见表3血清采集信息)。诊断是根据病人接触史，并进行世界卫生组织推荐的PCR分析及抗体测试确认。急性期的血清采集时间点是临床发病后5至13天(平均6.8天)。恢复期的血清采集时间点是临床发病后17至31天(平均24.7天)。病人5在临床发病后约1个月去世。

表3SARS病人急性期和恢复期血清采集信息

病例序号	急性期(临床发病后天数)	恢复期(临床发病后天数)
			1	5	31
2	8	30
			3	7	22
4	0	24
			5	6	26
6	9	29
			7	5	17
8	13	27
			9	6	18
10	9	23

3.2多肽阵列芯片生物探针检测分析

点阵分析基于膜芯片图像进行。从与血清反应的多肽阵列芯片中选择点阵的标准包括：1)明显的有很强荧光的位点(例如与背景和相邻低荧光的位点比较)；2)至少有连续两个位点的区域。但是，为了增加其专属特征性，SARS病人血清反应的所有可见位点都记录下来。位点的荧光强度采用KODAK 1D3.5版本软件分析并评分。位点的净强度是通过去除背景后得到。平均净强度用于位点评分并比较结果。

3.3SARS冠状病毒特征性多肽序列鉴定

急性期专属特征性序列

急性期SARS病人血清与多肽阵列芯片反应后，鉴别出共有61个区域具有两到三个多肽位点重叠。其中根据总体质量(如位点数和荧光强度)优选出共有17个区域(表4)。

检测的病人中，显示特有的多肽识别概率(阳性结果的百分率)介于20％至80％(见表4概率栏)。但是，病人9未发现任何强反应的重叠位点。70％的检测病人中，4728，4729区域对应SARS核衣壳蛋白(N蛋白)的VRGGDGKMKELS序列被IgM识别且从信号强度(荧光强度)来讲是质量最高的(见表4质量栏)。2588，2589区域对应SARS刺突糖蛋白(S蛋白)的SQNPLAELKCSV序列被IgA识别并且是质量次之。虽然该序列的阳性概率仅有20％，但两个阳性区域反应强度非常高。其他的序列有较强的信号并分别对应SARS膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)、ORF1a及ORF1b编码蛋白。在前8个序列，以质量排序，5个序列被IgM识别。被IgG主要识别的序列，发现反应强度低一些。

表4急性期专属特征性序列

质量排序	免疫球蛋白	基因组区域	多肽序列	结构蛋白	概率
						1	IgM	^*4728，4729	VRGGDGKMKELS	N	70％
2	IgA	^*2588，2589	SQNPLAELKCSV	S	20％
						3	IgM	4855，4856	DNVILLNKHIDA	N	30％
4	IgG	4383，4384	IQQLPETYFTQS	ORF1b	20％
						5	IgG	4993，4994	ASFRLFARTRSM	M	40％
6	IgM	3563，3564	YSDVETPHLMGW	ORF1b	40％
						7	IgM	3442，3443，3444	SRLSFKELLVYAAD	ORF1b	80％
8	IgM	5593，5594，5595	NWVTGGIAIAMACI	M	50％
						9	IgA	^*1048，1049，1050	GLKTIATHGIAAIN	ORF1a	50％
10	IgG	3426，3427	KIFVDGVPFVVS	ORF1b	50％
						11	IgG	5639，5640	KEITVATSRTLS	M	40％
12	IgG	1230，1231，1232	NPTDQSSYIVDSVA	ORF1a	40％
						13	IgG	173，174	GTENLVIEGPTT	ORF1a	30％
14	IgG	2211，2212	MRFFTLRSITAQ	ORF3	40％
						15	IgG	571，572，573	QVCVQTVRTQVYIA	ORF1a	60％
16	IgG	3875，3876	YYPSARIVYTAC	ORF1b	40％
						17	IgG	1612，1613	ADVLYQPPQTSI	ORF1a	20％

备注^*表示该序列在恢复期病人血清也被鉴别出。

恢复期特征性序列和区域

采用恢复期SARS病人血清与多肽阵列芯片反应后，鉴别出29个高质量的序列并按总体质量排序(表5)。阳性反应概率介于30％至60％之间。在前6个高质量的序列中，5个序列被IgA识别。这些序列分别对应SARS刺突糖蛋白(S蛋白)和ORF1a编码蛋白。排序第4的序列(2598，2599，2600：IYQTSNFRVVPSGD)被IgG识别，也对应SARS刺突糖蛋白(S蛋白)。由于我们发现一些特征性的序列在急性期也被鉴别，大部分恢复期鉴别出的序列分别对应SARS刺突糖蛋白(S蛋白)、ORF1a及ORF1b编码蛋白、膜蛋白(M蛋白)、核衣壳蛋白(N蛋白)。

