JP2021533781A - アプタマーバーコーディング - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2018年8月17日に出願された米国特許仮出願第62/719,406号の利益を主張するものである。この関連出願の内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2019年8月2日に作成されたサイズが4キロバイトのSequenceListingという名称のファイルとして提供されている。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々を、それぞれ、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、複数の試料の各々は、各々が1つまたは複数の細胞成分標的を含む1つまたは複数の細胞を含み、試料インデックス付与組成物は、アプタマーおよび試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含むアプタマー組成物を含み、アプタマーは、1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと;および複数の試料インデックス付与組成物の少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、1つまたは複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞の試料起源を識別することを含む。一部の実施形態では、細胞成分標的は、タンパク質標的を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの細胞の試料起源の識別は、複数のバーコードを使用して複数の試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および配列決定データ中の複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、細胞の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随していてもよい。複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーは、第1の担体に付着されていてもよい。アプタマーは、第1の担体に共有結合で付着されていてもよい。アプタマーは、第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。アプタマーは、第1の担体に非共有結合で連結されていてもよい。アプタマーは、リンカーを介して第1の担体に付随していてもよい。アプタマーは、第1の担体上に固定化されてもよく、第1の担体上に部分的に固定化されていてもよく、第1の担体内に固定化されていてもよく、第1の担体内に部分的に固定化されていてもよく、第1の担体内に封入されていてもよく、第1の担体内に部分的に封入されていてもよく、第1の担体内に埋め込まれていてもよく、第1の担体内に部分的に埋め込まれていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、本方法は、アプタマーを第1の担体から解離させることを含む。解離は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングした後で生じてもよい。解離は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングする前に生じてもよい。
一部の実施形態では、本方法は、複数の試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去することを含む。未結合試料インデックス付与組成物の除去は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を洗浄緩衝液で洗浄することを含んでいてもよい。未結合試料インデックス付与組成物の除去は、フローサイトメトリーを使用して、少なくとも1つのアプタマーに結合している細胞を選択することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を溶解することを含む。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、1つもしくは複数の細胞のいずれのゲノム配列とも相同性ではないか、種のゲノム配列と相同性であるか、またはそれらの組合せである。種は、非哺乳動物種であってもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された(または捕捉、ハイブリダイズ、もしくは結合することが可能な)捕捉配列に相補的な配列を含む。バーコードは、捕捉配列を含む標的結合性領域を含んでいてもよい。標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい。捕捉配列に相補的な試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコードのうちのバーコードは、標的結合性領域および分子標識配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードの分子標識配列は、異なる分子標識配列を含む。バーコードは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコードは、粒子に付随している。複数のバーコードのうちの少なくとも1つのバーコードは、粒子上に固定化されていてもよく、粒子上に部分的に固定化されていてもよく、粒子内に封入されていてもよく、粒子内に部分的に封入されていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。粒子は、破壊可能であってもよい。粒子は、ビーズを含んでいてもよい。粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴ(dT)コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、ヒドロゲルビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはそれらの任意の組合せを含んでいてもよく、または粒子は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。粒子は、破壊可能なヒドロゲルビーズを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること;および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
一部の実施形態では、単一ポリヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよび細胞成分結合性アプタマーを含む。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの5’側にあってもよい。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの3’側にあってもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随している。複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随していてもよい。一部の実施形態では、アプタマー組成物は、第1の担体に付随している。
一部の実施形態では、アプタマー組成物は、1つもしくは複数のタンパク質標的または1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能な第2の細胞成分結合性アプタマー、および第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含む。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。細胞成分結合性アプタマーは第1の担体に付随していてもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付着されている。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に共有結合で付着されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に非共有結合で連結されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、リンカーを介して第1の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体上に固定化されているか、第1の担体上に部分的に固定化されているか、第1の担体内に固定化されているか、第1の担体内に部分的に固定化されているか、第1の担体内に封入されているか、第1の担体内に部分的に封入されているか、第1の担体内に埋め込まれているか、第1の担体内に部分的に埋め込まれているか、またはそれらの組合せである。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された(または捕捉、ハイブリダイズ、もしくは結合することが可能な)捕捉配列に相補的な配列を含む。標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい。捕捉配列に相補的な試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ポリ(dA)領域、またはそれらの組合せを含む。分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第2の細胞成分結合性アプタマーを含み、第2の細胞成分結合性アプタマーは、1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である。
細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、1つまたは複数の細胞成分標的の同じ細胞成分標的に結合することが可能であってもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーには、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していなくてもよい。第2の細胞成分結合性アプタマーには、第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していてもよい。試料インデックス付与配列および第2の試料インデックス付与配列は同一であってもよい。試料インデックス付与配列および第2の試料インデックス付与配列は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、複数のタンパク質結合性アプタマーは、第2のタンパク質結合性アプタマーを含むか、または複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む。アプタマーおよび第2のアプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。アプタマーは、第1の担体に付随していてもよく、第2のアプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは、配列が少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一であってもよい。アプタマーおよび第2のタンパク質結合性アプタマーは同一であってもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは異なっていてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーおよび第2のアプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である。アプタマーおよび第2のアプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、複数のアプタマーを複数の細胞と接触させることは、アプタマーを含む第1の担体を、複数のタンパク質標的を含む複数の細胞のうちの細胞と接触させることを含む。第1の担体は、細胞へと内部移行されてもよい。第1の担体は、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行されてもよい。第1の担体は、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行されてもよい。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーが、複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの少なくとも1つと接触すると、ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する。第1のコンフォメーションのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域は、ヘアピン構造を構成してもよい。ヘアピン構造を伴うポリ(dA)領域は、バーコードの標的結合性領域のポリ(dT)領域に接近可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域とオリゴヌクレオチドプローブのポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションによりアプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされることができる。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含む。分子標識配列は2〜20ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは5〜50ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーは相補配列を含む。複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーは、互いにハイブリダイズして凝集体を形成する場合がある。凝集体は、細胞での分解の標的とされてもよい。
一部の実施形態では、複数の細胞の分配は、複数のアプタマーが付随している複数の細胞およびバーコーディング粒子を含む複数のバーコーディング粒子を複数の区画に分配することを含み、複数の区画のうちの区画は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートアプタマーおよびバーコーディング粒子が付随している複数の細胞に由来する単一細胞を含む。一部の実施形態では、区画は、ウェルまたは液滴である。一部の実施形態では、複数の標識化核酸またはそれらの一部の配列決定情報を得ることは、標識化核酸を1つまたは複数の反応に供して、核酸配列決定のための1セットの核酸を生成することを含む。
