KR20220061636A - 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 베로 세포에서 대량 증식이 가능하고, 유전자 결손 및 변이로 인해 야외주와 감별이 가능하다는 장점이 있다. 또한 상기 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 최근 유행하는 돼지 유행성 설사병 바이러스와 동일한 G2b 그룹에 속하여 기존 백신의 문제점을 개선할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 돼지 유행성 설사병 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사병 바이러스는 7일령 이하의 포유 자돈에서 감염하여 설사를 일으켜 치명적인 폐사를 일으키는 원인체로 알려져 있다. 상기 바이러스는 한국을 포함한 미국, 캐나다, 일본, 중국, 대만, 베트남, 필리핀 등의 전 세계의 나라에서 양돈산업에 큰 위협을 주고 있다. 돼지 유행성 설사병 바이러스는 주로 신생 자돈에 감염하여 수양성 설사와 급격한 탈수로 폐사를 일으킨다. 최근 연구보고에 따르면, 2013년 이후로 새로운 유형의 돼지 유행성 설사병 바이러스로 100만두 이상의 자돈이 폐사하였다고 보고하였다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스는 1976년 벨기에에서 처음으로 분리·보고하였으며, 코로나 바이러스과의 알파코로나 바이러스로 분류하고 있다. 돼지 유행성 설사병 바이러스는 1979년과 1980년 사이에 유럽에 전파되었고, 1992년 이후에 한국으로 유입되어 수많은 자돈을 폐사시켰다. 1995년 이후에 생백신 또는 사백신이 개발되어 대유행을 막을 수 있었지만, 도 1에 나타낸 바와 같이, 2003년도에 90건(40,377두에 발생), 2007년 36건(13,724두 발생), 2014년 163건 (33,646두에 발생), 2018년 221건 (34,716두 발생) 주기적으로 대유행하여 양돈농가에 피해를 주었다.
돼지 유행성 설사병을 예방하기 위하여 G1 그룹으로 분류하는 생백신과 사백신 그리고 G2 그룹으로 분류하는 사백신이 사용되고 있다. G1 그룹에 속한 유행성 설사병 백신은 전염성 위장염 바이러스 및 로타 바이러스와 함께 혼합 백신 형태 또는 단일 백신 형태로 사용되고 있다. 일본에서도 1997년 이후 유행성 설사병 바이러스를 세포배양을 통해 순화시킨 생백신을 사용하고 있다. G1 그룹에 속하는 경구용 백신(DR13주)도 한국과 필리핀에서 사용중이다.
이러한 백신들이 효과적인 것으로 여겨지고 있음에도 불구하고, 2013년 국내에 새로운 변이주의 출현으로 기존의 백신을 접종받은 모돈이 G2 그룹에 속하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 높은 면역원성을 나타내고 있지 못하는 것이 확인되었고, 백신을 접종하는 경로 및 초유 내 IgA 성분의 농도에 따라서 면역원성 및 효능에 차이가 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 돼지 유행성 설사병 백신의 면역원성 및 효능을 개선하기 위한 노력 중 하나로 생백신을 2회 접종한 후 사백신을 2회 접종하는 백신 프로그램이 개발되었다.
그 후, 2013년 하반기에 국내에 기존의 돼지 유행성 설사병 바이러스와 아미노산의 상동성이 약 8% 이상 차이가 나는 G2 그룹의 변이주가 확인되었다. 이에, 최근에 돼지 유행성 설사병이 발생한 농장에서 채혈한 혈청을 이용하여 기존 돼지 유행성 설사병 바이러스인 SM98주로 혈청검사를 실시한 경우 다양한 혈청 교차반응이 나타났다. 도 2에 나타낸 바와 같이, SM89주의 생백신을 자돈 2두에 접종하고 14일째에 G2 그룹에 속한 QIAP1401-10P로 공격 접종 하였을 때 심한 설사를 유발하였다. G2 그룹의 돼지 유행성 설사병 바이러스를 함유하는 사백신은 상용화되어 있음에도 생백신은 아직까지 상용화되어 있지 않다. 따라서 G2그룹에 속하는 유행성 설사병 바이러스를 이용한 생백신 및 백신 프로그램의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 물리·화학적 자극을 가하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401주를 배양하여 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P)를 포함하는 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 예방접종 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 감별 프라이머 세트를 포함하는 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P) 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852)를 포함하는 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 예방접종 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 서열번호 14 및 15의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 ORF1a 유전자 감별 프라이머 세트; (b) 서열번호 16 및 17의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트; 및 (c) 서열번호 18 및 19의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 감별 프라이머 세트를 포함하는 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 베로 세포에서 대량 증식이 가능하고, 유전자 결손 및 변이로 인해 야외주와 감별이 가능하다는 장점이 있다. 또한 상기 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 최근 유행하는 돼지 유행성 설사병 바이러스와 동일한 G2b 그룹에 속하여 기존 백신의 문제점을 개선할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 돼지 유행성 설사병 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 2000년 이후 2020년까지 국내 유행성 설사병 발생건수 및 발생두수를 나타낸 도이다.
도 2는 G1 그룹에 속하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 SM98주를 자돈에 접종한 후 14일째에 G2 그룹에 속하는 QIAP1401-10P를 경구로 공격 접종하여 나타낸 임상증상을 보여준다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주; 및 대조군인 QIAP1401-parent주;의 유전체를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 베로 세포에서 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포 변성 효과를 확인한 도이다(A : QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포, B : 정상 베로 세포).
도 5는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포질 내 특이 형광 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 전자 현미경을 이용하여 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 입자를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 수확 시간에 따른 바이러스 함량 분석을 통해 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 최적 수확 시간을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 소화효소 처리에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 증식 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 스파이크 유전자 특이 프라이머를 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자를 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자 서열를 바탕으로 작성한 계통도를 나타낸 도이다.
도 11은 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 ORF1a 유전자 서열을 기반으로 설계된 감별 프라이머의 유전체 상 위치를 나타낸 도이다.
도 12는 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자 서열을 기반으로 설계된 감별 프라이머의 유전체 상 위치를 나타낸 도이다.
도 13은 설계된 감별 프라이머를 이용하여 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 유전자 결손을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A : ORF3a 유전자, B : 스파이크 유전자).
도 14는 설계된 감별 프라이머 세트(ORF1a)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 설계된 감별 프라이머 세트(SDF1R1)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 설계된 감별 프라이머 세트(SDF2R2)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 동결건조하여 제조한 생건조 시험백신을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 동결건조하여 제조된 생건조 시험백신을 이용한 가속시험 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 접종한 3일령 자돈을 나타낸 도이다(A : 근육 접종, B : 경구 접종).
도 20은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 자돈의 설사 지수를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 자돈의 소장을 조직화학적 염색한 결과를 나타낸 도이다(A : 근육 접종군, B : 경구 접종군, C : 양성 대조군(야외에서 감염된 양성 시료)).
도 22는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 기니픽에서 항체형성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 백신 프로그램에 따른 중화항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 백신 프로그램을 적용한 돼지에 공격접종 후 설사지수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 백신접종 프로그램을 적용한 돼지에 공격접종 후 분변에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 유전자 검출여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 G1 그룹에 속하는 돼지 유행성 설사병 바이러스 SM98주를 자돈에 접종한 후 14일째에 G2 그룹에 속하는 QIAP1401-10P를 경구로 공격 접종하여 나타낸 임상증상을 보여준다.
도 3은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주; 및 대조군인 QIAP1401-parent주;의 유전체를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 베로 세포에서 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포 변성 효과를 확인한 도이다(A : QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포, B : 정상 베로 세포).
도 5는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포질 내 특이 형광 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 전자 현미경을 이용하여 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 입자를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 수확 시간에 따른 바이러스 함량 분석을 통해 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 최적 수확 시간을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 소화효소 처리에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 증식 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 스파이크 유전자 특이 프라이머를 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자를 증폭한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자 서열를 바탕으로 작성한 계통도를 나타낸 도이다.
도 11은 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 ORF1a 유전자 서열을 기반으로 설계된 감별 프라이머의 유전체 상 위치를 나타낸 도이다.
도 12는 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 스파이크 유전자 서열을 기반으로 설계된 감별 프라이머의 유전체 상 위치를 나타낸 도이다.
도 13은 설계된 감별 프라이머를 이용하여 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 유전자 결손을 확인한 결과를 나타낸 도이다(A : ORF3a 유전자, B : 스파이크 유전자).
도 14는 설계된 감별 프라이머 세트(ORF1a)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 설계된 감별 프라이머 세트(SDF1R1)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 설계된 감별 프라이머 세트(SDF2R2)를 이용하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 동결건조하여 제조한 생건조 시험백신을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 동결건조하여 제조된 생건조 시험백신을 이용한 가속시험 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 접종한 3일령 자돈을 나타낸 도이다(A : 근육 접종, B : 경구 접종).
도 20은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 자돈의 설사 지수를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 자돈의 소장을 조직화학적 염색한 결과를 나타낸 도이다(A : 근육 접종군, B : 경구 접종군, C : 양성 대조군(야외에서 감염된 양성 시료)).
도 22는 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생건조 시험백신을 접종한 기니픽에서 항체형성능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 백신 프로그램에 따른 중화항체가를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 백신 프로그램을 적용한 돼지에 공격접종 후 설사지수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 백신접종 프로그램을 적용한 돼지에 공격접종 후 분변에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 유전자 검출여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus) QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 순화(attenuation)는 병원성 미생물을 본래의 숙주 또는 다른 생물체에 계대하거나 특정 조건에서 배양하여 본래의 숙주에 대한 병원성이 감소되거나 없어지는 현상을 의미한다.
본 발명에 따른 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 최근 유행하는 변이된 유행성 설사병 바이러스를 분리하고, 분리된 바이러스에 물리·화학적 자극을 가하며 200 대까지 계대 배양하여 제작된 것이다. 제작된 바이러스를 ‘QIAP1401-200’으로 명명하고, 2020년 10월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁하여 수탁번호 KCTC18852P를 부여 받았다.
본 발명의 구체예에서, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 G2b 그룹에 속하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스는 스파이크 유전자의 유전형에 따라 G1a, G1b, G2a 및 G2b 그룹으로 나뉜다. 본 발명의 실시예에서 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200의 스파이크 전체 유전자의 염기서열에 기초하여 계통 분석을 실시한 결과, 최근 국내에서 유행하는 바이러스와 같은 G2b 그룹에 속하는 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명은 종래 기술의 문제점, 즉, (i) G1 그룹의 생/사백신이 최근 유행하는 G2 그룹에 속하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 면역원성을 나타내지 않는다는 문제점; (ii) G2 그룹의 돼지 유행성 설사병 바이러스와 아미노산 상동성이 8% 이상 차이나는 변이주 발생으로 인한 한계; 및 (iii) G2 그룹의 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 불활화 백신을 개발 되었으나 생백신은 상용화되지 않은 한계점;을 해결한 것이다.
본 발명의 구체적인 예에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 예에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 ORF1a 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200의 ORF1a 유전자는 야외주인 QIAP1401 대비 75개의 핵산이 결손된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 스파이크 유전자를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200의 스파이크 유전자는 야외주인 QIAP1401 대비 27개의 핵산이 결손된 것을 특징으로 한다.
또한, 앞서 언급한 전장서열(서열번호 1), ORF1a(서열번호 2) 또는 스파이크 유전자(서열번호 3)의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1, 2 또는 3의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열번호 1, 2 또는 3으로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명의 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 베로 세포에서 대량 증식이 가능하고, 유전자 결손 및 변이로 인해 야외주와 감별이 가능하다는 것을 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P)을 포함하는 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 백신(vaccine)은 동물에 특정 질병 또는 병원체에 대한 후천성 면역을 부여하는 의약품을 의미한다. 백신은 주로 병원체의 항원인식부위와 유사한 구조를 가지나, 병원체와 달리 병원성이 없다.
본 발명의 구체예에서, 상기 백신은 생백신 또는 사백신인 것이 바람직하다, 동일 또는 유사한 면역 반응을 유도할 수 있는 한 백신의 형태에 의해 본 발명이 제한되지 않는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 생백신(live vaccine, attenuated vaccine)은 병원체를 죽이지는 않은 상태, 즉 순화된 상태로 면역을 유도하고자하는 개체에 주입하여 병을 일으키지 않게 해주는 백신을 의미한다.
