CN101678125A - 用于递送抗病毒肽治疗剂的新制剂 - Google Patents

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CN101678125A CN200880018701A CN200880018701A CN101678125A CN 101678125 A CN101678125 A CN 101678125A CN 200880018701 A CN200880018701 A CN 200880018701A CN 200880018701 A CN200880018701 A CN 200880018701A CN 101678125 A CN101678125 A CN 101678125A
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邸杰
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Abstract

本发明提供了组合物及其作为治疗剂施用的方法。尤其是，本发明提供了组合物及其在抗病毒肽治疗剂施用中的用途。

Description

用于递送抗病毒肽治疗剂的新制剂
技术领域
本发明提供了组合物及将其作为治疗剂进行施用的方法。尤其是，本发明提供了组合物及其在施用生物活性分子例如抗病毒肽治疗剂中的用途。
背景技术
肽递送系统
肽产品作为用于预防和治疗疾病的治疗剂和/或预防剂具有广泛的用途。这样的肽产品属于各种类别，例如，举例来说，激素、酶和免疫调节剂(例如抗体、血清蛋白和细胞因子)。
对于在患者体内表现出恰当的生物学和治疗效果的肽，它们必须以适当的浓度存在于体内作用位点。更具体地，任何特定化合物(包括任何特定肽)的药代动力学依赖于该化合物在体内的生物利用度、分布和清除率。然而，肽的化学性质和特性，例如大小、复杂性、构象要求和溶解度性质，易于使肽的药代动力学性质不如其它化合物的药代动力学性质理想。
因此，本领域有大量工作致力于开发施用治疗剂例如肽的方法，以增加该治疗剂的生物利用度和半衰期。虽然在这方面已经有所进展，本领域仍然需要可用于以理想的药代动力学性质递送肽治疗剂的另外的组合物。本发明提供的组合物和方法解决了这些需求。
发明内容
本发明提供了组合物，该组合物例如可被用于向患者施用生物活性分子。具体地，本发明提供了包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物。不受理论的限制，本发明提供的实施方案至少部分地基于意外的发现，即可以在组合物向个体施用显示理想的药代动力学性质的同时，在组合物中提高所包含的生物活性分子的重量百分比。
在一个实施方案中，当施用于患者后，本发明提供的组合物产生的生物分子血浆浓度迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到Cmax并在5、7、10、14、17、21或28天或更长时间中提供该生物分子的相对恒定的血浆浓度。在具体实施方案中，本发明提供的组合物的理想药代动力学性质为更低的Cmax、更长的tmax和更长的t0.01或t0.1。
本发明提供的组合物例如可用于施用包含某些抗病毒肽的组合物，所述抗病毒肽被称为T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ IDNO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)、或者两个或多个上述肽的组合，以及T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ IDNO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)各肽的衍生物。
在一个实施方案中，所述组合物包含溶剂、通过溶剂-皮下液体交换形成基质的胶凝材料、以及至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽，例如T20(SEQID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)、或上述肽的衍生物。
在另一实施方案中，这些组合物进一步包含至少一种额外的成分，例如药学可接受载体、大分子、或其组合。在另一实施方案中，这些组合物除了以上列举的抗病毒肽之外可进一步包含抗病毒剂。
本发明进一步提供了使用本发明提供的组合物的方法。在一个实施方案中，所述组合物被用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这样的治疗方案可以，例如，被用于治疗HIV感染，例如HIV-1感染。
在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明提供的组合物抑制HIV向靶细胞传递的方法，所述方法包含向患者施用一定量的本发明提供的组合物，以使所述靶细胞与一定量的有效抑制细胞被病毒感染的活性剂(例如抗病毒肽和/或另一抗病毒剂)接触。
本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，HIV-1感染)的方法，所述方法包含向HIV感染的患者施用治疗HIV感染的有效量的本发明提供的组合物。
本发明进一步提供了使用包含有效量的生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物制备用于治疗HIV感染的药物(例如用于抑制HIV传递的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治疗或抑制HIV感染的方法)的方法。
结合附图，本发明提供的组合物和方法的上述和其它目标、特征、和益处将在以下详细说明中清晰呈现。
附图说明
图1为HIV-1gp41的示意图，显示了gp41的七个氨基酸重复区域1(HR1)和七个氨基酸重复区域2(HR2)以及其它功能区，所述HR2包括熟知的亮氨酸拉链样基序INNYTSLI。为了说明的目的，相对于HIVIIIB毒株的gp160，显示了对应于HR1和HR2的示例性天然氨基酸序列和氨基酸位点编号。
为了说明而非限制的目的，图2显示了由多个实验室毒株和临床分离株确定的HIV-1 gp41的HR2区域内包含的天然氨基酸序列的比较，其中以单字母氨基酸编码表示，显示了氨基酸序列中的某些变异(例如多态性)。为示例目的，与最上方分离株序列中氨基酸序列INNYTSLI比对的分离株序列对应于HR2亮氨酸拉链样基序。
图3为显示HIV融合抑制肽SEQ ID NO：9合成的示意图，所述HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述合成使用涉及3种肽片段组装的片段缩合法。
图4为显示HIV融合抑制肽SEQ ID NO：9合成的示意图，所述HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述合成使用涉及2种肽片段组装的片段缩合法。
图5显示了在通过以下组合物施用T1144后的432小时中猕猴体内的T1144血浆浓度图：用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，1000μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(60％肽)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图6显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(60％肽)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图7显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在80∶0∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在65∶15∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)。
图8显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在85∶0∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图9显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在70∶10∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图10显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在70∶10∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图11显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M：三乙酸甘油酯中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M：苯甲酸苄酯中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)。
图12显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的75mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μl(--▲--)。
图13显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(88％肽，2％锌)在77∶15∶8的SAIB∶NMP：乙醇中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(88％肽，2％锌)在77∶15∶8的SAIB∶NMP：乙醇中形成的100mg/g悬浮液，200μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μl(--◇--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，200μl(--□--)。
图14显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图15显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀(73％)并在ZnSO4溶液中制浆(70％)的T1144在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)；喷雾干燥(89％)并在ZnSO4溶液中制浆(66％)的T1144在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L：NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--○--)；用ZnSO4溶液沉淀(88％)并在ZnSO4溶液中制浆(71％)的T1144在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--Ж--)；喷雾干燥(89％)并在ZnSO4溶液中悬浮(65％)的T1144在75∶5∶20的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--x--)。
图16显示了在通过以下组合物施用T1144后的432小时中猴体内的T1144血浆浓度图：3.5mg/mL T1144溶液，800μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％)在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％)在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，1000μl(--▲--)。
图17显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在40∶60的PLGA1A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(89％肽，2％锌)在60∶40的PLGA1A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(88％肽，2％锌)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)。
图18显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在50∶50的PLGA1A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在40∶60的PLGA1A∶三乙酸甘油酯中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在40∶60的PLGA3A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--○--)。
图19显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在50∶50的PLGA1A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(73％肽，2％锌)在50∶50的PLGA1A∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(91％肽，2％锌)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◇--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(91％肽，2％锌)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的100mg/g悬浮液，400μ1(--□--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(90％肽，2％锌)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的200mg/g悬浮液，400μl(--△--)。
图20显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；喷雾干燥制备的T1144在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；在甲醇中pH沉淀的T1144(88％肽)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图21显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(60％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；洗涤过的T1144(94％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用ZnSO4溶液沉淀的T1144(88％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)；从甲醇/水中沉淀出的T1144(91％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--○--)。
图22显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中大鼠体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；用CaCl2溶液沉淀的T1144(29％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用CaCl2溶液沉淀的T1144(53％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)；用FeSO4溶液沉淀的T1144(88％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--▲--)；用FeSO4溶液沉淀的T1144(91％)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--○--)。
图23显示了在通过以下组合物施用T1144后的432小时中猴体内的T1144血浆浓度图：3.5mg/mL T1144溶液，800μl(-)；用锌溶液沉淀的T1144(89％)在40∶60的PLGA1A∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--◆--)；用锌溶液沉淀的T1144(60％肽)在40∶60的PLA3L∶NMP中形成的50mg/g悬浮液，400μl(--■--)。
图24显示了在通过以下组合物施用T1144后的168小时中猴体内的T1144血浆浓度图：3mg/mL T1144溶液，1200μl(-)；沉淀H在40∶60的PLA3L∶NMP中的悬浮液，400μl(--□--)；沉淀J在40∶60的PLA3L∶NMP中的悬浮液，400μl(--◇--)；沉淀M在40∶60的PLA3L∶NMP中的悬浮液，400μl(--◆--)；沉淀N在40∶60的PLA3L∶NMP中的悬浮液，400μl(--■--)。
详细说明
定义
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“患者”指哺乳动物，例如人。在具体实施方案中，“患者”是需要本发明公开的疾病或病症(例如HIV或艾滋病)治疗的哺乳动物，例如人。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“靶细胞”指能够被HIV感染的细胞。在一个实施方案中，所述细胞为人细胞；在另一实施方案中，所述细胞是能够通过包括膜融合的过程被HIV感染的人细胞。在另一实施方案中，所述细胞存在于患者例如人患者体内。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“组合物”指包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的制剂。本文描述了示例性组合物。本文提供的组合物可以例如被用作药物或用于制备药物。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“溶剂”指可与水混溶的液体。在一个实施方案中，所述溶剂是可与水混溶的液体并与助溶剂例如NMP组合使用。溶剂可被用于，例如，充分稀释胶凝材料以允许注射入患者体内。本发明描述了示例性溶剂，所述示例性溶剂为本领域技术人员所熟知。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“胶凝材料”指可与溶剂混溶的材料，所述材料当存在于包含溶剂和胶凝材料的组合物中时，通过溶剂-皮下液体交换(即溶剂-皮下患者液体交换)形成基质。本发明描述了示例性胶凝材料，所述示例性胶凝材料为本领域技术人员所熟知。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“基质”指在溶剂-皮下液体交换后胶凝材料呈现的可生物降解或可生物侵蚀的形式。在一个实施方案中，所述基质为粘性(即抗剪切)基质。在另一实施方案中，所述基质为凝胶。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“运载体”指可用于向患者递送生物活性分子(例如肽，例如抗病毒肽)的包含溶剂和胶凝材料的液体材料。运载体可以以水性状态存储。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“药学可接受的载体”指被添加到活性成分(例如HIV融合抑制肽)中而并不显著改变所述活性成分的生物学活性的载体介质。药学可接受的载体包括但不限于以下的一种或多种物质：水、缓冲水、盐水、0.3％甘氨酸、水性醇、等渗水性溶液；并可进一步包括一种或多种物质，例如甘油、油类、盐类(例如钠盐、钾盐、镁盐和铵盐)、磷酸盐、碳酸酯、脂肪酸、糖类(例如甘露醇)、多糖、聚合物、赋形剂、和防腐剂和/或稳定剂(用于延长保质期或为组合物生产和销售所必需且适合的)。在一个实施方案中，药学可接受载体适于肌肉内、皮下或肠胃外施用。
除非另外特别指出，在用于本说明书和权利要求书并涉及HIV融合抑制肽时，术语“包含异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸”分别指异亮氨酸或亮氨酸，或所述它们相应的天然存在的氨基酸(例如L-氨基酸)、非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)、异构体形式(例如正亮氨酸、别异亮氨酸等)、或衍生物形式(例如叔亮氨酸)。异亮氨酸或亮氨酸氨基酸的一种形式可用于排除所述氨基酸的其它形式。本文所述的HIV融合抑制肽还可在其氨基酸序列中包含源自HIV gp41HR2区域序列的一种或多种多态性(参见，例如图2)，除了在本发明教导的氨基酸序列中的一个或多个位点包括包含异亮氨酸或亮氨酸的氨基酸。
术语“HIV”指人类免疫缺陷病毒，在一个实施方案中，指HIV-1。
术语“分离的”在用于生物活性分子(例如抗病毒肽如HIV融合抑制肽、或肽片段)时，指所述生物活性分子基本不含未成为该生物分子自身整体结构的一部分的成分，例如，在使用生物、生物化学、或化学方法合成、制备、或修饰时，基本不含化学前体或其它化学药品。在某些实施方案中，分离的生物活性分子纯度超过大约75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或99.9％重量。
在用于HIV融合抑制肽时，术语“1到3个氨基酸替换”指HIV融合抑制肽还是具有SEQ ID NO：9-15中任一序列的氨基酸序列，但是与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比具有不少于1个且不多于3个氨基酸差异；同时还具有(a)多于一个的亮氨酸拉链样基序和除了形成亮氨酸拉链样基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨酸拉链样基序的1或8位点以外)的至少一个额外的亮氨酸，或(b)3到5个亮氨酸拉链样基序；并具有抗HIV的抗病毒活性(抑制HIV介导的融合的活性)。在此方面，具有替换(当与SEQ ID NO：9-15相比时)的HIV融合抑制肽的氨基酸差异位于除本发明的HIV融合抑制肽标示为亮氨酸和/或异亮氨酸残基以外的氨基酸序列位点(参见，例如本发明图示(I)和(II))。所述不少于1个且不多于3个氨基酸差异包括，但不限于，保守氨基酸替换(本领域已知包括与被替换氨基酸具有基本相同的电荷、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸替换；实例包括，但不限于，甘氨酸-丙氨酸-缬氨酸、色氨酸-酪氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、精氨酸-赖氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺、和丝氨酸-苏氨酸)和/或多态性(例如，如图2所示，或如在实验室发现的、多种分化枝、和/或HIV-1的临床分离株)。例如，对于SEQ ID NO：11、12、或13，HIV融合抑制肽具有1到3个氨基酸差异，所述氨基酸差异位于SEQ ID NO：11、12、或13中任一序列的氨基酸残基10、17、24、31、和38以外的位点。例如，对于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：14，HIV融合抑制肽具有1到3个氨基酸差异，所述氨基酸差异位于SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：14的氨基酸残基10、17、21、24、和38以外的位点。例如，对于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：15，HIV融合抑制肽具有1到3个氨基酸差异，所述氨基酸差异位于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：15的氨基酸残基10、17、21、31、和38以外的位点。所述实施方案的示例性例子包括但不限于SEQ ID NO：16的氨基酸序列，其中可能是1到3个氨基酸替换的氨基酸差异位点用Xaa标示(表示天然或非天然存在的任何氨基酸，即多于一种可能的氨基酸可用于此氨基酸位点)。同样地，可产生一个或多个保守氨基酸替换，例如用精氨酸或组氨酸替换赖氨酸、用赖氨酸或组氨酸替换精氨酸、用天冬氨酸替换谷氨酸、或用谷氨酸替换天冬氨酸。为示意目的，氨基酸位点10、17、21、24、31、和38用下划线标示。同样对于SEQ ID NO：9-15，应注意在SEQ ID NO：16中“Zaa”用于标示可能为亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸；并且Baa用于标示优选为亮氨酸、异亮氨酸，但可能为Xaa的氨基酸，但是至少一个Baa为亮氨酸或异亮氨酸。