一部の実施形態では、複数のタンパク質標的は、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞は、T細胞、B細胞、腫瘍細胞、骨髄性細胞、血液細胞、正常細胞、胎児細胞、母体細胞、またはそれらの混合物を含む。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、単一ポリヌクレオチドを形成する。細胞成分結合性アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいてアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの5’側にあってもよい。細胞成分結合性アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいてアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの3’側にあってもよい。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。細胞成分結合性アプタマーは第1の担体に付随していてもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付着されている。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に共有結合で付着されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に非共有結合で連結されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、リンカーを介して第1の担体に付随していてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体上に固定化されていてもよく、第1の担体上に部分的に固定化されていてもよく、第1の担体内に固定化されていてもよく、第1の担体内に部分的に固定化されていてもよく、第1の担体内に封入されていてもよく、第1の担体内に部分的に封入されていてもよく、第1の担体内に埋め込まれていてもよく、第1の担体内に部分的に埋め込まれていてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーが、複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの少なくとも1つと接触すると、ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する。第1のコンフォメーションのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域は、ヘアピン構造を構成してもよい。ヘアピン構造を伴うポリ(dA)領域は、バーコードの標的結合性領域のポリ(dT)領域に接近可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域とオリゴヌクレオチドプローブのポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションによりアプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされることができる。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含んでいてもよい。分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーは相補配列を含む。アプタマーは、互いにハイブリダイズして(またはハイブリダイズすることを可能にして)凝集体を形成するように構成されてもよい。凝集体は、細胞での分解の標的とされてもよい。
本明細書で参照されているすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、ならびにGenBankおよび他のデータベースの配列は、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的のため、以下の用語を下記にて定義する。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率論的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合性領域を含むポリヌクレオチド配列を指すことができる。確率論的バーコードは、確率論的バーコーディングのために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい。確率論的バーコードは、試料内の標的を定量化するために使用することができる。確率論的バーコードは、標識が標的に付随した後で生じ得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率論的バーコードは、増幅エラーまたは配列決定エラーを評価するために使用することができる。標的に付随している確率論的バーコードは、確率論的バーコード−標的または確率論的バーコード−タグ−標的と呼ばれる場合がある。
ここで使用される場合、「標的」という用語は、バーコード(例えば、確率論的バーコード)を付随させることができる組成物を指すことができる。本開示の方法、デバイス、および系による分析のための例示的で好適な標的としては、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、マイクロRNA、およびtRNAなどが挙げられる。標的は、一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、標的は脂質である。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と同義的に使用することができる。
確率論的バーコーディングなどのバーコーディングは、例えば、米国特許出願公開第20150299784号明細書、国際公開第2015031691号パンフレット、およびFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31; 108(22):9026-31に記載されており、こうした刊行物の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるバーコードは、標的を確率論的に標識(例えば、バーコード、タグ)するために使用することができるポリヌクレオチド配列であってもよい確率論的バーコードであってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、もしくは約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、またはこうした値の任意の2つの間の数値もしくは範囲であり得る場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。標的は、同一のまたはほぼ同一の配列を有するmRNA分子を含むmRNA種であってもよい。バーコードは、確率論的バーコードの異なるバーコード配列の数および標識されることになる標的のいずれかの出現数の比が、少なくとも1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、もしくは100:1であるか、または最大で1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、もしくは100:1である場合、確率論的バーコードと呼ぶことができる。確率論的バーコードのバーコード配列は、分子標識と呼ばれる場合がある。
バーコードは、1つまたは複数のユニバーサル標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、1つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に付着されているバーコードのセット内のすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、1つまたは複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに付着されているすべてのバーコードで同じであってもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードの配列決定に使用することができる。配列決定プライマー(例えば、ユニバーサル配列決定プライマー)は、ハイスループット配列決定プラットフォームに付随する配列決定プライマーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、PCRプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、配列決定プライマーおよびPCRプライマーにハイブリダイズすることが可能な核酸配列を含んでいてもよい。配列決定プライマーまたはPCRプライマーにハイブリダイズすることが可能なユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と呼ばれる場合がある。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始するために使用することできる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長に使用することができる配列を含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、もしくは約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはこうした値の任意の2つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約10個のヌクレオチドを含んでいてもよい。ユニバーサル標識は、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、もしくは300ヌクレオチド長であってもよく、または最大で1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、もしくは300ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、切断可能なリンカーまたは修飾ヌクレオチドは、バーコードが支持体から切断されることが可能になるようにユニバーサル標識配列の一部であってもよい。
バーコードは、1つまたは複数のディメンション標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ディメンション標識は、標識付与(例えば、確率論的標識付与)が生じたディメンションに関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。例えば、ディメンション標識は、標的がバーコード化された時点に関する情報を提供することができる。ディメンション標識は、試料内のバーコーディング(例えば、確率論的バーコーディング)の時点に関連付けられていてもよい。ディメンション標識は、標識付与の時点で活性化されることができる。異なるディメンション標識を異なる時点で活性化することができる。ディメンション標識は、標的、標的のグループ、および/または試料がバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞の集団を、細胞周期のG0期にてバーコード化することができる。細胞を、細胞周期のG1期にてバーコード(例えば、確率論的バーコード)で再度パルスすることができる。細胞を、細胞周期のS期などにてバーコードで再度パルスすることができる。各パルス(例えば、細胞周期の各期)におけるバーコードは、異なるディメンション標識を含むことができる。このように、ディメンション標識は、細胞周期のどの期でどの標的が標識化されたかに関する情報を提供する。ディメンション標識により、多数の異なる生物学的時点を調査することができる。例示的な生物学的時点としては、これらに限定されないが、細胞周期、転写(例えば、転写開始)、および転写物分解を挙げることができる。別の例では、試料(例えば、細胞、細胞の集団)は、薬物および/または療法による治療前および/または治療後に標識することができる。別個の標的のコピー数の変化は、薬物および/または療法に対する試料の応答を示すことができる。
バーコードは、1つまたは複数の空間標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードが付随している標的分子の空間的方向性に関する情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。空間標識は、試料の座標に関連付けられてもよい。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基材を基準にして固定されていてもよい。空間標識は、二次元または三次元グリッドを基準していてもよい。座標は、目印を基準にして固定されていてもよい。目印は、空間にて識別可能であってもよい。目印は、画像化することができる構造であってもよい。目印は、生物学的構造、例えば、解剖学的目印であってもよい。目印は、細胞性の目印、例えば細胞小器官であってもよい。目印は、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光物質、放射能、または固有のサイズもしくは形状などの識別可能な識別子を有する構造などの非天然の目印であってもよい。空間標識は、物理的な区画(例えば、ウェル、容器、または液滴)に関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、空間における1つまたは複数の位置をコード化するために、複数の空間標識が一緒に使用される。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の細胞標識を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源とするかを決定するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体(例えば、ビーズ)に付着されているすべてのバーコードで同一であるが、異なる固体支持体(例えば、ビーズ)毎に異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、100%、もしくは約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、100%、またはこうした値の任意の2つの間の数値もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の、同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、もしくは100%であってもよく、または約60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、もしくは100%であってもよい。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも60%が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。別の例として、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも95%が、同じ細胞標識を含んでいてもよい。
バーコードは、1つまたは複数のバーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。バーコード配列は、バーコード(例えば、標的結合性領域)にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する(例えば、大まかな近似値を提供する)核酸配列を含んでいてもよい。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の分子標識を含んでいてもよい。分子標識は、バーコード配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、分子標識は、バーコードにハイブリダイズした特定のタイプの標的核酸種を識別するための情報を提供する核酸配列を含んでいてもよい。分子標的は、バーコード(例えば、標的結合性領域)にハイブリダイズした標的核酸種の具体的な出現の計数手段を提供する核酸配列を含んでいてもよい。
バーコードは、捕捉プローブなど、1つまたは複数の標的結合性領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、目的の標的とハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、標的結合性領域は、標的(例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析しようとする細胞性核酸)に、例えば特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、特定の標的核酸の特定の位置に付着する(例えば、ハイブリダイズする)ことができる核酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、標的結合性領域は、制限酵素部位突出(例えば、EcoRI粘着末端突出)に対する特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含んでいてもよい。次いで、バーコードは、制限部位突出に相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートすることができる。