본 발명에 있어서, 사백신(killde vaccine, inactivated vaccine)은 배양한 병원체를 죽이되 병원체 자체의 특성은 유지한 상태로 면역을 유도하고자하는 개체에 주입하여 병을 일으키지 않게 해주는 백신을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 백신 조성물은 애주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 애주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용 가능한 애주번트로는 프로인트 완전 애주번트, 프로인트 불완전 애주번트, 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 애주번트는 몬타나이드 IMS1313(Montanide IMS1313) 또는 몬타나이드 젤 01(Montanide Gel 01)일 수 있고, 바람직하게는 몬타나이드 IMS1313 25 내지 40중량%; 또는 몬타나이드 젤 01 5 내지 15중량%;을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물은 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200 이외에도 추가로 약리학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 비-수용액 담체의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는 물, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제는 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
본 발명 백신 조성물의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 투여대상의 체중 1kg 당 0.01 내지 1㎖(105.0 TCID50/㎖ 이상), 바람직하게는 체중 1kg당 0.02 ~ 0.04㎖을 2주 간격으로 2회 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 백신 조성물은 경구, 근육, 피하, 피내, 복강, 정맥, 진피, 안구, 뇌내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 경구 또는 근육을 통해 투여될 수 있다.
본 발명에서는 기니픽 및 돼지를 대상으로 하여 본 발명 바이러스의 백신으로서의 안정성 및 효과를 평가하였다. 이를 통해 안정성 및 효과가 검증되었으므로, 우선적으로는 인간을 제외한 동물, 예를 들어 돼지, 말, 소, 양, 염소를 포함한 가축과 멧돼지, 고라니와 같은 야생동물 등의 유행성 설사병의 예방을 위해 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 예방접종 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 예방접종(vaccinetion)은 전염성 질환을 예방하기 위하여 병원성을 제거 또는 순화시킨 병원체를 면역(즉, 항체 생성)을 유도하고자하는 개체에 투여하는 것을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계는 생백신-생백신-사백신(live-live-killed vaccine: LLK); 생백신-사백신-사백신(live-killed-killed vaccine: LKK); 또는 경구백신-생백신-사백신(oral-live-killed vaccine: OLK);의 백신 프로그램으로 투여하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 생백신-생백신-사백신의 백신 프로그램으로 투여하는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P) 검출용 조성물을 제공한다. 상기 검출용 조성물은 (a) 서열번호 14 및 15의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 ORF1a 유전자 감별 프라이머 세트; (b) 서열번호 16 및 17의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트; 및 (c) 서열번호 18 및 19의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 감별 프라이머 세트를 포함한다.
본 발명에 있어서, 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에 따른 감별 프라이머 세트 (a) 내지 (c)는 야외주 대비 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200에서 유전자 결손이 확인된 부위(즉, ORF1a, 스파이크)를 기반으로 설계된 것인바, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200을 효과적으로 감별해낼 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 생백신주의 작성
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 작성하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1-1. 최근 유행하는 변이된 유행성 설사병 바이러스의 분리
국내에서 유행하는 유행성 설사병 바이러스를 분리하기 위하여 2014년 4월에 제주도 양돈 농장으로부터 돼지 유행성 설사병으로 의심된 자돈의 소장 시료를 수집하였다. trypsin 1 μg/ml이 함유된 D-MEM으로 수집된 시료를 10% 유제액으로 만들고, 3,000 rpm에서 15분 원심하여 상층액을 분리하였다. 원심한 상층액은 0.45 μm의 filter disk 여과한 후 trypsin이 10 μg/ml이 되도록 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 베로 세포(ATCC, CCL81)가 준비된 24 웰 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, trypsin으로 처리한 시료 100 μl씩 접종하였다. 접종 후 trypsin(1.0 μg/ml)이 첨가된 배지 1 ml를 추가하였다. 접종 후 1시간을 배양하고, 접종 시료를 제거한 후 trypsin(1.0 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지 1 ml를 각 웰에 넣어 주었다. 배양 1일째부터 신선한 배지(trypsin 1 μg/ml)로 교체하였다. 30개의 시료 중 2개의 시료에서 세포변성효과를 관찰할 수 있었다.
이렇게 분리된 돼지 유행성 설사병 바이러스는 QIAP1401주로 명명하고, 이를 이용하여 다음 실험을 진행하였다.
1-2. 유행성 설사병 바이러스주의 계대
바이러스의 계대는 6 웰 플레이트에서 한계 희석법을 이용하여 crystal trypsin이 1 내지 1.5 μg/ml이 함유된 DMEM 배지에서 계대하였다. 상기 실시예 1-1에서 분리된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401주에 화학적 및 물리적 자극을 가하여 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 작성하였다. 상기 화학적 처리는 4가지 시약, 즉, Urea, ribavirin, ammonium chloride(NH4Cl) 및 5’ bromo uracil을 처리하는 것이며, 상기 물리적 처리는 UV 조사 및 52℃ 가열이다. 계대별 구체적인 처리내용은 표 1에 나타내었다.
| 계대수 | 계대세포 | 처리내용 | 비 고 |
| 1-5 | 베로 세포 | - | 103.5 TCID50/ml |
| 6-20 | 베로 세포 | 5 mM Urea | |
| 21-40 | 베로 세포 | 200 mM ribavirin | |
| 41-60 | 베로 세포 | UV light 50초 노출 | 생물안전캐비넷 |
| 61-100 | 베로 세포 | 2 mM NH4Cl | |
| 101-150 | 베로 세포 | 52℃ 1분 처리 | |
| 151-200 | 베로 세포 | 4 mM 5‘ Bromo uracil |
표 1에 나타낸 바와 같이, 6대부터 20대 계대까지 5 mM Urea를 배지에 첨가하였다. 강력한 계면활성제인 Urea는 단백질의 비공유 결합을 파괴하고, 바이러스가 세포내로 들어갈 때 투과성을 증가시킨다. 21대부터 40대까지 200 mM ribavirin을 배지에 첨가하였다. 상기 ribavirin은 RNA-dependant RNA polymerase의 mutagen으로 알려져 있고, adenosine 및 guanidine과 분자구조가 비슷하여 바이러스 RNA와 경쟁관계로 핵산 위치에 끼어들어 갈수 있다. 41대부터 60대까지 바이러스를 6 웰 플레이트에 놓고 생물안전 케비넷을 이용하여 자외선을 50초 동안 조사하였다. 상기 자외선은 핵산 내의 thymine이 두 개가 결합되도록 하는 작용을 한다. 61대부터 100대까지 바이러스를 계대 배양할 때 2 mM ammonium chloride(NH4Cl)을 첨가한 배지를 사용하였다. 하기 표 2에 나타낸 것과 같이, ammonium chloride를 베로 세포에 독성을 나타내지 않는 농도로 처리하였고, 이는 세포 내 pH를 산성에서 알카리로 변화시켜 스파이크 유전자의 변이를 유도한다.
| Cytotoxicity of NH4Cl | |||||||
| Concentration of NH4Cl(mM) | 100 | 50 | 25 | 12.5 | 6.25 | 3.12 | 1.56 |
| toxicity | + | + | + | + | + | - | - |
101대부터 150대까지는 52℃ heat block에서 1분 동안 처리한 이후 계대하였다. 상기 열처리는 스파이크 유전자의 변이를 유도하는 것으로 알려져 있다. 151대부터 200대까지는 5‘ bromo uracil을 배지에 넣고 계대하였다. 이 5’ bromo uracil은 thymine과 유사하여 대체하여 유전자 변이를 일으키는 시약이다.
상기 과정을 통해 바이러스를 200대까지 계대하였고, 이 바이러스를 ‘QIAP1401-200주’로 명명하였다. 상기 QIAP1401-200주는 2020년 10월 8일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁하였으며, 수탁번호 KCTC18852P를 부여받았다.
후술되는 실험에 사용한 대조군은 다양한 계대수의 바이러스주를 이용하였고, 보다 상세하게는 QIAP1401 parent(계대수 : 0), QIAP1401-20(계대수 : 20), QIAP1401-40(계대수 : 40), QIAP1401-60(계대수 : 60) 등을 이용하였다.
1-3. 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생백신주의 변이 분석
1-3-1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 계대별 핵산 및 아미노산 변이의 분석
150 cm2의 조직배양 플라스크에서 베로 세포를 증식시킨 후에 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401 parent, QIAP1401-120주 및 QIAP1401-200주를 각각 접종하고 48시간의 후에 3번 얼린 후 녹여 수확하였다. 수확된 바이러스 100 ml를 PEG 8000으로 침전시킨 후 2 ml의 PBS로 현탁하여 준비하였다. 각각의 바이러스에 대하여 바이오니아사의 RNA 추출키트를 이용하여 viral RNA를 추출하고 마크로젠사에 3개의 바이러스 대한 전체 유전자 염기서열 시퀀싱(next-generation sequencing)을 의뢰하였다. NGS를 통해 얻은 QIAP1401 parent, QIAP1401-120주 및 QIAP1401-200주의 염기서열을 분석하였다.
돼지 유행성 설사병 바이러스의 중화능을 일으키는 부위인 스파이크 유전자에 대해서는 표 3의 특이 프라이머를 이용하여 QIAP1401-20, QIAP1401-60, QIAP1401-100의 스파이크 유전자를 증폭하고 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.
| 바이러스주 | 프라이머 이름 |
프라이머 염기서열 (5' to 3') |
서열번호 | 유전자 크기 | 목적 유전자 |
| QIAP1401-parent | S1-F | GTC GGC ATA ACA TGG GAC AA | 4 | 699 bp | S gene |
| S1-R | CCC TGA CGG TAG GAG GTA AA | 5 | |||
| S2-F | CCT CTG GGT GCT ACC CAA GT | 6 | 1044 bp | ||
| S2-R | CAT CAA CAT ATG CAG CCT GC | 7 | |||
| S3-F | GTC ACT AGT GGT GAT GTT | 8 | 925 bp | ||
| S3-R | GCT GGT TCC GCT GTA GAA CA | 9 | |||
| S4-F | CTT CTG CAG CGG CAT TGC CT | 10 | 888 bp | ||
| S4-R | GTT CTA TTG GGC AGA GAA GC | 11 | |||
| S5-F | GAG ATT TGT CTG GTC ACC TA | 12 | 339 bp | ||
| S5-R | GGT TGA AGT CTA GGA CCC C | 13 |
염기서열 분석을 통해 QIAP1401-200주의 전체 서열은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 확인하였다. 또한 QIAP1401-200주의 ORF1a 및 스파이크 유전자는 각각 서열번호 2 및 3의 염기서열로 표시되는 것을 확인하였다.
QIAP1401 parent주 대비 QIAP1401-200주의 결손 부위는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, QIAP1401-200주는 ORF1a 및 스파이크 단백질 부분에서 결손이 발생한 것을 확인하였다.
서열분석 결과에 기초하여, 핵산 및 아미노산 변이를 분석하였다.
