TW200902043A - Novel formulations for delivery of antiviral peptide therapeutics - Google Patents

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TW200902043A
TW200902043A TW097112437A TW97112437A TW200902043A TW 200902043 A TW200902043 A TW 200902043A TW 097112437 A TW097112437 A TW 097112437A TW 97112437 A TW97112437 A TW 97112437A TW 200902043 A TW200902043 A TW 200902043A
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peptide
composition
seq
amino acid
gelling material
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TW097112437A
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English (en)
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Brian L Bray
Jie Di
David Heilman
Peter Silinski
Scott Webb
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Trimeris Inc
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Description

200902043 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係提供組合物及投與該組合物作為治療劑之方 法。具體而言’本發明係提供組合物及投與該組合物作 生物活性分子（例如抗病毒肽治療劑）之用途。 ’ 【先前技術】 肽產品作為用於預防及治療疾病之治療劑及/ 具有寬使用範圍。該等肽產品屬於不同類別’例如激 ^酵素及免疫調節劑（例如，抗體、血清蛋白及細㈣ 為使肽在患者中顯現其適當生物及治療作用，a 適當濃度存在於其在活體内之作用位點處。更特定而二、 任何具體化合物（包括任何具體肽）之藥物代謝動^ :本 於彼化合物在活體内之生物利用度、分佈及清除率。：: 而^太之化學性質及特性（例如尺寸、複雜性、構象要: 及洛解度曲線)傾向於使肽的藥物代謝動力學*发仙 化合物之藥物代謝動力學曲線相比並非最佳。/、〃、 因此，該項技術中已作出相當大努力試圖 劑（例如肽）之途徑以便使治療劑之生物利用度及半衰期= 者增加。儘管在此方面已獲得 一 於#诸肝，△ *七 彳—°亥項技術仍需要用 以物ΓΓ具有合意藥物代謝動力學曲線之額外 所提供之組合物及方法滿足該等需要。 本發明所提供者係可（例如）用於將生物活性分子投與給 130299.doc 200902043 患者之組合物。特定而言，本發明所提供者係包含溶劑、 膠凝材料及生物活性分子（例如抗病毒肽）之組合物。儘管 不受限於理論，但本發明所提供之實施例至少部分地基於 以下意想不到的發現：可增加納入組合物中之生物活性分 子的重量％，同時投與給受試者後展示合意的藥物代謝動 力學曲線。 在一個實施例中，投與給患者後，本發明所提供之組合 物獲得迅速（例如，在8、12、16、20、24、28、32、36或 48小日守内）達到cmax之生物分子血漿濃度且然後在$、7、 1 0、1 4、1 7、2 1或2 8天或更長時間内提供相對恆定的生物 分子血漿濃度。在具體實施例中，本發明所提供組合物之 合意藥物代謝動力學性質係較低Cmax、較長tmax及較長t〇 〇ι 或 t〇. 1。 本發明所提供之組合物係（例如）用於投與包含以下之組 合物··某些抗病毒肽（稱為T20 (SEQ ID NO:2)、T1249 (SEQ ID NO:57)、T897 (SEQ ID NO:58)、T2635 (SEQ ID ΝΟ··5)、T999 (SEQ ID N〇:59)及 T1144 (SEQ ID ΝΟ··9))、 或兩種或更多該等肽之組合、以及該等T2〇 (seq id NO:2)、T1249 (SEQ ID N〇:57)、T897 (SEQ ID NO:58)、 T2635 (SEQ ID NO:5)、T999 (SEQ ID NO:59)及 T1144 (SEQ ID NO:9)肽之衍生物。 在一個實施例中’该等組合物包含溶劑、當溶劑-皮下 流體交換時形成基質之膠凝材料、及至少一種生物活性分 子（例如’抗病毒肽，例如丁20 (SEQ ID NO:2)、T1249 130299.doc 200902043 (SEQ ID NO:57)、T897 (SEQ ΙΕ) NO:58)、T2635 (SEQ ID NO:5)、T999 (SEQ ID NO:59)及 T1144 (SEQ ID NO:9)或其 衍生物）。 在另一實施例中，該等組合物進一步包含至少一額外組 份，例如醫藥上可接受之載劑、大分子或其組合。在又— 實施例中，該等組合物可進一步包含除以上所列示抗病毒 肽以外之抗病毒劑。 本發明進一步提供者係使用本發明所提供組合物之方 法。在-個實施例中，肖等組合物係作為治療方案(例如 抗病毒治療方案）的-部分。在某些實施例中，此―治療 方案可（例如）用於治療HIV感染（例如mv_丨感染）。 ’、 在-個實施例中，本發明所提供者係使用本發明所提供 之，合物抑制聊至革巴細胞傳播之方法，該方法包含將二 定量本發明所提供之組合物投與給患者以便該靶細胞盥—
定量活性劑（例如抗病毒肽及/或另—抗病毒劑）接觸以^效 抑制該細胞被該病毒感染。 本發明亦提供者係治細V感染（在一個實施例中 1感染）之方法，該方法包含向隱感染患者投 HIV感染之量的本發明所提供組合物。 〜有效、…療 本發明進一步提供者係在製造藥 活性分子(例如抗病毒肽)之組合物的方法，量生: 療HIV感染（例如，用於抑制之 用於治 融合之方法、及/或治療或抑細V感染：:二抑制-在以下實施方式中當結合隨附圖閱讀時將更清楚本發明 130299.doc 200902043 所提供組合物及方法之以上及其 【實施方式】 、他目標、特徵及優點。 定義 當本發明出於說明書及請求 n主甘〆. 只之目的使用術語”患者” 寺，八係指哺乳動物，例如人類。 在特疋實施例中，"患 者係吊要治療本發明所揭示疾病 内·^病症（例如HIV或AIDS) 之哺乳動物（例如人類）。 f 心發明出於說明書及請求項之目的使用術語、細胞" %，其係指能夠獅感染之細胞。在一個實施例中，該 細胞係人類細胞；且在另一實 ^ 1 j肀该細胞係能夠經由 一種過程（包括膜融合）被HIV感染之人類細胞。在另一實 施例中，該細胞存在於患者（例如人類患者）中。 、 當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語"組合物,， 時，其係指包含溶劑、膠凝材料及生物活性分子（例如抗 :毒肽)之調配物。本發明閣述例示性組合物。本發明所 提供之組合物可(例如)用作藥劑或用於製備藥劑。 士當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語”溶劑" '’嶋水可混溶液體。在—個實施例中，該溶劑係水 可混溶液體且與共溶劑（例如NMp)結合使用。溶劑可用於 (例如）將該膠凝材料充分稀釋以將其注射於患者中、 性溶劑闊述於本發明中且已為熟悉該項技術者習知。不 ^發明出於說明書及請求項之目的使用術語”膠凝材 /日寸’其係指當存在於包含溶劑及膠凝材料之組合物中 時溶劑-皮下流體交換（即，溶齊卜皮下患者流體交換）後形 I30299.doc 200902043 成基 > 之/谷劑可混溶材料。例干，地跌、妹从u ,n 例不性膠凝材料闌述於本發明 甲且已為熟悉該項技術者習知。 當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語"基質" 時，其係指溶劑-皮下流體交換後膠凝材料所採取之生物 可降解或生物可蝕解形式。 Λ在個實施例中，該基質係黏 木太^切)基質。在另—實施例中，該基質係凝膠。 發明出於說明書及請求項之目的使用術語”媒劑" %八係指包含溶劑及夥凝材料可用於將生物活性 (例如’肽，例如抗病毒肽)遞送給患者之 可以水性狀態储存。 〗螺劑 當本發明出於說明書及請求項之目的使用術 可接受之载劑”時，其係指不會明顯改變添加至…： 一融合抑制劑狀)之生物活性的載體介質： 西”可接文之載劑包括（但不限於）以下一或多種. 緩衝水、鹽水、〇.3%甘胺酸、含水醇、等 ^ 多種物質，例如甘油、油、鹽(例二 、文）膦酸酯、碳酸酯、脂肪酸、糖（例如， 醇）、多糖、平人队 如甘露 4合物、賦形劑、及防腐劑及/或穩定劑 加、’且“勿之存架壽命或視需要且適用於其製造及日 =實施例中，該醫藥上可接受之載劑適用於肌内、皮 下或非經腸投與。 皮 除非另外特別指出，否則出於說明書及 就HIV融合抑a貝之目的且 基酸,,之含義2 ’術語”含異白胺酸或白胺酸之胺 刀】係指異白胺酸或白胺酸、或其相應天然 130299.doc • 10- 200902043 存在之fee基酸（例如，L_胺基酸）、非天然存在之胺基酸（例 D胺基）、異構體形式（例如，正白胺酸、別-異白胺 酸及諸如此類）或衍生物形式（例如，第三_白胺酸）。可使 用胺基駄的一種形式異白胺酸或白胺酸並排除使用該胺基 -的/、他开y式本發明所述之HIV融合抑制劑肽在其胺基 酉文序列中亦可包含_或多種多形性，該等多形性發現於衍 生其之HIV gP41之HR2區域的序列中（參見，例如圖2) ’只 是在本發明所教示胺基酸序列之一或多個位置處包括含異 白胺酸或白胺酸之胺基酸。 術語”HIV"係指人類免疫缺陷病毒，且在一個實施例中 係 HIV-1 〇 田就生物活性分子（例如，抗病毒肽，例如HIV融合抑制 d肽或肽片段）而言使用術語”經分離"時，其係指基本上 不3未變成該生物活性分子自身整體結構一部分之組份， 例如當以化學方式使用生物、生化或化學方法進行合成、 製備或改良時基本上不含化學前體或其他化學品。在某些 實施例中，經分離生物活性分子之純度以重量計大於約 75/°、80%、85%、9〇%、95%、97%、99% 或 99 9%。 田多照HIV融合抑制劑肽使用術語”丨至3個之間的胺基酸 取代時’其係指HIV融合抑制劑肽亦可具有SEQ ID 9 -1 5 中 ι 1 —個胺基酸序列，只是與SEQ ID NO: 9-15中任—
個相比古T ’不少於1個且不多於3個的胺基酸差異；同時仍具 有（a)個以上白胺酸拉鏈樣基序及至少一個並非形成白胺 酸拉鏈樣基序所需白胺酸（即，除白胺酸拉鏈樣基序之位 130299.doc 200902043 置1或8處以外）的額外白胺酸，或（b)介於3與5個之間的白 fe SiL拉鏈樣基序’且具有抗之抗病毒活性（抑制扣介 導的融合的活性p鑒於此，具有取代之HIV融合抑制劑肽 的胺基酸差異（當與SEq ID Ν〇:9_15相比時）係在該胺基酸 序列除針對本發明HI V融合抑制劑肽所示之白胺酸及/或異 白胺酸殘基以外之位置中（參見例如本發明例示性（〗）及 (Π))。该不少於1個且不多於3個之胺基酸差異包括（但不限 於）保守胺基酸取代（該項技術中習知包括具有與所替代胺 基酸基本上相同的電荷、尺寸、親水性、及/或芳香性之 胺基酸取代；實例包括但不限於甘胺酸_丙胺酸_纈胺酸、 色胺酸-酪胺酸、天冬胺酸_麵胺酸、精胺酸-離胺酸、天冬 醯胺-麩胺醯胺及絲胺酸-蘇胺酸）及/或多形性（例如，如圖 2中所繪示或如在實驗室、各分枝系、及/或之臨床 分離物中所發現者p舉例而言，如關於SEq m N〇:丨j、 12或13 ’ HI V融合抑制劑肽具有】至3個胺基酸差異，該等 差異係在除SEQ ID NO: 1 1、1 2或1 3中任一個之胺基酸殘基 1 0、1 7、24、3 1及38以外的位置中。舉例而言，如關於
SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:14，HIV融合抑制劑肽具有1至 3個胺基酸差異，該等差異係在除SEq m n〇:9或SEQ ID NO.14之胺基酸殘基i〇、17、21、24及38以外的位置中。 舉例而言，如關於8£卩10 1^0:10或8£(^11)]^0:15，出乂融 合抑制劑肽具有1至3個胺基酸差異，該等差異係在除SEQ ID NO: 1 〇或 SEQ ID NO: 1 5之胺基酸殘基 1〇、17、21、31 及 38以外的位置中。此實施例之例示性實例包括（但不限於） 130299.doc -12- 200902043 胺基酸序列SEQIDN0:16，其中可為該等丨與3個之間胺基 酸取代之胺基酸差異位點之位置由Xaa表示（代表任何天然 或非天，㈣在的胺基酸；即，—個以上料能胺基酸可用 於此胺基酸位置）。而且’可獲得—或多個保守胺基酸取 代，例如離胺酸由精胺酸或組胺酸取代、精胺酸由離胺酸 或組胺酸取代、麵胺酸由天冬胺酸取代、或天冬胺酸由麵 胺酸取代。出於閣述目的胺基酸位置1G、ΐ7、2ΐ、24、η f 及38加有下劃線。亦在提及SEQ ID NO:9-15時，注意在 SEQ ID NO: 16中，，Zaa”係用於表示可為白胺酸或異白胺酸 之胺基酸，且Baa係用於表示較佳為白胺酸、異白胺酸中 任一個、但可為Xaa之胺基酸，只是至少一個細為白胺酸 或異白胺酸。 SEQ ID NO：16：
XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaa
XaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa 本發明所述之HIV融合抑制劑肽亦可包括（例如）衍生自 HIV gp41之HR2區域對應於在實驗室中存在之SEQ ID N〇:5(藉由序列對準）的肽、HIV-1之分枝系或臨床分離物 (例如彼等圖2中之實驗室株及臨床分離物），只要該等HIV 嘁合抑制劑肽滿足SEq ID no: 1 6之胺基酸要求即可。在一 個實施例中，該等HIV融合抑制劑肽與SEQ m N〇:9_i5中 任一個相比展示1至3個之間之胺基酸取代。在一個實施例 中，該HIV融合抑制劑肽進一步包含N_端封端基團或^端 封端基團或二者；且該等端基可包括（但不限於）：在該N_ 130299.doc 13 200902043 端之胺基或乙醯基；及在該c-端之羧基或醯胺基。 本發明所闡述之HIV融合抑制劑肽亦可包括展示美國專 利第2006/02474 16號中所揭示任何肽之變體胺基酸序列的 肽（該專利之整體内容以其整體引用的方式倂入本發明 中），只要該等HIV融合抑制劑肽滿足SEq ID Ν〇_·丨6之胺基 酸要求即可。在一個實施例中，該等HIV融合抑制劑肽與 SEQ ID ΝΟ··9-15中任一個相比展示1至3個之間之胺基酸取 代。在較佳實施例中，該HIV融合抑制劑肽長度介於14與 60個胺基酸殘基之間。在一個實施例中，該Hly融合抑制 劑肽進一步包含小端封端基團或c_端封端基團或二者；且 該等端基可包括（但不限於）：在該小端之胺基或乙醯基·， 及在δ亥C-端之緩基或酿胺基。 备丰餐明出於說明書及請求項之目的使用術語"反應伯 官能團"時係指能夠與另一化學基團或化學部分形治 鍵之化學基團或化學部分。就化學基團而言，熟悉該項担
術者習知反應性官能團包含包括（但不限於）以下之基圑： 馬來醯亞胺、硫醇、羧酸、t、磷醯基、醯基'經基、乙 醯基:疏水基團、胺、醯胺基、丹酿基、項基、琥站酿益 胺:硫醇_反應性基團、胺.反應性基團、絲_反應性基厘 及諸如此類。可使用一個反應性官能團並排除使用另 應性官能團。 日士當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語”連接體 :’其係指作為分子橋以操作方式連接兩個不同分子之介 口物或部分（例如’連接體之第一反應性官能團共價偶名 130299.doc •14- 200902043 至大分子載體之反應性官能團，且該連接體之第二反應性 g能團共價偶合至HI V融合抑制劑肽之反應性官能團）。該 連接體可為胺基酸，如在含一或多個HIV融合抑制劑肽拷 貝之重組融合蛋白的產生中。或者，該兩個不同分子可以 逐步方式（例如，經由化學偶合）連接至該連接體。通常， 對該連接體無具體尺寸或含量限制，只要其可實現其作為 分子橋之目的即可。熟㈣項技術者f知連接體包括（作 不限於）化學鏈、化學化合物（例如，試劑）、絲酸及諸如 此類。該等連接體可包括(但不限於)同雙官能團連接體、 異雙官能團連接體、生物穩定連接體、可水解連接體及生 物可降解連接體、以及其他該項技術中習知者。異雙官能 團連接體已為熟悉該項技術者f知且含有具有用於特定連 接第一分子之第一反應性官能團的U具有用；特定 ▲連接至第二分子之第二反應性官能團之對置端。對於熟悉 D亥項技術者顯而易見，各種單官能願 Μ s此圏、雙官能團及多官能 團試劑（例如彼等闡述於Pie TTT Lhemical公司，Rockford， πι目錄中者）皆可用作連接體d 每A 而視啫如欲連接之分子、 只把該連接之條件及投與後期望筚 +物代謝動力學性質等因 素而定’可改變該連接體之長廑 、 又及構成用於優化諸如以下 性貝.生物活性及功能之保存、 另/十，w ώ么 穩又性、對某些化學品 ^ 體内裂解之敏成性、及足 夠立體選擇性或尺寸。 α I·生及疋 當本發明出於說明書及請求項 裁It " ，甘及> 士 使用W 5。大为子 戰體時，其係指連接、結合 口（例如’以化學方式或 130299.doc 15 200902043 藉助重組方式使用基因表現）至本發明一或多種肽之分 子’由此相對於缺少該分子之一或多種肽該分子能夠職予 一或多種以下性質：該一或多種肽之穩定性、增加該—或 多種肽之生物活性、或增加該一或多種肽之血漿半衰期 (例如’延長該一或多種肽在體内之持久性）^該等大分子 載體已為該項技術習知且包括（但不限於）血清蛋白、聚人 物、碳水化合物、及脂質-脂肪酸連接物。通常用作大分 子載體之血清蛋白包括（但不限於）鐵傳遞蛋白、白蛋白（較 佳人類）、免疫球蛋白（較佳人類IgG或其一或多個鏈）、或 激素。通常用作大分子載體之聚合物包括（但不限於）聚離
胺酸或聚（D-L-丙胺酸）_聚（L-離胺酸）或聚醇。聚醇可包含 水溶性聚（環氧烷）聚合物，且可具有直鏈或具支鏈鏈。聚 合物可為具支鏈聚醇（例如P E G ,其具有多個（例如3個或更 夕個）鏈，各個鏈可直接或經由連接體偶合至該融合抑 制劑肽）；且在-個實施例中1在活體内條件下隨時間 生物可降解、及/或裂解之具支鏈聚醇。適宜聚醇包括（但 不限於）聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇（ppG)、及咖挪丘 聚物。在一個實施例中’聚醇包含平均分子尺寸選自約 1，〇〇〇道ϋ頓（Dalton)至、約20,000道爾頓之範圍的PEG。該 項技術習知可使用日请堂且士 有鬲於2〇,〇〇〇道爾頓之分子量 的其他類型大分子載體。 當本發明出於說明書及待七 永項之目的使用術語|，化學保 護基團”或”CPG”時，其係；^ m ” ” 、θ用於阻止一個反應性官能團 (包含胺基團）與另一反應性 图 g迠團化學反應之化學部分。 130299.doc -16. 200902043 熟悉肽合成技術者習知之化學保護基團包括（但不限於）tBu (第三-丁基）、trt (二苯曱基（triphenylmethyl 或 trityl))、
OtBu (第三-丁氧基）、Boc或t-B〇c (第三-丁基氧基羰基）、
Fmoc (9-苐基甲氧基数基）、a〇c (第三-戊基氧基-幾基）、 TEOC (β-三曱基乙基氧基羰基;）、CLIMOC (2-氯-1-二氫節 基曱氧基羰基）、BIMOC (苯并_[f]_茚_3_曱氧基羰基）、 PBF (2,2,4,6,7-五曱基二氫苯并呋喃_5_磺醯基）、2_Ci_z (氣苄基-氧基羰基）、Alloc (烯丙基氧基羰基）、Cbz (苄基 氧基羰基）、Adoc (金鋼烷基氧基_羰基）、Mcb (1_甲基環丁 基氧基羰基）、Bpoc (2-(對-聯苯基）丙基_2-氧基羰基）、 AZ〇c (2_(對-苯基偶氮基苯基）丙基-2-氧基羰基）、Ddz (2,2 一甲基_3,5-二甲基氧基苄基-氧基羰基）、MTf (4-曱氧基_ 2,3,6_三甲醯基苯磺醯基）、1>批（2,2,5,7,8-五甲基咬_6_石黃 醯基）、T〇s (甲苯磺酸基）、Hmb (2_羥基_4_甲氧基节基卜 p〇c、（2-笨基丙基_2氧基幾基）、^⑴(κ二甲基二 氧代％己-1-亞基）乙基）、ivDde (卜（4,4_二曱基·2,6_二氧 代-環己-丨-亞基）_3_甲基丁基）、节基、丹醯基、對-硝基节 基自曰及4如此類。可使用—個化學保護基團並排 一化學保護基團。 力 ± ^ ^月出於S兒明書及請求項之目的使用術語去保護" :一:員技術中習知其係指將一或多個化學保護基團自含 化學保護基團之分子去除之方法，纟中該分子 ::^、肽片段或HIV融合抑制劑肽。通常，去保蠖 使由—或多個化學保護基團保護之分子與去除該 130299.doc 200902043 化學保護基團之化學試劑反應。舉例而言，由化學保幾烏 團保護之N -端α胺基可與驗反應以去除鹼不穩定化學保^ 基團（例如，Fmoc及諸如此類）。藉由酸去除化學保護基團 (例如 ’ B〇C、TE0C、Aoc、Adoc、B〇pc、Ddz、cb二諸 ^此類）。其他化學保護基團、尤其彼等衍生自叛酸者可 精由酸或驗去除。 當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語"衍生物” 時，其係指源自母體化合物藉由一或多個原子經另一原子 或另-組原子代替所產生之化合⑯’在抗病毒化合物之情 況下其較佳料該母體化合物之所有或基本上所有抗病毒 活性。 甘 本發明可使用術語”第-”、，，第二"、”第三”及諸如此類 來：（a)指示順序；或（b)區分分子或分子之反應性官能 團’或（c)⑷與（b)之組合。然而，術語”第—””第_ ” 第二及諸如此類並不應另外理解為限制本發明。 本發明中所用關於本發明HIV融合抑制劑肽之術語"肽片 段”與M中間體”係同義的，且出於說明書及請求項之目的 其係指包含長度不少於約5個胺基酸且不多於約3〇個胺基 酸殘基之胺基酸序列的肽，且其包含該HIV融合抑制劑肽 胺基酸序狀至少—部分（作為鄰接胺基酸）。參見本發明 實例4-7、及表4、5、7及8，其係用於獲得SEQ m Ν〇: 9 及之肽片段的例示性實例。此外，儘管在較佳實施例中 肽片段（單獨或當作為基團經組合以形成hiv融合抑制劑肽 時）係經合成以便在該等胺基酸殘基之間形成肽鍵，但熟 i30299.doc -18- 200902043 悉該項技術者易於瞭解使用熟悉該項技術者習知之反應可 形成非肽鍵（例如，亞胺基、_ H偶氮、㈣㈣ 诸如此類）。 4當本發明出於說明書及請求項之目的使㈣語,,藥物代 -射動力學性質”時，其係指組合物中隨時間流逝全身可利 用生物活性分子（例如，抗病毒狀）之總量。藥物代謝動力 學t質可藉由活體内投與後量测生物活性分子（例如，抗 病毒肽）隨時間流逝之總全身濃度來確定。例如，藥物2 »射動力學性質可以曲線下面積(AUC)、生物學半衰期、及/ ”除率來表不。AUC係全身生物活性分子濃度隨時間流 ㈣積分量度，以質量.時間/體積為單體。投與一個劑量 的^物活性分子之後，自服藥時間至體内無殘留活性成份 之㈣敬係個體對生物活性分子⑷或該生物活性分子 之代謝物）之暴露的量度。當組合物令所包含之 分子與調配物中所包含不π ' 斤匕3不同於本發明所闡述者之生物活性 :j有以下—或多種改良時：(糊末端消除)半 ^ /2 )更長("增加")、(b)生物(總體内)清除率(C1)降 、(_放曲線更長、⑷納入該組合物 (:如’約1〇%或更多)、(〜少或降低、二更 長、及或匕更長’則該組合物具有"瘦改(），，= 加的”藥物代m 2改良或增 物代謝動力學係指生/域中’經改良藥 物降低，例如、甬片的， 之〉月除率相對於比較調配 例中，_經倍降低至約10倍降低。