確率論的バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、バーコードを方向付ける(例えば、アラインさせる)ために使用することができる1つまたは複数の方向付け特性を含んでいてもよい。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含んでいてもよい。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を構成することができる。こうしたバーコードが試料に導入されている場合、バーコードを既知の方向へと方向付けるために、試料を等電点電気泳動にかけることができる。このように、方向付け特性を使用すると、試料内のバーコードの既知マップを作成することができる。例示的な方向付け特性としては、電気泳動移動度(例えば、バーコードのサイズに基づく)、等電点、スピン、導電率、および/または自己組織化を挙げることができる。例えば、自己組織化の方向付け特性を有するバーコードは、活性化されると特定の方向(例えば、核酸ナノ構造)へと自己組織化することができる。
バーコード(例えば、確率論的バーコード)は、1つまたは複数の親和性特性を含んでいてもよい。例えば、空間標識は、親和性特性を含んでいてもよい。親和性特性は、バーコードと別の実体(例えば、細胞受容体)との結合を容易にすることができる化学的および/または生物学的部分を含んでいてもよい。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分(例えば、受容体)に対して特異的な抗体を含んでいてもよい。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞タイプまたは分子へと導くことができる。特定の細胞タイプにあるおよび/または付近にある標的を標識する(例えば、確率論的に標識する)ことができる。抗体はバーコードを特定の位置に導くことができるため、一部の実施形態では、親和性特性は、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、ヒト化またはキメラ化されていてもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体断片は、例えば、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、およびsFvなどの抗体の一部であってもよい。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体により認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、ならびに軽鎖可変領域および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)などの、抗体の可変領域からなる単離断片を含むことができる。例示的な抗体としては、これらに限定されないが、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体(CD8、CD34、CD45)に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができる。
バーコードは、1つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。例えば、遺伝子特異的確率論的バーコードなどの遺伝子特異的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルであるヌクレオチド配列を指すことができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 27、28、29、30ヌクレオチド長、もしくは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 27、28、29、30ヌクレオチド長、またはこれらのうちの任意の2つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長であってもよく、または最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルアダプタープライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよい。
バーコードが、1つよりも多くのタイプの標識を含む場合(例えば、1つの分子標識などの、1つよりも多くの細胞標識または1つよりも多くのバーコード配列)、標識は、リンカー標識配列で分散されていてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。リンカー標識配列は、最大で約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。一部の場合では、リンカー標識配列は、12ヌクレオチド長である。リンカー標識配列を使用して、バーコードの合成を容易にすることができる。リンカー標識は、エラー訂正(例えば、ハミング)コードを含んでいてもよい。
本明細書で開示される確率論的バーコードなどのバーコードは、一部の実施形態では、固体支持体に付随していてもよい。固体支持体は、例えば、合成粒子であってもよい。一部の実施形態では、固体支持体上の複数のバーコード(例えば、第1の複数のバーコード)の確率論的バーコード(例えば、第1のバーコード配列)の分子標識などの、バーコード配列の一部またはすべては、少なくとも1つのヌクレオチドが異なる。同じ個体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであってもよい。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも1つのヌクレオチドが異なっていてもよい。例えば、第1の固体支持体上の第1の複数のバーコードの第1の細胞標識は同じ配列を有してもよく、第2の固体支持体上の第2の複数のバーコードの第2の細胞標識は同じ配列を有してもよい。第1の固体支持体上の第1の複数のバーコードの第1の細胞標識および第2の固体支持体上の第2の複数のバーコードの第2の細胞標識は、少なくとも1つのヌクレオチドが異なっていてもよい。細胞標識は、例えば、約5〜20ヌクレオチド長であってもよい。バーコード配列は、例えば、約5〜20ヌクレオチド長であってもよい。合成粒子は、例えば、ビーズであってもよい。
また、生物学的刺激を使用して、ビーズの破壊、溶解、または分解を誘発することができる。一般に、生物学的誘発因子は、化学的誘発因子に類似するが、多数の例では、生体分子、または酵素、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、および核酸など、生体系に一般的に見出される分子が使用される。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる切断に感受性であるペプチド架橋連結を有するポリマーを含んでいてもよい。より具体的には、一例は、GFLGKペプチド架橋連結を含むマイクロカプセルを含むことができる。プロテアーゼカテプシンBなどの生物学的誘発因子を添加すると、シェル壁のペプチド架橋連結が切断され、ビーズの内容物が放出される。他の場合では、プロテアーゼは、熱活性化することができる。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解酵素キトサンの添加は、セルロース結合の切断、シェル壁の解重合、およびその内部内容物の放出のための生物学的誘発因子としての役目を果たす。
また、ビーズは、熱刺激の適用時にそれらの内容物を放出するように誘導することができる。温度の変化は、ビーズに様々な変化を引き起こすことができる。熱の変化は、ビーズの融解を引き起こし、ビーズ壁を崩壊させることができる。他の場合では、熱は、ビーズの内部成分の内圧を上昇させ、ビーズを破裂または爆発させることができる。さらに他の場合では、熱は、ビーズを変形して収縮脱水状態にすることができる。また、熱は、ビーズの壁内の熱感受性ポリマーに作用して、ビーズの破壊を引き起こすことができる。
また、ビーズは、電気刺激の結果として、破壊、溶解、または分解することができる。前節で説明した磁気粒子と同様に、電気的感受性ビーズは、ビーズの破裂誘発、ならびに電場でのアラインメント、電気伝導性、または酸化還元反応などの他の機能を両方とも可能にすることができる。一例では、電気的感受性材料を含有するビーズは、電場にてアラインされ、内部試薬の放出を制御することができる。他の例では、電場は、ビーズ壁自体内での酸化還元反応を誘導することができ、それにより多孔性を増加させることができる。
また、光刺激を使用して、ビーズを破壊することができる。数多くの光誘発因子が考えられ、特定の波長範囲の光子を吸収可能なナノ粒子および発色団などの種々の分子を使用する系を挙げることができる。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセル誘発因子として使用することができる。SiO2でコーティングされた高分子電解質カプセルをUV照射すると、ビーズ壁の崩壊を引き起こすことができる。さらに別の例では、アゾベンゼン基などの光スイッチング可能な物質をビーズ壁に組み込むことができる。UV光または可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子の吸収時に可逆的なシス−トランス異性化を起こす。この態様では、光子スイッチの組込みは、光誘発因子を適用すると崩壊するかまたはより多孔性になり得るビーズ壁をもたらす。
一部の実施形態では、ビーズ(例えば、標識が付着されるビーズ)は、ヒドロゲルビーズである。一部の実施形態では、ビーズはヒドロゲルを含む。
ビーズの例としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Dynabeads(登録商標)、MACS(登録商標)マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ(例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ)、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴ(dT)コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびBcMag(商標)カルボキシル末端化磁気ビーズを挙げることができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性の材料を含んでいてもよい。固体支持体は、それに付着されているリンカー、スキャフォールド、構造ブロック、または他の反応性部分を含む場合「官能化」されていると呼ぶことができ、固体支持体は、それに付着されているそのような反応性部分を欠如する場合、「非官能化」されていると呼ぶことができる。固体支持体は、マイクロタイターウェル形式、カラムなどのフロースルー形式、または浸漬スティックなどにおいて、溶液中に浮遊させて使用することができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何学的構成の形態をとっていてもよい。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、毛細管、ガラス繊維フィルター、ガラス表面、金属表面(鋼鉄、金銀、アルミニウム、ケイ素、および銅)などの平坦支持体、ガラス支持体、プラスチック支持体、ケイ素支持体、チップ、フィルター、膜、マイクロウェルプレート、スライド、マルチウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリドで形成されている)、および/またはウェーハ、コーム、ピン、もしくは針(例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ)、またはウェーハ(例えば、シリコンウェーハ)、フィルター底部を有するもしくは有しないピットを有するウェーハなどの平坦表面のピットもしくはナノリットルウェルのアレイ中のビーズを含むことができる。
本明細書で使用される場合、基材は、あるタイプの固体支持体を指すことができる。基材は、本開示のバーコードまたは確率論的バーコードを含んでいてもよい固体支持体を指すことができる。基材は、例えば、複数のマイクロウェルを含んでいてもよい。例えば、基材は、2つまたはそれよりも多くのマイクロウェルを含むウェルアレイであってもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルは、規定容積の小型反応チャンバーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つまたは複数の細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つのみの細胞を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つまたは複数の固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、1つのみの固体支持体を閉じ込めることができる。一部の実施形態では、マイクロウェルには、単一細胞および単一固体支持体(例えば、ビーズ)を閉じ込める。マイクロウェルは、本開示のバーコード試薬を含むことができる。
本開示は、物理的試料(例えば、組織、臓器、腫瘍、細胞)中の別個の位置にある別個の標的の数を推定するための方法を提供する。本方法は、バーコード(例えば、確率論的バーコード)を試料の近傍に配置すること、試料を溶解すること、別個の標的にバーコードを付随させること、標的を増幅すること、および/または標的をデジタル的に計数することを含んでいてもよい。本方法は、バーコードにある空間標識から得られる情報を分析および/または視覚化することをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化することを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする(例えば、確率論的にバーコーディングする)前にまたは後で生成することができる。試料中の複数の標的の視覚化は、複数の標的を試料のマップにマッピングすることを含んでいてもよい。複数の標的を試料のマップにマッピングすることは、試料の二次元マップまたは三次元マップを生成することを含んでいてもよい。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコーディングする前にまたは後で生成することができる。一部の実施形態では、二次元マップおよび三次元マップは、試料を溶解する前にまたは後で生成することができる。二次元マップまたは三次元マップを生成する前にまたは後で試料を溶解することは、試料を加熱すること、試料を界面活性剤と接触させること、試料のpHを変化させること、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
本開示は、試料(例えば、細胞)を、本開示の基材と接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄い切片を含む試料を、バーコード(例えば、確率論的バーコード)と接触させることができる。例えば、重力流により細胞を接触させることができ、その場合、細胞は沈降して単層を作出することができる。試料は、組織の薄い切片であってもよい。薄い切片を、基材上に配置することができる。試料は1次元であってもよい(例えば、平面状表面を形成してもよい)。試料(例えば、細胞)は、例えば、細胞を基材上で増殖/培養することにより、基材全体に広げることができる。
バーコードが標的の近傍に存在すると、標的は、バーコードにハイブリダイズすることができる。別個の標的の各々に本開示の別個のバーコードが付随し得るように、バーコードを非枯渇比率で接触させることができる。標的とバーコードと効率的な付随を保証するため、標的をバーコードと架橋連結してもよい。
細胞およびバーコードを配分した後、細胞を溶解して標的分子を遊離させてもよい。細胞溶解は、様々な手段のいずれかにより、例えば、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械的溶解、もしくは光学的溶解により達成することができる。細胞は、界面活性剤(例えば、SDS、ドデシル硫酸Li、Triton X−100、Tween−20、もしくはNP−40)、有機溶媒(例えば、メタノールもしくはアセトン)、または消化酵素(例えば、プロテイナーゼK、ペプシン、もしくはトリプシン)、またはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解することができる。標的へのバーコードの付随を増加させるため、標的分子の拡散速度を、例えば、温度を低減させることおよび/または溶解物の粘度を増加させることにより変更してもよい。
