CN113429453B - Ctv三肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CTV三肽，其氨基酸序列为Cys‑Thr‑Val。通过试验验证发现本发明的CTV三肽能够有效降低促炎因子mRNA表达水平，具有一定的医学价值，可用于开发预防和/或辅助治疗炎症性肠病的食品或药物。

Description

CTV三肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物活性肽领域，特别涉及CTV三肽及其应用。

背景技术

炎症是机体对外界刺激的一种防御反应，当炎症发生时，促炎介质(如肿瘤坏死因子 -a(TNF-a)、白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8和干扰素-g(IFN-g))在感染或组织损伤部位募集和激活。这些介质可以通过与不同细胞类型中的各种细胞和亚细胞成分相互作用来放大炎症反应。然而，持续的炎症反应使得促炎介质过量导致组织损伤和免疫功能丧失。炎症反应分为急性炎症和慢性炎症。急性炎症过程短，愈合快(如局部组织损伤)。慢性炎症过程长导致机体免疫紊乱。研究表明，慢性炎症反应通常与疾病的发病机制有关，如2型糖尿病、炎症性肠病(IBD)、关节炎、动脉粥样硬化和其他心血管疾病((Serhan&Savill,2005；Wanget al.,2011)。根据流行病学和临床研究，全世界15-20％的恶性肿瘤是由慢性炎症引起的，在发达国家和发展中国家，它已经成为一种公共威胁((Kuper,Adami,&Trichopoulos,2000)。然而，目前大多数药物干预不足以控制慢性炎症反应，长期服用抗炎药物会伴随严重的副作用(Carter et al., 2014；Roubille,Martel-Pelletier,Davy,Haraoui,&Pelletier,2013)，如心脑血管疾病、心肌梗等疾病与抗炎药物在不同水平上的使用有关。虽然慢性炎症性疾病致病因素复杂，但导致病理异常的炎症途径是相同的，因此这些炎症途径可以作为开发与慢性炎症反应相关疾病的治疗和预防治疗的潜在靶点(Majumder,Mine,&Wu,2016；VendraminiCosta&Carvalho,2012)。

NF-κB通路是负责维持防御系统免受有害刺激的的主要信号通路。然而，当这些信号变得过度和不受控制时，就会导致慢性炎症。NF-κB信号通路涉及多种功能，如细胞因子(IL-1b、 IL-6、IL-8和TNF-a)的产生、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)表达的调节。当机体受到内源性或外源性炎症(如脂多糖或肿瘤坏死因子)刺激时，IKK复合物(IKKα和 IKKβ)介导IκB-α磷酸化，导致p50-p65异源二聚体可以自由迁移到细胞核中，并激活与炎症、生长控制、细胞粘附和凋亡保护有关的各种基因的转录。

生物活性肽是一类对人体功能有积极影响，最终影响人体健康的特定蛋白片段。据报道， V PP、IPP、TPFP、AVPYPGA、YP等能够抑制血管紧张素转化降低血压。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种CTV三肽，其氨基酸序列为Cys-Thr-Va l，分子量为321Da。该CTV三肽通过固相合成法获得，能够有效预防并缓解炎症性肠病，可以应用在制备预防和/或缓解炎症性肠病的食品或药物中。

在本发明中，申请人公开了一种抗炎三肽的氨基酸序列，并检测了其在体外炎症模型中表现的抗炎效果，结果表明该三肽在体外模型中通过抑制NF-κB中p-IκB-α和p-p65的表达发挥抗炎作用。

本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其活性成分包括CTV三肽，用于预防和/或缓解炎症性肠病。该药物组合物还可以包括溶剂或可药用辅助剂。

本发明采用TNF-α诱导人肠上皮细胞(HT-29)体外炎症模型来研究在2、4、8、16mM的浓度该三肽的抗炎活性。测定典型细胞因子IL-8的含量，同时运用WST-1试剂盒测定细胞活力。本发明采用转录组测序、RT-PCR、Western-blot，验证其抗炎作用机制。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种CTV三肽，通过试验验证发现本发明的CTV 三肽能够有效降低促炎因子mRNA表达水平，具有一定的医学价值，可用于开发预防和/或辅助治疗炎症性肠病的食品或药物。

附图说明

图1所示为CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞IL-8的分泌影响及其对细胞活力的影响情况图；

图2所示为各组转录组数据样本间相关性热图；

图3所示为转录组数据主成分分析结果图；

图4所示为差异基因火山图，其中，(A)为NEGvsPOS组差异基因火山图，(B)为POSvsCTV组差异基因火山图；

图5所示为CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞因子mRNA表达水平的影响情况图；

图6所示为CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞NF-κB通路中关键蛋白表达水平的影响情况图；

图7所示为CTV对NF-κB信号通路的影响情况图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。

一、实验过程

1.炎症模型建立

以3×10⁵cells/mL的密度将细胞种于细胞培养板上，每隔24h换液，培养5-7天待细胞融合到85％左右，弃去培养液，用HBSS缓冲液洗2次。首先加入用含5％FBS的DMEM-F12新鲜培养液配置的不同浓度的三肽样品预孵育2h，其次再向培养板中加入TNF-α(使其终浓度为5ng/mL)继续孵育4h。孵育结束后，收集细胞上清液用于ELISA测定，下层细胞可根据不同实验要求进行处理。

2.细胞活力测定

参考Mengya Zhang(Zhang et al.,2018)等人所述方法对处理后细胞进行活力测定。实验细胞经HBSS清洗三次后，每孔加入等量WST-1稀释液均匀铺满细胞培养板，放入细胞培养箱中避光孵育15分钟左右，待溶液颜色变化显著时在450nm处测定OD值，按照如下公式计算细胞活力：