在另一實施 义糸勿代4t動力學係指相對於用於比較之調配 130299.doc •19· 200902043 物生物半衰期約10%增 物代謝動力學亦可涵蓋清除率降二之增加。經改良藥 者。在-個每於❹ 與生物半衰期增加二 “ 中，合意藥物代謝動力學性質包括迅速 (例如，在予^貝匕括迅速 到r n左从 32、36或48小時内）達 後維持相對恆定血漿濃度達5、7、10、14、 17、21或28天或更長。在特 人物夕人立# 在特疋實知例中’本發明所提供組 “勿之合思樂物代謝動力學性質 E f ,, x max 平乂我 tmax^ / Αΐ: I用於計算血聚濃度對時間曲線下之面積 關)、總體内清除率（Cl)及末端消除半衰期之等式 闡述於本發明實例1中。 Λ :::技術中提及—或多種固體溶於其中之水性流體的 f“一樣’本發明出於說明書及請求項之目的使用術 邊於浴液令”來指含在實際使用之濃度及溫度條件下溶於 其中之生物活性分子（例如Η! V融合抑制劑肽）的水溶液， 如本發明更詳細闡述且如可注射藥物調配物技術中之標準 含義一樣。與懸浮液之形成相反’業内有各種該項技财 f知之途徑來辨別溶液之形成’例如檢查清晰度（溶液之 透明度對懸浮液之渾濁度）、光透射及諸如此n解度” 係當生物活性分子（例如Η ί V融合抑制劑肽）以溶解形式^ 在於水性流體中且不展示沈澱出溶液之可見迹象、或二： 含該生物活性分子之水性流體發生膠凝時由該生物活性分 子的數量（例如，重量％)來確定。 當本發明出於說明書及請求項之目的使用術語"持續釋 放”時，其係指投與生物活性分子後在特定時間間隔内連 130299.doc -20- 200902043 續釋放。 當本發明出於說明書主 B车，甘及 叫未項之目的使用術語"有效量” 夺/、係指生物活性分子 量Uhl/ 成具體枝之期望結果之 _實把例中，生物分子之有效量 及/或與劑量方案結合）減少 、足乂（早獨 性分子之情、、兄對於不存在該生物活 之障况)患者中贿病毒負載之量 中，#妨7八2 #力 貫她例 …量可係足以抑制⑽，相對… 在該生物活性分子之愔 相對於不存 胞之病毒進人之量。料抑制可使 卩=、，、 析來量測。在另一實施例 中“之分 改善與mv感染有關之症狀的量。生爾以 熟悉該項技術者使用來自 《效置可由 .a ‘ 亥項技術者習知之常頻、、*鞞 外及活體内研究的數據來碟定。 規活體 就出v感染而言術語，，治療”或"療法”或复 互換使用，且出於說明書及請求y去4效物可 .. 貝之目的係指包令4 + 性分子（例如HIV融合抑制劑肽）之組人 活 ^ _ , 、 口物可用於影變_彳 夕種與HIV感染有關之過程、或— a或 ^ ,, /夕個用作確定該+ -麻 或療法之治療效果(例如，”治療應用”) ：：口療 點。舉例而言，該生物活性分子可 “的 > 數或、終 過程：HIV至乾細胞之傳播；抓與革巴細制^下—或多個 (HIV融合），病毒進人（感染過程期間咖或 ^ 進入#細胞之過程）；及融合體形成（例如=專物貝 與靶細胞之間之融合）。病毒抑制（藉 HIV_感染細胞 於量測體液或組織中HIV病#負栽:員技％中習知用 '確定）係用於評價 130299.doc 21 200902043 藥物在HIV感染之治療或療法中之效能的常用主要終點， 且血液中循環CD4+細胞之數量增加係常用次要終點；其各 自皆係抑制HIV至靶細胞之傳播的可量測效果。因此，包 含生物活性分子（例如HIV融合抑制劑肽）之組合物可用於 影響包含病毒抑制及/或循環CD4+細胞之相對量增加之治 療應用。 組合物 个奴扠伢有你用於將生物活性分子投與給患者之組 合物。特定而t，本發明所提供者係包含溶劑、膠凝材料 及生物活性分子(例如抗病毒肽)之組合物。儘管不受限於 理論，本發明所提供之實施例至少部分地基於以下音相不 到的發現：可增加納入組合物中之生物活性分子的重量 %，同時投與給患者後展示合意的持續釋放曲線。由於I =明所述之組合物投與給患者且發生溶劑-皮下流： 成組合物。 …基貝’故其可構成原位凝膠形
八在—個實施例中’當投與給患者時，本發明所提供之,且 &物本發明所提供之組合物獲得迅速（例如 16 、 20 、 24 、 28 、 ' 而將、*存 或48小時内）達到C⑽之生物分子 血漿浪度且然後在5、7、1〇、14、17、21:子 間内提供相對怪定的生物分子血漿濃 I長時 中，本發明所提供組合物之合意藥物代:、疋實施例 低cmax、較長tmax及較長“仏。。力學性質係較 本發明所提供之組合物係(例如)用於投與包含以下之組 I30299.doc -22- 200902043 合物：某些抗病毒肽（稱為T20 (SEQ ID NO:2)、T1249 (SEQ ID NO:57)、T897 (SEQ ID NO:58)、T2635 (SEQ ID NO:5)、T999 (SEQ ID NO:59)及 T1144 (SEQ ID NO:9))、 或兩種或更多該等肽之組合、以及該等T20 (SEQ ID NO:2)、T1249 (SEQ ID NO:57)、T897 (SEQ ID NO:58)、 T2635 (SEQ ID NO:5)、T999 (SEQ ID NO:59)及 T1144 (SEQ ID N〇:9)肽之衍生物。 在一個實施例中，該等組合物包含溶劑、當溶劑-皮下 流體交換時形成基質之膠凝材料、及至少一種生物活性分 子（例如，抗病毒肽，例如T20 (SEQ ID NO:2)、T1249 (SEQ ID NO:57) > T897 (SEQ ID NO:58) > T2635 (SEQ ID ΝΟ··5)、T999 (SEQ ID ΝΟ··59)及 T1144 (SEQ ID NO:9)或其 衍生物）。該等組合物投與之前可（例如）作為溶液或懸浮液 存在。該溶液或懸浮液可為水性或包含有機溶劑。當暴露 於患者皮下空間中之流體時，該膠凝材料可形成生物可降 解或至少生物可钱解之基質。因此，在一個實施例中，該 等組合物可以液體形式藉由（例如）皮下注射投與給有需要 的患者。所得基質可（例如）作為該（等）生物活性分子之持 續釋放基質。 本發明所提供之組合物通常包含足夠量（例如，約50-1000 毫克/克、100-900 毫克/克、150-900 毫克/克、200-900 毫克/克、250-900毫克/克、500-900毫克/克、750-900毫克/ 克或750-1000毫克/克）的至少一膠凝材料以便投與給患者 後形成基質。在一個實施例中，膠凝材料之適宜量（以毫 130299.doc -23 - 200902043 克/克表示）可藉由根據媒劑比例對媒劑膠凝材料組合物求 和並乘以1 G來確疋。在-個實施例中，該膠凝材料係丙交 醋或乙交S旨聚合物。在特定實施例中，該膠凝材料係乙酸 異丁酸蔗糖酯（SAIB)、聚丙交酿（PLA ’例如，PLA3L、 PLA3M、或PLA-PEG)或聚丙交_ •共_乙交醋（pL(}、 PLGA，例如，PLGA1、PLGA_ 葡萄糖或 pLGA pEG)。 本發明所提供之組合物亦可包含生物活性分子（例如抗病 毒肽）。在一個實施例中，本發明所提供之組合物包含足 夠濃度之生物活性分子以便當投與給患者後自所形成之基 質以（例如）持續釋放方式釋放該生物活性分子的有效劑 量。 本發明所提供之組合物通常可包含至少5%之生物活性 分子且可以至少5%之生物活性分子濃度投與。因此，在 個貝施例中，本發明所提供之組合物包含以該組合物重 量計數量等於或約係5%、6%、7%、8%、9%、iq%、 11%、12%、13%、14%、15%、2〇%或更多的生物活性分 子（例如，抗病毒肽）。 在特定實施例中’當投與給患者時，本發明所提供之組 口物形成基質，該基質在投與該組合物後提供生物活性分 子之初始突發釋放、隨後提供該生物活性分子至少5、7、 1〇或14天之持續釋放。在某些實施例中，#由將本發明所 提供之組合物投與給患者所提供之生物活性分子的初始突 發釋放係在投與該組合物後2、4、6、8、1〇、12、14、 16、18、20或Μ小時内為至少或約丨微克/毫升、2微克/ 130299.doc -24- 200902043 f 毫升、3微克/毫升、4微克/毫升、5微克/毫升、6微克/毫 升、7微克/毫升、8微克/毫升、9微克/毫升、1〇微克/毫 升、11微克/毫升、12微克/毫升、13微克/毫升、14微克/ 毫升或15微克/毫升或更多。在某些實施例中’藉由將本 發明所提供之組合物投與給患者所提供之生物活性分子的 持續釋放係在投與該組合物後以大於或等於〇1微克/毫 升、0.5微克/毫升、丨微克/毫升、125微克/毫升、15微克/ 毫升或2.0微克/毫升或更多持續釋放至少5、7、1〇、丨4、 21、25或28天或更長時間。 在另-實施例中，本發明所提供之組合物當投與給患者 :形成基質(例如，原位)且在投與12小時内提供生物活性 分子(例如’抗病毒肽)至少1〇微{/毫升之。_且隨後以至 少1微克/毫升之血漿含量持續釋放至少7天。 在-個實施例中’本發明所提供包含抗病毒肽之組合物 進-步包含至少-額外級份’例如醫藥上可接受之載劑、 大分子或其組合。 在另-實施例中’該等組合物包含—或多種生物活性分 子在㈤只把例中，該等組合物可包含丁2〇、丁、 τ_、Τ2635、Τ999或T1144肽或其衍生物。在另一實施 :中’該等組合物可包含或進一步包含一或多種其他抗病 毋9丨可單獨或作為組合治療方案的—部分用於該等組合 物中之其他抗病毒劑包括（但不限於）DPiq7 (了21)或任何其 他抗病毒多肽（例如彼等闡述於美國專利第W ι，⑽職 中者’該專利其整體以引用的方式倂人本發明中）。治： 130299.doc -25- 200902043 劑之其他實例性非限制實例包括抗病毒劑，例如細胞因 子，例如，rIFN a、rIFN β、rIFN γ ;逆轉錄酶抑制劑，包 括（但不限於）阿巴卡韋（abacavir)、ΑΖΤ(齊多夫定 (zidovudine))、ddC(紮西他賓（zalcitabine))、奈韋拉平 (nevirapine)、ddl(去羥肌苷（didanosine))、FTC(恩曲他濱 (emtricitabine))、（+)及（-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定 (lamivudine))、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW_ 5634、HBY097、地拉韋定（delaviridine)、依法韋偷 (efavirenz)、d4T(司他夫定（stavudine))、FLT、TMC125、 阿德福羊（adefovir)、替諾福韋（tenofovir)、及阿洛夫定 (alovudine);蛋白酶抑制劑，其包括（但不限於）安普羅銨 (amprenivir)、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、英地 那韋（indinavir)、奈非那韋（nelfinavir)、PNU-140690、利 托那韋（ritonavir)、沙喹那韋（saquinavir)、替利那韋 (telinavir)、替拉那韋（tipranovir)、阿紮那韋（atazanavir)、 洛匹那韋（lopinavir)、ABT378、ABT538 及 MK639 ;病毒 mRNA封帽抑制劑，例如利巴韋林（ribavirin);作為具有 抗-HIV活性之脂質結合分子的兩性黴素β ;作為糖蛋白加 工抑制劑之栗精胺；病毒進入抑制劑，例如融合抑制劑 (恩夫韋地（enfuvirtide)、T1249、其他融合抑制劑肽、及 小分子）、SCH-D、UK-427857 (Pfizer)、TNX-355 (Tanox 公司）、AMD-070 (AnorMED)、Pro 140、Pro 542 (Progenies) > FP-21399 (EMD Lexigen) > BMS806 ' BMS-488043 (Bristol-Myers Squibb)、maraviroc (UK-427857)、 -26- 130299.doc 200902043 ONO-4128、GW-873140、AMD-887、CMPD]67、及 GSK. 873,140 (GlaxoSmithKline) ; CXCR4拮抗劑，例如 AMEk 070);脂質及/或膽固醇相互作用調節劑，例如鹽酸普魯卡 因（procaine hydrochloride) (SP_01&Sp_〇1A);整合酶抑制 劑’包括（但不限於）L-870、及810; RNAseH抑制劑；⑽ 或REV之抑制劑；V1f之抑制劑（例如，衍生之富捕胺酸 肽、mv-1蛋白酶N-端衍生之肽）；病毒處理抑制劑，包括 (但不限於）樺木醇（betulin)、及二氫樺木醇衍生物（例如， PA-457);及免疫調節劑，包括（但不限於）as_i〇i、粒蝻 胞巨嗤細胞集落刺激因子、IL_2、丙戊酸、及胸腺噴丁 (thymopentin)。 在-個實施例中’本發明所提供者係其中該生物活性分 子（例如，抗病毒肽）經溶解之組合物。 在另-實施例中’本發明所提供者係其中該生物活性分 子（例如’抗病毒肽）經懸浮之組合物。 在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈噴霧乾燥形式之组合物。 在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈包含鹽（例如，金屬鹽）之喷霧 乾燥形式之組合物。 、 在另一實施例中，本發明所提供者係其中《浮生物活 性分子（例如’抗病毒肽）呈包含鋅之噴霧乾燥形式之組合 物。 在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 130299.doc •27- 200902043 性分子(例士口 ’抗病毒肽)呈包含鈣之噴霧乾燥形式之乡且合 物。 〜f 1恭其中該愁α工W办 性分子（例如，抗病毒肽）呈包含 ,Α 匕3鐵之噴霧乾燥形式之組合 物。 在另-實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈經沈澱形式之組合物。 在另一實施例中，本發明所辟仰心 -. /3所知供者係其中該懸泮生物活 性分子(例如，抗病毒肽)呈包含鹽(例如金屬鹽)之經沈澱 形式的組合物。 在另-實施例中’本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如’抗病|肽）呈包含鋅之經沈澱形式之組合 物。 在另-實施例中’本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如’抗病毒肽）呈包含約之經沈殿形式之組合 物。
在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈包含鐵之經沈澱形式之組合 物。 在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈包含鎂之經沈澱形式之組合 物。 在另一實施例中，本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如，抗病毒肽）呈包含鋼之經沈澱形式之組合 I30299.doc •28· 200902043 物 在另-實施例中’本發明所提供者係其中該懸浮生物活 性分子（例如’抗病毒肽）呈包 匕s銘之經沈澱形式的組合 物。 在另—實㈣中’本發明所提供者係包含約卜抓、卜 14%、1-13%、卜12%、1%、 1-10% > 1-9% > 1-8% ' 1- 7%、1-6%、1-5〇/0、ι_4〇/0、u/ J ’〇 1-2%、5-15%、7-15%、 5擔。、7韻或10_15%鹽（例如金屬鹽）之組合物。在其他 I施例中，本發明所提供者係包含與生物分子(例如抗病 骨肽）以1:1莫耳此在太夕_ /,, 、 在之皿（例如金屬鹽）的組合物。用於 本务明所提供組合物中之金屬_ μ ϋ & 备屬鹽的特定實例包括（但不限 於）鋅、鈣及鐵。 改變本發明所提供組 切T膠喊材枓之比例可調節（例 如改良或優化）源自基質 '疋生物分子之遞送速率，該基質 係將本發明所提供之έ — '之組合物投與給患者後所形成的。在特 疋貫施例中，降低本發 A $ x乃所徒供組合物中S AIB : PL A比例 曰導致患者在任何特定彳 行疋忪間下生物分子在血漿濃度的增 加’且會增加其申在*去由沾# 的持續_。 〜中維持生物分子之特定血漿含量 在特疋實施例中，在太双。口 A ^ + 本毛明所提供組合物中使用NMP作 為溶劑代替三醋精 時間下生物八； _夂> 基酿會導致患者在任何特定
唯持“刀子之血浆濃度增加，且會增加其令在患者中 維持生物分子之牿犮 T 中 水3量的持續時間。在特定實施例 Τ，使用ΝΜΡ作 Μ代替三醋精會導致Cmax增加。 13〇299.d〇c •29- 200902043 在另一實施例中，增加本發明所提供組合物之投與注射 體積（例如，加倍）會導致患者在任何特定時間下生物分子 之金漿濃度增加，且會導致其中在患者中維持生物分子之 特定企漿含量的持續時間。 在另一實施例中，所用膠凝材料之類型（例如，PLA)可 影響本發明所提供組合物之藥物代謝動力學參數。在具體 實施例中，將PLA類型從3L變成3M會導致c·降低、。 增加及t 〇 Q 1增加。 在另一實施例中，改變本發明所提供組合物中膠凝材料 與溶劑之比例會影響生物分子之遞送速率。在特定實施例 中，增加本發明所提供組合物中膠凝材料與溶劑（例如， PLGA1A與NMP)之比例會導致‘降低、^增加及t〇⑸增 加。 在另一實施例中，改變聚合物類型及分子量可改良生物 刀子之遞送速率。在特定實施例中，增加聚合物分子量及/ 或增加L: G (丙交酯：乙交酯）比例會導致“以降低、增 加且to o〗增加。 在另實鼽例中，增加本發明所提供組合物中之肽濃度 (例如，加倍）會導致Cmax降低、增加及t。⑸降低。 在另一實施例中，增加媒劑中膠凝材料（例如，PLGA) 之里會導致Cmax降低、tmax增加及t()降低。 在另一實施例中，增加媒劑（例如，含SAIB之媒劑）中膠 凝材料（例如’ PLA)之量可減緩生物分子自本發明所提供 組合物之釋放（例如，cmax降低、tmax增加及/或t0.01增加）。 130299.doc -30- 200902043 在特定實施例中’該媒劑中PLA之量自1%增加至5〇/〇進— 步減緩生物分子自本發明所提供組合物之釋放。在另—實 施例中，該媒劑中PLA之量自5%增加至丨〇%進一步減緩生 物分子自本發明所提供組合物之釋放。 溶劑 可用於本發明所提供之組合物及方法中之溶劑包括任何 可將該膠凝材料充分稀釋以允許將該組合物注射至患者中 之水可混溶液體。在一個實施例中，該溶劑係N_甲基 吡咯啶酮（NMP)。其他適宜溶劑包括（但不限於）水、醇（例 如，曱醇、乙醇、異丙醇及苄醇）、二醇（例如，聚乙二 醇、聚丙二醇及四乙二醇）、苯甲酸酯（例如，苯曱酸乙酯 及苯甲酸苄基酯）、甘油酯（例如，單_、二_及三_甘油酯）、 三醋精及醫藥上可接受之酯（例如，乳酸乙酯及碳酸丙 酯）。 膠凝材料 可用於本發明所提供組合物及方法中之膠凝材料可包含 任何當溶劑-皮下流體交換時形成基質之溶劑可混溶材 料。在一個實施例中，該膠凝材料係乙酸異丁酸蔗糖酯 (SAIB)或其衍生物，例如乙酸蔗糖酯或乙酸異丁酸蔗糖 酉旨-特級（SAIB-SG)。在另一實施例中，該膠凝材料係聚丙 交醋（PLA)，例如PLA3L或PLA3M。在另一實施例中，該 膠凝材料係聚丙交酯-共·乙交酯（PLG、pLGA、plga_葡 萄糖或其衍生物’例如PLGA-PEG1 500或PLA-PEG1500)。 在另一實施例中，該膠凝材料係聚_己内酯或其衍生物或 130299.doc -31 - 200902043 丙交酯/乙交酯J£取& h /、1物。PLA及PLGA在丙交酯：乙交t 例、分子量及复踹其士二 η —日比 一端基方面不同。分子量係根據名稱中之 字加以分級〇 Ύ.^ /1 刀于$估計值係10000乘以該數字。端基為 羧酸（Α)、甲基酯（Μ)或月桂基酯（L)。 在個實％例中，本發明所提供之組合物可包含兩種或 以上以相同或不同重量％存在之不同膠凝劑。在特定實施 例中’ δ玄膠凝材料係兩種或以上選自PL A、PLG、PLG A或 PLGA-葡萄糖之材料的混合物。 在某些實施例中，該膠凝材料係以介於約5_95重量％之 間、約5-90重量％、約1〇 —9〇重量％、約1〇_85重量％、約 15-85重量％、約2〇-85重量％、約30_85重量％、約3〇_8〇重 量％、約30-70重量％、約30_65重量％、約3〇_6〇重量％、約 40-85重量％、約45-85重量％、約50-85重量°/〇、約55-85重 量％、約60-85重量％、約65-85重量％、約70-85重量。/。、約 7 5 - 8 5重量％、約8 0 - 8 5重量％、約1 -1 5重量％、約5 -1 5重量 %或約1 0 -1 5重量％之量存在。 、 在另一實施例中，該膠凝材料係以約25-900毫克/克、 100-900 毫克/克、200-900 毫克/克、300-900 毫克/克、400-900 毫克/ 克、500-900 毫克/克、100-800 毫克/克、100-700 毫克/克、100-600毫克/克、100-500毫克/克、200-800毫克/ 克、300-600毫克/克、25-250毫克/克、25-200毫克/克、 25-150毫克/克、50-150毫克/克、50-100毫克/克、50毫克/ 克、75毫克/克或1〇〇毫克/克之量存在。 肽 130299.doc -32- 200902043 就為抗病毒肽之生物活性分子而言’任何該項技術中習 知之抗病毒肽皆可用於本發明所提供之組合物及方法中: 在一個實施例中，該抗病毒肽係Τ2〇 ' Τ1249、τ897、 Τ2635、Τ999或Τ1144肽或其衍生物。 用於本發明所提供！ 且合物及方法中（特定抗病毒狀包括 何生自具有SEQ ID ΝΟ:5胺基酸序列之鹼基胺基酸序列 (”驗基序列”）的HIV融合抑制劑肽’但其中各聊融合抑制 劑肽與祕&序列之；^同之處在於：在其胺基酸序列中具 有一個以上白胺酸拉鏈樣基序、且具有至少一個其胺基酸 序列中所存在並非形成白胺酸拉鏈樣基序所需的額外白胺 酸（即，該序列中除白胺酸拉鏈樣基序之胺基酸位置丨或8 處以外之胺基酸；如由在SEq ID Ν〇:5胺基酸位置21處異 白胺酸由白胺酸取代所例示）。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽包括 衍生自具有SEQ ID NO: 5胺基酸序列之鹼基胺基酸序列（,, 鹼基序列”）之HIV融合抑制劑肽，但其中各HIV融合抑制劑 肽與該鹼基序列之不同之處在於其胺基酸序列中具有兩個 以上的白胺酸拉鏈樣基序。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽包括 一系列HIV融合抑制劑肽，其中各HIV融合抑制劑肽： 包g衍生自HIV gp4 1之HR2區域的胺基酸序列；（b)具有含 不少於2個且不多於5個白胺酸拉鏈樣基序之胺基酸序列； (c)具有至少一個在其胺基酸序列中除白胺酸拉鏈樣基序之 月女基目文位置1或8處以外的額外白胺酸（例如，與seq 130299.doc •33- 200902043 NO: 5-7之任-個或多個的鹼基序列相比）；且視情況⑷顯 不-或多種生物性質意想不到的改良。在—個實施例令， 該mv融合抑制劑肽包含街生自㈣_之刪區域的胺 基酸序列，其中該胺基酸序列包含HR2白胺酸拉鏈樣基 序例如、，s不於圖丨或圖2中之HR2白胺酸拉鏈樣基序。在 較佳實施例中，該HIV融合抑制劑肽之長度介於Η盘60個 胺基酸殘基之間。在—個實施例巾，該聊融合抑制劑狀 進-步包含Ν-端封端基團或c_端封端基團或二者；該等末 端封端基團可包括(但不限於）：在該之胺基或乙醯 基；及在該c —端之羧基或醯胺基。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽HIV 融合抑·肽’其巾各HIV融合抑·肽：⑷包含衍生自 即41之赠區域的胺基酸序列；⑻具有含大於2個且 不^於5個白胺酸拉鏈樣基序的胺基酸序列；且（c)具有至 少-個在其胺基酸序列中除白胺酸拉鏈樣基序之胺基酸位 置1或8處以外的額外白胺酸（例如’與seqidn〇:5_7中任 :個或多個的鹼基序列相比）；且幻顯示一或多種生物性質 意想不到的改良。