SEQ ID NO：16：
XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa
本发明所述的HIV融合抑制肽也可以，例如，包括对应于SEQ ID NO：5的HIV gp41 HR2区域衍生的肽(通过序列比对)，所述肽存在于HIV-1的实验室株、分化枝或临床分离株中，例如图2中所列的实验室毒株和临床分离株，只要所述HIV融合抑制肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸要求。在一个实施方案中，这些HIV融合抑制肽与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比，显示出1到3个氨基酸替换。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团，或上述两者；且所述末端基团可包括，但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；位于C末端的羧基或酰胺基。
本发明所述的HIV融合抑制肽也可包括显示出美国专利US2006/0247416(通过引用将其全部内容并入本文中)公开的任何肽的变体氨基酸序列的肽，只要所述HIV融合抑制肽满足SEQ ID NO：16的氨基酸要求。在一个实施方案中，此类HIV融合抑制肽与SEQ ID NO：9-15中任一序列相比，显示出1到3个氨基酸替换。在优选实施方案中，所述HIV融合抑制肽的长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团，或上述两者；且所述末端基团可包括但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；位于C末端的羧基或酰胺基。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“反应性官能团”指能够与另一化学基团或化学部分形成化学键的化学基团或化学部分。关于化学基团，本领域技术人员所熟知，反应性官能团包含的基团包括但不限于，马来酰亚胺、巯基、羧酸、氢、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏水基团、胺、酰胺基、丹磺酰基、磺基、琥珀酰亚胺、巯基反应性基团、胺反应性基团、羧基反应性基团等。一种反应性官能团可用于排除另一反应性官能团。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“接头”指作为分子桥以可操作地连接两个不同分子的化合物或部分(例如，接头的第一个反应性官能团共价连接到大分子载体的反应性官能团，且该接头的第二个反应性官能团共价连接到HIV融合抑制肽的反应性官能团)。在包含HIV融合抑制肽的一个或多个拷贝的重组融合蛋白的制备中，接头可以是氨基酸。或者，两个不同分子可以以分步的方式(例如通过化学偶合)连接到接头上。一般而言，对于接头，没有特定的大小或成分限制，只要所述接头可满足作为分子桥的用途。本领域技术人员熟知，接头包括但不限于，化学链、化合物(例如试剂)、氨基酸等。接头可包括但不限于，同双功能接头、异双功能接头、生物稳定接头、可水解接头、和可生物降解接头，以及本领域已知的其它接头。本领域技术人员熟知，异双功能接头包含具有第一反应性官能团从而特异性连接第一分子的一端，和具有第二反应性官能团从而特异性连接第二分子的相对端。对本领域技术人员显而易见的是，多种单功能、双功能、和多功能试剂(例如Pierce Chemical Co.，Rockford，III目录中所述的试剂)可被用作接头。根据例如待被连接的分子、进行连接的条件、和施用时期望的药代动力学性质等因素，所述接头的长度和组成可以改变以优化例如以下性质：生物活性和功能的保持、稳定性、对某种化学品和/或温度参数的抗性、在体内对裂解的敏感性、以及足够的立体选择性或大小。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“大分子载体”指连接、加入、或融合(例如，以化学方法，或通过使用遗传表达的重组方法)至本发明的一个或多个肽的分子，由此与不存在所述分子时的所述一个或多个肽相比，所述分子能够赋予所述一个或多个肽一种或多种以下性质：稳定性、生物活性的增强、血浆半衰期的延长(例如延长所述一个或多个肽在体内的持久性)。本领域熟知，这些大分子载体包括但不限于，血清蛋白、聚合物、碳水化合物、和脂质-脂肪酸结合物。典型地用作大分子载体的血清蛋白包括但不限于，转铁蛋白、白蛋白(优选人白蛋白)、免疫球蛋白(优选人IgG或其一条或多条链)、或激素。典型地用作大分子载体的聚合物包括但不限于，聚赖氨酸或聚(D-L-丙氨酸)-聚(L-赖氨酸)、或多元醇。多元醇可包含水溶性聚(环氧烷烃)聚合物，且可具有直链或支链。聚合物可为支链多元醇(例如PEG，具有多(例如3或更多)条链，每条链都可直接或通过接头连接到HIV融合抑制肽)；在一个实施方案中，聚合物可以是可生物降解的、和/或在体内条件下随时间裂解的支链多元醇。合适的多元醇包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、和PEG-PPG共聚物。在一个实施方案中，多元醇包含PEG，所述PEG的平均分子量选自从约1000道尔顿到约20000道尔顿的范围。本领域已知可使用的其它类型大分子载体，所述载体通常具有高于20000道尔顿的分子量。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“化学保护基团”或“CPG”指用于阻断含有胺基团的反应性官能团与另一反应性官能团进行化学反应的化学部分。肽合成领域的技术人员熟知，化学保护基团包括但不限于，tBu(叔丁基)、trt(三苯甲基(trityl))、OtBu(叔丁氧基)、Boc或t-Boc(叔丁氧羰基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Aoc(叔戊氧羰基)、TEOC(β-三甲基乙氧羰基)、CLIMOC(2-氯-1-茚满基甲氧羰基)、BIMOC(苯-[f]-茚-3-甲氧羰基)、PBF(2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、2-Cl-Z(氯苄氧羰基)、Alloc(烯丙氧羰基)、Cbz(苄氧羰基)、Adoc(金刚烷氧羰基)、Mcb(甲基环丁氧羰基)、Bpoc(2-(对-联苯基)丙基-2-氧羰基)、Azoc(2-(对-苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz(2，2二甲基-3，5-二甲氧苄基-氧羰基)、MTf(4-甲氧基-2，3，6-三甲氧基苯基磺酰基)、PMC(2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基)、Tos(对甲苯磺酰基)、Hmb(2-羟基-4-甲氧苄基)、Poc(2-苯丙基-2-氧羰基)、Dde(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)、ivDde(1，(4，4-二甲基-2，6-二氧代-环己-1-亚基)-3-甲基丁基)、苄基、丹磺酰基、对-硝基苄酯等。一种化学保护基团可用于排除另一种化学保护基团。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，本领域已知术语“去保护”指从含有一个或多个化学保护基团的分子上去除一个或多个化学保护基团的过程，其中所述分子包含氨基酸、肽片段、或HIV融合抑制肽。通常，去保护过程涉及被一个或多个化学保护基团保护的分子与去除所述化学保护基团的化学试剂反应。例如，被化学保护基团保护的N-末端α氨基可与碱反应以去除碱不稳定的化学保护基团(例如Fmoc等)。化学保护基团(例如Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)用酸去除。其它化学保护基团，尤其是衍生自羧酸的基团，可用酸或碱去除。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“衍生物”指通过用另一个原子或另一组原子替换一个或多个原子从而由母体化合物产生的化合物，其中所述化合物为抗病毒化合物时，优选地保留母体化合物的所有或基本所有抗病毒活性。
术语“第一”、“第二”、“第三”等，在本文中可用于：(a)表明顺序；或(b)区分分子或分子的反应性官能团；或(c)，(a)和(b)的组合。但是术语“第一”、“第二”、“第三”等不应另外理解为限制本发明。
涉及本发明的HIV融合抑制肽时，术语“肽片段”和“中间体”在本文中同义使用，且当在本文中用于说明书和权利要求书时，指包含长度不少于约5个氨基酸且不多于约30个氨基酸残基的氨基酸序列的肽，并且包含所述HIV融合抑制肽的氨基酸序列的至少一部分(连续的氨基酸)。可用于制备SEQID NO：9和10的肽片段的示例性例子参见本发明实施例4-7，以及表4、5、7和8。另外，当在优选的实施方案中合成肽片段(单独地或组合成一组以形成HIV融合抑制肽)由此在氨基酸残基之间形成肽键时，对本领域技术人员显而易见的是，可以使用本领域技术人员熟知的反应形成非肽键(例如亚胺基、酯、酰肼、偶氮、氨基脲等)。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“药代动力学性质”指随着时间变化的系统性可利用的组合物中生物活性分子(例如抗病毒肽)的总量。可通过在体内施用后测定所述生物活性分子(例如抗病毒肽)随时间变化的全身总浓度来确定药代动力学性质。例如，药代动力学性质可用浓度-时间曲线下面积(AUC)、生物半衰期、和/或清除率表达。AUC是随时间的全身生物活性分子浓度的积分度量，单位为质量-时间/体积。施用一剂生物活性分子之后，自给药时间点至体内无活性成分存留的时间点的AUC是个体暴露于所述生物活性分子(和/或所述生物活性分子的代谢物)的度量。当组合物所包含的生物活性分子与本发明所述制剂以外的制剂中包含的生物活性分子相比具有以下一种或多种特征时，所述组合物具有“改善的”或“提高的”药代动力学性质：(a)更长的(“提高的”)生物(末端消除)半衰期(“t1/2”)，(b)生物(全身)清除率(Cl)的降低，(c)更长的持续释放性质，(d)在所述组合物中提高的重量百分比(例如约10％或更高)，(e)降低的或更低的Cmax，(f)更长的tmax，和(g)更长的t0.01或t0.1。在一个实施方案中，改善的药代动力学意味着相对于被比制剂生物活性分子清除率降低，例如典型地降低约2倍到约10倍。在另一实施方案中，改善的药代动力学意味着相对于被比制剂，生物半衰期延长约10％到约60％。改善的药代动力学还可同时包括清除率降低和生物半衰期延长。在一个实施方案中，理想的药代动力学性质包括迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到Cmax，然后在5、7、10、14、17、21或28天或更长时间保持相对恒定的血浆浓度。在具体实施方案中，本发明提供的组合物的理想药代动力学性质为更低的Cmax、更长的tmax和更长的t0.01或t0.1。用于计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、全身总清除率(Cl)、和末端消除半衰期(t1/2)的公式在本发明实施例1中详述。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，作为本领域中用于表示其中溶解了一种或多种固体的水溶液的标准术语“溶液中”指在本发明详细描述的和可注射药物制剂领域标准的浓度和温度实际应用条件下，包含了溶解在其中的生物活性分子例如HIV融合抑制肽的水溶液。本领域已知多种方法用于区分溶液形态和悬浮液形态，例如检查视觉澄清度(溶液透明而悬浮液混浊)、光穿透等。“溶解度”由存在于水性液体溶液中的生物活性分子例如HIV融合抑制肽的量(例如重量百分比)确定，所述溶液没有可见的沉淀，且含有所述生物活性分子的水性液体没有发生胶凝。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“持续释放”指在施用后，生物活性分子在特定的时间间隔中连续不断地释放。
当在本文中用于说明书和权利要求书时，术语“有效量”指可达到特定方法的理想结果的生物活性分子的量。在一个实施方案中，生物分子的有效量可以是足以(通过其自身和/或与多剂量方案结合)降低(例如相对于所述生物活性分子不存在时)患者体内HIV病毒载量的量。在另一个实施方案中，生物分子的有效量可以是足以抑制(例如相对于所述生物活性分子不存在时)HIV对细胞的感染或抑制病毒进入靶细胞的量。这些抑制可使用本领域已知的方法测定。在另一个实施方案中，生物分子的有效量可以是足以改善HIV感染相关症状的量。本领域技术人员可使用本领域技术人员熟知的常规体外和体内研究数据确定生物分子的有效量。
涉及HIV感染时，术语“治疗”或“疗法”、或其语法上等同的表达可互换使用，且当用于说明书和权利要求书时指包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽的组合物可被用于影响与HIV感染相关的一种或多种过程，或影响用作确定此类治疗或疗法(例如“治疗应用”)的疗效指标的一个或多个参数或终点。例如，生物活性分子可用于抑制以下一种或多种过程：HIV向靶细胞的传递；HIV与靶细胞的融合(“HIV融合”)；病毒进入(在感染过程中HIV或其遗传物质进入靶细胞的过程)；以及合胞体形成(例如HIV感染细胞与靶细胞的融合)。对于评估HIV感染治疗或疗法中药物的功效，病毒抑制(由本领域已知的用于测定体液或组织中病毒载量的方法确定)是常用的主要终点，血液循环中的CD4+细胞数量的增多是常用的次要终点；上述两者都是抑制HIV向靶细胞传递的可测效果。因此，包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽的组合物可用于影响治疗应用，包括病毒抑制和/或循环CD4+细胞相对数量增多。
组合物
本发明提供了可用于向患者施用生物活性分子的组合物。具体地，本发明提供了包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物。不受理论的限制，本发明提供的实施方案至少部分基于意外的发现，即可在组合物中提高所包含的生物活性分子的重量百分比而在施用于患者后显示出理想的持续释放性质。本发明所述的组合物可构成原位形成的凝胶组合物，因为所述组合物在施用于患者并发生溶剂-皮下液体交换后包含基质。
在一个实施方案中，当施用于患者时，本发明提供的组合物产生的生物分子血浆浓度迅速(例如在8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到Cmax并在5、7、10、14、17、21或28天或更长时间中提供所述生物分子的相对恒定的血浆浓度。在具体实施方案中，本发明提供的组合物的理想药代动力学性质为更低的Cmax、更长的tmax和更长的t0.01或t0.1。
本发明提供的组合物可用于，例如，施用包含某些抗病毒肽的组合物，所述抗病毒肽被称作T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ IDNO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)、或者上述肽中两个或多个的组合，以及T20(SEQ ID NO：2)、T1249(SEQ IDNO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)各肽的衍生物。
在一个实施方案中，所述组合物包含溶剂、通过溶剂-皮下液体交换形成基质的胶凝材料、以及至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽，例如T20(SEQID NO：2)、T1249(SEQ ID NO：57)、T897(SEQ ID NO：58)、T2635(SEQ ID NO：5)、T999(SEQ ID NO：59)和T1144(SEQ ID NO：9)或上述肽的衍生物。所述组合物可以，例如，在施用前作为溶液或悬浮液存在。所述溶液或悬浮液可以是水性的或包含有机溶剂。在暴露于患者皮下空间中的液体后，所述胶凝材料可形成可生物降解的或至少可生物侵蚀的基质。因此，在一个实施方案中，所述组合物可以以液体形式施用于有此需要的患者，例如，通过皮下注射。所产生的基质可以，例如，作为所述生物活性分子的持续释放基质。
本发明提供的组合物通常包含至少一种胶凝材料，所述胶凝材料的量(例如，约50-1000mg/g、100-900mg/g、150-900mg/g、200-900mg/g、250-900mg/g、500-900mg/g、750-900mg/g或750-1000mg/g)足以在施用于患者后形成基质。在一个实施方案中，确定胶凝材料适当含量(单位mg/g)的方法是从运载体比率添加运载体胶凝材料组成，再乘以10。在一个实施方案中，所述胶凝材料为丙交酯或乙交酯聚合物。在具体实施方案中，所述胶凝材料为乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)、聚丙交酯(PLA，例如PLA3L、PLA3M、或PLA-PEG)或聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG、PLGA例如PLGA1、PLGA-葡萄糖、或PLGA-PEG)。本发明提供的组合物还可包含生物活性分子，例如抗病毒肽。在一个实施方案中，本发明提供的组合物包含足够浓度的生物活性分子，由此可从施用于患者后形成的基质(例如以持续释放的方式)释放有效剂量的所述生物活性分子。
本发明提供的组合物通常可包含并施用浓度至少5％的生物活性分子。因此，在一个实施方案中，本发明提供的组合物包含的生物活性分子(例如抗病毒肽)的量等于组合物重量的约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％或更高。
在具体实施方案中，在施用于患者后，本发明提供的组合物形成基质，所述基质提供了所述生物活性分子的初始突释，然后在所述组合物施用后的至少5、7、10或14天中持续释放所述生物活性分子。在某些实施方案中，通过向患者施用本发明提供的组合物所提供的生物活性分子的初始突释是在施用所述组合物后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时内Cmax至少或大约为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml或15μg/ml或更高。在某些实施方案中，通过向患者施用本发明提供的组合物所提供的生物活性分子的持续释放是在施用所述组合物后至少5、7、10、14、21、25或28天或更长时间中大于或等于0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、1.5μg/ml或2.0μg/ml或更高。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物在施用于患者后形成基质(例如原位)，并在施用的12小时内提供至少10μg/ml的生物活性分子(例如抗病毒肽)的Cmax，然后持续释放，使得在至少7天中血浆水平至少为1μg/ml。
在一个实施方案中，本发明提供的包含抗病毒肽的组合物进一步包含至少一种额外成分，例如药学可接受载体、大分子、或其组合。
在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种额外的生物活性分子。在一个实施方案中，所述组合物可包含T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144肽或上述肽的衍生物。在另一实施方案中，此类组合物可包含或进一步包含一种或多种其它抗病毒剂。可单独或作为组合治疗方案的一部分用于组合物的其它抗病毒剂包括但不限于，DP107(T21)或任何其它抗病毒多肽，例如美国专利6,541,020 B1(通过引用将其全部内容结合到本文中)中所述的抗病毒多肽。其它示例性的、非限制性的治疗剂的例子包括抗病毒剂例如细胞因子，例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ；逆转录酶抑制剂，包括但不限于，阿巴卡韦、AZT(齐多夫定)、ddC(扎西他宾)、奈韦拉平、ddl(地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韦定、依法韦仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、泰洛福韦、和阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于，安普那韦(amprenivir)、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替拉那韦(tipranovir)、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639；病毒mRNA加帽抑制剂，例如利巴韦林；作为具有抗HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B；作为糖蛋白加工抑制剂的澳粟精胺(castanospermine)；病毒进入抑制剂，例如融合抑制剂(恩夫韦地、T1249、其它融合抑制肽，以及小分子)、SCH-D、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(Tanox Inc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro 140、Pro 542(Progenies)、FP-21399(EMD Lexigen)、BMS806、BMS-488043(Bristol-Myers Squibb)、马拉维若(UK-427857)、ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167、和GSK-873、140(GlaxoSmithKline)；CXCR4拮抗剂，例如AMD-070；脂质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂，包括但不限于，L-870和810；RNA酶H抑制剂；rev或REV抑制剂；vif抑制剂(例如源于vif的富含脯氨酸的肽、源于HIV-1蛋白酶N端的肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于，桦木醇和二氢桦木醇衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于，AS-101、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸腺喷丁。