一部の実施形態では、溶解は、機械的溶解、熱溶解、光学的溶解、および/または化学的溶解により実施することができる。化学的溶解は、プロテイナーゼK、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用を含んでいてもよい。溶解は、溶解緩衝液を基材に添加することにより実施することができる。溶解緩衝液は、Tris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約0.01、0.05、0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度のTris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、最大で約0.01、0.05、0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度のTris HCLを含んでいてもよい。溶解緩衝液は、約0.1MのTris HClを含んでいてもよい。溶解緩衝液のpHは、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも高くともよい。溶解緩衝液のpHは、最大で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも高くともよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のpHは約7.5である。溶解緩衝液は、塩(例えば、LiCl)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大で約0.1、0.5、または1M、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約0.5Mである。溶解緩衝液は、界面活性剤(例えば、SDS、ドデシル硫酸Li、triton X、tween、NP−40)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、または7%、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大で約0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、または7%、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約1%ドデシル硫酸Liである。溶解法に使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存する場合がある。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解に必要な時間が短くなる。溶解緩衝液は、キレート剤(例えば、EDTA、EGTA)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約1、5、10、15、20、25、または30mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大で約1、5、10、15、20、25、または30mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約10mMである。溶解緩衝液は、還元剤(例えば、ベータ−メルカプトエタノール、DTT)を含んでいてもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、少なくとも約1、5、10、15、または20mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、最大で約1、5、10、15、または20mM、またはそれよりも高濃度であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元剤の濃度は、約5mMである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約0.1MのTris HCl、約pH7.5、約0.5MのLiCl、約1%のドデシル硫酸リチウム、約10mMのEDTA、および約5mMのDTTを含んでいてもよい。
細胞を溶解し、それらから核酸分子を放出させた後、核酸分子に、共局在化されている固体支持体のバーコードをランダムに付随させることができる。付随は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の相補的部分とのハイブリダイゼーションを含んでいてもよい(例えば、バーコードのオリゴ(dT)は、標的のポリ(A)テイルと相互作用することができる)。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(例えば、緩衝液pH、イオン強度、温度など)は、特異的で安定したハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子に、基材上の複数のプローブを付随させる(例えば、基材上のプローブとハイブリダイズする)ことができる。プローブがオリゴ(dT)を含む場合、mRNA分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ(dT)部分は、cDNA分子の第一鎖合成のプライマーとして作用することができる。例えば、図2に例示されているバーコーディングの非限定的な例では、ブロック216において、mRNA分子を、ビーズ上のバーコードにハイブリダイズさせることができる。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合性領域にハイブリダイズすることができる。
付着されている標的−バーコード分子の固体支持体に基づくコレクションの回収は、磁気ビーズおよび外部から印加される磁場を使用することにより実施することができる。標的−バーコード分子をプールしたら、すべてのさらなる処理は、単一反応容器で進めることができる。さらなる処理は、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および/または核酸伸長反応を含んでいてもよい。マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞に由来する標識化標的核酸分子を最初にプールすることなく、さらなる処理反応を実施してもよい。
本開示は、逆転写を使用して標的−バーコードコンジュゲートを作出するための方法を提供する(例えば、図2のブロック224において)。標的−バーコードコンジュゲートは、バーコードおよび標的核酸のすべてまたは一部の相補配列(すなわち、確率論的バーコード化cDNA分子などのバーコード化cDNA分子)を含んでいてもよい。付随しているRNA分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより生じ得る。逆転写プライマーは、オリゴ(dT)プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ(dT)プライマーは、12〜18ヌクレオチド長であってもよく、または約12〜18ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物mRNAの3’末端にある内因性ポリ(A)テイルに結合することができる。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、様々な相補的部位にてmRNAに結合することできる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、選択的に目的のmRNAからのプライミングを生じる。
逆転写は、繰り返して生じて、複数の標識化cDNA分子を産生することができる。本明細書で開示される方法は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20回の逆転写反応を実施することを含んでいてもよい。本方法は、少なくとも約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100回の逆転写反応を実施することを含んでいてもよい。
1つまたは複数の核酸増幅反応(例えば、図2のブロック228における)を実施して、標識化標的核酸分子の複数コピーを作出することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅されるマルチプレックス様式で実施することができる。増幅反応を使用して、配列決定アダプターを核酸分子に付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、細胞標識および/またはバーコード配列(例えば、分子標識)の少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード配列(例えば、分子標識)、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい。増幅反応は、複数の核酸の0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、100%、またはこうした値の任意の2つの間の範囲もしくは数値を増幅することを含んでいてもよい。本方法は、1つまたは複数のcDNA合成反応を実施して、試料標識、細胞標識、空間標識、および/またはバーコード配列(例えば、分子標識)を含む標的−バーコード分子の1つまたは複数のcDNAコピーを産生することをさらに含んでいてもよい。
標識化核酸の増幅は、PCRベース法または非PCRベース法を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の指数関数的増幅を含んでいてもよい。標識化核酸の増幅は、標識化核酸の線形増幅を含んでいてもよい。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により実施することができる。PCRは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のDNA配列をin vitro増幅するための反応を指すことができる。PCRは、これらに限定されないが、RT−PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量的PCR、マルチプレックスPCR、デジタルPCR、サプレッションPCR、半サプレッシブPCR(semi−suppressive PCR)、およびアセンブリPCRを含む、この反応の派生形態を包含することができる。
増幅は、複数の核酸を含む1つまたは複数の試料に1つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。増幅は、複数の核酸に1つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含んでいてもよい。対照核酸は、対照標識を含んでいてもよい。
本明細書で開示される一部の実施形態は、オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬(タンパク質結合性試薬など)を各々が含む複数の組成物であって、オリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている細胞成分結合性試薬の固有識別子を含む組成物を提供する。細胞成分結合性試薬(バーコード化抗体など)およびそれらの使用(細胞の試料インデックス付与など)は、米国特許出願公開第2018/0088112号明細書および米国特許出願第15/937,713号明細書に記載されている。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、細胞成分結合性試薬のカクテル(例えば、抗体カクテル)を使用して、本明細書で開示される方法での標識付与感度を増加させることができる。いかなる特定の理論にも束縛されないが、これは、細胞成分発現またはタンパク質発現が、細胞タイプ間および細胞状態間で様々であり得るため、すべての細胞タイプを標識するユニバーサルな細胞成分結合性試薬または抗体を見出すことが困難であるためであり得ると考えられる。例えば、細胞成分結合性試薬のカクテルを使用すると、より多くの試料タイプのより高感度で効率的な標識付与を可能にすることができる。細胞成分結合性試薬のカクテルは、2つまたはそれよりも多くの異なるタイプの細胞成分結合性試薬、例えば、より広範囲の細胞成分結合性試薬または抗体を含むことができる。異なる細胞成分標的を標識する細胞成分結合性試薬を一緒にプールして、目的のすべての細胞タイプまたは1つもしくは複数の細胞タイプを十分に標識するカクテルを作出することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物およびバーコード配列(例えば、分子標識配列)を細胞成分結合性試薬(例えば、タンパク質結合性試薬)のオリゴヌクレオチドに付随させ得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的(例えば、タンパク質標的)の定量分析に使用することができる。細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドは、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであるか、またはこれらを含んでもよい。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、B細胞、T細胞、母体細胞、胎児細胞など、または様々な対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、試料は、マイクロウェルアレイにおけるマイクロウェルなどの個々のコンパートメント中に分離した複数の単一細胞を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面細胞成分である細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、本明細書に開示された組成物および細胞成分結合性試薬のオリゴヌクレオチドと核酸標的分子との両方にバーコード配列(例えば、分子標識配列)に付随し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、試料中の複数の細胞成分標的(例えば、タンパク質標的)および複数の核酸標的分子の同時定量分析のために使用され得る。複数の細胞成分標的および複数の核酸標的分子の同時定量分析の他の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2017年9月25日に出願された米国特許出願第15/715028号に記載されている。一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、組織試料、腫瘍試料、血液試料などであり得る。一部の実施形態では、試料は、正常細胞、腫瘍細胞、血液細胞、B細胞、T細胞、母体細胞、胎児細胞などの細胞型の混合物、または異なる対象からの細胞の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性試薬を、複数の細胞成分標的と特異的に結合させるために、試料と接触させる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、洗浄することによって除去され得る。試料が細胞を含む実施形態では、細胞に特異的に結合していない任意の細胞成分結合性試薬が除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、複数の細胞成分標的との特異的結合のために、複数の組成物を試料と接触させることを提供する。使用される条件は、細胞成分結合性試薬、例えば、抗体の、細胞成分標的への特異的結合を可能にし得ることが認識されるであろう。接触させるステップの後に、未結合の組成物を除去してもよい。例えば、試料が細胞を含み、かつ組成物が、細胞表面タンパク質などの細胞表面上にある細胞成分標的に特異的に結合する実施形態では、未結合の組成物は、細胞成分標的に特異的に結合する組成物のみが細胞と共に残るように、細胞を緩衝液で洗浄することによって除去され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法はまた、複数種の標的分子、例えば、タンパク質および核酸標的の同時定量分析のために使用することができる。例えば、標的分子は、細胞成分であってもよく、または細胞成分を含んでもよい。図6は、単一細胞における核酸標的と他の細胞成分標的(例えば、タンパク質)との両方の同時定量分析の例示的方法の概略図を示す。一部の実施形態では、各々が抗体などの細胞成分結合性試薬を含む複数の組成物605、605b、605cなどが提供される。異なる細胞成分標的に結合する、抗体などの異なる細胞成分結合性試薬が、異なる固有識別子とコンジュゲートされる。次に、細胞成分結合性試薬は、複数の細胞610を含有する試料とインキュベートされ得る。異なる細胞成分結合性試薬は、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せなどの細胞表面上の細胞成分に特異的に結合することができる。未結合の細胞成分結合性試薬は、例えば、緩衝液で細胞を洗浄することにより、除去され得る。次いで、細胞成分結合性試薬を含む細胞は、単一のコンパートメント615が単一細胞および単一ビーズ620に適合するように所定のサイズにされているマイクロウェルアレイなどの複数のコンパートメント中に分離され得る。各ビーズは、ビーズ上のすべてのオリゴヌクレオチドプローブと共通の細胞標識、およびバーコード配列(例えば、分子標識配列)を含み得る複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドプローブは、標的結合性領域、例えば、ポリ(dT)配列を含み得る。細胞成分結合性試薬にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチド625は、化学的、光学的または他の手段を使用して、細胞成分結合性試薬から脱離され得る。細胞は溶解されて(635)、ゲノムDNAまたは細胞のmRNA630などの細胞内の核酸を放出し得る。細胞のmRNA630、オリゴヌクレオチド625またはその両方は、ビーズ620上のオリゴヌクレオチドプローブによって、例えば、ポリ(dT)配列にハイブリダイズすることによって、捕捉され得る。逆転写酵素を使用して、細胞のmRNA630およびオリゴヌクレオチド625にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを細胞のmRNA630およびオリゴヌクレオチド625を鋳型として使用して伸長することができる。逆転写酵素によって生成された伸長産物は、増幅および配列決定に供され得る。配列決定リードは、試料中の各単一細胞の細胞成分および遺伝子発現のデジタルな表現をもたらすことができる、細胞標識、バーコード(例えば、分子標識)、遺伝子、細胞成分結合性試薬に特異的なオリゴヌクレオチド(例えば、抗体に特異的なオリゴヌクレオチド)などの配列または識別子のデマルチプレクシングに供され得る。