[계대별 스파이크 유전자의 핵산 및 아미노산 변이]
상기 염기서열 분석 결과로부터 확인된 돼지 유행성 설사병 바이러스의 계대별 스파이크 유전자의 핵산 및 아미노산 변이는 표 4 및 5에 나타내었다.
| PED virus(QIAP1401) | ||||||
| Parent | 20P | 40P | 60P | 120P | 200P | |
| 핵산 | 4161 | 4161 | 4161 | 4161 | 4134 | 4134 |
| 아미노산 | 1386 | 1386 | 1386 | 1386 | 1377 | 1377 |
| 핵산 변이 | - | 5 | 6 | 7 | 38 | 40 |
| 아미노산 변이 | - | 5 | 6 | 7 | 18 | 19 |
| Mutation of the amino acids in spike gene of PEDV | |||||||||||
| No. of passage | 102 | 130-138 | 214 | 265 | 370 | 380 | 511 | 635 | 679 | 887 | 1228 |
| Parent | P | SIKTLGPTA | M | D | P | Y | S | L | D | S | V |
| 20 | S | SIKTLGPTA | M | G | P | Y | F | F | D | R | V |
| 40 | S | SIKTLGPTA | M | G | P | Y | F | F | E | R | V |
| 60 | S | SIKTLGPTA | I | G | P | Y | F | F | E | R | V |
| 120P | S | - | I | G | S | F | F | F | E | R | V |
| 200P | S | - | I | G | S | F | F | F | E | R | G |
표 4 및 5에 나타낸 바와 같이, QIAP1401 parent 대비 QIAP1401-200주의 스파이크 아미노산은 1386개에서 1377개로 줄어들었으며, 총 19개의 아미노산 변이 중 9개는 결손되었고, 10개의 아미노산이 변화되었다. QIAP1401 parent에서 20대, 40대, 60대를 계대하면서 5, 6, 7개의 아미노산이 변화되었으며, 120대 까지 계대하면서 9개의 아미노산이 결손되었고, 8개의 아미노산이 변화되어 총 18개의 변이가 나타났다. 200대까지 계대하면서 1228번의 발린이 글리신으로 1개의 아미노산이 추가로 변이되어 총 19개의 아미노산이 변이되었다.
[계대별 ORF3, E, M, N 단백질의 변이]
상기 염기서열 분석 결과로부터 확인된 돼지 유행성 설사병 바이러스의 계대별 ORF3, E, M, N 단백질의 변이는 표 6에 나타내었다.
| Mutation of amino acids in ORF3, E, M and N genes of PEDV | ||||||||
| 유전자 | ORF3 | E | M | N | ||||
| 아미노산 위치 | 206 | 58 | 67 | 25 | 79 | 212 | 199 | 369 |
| Parent | I | R | D | I | A | P | K | S |
| 120P | L | G | N | T | S | P | R | L |
| 200P | L | G | N | T | S | L | R | L |
표 6에 나타낸 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 구조 단백질 중 ORF3, E, M, N 단백질에 대한 변이를 살펴보면, QIAP1401 parent 대비 QIAP1401-200주의 ORF3 단백질에서는 206번의 이소류신(I)이 류신(L)으로 1개가 변이되었다. 또한 QIAP1401-200주의 E 단백질에서는 58번째 아미노산이 아르기닌(R)에서 글리신(G)로, 67번째 아미노산이 아스파틱산(D)에서 아스파라긴(N)으로 변이되었다. QIAP1401-200주의 M 단백질은 3개의 아미노산이 변화되었는데, 25번째 아미노산은 이소류신(I)에서 트레오닌(T)으로, 79번째 아미노산은 알라닌(A)에서 세린(S)으로, 212번째 아미노산은 프롤린(P)에서 류신(L)로 변이되었다. QIAP1401-200주의 N 단백질에서는 199번째 아미노산이 리신(K)에서 아르기닌(R)으로, 369번째 아미노산이 세린(S)에서 류신(L)으로 변화되었다.
[계대별 polyprotein 단백질의 변이]
상기 염기서열 분석 결과로부터 확인된 돼지 유행성 설사병 바이러스의 계대별 polyprotein 단백질의 변이는 표 7에 나타내었다.
| Mutation of the amino acids in polyprotein gene of PEDV | ||||||||||||||||||||||||
| 135 | 141 | 419 | 438 | 524 | 554 | 668 | 1011-1035 | 1204 | 1312 | 1429 | 1564 | 1629 | 1941 | 2587 | 2650 | 3044 | 4200 | 4448 | 4500 | 4622 | 4744 | 5550 | 6046 | |
| Parent | Y | D | G | T | I | T | T | FEGDEVD SSDPDKV ADVANSEPEDD |
I | L | D | S | A | K | Q | V | T | D | I | M | L | T | A | P |
| 120P | H | G | G | I | V | I | A | - | V | F | E | S | E | R | L | I | T | A | V | L | L | T | T | L |
| 200P | H | G | G | I | V | I | A | - | V | F | E | F | E | R | L | I | S | A | V | L | F | T | T | L |
표 7에 나타낸 바와 같이, QIAP1401-200주는 120내 까지 계대하면서 25개의 아미노산의 결손과 20개의 아미노산의 변이가 나타났으며, 200대까지 계대하면서 추가로 3개의 아미노산의 변이가 확인되었다.
[S, M, N, E, ORF3 구조 단백질에서 글리코실레이션 확인]
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 S, M, N, E, ORF3 구조 단백질에서 글리코실레이션을 추정하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.
| Strains | QIA1401P | QIA1401-200P | virulent DR13 | attenuated DR13 | CV777 |
| Genes | Number of N-glycosylation sites | ||||
| S | 29 | 29 | 29 | 28 | 29 |
| M | 4 | 5 | 4 | 3 | 4 |
| N | 7 | 7 | 5 | 6 | 6 |
| E | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ORF3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 3 |
| 계 | 43 | 44 | 41 | 39 | 43 |
표 8에 나타낸 바와 같이, QIAP1401-200P주는 글리코실레이션 부위가 총 1개 추가되어 44개이며, 추가된 단백질은 M 단백질로 확인되었다. QIAP1401-200P주는 다른 돼지 유행성 설사병 바이러스(virulent DR13, attenuated DR13 및 CV777)와 비교하였을 때 글리코실레이션 부위가 44개로 가장 많은 것을 확인하였다.
1-4. 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 생백신주의 확인
1-4-1. 생물학적 기법을 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 확인
베로 세포를 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 확인하였다.
[돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포 변성 효과 확인]
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포의 세포 변성 효과를 확인하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포(A)는 정상 베로 세포(B)에 비교하였을 때, 세포 변성이 일어난 것을 확인하였다.
[돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 세포질 내 특이 형광 발현 여부 확인]
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포를 고정한 후, 돼지 유행성 설사병 특이항체 및 형광 콘쥬게이트로 염색하였다. 염색된 세포의 세포질 내 특이 형광 발현 여부를 확인하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주가 감염된 베로 세포는 세포질 내에서 특이적 형광이 발현되는 것을 확인하였다.
[돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 관찰]
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 베로 세포에 감염시킨 후 증식시켰다. 증식된 바이러스를 sucrose로 정제하였다. 정제된 바이러스 QIAP1401-200주를 전자현미경으로 관찰하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 베로 세포 내에서 QIAP1401-200주는 정상적으로 증식되는 것을 확인하였다.
1-4-2. 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 최적 수확 시간 확인
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 최적 수확 시간을 확인하였다. 구체적으로, 베로 세포를 25 cm2의 배양 플라스크에 준비하였다. 준비된 베로 세포에 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-parent 및 QIAP1401-200주를 각각 접종하고 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 및 96시간 후 수확하여 바이러스 함량을 분석하였다. 본 실험의 대조군은 QIAP1401-parent를 사용하였다. 접종 후 수확 시간에 따른 바이러스 함량 분석 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주는 QIAP1401-parent주에 비해 빠른 시간(즉, 24시간)에 바이러스 함량이 가장 높은 지점(107.0 TCID50/ml)에 도달하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 QIAP1401-200주의 ORF1a 및 스파이크 유전자에 발생한 결손이 증식속도에 영향을 미친 것으로 사료된다.
1-4-3. 소화효소 처리에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 증식 확인
소화효소 처리에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주의 증식 여부를 확인하였다. 구체적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 베로 세포에 감염시켜 준비하였다. 준비된 베로 세포에 돼지 유행성 설사병 바이러스의 감염에 영향을 미치는 소화효소 3종(crystal trypsin, trypsin-EDTA 및 pancreatin)을 각각 1 μg/ml가 되도록 처리한 후, 바이러스를 증식시켰다. 증식된 바이러스를 수확한 후 바이러스 함량을 분석하였으며, 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 소화효소 처리군 중 crystal trypsin을 처리한 시험군의 바이러스 함량이 가장 높았다(10 7.0 TCID50/ml). 상기 결과는 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 다량 수확하기 위하여 소화효소 crystal trypsin을 지속적으로 처리하는 방법을 적용할 수 있음을 의미한다.
1-4-4. 유전학적 기법을 이용한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 확인
돼지 유행성 설사병 바이러스를 계대하면서 20, 40, 60대 계대주에 대하여 스파이크 유전자를 확인하였고, 120대와 200대 계대한 바이러스는 NGS로 전체 염기서열을 확인하였다고 위에서 언급하였다.
이에, 본 실시예에서는 20, 40, 60대 계대한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 스파이크 유전자를 확인하기 위하여 상기 표 3에 기록된 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하였다. 증폭 산물은 전기영동을 통해 확인하였고, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 전기영동으로 증폭산물을 확인한 결과, 예상된 위치에서 밴드가 확인되었다.
위의 증폭 산물(즉, 스파이크 유전자)을 클로닝한 후 스파이크 전체 유전자에 대한 염기서열을 결정하였다. 스파이크 유전자의 서열 분석 결과에 기초하여, 돼지 유행성 설사병 바이러스의 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다. 작성된 계통도는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, QIAP1401 parent부터 20, 40, 60, 120, 200대 계대한 바이러스는 가장 높은 근연관계를 나타내고 있으며, G2b 군에 속하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 돼지 유행성 설사병 바이러스 생백신주의 감별
2-1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 감별 프라이머 설계 및 유전자 결손이 발생한 계대수 확인
상기 실시예 1-3에서 유전체 분석을 통해, QIAP1401-200주는 ORF1a 및 스파이크 유전자에서 각각 75 및 27개의 핵산이 결손된 것을 확인하였다.
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401 parent주를 계대하면서 어느 계대에서 결손이 발생하였는지 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 결손이 확인된 ORF1a 및 스파이크 유전자 서열을 기반으로 프라이머를 설계하였다. 설계된 프라이머는 표 9 및 10에 나타내었고, 유전체 상의 프라이머의 위치는 도 11 및 12에 나타내었다.
| Name | Oligonucleotide sequence (‘5-3’) |
서열번호 | Size(bp) | Position of primer | |
| QIAP1401 -parent |
QIAP1401 -200 |
||||
| ORF1aF | GGT GGT TGG GAC GAT GTT GTT GAG | 14 | 514 | 439 | 3118- |
| ORF1aR | GCT CCA TTG CAG GGT CAT CAA CG | 15 | -3556 | ||
| Name | Oligonucleotide sequence (‘5-3’) |
서열번호 | Size(bp) | Position of primer | |
| QIAP1401 -parent |
QIAP1401 -200 |
||||
| SDF1 | GAG ATT GGC ATT TCG CAA GAG CC | 16 | 308 | 281 | S274-296 |
| SDR1 | GTC GCA ACA CGG GAC CAA TC | 17 | S562-582 | ||
| SDF2 | GGC CAA CAT CCA ACT GCT AGT GGC G | 18 | 206 | 0 | S205-229 |
| SDR2 | CAG TGG GGC CCA ATG TTT TA | 19 | S393-411 | ||
상기 표 9 및 10의 감별 프라이머를 이용하여 돼지 유행성 설사병 바이러스의 계대별 유전자 결손을 확인하였다. ORF1a 유전자의 결과는 도 13A에 나타내었고, 스파이크 유전자의 결과는 도 13B에 나타내었다.
도 13A에 나타낸 바와 같이, ORF1a 유전자는 37대에서 40대 계대 사이에서 결손이 발생한 바이러스주; 및 결손이 발생하지 않은 바이러스주;가 혼재되어 있음을 확인하였다. 41대부터는 ORF1a 유전자에 결손이 있는 바이러스만 존재하는 것을 확인하였다.
도 13B에 나타낸 바와 같이, 스파이크 유전자는 91대에서 결손이 시작되었고, 94대 이후에서는 스파이크 유전자에 결손이 있는 바이러스만 존재하는 것을 확인하였다.