在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述生物活性分子(例如抗病毒肽)被溶解。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述生物活性分子(例如抗病毒肽)被悬浮。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为喷雾干燥形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含盐(例如金属盐)的喷雾干燥形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含锌的喷雾干燥形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含钙的喷雾干燥形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含铁的喷雾干燥形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含盐(例如金属盐)的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含锌的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含钙的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含铁的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含镁的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含铜的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如抗病毒肽)为包含铝的沉淀形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物包含约为1-15％、1-14％、1-13％、1-12％、1-11％、1-10％、1-9％、1-8％、1-7％、1-6％、1-5％、1-4％、1-3％、1-2％、5-15％、7-15％、5-10％、7-10％或10-15％的盐(例如金属盐)。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含盐(例如金属盐)的组合物，所述盐与生物分子(例如抗病毒肽)以摩尔比1∶1存在。可用于本发明提供的组合物的金属盐具体例子包括但不限于，锌、钙和铁。
通过改变本发明提供的组合物中胶凝材料的比率，可以调节(例如改善或优化)生物分子自基质的递送率，所述基质在向患者施用本发明提供的组合物后形成。在具体实施方案中，降低本发明提供的组合物中的SAIB∶PLA比率可导致生物分子在患者体内的血浆浓度在任何特定时间升高，并可延长生物分子的特定血浆水平在患者体内保持的时间。
在具体实施方案中，使用NMP代替三乙酸甘油酯或苯甲酸苄酯作为本发明提供的组合物中的溶剂可导致生物分子在患者体内的血浆浓度在任何特定时间升高，并可延长生物分子的特定血浆水平在患者体内保持的时间。在具体实施方案中，使用NMP代替三乙酸甘油酯作为溶剂可导致Cmax升高。
在另一个实施方案中，增加本发明提供的组合物的施用注射体积(例如加倍)可导致生物分子在患者体内的血浆浓度在任何特定时间升高，并可延长生物分子的特定血浆水平在患者体内保持的时间。
在另一个实施方案中，所使用的胶凝材料(例如PLA)的类型可影响本发明提供的组合物的药代动力学参数。在具体实施方案中，PLA类型从3L改变为3M可导致Cmax降低、tmax增加和t0.01增加。
在另一个实施方案中，改变本发明提供的组合物中胶凝材料与溶剂的比率可影响生物分子的递送率。在具体实施方案中，在本发明提供的组合物中提高胶凝材料对溶剂的比率(例如PLGA1A对NMP)可导致Cmax降低、tmax增加和t0.01增加。
在另一个实施方案中，改变聚合物类型和分子量可改善生物分子的递送率。在具体实施方案中，增加聚合物分子量和/或增加L∶G(丙交酯∶乙交酯)比率可导致Cmax降低、tmax增加和t0.01增加。
在另一个实施方案中，提高本发明提供的组合物中的肽浓度(例如加倍)可导致Cmax降低、tmax增加和t0.01减少。
在另一个实施方案中，提高所述运载体中的胶凝材料(例如PLGA)的量可导致Cmax降低、tmax增加和t0.01减少。
在另一个实施方案中，在所述运载体(例如包含SAIB的运载体)中增加胶凝材料(例如PLA)的量可减缓生物分子从本发明提供的组合物中的释放(例如降低Cmax、增加tmax和/或增加t0.01)。在具体实施方案中，将所述运载体中的PLA量从1％增加到5％可进一步减缓生物分子从本发明提供的组合物中的释放。在另一个实施方案中，将所述运载体中的PLA量从5％增加到10％可进一步减缓生物分子从本发明提供的组合物中的释放。
溶剂
可用于本发明提供的组合物和方法的溶剂包括可充分稀释胶凝材料以允许向患者注射所述组合物的任何可与水混溶的液体。在一个实施方案中，所述溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。其它合适的溶剂包括但不限于，水、醇类(例如甲醇、乙醇、异丙醇和苯甲醇)、二醇类(例如聚乙二醇、丙二醇和四甘醇)、苯甲酸酯(例如苯甲酸乙酯和苯甲酸苄酯)、甘油酯(例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯)、三乙酸甘油酯和药学可接受酯(例如乳酸乙酯和碳酸丙酯)。
胶凝材料
可用于本发明提供的组合物和方法的胶凝材料包括可通过溶剂-皮下液体交换形成基质的任何可与溶剂混溶的材料。在一个实施方案中，所述胶凝材料为乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)或其衍生物，例如乙酸蔗糖酯或特级乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB-SG)。在另一个实施方案中，所述胶凝材料为聚丙交酯(PLA)，例如PLA3L或PLA3M。在另一个实施方案中，所述胶凝材料为聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLG、PLGA、PLGA-葡萄糖或其衍生物，例如PLGA-PEG1500或PLA-PEG1500)。在另一个实施方案中，所述胶凝材料为聚己内酯或其衍生物或其丙交酯/乙交酯共聚物。PLA和PLGA的区别在于丙交酯/乙交酯的比率、分子量和末端基团。分子量以名称中的数字分级。分子量估值为所述数字的10000倍。所述末端基团是羧酸(A)、甲酯(M)或月桂醇酯(L)。
在一个实施方案中，本发明提供的组合物可包含以相同或不同重量百分比存在的两种或多种不同的胶凝材料。在具体实施方案中，所述胶凝材料为两种或多种选自PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖的材料的混合物。
在某些实施方案中，所述胶凝材料存在的量为约5-95％重量、约5-90％重量、约10-90％重量、约10-85％重量、约15-85％重量、约20-85％重量、约30-85％重量、约30-80％重量、约30-70％重量、约30-65％重量、约30-60％重量、约40-85％重量、约45-85％重量、约50-85％重量、约55-85％重量、约60-85％重量、约65-85％重量、约70-85％重量、约75-85％重量、约80-85％重量、约1-15％重量、约5-15％重量或约10-15％重量。
在另一个实施方案中，所述胶凝材料存在的量为约25-900mg/g、100-900mg/g、200-900mg/g、300-900mg/g、400-900mg/g、500-900mg/g、100-800mg/g、100-700mg/g、100-600mg/g、100-500mg/g、200-800mg/g、300-600mg/g、25-250mg/g、25-200mg/g、25-150mg/g、50-150mg/g、50-100mg/g、50mg/g、75mg/g或100mg/g。
肽
对于抗病毒肽生物活性分子，本领域已知的任何抗病毒肽都可用于本发明提供的组合物和方法。在一个实施方案中，所述抗病毒肽为T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144或上述肽的衍生物。
可用于本发明提供的组合物和方法的特定抗病毒肽包括源自基本氨基酸序列(“基本序列”)的HIV融合抑制肽，所述基本序列具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，但是其中每种HIV融合抑制肽与基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于一个的亮氨酸拉链样基序，并且在其氨基酸序列中除形成亮氨酸拉链样基序所必需的亮氨酸以外具有至少一个额外的亮氨酸(即在所述序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外的氨基酸；例如在SEQ IDNO：5的氨基酸位点21用亮氨酸替换异亮氨酸)。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括源自基本氨基酸序列(“基本序列”)的HIV融合抑制肽，所述基本序列具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，但是其中每种HIV融合抑制肽与基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于两个的亮氨酸拉链样基序。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括一系列HIV融合抑制肽，其中每种HIV融合抑制肽：(a)包含源自HIV gp41 HR2区域的氨基酸序列；(b)具有不少于2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO：5-7中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且任选地(d)在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽包含源自HIV gp41 HR2区域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，所述HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团或上述两者；所述末端封闭基团可包括，但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于C末端的羧基或酰胺基。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括HIV融合抑制肽，其中每种HIV融合抑制肽：(a)包含源自HIV gp41 HR2区域的氨基酸序列；(b)具有含有多于2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；并且(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO：5-7中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且(d)在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽包含源自HIV gp41 HR2区域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，所述HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团或上述两者；所述末端基团可包括但不限于：位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于C末端的羧基或酰胺基。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括具有与SEQ IDNO：5相似氨基酸序列的HIV融合抑制肽，但是所述HIV融合抑制肽氨基酸序列：(a)具有多于一个亮氨酸拉链样基序，并且除了形成亮氨酸拉链样基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨酸拉链样基序的1或8位点以外)具有至少一个额外的亮氨酸；或(b)具有多于2个亮氨酸拉链样基序；并且其中所述HIV融合抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出改善。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述HIV融合抑制肽包含源自HIV gp41 HR2区域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ IDNO：9、10、14、和15所示的肽，或者与SEQ ID NO：9、10、14、和15中任一序列相比包含1到3个氨基酸差异的HIV融合抑制肽。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括氨基酸序列与SEQ ID NO：5基本氨基酸序列相似的HIV融合抑制肽，但是与所述基本氨基酸序列相比，所述HIV融合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于2个亮氨酸拉链样基序；其中所述HIV融合抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。
可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ IDNO：11-13所示的肽，或者与SEQ ID NO：11-13中任一序列相比包含1到3个氨基酸差异的HIV融合抑制肽。
本发明所述的HIV融合抑制肽可通过熟知的方法常规制备，所述方法包括编码所述肽的核酸的重组表达。例如，用于重组表达HIV融合抑制肽的工程细胞可在适当的条件下培养适当的时间以表达所述肽，并且所述肽可由此获得。本发明所述的HIV融合抑制肽也可通过合成方法制备。
以下是可用于本发明所述的组合物的具体肽片段。每个肽片段都可以作为中间体，该中间体可与一组肽片段中的一个或多个其它肽片段共价结合从而产生具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在一个实施方案中，在一组肽片段中，肽片段在液相过程中以一定方式结合从而产生所需的具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HIV融合抑制肽。通过如下方式制备的HIV融合抑制肽也可用于本发明提供的组合物：合成所述HIV融合抑制肽的组成肽片段，然后将所述肽片段组装成所述HIV融合抑制肽，其中所述HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，所述方法包含将所述肽喷雾干燥。例如，肽可在pH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如1N NaOH或1N HCl调节pH，然后将所述肽溶液通过喷雾嘴喷到加热的箱体中。可人工收集干燥的肽颗粒。
在另一个实施方案中，上述喷雾干燥方法进一步包含向所述喷雾干燥溶液加入赋形剂，由此掺入赋形剂与肽。示例性赋形剂的实例包括但不限于，填充剂、膨胀剂、稀释剂、湿润剂、溶剂、乳化剂、防腐剂、调味剂、吸收促进剂、持续释放基质、着色剂、和大分子物质例如白蛋白、或例如氨基酸和糖的物质。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，所述方法包括将肽溶液通过喷雾嘴喷到(与喷雾干燥方式相似)另一溶液(例如金属盐溶液，例如锌盐、铁盐或钙盐溶液)中。可将所得悬浮液离心，弃去上清液，冷冻沉淀。所述沉淀可冻干并过200μm筛。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，所述方法包含盐沉淀或pH沉淀，其中肽可在pH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如1N NaOH或1N HCl调节pH至约4到6之间或约4.8到5.2之间。在具体实施方案中，所述方法包含向肽溶液中加入盐溶液或强酸/碱溶液以导致沉淀。在另一个实施方案中，所述方法进一步包含通过离心收集沉淀、通过冻干干燥沉淀、以及任选地将沉淀过200μm筛以控制颗粒大小。
不受理论限制，认为用于制备本发明提供的组合物的肽的方法和试剂可产生有益于某些患者或疾病的理想的或改善的药代动力学参数(例如释放生物活性分子的量或持续时间)。尤其是，金属(例如锌、铁或改)结合到肽沉淀中的方式(例如喷雾和/或沉淀)可影响所得组合物的药代动力学参数。
在一个实施方案中，在所述肽沉淀过程中增加所述金属含量(例如锌含量)可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。在另一实施方案中，向低金属(例如低锌)沉淀加入作为冻干盐的金属盐(例如硫酸锌)可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。
在另一实施方案中，沉淀出肽的溶液可影响Cmax和tmax。例如，从50∶50甲醇∶水中沉淀出肽相对于从纯水中沉淀出肽可降低Cmax并增加tmax。
在另一实施方案中，制备肽的方式可影响Cmax和tmax大。例如，喷雾沉淀相对于非喷雾沉淀可升高Cmax并增加tmax。
使用方法
本发明进一步提供了使用本发明提供的组合物的方法。在一个实施方案中，所述组合物用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这样的治疗方案可以，例如，被用于治疗HIV感染。
在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明提供的组合物抑制HIV向靶细胞传递的方法，所述方法包括向患者施用一定量的本发明提供的组合物，以使所述靶细胞与抑制细胞被病毒感染的有效量的活性药剂(例如抗病毒肽)接触。所述方法可以，例如用于治疗HIV感染患者。在一个实施方案中，抑制HIV向靶细胞传递包括抑制gp41介导的HIV-1与靶细胞融合和/或抑制HIV感染细胞与靶细胞合胞体形成。
本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，HIV-1感染)的方法，所述方法包括向HIV感染患者以治疗HIV感染的有效量施用本发明提供的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含抑制HIV向靶细胞传递的有效量的HIV融合抑制肽，和/或抑制gp41介导的HIV与靶细胞融合的有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可以，例如，用于治疗HIV感染患者。
在具体实施方案中，本发明提供了改善HIV感染相关症状的方法，所述方法包括向HIV感染患者施用包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中所述肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的组合。
本发明进一步提供了将包含HIV融合抑制肽的组合物用于制备用于治疗HIV感染的药物(例如用于抑制HIV传递的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治疗HIV感染的方法)的方法。所述药物可为药物组合物形式，所述药物组合物包含生物活性分子例如HIV融合抑制肽、溶剂、胶凝材料，并任选地包含一种或多种药学可接受载体。
在一个实施方案中，本发明提供的组合物可通过注射施用，例如皮下注射。
在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每3、5、7、10、14、17、21、28或60天施用(例如通过皮下注射)一次。
在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可持续一天或多天、一周或多周、一月或多月、或一年或多年每天施用(例如通过皮下注射)1次、2次、3次或更多次。
在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每周施用(例如通过皮下注射)1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在特定实施方案中，本发明提供的组合物可每周施用(例如通过皮下注射)1次或2次。在另一特定实施方案中，本发明提供的组合物每2周施用(例如通过皮下注射)2次。每次施用可包含1次、2次、3次或更多次注射。
在一个实施方案中，本发明提供的组合物的施用体积为100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl或更多。
实施例
实施例1
在以下实施例中，评估了多种生物物理学参数和生物学参数。确定所述参数的方法如下所述。
使用标准固相合成技术并使用标准FMOC肽化学法，或如本发明实施例3详述的固相合成与液相合成的组合在肽合成仪上合成肽，包括HIV融合抑制肽和基本序列。在本实施例中，所述HIV融合抑制肽可进一步包含反应性官能团，即大部分所述反应性官能团在N端被乙酰基保护和/或在C端被酰胺基保护。从树脂上脱离后，所述肽被沉淀，所述沉淀被冻干。然后使用反相高效液相色谱纯化所述肽；用电喷雾质谱法确认肽的身份。
生物物理参数的评估包括测定螺旋度和热稳定性。使用圆二色谱(“CD”)如下测定螺旋度。简单地说，使用配有热电温控器的分光计获得CD光谱。光谱获得条件为：25℃，从200到260nm步进0.5纳米(nm)，带宽1.5nm，典型平均时间4秒/步。扣除细胞/缓冲液空白后，使用保守窗口大小通过三阶最小二乘多项式拟合平滑光谱以给出随机残差。原始椭圆率数值使用标准方法转换为平均残基椭圆率，并用波长(200到260nm)对[θ]×10-3(度cm2/dmol)作图。然后使用标准方法计算百分比螺旋度值(通常表示为10μM、25℃的百分比螺旋度)。热稳定性评估如下进行：当以2℃步进升高温度时监测CD信号在222nm处的变化，平衡时间为1分钟。每个样品(例如HIV融合抑制肽)的热稳定性(以Tm值表示)是对应于热转变一阶导数最大值的温度。