細胞成分結合性試薬(例えば、抗原結合性試薬またはタンパク質結合性試薬)および/または核酸分子に付随しているオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、確率論的バーコードなどのバーコード)にランダムに付随し得る。本明細書において、結合性試薬オリゴヌクレオチドと称される細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドは、本開示のオリゴヌクレオチド、例えば、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなどであってもよく、またはこれらを含んでもよい。付随は、例えば、標的核酸分子および/またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドの相補的部分へのオリゴヌクレオチドプローブの標的結合性領域のハイブリダイゼーションを含む。例えば、バーコード(例えば、確率論的バーコード)のオリゴ(dT)領域は、標的核酸分子のポリ(A)テイルおよび/またはタンパク質結合性試薬のオリゴヌクレオチドのポリ(dA)テイルと相互作用可能である。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(例えば、緩衝液のpH、イオン強度、温度など)は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。
一部の実施形態では、分子標識は、オリゴヌクレオチドプローブ標的結合性領域と標的核酸分子の一部および/または細胞成分結合性試薬に付随している(例えば、現在、または以前に付随した)オリゴヌクレオチドとのライゲーションにより追加され得る。例えば、標的結合性領域は、制限部位オーバーハング(例えば、EcoRI付着末端オーバーハング)への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。本方法は、制限部位オーバーハングを生成するために制限酵素(例えば、EcoRI)で標的核酸および/または細胞成分結合性試薬に付随しているオリゴヌクレオチドを処置することをさらに含み得る。2つの断片を接続するために、リガーゼ(例えば、T4 DNAリガーゼ)を使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示された方法は、各固有識別子、各核酸標的分子、および/または各結合性試薬オリゴヌクレオチド(例えば、抗体オリゴヌクレオチド)のための固有分子標識配列の数または存在を決定することを含む。例えば、配列決定リードを使用して、各固有識別子、各核酸標的分子、および/または各結合性試薬オリゴヌクレオチドのための固有分子標識配列の数を決定することができる。別の例として、配列決定リードを使用して、分子標識配列(例えば、配列決定リードにおける標的に付随している分子標識配列、結合性試薬オリゴヌクレオチド、抗体オリゴヌクレオチド、試料インデックス付与オリゴヌクレオチド、細胞識別オリゴヌクレオチド、制御粒子オリゴヌクレオチド、制御オリゴヌクレオチド、相互作用決定オリゴヌクレオチドなど)の存在または非存在を決定することができる。
本明細書に開示された一部の実施形態は、試料中の複数の細胞成分(例えば、タンパク質)および/または複数の核酸標的分子の同時定量分析のためのキットおよび組成物を提供する。キットおよび組成物は、一部の実施形態では、各々がオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした複数の細胞成分結合性試薬(例えば、複数のタンパク質結合性試薬)を含むことができ、オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性試薬に対する固有識別子、および複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々は、標的結合性領域、バーコード配列(例えば、分子標識配列)を含み、バーコード配列は、固有バーコード配列の多様なセットに由来する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、分子標識、細胞標識、試料標識、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、リンカーを含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各々は、オリゴヌクレオチドプローブの結合部位、例えば、ポリ(A)テイルを含み得る。例えば、ポリ(A)テイルは、例えば、oligodA18(固体支持体に係留していない)またはoligoA18V(固体支持体に係留している)であり得る。オリゴヌクレオチドは、DNA残基、RNA残基、またはその両方を含み得る。
本明細書の開示は、試料を識別するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、1つまたは複数の細胞の各々は、1つまたは複数の細胞成分標的を含み、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を含み、細胞成分結合性試薬は、1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと;複数のバーコード(例えば、確率論的バーコード)を使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディング(例えば、確率論的にバーコーディング)して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、1つまたは複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞の試料起源を識別することを含む。
本明細書の開示は、細胞のオーバーローディングおよびマルチプレットを識別するための方法、キットおよびシステムも含む。このような方法、キットおよびシステムは、例えば、オリゴヌクレオチドが付随している細胞成分結合性試薬を用いて細胞成分の発現レベル(例えば、タンパク質発現レベル)を測定するための方法、キットおよびシステムなどの、本明細書に開示された任意の適切な方法、キットおよびシステムにおいて、またはそれらと組み合わせて使用され得る。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコードを使用して細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することであって、複数のバーコードの各々は、細胞標識配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと;およびバーコード化標的の配列決定データを得ることを含む。複数のバーコードを使用して複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することは、標的のコピーをバーコードの標的結合性領域と接触させること;および複数のバーコードを使用して複数の標的を逆転写して、複数の逆転写標的を生成することを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを、細胞識別オリゴヌクレオチドと接触させて、細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること;および細胞識別オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。バーコードを伸長することは、DNAポリメラーゼを使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。バーコードを伸長することは、逆転写酵素を使用してバーコードを伸長して、複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して細胞識別オリゴヌクレオチドをバーコーディングして複数のバーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、細胞識別オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化細胞識別オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
本明細書の開示は、アプタマーを使用して、細胞成分の発現(例えば、細胞内タンパク質発現を含む、細胞内での細胞成分の発現)をプロファイリングするための方法の実施形態を含む。図8A〜8Eは、細胞成分の発現(例えば、タンパク質発現)を決定するためにオリゴヌクレオチドが付随している(例えば、コンジュゲートした)アプタマーを使用する例示的ワークフローの略図を示す。一部の実施形態では、本方法は、任意の単一細胞RNA配列決定方法(BD Rhapsody(商標)などの任意の単一細胞3’RNA配列決定方法、および単一細胞5’RNA配列決定方法を含む)と共に使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、細胞を固定および透過処理する必要なく(例えば、細胞を部分的または完全に固定および/または透過処理する必要なく)、単一細胞RNA配列決定方法と共に使用することができる。
一部の実施形態では、複数の標識化核酸またはそれらの一部の配列決定情報を得ることは、標識化核酸を1つまたは複数の反応に供して、核酸配列決定のための1セットの核酸を生成することを含む(例えば、図3およびそれに伴う記載を参照のこと)。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの各々は、細胞標識、ユニバーサルプライマーの結合部位、増幅アダプター、配列決定アダプター、またはそれらの組合せを含む(例えば、図1に関して記載されたバーコード104)。一部の実施形態では、バーコーディング粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、ヒドロゲルビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはヒドロゲルビーズである。
アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのアプタマーへの付随は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、例えば、単一ポリヌクレオチド(例えば、図8Aおよび図9に示されている単一ポリヌクレオチド804)中に存在(例えば、単一ポリヌクレオチドを形成)してもよい。アプタマーは、単一ポリヌクレオチド中のアプタマー特異的オリゴヌクレオチドに対して5’側にあってもよい。アプタマーは、単一ポリヌクレオチド中のアプタマー特異的オリゴヌクレオチドに対して3’側にあってもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーに付随していてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーに付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーに非共有結合で付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介してアプタマーにコンジュゲートされていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。一部の実施形態では、本方法は、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドをアプタマーから脱離させることを含む。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アラインメント配列を含む(例えば、図9を参照して記載されている、ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列804b)。アラインメント配列は、1またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、2ヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーであるかまたは含む。ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、塩基アナログを含んでいてもよい。塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、フルオロフォアを含んでいてもよい。アプタマーは、ペプチドアプタマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数のタンパク質結合性アプタマーは、第2のタンパク質結合性アプタマーを含むか、または複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む。アプタマーおよび第2のアプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。アプタマーは、第1の担体に付随していてもよく、第2のアプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一であってもよい。アプタマーと第2のアプタマーとの間の配列同一性は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、アプタマーおよび第2のアプタマーは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、30%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列同一性、もしくは約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、30%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の配列同一性、またはこうした値の任意の2つの間の数値もしくは範囲の配列同一性を有していてもよい。一部の実施形態では、アプタマーおよび第2のアプタマーは、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、30%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性、または最大で1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、30%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有していてもよい。アプタマーおよび第2のタンパク質結合性アプタマーは同一であってもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは異なっていてもよい。