2-2. 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주 감별 프라이머를 이용한 감별
상기 실시예 2-2에서 설계된 감별 프라이머로 돼지 유행성 설사병 바이러스를 감별할 수 있는지 확인하였다. 감별 실험에 사용한 돼지 유행성 설사병 바이러스주는 QIAP1401-20주(계대수 : 20), QIAP1401-60주(계대수 : 60), QIAP1401-120주(계대수 : 120) 및 QIAP1401-200주(계대수 : 200)을 사용하였다. 상기 표 9 및 10의 감별 프라이머(ORF1a 세트, SDF1R1 세트, SDF2R2 세트)로 각 바이러스주의 ORF1a 및 스파이크 유전자를 증폭하였고, 전기영동으로 밴드를 확인하였다. ORF1a 프라이머 세트, SDF1R1 세트 및 SDF2R2 세트를 이용한 전기영동 결과는 도 14 내지 16에 각각 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, ORF1a 감별 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 결과, QIAP1401-20주는 514 bp인 단편이 확인되었고, QIAP1401-40주, QIAP1401-60주, QIAP1401-120주 및 QIAP1401-200주는 439 bp인 단편이 확인되었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트(SDF1R1)를 이용하여 유전자를 증폭한 결과, QIAP1401-20주, QIAP1401-40주 및 QIAP1401-60주는 308 bp인 단편이 확인되었고, QIAP1401-200주는 281 bp인 단편이 확인되었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 스파이크 유전자의 감별 프라이머 세트(SDF2R2)를 이용하여 유전자를 증폭한 결과, QIAP1401-20주, QIAP1401-40주 및 QIAP1401-60주는 206 bp인 단편이 확인되었고, QIAP1401-200주는 증폭되지 않았다.
상기 결과는 표 9 및 10의 감별 프라이머 세트를 이용하여 QIAP1401-200주를 감별해낼 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. 돼지 유행성 설사병 바이러스 생백신주 안전성 및 효능시험
3-1. 돼지 유행성 설사병 바이러스 생건조 시험백신의 생산 및 안정성 시험
돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 베로 세포 및 1.0 μg/ml의 crystal trypsin을 이용하여 증식시켰다. 증식된 바이러스 배양액 100 ml 및 SPGG(sucrose phosphate gelatine glucose) 보호제를 혼합하여 동결건조하였다. 제조된 돼지 유행성 설사병 바이러스 생건조 시험백신은 도 17에 나타내었다.
제조된 돼지 유행성 설사병 바이러스 생건조 시험백신의 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 온도 조건(4℃, 24℃ 및 37℃)에서 생건조 시험백신의 가속시험을 실시하였으며, 그 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 4℃에서는 5일 동안 바이러스 함량이 106.0 TCID50/ml으로 변하지 않았으며, 24℃ 및 37℃에 정치 5일 후의 바이러스 함량은 각각 104.0 및 102.3 TCID50/ml 로 확인되었다.
3-2. 3일령 자돈에서 유행성 설사병 바이러스 생건조 시험백신(QIAP1401-200)의 안전성 시험
상기 실시예 3-1에서 제조된 생건조 시험백신이 자돈에 설사병을 일으키는지의 여부를 확인하였다. 구체적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체가 음성 3일령 자돈 4두를 준비하였다. 자돈 2두는 근육 접종군으로, 생건조 시험백신 1 두분(106.0 TCID50/ml) 1 ml를 근육에 접종하였다. 다른 자돈 2두는 경구 접종군으로, 생건조 시험백신 1 두분(106.0 TCID50/ml)을 1 ml씩 경구로 접종하였다. 도 19와 같이, 생건조 시험백신을 접종한 자돈은 돼지용 아이솔레이터에서 동거 사육하였다. 사육중인 자돈의 설사 유무를 매일 확인하였고, 이를 설사지수로 환산하였다. 상기 설사 지수 확인 결과는 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 경구 접종군은 접종 후 3일과 4일부터 약한 설사를 보이다가, 9일째에 정상적인 분변을 나타내었다. 근육 접종군은 4일과 5일에 약한 설사를 보이다가 8일째에 정상적인 분변을 나타났으며 폐사를 일으키지 않았다. 상기 실험 결과, 즉, 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체 음성인 3일령 자돈에서 약한 설사를 4-5일 동안 일으키고 그 후 14일까지 정상 분변을 나타낸 것은 상기 실시예 3-1에서 제조된 생건조 시험백신의 안전성을 의미한다.
생건조 시험백신 접종 14일 후, 자돈 4두를 부검하였다. 부검한 자돈의 소장을 적출하였다. 적출된 소장 시료를 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대하여 조직화학적 염색하였다. 본 실험의 양성 대조군은 야외에서 감염된 양성 시료를 이용하였다. 조직화학적 염색 결과는 도 21에 나타내었다(A : 근육 접종군, B : 경구 접종군, C : 양성 대조군).
도 21에 나타낸 바와 같이, 경구 접종군 및 근육 접종군의 소장에서는 염색된 부분이 적었다(도 21A 및 B). 반면 감염된 양성시료를 대조군으로 사용한 소장 조직(도 21C)은 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체에 강하게 반응하는 것(즉, 염색이 짙게된 것)을 확인하였다. 상기 결과는 임상 증상에서 나타난 것과 일치하는 것으로, 소장에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주가 거의 증식되지 않았음을 의미한다.
3-3. 기니픽에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 생건조 시험백신(QIAP1401-200)의 면역원성 시험
상기 실시예 3-1에서 제조된 생건조 시험백신의 면역원성을 확인하기 위하여, 기니픽 8두를 준비하였다. 4두의 기니픽에 생건조 시험백신 1두분을 2주 간격으로 2회 근육으로 접종하였고, 나머지 4두는 무처리 대조군으로 사용하였다. 생건조 시험백신 접종 4주 후에 근육 접종군 및 대조군에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액으로 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 이용한 ELISA를 실시하였다. ELISA 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 근육 접종군은 흡광도가 대조군에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다. 상기 결과는 기니픽에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주에 대한 항체가 형성되었음을 의미한다.
3-4. 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 최적 백신 프로그램
돼지 유행성 설사병을 예방하기 위하여, 생건조 백신 및 사백신과 접종 경로의 조합을 통해 최적 예방 프로그램의 제시가 필요하다. 3종 백신 프로그램을 설계하고, 돼지 유행성 설사병 예방을 위한 백신 프로그램을 선정하였다.
구체적으로, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체가 없는 4주령 자돈 24두를 준비하였다. 3종의 백신 프로그램에 사용한 생백신은 상기 실시예 3-1에서 제조된 생건조 시험백신이며, 사백신은 QIAP1401-200주를 불활화하여 몬타나이드 IMS1313 에쥬번트가 30% 함유된 백신을 준비하였으며, 경구백신은 QIAP1401-200주를 사용하였다. 상기 3종의 백신 프로그램은 다음과 같다.
- 생백신-생백신-사백신(live-live-killed vaccine: LLK)
- 생백신-사백신-사백신(live-killed-killed vaccine: LKK)
- 경구백신-생백신-사백신(oral-live-killed vaccine: OLK)
LLK, LKK, OLK, 대조군(NVC: non-vaccinated control) 각각 6두에 2주 간격으로 1두분(생백신은 1 ml, 불활화 백신은 2 ml, 경구백신은 1 ml)을 프로그램에 맞게 접종하였다. 백신 3차 접종 후 2주에 강병원성을 나타내는 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-10주(105.0 TCID50/ml)를 각각 경구로 공격 접종하였다. 공격 접종 후 14일 동안 임상증상을 관찰하였으며, 분변을 채취하였다. 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 항체를 측정하기 위하여 접종 전, 0 14, 28, 42, 56일에 각각 채혈하고 중화 항체가를 측정하였다. 중화 항체가를 측정한 결과는 도 23에 나타내었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 3종의 백신 프로그램을 적용한 돼지는 1차, 2차, 3차 및 공격 접종 후까지 평균 항체가에 있어서 큰 차이를 나타내지 않았고 1차 접종 후는 약 16배, 2차 접종 후는 약 32-64배, 3차 접종 후는 약 64배-128배의 항체가를 나타내었다. 반면, 대조군(NVC)은 중화항체가가 4배 이하였다. 공격 접종 후 14일 째의 중화항체가는 대조군이 가장 낮았고(약 64배), 백신접종 프로그램을 적용한 돼지는 128배였다.
3종의 백신접종 프로그램을 적용한 후 공격 접종한 돼지의 임상증상을 확인한 결과는 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 3종의 백신 프로그램을 적용한 그룹 중에서 LLK 그룹이 공격 접종 후 9일째에서 설사를 시작하여 14일에 끝이 났다. LKK 및 OLK 그룹은 각각 6일, 8일부터 시작하여 14일까지 설사를 보였으며 설사의 정도도 LLK 그룹 보다 심하였다. 반면에, 대조군은 5일 째에 설사를 시작하여 14일까지도 지속적으로 설사하였다.
3종의 백신접종 프로그램을 적용하고 공격접종 한 돼지의 분변에서 돼지 유행성 설사병 바이러스 유전자 검출 시험을 실시하였고, 그 결과는 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타낸 바와 같이, LLK 그룹은 9일부터 11일까지 분변 내 유전자가 4일간 검출되었고 그 이후에는 검출되지 않았으나, 대조군은 4일부터 14일까지 확인되었다.