生物学性质的评估包括测定对HIV-1毒株的抗病毒活性。在确定HIV融合抑制肽抗病毒活性(例如，一种测量是抑制HIV向靶细胞传递的能力)时，使用了体外分析，通过使用源于HIV gp41HR区域的肽产生的数据，所述体外分析已经显示对体内观察到的抗病毒活性具有预测性。更具体地，对于相同的源于HIV gp41的肽，使用体外感染性分析(“Magi-CCR5感染性分析”，参见例如美国专利号6,258,782)观察到的抗病毒活性已显示出与体内抗病毒活性合理相关(参见，例如Kilby等人，1998，Nature Med.4：1302-1307)。所述分析使用指示细胞系MAGI或表达衍生cMAGI的CCR5对感染性病毒滴度降低进行记分。上述两种细胞系都利用HIV-1 tat的能力以反式激活HIV-LTR驱动的β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因的表达。所述β-gal报告基因已被修饰以定位在细胞核内，并可在感染后几天内用X-gal底物强烈核染色检测。如果染色前只有一轮感染，被染色的核数量就可解释为等于激发接种物(challengeinoculum)中的感染性病毒粒子数量。感染的细胞用CCD-成像器计数，原代细胞和实验室改变的分离株都显示出病毒输入和成像器显示的感染细胞数量之间的线性关系。在MAGI和cMAGI分析中，感染性滴度降低50％(Vn/Vo＝0.5)是显著的，并提供了评估抗病毒活性的主要截断值(“IC50”定义为导致感染性病毒滴度降低50％的活性成分浓度)。用于测试抗病毒活性的肽被稀释成多种浓度，并针对HIV接种进行2次或3次重复测试，所述HIV接种物经调整在48孔微量滴定板中产生约1500到2000个感染细胞/孔。所述肽(在相应稀释中)被加入cMAGI或MAGI细胞中，然后是病毒接种物；24小时后，加入感染和细胞-细胞融合抑制剂(例如SEQ ID NO：2(恩夫韦地))以防止第二轮HIV感染和细胞-细胞病毒传播。所述细胞再培养2天，然后固定并用X-gal底物染色以检测HIV感染细胞。每个对照和肽稀释物的感染细胞数量用CCD成像器确定，然后计算IC50(以μg/ml表示)。
对由基本序列组成的肽的抗病毒活性具有抗性的病毒可使用标准的实验室方法制备。基本而言，在计算IC50和IC90后，细胞与病毒和肽(例如浓度接近IC90)在培养物中混合(包括当所述细胞此后分瓶时)。维持并监测所述培养物直至合胞体出现。从第一轮培养收获的病毒用于在第二轮培养中感染细胞，肽的浓度高于(2到4倍)第一轮培养使用的浓度。维持并监测第二轮培养物中对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒的存在。可能需要随后几轮培养以最终产生对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒分离株(在抗此类分离株的肽的IC50预定水平)。
为确定药代动力学性质，将HIV融合抑制肽或衍生出HIV融合抑制肽的基本序列静脉内施用到猕猴(Macaca fasicularis)(如本领域已知，其它动物模型也可用于确定药代动力学性质)。在施用后多个时间点抽取血样并离心分离血浆。冷冻保存血浆样品直至在电喷雾阳离子模式下进行LC-MS(液相色谱/质谱)分析。使用pH6.8的10mM乙酸铵缓冲液中的乙腈梯度将HIV融合抑制剂或基本序列从C18或C8HPLC柱上洗脱。分析时，使用2倍或3倍体积的包含0.5％甲酸的乙腈将血浆样品去蛋白。猕猴血浆样品的双份校准标准与所述样品同时制备，并在所述包含HIV融合抑制肽或基本序列的样品之前或之后分析。使用单指数或双指数数学模型从血浆浓度-时间数据计算出药代动力学性质。通过非线性最小二乘优化获得模型。使用了浓度1/C2权重。使用以下方程计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、全身清除率(Cl)、和末端消除半衰期(t1/2)。
AUC＝A/-a+B/-b
其中A和B为截距，a和b为指数方程的速率常数，分别描述分布期和消除期。当使用单指数模型时，消除参数“A”和“a”。
Cl＝剂量/AUC(以L/K/hr表示)
t1/2＝-0.6903/b(以小时(hr)表示)
实施例2
为说明本发明提供的实施方案，基本序列具有如下氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。
TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL
在一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于2个亮氨酸拉链样基序。这些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于，SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13；或与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、或SEQ ID NO：13中任一序列相比具有1到3个氨基酸差异(例如，至少92％一致性)的氨基酸序列；每个HIV融合抑制肽具有3到5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列。以下图示(I)显示了HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸编码(“L”表示亮氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的1或8位点，或一个亮氨酸拉链样基序的8位点和相邻亮氨酸拉链样基序的1位点)用下划线标示。一个亮氨酸拉链的1或8位点也可作为序列中另一亮氨酸拉链样基序的相对末端位点，即作为一个基序的8位点和另一相邻基序的1位点。
Figure A20088001870100451
在另一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于1个亮氨酸拉链样基序，以及不参与形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸。这些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、和SEQ ID NO：15；或与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15中任一序列相比具有1到3个氨基酸差异(例如，至少92％一致性)的氨基酸序列；并且每种HIV融合抑制肽氨基酸序列与SEQ ID NO：5基本序列的不同点在于包含多于1个亮氨酸拉链样基序，以及不参与形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸(即，除亮氨酸拉链样基序1或8位点以外的亮氨酸)。在一个实施方案中，非亮氨酸拉链样基序亮氨酸替换在SEQ ID NO：5基本序列的氨基酸位点21替换了异亮氨酸，该替换提供了促进所述肽的有利生物学性质的因素。以下图示(II)显示了HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“|”对齐)用单字母氨基酸编码(“L”表示亮氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的1或8位点，或一个亮氨酸拉链样基序的8位点和相邻亮氨酸拉链样基序的1位点)用下划线标示。不参与形成亮氨酸拉链样基序的亮氨酸为斜体。
以下图示(III)显示了“基本序列”SEQ ID NO：5与本发明公开的SEQ IDNO：9-15肽的比较总结，SEQ ID NO：9-15肽相对于SEQ ID NO：5显示出改善的生物学性质。SEQ ID NO：9-15中各序列相对于SEQ ID NO：5基本序列的氨基酸替换用下划线和粗体标示。
Figure A20088001870100471
参考表1，将根据本发明的HIV融合抑制肽与合成肽比较，所述合成肽具有相同的基本序列，但氨基酸序列有所不同(与SEQ ID NO：9-15比较)，并具有抗HIV活性。所述比较包括用本发明实施例1所述的方法确定的生物物理参数和生物活性参数。在确定生物活性时，由于通过抗病毒活性进行评估，使用了病毒分离株，所述病毒分离株对已知抑制HIV介导的融合的某些肽的抗病毒活性具有抗性(所述抗性病毒分离株在表1中命名为“Res”)。
表1：生物物理学和生物学(抗病毒活性)参数
  SEQ IDNO：   螺旋度(％)   Tm(℃) 抗病毒活性(μg/ml)HIV-IIIB IC50  抗病毒活性(μg/ml)HIV-Res IC50
  5   71   42   ＜0.10   ＜0.10
  6   97   65  ＜ 0.10   ≥0.10
  7   84   75   ＜0.10   ＞0.10
  8   99   46   ＜0.10   未测试
  9   61   62   ＜0.10   ＜0.10
  10   77   75   ＜0.10   ＜0.10
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7与基本序列SEQ ID NO：5的不同在于单个亮氨酸替换(分别位于24位点和31位点)；如以上表1所示，所述替换没有显著地影响抗病毒活性，但导致了半衰期的改善(参见以下表2)。SEQ ID NO：6与根据本发明具有SEQ ID NO：9的HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有另一个氨基酸差异，氨基酸位点21的亮氨酸(而SEQ IDNO：6在氨基酸位点21是异亮氨酸)。参考表1，与SEQ ID NO：6的肽比较，SEQ ID NO：9中亮氨酸替换异亮氨酸导致螺旋度降低(从97％到61％)，同时保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res”的活性)。类似地，SEQ ID NO：7的氨基酸序列与根据本发明具有SEQ ID NO：10的HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有一个氨基酸差异，氨基酸位点21的亮氨酸(而SEQ ID NO：7在氨基酸位点21是异亮氨酸)。参考表1，与SEQ ID NO：7的肽比较，SEQ ID NO：10中亮氨酸替换异亮氨酸导致螺旋度降低(从84％到77％)，同时保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res”的活性)。因此，表1显示了SEQ ID NO：9和10相对于SEQ ID NO：6-7的改善性质。
本实施方案说明了与基本氨基酸序列相比，根据本发明的HIV融合抑制肽的药代动力学性质。使用实施例1此前详述的评估药代动力学性质的方法，表2说明了与基本序列SEQ ID NO：5的药代动力学性质相比，根据本发明的HIV融合抑制肽的药代动力学性质。
表2
  SEQ ID NO： 清除率(L/kg/hr) 半衰期(t1/2：hr)
  5   ＞0.04   6
  6   ＜0.02   15
  7   ＜0.02   17
  8   ＞0.04   7
  9   ＜0.02   12
  10   ＜0.02   21
如表2所示，SEQ ID NO：6、7、9和10都显示出延长的生物半衰期(“t1/2”)。SEQ ID NO：8在氨基酸位点21而非氨基酸位点24或31为亮氨酸，没有显示出SEQ ID NO：6、7、9和10肽所显示的显著延长的半衰期。
为了在生产药物制剂时将HIV融合抑制肽配制到药学可接受载体中，在水溶液中的稳定性可能是重要的参数，尤其是当药物制剂被肠胃外施用时。应注意到，根据本发明的HIV融合抑制肽在生理pH下显示出在水溶液中改善的稳定性。例如，如下分别测试具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5氨基酸序列的合成肽，和具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的溶解度：向磷酸缓冲液(PBS)中加入浓度为10mg/ml的所述肽，在1周(168小时)时间中的不同时间点，测定(例如用HPLC)在37℃下约pH 7.3到约pH 7.5范围内的溶液中残留的肽的量。包含SEQ ID NO：2的溶液在仅仅数小时后变得不稳定(溶液中检测到最少量的肽)。相反，在1周的时间点仍可在溶液中检测到90％或更多的HIV融合抑制肽具有SEQ ID NO：9氨基酸序列，但是在1周的时间点只可在溶液中检测到少于80％的肽具有SEQ ID NO：5氨基酸序列。
实施例3
将本发明提供的HIV融合抑制肽的生物学性质与其它公认的有效抗病毒药剂(包括SEQ ID NO：2(恩夫韦地))进行了比较。尤其是，将感兴趣的新化合物SEQ ID NO：9与公认的抗病毒剂SEQ ID NO：2进行了体外抗性比较研究，详述如下：MT2细胞用病毒分离株(IIIB、030、060和098)感染，并在浓度逐渐升高的SEQ ID NO：2(恩夫韦地)或SEQ ID NO：9中培养以选择抗性。初始肽浓度约为各个肽对相应野生型分离株的IC50的2倍。通过每1-3天添加新鲜肽保持肽浓度。使用标准技术监测培养物的细胞病理效应(CPE)，当达到最大CPE时，将一小等份病毒用于随后轮次的感染。与野生型病毒生长速率比较，根据培养时间，肽浓度升高2到4倍。在选择期间，也收集不含肽的病毒储液。不含肽的病毒储液用双脱氧测序化学法鉴定gp41的基因型改变，并使用cMAGI感染性分析确定表型易感性。
使用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9进行体外选择的比较结果如表3所示。这些数据显示SEQ ID NO：9选择的培养时间比SEQ ID NO：2选择平均长3倍，导致IC50更低的倍数改变(SEQ ID NO：2的42倍与SEQ ID NO：9的24倍相比)。SEQ ID NO：9选择需要的突变(几何平均数3.6)比SEQ ID NO：2(几何平均数1.7)更多以达到所述更低的倍数改变。更长的培养时间、更低的倍数改变、以及实现所述更低的倍数改变所需的更高的突变数量，都表明与SEQ ID NO：2相比，SEQ ID NO：9显示出更不易发展体外抗性。也就是说，所述结果说明HIV出现对SEQ ID NO：9的抗性比出现对SEQ ID NO：2的抗性需要更长的时间。基于以前对其它肽例如SEQ ID NO：2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可预期本发明提供的体外结果可与体内结果合理地关联。
表3：SEQ ID NO：2(恩夫韦地)与SEQ ID NO：9体外选择的比较
  起始病毒分离株   肽(SEQ ID NO)   培养天数   起始IC50(ng/mL)   终止IC50(ng/mL)   IC50倍数变化   获得突变的数目
  IIIB   2   62   6   163   27   2
  584.000030   2   46   42   798   19   2
  584.000060   2   46   10   68   7   2
  584.000098   2   45   50   45575   912   1
  几何平均值   2   49   19   797   42   1.7
  起始病毒分离株   肽(SEQ ID NO)   培养天数   起始IC50(ng/mL)   终止IC50(ng/mL)   IC50倍数变化   获得突变的数目
  IIIB   9   168   12   2768   231   4
  584.000030   9   77   28   113   4   2
  584.000060   9   173   8   208   26   4
  584.000098   9   173   37   521   14   5
  几何平均值   9   140   18   429   24   3.6
基于以前对其它肽例如SEQ ID NO：2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可预期本发明提供的体外结果应与体内结果合理相关联(参见，例如Melby等人，2006，AIDS Research and Human Retroviruses 22(5)：375-385；Greenberg&Cammack，2004，J.Antimicrobial Chemotherapy 54：333-340；Sista等人，2004，AIDS 18：1787-1794)。
实施例4
一般而言，本发明提供的HIV融合抑制肽可通过两种方法中的一种合成。第一种方法为使用标准固相合成技术和使用标准Fmoc肽化学法或其它标准肽化学法(使用CPG)的线性合成。合成本发明提供的HIV融合抑制肽的第二种方法为通过片段缩合法。简单地说，合成2个或多个片段，每个片段包含所要制备的HIV融合抑制肽完整氨基酸序列的相应部分。在片段合成中，如果需要，加入的氨基酸可具有被化学保护剂化学保护的游离胺(例如侧链胺)。然后组装(以一定方式和顺序共价结合)所述片段，由此制备(以正确的氨基酸序列)所述HIV融合抑制肽。
关于肽合成，可使用肽序列合成领域技术人员熟知的技术制备各个肽片段自身，以及由一组肽片段组合生产的本发明提供的HIV融合抑制肽。例如，在一种方法中，肽片段可在固相中合成，然后在组装过程中在液相中组合以制备产物HIV融合抑制肽。在另一种方法中，可使用液相合成制备肽片段，然后所述肽片段在组装过程中在固相中组合以制备HIV融合抑制肽。在另一种方法中，各种肽片段可使用固相合成，然后在组装过程中在固相中组合以制备HIV融合抑制肽的完整氨基酸序列。在一个实施方案中，使用本领域技术人员熟知的固相合成法制备各个肽片段。在另一个实施方案中，使用一组肽片段并使用固相和液相技术组合的组装过程制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。例如，一组肽片段包含2到4个肽片段，所述片段被合成，然后组装，以完成本发明提供的HIV融合抑制肽的合成。基于本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，所述的片段组装方法可用于、且已经被用于具有SEQ ID NO：9-16中任一序列的氨基酸序列的一些HIV融合抑制肽。
为说明通过片段缩合法制备本发明提供的HIV融合抑制肽，在合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中，一组肽片段中的肽片段在肽片段组装过程中共价结合。本发明提供的肽片段可包括但不限于，具有如下表4所示氨基酸序列的肽片段。本发明提供的某些肽片段可用于排除其它肽片段。还标示了各种肽片段在SEQ ID NO：9中的对应氨基酸；因此，显示出各种肽片段由SEQ ID NO：9氨基酸序列中多个连续的氨基酸组成。
表4
 SEQID NO：   氨基酸序列 在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
  17   TTWEAWDRAIAE   1-12
  18   YAARIEALLRALQE   13-26
  19   QQEKNEAALRE   27-37
  20   QQEKNEAALREL   27-38
  21   TTWEAWDRAIA   1-11
  22   EYAARIEALLRALQE   12-26
  23   TTWEAWDRAI   1-10
  24   AEYAARIEALLRALQE   11-26
  25   TTWEAWDRA   1-9
  26   IAEYAARIEALLRALQE   10-26
  27   TTWEAWDR   1-8
  28   AIAEYAARIEALLRALQE   9-26
  29   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL   1-20
  30   LRALQEQQEKNEAALRE   21-37
  31   LRALQEQQEKNEAALREL   21-38
  32   TTWEAWDRAIAEYAARIE   1-18
  33   ALLRALQEQQEKNEAALRE   19-37
  34   ALLRALQEQQEKNEAALREL   19-38
  35   YAARIE ALLRALQEQQEKNAEAALREL   13-38
  36   EYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL   12-38
  37   AEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL   11-38
  38   IAEYAARIE ALRALQEQQEKNEAALREL   10-38
  39   AIAEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL   9-38
  40   TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE   1-26
本发明还提供了特定的肽片段组，所述肽片段组在合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括1-16组，如表5所示(组的编号仅为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。
表5
  组号   肽片段 在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
  1   TTWEWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-1213-2627-37
  2   TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：18)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-1213-2627-38
  3   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：30)   1-2021-37
  4   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：31)   1-2021-38
  5   TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-1112-2627-37
  6   TTWEAWRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-1011-2627-37
  7   TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：26)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-910-2627-37
  8   TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-89-2627-37
  9   TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：22)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-1112-2627-38
  10   TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：24)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-1011-2627-38
  11   TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-910-2627-38
  12   TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：28)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-89-2627-38
  13   TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALRE(SEQ ID NO：33)   1-1819-37
  14   TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRALQEQQEKNEAALREL(SEQ ID NO：34)   1-1819-38
  15   TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)QQEKNEAALRE(SEQ ID NO：19)   1-2627-37