一部の実施形態では、本方法は、複数のアプタマーを複数の細胞と接触させた後、複数の細胞と接触していないアプタマーを除去することを含む。複数の細胞と接触していないアプタマーの除去は、複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含んでいてもよい。
アプタマーの除去 − アプタマースポンジ
複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの除去は、アプタマースポンジ(図8Eを参照して記載されているアプタマースポンジ828)を使用して、複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含んでいてもよい。アプタマースポンジは、例えば、アプタマーの配列に相補的な複数の配列を含んでいてもよい。複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーは、アプタマースポンジの複数の配列にハイブリダイズすることができる。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーが、複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの少なくとも1つと接触すると、ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する。例えば、図8Dに例示されていように、接近不能なポリ(dA)領域を有するアプタマー特異的オリゴヌクレオチドが付随しているアプタマー804inは、アプタマー804inがその細胞成分標的に結合すると、接近可能なポリ(dA)領域を有するアプタマー特異的オリゴヌクレオチドが付随しているアプタマー804acへと変化することができる。第1のコンフォメーションのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域は、ヘアピン構造(図8Dを参照して記載されているヘアピン構造820)を構成してもよい。ヘアピン構造を伴うポリ(dA)領域は、バーコードの標的結合性領域のポリ(dT)領域に接近可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域とオリゴヌクレオチドプローブのポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションにより、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。細胞コンパートメント標的(cellular compartment target)と接触していないアプタマーに付随しているアプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブのポリ(dT)領域にハイブリダイズすることができない接近不能なポリ(dA)領域を有してもよい。そのようなアプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびそれが付随しているアプタマーは、除去することができる。
一部の実施形態では、複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの除去は、複数のアンチセンスアプタマーを使用して、複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含み、複数のアンチセンスアプタマーの各アンチセンスアプタマーは、複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの1つのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの相補配列またはその一部を含むアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含む第2のアプタマーを含み、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、二本鎖のまたは部分的に二本鎖のデオキシリボ核酸(DNA)分子を形成する。
一部の実施形態では、複数のタンパク質標的は、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、複数の細胞は、T細胞、B細胞、腫瘍細胞、骨髄性細胞、血液細胞、正常細胞、胎児細胞、母体細胞、またはそれらの混合物を含む。
本明細書における開示は、複数の細胞成分結合性アプタマーを含む組成物であって、複数の細胞成分結合性アプタマーの各々は、細胞成分結合性アプタマーのための固有識別子配列を含むアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含み、細胞成分結合性アプタマーは、複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である組成物を含む。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、単一ポリヌクレオチドを形成する。細胞成分結合性アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいてアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの5’側にあってもよい。細胞成分結合性アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいてアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの3’側にあってもよい。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに付随している。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに非共有結合で付着されていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含んでいてもよい。分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含む。アラインメント配列は、1またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、2ヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含む。ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、塩基アナログを含んでいてもよい。塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、フルオロフォアを含んでいてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、ペプチドアプタマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。細胞成分結合性アプタマーは第1の担体に付随していてもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2のタンパク質結合性アプタマーは同一であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは異なっていてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、第1の担体は、金属ナノ材料を含む。第1の担体は、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。第1の担体は、金ナノ材料を含んでいてもよい。第1の担体は、金ナノ構造、金ナノ粒子、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。第1の担体は、リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、第1の担体は、細胞へと内部移行される(または内部移行され得る)ように構成されている。第1の担体は、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行される(または内部移行され得る)ように構成されていてもよい。第1の担体は、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行される(または内部移行され得る)ように構成されていてもよい。
一部の実施形態では、組成物は、アプタマースポンジを含む。アプタマースポンジは、アプタマーの配列に相補的な複数の配列を含んでいてもよい。アプタマースポンジを使用して、標的に結合していないアプタマーを除去することができる。
アプタマーの除去 − アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのコンフォメーション
一部の実施形態では、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、アプタマーが、複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの少なくとも1つと接触すると、ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する。第1のコンフォメーションのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域は、ヘアピン構造を構成してもよい。ヘアピン構造を伴うポリ(dA)領域は、バーコードの標的結合性領域のポリ(dT)領域に接近可能であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドのポリ(dA)領域とオリゴヌクレオチドプローブのポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションによりアプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされることができる。
一部の実施形態では、アプタマーは相補配列を含む。アプタマーは、互いにハイブリダイズして(またはハイブリダイズすることを可能にして)、凝集体を形成するように構成されてもよい。凝集体は、細胞での分解の標的とされてもよい。
一部の実施形態では、組成物は、複数のアンチセンスアプタマーを含み、複数のアンチセンスアプタマーの各アンチセンスアプタマーは、アプタマーの1つのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの相補配列またはその一部を含むアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含む第2のアプタマーを含み、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、二本鎖のまたは部分的に二本鎖のデオキシリボ核酸(DNA)分子を形成する。
本明細書における開示は、細胞成分をプロファイリングするための(例えば、タンパク質発現をプロファイリングするための)キットを含む。キットは、複数の細胞成分結合性アプタマーを含む組成物であって、複数の細胞成分結合性アプタマーの各々は、細胞成分結合性アプタマーのための固有識別子配列を含むアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含み、細胞成分結合性アプタマーは、複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である組成物を含んでいてもよい。キットは、アプタマー特異的オリゴヌクレオチドをバーコーディング(例えば、確率論的にバーコーディング)するためのバーコーディング粒子を含んでいてもよい。キットは、アプタマースポンジを含んでいてもよい。アプタマーは、互いにハイブリダイズして(またはハイブリダイズすることを可能にして)、凝集体を形成するように構成されてもよい。組成物は、複数のアンチセンスアプタマーを含んでいてもよい。
図10A〜10Bは、試料インデックス付与または試料識別のためにオリゴヌクレオチド付随アプタマーを使用する例示的なワークフローの概略図を示す。本方法は、ステップ1000aにて、各試料の細胞を試料インデックス付与組成物と接触させること;ステップ1000bにて、試料インデックス付与組成物と接触させた異なる試料に由来する細胞をプールすること;ステップ1000cにて、プールされた細胞のうちの単一細胞を単一ビーズと共に区画に共分配すること;ステップ1000dにて、区画内の細胞を溶解し、試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすること;およびステップ1000eにて、バーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ることを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、少なくとも1つの細胞の試料起源の識別は、複数の試料インデックス付与組成物の少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列の存在または非存在を識別することを含む。試料インデックス付与配列の存在または非存在の識別は、少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および配列決定データ中の少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドに対応する複数の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、細胞の試料起源を識別することを含む。
一部の実施形態では、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していない第2のアプタマーを含む。アプタマーおよび第2のアプタマーは同一であってもよい。試料インデックス付与組成物中のアプタマーの数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、アプタマーを含む。
一部の実施形態では、単一ポリヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよびアプタマーを含む。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの5’側にあってもよい。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの3’側にあってもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーに付随していてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーに付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介してアプタマーにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーに非共有結合で付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、リンカーを介してアプタマーに付随していてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含む。アラインメント配列は、1またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、2またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含む。ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、塩基アナログを含んでいてもよい。塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、フルオロフォアを含んでいてもよい。アプタマーは、ペプチドアプタマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随していてもよい。複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随していてもよい。担体の数は、インプリメンテーションが異なれば異なっていてもよい。一部の実施形態では、担体の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000であってもよく、もしくは約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000であってもよく、またはこうした値の任意の2つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、担体の数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、もしくは1000であってもよく、または最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、もしくは1000であってもよい。