在-個實施例巾，該研融合抑制劑狀 包含衍生自HIV gP41之HR2區域的胺基酸序列，其中該胺 基酸序列包含HR2白胺酸拉鏈樣基序，例如繪示於圖】或 圖2中之HR2白胺酸拉鏈樣基序。在較佳實施例中，該出v 融σ抑制劑肽之長度介於丨4與6〇個胺基酸殘基之間。在一 個實施例巾，該HIV融合抑制劑肽進—步包含Ν_端封端基 團或C端封端基團或二者；該等端基可包括（但不限於）： 130299.doc -34- 200902043 在该N-端之胺基或乙醯基；及在該c_端之羧基或醯胺基。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽包括 具有類似於SEQ ID NO:5之胺基酸序列的HIV融合抑制劑 肽，只是該HIV融合抑制劑肽胺基酸序列：（a)具有一個以 上白胺酸拉鏈樣基序，且具有至少一個並非形成白胺酸拉 鏈樣基序所需白胺酸（即，除白胺酸拉鏈樣基序之位置】或 8處以外）的額外白胺酸；或（b)具有2個以上的白胺酸拉鏈 樣基序，且其中3亥HIV融合抑制劑肽顯示一或多種生物性 質的改良。在一個實施例中，該mv融合抑制劑肽之長度 介於14與60個胺基酸殘基之間。在一個實施例中，該hiv 琺合抑制劑肽包含衍生自HIv gp4丨之HR2區域的胺基酸序 列，其中该胺基酸序列包含HR2白胺酸拉鏈樣基序，例如 繪示於圖1或圖2中之HR2白胺酸拉鏈樣基序。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽包括 由SEQ id N0.9、1〇、14及15例示之肽、或與seq 9 1 〇、1 4及1 5中任一個相比包含介於1至3個之間之胺 基酸差異的HIV融合抑制劑肽。 用於本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒肽包括 胺基酸序列軸於SEQ ID脱5之鹼基胺基酸序列的聊 融合抑㈣m，只是與㈣基胺基㈣列減該mv融合 ㈣劑肽胺基酸序列在其胺基酸序列中具有2個以上的白 私酸拉鏈樣基序；其中該HIV融合抑制劑肽展示—或多種 生物性質意想不到的改良。 :本發明所提供組合物及方法中之其他抗病毒狀包括 130299.doc 05- 200902043 由_1〇>'10:11-13例示之肽、或與8£〇1〇脱11_13中任 個相比包έ ;丨於1至3個之間之胺基酸差異的v融合抑 制劑狀。 本發明所闡述之ΗIV融合抑制劑肽可經由習知方法（包括 ，碼該肽之核酸的重組表現）以常規方式製備。舉例而 吕，可將經設計以重組方式表現HIV融合抑制劑肽之細胞 在適田條件下培養適當時間以便該肽經表達，J_由此可獲 知忒肽亦可經由合成方法製備本發明所闈述之HIV融合 抑制劑肽。 下文闡述可用於本發明所述組合物中之特定肽片段。各 肽片段可用作中間體’其可與一組肽片段中之一或多個其 :也肽片&共價偶合以獲得具有以下任一胺基酸序列之㈣ 融合抑制劑肽：SEq ID n〇:9、SEQ ID ν〇:ι〇、_ ι〇 NO:11、SEQ ID N〇:12、SEQ m N〇:n、_ 山職14、 i ID N〇:15。在一個實施例中’ 一組肽片段内之肽片 又糸在溶液相方法中以獲得具有以下胺基酸序列之合意 ㈣融合抑制劑肽的方式進行偶合：SEQ ID NO.9、SEQ ；；=:1()、SEQm^n、SEQlDN〇:12、 NO:13 ' SE〇 ττ^ χτ^ ν 所提供“物中去Μ、或SEQlDN〇:15。亦用於本發明 合成藉由以下製備之HIV融合抑制劑狀： 、成肽片段、且然後將該等肽片段組裝 mv融合抑制旬衣从Φ成该 N〇:9卩=丨肽，其中訓v融合抑㈣肽具有聊⑴ seq1DnQq =⑽:mEQIDN〇:11、SEQlDN〇:i2、 0.13、SEQ ID NO:14、或 SEQ m N〇:i5 中任一 130299.doc -36- 200902043 個之胺基酸序列。 在-個實施例中，本發明所提供者係製備肽之方法，其 包含喷霧乾燥該肽。舉例而言，可將肽在小於4或大於6之 PH下洛解(例如’於水中）’其中使用適宜酸或鹼(例如m 二藏或IN HC1)來調節pH ’隨後藉助霧化噴嘴將肽溶液喷 霧於加熱室中。可人工收集經乾燥肽顆粒。 實ώ例+上述喷霧乾燥方法進—步包含將賦形 f 筆於喷霧乾燥溶液中，由此將賦形劑與肽合併。例示 性賦形劑之實例包括（但不限於）填充劑、增量劑、稀釋 劑、潤濕劑、溶劑、阌斗為,_ . 礼化d、防腐劑、矯味劑、吸收增強 劑、持續釋放基質、著色劑及大分子物質（例如白蛋白或 δ者如胺基酸及糖等物質）。 在另-實施例中，本發明所提供者係製備肽之方法，其 2含藉助：化喷嘴(以類似於喷霧乾燥之方式)將肽溶液喷 、、合液（例如，金屬鹽溶液，例如辞鹽、鐵鹽或鈣 ‘ I ’奋液)中然後可將所得懸浮液離心’傾析出上清液， 並將沈殿物冷减。可膝；、+ 一 了將沈癥物凍乾並使其穿過2〇〇微米 篩。 在另一實施例中’本發明所提供者係製備肽之方法’其 包含鹽或pH沈澱，其中將肽在小於4或大於6之阳下溶解 (例如’於水中），其中使用適宜酸或驗（例如IN NaOH或1N 邮）將PH調節至約4與6之間或約4·8與5 2之間。在具體實 她例中，此方法包含將鹽溶液或強酸/驗溶液添 溶液以引起沈殿。在另—實施例中，此方法進一步包含藉 130299.doc -37· 200902043 由離〜收集沈澱物，藉由凍乾乾燥該沈澱物且視情況使該 沈殿物穿過200微米篩以控制粒徑。 儘管不受限於理論，但認為用於製備本發明所提供組合 物中所用肽之方法及試劑可獲得對某些患者或疾病有用之 合意或經改良藥物代謝動力學參數（例如，生物活性分子 釋放之量或持續時間）。具體而言’將金屬（例如，鋅、鐵 或卵内入肽沈殿物之方式（例如，喷霧及/或沈殿）可影響 所得組合物之藥物代謝動力學參數。 在-個實施例中’在肽沈澱製程期間增加金屬含量(例 如丄鋅含量）會導致降fe，w曾加及^增加。在另 一貫施例中，將金屬鹽(例如，硫酸鋅)以凍乾鹽添加於低 金屬（例如’低-鋅）沈澱物 Υ θ等级Lmax降低’ tmax增加及 t〇.01增加。 在另例中，沈殺該肽之溶液可影響CJW。 舉例而言，自5叫水沈w目對於僅自水沈殿肽會導 致Cmax降低及tmax增加。 在另-實施例中，沈積該狀之 tbL ^ ^ j 丁/ 日 ^max 久1max 舉例而έ ’贺霧沈澱物相· 對於非贺務沈澱物會導致cmax增 加及t m a x增加。 使用方法 本發明進一步提供 .y 作使用本發明所提供組合物之方 法。在一個實施例令， P &主、A A + 11亥4組合物係用作治療方案（例如 抗病毋療方案）的一部 古g π u心、 你彔二貧施例申，此一治療 方案可(例如)用於治療HIV感染。 I30299.doc -38- 200902043 在一個實施ϊ列中，本發明提供使用本發明所提供之組合 =於抑制HIV至靶細胞之傳播的方法，該方法包含將： 定量的本發明所提供組合物投與給患者以便該輕細胞與有 效抑制細胞被該病毒感染之量的活性劑(例如抗病毒肽)接 觸。此方法可（例如）用於治療扪^感染患者。在—個實施 例中，抑制HIV至乾細胞之傳播包含抑制响卜介導的 1至靶細胞的融合及/或抑制HIV_感染細胞與靶細胞之間之 融合體形成。 本發明亦提供者係治療HIV感染（在一個實施例中，HU 1感染）之方法’纟包含向HIV感染患者投與有效治療該 HIV感染之量的本發明所提供組合物。在一個實施例中， 該組合物包含有效抑制HIm細胞之傳播之量的耐融 ，抑制劑肽、及/或有效抑制gp41_介導的mv至乾細胞之 融合之量的HIV融合抑制劑肽。該等方法可（例如）可用於 治療HIV-感染患者。 在特疋實紅例中，本發明所提供者係改善與感染有 關之症狀的方法’該方法包含向HIV感染患者投與組合 物，該組合物包含溶劑、膠凝材料及 ⑽、了則、侧及τη44、或其組合之狀。 本發明進一步提供者係在製造藥劑中使用包含HIV融合 制Μ肽之組口物的方法，該藥劑用於治療Η”感染（例 如、，用於抑制HIV傳播之方法、抑制㈣融合之方法、及/ 或冶療HIV感染之方法）。肖藥劑可為包含生物活性分子 ⑼如mv融合抑制劑狀）、溶劑、膠凝材料及視情況一或 130299.doc -39- 200902043 多種醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物形式。 在個實施例中，本發明所提供之組合物可藉由注射 (例如皮下注射）投與。 在另κ施例中，本發明所提供之組合物可（例如，藉 由皮下注射）每3、5、7、1〇、14、17、21、28或6〇天投^ 一次。 f 在另實把例中，本發明所提供之組合物可（例如，藉 由皮下注射）每天投與一次、兩次、三次或更多次，持續 一天或多天、一週或多週、一個月或多個約、或—年或多 年。 在另一實施例中，本發明所提供之組合物可（例如，藉 由皮下注射）每週投與卜2、3、4、5、6、7或更多次。在 特疋實施例中，本發明所提供之組合物可（例如，藉由皮 下〆主射）每週投與—次或兩次。在另-特定實施例令’本 發明所提供之組合物係（例如，藉由皮下注射）每兩週投斑 兩次。每次投與可包含卜2、3或更多次注射。 ’、 在一個實施例中，本發明所提供之組合物可以100微 升、細微升' 3〇0微升、_微升、爾升、_微升、 ^微升、綱微升、_微升、刪微升或更多之體積投 實例 實例1 在以下實例中，評價各生物物 確定該等參數之-般方法係如下。4及生物學參數。 130299.doc -40- 200902043 在肽《成為上使用標準固相合成技術且使用標準 子 或固相合成與溶液相合成之組合來合成肽（包 括請融合抑制劑肽及驗基序列），如本發明實例3中更詳 、、田闡述纟此實例中，該等HIV融合抑制劑狀可進一步包 含反應性官能團，·即，其大多數在Ν·端處由乙醯基封端及/ 或在C-端除由酸胺基團封端。肽自樹脂裂解後，將豆沈 殿，並將沈殺物;東乾。然後使用反相高效液體層析將狀純 化，且利用電噴霧質譜來證實肽一致性。 生物物理學參數之評價包括螺旋率及熱穩定性之量測。 螺旋率係藉由圓二色性（”CD”）如下評價。簡言之，使用配 備有熱電溫度控制器的光譜儀獲得CD譜。該等譜係在坑 下以〇·5奈米（㈣）步長自删至26〇奈米以15奈米頻寬及術 步之典型平均時間獲得。減去細胞/緩衝劑空白之後’使 用三階最小平方多項式擬合利用保守窗口尺寸對該等譜進 打平滑以獲得隨機殘差項。使用標準方法將原始概圓率值 轉換成平均殘餘橢圓率’並綠製波長（自200至26〇奈米）對 [Θ]χ 1 〇·3(度數em2/dm()1)之曲線。然後使用標準方法計算％ 螺旋率值（通常以1G μΜ、坑下之％螺旋率表示）。藉由在° 溫度以2。(：步長升高時監測〇〇信號在222奈米處之變^進行 熱穩定性之評價，其中平衡時間為丨分鐘。各樣品…如， 則融合抑制劑肽）之穩定性由Tm值表#，其係對應於敎 轉變一階導數之最大值的溫度。 …、 生物學性質之評價包括量測對抗㈣]株之抗病毒活 性。在測定HIV融合抑制劑肽之抗病毒活性中（例如，—種 130299.doc -41 · 200902043 量度係抑制HI V至靶細胞之傳播的能力），使用活體外分 析，其根據使用衍生自HIV gp41之HR區域的肽所產生之 數據已展示係活體内所觀察到抗病毒活性之預測。更具體 而言’使用活體外感染性分析（"Magi-CCR5感染性分析，1 ; 參見例如美國專利第6,258,782號）所觀察到之抗病毒活性 已經展不與相同HIV gp41衍生之肽在活體内觀察到之抗病 毋活性適當相關（參見例如Kilby等人，1998, TVaiwre Λ/ed. 4:1302-1307)。將該等分析使用指示細胞系MAGI4 CCR5 表現衍生物cMAGI對感染性病毒滴度的減少進行計分。兩 種細胞系均利用HIV-1 tat反式激活由HIV-LTR驅使之β-半 乳糖苦酶報告基因之表現的能力。該道基因已經修 飾以位於核中’且可在感染幾天内利用x_gal底物作為強 烈的核染色進行檢測。若在染色前僅有一輪感染，則經染 色核之數里可解釋為等於激發接種物中感染性病毒粒子之 數量。感染細胞使用CCD-圖像儀計數，且原始分離物及 實驗室用分離物二者在病毒輸入及藉由圖像儀目測之感染 細胞數量之間均顯示線性關係。在MAGI及cMAGI分析 中’感染性滴度減少50。/〇 (Vn/V〇 = 0 5)係有效的，且提供 用於評價抗病毒活性之初級截距值（"IC50”係定義為活性試 劑使得感染性病毒滴度減少50%之濃度）。將用於測試抗病 毒活性之肽稀釋成不同濃度，並一式兩份或一式三份對經 調節獲得約1500-2000個感染細胞/48孔微量滴定板之孔的 HIV接種物進行測試。將該肽（以相應稀釋度）添加於 cMAGI或MAGI細胞中，隨後添加病毒接種物；且24小時 130299.doc -42· 200902043 後，添加感染及細胞_細胞融合之抑制劑（例如，SEq ID NO:2(恩夫韋地））以防止第二輪HIV感染及細胞_細胞病毒 散佈。將該等細胞培養2天以上，且然後固定並用 物染色以k測HIV-感染細胞。利用CCD-圖像儀針對每一 對照及肽稀釋度確定感染細胞之數量，且然後計算 IC5〇(以微克/毫升表示）。 可使用才不準實驗至方法產生抗由驗I序列組成之狀的抗 病毒活性之病毒。基本上，計算1<:50及1(:90之後，將細胞 與病毒及肽（例如，以接近1(:90之濃度）於培養液中混合（包 括當該等細胞之後進行分樣）。將該等培養液進行培養並 監測直至出現融合體為止。自此第—輪培養收穫之病毒用 於在第二輪培養中感染細胞，其中肽以較第—輪培養中所 用為高的濃度（2至4倍）存在。維持第二輪培養並監測抗該 肽之抗病毒活性的病表沾ψ T目 ,Λ. _ ^ j炳毋的出現。隨後可需要數輪培養以最 後產生抗該肽之抗病表、壬，14 & +主、& , 机炳母·活性的病毒分離物（在該肽對抗該 分離物之預定程度IC5 0下）。 i 為確定藥物代謝動力學性質，將则融合抑制劑肽或衍 生出mv融合抑制劑肽之驗基序列靜貌給義（鳩卿 細Γ㈣投藥（可使用其他動物模型確Μ物代謝動力學 性質’如該項技術中所習知、 、. 所“。)。在投藥後不同時間，抽取 血液樣品並藉由離心分離屮a將 p“ 刀離出血漿。將血漿樣品冷凍儲存直 至藉由LC-MS(液體層析/質碰 星 貝Da)以電喷霧陽離子模式進杆八 析為止。將HIV融合抑 仃刀 市U或驗基序列自C18或C8 Η 柱利用乙腈於1 〇 mM乙酸 吕 0文叙、'友衝液（pH 6.8)中之梯度進行 130299.doc -43 - 200902043 、—、析寺將血漿樣品利用2或3體積含〇·5%甲酸之乙 、了脫蛋白。同時製備—式兩份於獼猴血漿樣品中之校 準標準料樣品並在該等樣品包含附融合抑制劑狀或驗 :】之月)及之後分析。藥物代謝動力學性質係根據血漿 辰度Τ間數據使用單指數或雙指數數學模型來計算。藉 非、-友(生最小平方優化來獲得模型。使用1冗2的濃度加 權。使用以下等式計算血漿濃度對時間曲線下之面積 (AUC)總體内清除率㈣及末端消除半衰期（t句。
AUC A/-a+B/-b "中A14 B係截距且a與b係指數等式分別闡述分佈及消除 相之速率吊數。當使用單指數模型時，不予考慮” A"與”&，, 性質。 = 劑量/AUC(以L/K/hr表示） t /2 — _0.69〇3/b(以 hr表示） 實例2 v.:. 出於闡述本發明所提供實施例之目的，該鹼基序列具有 以下胺基酸序列（SEQ ID NO:5)。
TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL 在一個實施例中，HI V融合抑制劑肽與衍生其之鹼基序 列相比包含多於2個的白胺酸拉鏈樣基序。該等HIV融合抑 制劑肽之實例包括（但不限於）SEq id NO: 1 1、SEQ id NO:12 及 SEQ ID NO:13 ;或與 SEQ ID ΝΟ:11、SEQ Π) N 〇. 12、S E Q HD或N 0:13中任一個相比（例如’具有至少 92% —致性）具有介於1與3個之間之胺基酸差異的胺基酸序 130299.doc -44 - 200902043 鏈樣A庠嘁°抑制劑肽具有介於3與5個之間之白胺酸拉 胺基酸序列。以下圖解⑴展示mv融合抑制劑 肽之胺基酸序列，誃胺其納生， ^ 人土次序列具有在該鹼基序列之胺基 酸位置下（如使用”卜 I斤對準）使用一個字母胺基酸編碼c'L，， 用於白酸’且·τ’用於異白胺酸）之胺基酸差異（與驗基序
列相比），且：呈古 & I X /、/、有與白胺酸拉鏈樣基序有關（在同一白胺
-夂拉鏈樣基序之位置處、或一個白胺酸拉鏈樣基序之 位置8及毗鄰白胺酸拉鏈樣基序之位置1處)加下劃線之里 白胺酸及白胺酸。一個白胺酸拉鏈之位置_亦可作為二 白胺馱拉鏈樣基序之對置末端位置，即，作為一個基序 之位置8及另一序列基序之位置1。 (I) TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQ IDNO:5
I I L L SEQ ID NO： 11 i L SEQ ID NO: 12 L I SEQ ID NO: 13 在另一實施例中，HIV融合抑制劑肽與衍生其之鹼基序 列相比包含1個以上的白胺酸拉鏈樣基序以及與形成白胺 酸拉鏈樣基序無關之額外白胺酸。該等HIV融合抑制劑肽 之實例包括（但不限於）SEQ id NO:9、SEQ ID ΝΟ:1〇、 SEQ ID ΝΟ:14 及 SEQ ID ΝΟ:15 ;或與 SEQ ID ΝΟ:9、SEQ ID NO:1〇、SEQ ID NO:14或 SEQ ID NO:15 中任一個相比 具有介於1與3個之間之胺基酸差異（例如，具有至少92%一 致性）的胺基酸序列；且各HIV融合抑制劑肽胺基酸序列與 130299.doc -45- 200902043 SEQ ID NO:5之鹼基序列的不同之處在於含有1個以上的白 月女拉鏈樣基序及與形成白胺酸拉鏈樣基序無關（即，除 白胺酸拉鏈樣基序之位置1或8處以外）之額外白胺酸。在 一個實施例中，該非_白胺酸拉鏈樣基序白胺酸取代代替 SEQ ID NO:5之鹼基序列中胺基酸21位置處的異白胺酸， 此係一種提供增進該等肽有益生物學性質之因子的取代。 以下圖解（Π)展示HIV融合抑制劑肽之胺基酸序列，該胺基 駄序列具有在該鹼基序列之胺基酸位置下（如使用"|，，所對 準）使用一個字母胺基酸編碼（”L”用於白胺酸，且"〗"用於 異白fe： )之胺基酸差異（與驗基序列相比）’且其具有與白 fe:酉欠拉鏈樣基序有關（在同一白胺酸拉鏈樣基序之位置i或 8處、或一個白胺酸拉鏈樣基序之位置8及毗鄰白胺酸拉鏈 樣基序之位置1處）加下劃線之異白胺酸及白胺酸。斜體字 母係與形成白胺酸拉鏈樣基序無關之白胺酸。 (Π) TTWEAWDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQIDN05
丨丨I 1 ^ SEQ ID NO:9 1 L SEQ ID NO: 10 L i SEQIDNO:14 1 I SEQ ID NO: 15 以下插圖（III)代表”驗基序列”SEQ ID N〇:5與本發明所 揭不之肽SEQ ID NO:9_15之簡要比較，本發明所揭示之肽 相對於SEQ ID NO:5顯示經改良生物學性質。SEQ m ΝΟ:9-15中每-個相對於SEQidn〇:5驗基序列之胺基酸取 130299.doc -46- 200902043 代皆加下劃線且以粗體表示。 (III) SEQK)NO:5 TTWEAWDRAIAEYAARIEALI RAAQEQQEKNEAALREL SEQIDNO:9
TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL SEQIDNO:10
TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL SEQIDNO:ll
, TTWEAWDRAIAEYAARIEALI RA LQEQQEKLEAALREL SEQIDNO:12 TTWEAWDRAIAEYAARIEALI RA I QEQQEKLEAALREL SEQIDNO:13 TTWEAWDRAIAEYAARIEALI RA LQEQQEKI EAALREL SEQIDNO:14 TTWEAWDRAIAEYAARIEALL RAI QEQQEKNEAALREL SEQE)NO:15
TTWEAWDRAIAEYAARIEALL RA AQEQQEKIE A ALREL 參照表1，將本發明之HIV融合抑制劑肽與合成肽相 { X 比，該等合成肽具有相同鹼基序列，但胺基酸序列不同 (與SEQ ID NO:9-15相比）且具有抗-HIV活性。比較包括生 物物理學參數及生物活性參數，如使用本發明實例1中所 闡述之方法所確定。在確定生物活性時，如藉由抗病毒活 性所評價，利用對抗一些習知抑制HIV-介導的融合之肽抗 病毒活性的病毒分離物（在表1中抗性病毒分離物指定為 '，ResM)。 130299.doc -47- 200902043 表1 :生物物理及生物（抗病毒活性）參數 ~SEQ ID NO:
seq ID ΝΟ:6及SEQ ID Ν0:7與鹼基序列 SEQ ID Ν〇:5^ 不同之處在於單一白胺酸取代（分別在位置或位置3 J 處）’·如以上在表1中所看到，此取代並不顯著影響抗病毒 活性，然而此取代使得半衰期改良（參見下表2)。SEQ ID NO:6與本發明具有SEQ m N〇:9之HIV融合抑制劑肽類 似/、疋SEQ ID Ν0:9之胺基酸序列具有一個其他胺基酸 差異，即在胺基酸位置21中之白胺酸（而SEQ ID Ν〇:6在胺 基酸位置2 1中具有異白胺酸）。參照表1，SEQ ί〇 NO:9中 用於異白胺酸取代之白胺酸與SEQ ID NO:6之肽相比使螺 旋率降低（自97%至61%)，同時保持良好抗性曲線（對抗抗 性病毒分離物"Res"之活性p同樣，SEQ ID Ν〇:^類似 於本發明具有SEQ ID NO:10之HIV融合抑制劑肽的胺基酸 序列’只是SEQ ID NO:10之胺基酸序列具有—個胺基酸差 異’即在胺基酸位置21中之白胺酸（而SEQ ID NO:7在胺基 酸位置21中具有異白胺酸）。參照表1，SEQ ID NO: 10中用 130299.doc -48 - 200902043 於異白胺酸取代之白胺酸與SEQ ID N〇:72肽相比使螺旋 率降低（自84%至77%)’同時保持良好抗性曲線（對抗抗性 病毒分離物，，Res”之活性）。因此，表i表明seq m N〇:9及 10相對於SEQ ID NO:6-7性質經改良。 / 此實施W中所闡述者係本發明之HIV融合抑制劑狀與驗 基胺基酸序列相比之藥物代謝動力學性質。使用先前在實 例1中詳細闡述用於評價藥物代謝動力學性質之方法，表2 說明本發明ΗIV融合抑制劑肽代表之藥物代謝動力學性質 與驗基序列SEQIDN〇:5之藥物代謝動力學性質的比較。' 表2 SEQlDNa 畚除率 >0.04 hr) 6 ~~ ' 7 <0.02 8 <0.02 15 >0.04 17 9_ 10 <0.02 <0.02 7 12 21 生示，SEQlDN〇:6、7、9及1〇中每-個皆展現 =4Γ(，”，，)增加。在胺基酸位置21處㈣^ Ν〇. — 31處包含白胺酸之剛ID _未展示SEQ ID 产，、、9及Μ之肽所展現的半衰期之顯著增加。 在製造醫藥調配物時為 可接^載劑中’於水::=:=調配_上 抑制劑：Γ 投與。注意，本發明之_合 理ΡΗΤ於水溶液中之穩定性得到改良。 i30299.doc -49- 200902043 舉例而5 ’藉由以下個別測試具有SEQ ID n〇:2、SEQ ID NO:5之胺基酸序列的合成肽、及具有SEq ID N〇:9之胺基 酸序列的HI V融合抑制劑肽各自的溶解性：將肽以丨〇毫克/ 毫升之濃度添加於墙酸鹽緩衝鹽水（pB s)中，並在約pH 7,3 至約pH 7.5之範圍内在3rC下在i週時期（16s小時）内不同 時間點$測（例如，藉由HPLC)溶液中殘餘肽之量。僅數小 時後含SEQ ID N0:2之溶液即變得不穩定（溶液中檢測到最 少肽）。相反，90%或更多具有SEQ m n〇:9之胺基酸序列 的ΗIV融合抑制劑肽在1週時間點時在溶液中仍可檢測到， 而小於80%的具有SEQ ID Ν0..5胺基酸序列之肽在！週時間 點時在溶液中仍可檢測到。 實例3 已將本發明所提供HIV融合抑制劑肽之生物學性質與其 他已認可有效抗病毒劑（包括SEQ ID NO: 2(恩夫韋地））進 行比較。具體而言，在感興趣的新穎SEQ ID N〇:9化合物 與已確立抗病毒劑SEQ ID NO:2之間如下詳細闡述來實施 活體外抗性比較研究：將MT2細胞用病毒分離物（IIIB、