表5恢复期专属特征性序列

质量排序	免疫球蛋白	基因组区域	多肽序列	结构蛋白	概率
						1	IgA	^*2588，2589	SQNPLAELKCSV	S	30％
2	IgA	1919，1920	SKMSDVKCTSVV	ORF1a	30％
						3	IgA	^*1048，1049，1050	GLKTIATHGIAAIN	ORF1a	40％
4	IgG	2598，2599，2600	IYQTSNFRVVPSGD	S	30％
						5	IgA	363，364	EQLQLLMPLKAP	ORF1a	30％
6	IgA	1064，1065	AITTSNCAKRLA	ORF1a	40％
						7	IgM	3414，3415	LHCANFNVLFST	ORF1b	40％
8	IgA	2713，2714	FNGLTGTGVLTP	S	30％
						9	IgM	^*4728，4729	VRGGDGKMKELS	N	40％
10	IgG	3085，3086，3087	MFHLVDFQVTIA	ORF8	50％
						11	IgG	3901，3902	STLEQYVFCTVN	ORF1b	50％
12	IgG	3784，3785	ETLKATEETFKL	ORF1b	40％
						13	IgG	3947，3948	RRCPAEIVDTVS	ORF1b	50％
14	IgG	5009，5010	TRPLMESELVIG	M	50％
						15	IgM	3335，3336	NCCDDDYFNKKD	ORF1b	30％
16	IgM	3987，3988	ASKILGLPTQTV	ORF1b	40％
						17	IgM	3782，3783，3784，3785	CDWTNAGDYILANTCT	ORF1b	20％
18	IgM	772，773	KTIKVFTTVDNT	ORF1a	50％
						19	IgM	1795，1796	LPFTLGIMAIAA	ORF1a	30％
20	IgM	4336，4337，4338	APAHVSTIGVCTMT	ORF1b	60％
						21	IgG	1075，1076	VFTLLFQLCTFT	ORF1a	10％
22	IgG	4171，4172	RVDWSVEYPIIG	ORF1b	40％
						23	IgA	4390，4391	LEDFKPRSQMET	ORF1b	40％
24	IgA	822，823	SIKWADNNCYLS	ORF1a	30％
						25	IgM	2524，2525，2526	MIFDNAFNCTFE	S	60％
26	IgA	1036，1037	DLMAAYVENTSI	ORF1a	40％
						27	IgA	3470，3471	YDFAVSKGFFKE	ORF1b	40％
28	IgA	4566，4567	LIGANYLGKPKE	N	50％
						29	IgM	5872，5873	SRIGMEVTPSGT	N	40％

备注^*表示该序列在急性期病人血清也被鉴别出。

恢复期专属特征性序列

发现2个序列是恢复期专属特征性序列(表6，图5)。虽然两个序列都对应SARS的ORF1a编码蛋白，但一个序列被IgA识别，而另一个序列被IgG识别。相应的阳性反应概率分别为30％和10％。

表6SARS病人恢复期专属特征性序列

免疫球蛋白	基因组区域	多肽序列	结构蛋白	概率
					IgA	1919，1920	SKMS DVKCT SVV	ORF1a	30％

[1228]

IgG

1075，1076

VFTLLFQLCTFT

ORF1a

10％

急性期和恢复期共有的专属特征性序列

四个共有的专属特征性序列在SARS急性期和恢复期病人被鉴别出(表7，图6)。两个序列对应SARS刺突糖蛋白(S蛋白)，一个序列对应SARS核衣壳蛋白(N蛋白)，一个序列对应SARS的ORF1a编码蛋白。在急性期和恢复期，其阳性反应概率明显降低，但其他三个序列在急性期和恢复期的阳性反应概率未见惊人的差异。