一部の実施形態では、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物は、第2のタンパク質結合性アプタマーを含む第2のアプタマー組成物を含み、第2のアプタマーは、1つもしくは複数のタンパク質標的のうちの少なくとも1つに、または1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である。アプタマーおよび第2のアプタマーは、1つもしくは複数のタンパク質標的または1つもしくは複数の細胞成分標的の同じタンパク質標的に結合することが可能であってもよく、第2のアプタマーには、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していない。第2のアプタマーには、第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していてもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一であってもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは同一であってもよい。アプタマーおよび第2のアプタマーは異なっていてもよい。
一部の実施形態では、複数の試料のうちの試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む。複数の試料は、哺乳動物細胞、細菌細胞、ウイルス細胞、酵母細胞、真菌細胞、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、1つもしくは複数のタンパク質標的または1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つは、細胞表面上にある。一部の実施形態では、タンパク質標的または細胞成分標的は、炭水化物、脂質、タンパク質、細胞外タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、細胞内タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含む。タンパク質標的または細胞成分標的は、10〜100個の異なるタンパク質標的または細胞成分標的を含む群から選択することができる。
一部の実施形態では、本方法は、複数の試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去することを含む。未結合試料インデックス付与組成物の除去は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を洗浄緩衝液で洗浄することを含んでいてもよい。未結合試料インデックス付与組成物の除去は、フローサイトメトリーを使用して、少なくとも1つのアプタマーに結合した細胞を選択することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本方法は、複数の試料の各々に由来する1つまたは複数の細胞を溶解することを含む(例えば、図10Bのステップ1000dにて)。
一部の実施形態では、本方法は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングする前に、複数の試料インデックス付与組成物と接触させた複数の試料をプールすることを含む(例えば、図10Aのステップ1000bにて)。
一部の実施形態では、複数のバーコードのうちのバーコードは、標的結合性領域および分子標識配列を含み、複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードの分子標識配列は、異なる分子標識配列を含む。バーコードは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはそれらの任意の組合せを含んでいてもよい。標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、複数のバーコードを試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること;および試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを伸長して、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
一部の実施形態では、複数のバーコードを使用して試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む。
本明細書における開示は、複数の試料インデックス付与組成物の実施形態である。一部の実施形態では、複数の試料インデックス付与組成物の各々は、第1の細胞成分結合性アプタマーおよび試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含むアプタマー組成物を含み、細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも1つの細胞成分標的に特異的に結合することが可能であり、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料の1つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含み、複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第2の細胞成分結合性アプタマーを含み、第2の細胞成分結合性アプタマーは、1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である。
細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、1つまたは複数の細胞成分標的の同じ細胞成分標的に結合することが可能であってもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーには、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していなくてもよい。第2の細胞成分結合性アプタマーには、第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していてもよい。試料インデックス付与配列および第2の試料インデックス付与配列は同一であってもよい。試料インデックス付与配列および第2の試料インデックス付与配列は異なっていてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、配列が少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは同一であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、同じタンパク質標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、1つまたは複数のタンパク質標的の異なるタンパク質標的に結合することが可能であってもよい。
一部の実施形態では、単一ポリヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよび細胞成分結合性アプタマーを含む。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの5’側にあってもよい。アプタマーは、単一ポリヌクレオチドにおいて試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの3’側にあってもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、アプタマーに付随している。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、細胞成分結合性アプタマーに非共有結合で付着されていてもよい。試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して、タンパク質結合性アプタマーまたは細胞成分結合性アプタマーに付随していてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ポリ(dA)領域、またはそれらの組合せを含む。分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー(例えば、Illumina P7配列もしくはその部分配列)、配列決定プライマー(例えば、Illumina R2配列もしくはその部分配列)、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された(または捕捉、ハイブリダイズ、もしくは結合することが可能な)捕捉配列に相補的な配列を含む。標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい。捕捉配列に相補的な試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含む。アラインメント配列は、またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、2またはそれよりも長いヌクレオチド長であってもよい。アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、タンパク質結合性アプタマーまたは細胞成分結合性アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含む。ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、塩基アナログを含んでいてもよい。塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい。ヌクレオチドアプタマーは、フルオロフォアを含んでいてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、ペプチドアプタマーを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーには、同一の配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している。細胞成分結合性アプタマーには、異なる試料インデックス付与配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していてもよい。
一部の実施形態では、試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随している。複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随していてもよい。一部の実施形態では、アプタマー組成物は、第1の担体に付随している。
一部の実施形態では、第1の担体は、金属ナノ材料を含む。第1の担体は、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。第1の担体は、金ナノ材料を含んでいてもよい。第1の担体は、金ナノ構造、金ナノ粒子、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。第1の担体は、リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付着されている。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に共有結合で付着されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して第1の担体にコンジュゲートされていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に非共有結合で連結されていてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、リンカーを介して第1の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、第1の担体は、細胞へと内部移行される(または内部移行され得る)ように構成されている。第1の担体は、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、またはそれらの組合せにより、細胞へと内部移行されてもよい。第1の担体は、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行されてもよい。
一部の実施形態では、アプタマー組成物は、1つもしくは複数のタンパク質標的または1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能な第2の細胞成分結合性アプタマー、および第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%配列同一性を有してもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは同一であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは異なっていてもよい。一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随していてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随していてもよく、第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随していてもよい。
一部の実施形態では、細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能であってもよい。細胞成分結合性アプタマーおよび第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は異なっていてもよい。
本明細書における開示は、試料を識別するためのキットの実施形態である。一部の実施形態では、キットは、複数の試料インデックス付与組成物を含む。一部の実施形態では、キットは、複数のバーコードを含む。複数のバーコードのうちのバーコードは、標的結合性領域を含む。標的結合性領域は、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された(または捕捉、ハイブリダイズ、もしくは結合することが可能な)捕捉配列を含んでいてもよい。細胞成分結合性アプタマーは、試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよび第1の細胞成分結合性アプタマーを含んでいてもよい。
タンパク質結合性試薬に付随させるためのオリゴヌクレオチド
この実施例は、タンパク質結合性試薬がコンジュゲートし得るオリゴヌクレオチドの設計について実証する。オリゴヌクレオチドを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現を同時に決定することができる。オリゴヌクレオチドを試料インデックス付与のために使用して、同一または異なる試料の細胞を決定することもできる。
以下の方法を使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための、候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