030、060及098)感染且在SEQ ID NO: 2(恩夫韋地）或SEQ ID NO:9之？辰度逐漸增加的情況下加以培養以針對抗性進 行選擇。初始肽濃度為各種肽對抗相應野生型分離物之 ICso的大約2倍。藉由每1 _3天添加新鮮肽維持肽濃度。使 用標準技術監測培養液之細胞病變效應（cpE)且當達成最 大CPE時，使用病毒的少量等份試樣用於隨後數輪感染。 菖兵野生型病毒之生長速率相比時，端視於培養液中之時 130299.doc -50- 200902043 間長f使肽濃度增加2至4倍。在選擇期間，亦收集不含肽 之病毒原⑨。藉由雙脫氧定序化學品表徵不含肽之病毒原 液之gp4 1通傳型改變且表型敏感性係使用心八以感染性分 析確定。
使用SEQ ID N0:2及卿ID NO:9在活體外選擇之間之 比較結果展示於下表3中。該等數據展示，於培養液中 SEQ ID N0:9選擇比SEQ ID N〇:2選擇平均長3倍，此使得 IC5G之倍數變化較低（相比SEQ m N〇:9224倍，山 N0.2為42倍）。SEQ ID n〇:9選擇需要較多突變（幾何平均 為以達成該等比SEQ m N〇:2(幾何平均為17)所達成 為低之倍數變化。較長培養天數、較低倍數變化及實現該 較低倍數變化所需之較高突變數量皆表明SEQ ID N0:9與 Q ID NO.2相比對形成活體外抗性展示更高阻礙。換言 之，該等結果表明’與對SEQ ID N〇:2之抗性相比，Hiv 對SEQ ID ΝΟ:9之抗性需要花費更長時間才能出現。基於 先蚰針對其他肽（例如SEQ ID ΝΟ:2及Τ1249)所實施之HIV 抗性發展的研究，應預計到本發明所呈現之活體外結果應 與活體内結果適當相關。 表3 . SEQ ID ΝΟ:2(恩夫韋地）與SEQ ID ΝΟ:9活體外選擇 之間之比較 130299.doc 51 200902043 起始病毒 分離物 肽 (SEQDNO) 于培養液 中之天數 起始IC50 (ng/mL) 結束IC50 (ng/mL) IC50之倍 數變化 所需突變 之數量 IIIB 2 62 6 163 27 2 584.000030 2 46 42 798 19 2 584.000060 2 46 10 68 7 2 584.000098 2 45 50 45575 912 1 幾何平均 2 49 19 797 42 1.7 起始病毒 分離物 月太 (SEQIDNO) 于培養液 中之天數 起始IC50 (ng/mL) 結束IC50 (ng/mL) IC50之倍 數變化 所需突變 之數量 IIIB 9 168 12 2768 231 4 584.000030 9 77 28 113 4 2 Γ 584.000060 9 173 8 208 26 4 584.000098 9 173 37 521 14 5 幾何平均I 9 140 18 429 24 3.6 基於先前針對其他肽（例如SEQ ID NO:2及T1249)所實施 之HIV抗性發展的研究，應預計到，本發明所呈現之活體 外結果應與活體内結果適當相關（參見例如Melby等人， 2006, AIDS Research and Human Retroviruses 22(5):375-3 85 ; Greenberg & Cammack, 2004, J · Antimicrobial
Chemotherapy 54:333-340 ； Sista 等人，2004, AIDS 18:1787-1794) ° 實例4 通常，本發明所提供之HIV融合抑制劑肽可藉由兩種方 法中的任一種合成。第一種方法係使用標準固相合成技術 且使用標準Fmoc肽化學品或其他標準肽化學品（使用CPGs) 130299.doc -52- 200902043 精由線性合成實施。合成本發明所提供請融合抑制劑肚 之第一種方法係藉由片段縮合途捏來實施。簡言之，合成 2個或更夕片段，各個片段包含欲製備爾融合抑制劑狀之 完整胺基酸序列的相應部分。在片段合成中，若期望，可 納入其游離胺（例如，側鏈胺）由化學保護劑以化學方式保 f之胺基酸。然後將該等片段組裝(以一定方式及順序共 f貝禺口在起）以產生HIV融合抑制劑肽（具有正確胺基酸 序列）。 ^ 就肽合成而言m目別肽片段本身及本發明所提供自 :組肽片段之組合製得之HIV融合抑制劑肽各自皆可使用 熟悉合成肽序列技術者習知之技術獲得。舉例而〜在一 種途徑中，可在固相中合成肽片段’且然後在溶:相中在 ,、'裝方法中、、且δ以產生合成物ΗΙV融合抑制劑肽。在另一 種途徑中’可使用溶液相合成產生肽片段’然後將其在固 相中在組裝方法中組合以產生HIV融合抑制劑肽。在又一 方法中，可使用固相合成來合成各肽片段，且然後在固相 中在組裝方法中組合以產生HIV融合抑制劑肽之完整胺基 酸序列。在-個實施例中，使用熟悉該項技術者習知之= 相合成製備各肽片段。在另-實施例中’使用將固相盘溶 液相技術組合之組裝方法使用—組肽片段製備具有卿⑴ ΝΟ:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽。舉例而言，一组 肽片段包含2至4個之間之合成肽片段’且然後將其組裝、、且 以完成本發明所提供HIV融合抑制劑肽之合成。基於本發 明之教示’熟悉該項技術者應明瞭，此片段組農二法可^ 130299.doc -53 - 200902043 於、且已經用於一些具有SEQ ID NO: 9-16中任一胺基酸序 列之HIV融合抑制劑肽。 為闡釋藉由片段縮合途徑製備本發明所提供之HIV融合 抑制劑肽，在合成具有SEQ ID NO:9胺基酸序列的HIV融 合抑制劑肽的方法中在肽片段組裝中將一組肽片段中之肽 片段共價偶合。本發明所提供之肽片段可包括（但不限於） 彼等具有下表4中所繪示胺基酸序列者。可使用本發明所 提供之某些肽片段並排除使用其他肽片段。亦顯示各肽片 段之SEQ ID NO:9中之對應胺基酸；因此，其表明各肽片 段係由SEQ ID NO:9之胺基酸序列的許多鄰接胺基酸構 成。 表4 SEQID NO: 胺基酸序列 SEQIDNO:9 中之 胺基酸位置 17 TTWEAWDRAIAE 1-12 18 YAARIEALLRALQE 13-26 19 QQEKNEAALRE 27-37 20 QQEKNEAALREL 27-38 21 TTWEAWDRAIA 1-11 22 EYAARIEALLRALQE 12-26 23 TTWEAWDRAI 1-10 24 AEYAARIEALLRALQE 11-26 25 TTWEAWDRA 1-9 26 IAEYAARIEALLRALQE 10-26 27 TTWEAWDR 1-8 28 ^IAEYAARIEALLRALQE 9-26 29 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL 1-20 30 LRALQEQQEKNEAALRE 21-37 130299.doc -54- 200902043 31 LRALQEQQEKNEAALREL 21-38 32 TTWEAWDRAIAEYAARIE 1-18 33 ALLRALQEQQEKNEAALRE 19-37 34 ALLRALQEQQEKNEAALREL 19-38 35 YAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL 13-38 36 EYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL 12-38 37 AEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL 11-38 38 IAEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL 10-38 39 AIAEYAARIE ALLRALQEQQEKNEAALREL 9-38 40 TTWEAWDRAIAEYAARIE ALLRALQE 1-26 本發明進一步提供者係在合成具有SEQ ID NO:9之胺基 酸序列的HIV融合抑制劑肽之方法中用作中間體之特定肽 片段組。本發明所提供之肽片段組包括組1 -1 6，如表5中 所指定（組編號僅出於易於闡述的目的）。可使用某些肽片 段組並排除使用其他肽片段組。 表5 組編號 肽片段 SEQIDNO:9 中 之胺基酸位置 1 TTWEAWDRAIAE (SEQ ID NO: 17) 1-12 YAARIEALLRALQE (SEQ ID NO: 18) 13-26 QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 2 TTWEAWDRAIAE (SEQ ID NO: 17) 1-12 YAARIEALLRALQE (SEQ ID NO: 18) 13-26 QQEKNEAALREL (SEQ ID NO:20) 27-38 3 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL (SEQ ID NO:29) 1-20 LRALQEQQEKNEAALRE (SEQ ID NO:30) 21-37 4 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL (SEQ ID NO:29) 1-20 LRALQEQQEKNEAALREL (SEQ ID NO:31) 21-38 5 TTWEAWDRAIA (SEQ ID NO:21) 1-11 EYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:22) 12-26 QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 130299.doc -55- 200902043 6 TTWEAWDRAI (SEQ ID NO:23) 1-10 AEYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:24) 11-26 QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 7 TTWEAWDRA (SEQ ID NO:25) 1-9 IAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:26) 10-26 QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 8 TTWEAWDR (SEQ ID NO:27) 1-8 AIAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:28) 9-26 QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 9 TTWEAWDRAIA (SEQ ID NO:21) 1-11 EYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:22) 12-26 QQEKNEAALREL (SEQ Π) NO:20) 27-38 10 TTWEAWDRAI (SEQ ID NO:23) 1-10 ^EYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:24) 11-26 QQEKNEAALREL (SEQ ID NO:20) 27-38 11 TTWEAWDRA (SEQ ID NO:25) 1-9 IAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:26) 10-26 QQEKNEAALREL (SEQ ID NO:20) 27-38 12 TTWEAWDR (SEQ ID NO:27) 1-8 AIAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID NO:28) 9-26 QQEKNEAALREL (SEQ ID NO:20) 27-38 13 TTWEAWDRAIAEYAARIE (SEQ ID NO:32) 1-18 ALLRALQEQQEKNEAALRE (SEQ ID NO:33) 19-37 14 TTWEAWDRAIAEYAARIE (SEQ ID NO:32) 1-18 ALLRALQEQQEKNEAALREL (SEQ ID NO:34) 19-38 15 TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID 1-26 NO: 40) QQEKNEAALRE (SEQ ID NO: 19) 27-37 16 TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQE (SEQ ID 1-26 NO: 40) QQEKNEAALREL (SEQ ID NO:20) 27-38 因此，在一個實施例中，本發明所提供者係可用於合成 具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽的方 法、肽片段及肽片段組。根據本發明之闡述亦可明瞭，該 130299.doc -56- 200902043 等方法、肽片段、及肽片段組可用於合成具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽，其中該HIV融合 抑制劑肽包含一或多個化學基團：
B- TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL -Z
I
U 其中胺基末端、羧基末端或無側鏈反應性官能團（例 如，内部離胺酸之ε胺）中一或多個經化學基團（B、U、Z ; 其中Β、U及Ζ可為相同化學基團或不同化學基團）修飾， / t 該化學基團可包括（但不限於）以下一或多個：反應性官能 團、化學保護基團（CPG)、及連接體。用於在肽片段之N-端、或肽片段之C-端、在内部胺基酸之游離胺處、或其組 合引入化學基團之技術已為該項技術習知。經保護肽片段 (具有一或多個化學基團之肽片段）之例示性實例（如關於具 有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽之製備） 包括（但不限於）表6中所列示之肽片段。 SEQ ID NO: 胺基酸序列 SEQIDNO:9 中 之胺基酸位置 17 Ac-TTWEAWDRAIAE 1-12 18 CPG-YAARIEALLRALQE 13-26 19 CPG-QQEKNEAALRE 27-37 19 CPG- QQEKNEAALRE I 27-37 1 U 20 qqekneaalrel-nh2 27-38 29 Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL 1-20 30 CPG-LRALQEQQEKNEAALRE 21-37 130299.doc -57- 200902043 31 LRALQEQQEKNEAALRE L-NH2 21-38 21 Ac-TTWEAWDRAIA 1-11 22 CPG-EYAARIEALLRALQE 12-26 23 Ac-TTWEAWDRAI 1-10 24 CPG-AEYAARIEALLRALQE 11-26 25 Ac-TTWEAWDRA 1-9 26 CPG-IAEYAARIEALLRALQE 10-26 27 Ac-TTWEAWDR 1-8 28 CPG-AIAEYAARIEALLRALQE 9-26 32 Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE 1-18 33 CPG-ALLRALQEQQEKNEAALRE 19-37 34 ALLRALQEQQEKNEAALRE L-NH2 19-38
Ac-乙醯基，NH2-醯胺基團（但可為另一化學基團，如在 本發明”定義”章節中所詳細闡述）；CPG係化學保護基團 (例如，Fmoc或其他N-端化學保護基團，如在本發明”定義" 章節中所詳細闡述）；U係如上文所定義。 實例5 參照表5(組1或組2)及圖3，所闡釋者係一種合成具有 SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽之方法， 該方法使用3個特定肽片段（例如，SEQ ID NO:17-19+Leu ; 或SEQ ID NO:17、18、及20)、且使用包括將該3個肽片段 組合以產生HI V融合抑制劑肽之片段縮合途徑。每一該等 肽片段皆顯示達成以下之物理性質及溶解度特性：使其成 為用於以高產率及高純度合成具有SEQ ID NO:9之胺基酸 序列的HIV融合抑制劑肽之較佳肽片段（相對於兩片段途 徑），且進一步僅需要一種負載樹脂作為起始材料（簡化合 成方法）。具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列及包含SEQ ID NO:9前12個胺基酸（參見圖3，”AA(1-12)))之肽片段係藉由 130299.doc -58- 200902043 才*準固相合成（使用超酸敏感樹脂，例如，4 -經基曱基_ 3 _ 甲氧基苯氧基-丁酸樹脂、或2-氣三苯甲基氯樹脂_ "CTC"，圖3)、利用N-端之乙醯化（"Ac”，作為化學基 團）、同時在C-端處具有經基（-OH)來合成（參見圖3，”ac_ ΑΑ(1-12)-〇Η”）。具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列及包含 SEQ ID NO:9之胺基酸13-26的肽片段（參見圖3，，，AA(13_ 26))係藉由標準固相合成利用N-端之Fmoc^作為化學保護 基團）及C-端之_〇H(參見圖3 ’ "Fmoc-AA(13-26)-〇H")來合 成。具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列及且包含seq id NO:9之胺基酸27_37的肽片段（參見圖3，ΠαΑ(27_37)π)係藉 由標準固相合成利用Ν_端之Fmoc(作為化學保護基團）及c_ 端之-〇H(參見圖3 ’ "Fmoc-AA(27-37)-〇H”）來合成。藉由 熟悉該項技術者習知之裂解劑、溶劑及技術將各肽片段自 用於其固相合成之樹脂裂解。然後藉由以下分離出各肽片 段：藉由蒸餾去除大部分以上所提及之溶劑且藉由在有或 沒有含醇共溶劑之情況下添加水使該肽片段沈澱。藉由過 濾、洗滌、於水或醇/水中重新變成漿液、再過濾並於真 空烘箱中乾燥分離出所得固體。 如圖3中所示’藉由溶液相合成製得肽片段，其中將具 有8£(5 10!^0:19之胺基酸序列的肽片段（參見圖3，”17111〇(> ΑΑ(27·3 7)-〇Η”）以化學方式偶合至已於溶液相中酿胺化的 Leu(即，SEQ ID ΝΟ:9之胺基酸38)以獲得具有seq山 NO:20之胺基酸序列（包含SEQ ID N〇:9之胺基酸27_3δ)同 時c-端醯胺化（作為化學基團）的肽片段（參見圖3，"Fm〇c_ 130299.doc -59· 200902043 ΑΑ(27_38)_ΝΗ2’’）。在一種合成方法中，本發明所提供之 知胺化肽片& (其包括但不限於月太片段龍2) 可使用醯胺樹月日直接合成。總結此溶液相反應，分別使用 ΗΒΤυ(0·苯并二σ坐小基_N，N，N,，Nl_四甲基腺六氣填酸鹽） 或TBTU(0-苯并二唾小基_N，N，N,，N、四甲基四氟石朋酸鹽） 及HOBT 6-C1 HOBT或HOAT在DIEA(二異丙基乙基胺）及 白胺酸醯胺（例如，偶合劑與外消旋抑制劑之組合）之存在 下將經分離肽片段Fm〇c_AA(27_37)_〇H之羧基末端轉化成 ΗΟΒΤ(ϋ基苯并二唑水合物）、6 C1 H〇Bt、或HOAT。· 羥基-7-氮雜苯并三唑）之活性酯。此反應係在極性非質子 溶劑（例如DMF(二曱基曱醯胺）或nmp(n_甲基吼咯啶酮）中 於0至30°C下實施。偶合反應完成時，將六氫吡啶、碳酸 鉀、DBU或其他熟悉該項技術者習知之鹼在有或沒有額外 共溶劑之情況下添加於反應中以實施末端Fm〇c保護基團之 去除。反應完成後’添加醇或水可混溶溶劑及/或水以沈 須又具有SEQ ID NO:20之胺基酸序列同時在c_端醯胺化之肽 片段（H-AA(27-38)-NH2)。 如圖3中示意性緣示，為使用肽片段Fm〇c_AA(27-37：)-OH結合白胺酸醯胺（參見圖3，”H_Leu_NH2")在溶液相方法 中製備肽片段H-AA(27-38)-NH2，將肽片段Fmoc-AA(27- 37)-OH (571 克 ’ 205 毫莫耳，！當量）、H_Leu -NH2 (32.0 克 ’ 246 毫莫耳，1.2 當量）、&6_cl HOBT (41.7 克，246 毫 莫耳，1.2當量）添加mDMf (4568毫升，8體積）中，用 DIE A (53.6毫升’ 307.5毫莫耳’ 1.5當量）處理並於室溫下 130299.doc •60- 200902043 攪拌直至溶解（約20分鐘）。使溶液冷卻，並添加ΤΒΤϋ (79.0克’ 246毫莫耳’ U當量）。將反應於(TC、然後於 25 C下授拌HiPLC分析顯示反應完成冑，添加六氮比 啶（81笔升，820毫莫耳，4當量）以去除肽片段Fm〇c_ AA(27-38)-NH2之Fmoc保護基團（可使用其他鹼，例如碳酸 钟、DBU等）。將反應於3〇〇c下攪拌直至由HpLc顯示完 成。然後將反應混合物冷卻至低於5。〇且緩慢添加預冷水 (8體積，4568毫升）以使所得漿液溫度保持低於1〇。〇。將懸 浮液攪拌30分鐘，且然後過濾並用25%乙醇/水洗滌兩次 (2284毫升，每次4體積）。藉由於乙醇/水（有或沒有稀酸） 及/或MTBE/庚烷或其他類似溶劑混合物中重新變成漿液 去除殘餘六氫吼啶及六氫吡啶二苄基富烯。如圖3中所 示’所得係經分離肽片段H-AA(27-38)-NH2之製備物。 如圖3中所繪示，然後實施溶液相反應，其中將肽片段 H-AA(27-38)-NH2 (SEQ ID NO:20)與肽 段 Fmoc-AA(13-26)-OH (SEQ ID NO:18)組合且去保護以獲得肽片段^ 八八（13-38)->^2(在义端及（：-端每一端具有化學基團之8£〇 ID NO:35)。 將肽片段？111〇〇八八（13-2 6)-011(460克，167毫莫耳，1當 量）、肽片段 H-AA(27-38)-NH2 (460 克，172 毫莫耳，1.03 當量）及6-C1 HOBT (34克，200毫莫耳，1.2當量）添加於 DMF (6900毫升，15體積）中，用DIEA (47毫升，267毫莫 耳’ 1.6當量）處理，並攪拌以溶解所有固體。將所得溶液 冷卻至低於5°C。向反應中添加TBTU (64克，200毫莫耳， 130299.doc 61 200902043 1，2當量），並將反應於〇°C、且然後於25°C下授祥。 顯示反應完成後，添加六氫吡啶（5 8毫升，668毫莫耳 4 當量）以去除Fmoc，並將反應攪拌直至HPLC顯示完成為 止。將溶液冷卻至低於5°C並以不會使溫度升高至超過 l〇°C之速率緩慢添加水（6900毫升’ 15體積）。將所得懸浮 液攪拌3 0分鐘後’藉由過濾收集固體並用水洗滌（兩次， 2300毫升’每次5體積）’並乾燥。藉由於乙醇/水（有或沒 有稀酸）及/或MTBE/庚烷或其他類似溶劑混合物中重新變 成漿液去除殘餘六氫吡啶及六氫吡啶二苄基富烯。藉由過 濾收集固體，洗滌並乾燥，獲得呈基本上純的白色固體札 AA(13-3 8)-NH2 (SEQ ID NO:3 5)，如藉由用於純度之高效 液體層析（HPLC)分析所確定。
如圖3中所繪示’然後將肽片段^1_八八（13_3 8)^112(8£(5 ID NO:3 5)於溶液相反應中與肽片段— (SEq ID