  16   TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE(SEQ ID NO：40)QQEKNEAALREL(SEQ ID NO：20)   1-2627-38
因此，在一个实施方案中，本发明提供了可用于合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本发明描述中还显而易见的是，所述方法、肽片段、和肽片段组可用于合成具有SEQ IDNO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所述HIV融合抑制肽包含一个或多个化学基团：
Figure A20088001870100551
其中一个或多个氨基末端、羧基末端、或侧链游离反应性官能团(例如内部赖氨酸的ε胺)用化学基团(B、U、Z；其中B、U、Z可为相同的化学基团或不同的化学基团)修饰，所述化学基团可包括但不限于，一种或多种以下基团：反应性官能团、化学保护基团(CPG)、和接头。本领域还已知可用于在肽片段N端、或肽片段C端、在内部氨基酸的游离胺、或其组合处引入化学基团的技术。与制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽有关，被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的肽片段)的示例性实例包括但不限于，表6中所列的肽片段。
表6
 SEQID NO：   氨基酸序列   在SEQ ID NO：9中的氨基酸位点
  17   Ac-TTWEAWDRAIAE   1-12
  18   CPG-YAARIEALLRALQE   13-26
  19   CPG-QQEKNEAALRE   27-37
  19   CPG-QQEKNEAALREIU   27-37
  20   QQEKNEAALREL-NH2   27-38
  29   Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL   1-20
  30   CPG-LRALQEQQEKNEAALRE   21-37
  31   LRALQEQQEKNEAALRE L-NH2   21-38
  21   Ac-TTWEAWDRAIA   1-11
  22   CPG-EYAARIEALLRALQE   12-26
  23   Ac-TTWEAWDRAI   1-10
  24   CPG-AEYAARIEALLRALQE   11-26
  25   Ac-TTWEAWDRA   1-9
  26   CPG-IAEYAARIEALLRALQE   10-26
  27   Ac-TTWEAWDR   1-8
  28   CPG-AIAEYAARIEALLRALQE   9-26
  32   Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE   1-18
  33   CPG-ALLRALQEQQEKNEAALRE   19-37
  34   ALLRALQEQQEKNEAALREL-NH2   19-38
Ac-乙酰基，NH2-氨基(但可为其它化学基团，如本发明“定义”部分详述)；CPG为化学保护基团(例如，Fmoc或其它N端化学保护基团，如本文“定义”部分详述)；U如上定义。
实施例5
参考表5(组1和组2)和图3，说明了使用3种特定肽片段(例如SEQ IDNO：17-19+Leu；或SEQ ID NO：17、18、和20)并使用片段缩合法合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，所述片段缩合法包括将3个肽片段组合以制备HIV融合抑制肽。每个所述肽片段显示出的物理性质和溶解度特性使所述肽片段成为优选肽片段(相对于二片段法)，以用于以高产量和高纯度合成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，且进一步只需一种加样树脂作为起始材料(简化合成方法)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：17氨基酸序列且包含SEQ ID NO：9前12位氨基酸(参见图3，“AA(1-12)”)的肽片段(使用超酸敏感树脂，例如4-羟甲基-3-甲氧苯氧基丁酸树脂、或2-氯三苯甲基氯树脂-“CTC”，图3)，所述片段N端乙酰化(“Ac”，作为化学基团)，C端具有羟基(-OH)(参见图3，“Ac-AA(1-12)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：18氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第13-26位氨基酸(参见图3，“AA(13-26)”)的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作为化学保护基团)，C端具有-OH(参见图3，“Fmoc-AA(13-26)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：19氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第27-37位氨基酸(参见图3，“Fmoc-AA(27-37)-OH”)的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作为化学保护基团)，C端具有-OH(参见图3，“Fmoc-AA(27-37)-OH”)。使用本领域技术人员熟知的裂解剂、溶剂、和技术将各个肽片段从固相合成树脂上裂解。然后如下分离各个肽片段：通过蒸馏去除上述溶剂的大部分，并通过加水(加或不加含醇的助溶剂)沉淀所述肽片段。所得固体通过过滤分离、洗涤、在水或乙醇/水中重新制浆、再过滤、并在真空炉中干燥。
如图3所示，通过液相合成制备肽片段，其中具有SEQ ID NO：19氨基酸序列的肽片段(参见图3，“FmocAA(27-37)-OH”)与SEQ ID NO：9第38位氨基酸亮氨酸(已在液相中被酰胺化)化学结合，从而生成具有SEQ ID NO：20氨基酸序列的肽片段(包含SEQ ID NO：9中第27-38位氨基酸)，所述肽片段C端酰胺化(作为化学基团)(参见图3，“Fmoc-AA(27-38)-NH2”)。在一种合成方法中，本发明提供的酰胺化肽片段(包括但不限于肽片段H-AA(27-38)-NH2)可使用酰胺树脂直接合成。总结所述液相反应，分离的肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH的羧基端被转换成活性酯HOBT(1-羟基苯并三唑水合物)、6-Cl HOBT、或HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三唑)，在DIEA(二异丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如，偶联剂和消旋抑制剂的组合)存在下，所述转换分别使用HBTU(O-苯并三氮唑1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯)或TBTU(O-苯并三氮唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯)、以及HOBT、6-Cl HOBT、或HOAT。所述反应在0到30℃在极性非质子溶剂例如DMF(二甲基甲酰胺)或NMP(N-甲基吡咯烷酮)中进行。所述偶联反应完成时，将哌啶、碳酸钾、DBU或本领域技术人员熟知的其它碱加入到所述反应中(加或不加另外的助溶剂)以有效去除末端Fmoc保护基团。所述反应完成时，加入醇或可与水混溶的溶剂和/或水以沉淀肽片段，所述肽片段具有SEQ ID NO：20氨基酸序列，并在C端酰胺化(H-AA(27-38)-NH2)。
如图3图解说明，为在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH与亮氨酰胺(参见图3，“H-Leu-NH2”)组合制备肽片段H-AA(27-38)-NH2，将所述肽片段Fmoc-AA(27-37)-OH(571g，205mmol，1当量)、H-Leu-NH2(32.0g，246mmol，1.2当量)、和6-Cl HOBT(41.7g，246mmol，1.2当量)加入到DMF(4568ml，8体积)中，用DIEA(53.6ml，307.5mmol，1.5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约20分钟)。将所述溶液冷却，并加入TBTU(79.0g，246mmol，1.2当量)。将所述反应在0℃搅拌，然后在25℃搅拌。当HPLC分析显示所述反应完成时，加入哌啶(81ml，820mmol，4当量)以去除所述肽片段Fmoc-AA(27-38)-NH2的Fmoc保护基团(也可使用其它碱，例如碳酸钾、DBU等)。将反应在30℃搅拌，直至HPLC显示反应完成。然后将所述反应混合物冷却至5℃以下，并缓慢加入预冷水(8体积，4568mL)保持所得浆体温度低于10℃。将悬浮液搅拌30分钟，然后过滤并用25％乙醇/水洗涤2次(每次2284mL，4体积)。通过在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆以去除残留哌啶和哌啶二苄基富烯。如图3所示，产物为分离的肽片段H-AA(27-38)-NH2制剂。
如图3说明，进行液相反应，其中肽片段H-AA(27-38)-NH2(SEQ ID NO：20)与肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(SEQ ID NO：18)组合，并去保护产生肽片段H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO：35，在N端和C端都具有化学基团)。
将肽片段Fmoc-AA(13-26)-OH(460g，167mmol，1当量)、肽片段H-AA(27-38)-NH2(460g，172mmol，1.03当量)、和6-Cl HOBT(34g，200mmol，1.2当量)加入到DMF(6900ml，15体积)中，用DIEA(47ml，267mmol，.1.6当量)处理，并搅拌以溶解所有固体。将所得溶液冷却至5℃以下。向反应中加入TBTU(64g，200mmol，1.2当量)，且将反应在0℃搅拌，然后在25℃搅拌。一旦HPLC分析显示所述反应完成，加入哌啶(58ml，668mmol，4当量)以去除Fmoc，然后搅拌所述反应直至HPLC显示反应完成。将溶液冷却至5℃以下，并以一定速率缓慢加入水(6900mL，15体积)使得温度不会升到10℃以上。将所得悬浮液搅拌30分钟后，通过过滤收集固体并用水洗涤(2次，每次2300mL，5体积)并干燥。通过在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆去除残留哌啶和哌啶二苄基富烯。通过过滤收集固体、洗涤、并干燥以产生基本纯的白色固体H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO：35)，由高效液相色谱(HPLC)纯度分析确定。
如图3说明的，肽片段H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO：35)在液相反应中与肽片段Ac-(1-12)-OH(SEQ ID NO：17)组装以产生具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如图3，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段Ac-AA(1-12)-OH(130g，58.5mmol，1当量)研磨成细粉并与肽片段H-AA(13-38)-NH2(303g，58.5mmol，1当量)混合。将所述混合物缓慢加入到2∶1DCM/DMF(20体积，2600mL)和DIEA(25.5mL，146mmol，2.5当量)温热溶液中。加入HOAT(15.9g，117mmol，2.0当量)且搅拌所述混合物以溶解所有固体。将所得溶液冷却至5℃以下，并加入TBTU(28.2g，87.8mmol，1.5当量)。将溶液在0℃搅拌30分钟，然后在25℃搅拌，直至HPLC显示反应完成。将所述溶液加热到30-35℃，并加入额外的DCM(13体积，1740mL)和水(1820mL，14体积)。将所述混合物搅拌5分钟，然后允许分层。去除水层并替换为新鲜水(1820ml，14体积)。分层重复总计5次。将有机层蒸馏至原体积1/3，并加入异丙醇(IPA；1820ml，14体积)。继续蒸馏以去除残留DCM。将所得浆体冷却至5℃以下，并缓慢加入水(1820ml，14体积)。形成的固形通过过滤收集，用水洗涤2次(每次520mL，4体积)，并干燥以产生分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：9)制剂，由HPLC纯度分析确定。
如图3所示，可通过酸解或本领域技术人员熟知的其它通过去除侧链化学保护基团将肽去保护的方法去除HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2的侧链化学保护基团。在本实施例中，HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(60g，8.1mmol)用TFA(三氟乙酸)∶DDT(二硫苏糖醇)∶水(90∶10∶5；570ml)处理，并在室温搅拌6小时。将该溶液冷却至10℃以下，并以一定速率缓慢加入预冷MTBE(25体积，1500ml)使得温度保持低于10℃。生成的固体通过过滤收集，用MTBE洗涤，并干燥。然后将所得粉末在乙腈(ACN；10体积，600mL)中制浆，用DIEA和乙酸调节pH至4到5之间，以使所述肽脱羧基。一旦HPLC显示所述反应完成，通过过滤收集固体，用ACN洗涤，并干燥以产生去保护且脱羧基的肽制剂，然后所述肽制剂通过HPLC或其它合适的色谱技术纯化，以产生具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的分离的HIV融合抑制肽制剂。
实施例6
参考表5(组3和组4)和图4，说明了使用2个特定肽片段(例如SEQ IDNO：29和30+Leu；或SEQ ID NO：29和31)并使用片段组装法合成具有SEQ IDNO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，所述片段组装法包括将2个肽片段通过化学结合(“组装”)进行组合以生成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。每种所述肽片段显示出的物理性质和溶解度特性使所述肽片段成为优选肽片段，用于使用2个肽片段以高产量和高纯度合成具有SEQID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中。在选择用于二片段组装方法的肽片段时，发现在被组装的2个片段之间的接合点(例如，具有SEQ IDNO：29氨基酸序列的肽片段C端，和具有SEQ ID NO：31氨基酸序列的肽片段N端)具有亮氨酸和/或谷氨酸有利于以高产量组装和获得的纯度水平。
通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：29氨基酸序列并包含SEQ IDNO：9前20位氨基酸(“AA(1-20)”)的肽片段，所述片段N端乙酰化(“Ac”，作为化学基团)，C端具有羟基(-OH)(参见图6；本文中也被称为“Ac-AA(1-20)-OH”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO：30氨基酸序列并包含SEQ ID NO：9中第21-37位氨基酸(“AA(21-37)”)的肽片段，所述片段N端具有Fmoc(作为化学保护基团)，C端具有-OH(参见图6；本文中也被称为“Fmoc-AA(21-37)-OH”)。
如表5组3和组4以及图4所示，通过液相合成制备肽片段，其中肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH化学结合到已在液相中酰胺化的SEQ ID NO：9第38位氨基酸亮氨酸上以生成具有SEQ ID NO：31氨基酸序列的肽片段(包含SEQID NO：9中第21-38位氨基酸)，所述肽片段C端酰胺化(作为化学基团)(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)。为了在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH与亮氨酸(“H-Leu-NH2”)组合制备肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2，将肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH(30g，7.43mmol，1.0当量)、H-Leu-NH2*HCl(1.36g，8.16mmol，1.2当量)、和HOAT(1.52g，11.2mmol，1.5当量)溶解于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(6.5ml，37.3mmol，5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约30分钟)。将该溶液冷却至0±5℃，并加入TBTU(2.86g，8.91mmol，1.2当量)，在0±5℃搅拌5分钟，然后在25±5℃反应2小时或直至HPLC显示反应完成。
在分离片段H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fmoc化学保护基团。加入哌啶(7.3mL，73.8mmol，10当量)，且将所述溶液在25±5℃搅拌1小时或直至HPLC分析显示基本所有Fmoc从所述肽片段去除。冷却反应器，加入水(1000ml，30体积)，在10℃以下搅拌自由流动的浆体30分钟，然后通过过滤分离。用1∶1乙醇/水洗涤收集的固体，并在真空炉中在35±5℃干燥。然后将肽片段在1∶1乙醇/水(450mL，15体积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体。然后所述肽片段在3∶1正己烷∶MTBE(450mL，15体积)中制浆过夜，然后通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制浆可重复以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH2制剂(参见图4)。
然后进行了液相反应，其中将肽片段H-AA(21-38)-NH2(SEQ ID NO：31)与肽片段Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29)组合，以生成具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见图4，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段H-AA(21-38)-NH2(3.40g，0.86mmol，1当量)、肽片段Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)、以及HOAT(0.177g，1.3mmol，1.5当量)和DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(二甲基乙酰胺；100ml，33体积)，冷却至0±5℃。向反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。将所述反应在0±5℃搅拌5分钟，并在25±5℃搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(200ml，66体积)。形成浆体并在10℃以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用另外的水洗涤。在真空炉中在35±5℃干燥收集的固体。所得产物是完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：9)制剂，由HPLC纯度分析确定。然后使用本发明实施例5所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV融合抑制肽去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)，然后纯化(例如通过HPLC)。所得产物是具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(在本说明中，N端乙酰化，C端酰胺化)制剂(去保护且脱羟基的)。
使用相似的技术和条件，使用其它涉及2个片段组装或3个片段组装的片段组装法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表4和5)。从本文描述应理解，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选肽片段可用于排除优选肽片段以外的肽片段。同样地，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO：9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选肽片段组可用于排除优选肽片段组以外的肽片段组。
实施例7
本发明的另一实施方案涉及可用于合成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本文描述中还显而易见的是，所述方法、肽片段、和肽片段组可用于合成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所述HIV融合抑制肽包含一个或多个化学基团：
Figure A20088001870100641
其中氨基末端或羧基末端之一或两者用化学基团(B、U、Z；其中B、U、Z可为相同的化学基团或不同的化学基团)修饰，所述化学基团可包括但不限于一种或多种以下基团：反应性官能团、化学保护基团(CPG)、和接头。涉及到制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽时，肽片段、肽片段组、和被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的肽片段)的示例性实例包括但不限于，表7、8、和9中分别所列的肽片段。
表7
  SEQIDNO：   氨基酸序列  在SEQ ID NO：10中的氨基酸位点
  17   TTWEAWDRAIAE   1-12
  41   YAARIEALLRAAQE   13-26
  42   QQEKLEAALRE   27-37
  43   QQEKLEAALREL   27-38
  21   TTWEAWDRAIA   1-11
  44   EYAARIEALLRAAQE   12-26
  23   TTWEAWDRAI   1-10
  45   AEYAARIEALLRAAQE   11-26
  25   TTWEAWDRA   1-9
  46   IAEYAARIEALLRAAQE   10-26
  27   TTWEAWDR   1-8
  47   AIAEYAARIEALLRAAQE   9-26
  29   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL   1-20
  48   LRAAQEQQEKLEAALRE   21-37