상기 임상증상 관찰 및 바이러스 유전자 검출 시험 결과, 돼지 유행성 설사병의 예방 및 경감을 위한 최적 백신 프로그램은 LLK인 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 물리·화학적 자극을 가하여 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401주를 배양함으로써 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주를 제작하였다. 상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주는 베로 세포에서 대량 증식이 가능하고, 유전자 결손 및 변이로 인해 야외주와 감별이 가능하다는 장점이 있다. 또한 상기 QIAP1401-200주는 최근 유행하는 돼지 유행성 설사병 바이러스와 동일한 G2b 그룹에 속하여, G1 그룹의 생/불활화 백신의 문제점; 및 G2 그룹의 불활화 백신의 예방 효과의 문제점;을 개선할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200주는 돼지 유행성 설사병 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
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<120> Novel porcine epidemic diarrhea virus and vaccine composition for
preventing porcine epidemic diarrhea using the same
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<212> RNA
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 1
tttctatcta cggatagtta gctctttttc tagactcttg tctactcaat tcaactaaac 60
gaaattttgt ccttccggcc gcatgtccat gctgctggaa gctgacgtgg aatttcatta 120
ggtttgctta agtagccatc gcaagtgctg tgctgtcctc tagttcctgg ttggcgttcc 180
gtcgccttct acatactaga caaacagcct tcctccggtt ccgtctgggg gttgtgtgga 240
taactagttc cgtctagttt gaaaccagta actgtcggct atggctagca accatgttac 300
attggctttt gccaatgatg cagaaatttc agcttttggc ttttgcactg ctagtgaagc 360
cgtctcatac tattctgagg ccgccgctag tggatttatg caatgccgtt tcgtgtcctt 420
cgatctcgct gacactgttg agggattgct tcccgaagac tatgtcatgg tggtggtcgg 480
cactaccaag cttagtgcgt atgtggacac ttttggtagc cgccccaaaa acatttgtgg 540
ttggctgtta ttttctaact gtaattactt cctcgaagag ttagagctta cttttggtcg 600
tcgtggtggt aacatcgtgc cagttgacca atacatgtgt ggcgctgacg gtaaacctgt 660
tcttcaggaa tccgaatggg agcacacaga tttctttgct ggctccgaag acggtcaact 720
caacattgct ggtatcactt atgtgaaggc ctggattgta gagcgatcgg atgtctctta 780
tgcgagtcag aatttaacat ctattaagtc tattacttac tgttcaacct atgagcatac 840
ttttcctgat ggtactgcca tgaaggttgc acgtactcca aagattaaga agactgttgt 900
cttgtctgag ccacttgcta ctatctacag ggaaattggt tctccttttg tggataatgg 960
gagcgatgct cgttctatca ttaagagacc agtgttcctc cacgcttttg ttaagtgtaa 1020
gtgtggtagt tatcattgga ctgttggtga ttggacttcc tatgtctcca cttgctgtgg 1080
ctttaagtgt aagccagtcc ttgtggcttc atgctctgct acgcctggtt ctgttgtggt 1140
tacgcgcgct ggtgctggca ctggtgttaa gtattacaac aacatgttcc tgcgccatgt 1200
ggcagacatt gatgggttgg cattctggcg aattctcaag gtgcagtcca aagacgacct 1260
cgcttgctct ggtaaattcc ttgaacacca tgaggaaggt ttcacagatc cttgctactt 1320
tttgaatgac tcgagcattg ctactaagct caagtttgac atccttagtg gcaagttttc 1380
tgatgaagtc aaacaagcta tctttgctgg tcatgttgtt gttggcagcg cgctcgttga 1440
cattgttgac gatgcactgg gacagccttg gtttatacgt aagcttggtg accttgcaag 1500
tgcagcttgg gagcagctta aggctgtcgt tagaggcctt aacctcttgt ctgatgaggt 1560
cgtgctcttt ggcaaaagac ttagctgtgc cattcttagt atcgttaacg gtgtttttga 1620
gttcatcgcc gaagtgcctg agaagttggc tgcggctgtt acagtttttg tcaacttctt 1680
gaatgagctt tttgagtctg cctgtgactg cttaaaggtc ggaggtaaaa cctttaacaa 1740
ggttggctct tatgttcttt ttgacaacgc attggttaag cttgtcaagg caaaagttcg 1800
cggcccacga caggcaggtg tttgtgaagt tcgttacaca agccttgttg ttgggagtac 1860
taccaaggtg gtttccaagc gcgttgaaaa tgccaatgtg aatctcgtcg tcgttgacga 1920
ggatgtgact ctcaacacca ttggtcgtac agttgttgtt gacggacttg cattcttcga 1980
gagtgacggg ttttacagac atcttgctga tgctgacgtt gtcattgaac atcctgttta 2040
taagtctgct tgtgagctca agccagtttt tgagtgtgac ccaatacctg attttcctat 2100
gcctgtggcc gctagtgttg cagagctttg tgtgcaaact gatctgttgc ttaaaaatta 2160
caacactcct tataaaactt acagctgcgt tgtgagaggt gataagtgtt gcatcacttg 2220
caccttacat atcacagcac caagttatat ggaggatgct gctaattttg tagacctctg 2280
tgccaagaac attggtactg ctggttttca tgagttttac attacggccc atgaacaaca 2340
ggatctgcaa gggttcgtaa ccacttgttg cacgatgtca ggttttgagt gttttatgcc 2400
tataatccca cagtgtccag cagtgcttga agagattgat ggtggtagca tctggcggtc 2460
ttttatcact ggtcttaata caatgtggga tttttgcaag catcttaaag tcagctttgg 2520
actagatggc attgttgtca ctgtagcacg caaatttaaa cgacttggtg ctctcttggc 2580
agaaatgtat aacacttacc tttcaactgt ggtggaaaac ttggtactgg ccggtgttag 2640
cttcaagtat tatgccacca gtgtcccaaa aattgttttg ggctgttgtt ttcacagtgt 2700
taaaagtgtt cttgcaagtg ccttccagat tcctgtccaa gcaggcattg agaagtttaa 2760
agtcttcctt aactgtgttc accctgttgt accacgcgtt attgaaactt cttttgtgga 2820
attagaagag acgacattta aaccaccagc actcaatggt agtattgcta ttgttgatgg 2880
ctttgctttc tattatgatg gaacactata ctatcccacc gatggtaata gtgttgtgcc 2940
tatttgtttt aagaagaagg gtggtggtga tgtcaaattc tctgatgaag tctctgttag 3000
aaccattgac ccagtttata aggtctccct tgaatttgag ttcgagtctg agactattat 3060
ggctgtgctt aataaggctg ttggtaatcg tatcaaggtt acaggtggtt gggacgatgt 3120
tgttgagtat atcaacgtcg ccattgaggt tcttaaagat catatcgatg tgcctaagta 3180
ctacatctat gatgaggaag gtggcaccga tcctaatctt cccgtaatgg tttctcagtg 3240
gccgttgaat gatgacacga tctcacagga tctgcttgat gtggaagttg ttactgatgc 3300
accaattgat ggtcctaatg tagctcctga aacaaatgta gagtctgaag ttgaggaaat 3360
tgccgcaacc ttgtctttta ttaaagatac accttccaca gttactaagg atccttttgc 3420
ttttgacttt gcaagctatg gaggacttaa ggttttaaga caatctcata acaactgctg 3480
ggttacttct accttggtgc agctacaatt gcttggcatc gttgatgacc ctgcaatgga 3540
gctttttagt gctggtagag ttggtccaat ggttcgcaaa tgctatgagt cacaaaaggc 3600
tatcttggga tctttgggtg atgtgtcggc ttgcctagag tctctgacta aggacctaca 3660
cacacttaag attacctgtt ctgtagtctg tggttgtggt actggtgaac gtatctatga 3720
gggttgtgct tttcgtatga cgccaacttt ggaaccgttc ccatatggtg cttgtgctca 3780
gtgtgctcaa gttttgatgc acacttttaa aagtgttgtt ggcaccggca tcttttgtcg 3840
agatactact gctctctcct tggattcttt ggttgtaaaa cctctttgtg cggctgcttt 3900
tataggcaag gacagtggtc attatgtcac taacttttat gatgctgcta tggctattga 3960
tggttatggt cgtcatcaga taaagtatga cacactgaac actatttgtg ttaaagacgt 4020
taattggaca gcaccttttg tccctgacgt tgagcctgta ttggagcctg ttgtcaaacc 4080
gttctattct tataagaatg ttgattttta ccaaggagat tttagtgacc ttgttaaatt 4140
tccatgtgac tttgttgtta atgctgcaaa tgagaatttg tctcacggtg gcggcatagc 4200
aaaggccatt gatgtttata ccaagggcat gttgcagaag tgctcgaatg attacattaa 4260
agcacacggt cccattaaag ttggacgtgg tgtcatgttg gaggcattag gtcttaaggt 4320
ctttaatgtt gttggtccac gtaagggtaa gcatgcacct gagcttcttg ttaaggctta 4380
taagtccgtt tttgctaatt caggtgttgc tcttacacct ttgattagtg ttggaatttt 4440
tagtgttcct ttggaagaat ctttatctgc ttttcttgca tgtgttggtg agcgccactg 4500
taagtgcttt tgttatagtg acaaagagcg cgaggcgatc attaattaca tggatggctt 4560
ggtagatgct attttcaaag atgcacttgt tgatactact cctgtccagg aagatgttca 4620
acaagtttca caaaaaccag ttttgcctaa ttttgaacct ttcaggattg aaggtgctca 4680
tgctttctat gagtgcaacc ctgaaggttt gatgtcatta ggtgctgaca agctggtgtt 4740
gtttacaaat tccaatttgg atttttgtag cgttggtaag tgtcttaaca atgtgactgg 4800
cggtgcattg cttgaagcca taaatgtatt taaaaagagt aacaaaacag tgcctgctgg 4860
caactgtgtt acttttgagt gtgcagatat gatttttatt actatggtag tattgccatc 4920
tgacggtgat gctaattatg acaaaaatta tgcacgcgcc gtcgtcaagg tatctaagct 4980
taaaggcaag ttattgcttg ctgttggtga tgccatgttg tattccaagt tgtcccacct 5040
cagcgtgtta ggtttcgtat ccacacctga tgatgtggag cgtttctacg aaaataagag 5100
tgtggttatt aaagttactg aggatacacg tagtgttaag actgttaaag tagaatccac 5160
tgttacttat ggacaacaaa ttggaccttg tcttgttaat gacaccgttg tcacagacaa 5220
caaacctgtt gttgctgatg ttgtagctaa ggttgtacca agtgctaatt gggattcaca 5280
ttatggtttt gataaggctg gtgagttcca catgctagac catactgggt ttgcctttcc 5340
tagtgaagtt gttaacggta ggcgtgtgct taaaaccaca gataataact gttgggttaa 5400
tgttacatgt ttacaattac agtttgctag atttaggttc aagtcagcag gtctacaggc 5460
tatgtgggag tcctattgta ctggtgatgt tgctatgttt gtgcattggt tgtactggct 5520
tacgggtgtt gacaaaggtc agcctagtga ttcagaaaat gcacttaaca tgttgtctaa 5580
gtacattgtt cctgctggtt ctgtcactat tgaacgtgtc acgcatgacg gttgttgttg 5640
tagtaagcgt gttgtcactg caccagttgt gaatgctagc gtgttgaagc ttggcgtcga 5700
ggatggtctt tgtccacatg gtcttaacta cattgacaaa gttgttgtag ttaaaggtac 5760
tacaattgtt gtcaatgttg gaaaacctgt agtggcacca tcgcacctct ttcttaaggg 5820
tgtttcctac acaacattcc tagataatgg taacggtgtt gccggccatt atactgtttt 5880
tgatcatgac actggtatgg tgcatgatgg agatgttttt gtaccaggtg atctcaatgt 5940
gtctcctgtt acaaatgttg tcgtctcaga gcagacggct gttgtgatta aagaccctgt 6000
gaagaaagta gagttagacg ctacaaggct gttagacact atgaattatg catcggaaag 6060
attcttttcc tttggtgatt ttatgtcacg taatttaatt acagtgtttt tgtacatcct 6120
tagtattttg ggtctctgtt ttagggcctt tcgtaagagg gatgttaaag ttctagctgg 6180
tgtaccccaa cgtactggta ttatattgcg taaaagtgtg cgctataatg caaaggcttt 6240
gggtgtcttc ttcaagctaa aactttattg gttcaaagtt cttggtaagt ttagtttggg 6300
tatttatgca ttgtatgcat tactattcat gacaatacgc tttacaccta taggtggccc 6360
tgtttgtgat gatgttgttg ctggttatgc taattctagt tttgacaaga atgagtattg 6420
caacagtgtt atttgtaagg tctgtctcta tgggtaccag gaactttcgg acttctctca 6480
cacacaggta gtatggcaac accttagaga cccattaatt ggtaatgtga tgcctttctt 6540
ttatttggca tttctggcaa tttttggggg tgtttatgta aaggctatta ctctctattt 6600
tattttccat tatcttaaca tacttggtgt gtttttgggc ctacaacagt ccatttggtt 6660
tttgcagctt gtgccttttg atgtctttgg tgacgagatc gttgtctttt tcatcgttac 6720
acgcgtattg atgttcctta agcatgtttt ccttggctgc gataaggcat cttgtgtggc 6780
ttgctctaag agtgctcgcc ttaagcgcgt tcctgtccag actatttttc agggtactag 6840
caaatccttc tacgtacatg ccaatggtgg ttctaagttc tgtaagaagc acaatttctt 6900
ttgtttaaat tgtgactctt atggtccagg ctgcactttt attaatgacg tcattgcaac 6960
tgaagttggt aatgttgtca aacttaatgt gcaaccgaca ggtcctgcca ctattcttat 7020
tgacaaggtt gaattcagta atggttttta ctatctttat agtggtgaca cattttggaa 7080
gtacaacttt gacataacag ataacaaata cacttgcaaa gagtcactta aaaattgtag 7140