NO: 17)組裝以獲得具有沾〇 id n〇:9之胺基酸序列的HIV w虫合抑制劑肽（參見例如圖3，AC_( 1 _3 8)-NH2)。將肽片段 Ac-AA(l-12)-OH (130克，58.5毫莫耳，}當量）磨成細粉末 並與肽片段H-AA(13-3 8)-NH2 (3 03克，58.5毫莫耳，1當 置）混合。將此混合物緩慢添加於2:;[ DCM/DMF (20體積， 2600毫升）及DIEA (25.5毫升，146毫莫耳，2.5當量）之溫 溶液中。添加HOAT (15.9克，117毫莫耳，2.〇當量）並將 混合物攪拌直至所有固體溶解為止。將所得溶液冷卻至低 於5 C並添加TBTU (2 8.2克，87.8毫莫耳，1.5當量）。將溶 液於0 C下攪拌30分鐘且然後於25下攪拌3 〇分鐘，直至 130299.doc -62- 200902043 HPLC展示反應完成為止。將溶液加熱至3〇_35它並添加額 外DCM (13體積，1740毫升），隨後添加HA (182〇毫升， 14體積）。將混合物攪拌5分鐘且然後使層分離。去除水層 並用新鮮H2〇 (1 820毫升，14體積）代替。此分離總共重複5 次。將有機層蒸餾至其初始體積的約1/3並添加異丙醇 (IPA; 1S20毫升，Μ體積）。繼續蒸餾以去除剩餘dcm。 將所得漿液冷卻至低於5°C並緩慢添加H2〇 (1820毫升，14 體積）。藉由過濾收集所形成固體，用H2〇洗滌兩次（52〇毫 升，每次4體積）並乾燥，獲得經分離HIV融合抑制劑肽八〇_ AA(l-3 8)-NH2 (SEQ ID ΝΟ:9)之製備物，如藉由用於純度 之HPLC分析所確定。 如圖3中所示，可藉由酸解或熟悉該項技術者習知藉由 去除側鏈化學保護基團使肽去保護之任何其他方法去除 HIV融合抑制劑肽Ac-AA(l-38)-NH2之側鏈化學保護基 團。在此實例中，將HIV融合抑制劑肽ac_aa( 1-3 (60克，8」毫莫耳）用TFA (三氟乙酸）:DTT(二硫蘇糖醇）：水 (90:10:5 ; 570毫升）處理並於室溫下攪拌6小時。將溶液冷 卻至低於HTC，並以使溫度保持低於1(rC2速率緩慢添力7口 預冷MTBE (25體積，1500毫升）。藉由過濾收集所得固 體，用MTBE洗滌並乾燥。然後將所得粉末於乙腈（acn ; 10體積，600毫升）中變成聚液並利用DIEA及乙酸將？11調 節至介於4與5之間以使狀脫羧。藉由hplc顯示此完成 後，藉由過濾收集固體，用ACN洗滌並乾燥，以獲得去保 護及賴之肽’其然後可藉由HPLC或其他適宜層析技術 130299.doc -63 - 200902043
’、’屯化以獲得具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的經分離HIV 融合抑制劑肽之製備物。 實例6
參知、表5(組3及組4)及圖4 ,其闡釋了合成具有SEQ ID no:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽之方法，該方法使 用2個特疋肽片段（例如，SEq出no:”及或 ID N〇:29及31)且使用包括將2個肽片段藉由化學偶合（"組 表）組合之片段組裝途徑以產生具有seq ID N〇:9之胺基 酸序列的HIV融合抑制劑肽。每—該等肽片段皆顯示使其 在使用2個肽片段以尚產率及純度合成具有seq ι〇 n〇:9之 月女基馱序列的HIV融合抑制劑肽之方法中較佳的物理性質 及岭解度特性。在選擇用於兩片段組裝方法之肽片段中， 已發現在兩個已組裝在一起的片段間接合點處具有白胺酸 及/或麵胺酸殘基（例如，具有SEQ m N〇:29胺基酸序列的 月片奴的C_端胺基酸、及具有SEQ ID No」^胺基酸序列的 肽片段的N-端胺基酸)有利於以高產率組裝及獲得一定純 度。 ，、有SEQ ID N0.29之胺基酸序列且包含SEq ID N〇:9前 2〇個胺基酸（”AA(1-20)”）之肽片段係藉由標準固相合成、 利用N-端之乙醯化（’，Ac"，作為化學基團）、㈣在c_端處 具有經基（-OH)來合成（參見表6 ;本發明亦稱為"八“^ _ 20)-〇H )。具有SEQ ID N〇:3〇之胺基酸序列且包含SEQ m N〇:9之胺基酸21-37(”AA⑵，”）的肽片段係藉由標準固 相合成利用N-端之Fm〇c(作為化學保護基團）、及c_端之 130299.doc -64 - 200902043 -OH來合成（參見表6 ;本發明亦稱為”Flnoc_AA(21_37)_ OH")。 如表5中組3及組4、及圖4中所示，肽片段係藉由溶液相 合成來製備，當將肽片段Fmoc-AA(2 1-37)-〇H於溶液相中 化學偶合至Leu(即SEQ ID NO:9之醯胺化胺基酸38)時獲得 具有SEQ ID ΝΟ··31之胺基酸序列（包含SEQ ID NO:9之胺基 酸2 1 -38)同時C-端醯胺化（作為化學基團）的肽 AA(21-3 8)-NH2")。為使用肽片段Fmoc-AA(21-37)-〇H結合 白胺酸（"Η-Leu NH2")於溶液相方法中合成肽片段Fm〇c_ AA(21-38)-NH2 ’ 將肽片段Fmoc-AA(21-37)-〇H (30 克， 7.43毫莫耳，1.0當量）、：9_1^11_>^2*]9[(：：1(136克，816毫 莫耳’1.2當量）及肋八丁（1.52克，11.2毫莫耳，1.5當量）溶 於〇]\^(450毫升，15體積）中，用_八（65毫升，37 3毫 莫耳，5當量）處理，並於室溫下攪拌直至溶解（約3〇分 鐘）。將溶液冷卻至〇±5。(：，並添加7^1'11(2.86克，8.91毫 莫耳1 ·2 g畺），於〇±5 c下擾拌5分鐘，且然後使其於 25±5°C下反應2小時或直至HPLC顯示反應完成為止。 然後去除肽片段Fm〇C-AA(21-38)-NH2之Fmoc化學保護 基團，之後分離出片段H_AA(21_38)_NH2。添加六氫吡啶 (7.3笔升，73 8毫莫耳，1〇當量）並將溶液於25±5。〇下攪拌 1小時或直至HPLC分析展示自該肽片段去除基本上所有 為止將反應器冷卻’並添加水（1000毫升，30體 積），並將自由流動漿液於小於丨0它下攪拌30分鐘，且然 後藉由過濾分離。將所收集固體用丨：i Et0H/水洗滌並於真 130299.doc -65 - 200902043 空烘箱中於35士5。(：下乾燥。然後使該肽片段於1:1 EtOH/水 (450毫升，丨5體積）中重新變成漿液，持續3小時。將固體 收集並乾燥。然後使肽片段於3 :1己烧：MTBE (450毫升， 1 5體積）中成漿液過夜，且然後藉由過濾分離並重新乾 燦。視需要可使Μ1ΈΕ重複成漿液以去除額外六氫吡啶。 所得係經分離肽片段;9-八八（21-38)4?12(參見圖4)之製備 物。 然後實施溶液相反應，其中將肽片段Η_αα(2 1 -38)-ΝΗ2 (SEQ ID ΝΟ:31)與肽片段 Ac-AA(1-20)-〇H (SEQ ID ΝΟ:29) 組合以獲得具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑 制劑肽（參見圖4，Ac-(1-38)-NH2)。將肽片段h-AA(21-3 8)-NH2 (3.40 克 ’ 〇·86 毫莫耳，1 當量）、肽片段 Ac_AA(1_ 20)观（3.0〇克，0.86毫莫耳，1〇當量）、及肋八丁（〇177 克，1.3毫莫耳’ 15當量）及DIEA (〇 599毫升，毫莫 耳，4爾里）洛於DMAc (二甲基乙醯胺；⑽毫升，η體積） 中，冷卻至〇士代。向反應中添加TBTU (〇.331克，丨〇3毫 莫耳1.2田里）。將反應於0±5°c下攪拌5分鐘且於25±5°C 下授拌3 j時或直至hplc展示反應完成為止。將反應器冷 卻。，並緩慢添加水（200毫彳，66體積）。形錢液並於小於 10C下授拌至少30分鐘。藉由過渡收集固體並用額外的水 洗條。將所收集固體於真空烘箱中於35坑下乾燦。所得 係元全經·保達、經分人 、刀離之HIV嘁合抑制劑肽Ac_aA(1_38)_ 題2 (SEQ ID N0:9)之製備物，如藉由用於純度之紙c分 析所確定。然後藉由使用實例5中所述之方法、或熟悉該 130299.doc -66- 200902043 項技術者習知用於去保護及脫羧之任何其他方法使出v融 合抑制劑肽去保護（藉由去除側鏈側鏈化學保護基團）並脫 羧（在色胺酸殘基處）’且然後純化（例如，藉由HpLc)戶 得係具有SEQ ID N0:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑2 之製備物（去保護及脫羧）（在此闡述中，在沁端處乙醯L， 且在C-端處醯胺化）。 使用類似技術及條件，包括2片段組裝或3片段組裝之額 外片段組裝途徑已用於製備具有SEQ ID Ν〇:9之胺基酸序 列的Η】V融合抑制劑肽(參見例如表4及5)。根據本發明之
說明應瞭解，可使用用於藉由本發明方法製備具有SEQ ID Ν〇··9之胺基酸序列的mv融合抑制劑月太之較佳肽片段並排 除使用非較佳肽片段之肽片段。同樣，亦可使用用於藉由 本發明方法製備具有SEQ ID Ν〇:9之胺基酸序列的出乂融 合抑制劑肽的較佳肽片段組並排除使用非較佳肽片段組之 肽片段組。 實例7 本务明另—實施例係關於可用於合成具有SEQ ID NO: 1 〇 之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽的方法、肽片段及肽片 &組。根據本發明之說明亦應瞭解，言玄等方法、肽片段及 肽片段組可用於合成具有SEQ ID NO: 1〇之胺基酸序列的 HIV嘁合抑制劑肽’ λ中該HIV融合抑制劑肽包含一或多 個化學基團： B TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL _Ζ 130299.doc -67- 200902043 其中胺基末端或羧基末端中任一個或二者經化學基團 (B、U、Z;其中B、U及Z可為相同化學基團或不同化學基 團）修飾，該化學基團可包括（但不限於）以下一或多個：反 應性官能團、化學保護基團（CPG)、及連接體。肽片段、 肽片段組及經保護肽片段（具有一或多個化學基團之肽片 段）之例示性實例（如關於具有SEQ ID NO: 1 0之胺基酸序列 的HIV融合抑制劑肽之製備）包括（但不限於）彼等分別列示 於表7、8及9中者。 表7 SEQID NO: 胺基酸序列 SEQ ID NO: 10 中之胺基酸位置 17 TTWEAWDRAIAE 1-12 41 YAARIEALLRAAQE 13-26 42 QQEKLEAALRE 27-37 43 QQEKLEAALREL 27-38 21 TTWEAWDRAIA 1-11 44 EYAARIEALLRAAQE 12-26 23 TTWEAWDRAI 1-10 45 AEYAARIEALLRAAQE 11-26 25 TTWEAWDRA 1-9 46 IAEYAARIEALLRAAQE 10-26 27 TTWEAWDR 1-8 47 AIAEYAARIEALLRAAQE 9-26 29 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL 1-20 48 LRAAQEQQEKLEAALRE 21-37 49 LRAAQEQQEKLEAALREL 21-38 32 TTWEAWDRAIAEYAARIE 1-18 50 ALLRAAQEQQEKLEAALRE 19-37 130299.doc -68- 200902043
51 ALLRAAQEQQEKLEAALREL 19-38 52 YAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL 13-38 53 EYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL 12-38 54 AEYAARIE ALLRAAQEQQEKLEAALREL 11-38 55 IAEYAARIE ALLRAAQEQQEKLEAALREL 10-38 56 AIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL 9-38 57 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF 58 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT 59 YQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQOEKNMYELQKL 本發明進一步提供者係在合成具有SEQ ID ΝΟ:1 0之胺基 酸序列的HIV融合抑制劑肽之方法中用作中間體之特定肽 片段組。本發明所提供之肽片段組包括組1 -1 4，如表8中 所指定（組編號僅出於易於闡述的目的）。可使用某些肽片 段組並排除使用其他肽片段組。 表8 組編號 肽片段 SEQ ID NO:10 中之胺基酸位置 1 TTWEAWDRAIAE (SEQ ID NO: 17) 1-12 YAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:41) 13-26 QQEKLEAALRE (SEQ ID NO :42) 27-37 2 TTWEAWDRAIAE (SEQ ID NO: 17) 1-12 YAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:41) 13-26 QQEKLEAALREL (SEQ ID NO:43) 27-38 3 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL (SEQ ID NO:29) 1-20 LRAAQEQQEKLEAALRE (SEQ ID NO:48) 21-37 4 TTWEAWDRAIAEYAARIEAL (SEQ ID NO:29) 1-20 LRAAQEQQEKLEAALREL (SEQ ID NO:49) 21-38 5 TTWEAWDRAIA (SEQ ID NO:21) 1-11 EYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:44) 12-26 QQEKLEAALRE (SEQ ID NO:42) 27-37 130299.doc •69- 200902043 6 TTWEAWDRAI (SEQ ID NO:23) 1-10 AEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:45) 11-26 QQEKLEAALRE (SEQ ID NO :42) 27-37 7 TTWEAWDRA (SEQ ID NO:25) 1-9 IAEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:46) 10-26 QQEKLEAALRE (SEQ ID NO:42) 27-37 8 TTWEAWDR (SEQ ID NO:27) 1-8 AIAEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:47) 9-26 QQEKLEAALRE (SEQ ID NO:43) 27-37 9 TTWEAWDRAIA (SEQ ID NO:21) 1-11 EYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:44) 12-26 QQEKLEAALREL (SEQ ID NO:43) 27-38 10 TTWEAWDRAI (SEQ ID NO:23) 1-10 AEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:45) 11-26 QQEKLEAALREL (SEQ ID NO:43) 27-38 11 TTWEAWDRA (SEQ ID NO:25) 1-9 IAEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:46) 10-26 QQEKLEAALREL (SEQ ID NO:43) 27-38 12 TTWEAWDR (SEQ ID NO:27) 1-8 AIAEYAARIEALLRAAQE (SEQ ID NO:47) 9-26 QQEKLEAALREL (SEQ ID NO:43) 27-38 13 TTWEAWDRAIAEYAARIE (SEQ ID NO:32) 1-18 ALLRAAQEQQEKLEAALRE (SEQ ID NO:50) 19-37 14 TTWEAWDRAIAEYAARIE (SEQ ID NO:32) 1-18 ALLRAAQEQQEKLEAALREL (SEQ ID NO:51) 19-38 表9 SEQ ID NO: 胺基酸序列 SEQ ID NO:10 中之胺基酸位置 17 Ac-TTWEAWDRAIAE 1-12 41 CPG-YAARIEALLRAAQE 13-26 42 CPG-QQEKLEAALRE 27-37 130299.doc -70- 200902043 42 CPG- QQEKLEAALRE I 27-37 1 IvDde 43 qqekleaalrel-nh2 27-38 29 Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIEAL 1-20 48 CPG-LRAAQEQQEKLEAALRE 21-37 49 LRAAQEQQEKLEAALRE L-NH2 21-38 21 Ac-TTWEAWDRAIA 1-11 44 CPG-EYAARIEALLRAAQE 12-26 23 Ac-TTWEAWDRAI 1-10 45 CPG-AEYAARIEALLRAAQE 11-26 25 Ac-TTWEAWDRA 1-9 46 CPG-IAEYAARIEALLRALQE 10-26 27 Ac-TTWEAWDR 1-8 47 CPG-AIAEYAARIEALLRAAQE 9-26 32 Ac-TTWEAWDRAIAEYAARIE 1-18 50 CPG-ALLRAAQEQQEKLEAALRE 19-37 51 ALLRAAQEQQEKLEAALRE L-NH2 19-38 參照表8(組3及組4)，其闡釋了合成具有SEQ ID NO:10 之胺基酸序列的HI V融合抑制劑肽之方法，該方法使用2個 特定肽片段（例如，SEQIDNO:29及48 + Leu;或SEQID NO: 29及49)且使用包括將2個肽片段藉由化學偶合（”組裝") 組合之片段組裝途徑以產生具有SEQ ID NO:10之胺基酸序 列的HIV融合抑制劑肽。為使用具有SEQ ID NO:48之胺基 酸序列的肽片段（"Fmoc-AA(21-37)-OH")結合白胺酸 （"H-Leu NH2")於溶液相方法中製備具有SEQ ID NO:49之胺基 酸序列的肽片段（”Fmoc-AA(21-38)-NH2”），將肽片段 ?〇1〇〇-八八（21-37)-01^(30.01克，7.98毫莫耳，1.0當量）、 130299.doc -71 - 200902043 H-Leu-NH2*HC1 (1.48 克，8.78 毫莫耳，l.l 當量）、及 恥八丁（1.63克’11.97毫莫耳’1_5當量）溶於]：)游（45〇毫 升’ 15體積）中，用DIEA (7.0毫升，39.91毫莫耳，5當量） 處理並於室溫下攪拌直至溶解（約3〇分鐘），將溶液冷卻至 〇±5〇，並添加丁3丁11(3,09克，9.58毫莫耳，1.2當量），於 〇±5 C下攪拌5分鐘，且然後使其於25±5它下反應2小時或 直至HPLC顯示反應完成為止。 然後去除肽片段Fmoc-AA(21-38)-NH2之Fmoc化學保護 基團，之後分離出片段H_AA(21_38)_NH2。添加六氫吡啶 (8.0¾升，79.8宅莫耳，1〇當量）並將溶液於25±5qc下攪拌 1.5小時或直至HPLC分析展示自該肽片段去除基本上所有 Fmoc為止。將反應器冷卻，並添加水（1〇〇〇毫升，3〇體 積），並將自由流動漿液於小於丨〇〇c下攪拌3〇分鐘，且然 後藉由過濾分離。將所收集固體用1:3 Et〇H/水洗滌並於真 空烘箱於35±5°C下乾燥。然後使該肽片段於丨：3以〇11/水 (400毫升，13體積）中重新變成漿液，持續3小時。將固體 收集並乾烯’且然後將肽片段於3 ·· 1己烷：MTBe (4〇〇毫 升，13體積）中成漿液過夜，藉由過濾分離並重新乾燥。 視需要可使MTBE重複成漿液以去除額外六氫α比啶。所得 係經分離肽片段Η-ΑΑ(21_38)_ΝΗ2(參見表9，SEQ ι〇 NO:49)之製備物。 然後實施溶液相反應，其中將肽片 (SEQ ID NO:49)與肽片段 Ac-AA(1-20)-OH (SEQ ij) NO:29，表9)組合以產生具有SEQ m N〇:1〇之胺基酸序列 130299.doc -72- 200902043 的HIV融合抑制劑肽（參見例如Ac-(l-38)-NH2)。將肽片段 114八(21-3 8)->^2(3.14克，0.86毫莫耳，1當量）、肽片段 Ac-AA(1-2〇)-〇h (3.00 克，0·86 毫莫耳，1.0 當量）、及 Η0ΑΤ (〇·18 克，1.3毫莫耳 ’ 1.5 當量）及 DIEA (0.599 毫 升’ 3.44毫莫耳，4當量）溶於DMAc (1〇〇毫升，33體積） 中’冷卻至0±5°C。向反應中添加TBTU (0.331克，1.03毫 莫耳’ 1.2當量）。將反應於〇±yc下攪拌5分鐘且於25±5t： 下攪拌3小時或直至使用HPLC展示反應完成為止。將反應 器冷卻，並緩慢添加水（250毫升，83體積）。形成漿液並於 小於1 0 C下攪拌至少3 〇分鐘。藉由過濾收集固體並用額外 的水洗務。將所收集固體於真空烘箱中於35±5^下乾燥。 所得係完全經保護、經分離之HIV融合抑制劑肽Ac_aa(i_ 38)-NH2 (SEQ ID N〇:1〇)之製備物，如藉由用於純度之 HPLC分析所確定。然後藉由使用實例4中所述之方法、或 熟悉該項技術者習知用於去保護及脫羧之任何其他方法使 HIV融合抑制劑肽Ac_AA(1_38)_NH2去保護（藉由去除側鏈 側鏈化學保護基團）並脫羧（在色胺酸殘基處p純化後，所 得係SEQ ID NQ:1G之胺基酸序狀經分離mv融合抑制劑 肽之製備物（去保護及脫羧）（在冰端處乙醯化且在c_端處醯 胺化）’如使用HPLC所確定。 使用類似技術及條件，包括2片段組裝或3片段植H 外片段組裝途徑可用於製備具有SEQidn〇:i()之胺基西^ 列的融合抑制劑肽（參見例如表⑷）。根據本於明欠 說明應瞭解，可使用用於藉由本發明所提供之方法製 130299.doc •73- 200902043 有SEQ ID NO:1〇之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽的肽片 段並排除使用其他肽片段。同樣，可使用用於藉由本發明 所提供之方法製備具有SEq ID NO: 10之胺基酸序列的HIV 融合抑制劑肽的肽片段組並排除使用其他肽片段組。 實例8 本發明進一步提供者係在治療HIV感染及/或aids或其 療法中或作為其治療方案的_部分用於將抗病毒肽⑼如 HIV融合抑制劑肽)單獨投與或作為本發明所提供組合物中 之活性樂物投與之方法。在抑制HIV至無細胞之傳播的方 法中可利用抗病毒活性HIV融合抑制劑肽，該方法包含使 病毒及/或細胞與有效抑制細胞被㈣感染、且更佳抑制 鮮介導的病毒與乾細胞間之融合之量的η 肽接觸。此方法可用於、Λ成UT ^ ^ 療HIV感染患者（治療）或用於治 療新暴露於HIV或且右古| & ^ 円暴路危險（例如，藉助藥物濫用或 尚危險性行為）之患者 *者之m (預防）α此，例如，在Hiv-i感染 L或結V劑量:Γ):^ 量。如熟二=療患者:™載之劑 之標準方法，該等方 由。午夕里測HIV病毒負載 定量培養及血聚hIVrn=⑽不限於）外週血單核細胞之 以間歇性、週期性、Γ 。該等Ηίν融合抑制劑狀可 由醫師藉由(例如)監二續方式在單次投與令投與，如可 7皿病毒倉截决 a 供包含HIV融合抑制具^=。知視本發明所提 供之具體組合物θ不 丑' 口物、諸如本發明所提 疋進—步包含醫藥上可接受之載劑及/ 130299.doc -74· 200902043 或大刀子载體等因素而定，該mv融合 至數週或可泸争i 抑制劑肽可以數天 之立他h二I週期投與。