  49   LRAAQEQQEKLEAALREL   21-38
  32   TTWEAWDRAIAEYAARIE   1-18
  50   ALLRAAQEQQEKLEAALRE   19-37
  51   ALLRAAQEQQEKLEAALREL   19-38
  52   YAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL   13-38
  53   EYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL   12-38
  54   AEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL   11-38
  55   IAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL   10-38
  56   AIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL   9-38
  57   WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF
  58   YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT
  59   YQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL
本发明进一步提供了特定的肽片段组，所述肽片段组在合成具有SEQ IDNO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括表8所示的组1-14(组的编号只为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。
表8
  组号   肽片段  在SEQ ID NO：10中的氨基酸位点
  1   TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：41)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42)   1-1213-2627-37
  2   TTWEAWDRAIAE(SEQ ID NO：17)YAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：41)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43)   1-1213-2627-38
  3   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRAAQEQQEKLEAALRE(SEQ ID NO：48)   1-2021-37
  4   TTWEAWDRAIAEYAARIEAL(SEQ ID NO：29)LRAAQEQQEKLEAALREL(SEQ ID NO：49)   1-2021-38
  5   TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：44)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42)   1-1112-2627-37
  6   TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：45)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42)   1-1011-2627-37
  7   TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：46)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：42)   1-910-2627-37
  8   TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：47)QQEKLEAALRE(SEQ ID NO：43)   1-89-627-37
  9   TTWEAWDRAIA(SEQ ID NO：21)EYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：44)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43)   1-1112-2627-38
  10   TTWEAWDRAI(SEQ ID NO：23)AEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：45)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43)   1-1011-2627-38
  11   TTWEAWDRA(SEQ ID NO：25)IAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：46)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43)   1-910-2627-38
  12   TTWEAWDR(SEQ ID NO：27)AIAEYAARIEALLRAAQE(SEQ ID NO：47)QQEKLEAALREL(SEQ ID NO：43)   1-89-2627-38
  13   TWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRAAQEQQEKLEAALRE(SEQ ID NO：50)   1-1819-37
  14   TTWEAWDRAIAEYAARIE(SEQ ID NO：32)ALLRAAQEQQEKLEAALREL(SEQ ID NO：51)   1-1819-38
表9
  SEQID NO：   氨基酸序列  在SEQ ID NO：10中的氨基酸位点
  17   Ac-TTWEAWDRAIAE   1-12
  41   CPG-YAARIEALLRAAQE   13-26
  42   CPG-QQEKLEAALRE   27-37
  42   CPG-QQEKLEAALREIIvDde   27-37
  43   QQEKLEAALREL-NH2   27-38
  29   Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL   1-20
  48   CPG-LRAAQEQQEKLEAALRE   21-37
  49   LRAAQEQQEKLEAALREL-NH2   21-38
  21   Ac-TTWEAWDRAIA   1-11
  44   CPG-EYAARIEALLRAAQE   12-26
  23   Ac-TTWEAWDRAI   1-10
  45   CPG-AEYAARIEALLRAAQE   11-26
  25   Ac-TTWEAWDRA   1-9
  46   CPG-IAEYAARIEALLRALQE   10-26
  27   Ac-TTWEAWDR   1-8
  47   CPG-AIAEYAARIEALLRAAQE   9-26
  32   Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE   1-18
  50   CPG-ALLRAAQEQQEKLEAALRE   19-37
  51   ALLRAAQEQQEKLEAALREL-NH2   19-38
参考表8(组3和组4)，说明了使用2个特定肽片段(例如SEQ ID NO：29和48+Leu；或SEQ ID NO：29和49)并使用片段组装法合成具有SEQ IDNO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法，所述片段组装法包括通过化学结合(“组装”)组合2个肽片段以制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽。为了在液相过程中使用具有SEQ ID NO：48的肽片段(“Fmoc-AA(21-37)-OH”)与亮氨酸(“H-Leu-NH2”)组合制备具有SEQ ID NO：49的肽片段(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)，将肽片段Fmoc-AA(21-37)-OH(30.01g，7.98mmol，1.0当量)、H-Leu-NH2*HCl(1.48g，8.78mmol，1.1当量)、和HOAT(1.63g，11.97mmol，1.5当量)溶于DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(7.0ml，39.91mmol，5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约30分钟)。将所述溶液冷却至0±5℃，并加入TBTU(3.09g，9.58mmol，1.2当量)，在0±5℃搅拌5分钟，然后在25±5℃反应2小时或直至HPLC显示所述反应完成。
在分离片段H-AA(21-38)-NH2之前去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2的Fmoc化学保护基团。加入哌啶(8.0ml，79.8mmol，10当量)，并将所述溶液在25±5℃搅拌1.5小时或直至HPLC分析显示基本所有Fmoc都被从所述肽片段去除。将反应器冷却，加入水(1000ml，30体积)，在10℃以下搅拌自由流动的悬浮液30分钟，然后通过过滤分离。收集的固体用1∶3乙醇/水洗涤，并在真空炉中于35±5℃干燥。然后将肽片段在1∶3乙醇/水(400mL，13体积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体，然后将所述肽片段在3∶1正己烷∶MTBE(400mL，13体积)中制浆过夜，通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制浆可重复以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH2制剂(参见表9，SEQ ID NO：49)。
然后进行液相反应，其中肽片段H-AA(21-38)-NH2(SEQ ID NO：49)与肽片段Ac-AA(1-20)-OH(SEQ ID NO：29，表9)结合，以生成具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段H-AA(21-38)-NH2(3.14g，0.86mmol，1当量)、肽片段Ac-AA(1-20)-OH(3.00g，0.86mmol，1.0当量)、以及HOAT(0.18g，1.3mmol，1.5当量)和DIEA(0.599ml，3.44mmol，4当量)溶解于DMAc(100ml，33体积)，冷却至0±5℃。向反应中加入TBTU(0.331g，1.03mmol，1.2当量)。将所述反应在0±5℃搅拌5分钟，并在25±5℃搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(250ml，83体积)。浆体形成并在10℃以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用额外的水洗涤。收集的固体在真空炉中于35±5℃干燥。所得产物是完全保护的、分离的HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ ID NO：10)制剂，由HPLC纯度分析确定。然后使用本发明实施例4所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)。纯化后，所得产物是分离的具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(N端乙酰化，C端酰胺化)制剂(去保护且脱羟基的)，由HPLC确定。
使用相似的技术和条件，使用其它涉及2个片段组装或3个片段组装的片段组装法制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表8和9)。从本文描述应理解，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ IDNO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的肽片段可用于排除其它肽片段。同样地，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ ID NO：10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的肽片段组可用于排除其它肽片段组。
实施例8
本发明进一步提供了施用抗病毒肽例如HIV融合抑制肽(该肽本身或作为本发明提供的组合物中的活性药物物质)治疗HIV感染和/或AIDS或作为HIV感染和/或AIDS治疗方案的一部分的方法。HIV融合抑制肽的抗病毒活性可用于抑制HIV向靶细胞传递的方法，所述方法包含使病毒和/或细胞与一定量的HIV融合抑制肽，所述量有效抑制细胞HIV感染，更优选地，有效抑制HIV介导的病毒与靶细胞的融合。所述方法可用于治疗HIV感染患者(治疗用)或治疗刚刚暴露于或有高风险暴露于(例如，通过用药或高风险性行为)HIV的患者(预防用)。因此，例如，在HIV-1感染患者的例子中，有效量的HIV融合抑制肽是足以(通过该肽本身和/或与多剂量方案结合)降低所治疗患者体内HIV病毒载量的剂量。如本领域技术人员熟知，有多种测定HIV病毒载量的标准方法，包括但不限于，通过外周血单核细胞定量培养和通过血浆HIV RNA测量。所述HIV融合抑制肽可单次地、间歇地、定期地、或连续地施用，施用方式由医务人员确定，例如通过监测病毒载量。根据本发明提供的包含HIV融合抑制肽的特定组合物，以及诸如本发明提供的特定组合物是否进一步包含药学可接受载体和/或大分子载体等因素，HIV融合抑制肽可以以数天到数周或可能更长的周期施用。另外，HIV融合抑制肽在抗病毒治疗中可与其它用于治疗HIV的抗病毒药物或预防药剂组合使用或用于治疗方案(例如，同时使用、或交替与一种药物和另一种药物组合)中。
一种常用的涉及抗病毒剂组合的治疗被称为HAART(高活性抗逆转录病毒疗法)。HAART典型地组合3种或更多种具有抗HIV抗病毒活性的药物，并典型地涉及多于一类的药物(“类”涉及作用机制、或药物靶向的病毒蛋白或过程)。因此，本发明提供的包含HIV融合抑制肽的组合物可单独施用(例如作为单一疗法)或在治疗方案中施用、或共同施用，所述共同施用涉及用于治疗HIV感染和/或AIDS的其它治疗剂的组合，如本文详述。
例如，在一个实施方案中，一种或多种治疗剂可在治疗中在本发明提供的组合物中与HIV融合抑制肽组合。这些组合除所述HIV融合抑制肽以外可包含至少一种抗病毒剂。这些组合可以，例如由目前批准的或将来批准的有效剂量的抗病毒剂(用于治疗HIV感染)制备，所述抗病毒剂包括但不限于选自以下药剂的一种或多种其它治疗剂：抗病毒剂例如细胞因子，例如rIFNα、rIFNβ、rIFNγ；逆转录酶抑制剂，包括但不限于，阿巴卡韦、AZT(齐多夫定)、ddC(扎西他宾)、奈韦拉平、ddl(地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韦定、依法韦仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、泰洛福韦、和阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于，安普那韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替拉那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639；病毒mRNA加帽抑制剂，例如利巴韦林；作为具有抗HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B；作为糖蛋白加工抑制剂的澳粟精胺；病毒进入抑制剂，例如融合抑制剂(恩夫韦地、T1249、其它融合抑制肽，以及小分子)、SCH-D、UK-427857(Pfizer)、TNX-355(Tanox Inc.)、AMD-070(AnorMED)、Pro140、Pro 542(Progenies)、FP-21399(EMD Lexigen)、BMS806、BMS-488043(Bristol-Myers Squibb)、马拉维若(UK-427857)、ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD-167、和GSK-873、140(GlaxoSmithKline)；CXCR4拮抗剂，例如AMD-070；脂质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂，包括但不限于，L-870和810；RNA酶H抑制剂；rev或REV抑制剂；vif抑制剂(例如源于vif的富含脯氨酸的肽、源于HIV-1蛋白酶N端的肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于，桦木醇和二氢桦木醇衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于，AS-101、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸、和胸腺喷丁。如HIV感染和/或AIDS治疗领域技术人员所了解，组合药物治疗可包含两种或多种具有相同作用机制的治疗剂，或可包含两种或多种具有不同作用机制的治疗剂。
可与本发明提供的HIV融合抑制肽和/或组合物组合使用的所述示例性其它治疗剂的有效剂量是本领域已知的。而且，本发明提供的HIV融合抑制肽或药物组合物的施用有效剂量可通过本领域技术人员熟知的方法确定，例如通过确定效力、生物半衰期、生物利用度、和毒性来确定。在一个实施方案中，本领域技术人员使用本领域技术人员熟知的常规体外和体内研究数据确定HIV融合抑制肽的有效剂量和剂量范围。例如，诸如本发明所述的抗病毒活性的体外感染性分析使本领域技术人员可确定化合物(作为单独活性成分或与其它活性成分组合)抑制预定范围的病毒感染性(例如50％抑制，IC50；或90％抑制，IC90)或抑制病毒复制所需要的平均抑制浓度(IC)。然后本领域技术人员可使用一种或多种标准模型的药代动力学数据来选择合适的剂量，由此得到等于或超过抑制病毒感染性或病毒复制的预定值的所述活性成分的最小血浆浓度(C[min])。虽然剂量范围典型地依赖于选择的施用途径和剂量配方，当施用时，例如施用途径包括但不限于，皮下、肠胃外、皮内或口服，作为活性成分的化合物的示例性剂量范围可从约1mg/kg体重到约100mg/kg体重；且更优选地从不低于1mg/kg体重到不超过10mg/kg体重。在一个实施方案中，通过注射(使用例如皮下注射)施用。在一个实施方案中，施用HIV融合抑制肽。
因此，提供了抑制HIV向细胞传递的方法，所述方法包括施用本发明所述的组合物，所述组合物包含抑制细胞HIV感染的有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可进一步包括向患者组合施用本发明所述的组合物与其它用于治疗HIV感染和/或AIDS的治疗剂，所述方法是向个体施用包含有效量的本发明提供的HIV融合抑制肽或药物组合物的治疗剂的组合(同时或先后，或治疗方案的一部分)。还提供了抑制HIV进入的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用本发明所述的组合物，所述组合物包含抑制病毒进入靶细胞的有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可进一步包含组合施用本发明所述的组合物与有效量的一种或多种可用于治疗HIV感染的其它抑制剂，例如病毒进入抑制剂。
实施例9
制备本发明提供的组合物的方法如下详述。另外，描述了示例性组合物。
材料：乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)来自Eastman Chemicals。聚丙交酯(PLA)和聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)来自Lakeshore Biomateials。PLA和PLGA的区别在于丙交酯：乙交酯比率、分子量和它们的末端基团。本研究中使用的所有PLGA均为50∶50丙交酯∶乙交酯。分子量以名称中的数字分级。分子量估值为所述数字的10000倍。末端基团是羧酸(A)、甲酯(M)或月桂醇酯(L)。N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)来自Spectrum。苯甲酸苄酯和三乙酸甘油酯来自Sigma。盐酸胍来自Amresco。Tris-HCl来自Sigma。4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚来自Sigma。甲醇来自VWR。七水硫酸锌来自Sigma。氯化锌来自Sigma。
T1144肽材料制备：根据以下规程制备T1144肽材料。
喷雾干燥：将T1144肽在pH小于4或大于6时通常溶解在水中。使用1NNaOH或1N HCl调节pH。肽溶液通过喷雾嘴喷到加热箱中。人工收集干燥的肽颗粒。
肽可进一步通过上述喷雾干燥方法制备，但向喷雾干燥溶液加入赋形剂，由此将赋形剂与肽结合。
盐沉淀或pH沉淀：将肽在pH小于4或大于6下通常溶解在水中。使用1N NaOH或1N HCl调节pH。加入盐溶液或强酸/碱以导致沉淀。沉淀物通过离心收集、冻干法干燥、并过200μm筛以控制颗粒大小。
运载体制备：根据以下方法制备运载体。
SAIB运载体制备：将可达到所需终浓度的合适量SAIB加热并加入到NMP中，混合均匀。
SAIB/PLA运载体制备：将可达到所需终浓度的合适量PLA溶解于NMP、苯甲酸苄酯或三乙酸甘油酯。将可达到所需终浓度的合适量SAIB加热并加入到所述PLA溶液，混合均匀。
PLA、PLG和PLGA运载体制备：将可达到所需PLA、PLG或PLGA终浓度的合适量PLA、PLG和PLGA溶解于NMP。
可通过本领域技术人员熟知的任何方法制备组合物。在本实施例中，将肽材料(沉淀的或喷雾干燥的)加入到小瓶中。将运载体加入到所述小瓶中，并将内容物混合均匀。在某些情况下，需要加热至约40℃以确保正确混合。配方定量为肽重量/配方(以mg/g表示)。
通过与Edelhoch方法相似的方式，根据色氨酸和酪氨酸吸收确定肽含量。简单地说，将约1mg肽材料溶解在1mL 8M盐酸胍中。在276、280和288nm测定溶液的紫外吸收。使用这些测定的吸收值，以及已知的样品重量、样品体积、肽中色氨酸和酪氨酸残基的数量、和肽分子量，确定固体中的肽含量(％w/w)。
使用紫外/可见光吸收分析确定金属阳离子含量，所述分析使用4-(2-吡啶偶氮)间苯二酚(PAR)，PAR是已知与M2+形成2∶1复合物的一种金属显色指示剂。简单地说，将约1mg固体溶解于1mL包含6M盐酸胍的Tris-HCl缓冲液(pH 8)中。稀释所述溶液(使用相同的缓冲液)使金属阳离子终浓度为1-10μM。将50μl 0.1M PAR加入到950μL稀释溶液中。平衡后，在500nm测定测试溶液的紫外/可见光吸收。基于同一天获得的标准曲线的线性最小二乘分析计算金属阳离子浓度，并确定样品的金属阳离子含量(wt％)。