cataatcaca gactttattg tttttaacaa taatggttcc aatgtaaatc aggttaagaa 7200
tgcatgtgtg tatttttcac agatgctttg taaacctgtt aagttagtgg actcagcgtt 7260
gttggccagt ttgtctgttg attttggtgc aagcttacat agtgcttttg ttagtgtgtt 7320
gtcgaatagt tttggcaaag acctgtcaag ttgtaatgac atgcaggatt gcaagagcac 7380
attgggtttt gatgatgtac cattggatac ctttaatgct gctgttgctg aggctcatcg 7440
ttacgatgtc ctcttgactg acatgtcgtt caacaatttt accaccagtt atgcaaaacc 7500
agaggaaaaa cttcccgtcc atgacattgc cacgtgtatg cgtgtaggtg ccaagattgt 7560
taatcataac gttcttgtca aggatagtat acctgtggta tggcttgtac gtgatttcat 7620
tgccctttct gaagaaacta ggaagtacat tattcgtacg actaaagtta agggtataac 7680
cttcatgttg acctttaatg attgtcgtat gcatactacc atacctactg tttgcattgc 7740
aaataagaag ggtgcaggtc ttcctagttt ttcaaaggtt aagaaattct tctggttttt 7800
gtgtctgttt atagttgctg ttttctttgc actaagcttt tttgatttta gtactcaggt 7860
tagcagtgat agtgattatg acttcaagta tattgagagt ggccagttga agacttttga 7920
caatccactt agttgtgtgc ataatgtctt tagtaacttc gacctgtggc atgatgccaa 7980
gtttggtttc acccccgtca acaatcctag ttgtcctata gtcgttggtg tatcagacga 8040
agcgcgcact gttccaggta tcccagcagg tgtttattta gctggtaaaa cacttgtttt 8100
tgctattaac accatttttg gtacatctgg tttgtgcttt gatgctagtg gcattgctga 8160
taagggcgct tgcattttta attcggcttg caccacatta tctggtttgg gtggaactgc 8220
tgtctactgt tataagaatg gtctagttga aggtgctaaa ctttatagtg agttggcacc 8280
tcatagctac tataaaatgg tagatggtaa tgctgtgtct ttacctgaaa ttatctcacg 8340
cggctttggc atccgtacta tccgtacaaa ggctatgacc tactgtcgcg ttggccagtg 8400
tgtgcaatct gcagaaggtg tttgttttgg cgccgataga ttctttgtct ataatgcaga 8460
atctggttct gactttgttt gtggcacagg gctctttaca ttgttgatga acgttattag 8520
tgttttttcc aagacagtac cagtaactgt gttgtctggt caaatacttt ttaattgcat 8580
tattgctttt gctgctgttg cggtgtgttt cttatttaca aagtttaagc gcatgttcgg 8640
tgatatgtct gttggcgttt tcactgtcgg tgcttgtact ttgttgaaca atgtttccta 8700
cattgtaaca cagaacacac ttggcatgtt gggctatgca actttgtact ttttgtgcac 8760
taaaggtgtt agatatatgt ggatttggca tttgggattt ttgatctcat atatacttat 8820
tgcaccatgg tgggttttga tggtttatgc cttttcagcc atttttgagt ttatgcctaa 8880
cctttttaag cttaaggttt caacacaact ttttgagggt gacaagttcg taggctcttt 8940
tgaaaatgct gcagcaggta catttgtgct tgatatgcat gcctatgaga gacttgccaa 9000
ctctatctca actgaaaaac tgcgtcagta tgctagtact tacaataagt acaagtatta 9060
ttcaggcagt gcttcagagg ctgattacag gcttgcttgt tttgcccatt tggccaaggc 9120
tatgatggat tatgcttcta atcacaacga cacgttatac acaccaccca ctgtgagtta 9180
caattcaact ctacaggctg gcttgcgtaa gatggcacaa ccatctggtg ttgttgagaa 9240
gtgcatagtt cgtgtttgct atggtaatat ggctcttaat ggcctatggc ttggtgatac 9300
tgttatctgc ccacgccatg ttatagcgtc tagtattact agcactatag attatgacta 9360
tgccctttct gttttacgcc tccacaactt ctccatttca tctggtaatg ttttcctagg 9420
tgttgtgggt gtaaccatgc gaggtgcttt gttgcagata aaggttaatc aaaacaatgt 9480
ccacacgcct aagtacacct atcgcacagt tagaccgggt gaatctttta atatcttggc 9540
gtgctatgat ggttctgcag ctggtgttta cggcgttaac atgcgctcta attacactat 9600
tagaggctcg ttcattaatg gcgcttgtgg ttcacctggt tataacatta acaatggtac 9660
cgttgagttt tgctatttac accagcttga acttggttca ggctgtcatg ttggtagcga 9720
cttagatggt gttatgtatg gtggttatga ggaccaacct actttgcaag ttgaaggcgc 9780
tagtagtctg tttacagaga atgtgttggc atttctttat gcagcactca ttaatggttc 9840
tacctggtgg cttagttctt ctaggattgc tgtagacagg tttaatgagt gggctgttca 9900
taatggtatg acaacagtag ttaatactga ttgcttttct attcttgctg ctaagactgg 9960
tgttgatgta caacgtttgt tggcctcaat ccagtctctg cataagaatt ttggtggaaa 10020
gcaaattctt ggctatacct cgttgacaga tgagtttact acaggtgaag ttatacgtca 10080
aatgtatggc gttaatcttc agagtggtta tgtttcacgc gcctgtagaa atgtcttgct 10140
ggttggttct tttctgactt tcttttggtc agaattagtt tcctacacta agttcttttg 10200
ggtaaatcct ggttatgtca cacctatgtt tgcgtgtttg tcattgctgt cctcactttt 10260
gatgttcaca ctcaagcata agacattgtt tttccaggtc tttctaatac ctgctctgat 10320
tgttacatct tgcattaatt tggcatttga tgttgaagtc tacaactatt tggcagagca 10380
ttttgattac catgtttctc tcatgggttt taatgcacaa ggtcttgtta acatctttgt 10440
ctgctttgtt gttaccattt tacacggcac atacacatgg cgctttttta acacacctgt 10500
gagttctgtc acttatgtgg tagctttgct gactgcggca tataactatt tttacgctag 10560
tgacattctt agttgtgcta tgacactatt tgctagtgtg actggcaact ggttcgttgg 10620
tgctgtttgt tataaagctg ctgtttatat ggccttgaga tttcctactt ttgtggctat 10680
ttttggtgat attaagagtg ttatgttctg ttaccttgtg ttgggttatt ttacctgttg 10740
cttctacggt attctctact ggttcaacag gttttttaag gttagtgtag gtgtctatga 10800
ctatactgtt agtgctgctg agtttaagta tatggttgct aacggcctac gtgcaccaac 10860
tggaacactt gattcactac ttctgtctgc caaattgatt ggtattggtg gtgagcggaa 10920
tattaagatt tcttccgttc agtctaaact gactgatatt aagtgtagta acgttgtgct 10980
tttaggctgt ctctctagca tgaatgtctc agcaaattca acagaatggg cctattgtgt 11040
tgacttgcat aacaagatca acttgtgtaa tgacccagaa aaagcgcagg aaatgctact 11100
tgctttgttg gcatttttcc ttagtaagaa tagtgctttt ggtttagatg acttattgga 11160
atcctatttt aatgacaata gtatgttgca gagtgttgca tctacttatg tcggtttgcc 11220
ttcttatgtc atttatgaaa atgcacgcca acagtatgaa gatgctgtta ataatggttc 11280
tccacctcag ttggttaagc aattgcgcca tgccatgaat gtagcaaaga gcgaatttga 11340
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gtacaaagag gcacgagcag ttaataggaa gtccaaagtt gtaagtgcta tgcattcact 11460
gctttttggt atgttgagac gtttggacat gtcttctgta gacaccattc tcaacttggc 11520
aaaggatggg gttgtacctc tgtctgtcat accggcagtc agtgctacta agcttaacat 11580
tgttacttct gatatcgatt cttataatcg tatccagcgt gagggatgtg tccactacgc 11640
tggtaccatt tggaatataa ttgatatcaa ggacaatgat ggcaaggtgg tacacgttaa 11700
ggaggtaacc gcacagaatg ctgagtccct gtcatggccc ctggtccttg ggtgtgagcg 11760
tattgtcaag ctccagaata atgaaattat tcctggtaag ctgaagcagc gctccattaa 11820
ggcagaagga gatggcatag ttggagaagg taaggcactt tacaataatg agggtggacg 11880
tacttttatg tatgctttca tctcggacaa accggacctg cgtgtagtca agtgggagtt 11940
cgatggtggt tgtaacacta ttgagctaga accaccacgt aagttcttgg tggattctcc 12000
taatggtgca cagatcaagt atctctactt tgttcgtaac cttaacacgt tacgtagggg 12060
tgctgttctc ggctacatag gtgccactgt acgcttgcag gctggtaaac aaacagaaca 12120
ggctattaac tcttcattgt tgacactttg cgctttcgct gtggatcctg ctaagaccta 12180
catcgatgct gtcaaaagtg gtcacaaacc agtaggtaac tgtgttaaga tgttggccaa 12240
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aataaagtct ggtttgaccc tgttgaaaat gaagacattc atcgtgtcta tgcattgtta 13020
ggtaccattg tttcacgtgc tatgcttaaa tgcgttaagt tctgtgatgc aatggttgaa 13080
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tccactacta tacctattac ggcatttgga cctttgtgtc gcaagtgttg gattgatggt 13500
gttccactgg taactacagc tggttatcat tttaaacagt taggtgtagt ttggaacaat 13560
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gttgcagcgc taggtacagg tttgactaac cagactgtta aacctggcca tttcaataag 13740
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cgctattttg atatttacga aggtggttgt atcactgcta aagaggtggt tgttacaaac 13980
cttaacaaga gcgcaggtta tcctttgaac aagtttggta aagctggtct ttactatgag 14040
tctttatcct atgaggaaca ggatgaattt tatgcttata ctaagcgtaa catcctgccc 14100
actatgacac agctcaacct taaatatgct ataagtggca aagaacgtgc acgcacagtg 14160
ggtggtgttt cgcttttgtc aaccatgact actcggcagt atcatcagaa acaccttaag 14220
tccatagtta atactagggg cgcttcggtt gttattggta ctactaagtt ttatggtggt 14280
tgggacaata tgcttaagaa ccttattgat ggtgttgaaa atccgtgtct tatgggttgg 14340
gactacccaa agtgcgacag agcactgccc aatatgatac gtatgatttc agccatgatt 14400
ttaggctcta agcacaccac atgctgcagt tccactgacc gctttttcag gttgtgcaat 14460
gaattggctc aagtccttac tgaggttgtt tattctaatg gaggttttta tttgaagcca 14520
ggtggtacta cctctggtga tgcaaccacc gcatatgcaa actcagtttt taatatcttc 14580
caagcagtaa gtgccaatgt taacaaactt cttagtgttg acagcaatgt ctgtcataat 14640
ttagaagtta agcaattgca gcgtaagctt tacgagtgct gttatagatc aactaccgtc 14700
gatgaccagt tcgtcgttga gtattatggt tacttgcgta aacatttttc aatgatgatt 14760
ctttctgatg atggcgttgt ttgttataac aatgactatg catcacttgg ttatgtcgct 14820
gatcttaacg cattcaaggc tgttttgtat taccagaaca atgtcttcat gagcgcctct 14880
aaatgttgga tcgagcctga cattaataaa ggtcctcatg aattttgttc gcagcatact 14940
atgcagattg tcgataaaga tggtacttat taccttcctt accctgatcc ttcaagaatt 15000
ctctctgcag gtgtgtttgt tgatgacgtt gttaaaactg atgcagttgt attgcttgaa 15060
cgttatgtgt cattggctat agatgcctac ccgttatcta agcatgaaaa ccctgaatat 15120
aagaaggtgt tttatgtgct tttggattgg gttaagcatc tgtacaaaac tcttaatgct 15180
ggtgtgttag agtctttttc tgtcacactt ttggaagatt ctactgctaa attctgggat 15240
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gttgtttgtg gctctcaaac tgttttacgt tgtggtgatt gtctacggcg tcctatgctt 15360
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aacctcttgt ctgatgaggt cgtgctcttt ggcaaaagac ttagctgtgc cattcttagt 1320
atcgttaacg gtgtttttga gttcatcgcc gaagtgcctg agaagttggc tgcggctgtt 1380
acagtttttg tcaacttctt gaatgagctt tttgagtctg cctgtgactg cttaaaggtc 1440
ggaggtaaaa cctttaacaa ggttggctct tatgttcttt ttgacaacgc attggttaag 1500
cttgtcaagg caaaagttcg cggcccacga caggcaggtg tttgtgaagt tcgttacaca 1560
agccttgttg ttgggagtac taccaaggtg gtttccaagc gcgttgaaaa tgccaatgtg 1620
aatctcgtcg tcgttgacga ggatgtgact ctcaacacca ttggtcgtac agttgttgtt 1680
gacggacttg cattcttcga gagtgacggg ttttacagac atcttgctga tgctgacgtt 1740
gtcattgaac atcctgttta taagtctgct tgtgagctca agccagtttt tgagtgtgac 1800
ccaatacctg attttcctat gcctgtggcc gctagtgttg cagagctttg tgtgcaaact 1860
gatctgttgc ttaaaaatta caacactcct tataaaactt acagctgcgt tgtgagaggt 1920
gataagtgtt gcatcacttg caccttacat atcacagcac caagttatat ggaggatgct 1980
gctaattttg tagacctctg tgccaagaac attggtactg ctggttttca tgagttttac 2040
attacggccc atgaacaaca ggatctgcaa gggttcgtaa ccacttgttg cacgatgtca 2100
ggttttgagt gttttatgcc tataatccca cagtgtccag cagtgcttga agagattgat 2160