此外，當與用於治細v …： 樂物或預防劑結合使用或按—種户療方荦 (例如’當同時使用、或用一種藥物：療'案 物不循環時）使用_，m 衣且另一種藥 中。 用時HIV融合抑制劑肽可用於抗病毒治療 種涉及抗病毒劑組合之常用 性抗-读鐘梓广主 黡係自知haart(高活 逆轉錄病U療）。HAARTitt# 勝抗病m生之藥物結合， Μ對具有抗 Γ種類m 夕及—種以上的藥物 程)。因：：、或該藥物乾向之病毒蛋白或過 因此’本發明所提供含HIV融合抑制劑肤之組合物可 單獨技與（例如，作為置__、Λ #、上 残华及β Ατη 4早一〉口療）或可在涉及用於治療請 α木及/或AIDS之額外治療劑組合 同浐盥Λ + σ 口療方案中投與或共 门杈/、如本發明更詳細闡述者。 舉例而δ，在一個實施例中， 可盥在，口療中一或多種治療劑 υνι抑制劑肽組合於本發明所提供之組合物卜 Γ組合除該HIV融合抑制劑肽以外可包含至少—種抗病 毒劑。該等組合可（例如）自目义ρ “ # 柷病 旦』 j (例如）自目則已批准或將來批准之有效 =病毒劑（用於治療HIV感染）製備，該等組合包括（但不 限於)-或多種選自以下之額外治療劑： 細胞因子，例如rIFN a、rIFN P、rIFN . 1q如 劑，1包括η曰a、 β Ν γ’逆轉錄酶抑制 ”括（但不限於）阿巴卡韋、ΑΖΤ(齊多夫定）、 ddC(紮西他賓）、太貴如承 、、 不早拉+ ddl(去羥肌苷）、FTC(恩曲他 肩、（+)及㈠ FTC、reverset、3TC(拉米夫定）、GS _、 130299.doc -75- 200902043 GW-1 592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韋定、依 法韋倫、d4T(司他夫定）、FLT、TMC125、阿德福韋、替 諾福韋、及阿洛夫定；蛋白酶抑制劑，其包括（但不限於） 安普羅銨、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、英地那 韋、奈非那韋、PNU-140690、利托那韋、沙喹那韋、替 利那韋、替拉那韋、阿紮那韋、洛匹那韋、ABT378、 ABT538及MK639 ;病毒mRNA封帽抑制劑，例如利巴韋 林；作為具有抗-HIV活性之脂質結合分子的兩性黴素B ; 作為糖蛋白加工抑制劑之栗精胺；病毒進入抑制劑，例如 融合抑制劑（恩夫韋地、T1 249、其他融合抑制劑肽、及小 分子）、SCH-D、UK-427857 (Pfizer)、TNX_3 55 (丁抓⑽公 司）、AMD-070 (AnorMED)、pro 140、Pro 542 (Progenies) ' FP-21399 (EMD Lexigen) ^ BMS806 ^ BMS- 488043 (Bristol-Myers Squibb)、maraviroc (UK-427857)、 ONO-4128、GW-873 140、AMD-887、CMPD-167、&GSK-873,140 (GlaxoSmithKline) ; CXCR4拮抗劑，例如 AMD- 070);脂質及/或膽固醇相互作用調節劑，例如鹽酸普魯卡 因（SP-01及SP-01A);整合酶抑制劑，包括（但不限於）L_ 870、及810，RNAseH抑制劑；rev或REV之抑制劑；vif之 抑制劑（例如，Wf衍生之富脯胺酸肽、HIV]蛋白酶N_端衍 生之肽）；病毒處理抑制劑，包括（但不限於）樺木醇、及二 氫樺木醇衍生物（例如，pA_457);及免疫調節劑，包括（但 不限於）AS-101、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、iL_2、 丙戊酸、及胸腺噴丁。如熟悉HIV感染及/或AIDS治療技 130299.doc -76- 200902043 術者所瞭解，組合藥物之量可包含兩 用機制之治療劑，或可包含兩種或或以上具有相同作 之治療劑。 上具有不同作用機制 該項技術中已習知可與HIV融合 ζ入 ’劑狀、及/或本發明 所k供之組合物結合使用之該等 Μ- ^ n '、生碩外治療劑之有效 -I里。而且，欲投與本發明所提供 荜组人铷夕古4 U曰 Iv融合抑制劑肽或醫 条，、口物之有效劑1可藉助熟悉 砝宏.点丨丄.. 支術者習知之程序來 疋，例如，精由確定效能 '生物 毒性。在一+农期、生物利用度及 在個貝施例中，HIV融合抑制十丨 劑詈笳11仫士 4 4 背丨】月太之有效量及其 里祀圍係由熟悉該項技術者根 常規活體外及活體内研究來確定。舉;;Μ技術者習知之 之活體外感染性分析(例如本發明所牛闡而':抗病毒活性 項技術者確定化合物作為單獨活性 '者）成夠使熟悉該 ^ f,J ^ ^ ® ^ # IC5。；或 90%抑制，IC9Q) 如 ’ 50%抑制， (1C)。然後可由熟悉該項技 雨均抑制沒度 型之荜物代魅… 來自—或多種標準模 i之柰物代。射動力學數據 馍 過抑制病毒感染性或病主㈣…1里’以獲得等於或超 將'm h 複製之預定值的活性試劑最大血 漿/辰度仰_])。儘管 幻取大血 及劑量調配，"投與 通取決於所選投與途捏 ί j如包括（但不限於、由τ 經腸、皮内或經口之投與途 限於)皮下、非 實例性劑量範圍可Α ，、'、，〖忒劑之化合物的 固了為約1笔克/公斤體 體重；且更佳不少^、 玍、、^⑽耄克/公斤 夕於1笔克/公斤體重至 體重。在一個實施例中， 夕於10毛克/公斤 藉由注射（使用例如皮下）投與（在 130299.doc -77. 200902043 一個實施例中）HIV融合抑制劑肽。 因此，提供一種抑制HIV至細胞之傳播的方法，該方法 包含將本發明所述包含HIV融合抑制劑肽之組合物以有效 量投與以抑制細胞被HIV感染。該方法可進—步包括將本 發明所述組合物與其他用於治療HIV感染及/或aids之治 療劑組合投與給患者，其係藉由向該個體投與包含有效量 的本發明所提供HIV融合抑制劑肽或醫藥組合物之治療劑 組合（同時或相繼，或治療方案的一部分）。亦提供抑制 HIV進入之方法，該方法包含向有需要的患者投與有效量 的本务明所述包含HIV融合抑制劑肽之組合物以抑制革巴細 胞之病毒進入。該方法可進一步包括將本發明所述組合物 與有效量的一或多種抑制HIV感染之額外抑制劑（例如病毒 進入之抑制劑）組合投與。 實例9 以下闡述製備本發明所提供組合物之方法。此外，闡述 例示性組合物。 材料：乙酸異丁酸蔗糖酯（SAIB)係自Eastman chemicals 獲得。聚丙父酯（PLA)及聚丙交酯-共-乙交酯（ρ[ga)皆自 Lakeshore Biomateials獲得。pLA及PLGA在丙交酯：乙交酯 比例、分子量及其端基方面不同。用於次研究之所有 PLGA皆為50:50丙交酯：乙交酯。分子量係根據名稱中之數 字加以分級。分子量估計值係i 0000乘以該數字。端基為 叛睃（A)、曱基醋（M)或月桂基醋（L)。N-曱基-2- °比σ各咬酮 (ΝΜΡ)係自Spectrum獲得。苯甲酸苄基酯及三醋精係自 130299.doc -78- 200902043
Sigma獲得。胍HC1係自Α_π〇獲得。ΤΓ^Ηα係自叫则 " (2比σ疋基氮雜）間苯二齡·係自Sigma獲得。甲醇係 自WR彳I得。硫酸辞七水合物係自Sigma獲得。氣化鋅係 自Sigma獲得。 TU44肽類物質之製備：τη44肽類物質係根據以下方案 製備。 喷霧乾燥：將Τ1144肽在小於4或大於6之ρΗ下溶解（通常 於水中）。使用1 N NaOH或1 N HC1調節ΡΗ。藉助霧化噴嘴 將肽命液噴務於加熱室中。人工收集經乾燥肽顆粒。 肽可進一步藉由上述噴霧乾燥方法製備，但同時將賦形 训添加於噴霧乾燥溶液中，由此將該賦形劑與該肽合倂。 鹽或pH沈澱：將肽在小於4或大於6之ρΗ下溶解（通常於 水中）。使用1 N NaOH或IN HC1調節ρΗ。添加鹽溶液或強 酸/鹼以引起沈澱。藉由離心收集沈澱物，藉由凍乾乾燥 並使其穿過2 0 0微米筛以控制粒徑。 媒劑製備：媒劑係根據以下方案來製備。 SAIB媒劑製備：將達到合意最終濃度之適宜量的从汨 加熱並添加於NMP中，並混合直至均勻。 SAIB/PLA媒劑製備：將達到合意最終濃度之適宜量的 PLA溶於NMP、笨曱酸苄基酯或三醋精中。將達到合意最 終濃度之適宜量的SAIB加熱並添加於PLA溶液，並混合 至均勻。 PLA、PLG及PLGA媒劑製備：將達到PLA、PLG或 PLGA合意最終濃度之適宜量的PLA、pLG或pLGA溶於 130299.doc -79- 200902043 NMP 中。 組合物可藉由任何熟悉該項技術者習知之方法製備。在 本發月實例中’將肽類物質（經沈殿或喷霧乾燥）添加於小 瓶中。將媒劑添加於該小瓶中，並將該等内容物混合直至 句勻在些情況中，需要將此加熱至約4〇°C以確保適當 混合。將配方量化為肽重量/配方重量（以毫克/克表示）。 肽3里係基於色胺酸及酪胺酸吸光度以類似於 方法之方式確疋。簡言之，將約丨毫克肽類物質溶於1毫升 8M胍鹽酸鹽中。評價溶液在276、28〇及288奈米下之 光度。使用該等所量測吸光度值、連通已知樣品重量、樣 品體積、肽中色胺酸及酪胺酸殘基之數量、及肽分子量， 確定固體之肽含量（％ w/w)。 金屬陽離子含量係使用利用4_(2_吡啶基氮雜）間苯二酚 (PAR)(習知與m2+形成2:1錯合物之金屬顯色指示劑）之用途 的UV/vis吸光度分析來確定。簡言之，將約丨毫克固體溶 於1毫升含6M胍HC1之Tris-HCl緩衝液（PH 8)中。將此溶液 稀釋（使用相同緩衝液）以便最終金屬陽離子濃度為丨_ i 〇 μΜ。將50微升0.1 M PAR添加於950微升稀釋溶液中。平 衡後，評價測試溶液於5〇〇奈米下之υν/vis吸光度。基於 線性最小平方分析根據同一天獲得之標準曲線計算金屬陽 離子濃度’並確定樣品之金屬陽離子含量（wtQ/〇)。 藉由LC-MS評價確定血漿中之肽濃度。將血漿樣品用3 體積含0·5%(ν/ν)甲酸之乙腈稀釋，離心並直接分析上清 液。使用梯度溶析（1 0 mM乙酸錢，pH 6.8:乙腈，〇.6毫升/ 130299.doc -80- 200902043 分鐘）實施層析’總運行時間為6分鐘。在由4x2毫米 Phenomenex SecurityGuard C8 保護柱保護之 phenomenex Luna C8(2) 50x2毫米柱上實施分離。在Sciex API4000或 API4000 Qtrap儀器上通常以單-四模式實施質譜分析 (ESI+)，其中檢測…+讯]”或[m+4H]4+離子。自3〇毫微克/ 笔升至3 0微克/毫升構建tri- 11 44之校準曲線。結果報告 為隨時間流逝血漿肽濃度。使用以下縮寫：最大血 漿肽濃度；tma’處於Cmax下之時間；tQi =血漿肽濃度降至 低於0.1微克/毫升之時間；且1()()1係血漿濃度降至低於〇〇1 U克/耄升之標準化時間。在一些情況中，將血漿濃度標 準化成3毫克肽/公斤動物重量以有利於比較。 如下所述對動物投藥。藉助丨6G針將過量含τ 11之組 σ物抽取至1 cc唧筒中。將此針用丨8G或2丨〇針代替，並將 P筒排放至正確劑量。在肩肝骨之間之皮下空間給動物投 藥大既（400克）係以400微升投藥，每一劑量組三隻動 物。獼猴（2.5公斤）係以4〇〇微升或1〇〇〇微升投藥，每組三 隻動物。 使用大 情況中， 比較。 /或猴子收集所有藥物代謝動力學數據。在一些 將血水/辰度標準化成3毫克肽/公斤動物以有利於 製備以下含肽之組合物。 6 2枯六鋅沈搬物A.將™144溶於水中。將阳調節至約 過庹乙^至’辰度為25毫克’毫升。使溶液穿過0.22微米 …將2*升〇」M加〇4添加於8〇毫升丁"44溶液 130299.doc 200902043 中。將所得懸浮液離心’傾析掉上清液，並將沈澱物冷 凍。將沈澱物凍乾並使其穿過200微米的篩。 T1144/辞沈澱物Β·將丁1144溶於水中。將？11調節至約 6.2並添加水至濃度為25毫克/毫升。使溶液穿過o u微米 過濾器。將60毫升0.1 M ZnS04添加於12〇毫升T1144溶液 中。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並將沈澱物冷 東。將沈澱物凍乾並使其穿過2〇〇微米的篩。 Τ1144/辞沈澱物c·將Τ1144溶於水中。將ρΗ調節至約 5.7並添加水至濃度為4〇毫克/毫升。使溶液穿過微米 過濾器。將<100毫克的ZnCl2添加於2〇毫升丁1144溶液中。 將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並用丨毫升水洗滌沈 澱物。將沈澱物冷凍，凍乾並使其穿過2〇〇微米的篩。 TU44/辞沈澱物D.將沈澱物8用5毫升水洗滌，離心並 傾析掉上清液。將此重複兩次以上。將所得沈澱物冷凍’ 凍乾並使其穿過2〇〇微米的篩。 TII44/辞沈澱物Ε·將445毫克ZnS〇4*7H2〇溶於2毫升水 中。1.0克沈澱物D於該鋅溶液中變成漿液。將該漿液冷 凍，凍乾並使其穿過200微米的篩。 T1144沈殿物F•將T1144溶於水中。將卩^^周節至約62 並添加水至濃度為25毫克/毫升。使溶液穿過〇.22微米過濾 器。添加5亳升1 Ν乙酸，使ρΗ降至約5。將所得懸浮液離 、，傾析掉上清液，並將沈殿物冷凍。將沈澱物凍乾並使 其穿過200微米的篩。 TU44/鋅沈澱物G.將230毫克ZnS〇4*7H2〇溶於2毫升水 130299.doc -82- 200902043 中。使500毫克沈澱物F於該鋅溶液中成漿液。將該漿液冷 珠，凍乾並使其穿過200微米的篩。 TUO/辞沈澱物Η·將τη"溶於水中。將pH調節至約 8.4並添加水至濃度為50毫克/毫升。使溶液穿過0.22微米 過濾器。添加甲醇至濃度為25毫克/毫升（5〇:5〇甲醇： 水）將約1毫升0.1 M ZnS〇4添加於20毫升TRI-1 144溶液 中。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並將沈澱物冷 束。將沈澱物凍乾並使其穿過2〇〇微米的筛。 T1144沈殿物I·將TRI_1144溶於水中。將pH調節至約84 並添加水至濃度為50毫克/毫升。使溶液穿過〇22微米過濾 為添加甲醇至濃度為25毫克/毫升（5〇:5〇甲醇：水）。將pH 調節至約5。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並將沈 殿物冷凍。將沈澱物凍乾並使其穿過200微米的篩。 T1144/鋅沈殿物j·將τ 1 1 44溶於水中。將pH調節至約 6.2並添加水至濃度為25毫克/毫升。使溶液穿過〇 22微米 過濾、器。將60毫升0.1 M ZnS04添加於120毫升T1144溶液 中。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並將沈澱物冷 珠。將沈澱物凍乾並使其穿過1 5〇微米篩。
Tll44/鋅沈澱物Κ·將T1144溶於水中。將pH調節至約 6，2並添加水至濃度為2 5毫克/毫升。使溶液穿過〇 2 2微米 過壚杰。將1毫升〇· 1 M ZnS〇4添加於40毫升丁1 144溶液 中。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液，並將沈殿物冷 澡。將沈澱物凍乾並使其穿過1 50微米篩。 T1144/辞沈澱物L.將1.0克沈澱物J用30毫升水洗滌，離 130299.doc -83 · 200902043 〜並傾析掉上清液。重複此步驟。將所得沈殿物冷康，束 乾並使其穿過200微米的篩。 T11W鋅沈殿㈣.將T1144溶於水中。將邱調節至約 6.3 :添加水至濃度為25毫克/毫升。使溶液穿過〇·22微米 過濾'器。將25毫升TU44溶液藉助霧化喷嘴（以類似於喷霧 乾燥的方式)噴霧於50毫升劇烈混合的〇3 Μ加〇4溶液 中。將所得懸浮液離心’傾析掉上清液，並將沈澱物冷 凍。將沈澱物凍乾並使其穿過2〇〇微米的篩。 T1144/鋅沈嫩_.將丁1144溶於水中。將阳調節至約 6.3並添加水至濃度為5〇毫克/毫升。添加甲醇至最終 TH44溶液濃度為25毫克/毫升。使溶液穿過ο”微米過濾 器。將25㈣T1144溶液藉助霧化噴嘴（以類似於喷霧乾燥 的方式）噴霧於50毫升劇烈混合的W M ZnS〇4溶液中。將 所得懸浮液離心並傾析掉上清液。將沈澱物用_升水洗 務三次。將所得懸浮液離心，傾析掉上清液並將沈殿物冷 凍。將沈澱物凍乾並使其穿過2〇〇微米的篩。 表9 :肽類物質組合物 肽類物質 肽含量(％) PPTA 90.6 PPTB 72.5 PPTC 87.7 PPTD 89.3, 87.9 PPTE 70.1 PPTF 88.3 PPTG 71.7 130299.doc 1.6
2.9, 2.4 」0.0
N/A — 7.7 -84- 200902043 PPTH 90.6, 89.7 1.7, 1.9 PPTI 87.7 N/A PPTJ 60.2 11.5 PPTK 88.2 1.7 PPTL 93.7 1.9 PPTM 60.9 12.4 PPTN 92.5 2.1 如下文所述將上述組合物投與給大鼠或猴子。預計在大 鼠或猴子中所獲得之結果與人類結果適當相關。 將沈殺物D以100毫克/克調配於74:11:15 SAIB:PLA3L:NMP 中且在獼猴中以1000微升投用。如圖5中所示，血漿 濃度持續1 2天大於目標值1微克/毫升，超過了目標時間7 天。將沈澱物J以50毫克/克調配於40:60 PLA3L:NMP中並 在獼猴中以400微升投用。如圖5中（一__)所示，血漿濃度 持續7天大於目標值1微克/毫升；較大劑量（例如1 〇〇〇微升 1〇〇毫克/克沈澱物J)可使目標血漿濃度持續10-12天。此表 明T1 144可於SAIB/PLA或PLA媒劑中皮下遞送且持續1週 以上提供超過目標值（即，1微克/毫升）之血漿濃度。 將沈澱物〇以100毫克/克調配於74:11:15 8八18:?1^31^〜1^? 中並在大鼠中以400微升投用。如圖6中所示，血漿 濃度持續6天大於目標值1微克/毫升，接近滿足目標時間7 天的要求。將沈澱物J以50毫克/克調配於40:60 PLA3L:NMP中並在大鼠中以400微升投用。如圖6中 所示，血漿濃度持續7天大於目標值1微克/毫升。此表明 調配物在齧齒類動物及靈長類動物兩個模型中皆提供 130299.doc •85· 200902043 Τ1 1 44之類似持續遞送。 在大鼠中SAIB:PLA比例對藥物代謝動力學曲線的影 響。將沈澱物A以5〇毫克/克調配於SAIB:PLA3M:NMP媒劑 中並在大鼠中以400微升投用。如圖7中所示，降低SAIB:PLA 比例（即’更多？[八），則（^_)(降低’1;财)(增加且1；0.01增加。 亦將沈澱物B以50毫克/克調配於SAIB:PLA3M:NMP媒劑中 並在大鼠中以400微升投用。如圖8及9中所示，結果定性 地類似於沈澱物A所呈現之結果。然而，SAIB :PLA比例對 沈澱物B遞送之影響程度小於其對沈澱物a遞送之影響。 此表明降低SAIB:PLA比例改良T1144之持續遞送，且沈殿 物性質、尤其沈澱物中鋅之量可影響遞送速率。 在大鼠中基質：溶劑比例對藥物代謝動力學曲線的影 饗。將沈澱物B以50毫克/克調配於SAIB:PLA3M:NMP媒劑 中並在大鼠中以4 0 0微升投用。如圖1 〇中所示，約1 〇 %之 PLA含量相對於更低PLA含量可減緩肽遞送。 在大鼠中溶劑類型對藥物代謝動力學曲線的影響。將沈 澱物B以50毫克/克調配於75:5:20 SAIB:PLA3M:溶劑（即， 三醋精、苯甲酸苄基酯或NMP)媒劑中並在大鼠中以4〇〇微 升投用。如圖11中所示，當溶劑類型改變時，CMAX降低， tMAx增加且t〇,G1增加。NMP獲得比三醋精更合意之藥物代 謝動力學性質’其較苯甲酸苄基酯佳。此表明溶劑類型影 響肽遞送。 在大鼠中肽濃度對藥物代謝動力學曲線的影響。將沈殿 物B調配於 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP媒劑中並在大鼠中以 I30299.doc -86- 200902043 400微升投用。結果展示於圖12中，且表明在此媒劑，可 使肽濃度增加而不會不利地影響肽遞送。 在大鼠中注射體積對藥物代謝動力學曲線的影饗。將沈 澱物B以1〇〇毫克/克調配於74:11:15 劑中並在大鼠中投用。如圖13所示，劑量體積對持續遞送 參數無明顯影響；然而，400微升劑量比2〇〇微升劑量稍佳 (所有皆經標準化）。將沈澱物(3調配於77:15:8 SAIB:NMp: /
乙醇媒劑中並在大鼠中投用。如圖13中所示，當控制肽劑 量時在開始3天劑量體積對持續遞送參數無明顯影響；然 而，3天以後400微升劑量比2〇〇微升劑量稍佳。此表明增 加注射體積可促進持續遞送。 在大鼠中SAIB媒劑中PLA類型對藥物代謝動力學曲線的 影響。將沈澱物A以50毫克/克調配於75:5:2〇 SAIB:PLA:NMP媒劑中並在大鼠中以4〇〇微升投用。如圖14 中所示’ PLA類型自几改變至3M，則“η降低，增加 且to.cn增加。此表明plA類型可影響持續遞送。 在大鼠中肽沈澱物形式對藥物代謝動力學曲線的影響。 將沈澱物A、B、E&G分別以5〇毫克/克調配於75:5:2〇 SAIB:PLA3M:NMP媒劑中並在大鼠中以4〇〇微升投用。如 圖1 5中所示，在初始沈澱製程期間增加鋅含量則“η降 低，tMAX增加且tQ(n增加（八及…。將硫酸鋅作為凍乾鹽添 加於低-辞沈殿物中使C μ △ v降供，+ , α 义MAX啤低’ tMAX增加且t〇.〇1增加（A及 E)。當最終沈澱物包含硫酸鋅凍乾鹽卩及G)時，利用鋅代 替PH進行沈澱並不影響持續遞送參數。沈澱物£或〇皆不 I30299.doc -87- 200902043 如於此媒劑中之沈澱物B，即使總鋅含量相似。此表明將 鋅納入該沈澱物之方式（例如，其如何沈澱或噴霧）明顯影 響狀·之持續遞送。 在猴子中聚合物類型及劑量體積對藥物代謝動力學曲線 之影響。將沈澱物D調配於SAIB:PLA:NMP媒劑中並在獼 猴中投用。如圖16中所示，媒劑自75:5:20變至74:11:15 (400微升劑量）並不會明顯影響持續遞送參數；然而，兩者 皆較水溶液為佳。以74:1 1:1 5使劑量體積增加至丨〇〇〇微 升’則CMAX降低，tMAx降低且tG.Q1增加。此表明改變劑量 體積可影響持續遞送。 PLA及PLGA凝膠系統 在大鼠中基質：溶劑比例對藥物代謝動力學曲線的影 饗。將沈澱物A及D分別以50毫克/克調配於PLGA1A:NMP 媒劑中並在大鼠中以400微升投用。如圖1 7中所示，增加 基質：溶劑比例（更多PLGA)，則使CMAX降低，tMAX增加並 增加t〇 〇 ,。此表明聚合物於媒劑中之量影響持續遞送。 在大鼠中聚合物類型對藥物代謝動力學曲線的影響。將 沈澱物A及D分別以50毫克/克調配於聚合物：NMP媒劑中並 在大鼠中以400微升投用。如圖1 7中所示，同時增加聚合 物MW及L:G比例使CMAX降低，tMAX增加且tow增加。將沈 澱物B以50毫克/克調配於聚合物：NMP媒劑中並在大鼠中 以400微升投用。如圖1 8中所示，增加L:G比例使CMAX降 低’ tMAX增加且t〇.C)i增加。增加聚合物MW使CMAX降低， tMAX增加且t〇.(n增加。此表明媒劑中之聚合物類型影響持 130299.doc -88- 200902043 續遞送。 在大鼠中溶劑類型對藥物代謝動力學曲線的影審。將沈 殿物B以5 0毫克/克調配於PLGA 1A:溶劑媒劑中並在大鼠中 以400微升投用。如圖1 8中所示’溶劑自NMP改變至三醋 精僅使to o!增加。此表明該媒劑中之溶劑類型影響持續遞 送。 在大鼠中狀浪度對藥物代謝動力學曲線的影響。將沈殿 物B調配於50:50 PLGA1A:NMP媒劑中並在大鼠中以4〇〇微 升投用。如圖1 9中所示，增加劑量使CMAX降低，tMAX增加 且tow降低（所有皆經標準化）。將沈澱物η調配於4〇:6〇 PLA3L:NMP媒劑中並在大鼠中以400微升投用。如圖19中 所示’增加劑量使CMAX降低，tMAX增加且to』〗降低（所有皆 經標準化）。此表明PLA及PLGA媒劑可提供高劑量肽之持 續遞送。 在大鼠中肽形式（無辞）對藥物代謝動力學曲線的影饗。 將沈澱物I及噴霧乾燥材料以50毫克/克調配於40:60 PL A3 L:NMP媒劑中並在大鼠中以400微升投用。