通过LC-MS分析确定血浆中的肽浓度。使用3倍体积的包含0.5％(v/v)甲酸的乙腈稀释血浆样品，离心，并直接分析上清液。使用梯度洗脱(10mM乙酸铵，pH6.8∶乙腈，0.6mL/min)进行色谱法，共运行6分钟。在PhenomenexLuna C8(2)50×2mm柱上进行分离，所述柱由4×2mm PhenomenexSecurityGuard C8保护柱保护。在Sciex API4000或API4000 Qtrap设备上进行质谱分析(ESI+)，通常使用单-四极模式，检测[M+3H]3+或[M+4H]4+离子。从30ng/mL到30μg/mL构建TRI-1144校准曲线。结果表示为随时间变化的血浆肽浓度。使用下列缩略语：Cmax＝最大血浆肽浓度；tmax＝Cmax的时间；t0.1＝血浆肽浓度下降到0.1μg/ml以下的时间；以及t0.01为标准化血浆肽浓度下降到0.01μg/ml以下的时间。在某些情况下，为便于比较，血浆浓度标准化为3mg肽/千克动物体重。
动物给药方式如下。包含过量T1144的组合物通过16G针头被吸入1cc注射器。用18G或21G针头替换所述针头，并且注射器排空至正确剂量。在动物肩胛骨之间的皮下区域给药。大鼠(400g)给药400μL，每个剂量组3只动物。猕猴(2.5kg)给药400μL或1000μL，每组3只动物。
所有药代动力学数据收集自大鼠或猴子。在某些情况下，为便于比较，血浆浓度标准化为3mg肽/千克动物。
制备了以下包含肽的组合物。
T1144/锌沉淀A.将T1144溶于水。调节pH至约6.2并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将2mL 0.1M ZnSO4加入到80mLT1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将所述沉淀冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀B.将T1144溶于水。调节pH至约6.2并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将60mL 0.1M ZnSO4加入到120mLT1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将所述沉淀冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀C.将T1144溶于水。调节pH至约5.7并加水至浓度为40mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将＜100mg ZnCl2加入到20mL T1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并用1mL水洗涤沉淀。将所得沉淀冷冻、冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀D.用5mL水洗涤沉淀B，离心并弃上清。此步骤再重复2次。将所得沉淀冷冻、冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀E.将445mg ZnSO4 *7H2O溶于2mL水。将1.0g沉淀D在锌溶液中制浆。将浆体冷冻、冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀F.将T1144溶于水。调节pH至约6.2并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。加入5mL 1N乙酸，降低pH至约5。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀G.将230mg ZnSO4 *7H2O溶于2mL水。将500mg沉淀F在锌溶液中制浆。将浆体冷冻、冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀H.将T1144溶于水。调节pH至约8.4并加水至浓度为50mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。加入甲醇至浓度为25mg/mL(50∶50甲醇∶水)。将约1mL 0.1M ZnSO4加入到20mL TRI-1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀I.将TRI-1144溶于水。调节pH至约8.4并加水至浓度为50mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。加入甲醇至浓度为25mg/mL(50∶50甲醇∶水)。调节pH至约5。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀J.将T1144溶于水。调节pH至约6.2并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将60mL 0.1M ZnSO4加入到120mLT1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过150μm筛。
T1144/锌沉淀K.将T1144溶于水。调节pH至约6.2并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将1mL 0.1M ZnSO4加入到40mLT1144溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过150μm筛。
T1144/锌沉淀L.用30mL水洗涤1.0g沉淀J，离心并弃上清。此步骤再重复1次。将所得沉淀冷冻、冻干并通过200μm筛。
T1144/锌沉淀M.将T1144溶于水。调节pH至约6.3并加水至浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将25mL T1144溶液通过喷雾嘴(方式与喷雾干燥相似)喷到50mL剧烈混合的0.3M ZnSO4溶液中。将所得悬浮液离心，弃上清，并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过150μm筛。
T1144/锌沉淀N.将T1144溶于水。调节pH至约6.3并加水至浓度为50mg/mL。加入甲醇至T1144溶液终浓度为25mg/mL。将所述溶液通过0.22μm滤器。将25mL T1144溶液通过喷雾嘴(方式与喷雾干燥相似)喷到50mL剧烈混合的0.1M ZnSO4溶液中。将所得悬浮液离心并弃上清。用10mL水洗涤沉淀3次。将悬浮液离心，弃上清并冷冻沉淀。将沉淀冻干并通过200μm筛。
表9：肽材料组合物
  肽材料   肽含量(％)   锌含量(％)
  PPT A   90.6   1.6
  PPT B   72.5   7.8
  PPT C   87.7   1-5
  PPT D   89.3，87.9   2.9，2.4
  PPT E   70.1   10.0
  PPT F   88.3   N/A
  PPT G   71.7   7.7
  PPT H   90.6，89.7   1.7，1.9
  PPT I   87.7   N/A
  PPT J   60.2   11.5
  PPT K   88.2   1.7
  PPT L   93.7   1.9
  PPT M   60.9   12.4
  PPT N   92.5   2.1
以下述方式将上述组合物施用于大鼠或猴子。在大鼠或猴子中获得的结果预期与人的结果合理相关联。
沉淀D在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中配制为100mg/g，并对猕猴给药1000μL。如图5(--◆--)所示，血浆浓度持续12天高于1μg/mL的目标值，超过了7天的目标时间。沉淀J在40∶60的PLA3∶NMP中配制为50mg/g，并对猕猴给药400μL。如图5(--■--)所示，血浆浓度持续7天高于1μg/mL的目标值；更大剂量，例如1000μL 100mg/g沉淀J，可能持续10-12天产生目标血浆浓度。这表明T1144可在SAIB/PLA或PLA运载体中皮下递送，并持续超过一周提供超过目标值(即1μg/mL)的血浆浓度。
沉淀D在74∶11∶15的SAIB∶PLA3L∶NMP中配制为100mg/g，并对大鼠给药400μL。如图6(--◆--)所示，血浆浓度持续6天高于1μg/mL的目标值，接近符合7天的目标时间。沉淀J在40∶60的PLA3∶NMP中配制为50mg/g，并对大鼠给药400μL。如图6(--■--)所示，血浆浓度持续7天高于1μg/mL的目标值。这表明所述制剂在啮齿动物和灵长动物模型中提供了相似的T1144持续递送。
SAIB∶PLA比率对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀A在SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图7所示，降低SAIB∶PLA比率(即更多的PLA)可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。将沉淀B也在SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图8和9所示，结果与沉淀A呈现的结果在性质上相似。但是，SAIB∶PLA比率影响沉淀B递送的程度低于其对沉淀A递送的影响。这表明降低SAIB∶PLA比率可改善T1144的持续递送，并且沉淀性质，尤其是沉淀中的锌含量，可影响递送率。
基质：溶剂比率对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀B在SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图10所示，相对于更低的PLA水平，10％左右的PLA水平可减缓肽递送。
溶剂类型对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀B在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶溶剂(即三乙酸甘油酯、苯甲酸苄酯或NMP)运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图11所示，由于溶剂类型改变，Cmax降低、tmax增加且t0.01增加。NMP可提供比三乙酸甘油酯更理想的药代动力学性质，三乙酸甘油酯比苯甲酸苄酯表现更好。这表明溶剂类型可影响肽递送。
肽浓度对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀B在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制并对大鼠给药400μl。结果如图12所示，并表明，在该运载体中，提高肽浓度对肽递送没有不利影响。
注射体积对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀B在74∶11∶15的SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制为100mg/g并对大鼠给药。如图13所示，剂量体积对持续递送参数没有显著影响；但是，400μl剂量比200μl剂量表现更好一些(全部标准化)。将沉淀C在77∶15∶8的SAIB∶NMP∶乙醇运载体中配制并对大鼠给药。如图13所示，当控制肽剂量时，最初3天剂量体积对持续递送参数没有显著影响；但是，3天以后，400μl剂量比200μl剂量表现更好一些。这表明增加注射体积可促进持续递送。
SAIB运载体中的PLA类型对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀A在75∶5∶20的SAIB∶PLA∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图14所示，PLA类型从3L改变为3M可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。这表明PLA类型可影响持续递送。
肽沉淀形式对大鼠药代动力学性质的影响.沉淀A、B、E和G在75∶5∶20的SAIB∶PLA3M∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图15所示，在起始沉淀过程中增加锌含量可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01(A和B)。向低锌沉淀中加入硫酸锌作为冻干盐可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01(A和E)。当最终沉淀包含硫酸锌作为冻干盐时，用锌沉淀代替pH沉淀并未影响持续递送参数(E和G)。即使总锌含量相似，在此运载体中，沉淀E和G都不如沉淀B表现好。这表明锌结合进沉淀的方式(例如，如何沉淀或喷雾)显著地影响肽的持续递送。
聚合物类型和剂量体积在猴子体内对药代动力学性质的影响。沉淀D在SAIB∶PLA∶NMP赋形剂中配制并对猕猴给药。如图16所示，赋形剂从75∶5∶20改变为74∶11∶15(400μl剂量)并未显著影响持续递送参数；但是，两者都比水溶液表现更好。增加74∶11∶15的剂量体积到1000μl可降低Cmax、减少tmax并增加t0.01。这表明改变剂量体积可影响持续递送。
PLA和PLGA凝胶系统
基质∶溶剂比率对大鼠药代动力学性质的影响.沉淀A和D分别在PLGA1A∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图17所示，提高基质∶溶剂比率(更多PLGA)可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。这表明运载体中聚合物的量可影响持续递送。
聚合物类型对大鼠药代动力学性质的影响.沉淀A和D分别在聚合物：NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图17所示，提高聚合物分子量和L∶G比率可同时降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。将沉淀B在聚合物：NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图18所示，提高L∶G比率可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。提高聚合物分子量可降低Cmax、增加tmax并增加t0.01。这表明运载体中的聚合物类型可影响持续递送。
溶剂类型对大鼠药代动力学性质的影响.沉淀B在PLGA1A：溶剂运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图18所示，溶剂从NMP改变为三乙酸甘油酯只增加t0.01。这表明运载体中的溶剂类型可影响持续递送。
肽浓度对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀B在50∶50的PLGA1A∶NMP运载体中配制并对大鼠给药400μl。如图19所示，增加剂量可降低Cmax、增加tmax并减少t0.01(全部标准化)。沉淀H在40∶60的PLA3L∶NMP运载体中配制并对大鼠给药400μl。如图19所示，增加剂量可降低Cmax、增加tmax并减少t0.01(全部标准化)。这表明PLA和PLGA运载体可提供高剂量肽的持续递送。
肽形式(无锌)对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀I和喷雾干燥材料在40∶60的PLA3L∶NMP运载体中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图20所示，改变不含锌的肽形式并未改变持续递送参数。这表明不含锌的肽的物理形式并不显著影响持续递送。
肽形式对大鼠药代动力学性质的影响.将沉淀H、J、K和L在40∶60的PLA3L∶NMP赋形剂中配制为50mg/g并对大鼠给药400μl。如图21所示，洗涤沉淀，由此降低锌含量，并未改变持续递送参数(J和L)。洗涤的沉淀与未洗涤的低锌沉淀的行为方式确实显著不同(K和L)。从50∶50的甲醇∶水溶液中沉淀导致降低的Cmax和增加的tmax。这表明在该运载体中，与肽共同沉淀的锌的量并不影响持续递送；但是，沉淀出肽的溶液显著影响递送。
阳离子类型对大鼠药代动力学性质的影响.将多种钙和铁沉淀在40∶60的PLA3L∶NMP运载体中配制并对大鼠给药400μl。如图22所示，所有制剂显示了一定的持续递送，其中铁制剂比钙制剂表现更好。这表明除锌以外的其它阳离子沉淀可提供肽的持续递送。
聚合物类型和肽形式对猴的药代动力学性质的影响.沉淀在聚合物：NMP运载体中配制并对猕猴给药。如图23所示，将40∶60的PLGA1A∶NMP运载体和沉淀A同时改变为40∶60的PLA3L∶NMP运载体和沉淀J可降低Cmax、减少tmax并增加t0.01。这表明聚合物性质(例如类型和分子量)和肽的制备方式对持续递送有重要意义。
沉淀方法对大鼠药代动力学性质的影响.沉淀H、J、M和N分别在40∶60的PLA3L∶NMP运载体中配制并对大鼠给药400μl。如图24所示，标准沉淀J和H分别是喷雾沉淀M和N的类似物(即具有相似的肽和锌含量)。在每种情况下，喷雾沉淀显示出增加的Cmax和tmax。喷雾沉淀在一周结束时的血浆浓度高于或等于标准沉淀的血浆浓度。这表明与标准沉淀相比，喷雾沉淀可提供改善的持续递送潜力。
为了说明目的，对本发明提供的特定实施方案的前述描述已经被详细说明。根据描述和说明，本领域其它技术人员可以通过应用现有知识，在不违背基本概念的情况下，容易地为多种用途修改和/或调整所述实施方案；因此，这些修改和/或调整应包括在所附权利要求书的含义和范围内。
序列表
<110>特里梅里斯公司
<120>用于递送抗病毒肽治疗剂的新制剂
<130>基于60/921,704的申请
<160>56
<170>PatentIn 3.2版
<210>1
<211>64
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>1
Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn
1               5                   10                  15
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
            20                  25                  30
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
        35                  40                  45
Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe
    50                  55                  60
<210>2
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>2
Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Asn Trp Phe
        35
<210>3
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>3
Met Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu
1               5                   10                  15
Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Glu Leu Leu
        35
<210>4
<211>36
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>4
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu
            20                  25                  30
Leu Leu Glu Leu
        35
<210>5
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>5
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>6
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>6
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>7
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>7
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>8
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>8
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>9
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>9
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>10
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>10
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>11
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>11
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>12
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>12
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>13
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>13
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Ile Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>14
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>14
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ile Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>15
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>15
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Ile Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu
        35
<210>16
<211>38
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(3)
<223>多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>优选亮氨酸或异亮氨酸，或可以是多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