ggtggtagca tctggcggtc ttttatcact ggtcttaata caatgtggga tttttgcaag 2220
catcttaaag tcagctttgg actagatggc attgttgtca ctgtagcacg caaatttaaa 2280
cgacttggtg ctctcttggc agaaatgtat aacacttacc tttcaactgt ggtggaaaac 2340
ttggtactgg ccggtgttag cttcaagtat tatgccacca gtgtcccaaa aattgttttg 2400
ggctgttgtt ttcacagtgt taaaagtgtt cttgcaagtg ccttccagat tcctgtccaa 2460
gcaggcattg agaagtttaa agtcttcctt aactgtgttc accctgttgt accacgcgtt 2520
attgaaactt cttttgtgga attagaagag acgacattta aaccaccagc actcaatggt 2580
agtattgcta ttgttgatgg ctttgctttc tattatgatg gaacactata ctatcccacc 2640
gatggtaata gtgttgtgcc tatttgtttt aagaagaagg gtggtggtga tgtcaaattc 2700
tctgatgaag tctctgttag aaccattgac ccagtttata aggtctccct tgaatttgag 2760
ttcgagtctg agactattat ggctgtgctt aataaggctg ttggtaatcg tatcaaggtt 2820
acaggtggtt gggacgatgt tgttgagtat atcaacgtcg ccattgaggt tcttaaagat 2880
catatcgatg tgcctaagta ctacatctat gatgaggaag gtggcaccga tcctaatctt 2940
cccgtaatgg tttctcagtg gccgttgaat gatgacacga tctcacagga tctgcttgat 3000
gtggaagttg ttactgatgc accaattgat ggtcctaatg tagctcctga aacaaatgta 3060
gagtctgaag ttgaggaaat tgccgcaacc ttgtctttta ttaaagatac accttccaca 3120
gttactaagg atccttttgc ttttgacttt gcaagctatg gaggacttaa ggttttaaga 3180
caatctcata acaactgctg ggttacttct accttggtgc agctacaatt gcttggcatc 3240
gttgatgacc ctgcaatgga gctttttagt gctggtagag ttggtccaat ggttcgcaaa 3300
tgctatgagt cacaaaaggc tatcttggga tctttgggtg atgtgtcggc ttgcctagag 3360
tctctgacta aggacctaca cacacttaag attacctgtt ctgtagtctg tggttgtggt 3420
actggtgaac gtatctatga gggttgtgct tttcgtatga cgccaacttt ggaaccgttc 3480
ccatatggtg cttgtgctca gtgtgctcaa gttttgatgc acacttttaa aagtgttgtt 3540
ggcaccggca tcttttgtcg agatactact gctctctcct tggattcttt ggttgtaaaa 3600
cctctttgtg cggctgcttt tataggcaag gacagtggtc attatgtcac taacttttat 3660
gatgctgcta tggctattga tggttatggt cgtcatcaga taaagtatga cacactgaac 3720
actatttgtg ttaaagacgt taattggaca gcaccttttg tccctgacgt tgagcctgta 3780
ttggagcctg ttgtcaaacc gttctattct tataagaatg ttgattttta ccaaggagat 3840
tttagtgacc ttgttaaatt tccatgtgac tttgttgtta atgctgcaaa tgagaatttg 3900
tctcacggtg gcggcatagc aaaggccatt gatgtttata ccaagggcat gttgcagaag 3960
tgctcgaatg attacattaa agcacacggt cccattaaag ttggacgtgg tgtcatgttg 4020
gaggcattag gtcttaaggt ctttaatgtt gttggtccac gtaagggtaa gcatgcacct 4080
gagcttcttg ttaaggctta taagtccgtt tttgctaatt caggtgttgc tcttacacct 4140
ttgattagtg ttggaatttt tagtgttcct ttggaagaat ctttatctgc ttttcttgca 4200
tgtgttggtg agcgccactg taagtgcttt tgttatagtg acaaagagcg cgaggcgatc 4260
attaattaca tggatggctt ggtagatgct attttcaaag atgcacttgt tgatactact 4320
cctgtccagg aagatgttca acaagtttca caaaaaccag ttttgcctaa ttttgaacct 4380
ttcaggattg aaggtgctca tgctttctat gagtgcaacc ctgaaggttt gatgtcatta 4440
ggtgctgaca agctggtgtt gtttacaaat tccaatttgg atttttgtag cgttggtaag 4500
tgtcttaaca atgtgactgg cggtgcattg cttgaagcca taaatgtatt taaaaagagt 4560
aacaaaacag tgcctgctgg caactgtgtt acttttgagt gtgcagatat gatttttatt 4620
actatggtag tattgccatc tgacggtgat gctaattatg acaaaaatta tgcacgcgcc 4680
gtcgtcaagg tatctaagct taaaggcaag ttattgcttg ctgttggtga tgccatgttg 4740
tattccaagt tgtcccacct cagcgtgtta ggtttcgtat ccacacctga tgatgtggag 4800
cgtttctacg aaaataagag tgtggttatt aaagttactg aggatacacg tagtgttaag 4860
actgttaaag tagaatccac tgttacttat ggacaacaaa ttggaccttg tcttgttaat 4920
gacaccgttg tcacagacaa caaacctgtt gttgctgatg ttgtagctaa ggttgtacca 4980
agtgctaatt gggattcaca ttatggtttt gataaggctg gtgagttcca catgctagac 5040
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gataataact gttgggttaa tgttacatgt ttacaattac agtttgctag atttaggttc 5160
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gtgcattggt tgtactggct tacgggtgtt gacaaaggtc agcctagtga ttcagaaaat 5280
gcacttaaca tgttgtctaa gtacattgtt cctgctggtt ctgtcactat tgaacgtgtc 5340
acgcatgacg gttgttgttg tagtaagcgt gttgtcactg caccagttgt gaatgctagc 5400
gtgttgaagc ttggcgtcga ggatggtctt tgtccacatg gtcttaacta cattgacaaa 5460
gttgttgtag ttaaaggtac tacaattgtt gtcaatgttg gaaaacctgt agtggcacca 5520
tcgcacctct ttcttaaggg tgtttcctac acaacattcc tagataatgg taacggtgtt 5580
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gtaccaggtg atctcaatgt gtctcctgtt acaaatgttg tcgtctcaga gcagacggct 5700
gttgtgatta aagaccctgt gaagaaagta gagttagacg ctacaaggct gttagacact 5760
atgaattatg catcggaaag attcttttcc tttggtgatt ttatgtcacg taatttaatt 5820
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cgctataatg caaaggcttt gggtgtcttc ttcaagctaa aactttattg gttcaaagtt 6000
cttggtaagt ttagtttggg tatttatgca ttgtatgcat tactattcat gacaatacgc 6060
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gaactttcgg acttctctca cacacaggta gtatggcaac accttagaga cccattaatt 6240
ggtaatgtga tgcctttctt ttatttggca tttctggcaa tttttggggg tgtttatgta 6300
aaggctatta ctctctattt tattttccat tatcttaaca tacttggtgt gtttttgggc 6360
ctacaacagt ccatttggtt tttgcagctt gtgccttttg atgtctttgg tgacgagatc 6420
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tgtaagaagc acaatttctt ttgtttaaat tgtgactctt atggtccagg ctgcactttt 6660
attaatgacg tcattgcaac tgaagttggt aatgttgtca aacttaatgt gcaaccgaca 6720
ggtcctgcca ctattcttat tgacaaggtt gaattcagta atggttttta ctatctttat 6780
agtggtgaca cattttggaa gtacaacttt gacataacag ataacaaata cacttgcaaa 6840
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gctgttgctg aggctcatcg ttacgatgtc ctcttgactg acatgtcgtt caacaatttt 7200
accaccagtt atgcaaaacc agaggaaaaa cttcccgtcc atgacattgc cacgtgtatg 7260
cgtgtaggtg ccaagattgt taatcataac gttcttgtca aggatagtat acctgtggta 7320
tggcttgtac gtgatttcat tgccctttct gaagaaacta ggaagtacat tattcgtacg 7380
actaaagtta agggtataac cttcatgttg acctttaatg attgtcgtat gcatactacc 7440
atacctactg tttgcattgc aaataagaag ggtgcaggtc ttcctagttt ttcaaaggtt 7500
aagaaattct tctggttttt gtgtctgttt atagttgctg ttttctttgc actaagcttt 7560
tttgatttta gtactcaggt tagcagtgat agtgattatg acttcaagta tattgagagt 7620
ggccagttga agacttttga caatccactt agttgtgtgc ataatgtctt tagtaacttc 7680
gacctgtggc atgatgccaa gtttggtttc acccccgtca acaatcctag ttgtcctata 7740
gtcgttggtg tatcagacga agcgcgcact gttccaggta tcccagcagg tgtttattta 7800
gctggtaaaa cacttgtttt tgctattaac accatttttg gtacatctgg tttgtgcttt 7860
gatgctagtg gcattgctga taagggcgct tgcattttta attcggcttg caccacatta 7920
tctggtttgg gtggaactgc tgtctactgt tataagaatg gtctagttga aggtgctaaa 7980
ctttatagtg agttggcacc tcatagctac tataaaatgg tagatggtaa tgctgtgtct 8040
ttacctgaaa ttatctcacg cggctttggc atccgtacta tccgtacaaa ggctatgacc 8100
tactgtcgcg ttggccagtg tgtgcaatct gcagaaggtg tttgttttgg cgccgataga 8160
ttctttgtct ataatgcaga atctggttct gactttgttt gtggcacagg gctctttaca 8220
ttgttgatga acgttattag tgttttttcc aagacagtac cagtaactgt gttgtctggt 8280
caaatacttt ttaattgcat tattgctttt gctgctgttg cggtgtgttt cttatttaca 8340
aagtttaagc gcatgttcgg tgatatgtct gttggcgttt tcactgtcgg tgcttgtact 8400
ttgttgaaca atgtttccta cattgtaaca cagaacacac ttggcatgtt gggctatgca 8460
actttgtact ttttgtgcac taaaggtgtt agatatatgt ggatttggca tttgggattt 8520
ttgatctcat atatacttat tgcaccatgg tgggttttga tggtttatgc cttttcagcc 8580
atttttgagt ttatgcctaa cctttttaag cttaaggttt caacacaact ttttgagggt 8640
gacaagttcg taggctcttt tgaaaatgct gcagcaggta catttgtgct tgatatgcat 8700
gcctatgaga gacttgccaa ctctatctca actgaaaaac tgcgtcagta tgctagtact 8760
tacaataagt acaagtatta ttcaggcagt gcttcagagg ctgattacag gcttgcttgt 8820
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acaccaccca ctgtgagtta caattcaact ctacaggctg gcttgcgtaa gatggcacaa 8940
ccatctggtg ttgttgagaa gtgcatagtt cgtgtttgct atggtaatat ggctcttaat 9000
ggcctatggc ttggtgatac tgttatctgc ccacgccatg ttatagcgtc tagtattact 9060
agcactatag attatgacta tgccctttct gttttacgcc tccacaactt ctccatttca 9120
tctggtaatg ttttcctagg tgttgtgggt gtaaccatgc gaggtgcttt gttgcagata 9180
aaggttaatc aaaacaatgt ccacacgcct aagtacacct atcgcacagt tagaccgggt 9240
gaatctttta atatcttggc gtgctatgat ggttctgcag ctggtgttta cggcgttaac 9300
atgcgctcta attacactat tagaggctcg ttcattaatg gcgcttgtgg ttcacctggt 9360
tataacatta acaatggtac cgttgagttt tgctatttac accagcttga acttggttca 9420
ggctgtcatg ttggtagcga cttagatggt gttatgtatg gtggttatga ggaccaacct 9480
actttgcaag ttgaaggcgc tagtagtctg tttacagaga atgtgttggc atttctttat 9540
gcagcactca ttaatggttc tacctggtgg cttagttctt ctaggattgc tgtagacagg 9600
tttaatgagt gggctgttca taatggtatg acaacagtag ttaatactga ttgcttttct 9660
attcttgctg ctaagactgg tgttgatgta caacgtttgt tggcctcaat ccagtctctg 9720
cataagaatt ttggtggaaa gcaaattctt ggctatacct cgttgacaga tgagtttact 9780
acaggtgaag ttatacgtca aatgtatggc gttaatcttc agagtggtta tgtttcacgc 9840
gcctgtagaa atgtcttgct ggttggttct tttctgactt tcttttggtc agaattagtt 9900
tcctacacta agttcttttg ggtaaatcct ggttatgtca cacctatgtt tgcgtgtttg 9960
tcattgctgt cctcactttt gatgttcaca ctcaagcata agacattgtt tttccaggtc 10020
tttctaatac ctgctctgat tgttacatct tgcattaatt tggcatttga tgttgaagtc 10080
tacaactatt tggcagagca ttttgattac catgtttctc tcatgggttt taatgcacaa 10140
ggtcttgtta acatctttgt ctgctttgtt gttaccattt tacacggcac atacacatgg 10200
cgctttttta acacacctgt gagttctgtc acttatgtgg tagctttgct gactgcggca 10260
tataactatt tttacgctag tgacattctt agttgtgcta tgacactatt tgctagtgtg 10320
actggcaact ggttcgttgg tgctgtttgt tataaagctg ctgtttatat ggccttgaga 10380
tttcctactt ttgtggctat ttttggtgat attaagagtg ttatgttctg ttaccttgtg 10440
ttgggttatt ttacctgttg cttctacggt attctctact ggttcaacag gttttttaag 10500
gttagtgtag gtgtctatga ctatactgtt agtgctgctg agtttaagta tatggttgct 10560
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ggtattggtg gtgagcggaa tattaagatt tcttccgttc agtctaaact gactgatatt 10680