如圖2〇中 所示’改變不含鋅之肽形式不會改變持續遞送參數。此表 明無鋅之肽的物理形式不會明顯影響持續遞送。 在大鼠中肽形式對藥物代謝動力學曲線的影響。將沈殿 物Η、J、K及L以50毫克/克調配於40:60 PLA3L:NMP媒劑 中並在大鼠中以400微升投用。如圖2 1中所示，洗滌該沈 澱物由此降低鋅含量不會改變持續遞送參數（j及L)。經洗 滌沈澱物以明顯不同於未洗滌低-鋅沈澱物（K及L)之方式 130299.doc -89- 200902043 進行。自50:50甲醇··水溶液沈澱使得Cmax降低且Wx增 加。此表明在此媒劑中’與狀一起沈殿之鋅的量不影塑持 續遞送；然而，沈澱肽之溶液明顯影響遞送。 在大鼠中陽離子類型對藥物代謝動力學曲線的影黎。將 許多鈣及鐵沈澱物調配於40:60 PLA3L:NMP媒劑中並在大 鼠中以400微升投用。如圖22中所示，所有調配物皆展示 一些持續遞送’其中鐵調配物較鈣調配物為佳。此表明除 鋅以外其他陽離子沈澱物亦可提供肽之持續遞送。 在猴子中聚合物類型及肽形式對藥物代謝動力學曲線之 影響。將沈澱物調配於聚合物：NMP媒劑中並在網猴中投 用。如圖23中所示’使40:60 PLGA1A:NMP媒劑及沈殿物 A同時變化至40:60 PLA3L:NMP媒劑及沈澱物j使Cmax降 低’ tMAX降低且t〇.(Π增加。此表明聚合物性質（例如，類型 及分子量）及製備肽之方式在持續遞送中很重要。 在大鼠中沈澱方法對藥物代謝動力學曲線的影響 將沈殿物Η、J、Μ及N分別調配於40:60 PLA3L:NMP媒 劑中並在大鼠中以400微升投用。如圖24中所示，標準沈 殿物J及Η分別類似（即’具有相似狀及辞含量）噴霧沈殿物 Μ及Ν。在每一種情況下’噴霧沈澱物展示增加之cMAX& (max。喷霧沈殿物在一週結束時之血漿濃度大於或等於標 準沈灰物之血衆濃度。此表明T霧沈殺物與標準沈丨殿物相 比可提供經改良持續遞送潛能。 已經出於闡釋之目的詳細闡述本發明所提供特定實施例 之前述說明。鑒於該等說明及闡述，熟悉該項技術者可藉 130299.doc -90- 200902043 由應用目前知識容易地改變及/或修改該等實施例用於各 種應用而不背離基本概念；且因此，該等改變及/或修改 意欲涵蓋於隨附請求項之含義及範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1係HIV-l gP4!之示意圖，其展示七肽重複i區域 (HR1)及七肽重複2區域（HR2)，其包括習知白胺酸拉鏈樣 基序INNYTSLI、以及gp41之其他功能區域。出於闡述之 目的且與gpl60(菌株HIV„IB)相比展示對應於HR1及HR2之 實例性天然胺基酸序列、及胺基酸位置編號。 圖2出於闡述而非限制之目的展示包含於Ηπ」卯“之 HR2區域内之天然胺基酸序列（如自各種實驗室菌株所確 定）與臨床分離物的比較，其中所繪示者係胺基酸序列中 的-些變體（例如，多形性），#由單字母胺基酸編碼所 示。出於實例之目的，彼等與頂部分離物序列中之胺基酸 序列INNYTSLI對準之彼等分離物序列對應於Hr2白:2 拉鏈樣基序。 圖3係展示使用涉及3個肽片段组裝之片段縮合途徑合成 具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽seq ID NO:9之示意圖。 圖4係展示使用涉及2個肽片段組裝之片段縮合途徑合成 具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HIV融合抑制劑肽wq ID ΝΟ:9之示意圖。 圖5展示在以下述組合物投與丁丨144後432小時時期内猴 子中T1144血漿濃度之曲線圖：1〇〇〇微升1〇〇毫克/克由 130299.doc -91 - 200902043 乙11804溶液所沈澱丁1144(89%肽）於74:11:15 8八18:?1^3[^]\^ 中之懸浮液及400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(60%肽）於 40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液。 圖6展示在以下述組合物投與T1 1 44後1 68小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：400微升100毫克/克由 Zn S 04 溶液所沈澱 T1 14 4 (8 9% 肽）於 74:11:15 S AIB: PL A3 L: NMP 中之懸浮液及400微升5 0毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 ΤΙ 1 44(60%肽）於40:60 PLA3L:NMP之懸浮液。 圖7展示在以下述組合物投與T1 144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：120Q微升3毫克/毫升T1144 溶液（-）、400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(89%肽，2%鋅）於 80:0:20 SAIB:PLA3M:NMP 中之懸 浮液（__♦__)、400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(890/〇 肽，2% 鋅）於 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP中之懸 浮液（__ — )及400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 1 44(890/〇 肽 ’ 2%鋅）於 65:1 5:20 SAIB:PLA3M:NMP 中之 懸浮液。 圖8展示在以下述組合物投與T1 144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升T1144 溶液（--——）、400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈殿 T1 144(73%肽，2%鋅）於 85:0:15 SAIB:PLA3M:NMP 中之懸 浮液及400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(73%肽，2%鋅）於 74:11:15 SAIB:PLA3M:NMP 中之 懸浮液。 130299.doc •92- 200902043 圖9展示在以下述組合物投與丁1144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升丁 ii44 溶液（ ）、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73%肽 ’ 2%鋅）於 7〇:l〇:2〇 SAIB:PLA3M:NMP 中之 懸浮液及400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 Τ1144(73% 肽 ’ 2% 鋅）於 75:5:2〇 SAIB:PLA3M:NMP 中之费 浮液。 圖10展示在以下述組合物投與T1144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升丁 11料 溶液（ ）、400微升毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱
Tll44(73% 肽 ’ 2% 鋅）於 7〇:i〇:2〇 SAIB:PLA3M:NMP 中之 懸浮液及400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73%肽 ’ 2%鋅）於 74:i1:15 SAIB:pLA3M:NMp 中之 懸浮液（--—)。 圖1 1展示在以下述組合物投與T丨i 44後！ 68小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升丁11料 /谷液（ ）、400微升毫克/克由ZnS〇4溶液所沈殿 T1 144(73% 肽，2%辞）於 75:5:2〇 SAIB:pLA3M:三醋精中之 懸浮液（--♦--)、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 Τ1144(73〇/〇 肽，2% 辞）於 75:5:2〇 SAIB:pLA3M:苯甲醆苄基 酯中之懸洋液及4〇〇微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所 沈澱 T1 144(73%肽，2%鋅）於 75:5:2〇 SAIB:PLA3M:NMP 中 之懸浮液（一▲—)。 圖12展不在以下述組合物投與T1144後168小時時期内大 130299.doc -93· 200902043 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升τιι44 ’合液( )400彳政升5〇毫克/克由ZnS04溶液所沈殿 T1 144(73 /。肽 ’ 2% 鋅）於 75:5:2〇 SAIB:pLA3M:NMp 中之懸 浮液（ — ♦ — )、400微升乃毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73% 肽，2% 鋅）於 75:5:2〇 SAIB:pLA3M:NMp 中之懸 浮液及400微升1〇〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73%肽，2% 鋅）於 75:5:2〇 SAIB:pLA3M:NMp 中之懸 浮液。 圖13展不在以下述組合物投與丁丨丨扣後丨以小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升『no 溶液（ ）、400微升5〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(88% 肽，2%鋅）於 77:15:8 SAIB:NMp:乙醇中之懸浮 液（--♦--)、200微升1〇〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(88% 肽，2%鋅）於 77:15:8 SAIB:NMp:乙醇中之懸浮 液（__一）、400微升1〇〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73%肽 ’ 2% 鋅）於74:11:15 SAIB:pLA3M:NMp 中之 懸浮液及200微升1〇〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(73%肽 ’ 2%鋅）於 74:11:15 SAIB:pLA3M:NMp 中之 懸浮液（--□—)。 圖14展示在以下述組合物投與T1144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升丁丨丨44 溶液（-）、4〇〇微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈滅 T1 144(89%肽，2% 鋅）於 75:5:2〇 SAIB:PLA3L:NMp中之懸 浮液及4〇0微升5〇毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 130299.doc -94- 200902043 T1 144(89o/cJii，2o/(^f)K 75:5:20 SAIB:PLA3M:NMP*i-浮液（--，-)。 圖15展示在以下述組合物投與ΤΙ 144後168小時時期内大 鼠中Τ1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升Τ1144 溶液（--）、400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(730/〇)於 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP中之懸浮液（--♦-)、 400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱T1 144(89%)於 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 中之懸浮液（----)、400微升 50 毫克/克由ZnS04溶液所沈澱（73%)並於ZnS04溶液中成漿之 Τ1144(70ο/〇)於 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 中之懸浮液（--▲--)、 400微升50毫克/克喷霧乾燥（89%)並於ZnS04溶液中成漿之 T1144(66%)於 75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP 中之懸浮液（--〇--)、 400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱（88%)並於ZnS04溶 液中成漿之丁1144(71%)於75:5:20 8八1丑:？1^31^”]一？中之懸浮 液（__笊__)及400微升50毫克/克噴霧乾燥（89%)並於ZnS04溶 液中成漿之T1144(65%)於75:5:20 SAIB:PLA3L:NMP (--X--)中 之懸浮液。 圖16展示在以下述組合物投與T1 144後432小時時期内猴 子中T1144血漿濃度之曲線圖：80Q微升3.5毫克/毫升 T1 144溶液（-）、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所 沈澱T1 144(8 90/o)於 7 5:5:20 SAIB:PLA3M:NMP中之懸浮液 (__♦__)、400微升100毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(89%)於74:ll:15SAIB:PLA3L:NMP中之懸浮液（----)及1000微升100毫克/克由ZnS04溶液所沈澱T1 144(89°/〇) 130299.doc •95- 200902043 於74:11:15 8八18凡八31^職卩中之懸浮液（__14__)。 圖17展不在以下述組合物投與71144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：12〇〇微升3毫克/毫升丁1144 溶液（ ）、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 144(89% 肽，2%鋅）於 4〇:60 PLGA1A:NMp中之懸浮液 (--♦--)、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱T1 144(89% 肽，2°/〇鋅）於60:40 PLGA1A:NMp中之懸浮液（·_〜）及4〇〇 微升50*克/克由ZnS〇4溶液所沈澱T1 144(88%肽，2%鋅） 於40:60 PLA3L:NMP中之懸浮液（一▲__)。 圖18展示在以下述組合物投與T1 144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升T1144 /合液（ ）、4〇〇微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 Τ1 144(73% 肽，2%鋅）於 50:50 PLGA1A:NMP中之懸浮液 、4〇〇微升5〇毫克/克由ZnS04溶液所沈澱T1 144(73% 肽’ 2%鋅）於40:60 PLGA1A:三醋精中之懸浮液 400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱η 144(73%肽，2% 鋅）於40:60 PLGA3A:NMP中之懸浮液（__▲—)及4〇〇微升5〇 毫克/克由ZnS04溶液所沈澱τι 144(73%肽，2%鋅）於40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液。 圖19展示在以下述組合物投與τι 144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升τ1144 溶液（-）、4⑽微升5〇毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(73〇/〇 肽 ’ 2°/。鋅）於 50:50 PLGA1A:NMP 中之懸浮液 (--♦ — )、400微升1〇〇毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 130299.doc -96- 200902043 T1 144(73〇/〇 肽，2%鋅）於 50:50 PLGA1A:NMP 中之懸浮液 (----)、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈殿t1144(91% 肽 ’ 20/。辞）於 40:60 PLA3L:NMP中之懸浮液（―◊__)、4〇〇 微 升100毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱T1 144(91%肽，2%鋅）於 40:60 PLA3L:NMP中之懸浮液及4〇〇微升200毫克/克 由ZnS04溶液所沈澱T1 144(90%肽，2°/。鋅）於40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液。 圖20展示在以下述組合物投與τ 1 1 44後1 68小時時期内大 执中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升T1144 溶液（ ）、400微升50毫克/克藉由噴霧乾燥所製得 T1 144於 40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液及 4〇〇微升 50 毫克/克pH沈澱於MeOH中之T1 144 (88%肽）於40:60 PLA3L:NMP中之懸浮液。 圖2 1展示在以下述組合物投與Τ1 1 44後1 68小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升T1144 溶液（-）、400微升50毫克/克由ZnS04溶液所沈澱 T1 144(60%)於40:60 PLA3L:NMP中之懸浮液（--♦--)、4〇〇微 升50毫克/克經洗滌T1 144 (94%)於40:60 PLA3L:NMP中之 懸浮液（----)、400微升50毫克/克由ZnS〇4溶液所沈澱 T1 1 44(8 8%)於 40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液及 400 微升50毫克/克自MeOH/H20所沈澱T1 144 (91%)於40:6〇 PLA3L:NMP 中之懸浮液。 圖22展示在以下述組合物投與T1 144後168小時時期内大 鼠中T1144血漿濃度之曲線圖：1200微升3毫克/毫升T1i44 130299.doc -97- 200902043 溶液（-）、400微升50毫克/克由CaCh溶液所沈凝 T1 144 (29%)於 40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液 微升50毫克/克由CaCh溶液所沈澱丁1 144(53%)於4〇.6〇 PL A3 L:NMP中之懸浮液400微升50毫克/克由 FeS04溶液所沈澱 T1 144(88%)於 40:60 PLA3L:NMP 中之辯 浮液及400微升50毫克/克由Fes〇4溶液所沈殿 T11 44(91%)於 40:60 PLA3L:NMP 中之懸浮液。 圖23展示在以下述組合物投與τι 144後432小時時期内猴 子中T1144血漿濃度之曲線圖：8〇()微升3.5毫克/毫升 丁1144溶液（-）' 400微升5〇毫克/克由鋅溶液所沈澱 T1 144 (89%)於 40:60 PLGA1A:NMP 中之懸浮液及 4〇〇 微升50毫克/克由鋅溶液所沈澱T1144(6〇%肽）於 PLA3L:NMP中之懸浮液—。 圖24展示在以下述組合物投與丁1144後168小時時期内猴 子中T1144血漿濃度之曲線圖：12㈧微升3毫克/毫升的 ΤΊ144溶液（-)、400微升沈澱物η於4〇:6〇 PLA3L:NMP中之懸浮液（一□一）、4〇〇微升沈澱物】於4〇:6〇 PL A3 L:NMP中之懸浮液（__◊__)、4〇〇微升沈澱物河於4〇:6〇 PLA3L:NMP中之懸浮液及4〇〇微升沈澱物4〇:6〇 PL A3 L:NMP中之懸浮液。 130299.doc -98- 200902043 序列表 <110>美商特雷米爾思公司 <120>用於遞送抗病毒肽療劑之新穎調配物 <130> app based on 60/921,704 <140> 097112437 <141> 2008-04-03 <150〉60/921,704 <151> 2007-04-03 <160> 56 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 64 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>合成 <400> 1
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Leu Leu Glu Leu 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 合成 <400> 5
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu lie Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 i <210> 6 \. <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220> <223〉合成 <400> 6
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu lie Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 7 <211> 38 130299-序列表,doc 200902043 <212> PRT <213>人工 <220> λ , <223>合成 <400〉 7
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu ile Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210〉 8 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <400〉 8
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 9 <211> 38 <212〉 PRT <213>人工 <220> x , <223>合成 <400> 9
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15
Ile Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 10 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 10