<223>多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(28)
<223>多于一种可能的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>多于一种可能的氨基酸，优选亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>亮氨酸或异亮氨酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>亮氨酸或异亮氨酸
<400>16
Xaa Xaa Xaa Glu Ala Xaa Asp Arg Ala Xaa Ala Glu Xaa Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Xaa Glu Ala Xaa Xaa Arg Ala Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Lys Xaa Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Xaa Arg Glu Xaa
        35
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>17
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu
1               5                   10
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>18
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1               5                   10
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>19
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu
1               5                   10
<210>20
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>20
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
1               5                   10
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>21
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala
1               5                   10
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>22
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1               5                   10                  15
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>23
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile
1               5                   10
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>24
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1               5                   10                  15
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>25
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala
1               5
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>26
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln
1               5                   10                  15
Glu
<210>27
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>27
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg
1               5
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>28
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu
<210>29
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>29
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu
            20
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>30
Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>31
Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg
1               5                   10                  15
Glu Leu
<210>32
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>32
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu
<210>33
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>33
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Arg Glu
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>34
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Arg Glu Leu
            20
<210>35
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>35
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>36
<211>27
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>36
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu Gln
1               5                   10                  15
Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>37
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>37
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
1               5                   10                  15
Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>38
<211>29
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>38
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln
1               5                   10                  15
Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>39
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>39
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25                  30
<210>40
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>40
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg
1               5                   10                  15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gln Glu
            20                  25
<210>41
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>41
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1               5                   10
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>42
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu
1               5                   10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>43
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
1               5                   10
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>44
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1               5                   10                  15
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>45
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1               5                   10                  15
<210>46
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>46
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln
1               5                   10                  15
Glu
<210>47
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>47
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala
1               5                   10                  15
Gln Glu
<210>48
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>48
Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>49
Leu Arg Ala Ala Leu Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Leu
<210>50
<211>19
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>50
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Arg Glu
<210>51
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>51
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Leu Arg Glu Leu
            20
<210>52
<211>26
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>52
Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Gln
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>53
<211>27
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>53
Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln
1               5                   10                  15
Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>54
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>54
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu
1               5                   10                  15
Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>55
<211>29
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>55
Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gln
1               5                   10                  15
Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25
<210>56
<211>30
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的
<400>56
Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala
1               5                  10                  15
Gln Glu Gln Gln Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu
            20                  25                  30

Claims (49)

1.包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子的组合物，其中在施用于患者后，所述组合物形成基质并在施用12小时内提供至少10μg/ml的所述生物活性分子的Cmax，然后以至少1μg/ml的血浆水平持续释放至少7天。
2.包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中所述肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的组合。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述溶剂为NMP。
4.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料为SAIB。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料为PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为30％到85％重量。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为30％到80％重量。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为30％到70％重量。
9.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为60％到85％重量。
10.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为65％到85％重量。
11.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料的存在量为75％到85％重量。
12.如权利要求2所述的组合物，其中所述肽为T1144。
13.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物在施用12小时内提供至少10μg/ml的所述生物活性分子的Cmax，然后以至少1μg/ml的血浆水平持续释放至少7天。
14.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种其它生物活性分子。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述其它生物活性分子为抗病毒剂。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗病毒剂为肽。
17.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗病毒剂为细胞因子。
18.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗病毒剂为逆转录酶抑制剂。
19.如权利要求15所述的组合物，其中所述抗病毒剂为病毒mRNA加帽抑制剂。
20.如权利要求2所述的组合物，其中所述胶凝材料为选自PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖的两种或多种材料的混合物。
21.如权利要求2所述的组合物，其中所述肽溶解于所述溶剂和胶凝材料中。
22.如权利要求2所述的组合物，其中所述肽悬浮于所述溶剂和胶凝材料中。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述悬浮的肽为喷雾干燥形式。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含盐的喷雾干燥形式。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含锌的喷雾干燥形式。
26.如权利要求24所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含钙的喷雾干燥形式。
27.如权利要求22所述的组合物，其中所述悬浮的肽为沉淀形式。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含盐的沉淀形式。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含锌的沉淀形式。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含钙的沉淀形式。
31.如权利要求28所述的组合物，其中所述悬浮的肽为包含铁的沉淀形式。
32.在患者体内持续释放肽的方法，其中所述方法包括向患者施用包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中所述肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的组合。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述组合物通过皮下注射施用。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述溶剂为NMP。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述胶凝材料为SAIB。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述胶凝材料为PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述肽为T1144。
38.改善HIV感染相关症状的方法，其中所述方法包括向HIV感染患者施用包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中所述肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和T1144，或上述肽的组合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述组合物通过皮下注射施用。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述溶剂为NMP。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述胶凝材料为SAIB。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述胶凝材料为PLA、PLG、PLGA或PLGA-葡萄糖。
43.如权利要求38所述的方法，其中所述肽为T1144。
44.如权利要求38所述的方法，其中所述组合物进一步包含至少一种其它生物活性分子。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述其它生物活性分子为抗病毒剂。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述抗病毒剂为肽。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述抗病毒剂为细胞因子。
48.如权利要求44所述的方法，其中所述抗病毒剂为逆转录酶抑制剂。
49.如权利要求44所述的方法，其中所述抗病毒剂为病毒mRNA加帽抑制剂。
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