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acagaatggg cctattgtgt tgacttgcat aacaagatca acttgtgtaa tgacccagaa 10800
aaagcgcagg aaatgctact tgctttgttg gcatttttcc ttagtaagaa tagtgctttt 10860
ggtttagatg acttattgga atcctatttt aatgacaata gtatgttgca gagtgttgca 10920
tctacttatg tcggtttgcc ttcttatgtc atttatgaaa atgcacgcca acagtatgaa 10980
gatgctgtta ataatggttc tccacctcag ttggttaagc aattgcgcca tgccatgaat 11040
gtagcaaaga gcgaatttga ccgtgaggct tctactcagc gtaagcttga tagaatggcg 11100
gaacaggctg cagcacagat gtacaaagag gcacgagcag ttaataggaa gtccaaagtt 11160
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gacaccattc tcaacttggc aaaggatggg gttgtacctc tgtctgtcat accggcagtc 11280
agtgctacta agcttaacat tgttacttct gatatcgatt cttataatcg tatccagcgt 11340
gagggatgtg tccactacgc tggtaccatt tggaatataa ttgatatcaa ggacaatgat 11400
ggcaaggtgg tacacgttaa ggaggtaacc gcacagaatg ctgagtccct gtcatggccc 11460
ctggtccttg ggtgtgagcg tattgtcaag ctccagaata atgaaattat tcctggtaag 11520
ctgaagcagc gctccattaa ggcagaagga gatggcatag ttggagaagg taaggcactt 11580
tacaataatg agggtggacg tacttttatg tatgctttca tctcggacaa accggacctg 11640
cgtgtagtca agtgggagtt cgatggtggt tgtaacacta ttgagctaga accaccacgt 11700
aagttcttgg tggattctcc taatggtgca cagatcaagt atctctactt tgttcgtaac 11760
cttaacacgt tacgtagggg tgctgttctc ggctacatag gtgccactgt acgcttgcag 11820
gctggtaaac aaacagaaca ggctattaac tcttcattgt tgacactttg cgctttcgct 11880
gtggatcctg ctaagaccta catcgatgct gtcaaaagtg gtcacaaacc agtaggtaac 11940
tgtgttaaga tgttggccaa tggttctggt aatggacaag ctgttactaa tggtgtggag 12000
gctagtacta atcaggattc atacggtggt gcgtccgtgt gtctatattg tagagcacat 12060
gttgagcatc catctatgga tggtttttgc agactgaaag gcaagtacgt acaggttcca 12120
ctaggtacag tggatcctat acgttttgta cttgagaatg acgtttgcaa ggtttgtggt 12180
tgttggctgg ctaatggctg cacttgtgac agatccatta tgcaaagcac tgatatggct 12240
tatttaaacg agtgcggggc tctagtgcag ctcgactag 12279
<210> 3
<211> 4134
<212> RNA
<213> porcine epidemic diarrhea virus
<400> 3
atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60
caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120
gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180
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tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300
gactctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360
gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctaat aatgatgtta caacaggtcg taattgccta 420
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tcccgtgttg cgacaaagtg ttacaacagt ggaggttgtg ctatgcaata tgtttacgaa 600
cccacctatt acatacttaa tgttactagt gctggtgagg atggtatttc ttatcaaccc 660
tgtacagcta attgcattgg ttatgctgcc aatgtatttg ctactgagcc caatggccac 720
ataccagaag gttttagttt taataattgg tttcttttgt ccaatggttc cactttggtg 780
catggtaagg tggtttccaa ccaaccattg ttggtcaatt gtcttttggc cattcctaag 840
atttatggac taggccaatt tttctccttt aatcaaacga tcgatggtgt ttgtaatgga 900
gctgctgtgc agcgtgcacc agaggctctg aggtttaaca ttaatgacac ctctgtcatt 960
cttgctgaag gctcaattgt acttcatact gctttaggaa caaatttttc ttttgtttgc 1020
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tcttattatt gttttcttaa agtggatact ttcaactcca ctgtttataa atttttggct 1140
gtcttacctc ctaccgtcag ggaaattgtc atcaccaagt atggtgatgt ttatgtcaat 1200
gggtttggat acttgcatct cggtttgttg gatgctgtca caattaattt cactggtcat 1260
ggcactgacg atgatgtttc tggtttttgg accatagcat cgactaattt tgttgatgca 1320
ctcatcgaag ttcaaggaac cgccattcag cgtattcttt attgtgatga tcctgttagc 1380
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accatttcac tgttttataa cgttacaaac agttatggtt atgtgtctaa atcacaggac 1680
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ggtagtggtg ttaagtttac gtccctttac tttcaattca caaagggtga gttgattact 1860
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accaagtata ctatctatgg ctttaaaggt gagggtatca ttacccttac aaattctagc 1980
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gcggcattgc cttttagcta tgctgttcaa gctagactca attatcttgc tctacagacg 2940
gatgttctac agcggaacca gcaattgctt gctgagtctt ttaactctgc tattggtaat 3000
ataacttcag cctttgagag tgttaaagag gctattagtc aaacttccaa gggtttgaac 3060
actgtggctc atgcgcttac taaggttcaa gaggttgtta actcgcaggg tgcagctttg 3120
actcaactta ccgtacagct gcaacacaac ttccaagcca tttctagttc tattgatgac 3180
atttactctc gactggacat tctttcagcc gatgttcagg ttgaccgtct catcaccggc 3240
agattatcag cacttaatgc ttttgttgct caaaccctca ctaagtatac tgaggttcag 3300
gctagcagga agttagcaca gcaaaaggtt aatgagtgcg ttaaatcgca atctcagcgt 3360
tatggttttt gtggtggtga tggcgagcac attttctctc tggtacaggc agcacctcag 3420
ggcctgctgt ttttacatac agtacttgta ccgagtgatt ttgtagatgt tattgccatc 3480
gctggcttat gcgttaacga tgaaattgcc ttgactctac gtgagcctgg cttagtcttg 3540
tttacgcatg aacttcaaaa tcatactgcg acggaatatt ttgtttcatc gcgacgtatg 3600
tttgaaccta gaaaacctac cgttagtgat tttgttcaaa ttgagagttg tgtgggcacc 3660
tatgtcaatt tgactagaga ccaactacca gatgtaatcc cagattacat cgatgttaac 3720
aaaacacttg atgagatttt agcttctctg cccaatagaa ctggtccaag tcttccttta 3780
gatgttttta atgccactta tcttaatctc actggtgaaa ttgcagattt agagcagcgt 3840
tcagagtctc tccgtaatac tacagaggag ctccaaagtc ttatatataa tatcaacaac 3900
acactagttg accttgagtg gctcaaccga gttgagacat atatcaagtg gccgtggtgg 3960
gtttggttga ttattttcat tgttctcatc tttgttgtgt cattactagt gttctgctgc 4020
atttccacgg gttgttgtgg atgctgcggc tgctgctgtg cttgtttctc aggttgttgt 4080
aggggtccta gacttcaacc ttacgaagtt tttgaaaagg tccacgtgca gtga 4134
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-F
<400> 4
gtcggcataa catgggacaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S1-R
<400> 5
ccctgacggt aggaggtaaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S2-F
<400> 6
cctctgggtg ctacccaagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S2-R
<400> 7
catcaacata tgcagcctgc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S3-F
<400> 8
gtcactagtg gtgatgtt 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S3-R
<400> 9
gctggttccg ctgtagaaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S4-F
<400> 10
cttctgcagc ggcattgcct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S4-R
<400> 11
gttctattgg gcagagaagc 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S5-F
<400> 12
ggttgaagtc taggacccc 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S5-R
<400> 13
ggttgaagtc taggacccc 19
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF1aF
<400> 14
ggtggttggg acgatgttgt tgag 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ORF1aR
<400> 15
gctccattgc agggtcatca acg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SDF1
<400> 16
gagattggca tttcgcaaga gcc 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SDR1
<400> 17
gtcgcaacac gggaccaatc 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SDF2
<400> 18
ggccaacatc caactgctag tggcg 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SDR2
<400> 19
cagtggggcc caatgtttta 20
Claims (11)
- 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus) QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P).
- 제1항에 있어서,
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 G2b 그룹에 속하는 것인, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P). - 제1항에 있어서,
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것인, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P). - 제1항에 있어서,
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 ORF1a 유전자를 포함하는 것인, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P). - 제1항에 있어서,
상기 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 스파이크 유전자를 포함하는 것인, 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P). - 순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P)을 포함하는, 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 백신은 생백신 또는 사백신인, 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 백신 조성물은 애주번트(adjuvant)를 더 포함하는, 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물. - 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계;를 포함하는, 돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 예방접종 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 백신 조성물을 돼지에 투여하는 단계는
생백신-생백신-사백신(live-live-killed vaccine: LLK);
생백신-사백신-사백신(live-killed-killed vaccine: LKK); 또는
경구백신-생백신-사백신(oral-live-killed vaccine: OLK);의 백신 프로그램으로 투여하는 것인,
돼지 유행성 설사병 바이러스에 대한 예방접종 방법. - (a) 서열번호 14 및 15의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 ORF1a 유전자 감별 프라이머 세트;
(b) 서열번호 16 및 17의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트; 및
(c) 서열번호 18 및 19의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 스파이크 유전자 감별 프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 감별 프라이머 세트를 포함하는,
순화된 돼지 유행성 설사병 바이러스 QIAP1401-200(수탁번호 : KCTC18852P) 검출용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200147832A KR20220061636A (ko) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200147832A KR20220061636A (ko) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220061636A true KR20220061636A (ko) | 2022-05-13 |
Family
ID=81583359
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200147832A KR20220061636A (ko) | 2020-11-06 | 2020-11-06 | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이를 이용한 돼지 유행성 설사병 예방용 백신 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20220061636A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160120500A (ko) | 2015-04-08 | 2016-10-18 | 박흥식 | 휴대용 얼룩 제거제 |
-
2020
- 2020-11-06 KR KR1020200147832A patent/KR20220061636A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160120500A (ko) | 2015-04-08 | 2016-10-18 | 박흥식 | 휴대용 얼룩 제거제 |
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