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 130299-序列表.doc 200902043 5 10 15 lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220〉… <223>合成 <400〉 11
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu He Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin G)u Lys Leu Glu f 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 12 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 12
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu lie Arg Ala He Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220> A , <223>合成 <400> 13
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu lie Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys lie Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 4- 130299-序列表.doc 200902043
<210〉 14 <211> 38 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 14
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala lie Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 15 <211> 38 <212> PR丁 <213>人工 <220〉 <223>合成 <400> 15
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 15 10 15 lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys lie Glu 20 25 30
Ala Ala Leu Arg Glu Leu 35 <210> 16 <211> 38 <232> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <220> <221> misc一feature <222> ¢1)..(3) <223> 一個以上的可能胺基酸 <220> <221> misc一feature <222> (6)..(6) <223> 一個以上的可能胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (10)..(10) <223>白胺酸或異白胺酸 <220> <221> misc„feature <m> f 13)..(13) <223> —個以上的可能胺基酸 130299-序列表.doc 200902043 <220> <221> misc feature <222> Π7Γ ΠΊ\ <223>白胺酸或異白胺酸 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223>白胺酸或異白胺酸 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223>較佳爲白胺酸或異白胺酸，或可爲一個以上的可能胺基酸 <220> <221> mi sc^feature <222> (25)..(25) <223> 一個以上的可能胺基酸 <220> <221> misc^feature <222> (27)..(28) <223> —個以上的可能胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> 一個以上的可能胺基酸，較佳爲白胺酸或異白胺酸 <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223>白胺酸或異白胺酸 <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223>白胺酸或異白胺酸 <400> 16
Xaa Xaa Xaa Glu Ala Xaa Asp Arg Ala Xaa Ala Glu Xaa Ala Ala Arg 15 10 15
Xaa Glu Ala Xaa Xaa Arg Ala Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Glu Lys Xaa Glu 20 25 30
Ala Ala Xaa Arg Glu Xaa 35 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 17
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212〉 PRT <213〉人工 -6- 130299-序列表.doc 200902043 <220> A , <223>合成 <400> 18 丁yr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 19
Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213>人工 <220> A „ <223>合成 <400> 20
Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu ^rg Glu Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 合成 <400〉 21
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213>人工 <220> •合成 <400> 22
Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu 15 10 15 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213>人工 <220> A , <223〉合成 <400> 23 130299-序列表.doc 200902043 丁hr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie 1 5 10 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213>人工
<220> A <223>合成 <400〉 24
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu 15 10 15 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213>人工 <220> .,, <223〉合成 <400> 25
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213>人工 您合成 <400> 26 lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin 15 10 15
Glu <210〉 27 <211> 8 <212> PRT <213>人工 <220〉 <223> 合成 <400〉 27
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213>人工 <220> A , <223>合成 <400> 28
Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu 130299-序列表.doc 200902043 15 10 15
Gin Glu <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 29
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala kig 1 5 10 15 lie Glu Ala Leu 20 <210> <211> <212> <213> 30 17 PRT 人工 <220> <223> 合成 <400> 30
Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg 15 10 15
Glu <210> 31 <211〉 18 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 31
Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg 15 10 15
Glu Leu <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>合成 <400> 32
Thr Thr Trp Glu Ala Trp Asp Arg Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg 1 5 10 15 9- 130299-序列表.doc 200902043 lie GIu
<210> 33 <211> 19 <212〉 PRT 人工 艺忿合成 <400> 33
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala 15 10 15
Leu Arg Glu <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213>人工 <220> •合成 <400> 34
Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala 15 10 15
Leu Arg Glu Leu 20 <210> 35 <211> 26 <212> PRT <213>人工 <400> 35
Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin Gin 15 10 15
Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210> 36 <211> 27 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 36
Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu Gin 15 10 15
Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 10- 130299·序列表.doc 200902043 <210〉 37 <211> 28 <212> PRT <2]3>人工 <400> 37
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu 1 5 10 15
Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 38 lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin 15 10 15
Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210> 39 <211> 30 <212> PRT <213〉人工 <220> . <223>合成 <400> 39
Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu 15 10 15
Gin Glu Gin Gin Glu Lys Asn Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 <210> 40 <211> 26 <212> PRT <213>人工 <220> A 、 <223〉合成 <400> 40
Thr Thr Trp Glu Ala 丁rp Asp Arg A】a lie Ala Glu Tyr A】a A!a Arg 15 10 15
He Glu Ala Leu Leu Arg Ala Leu Gin Glu 20 25 <210> 41 <211> 14 -11 - 130299·序列表.doc 200902043 <212〉PR 丁 <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 41
Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu 1 5 10
<210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> AX <220> <223> 合成 <400> 42
Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213〉人工 <220> <223> 合成 <400> 43
Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 1 5 10 <210> 44 <2]1> 】5 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 44
Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu 15 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 45
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu 15 10 15 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213>人工 <220> x <223>合成 -12- 130299-序列表.doc 200902043 <400> 46 lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg He Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin 15 10 15 GJu <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213>人工 <220> <223〉 合成 <400> 47
Ala He Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala 15 10 15
Gin Glu i <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213〉人工 <220> <223>合成 <400> 48
Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg 15 10 15
Glu <210> 49 <2U> 19 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 49
Leu Arg Ala Ala Leu Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu 15 10 15
Arg Glu Leu <2]〇> 50 <211> 19 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成 <400> 50 -13 - 130299-序列表.doc 200902043
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala 15 10 15
Leu Arg Glu <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213〉人工 <220> Λ , <223>合成 <400> 51
Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala 15 10 15
Leu Arg Glu Leu 20 <210> 52 <211> 26 <212> PRT <2i3>人工 <22C)>人上 <223〉合成 <400> 52
Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin Gin 15 10 15
Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210> 53 <21]> 27 <212> PRT <213>人工 <220> A , <223〉合成 <400> 53
Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu Gin 15 10 15
Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213>人工 合成 <400> 54
Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin Glu 15 10 15 14. 130299-序列表.doc 200902043
Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 <210〉 55 <211> 29 <212> PRT <213>人工 <220> … <223>合成 <400> 55 lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala Gin 15 10 15
Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 ί \ <210> 56 <2H> 30 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 合成 <400> 56
Ala lie Ala Glu Tyr Ala Ala Arg lie Glu Ala Leu Leu Arg Ala Ala 15 10 15
Gin Glu Gin Gin Glu Lys Leu Glu Ala Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 130299·序列表.doc -15 -

Claims (1)

  1. 200902043 十、申請專利範圍： 1. 一種組合物，其包含溶劑、膠凝材料及生物活性分子， 其中當投與患者時，該組合物會形成基質，且在投與12 小時内會提供该生物活性分子至少10微克/毫升之， 隨後以至少1微克/毫升之血漿含量持續釋放至少7天。 2. —種組合物，其包含溶劑、膠凝材料及選自T2〇、 Τ1249、Τ897、Τ2635、Τ999 和 TU44、或其組合之肽。 3. 如請求項2之組合物，其中該溶劑為NMp。 4. 如請求項2之組合物，其中該膠凝材料係SAIB。 5. 如請求項2之組合物，其中該膠凝材料係pLA、pL〇、 PLGA或PLGA-葡萄糖。 6，如請求項2之組合物，其中該膠凝材料係以介於3〇_85% 重量比之間之量存在。 士明求項2之組合物，其中該膠凝材料係以介於 重量比之間之量存在。 8·如請求項2之組合物，其中該膠凝材料係以介於約3〇_ 7〇%重量比之間之量存在。 9.如請求項2之組合物’其中該膠凝材料係以介於約6〇_ 85%重量比之間之量存在。 如請求項2之組合物’其中該膠凝材料係以介於約… 85%重量比之間之量存在。 11’如。月求項2之組合物，其中該膠凝材料係以介於約乃_ 85%重量比之間之量存在。 月长項2之組合物，其中該肽係τ】玉44。 130299.doc 200902043 1 3 ·如請求項2之組合物’其在投與1 2小時内提供該生物活 性分子至少10微克/毫升之Cmax，隨後以至少1微克/毫升 之血漿含量持續釋放至少7天。 1 4·如請求項2之組合物，其中該組合物進一步包含至少一 種其他生物活性分子。 1 5 .如請求項丨4之組合物’其中該其他生物活性分子係抗病 毒劑。 1 6.如請求項i 5之組合物，其中該抗病毒劑係肽。 1 7.如凊求項1 5之組合物，其中該抗病毒劑係細胞因子。 18. 如請求項15之組合物，其中該抗病毒劑係逆轉錄酶抑制 劑。 19. 如請求項15之組合物，其中該抗病毒劑係病毒mRNA封 帽抑制劑。 2〇_如請求項2之組合物，其中該膠凝材料係兩或多種選自 PLA、PLG、PLGA或PLGA_葡萄糖之材料之混合物。 21 ·如印求項2之組合物，其中该肽係溶於該溶劑及膠凝材 料中。 22. 如％求項2之組合物，其中该肽係懸浮於該溶劑及膠凝 材料中。 23. 如印求項22之組合物，其中該經懸浮肽呈喷霧乾燥形 式。 24. 如請求項23之組合物，其中該經懸浮肽係呈含鹽之噴霧 乾燥形式。 25. 如請求項24之組合物，其中該經懸浮肽呈含鋅之噴霧乾 130299.doc 200902043 燥形式。 2 6 ·如請求項2 4之組合物，其中該經懸浮肽呈含妈之噴霧乾 燥形式。 27. 如請求項22之組合物’其中該經懸浮肽呈經沈殺形式。 28. 如請求項27之組合物’其中該經懸浮肽呈含鹽之經沈澱 形式。 29·如請求項28之組合物’其中該經懸浮肽呈含鋅之經沈澱 形式。 3 0 _如請求項2 8之組合物，其中該經懸浮肽呈含妈之經沈殿 形式。 3 1.如請求項2 8之組合物，其中該經懸浮肽呈含鐵之經沈澱 形式。 3 2. —種在患者中持續釋放肽之方法，該方法包含向該患者 投與組合物，該組合物包含溶劑、膠凝材料及選自 丁20、T1249、T897、T2635、T999 及 丁1 144、或其組合 之肽。 33·如請求項32之方法’其中該組合物係藉由皮下注射投 與。 34.如請求項32之方法，其中該溶劑為NMp。 35_如4求項32之方法，其中該膠凝材料係SaIB。 36. 如請求項32之方法，其中該膠凝材料係pLA、pLG、 PLGA或PLGA-葡萄糖。 37. 如請求項32之方法’其中該肽係T1144。 38. 一種舒緩與HIV感染相關症狀之方法，該方法包含向 130299.doc 200902043 HIV感染患者投與組合物’該組合物包含溶劑、膠凝材 料 及 選自 T20 、 Τ124ί 或 其 組合之肽。 39. 如 請 求項3 8之方法， 與 〇 40. 如 請 求項3 8之方法， 41 . 如 請 求項3 8之方法， 42. 如 請 求項3 8之方法， PLGA或PLGA_葡萄糖 43. 如 請 求項3 8之方法， 44. 如 請 求項3 8之方法， 其 他 生物活性分子。 45. 如 請 求項44之方法， 劑 〇 其中該組合物係藉由皮下注射投 其中該溶劑為NMP。 其中該膠凝材料係SAIB。 種 其中該其他生物活性分子係抗病毒 * \ 46.如請求項44之方法 47_如請求項44之方法 48.如請求項44之方法 劑。 其中该抗病毒劑係肽。 其中s亥抗病毒劑係細胞因子。 其中該抗病毒劑係逆轉錄酶之抑制 49.如請求項44之方法 抑制劑。 其中該抗病毒劑係病毒mRNA封帽 130299.doc
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