表7急性期和恢复期共有的专属特征性序列

SARS冠状病毒特征性序列适用于诊断试剂盒

在急性期鉴别出的17个专属特征性序列(参见表4)，第一序号4728，4729区域对应SARS核衣壳蛋白(N蛋白)的VRGGDGKMKELS序列被IgM识别且质量最高(该序列的IgM异型与早期生成的抗体相一致)。在恢复期，40％的病人对该区域多肽序列显示较强的阳性反应概率，表明该多肽片段是非常特征性的SARS指征。此外，70％的急性期病人血清对该区域多肽序列显示较强的阳性反应概率。因此，使得该多肽片段区域单独或和其他序列成为关键部分用于构建疾病诊断试剂盒。

Claims

1.新型特异性多肽，其特征在于它是通过测试病人血清而得到的，该多肽序列是VRGGDGKMKELS，蛋白名称为N核衣壳蛋白，其氨基酸序列为：Val Arg Gly Gly Asp Gly LysMet Lys Glu Leu Ser。

2.根据权利要求1所述新型特异性多肽，其特征在于它通过如下方法获得：

(1)构建SARS多肽阵列芯片：

SARS全基因组编码的15ORFs蛋白质序列，通过软件系统设计和自动化设备，按序列漂移原则直接在纤维素膜上原位合成多肽氨基酸序列，并将这些重叠蛋白多肽片段以24×18的密度排列在芯片上，即重叠多肽阵列技术；带一级氨基的PEG改性纤维素膜也购自德国Intavis公司；每次氨基酸点样后，至少与经HOBT和DIPC化学活化的0.5M氨基保护剂fmoc反应15分钟；在20％氢化吡啶的二甲基甲酰胺溶液去保护基团后，依次用二甲基甲酰胺溶液、甲醇清洗，风干，再开始下一次的偶合反应；经过12次原位反应后，用含有5mL三氟乙酸、5mL二氯甲烷、300μL三异丙基硅烷和200μL水的溶液去除侧链保护基团；然后，多肽阵列芯片用二氯甲烷和甲醇清洗；风干后，多肽阵列膜于-20℃储存在密封袋中待用；

(2)病人血清和正常人血清采集；

(3)SARS冠状病毒特征性多肽序列鉴定：

A、急性期SARS病人血清与多肽阵列芯片反应后，优选出共有17个区域：

质量排序免疫球蛋白基因组区域多肽序列结构蛋白概率 1 IgM *4728，4729 VRGGDGKMKELS N 70％ 2 IgA *2588，2589 SQNPLAELKCSV S 20％ 3 IgM 4855，4856 DNVILLNKHIDA N 30％ 4 IgG 4383，4384 IQQLPETYFTQS ORF1b 20％ 5 IgG 4993，4994 ASFRLFARTRSM M 40％ 6 IgM 3563，3564 YSDVETPHLMGW ORF1b 40％ 7 IgM 3442，3443，3444 SRLSFKELLVYAAD ORF1b 80％ 8 IgM 5593，5594，5595 NWVTGGIAIAMACI M 50％ 9 IgA *1048，1049，1050 GLKTIATHGIAAIN ORF1a 50％ 10 IgG 3426，3427 KIFVDGVPFVVS ORF1b 50％ 11 IgG 5639，5640 KEITVATSRTLS M 40％ 12 IgG 1230，1231，1232 NPTDQSSYIVDSVA ORF1a 40％ 13 IgG 173，174 GTENLVIEGPTT ORF1a 30％ 14 IgG 2211，2212 MRFFTLRSITAQ ORF3 40％ 15 IgG 571，572，573 QVCVQTVRTQVYIA ORF1a 60％ 16 IgG 3875，3876 YYPSARIVYTAC ORF1b 40％ 17 IgG 1612，1613 ADVLYQPPQTSI ORF1a 20％

备注*表示该序列在恢复期病人血清也被鉴别出；

B、采用恢复期SARS病人血清与多肽阵列芯片反应后，鉴别出29个高质量的序列并按总体质量排序

备注*表示该序列在急性期病人血清也被鉴别出；

(4)新型特异性多肽的获得：

第一序号4728，4729区域对应SARS核衣壳蛋白的VRGGDGKMKELS序列被IgM识别且质量最高，该序列的IgM异型与早期生成的抗体相一致；在恢复期，40％的病人对该区域多肽序列显示较强的阳性反应概率，表明该多肽片段是非常特征性的SARS指征。

3.根据权利要求1或2所述的新型特异性多肽，其特征在于：使得该多肽片段区域单独或和其他序列成为关键部分用于构建疾病诊断试剂盒。