细胞活率(％)＝(As450/Ac450)x100％，其中，As450代表样品处理组，Ac450阴性未处理组。

3.IL-8含量测定

参考史雅凝等人(史雅凝，2015)的方法对IL-8含量进行测定。将样品稀释五倍后用于检测。

4.转录组测序

对处理组细胞进行转录组测序，整个测序过程由上海启因生物有限公司完成。

5.RNA-PCR检测

对转录组测序结果中部分差异基因进行验证。实验细胞经冰冷的HBSS清洗三次后，去除表面液体后加入适量TransZol裂解液，充分裂解后根据TransZOL Up Plus RNAKit试剂盒提取HT-29中总RNA。通过测定A260/A280nm处比率评估RNA的浓度和纯度。采用Eas y Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒合成cDNA。RT-P CR使用Perfect StartTM Green qPCR SuperMix试剂盒进行扩增，其条件为94℃变性5s，6 0℃退火15s和72℃延伸10s。整个反应保持40个扩增循环，测定关键基因的表达变化，使用GAPDH作为内部参考基因，并以POS阳性模型组做对照，计算其他组Fold Change值表达百分比，引物序列如表1。

表1

6.蛋白免疫印迹

对培养好的细胞进行预处理获得变性总蛋白。细胞蛋白经10％SDS-PAG胶分离后转移至用甲醇激活的PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1.5h。经洗涤后，将膜充分浸入一抗稀释液中4℃过夜孵育。经用洗涤后，再将膜充分浸入二抗稀释液中孵育1h。经洗涤后，取出PVD F膜至ChemiDocTMTouch仪器中，用移液器滴入ECL显色液进行显色，并拍照记录。采用Image J软件进行灰度分析，计算各组蛋白相对表达量。

二、生物实验结果

1.三肽CTV的抗炎活性验证

IL-8是一种中性粒细胞引诱剂，可诱导中性粒细胞从外周血迁移到炎症组织，与健康人群相比，IBD患者的组织中IL-8的显著增加。因此选用IL-8作为炎症标志物，初步筛选可能具有抗炎活性的三肽(Mahida,Ceska,Effenberger,Kurlark,Lindley,&Hawkey,1992)。如图1所示，采用TNF-α诱导HT-29细胞炎症模型，通过对炎症标志物IL-8的测定，研究在2、4、8、16 mM浓度下三肽CTV的抗炎活性。结合WST-1法测定其细胞活力，发现模型组与空白对照组之间细胞活力无显著性差异。经三肽预处理的HT-29炎症细胞有效抑制IL-8的分泌(p<0. 05)且无细胞毒性。与模型组相比，当CTV浓度高达16mM时，IL-8分泌量分别下降了99％。

2.转录组数据分析

1)样本相关性

各样本间基因表达水平的相关性是检验实验可重复性和样本选择合理性的重要指标。皮尔逊相关系数的平方(R²)越接近于1，表示各样本相关性越强。根据每个样本中所有基因的FPKM值，计算组内和组间样本的R2值，绘制热图。如图2所示，NEG各组(NEG1、NEG2、NEG3)与POS各组(POS1、POS2、POS3)与CTV各组(CTV1、CTV2、CTV3)。

2)主成分分析

主成分分析(PCA)也常用于评估组间差异和组内样本重复。将各组的FPKM表达值进行PCA降维处理，结果如图3所示，各组生物学重复都聚集在一起且与其他组别相隔较远。

3)转录组基因表达差异分析

采用DESeq2软件对其中两组进行组间差异表达分析(n＝3)。根据图4(A)所示结果，与空白对照组(NEG)相比，模型组(POS)下调了497个基因，上调了577个基因。根据图4(B)所示，与模型组(POS)相比，CTV组上调了3348个基因，下调了1975个基因。

4)差异基因聚集分析

将各组间差异基因取并集之后作为差异基因集，将表达模式相近的基因聚在一起。观察各组差异基因表达模式的相关性，及样品生物学联系。如图5所示，红色代表显著上调，蓝色代表显著下调。发现CTV组与POS组组间差异基因表达量相差较大，而NEG组与POS组差异基因表达量不如前者。

3.三肽CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞细胞因子mRNA表达水平的影响

为了进一步探究CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞抗炎作用的机制及RNA-seq结果的时候可靠性，选择NF-κB信号通路作为接下来的研究目标，采用RT-PCR方法对富集到NF-κB通路中的部分差异基因进行验证。结果如图6所示，与模型组相比，经CTV预处理后的TN F-α诱导的HT-29细胞能够显著下调TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β、COX-2等促炎因子的表达。此外，其对NF-κB通路中关键蛋白NF_KB1、NF_KB2、RELA和TNF通路中TRAF2受体蛋白均有所抑制。

4.三肽CTV对NF-κB信号通路的影响

为了进一步探究CTV对TNF-α诱导的HT-29细胞抗炎作用的机制，采用Western-blot 对NF-κB信号通路的关键蛋白进行检测，结果如图7所示。研究发现CTV能够显著抑制NF -κB通路中关键蛋白p-IκB-α和p-p65的表达，进而防止p65-p50异源二聚体移位至细胞核中激活炎症因子放大炎症。

综上，三肽CTV在体外实验中表现出良好的抗炎活性。因此，CTV可以用于预防或减缓慢性炎症疾病保健品或药品的研发。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (1)

1.CTV三肽在制备预防或减缓慢性炎症疾病药品中的应用，所述CTV三肽的氨基酸序列为Cys-Thr-Val。

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