以下のプロセスを使用して、タンパク質発現と遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
ステップ1a.所望の長さ(45bp)を有するいくつかの候補配列(50000配列)をランダムに生成する。
ステップ1b.生成した配列の5’末端に転写調節LSRR配列および生成した配列の3’末端にポリ(dA)配列(25bp)を付加する。
ステップ1c.生成および付加した配列で、40%〜50%の範囲のGC含量を有さない配列を除去する。
ステップ1d.残った配列で、各々1つまたは複数のヘアピン構造を有する配列を除去する。
残った候補オリゴヌクレオチド配列の数は、423であった。
残った423の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
2.1 N1プライマー:N1プライマーとして、ユニバーサルN1配列:5’−GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG−3’(LSRR配列;配列番号5)を使用する。
2.2 N2プライマー(特定試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする;例えば、図11B〜11DのN2プライマー):
2.2a.N1配列の下流で開始しない候補N2プライマーを除去する。
2.2b.候補オリゴヌクレオチド配列の最後の35bpにおいて重複する候補N2プライマーを除去する。
2.2c.オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム(例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム)とアラインするプライマー候補を除去する。
2.2d.プライマー−プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてILR2配列(ACACGACGCTCTTCCGATCT;配列番号6)を使用する。
423の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、390候補に対するN2プライマーを設計した。
残った390の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下のプロセスを使用した。
3a.すべてのバーコードについてポリ(dA)テイルを同じ長さに維持するために、Aで終わるランダム配列を有する(すなわち、ポリ(dA)配列の有効長さが25bpを超える)あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
3b.Gが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、4以上の連続するG(>3G)を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
図11Aは、上記の方法を使用して生成した非限定的な例示的候補オリゴヌクレオチド配列を示す。
以下の方法を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列および対応するプライマー配列を生成した。
以下を使用して、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定ならびに試料インデックス付与のための候補オリゴヌクレオチド配列を生成した。
1a.所望の長さ(128bp)を有するいくつかの候補配列(100000配列)をランダムに生成する。
1b.生成した配列の5’末端に転写調節LSRR配列と、非ヒト、非マウスの追加アンカー配列を、および生成した配列の3’末端にポリ(dA)配列(25bp)を付加する。
1c.生成および付加した配列で、40%〜50%の範囲のGC含量を有さない配列を除去する。
1d.ヘアピン構造スコアに基づき、残った候補オリゴヌクレオチド配列を選別する。
1e.最も低いヘアピンスコアを有する1000の残った候補オリゴヌクレオチド配列を選択する。
最も低いヘアピンスコアを有する400の候補オリゴヌクレオチド配列のプライマーを設計するために、以下の方法を使用した。
2.1 N1プライマー:N1プライマーとして、ユニバーサルN1配列:5’−GTTGTCAAGATGCTACCGTTCAGAG−3’(LSRR配列;配列番号5)を使用する。
2.2 N2プライマー(特定の試料インデックスオリゴヌクレオチドの増幅を目的とする;例えば、図11Bおよび11CのN2プライマー):
2.2a.N1配列の23nt下流で開始しない候補N2プライマーを除去する(アンカー配列は、すべての候補オリゴヌクレオチド配列についてユニバーサルであった)。
2.2b.標的配列の最後の100bpにおいて重複する候補N2プライマーを除去する。得られたプライマー候補は、標的配列の48番目のヌクレオチドと100番目のヌクレオチドとの間に存在し得る。
2.2c.オリゴヌクレオチドを使用して試験される細胞の種のトランスクリプトーム(例えば、ヒトトランスクリプトームまたはマウストランスクリプトーム)とアラインするプライマー候補を除去する。
2.2d.プライマー−プライマー相互作用を最小限にするかまたは回避するために、デフォルト対照としてILR2配列 5’−ACACGACGCTCTTCCGATCT−3’(配列番号6)を使用する。
2.2e.標的配列の最後の100bpにおいて重複するN2プライマー候補を除去する。
400の候補オリゴヌクレオチド配列のうち、392候補に対するN2プライマーを設計した。
残った392の候補プライマー配列をフィルタリングするために、以下を使用した。
3a.すべてのバーコードについてポリ(dA)テイルを同じ長さに維持するために、Aで終わるランダム配列を有する(すなわち、ポリ(dA)配列の有効長さが25bpを超える)あらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
3b.Gが連続するオリゴ合成では、コストが余分にかかり、しかも収率が低い可能性があるため、4以上の連続するG(>3G)を含むあらゆる候補オリゴヌクレオチド配列を排除する。
まとめると、これらのデータは、タンパク質発現および遺伝子発現の同時決定または試料インデックス付与のために、異なる長さのオリゴヌクレオチド配列を設計することができることを示す。オリゴヌクレオチド配列は、ユニバーサルプライマー配列、抗体特異的オリゴヌクレオチド配列または試料インデックス付与配列、およびポリ(dA)配列を含み得る。
オリゴヌクレオチドが付随している抗体のワークフロー
この実施例は、タンパク質標的の発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用するワークフローを実証する。
対象の凍結細胞(例えば、凍結末梢血単核細胞(PBMC))を解凍する。解凍した細胞を一定温度で一定期間(例えば、室温で20分間)オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体(例えば、0.06μg/100μlの抗CD4抗体(オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体ストックの1:333希釈液))で染色する。オリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体は、1、2、または3種のオリゴヌクレオチド(「抗体オリゴヌクレオチド」)にコンジュゲートされている。抗体オリゴヌクレオチドの配列を図12に示す。細胞を洗浄して、未結合のオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を除去する。目的の細胞(例えば、生細胞)を得るために、フローサイトメトリーによる選別を目的として、細胞をCalcein AM(BD(Franklin Lake、New Jersey))およびDraq7(商標)(Abcam(Cambridge、United Kingdom))で染色してもよい。細胞を洗浄して、過剰なCalcein AMおよびDraq7(商標)を除去してもよい。フローサイトメトリーを使用して、Calcein AM(生細胞)で染色され、Draq7(商標)(死滅または透過処理していない細胞)で染色されていない単一細胞をBD Rhapsody(商標)カートリッジ中に選別する。
まとめると、この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルを決定するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲート抗体を使用することを記載する。この実施例は、目的の標的のタンパク質発現プロファイルおよび目的の遺伝子のmRNA発現プロファイルを同時に決定することができることをさらに記載する。
以前に記載された実施形態の少なくとも一部では、実施形態において使用される1つまたは複数のエレメントは、このような置き換えが技術的に実施不可能でなければ、別の実施形態において交換可能に使用され得る。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、以上に記載の方法および構造に種々の他の省略、追加および変更を行い得ることが当業者によって認識されるであろう。このような変更および変化はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される主題の範囲内に含まれることが意図される。
Claims (252)
- 試料を識別するための方法であって、
複数の試料の各々を、それぞれ、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、
前記複数の試料の各々は、各々が1つまたは複数のタンパク質標的を含む1つまたは複数の細胞を含み、前記試料インデックス付与組成物は、アプタマーおよび試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含むアプタマー組成物を含み、前記アプタマーは、前記1つまたは複数のタンパク質標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能であり、
前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと;
複数のバーコードを使用して前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;
前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および
前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、前記1つまたは複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞の試料起源を識別すること
を含む方法。 - 試料を識別するための方法であって、
複数の試料の各々を、それぞれ、複数の試料インデックス付与組成物のうちの試料インデックス付与組成物と接触させることであって、
前記複数の試料の各々は、各々が1つまたは複数の細胞成分標的を含む1つまたは複数の細胞を含み、前記試料インデックス付与組成物は、アプタマーおよび試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含むアプタマー組成物を含み、前記アプタマーは、前記1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能であり、
前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料インデックス付与配列を含み、前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、こと;および
前記複数の試料インデックス付与組成物の少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、前記1つまたは複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞の試料起源を識別すること
を含む方法。 - 前記細胞成分標的は、タンパク質標的を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞の試料起源の識別は、
複数のバーコードを使用して前記複数の試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして、複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;
前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および
前記配列決定データ中の前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、前記細胞の試料起源を識別すること
を含む、請求項2〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの細胞の試料起源の識別は、前記複数の試料インデックス付与組成物の少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列の存在または非存在を識別することを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与配列の存在または非存在の識別は、
前記少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること;
前記複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ること;および
前記配列決定データ中の前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドに対応する前記複数の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの試料インデックス付与配列に基づいて、前記細胞の試料起源を識別すること
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製する前に、複製用アダプターを前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにライゲートさせることを含み、
前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの複製は、前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにライゲートされた前記複製用アダプターを使用して、前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む、
請求項6に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、前記少なくとも1つのバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製する前に、
捕捉プローブを、前記少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした捕捉プローブを生成すること;および
前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記捕捉プローブを伸長して、前記捕捉プローブが付随している試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含み、
前記少なくとも1つの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの複製は、前記捕捉プローブが付随している前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを複製して、前記複数の複製試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む、
請求項6に記載の方法。 - 前記試料インデックス付与配列は、6〜60ヌクレオチド長または50〜500ヌクレオチド長である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも10、100、または1000個の試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 単一ポリヌクレオチドは、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよび前記アプタマーを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの5’側にある、請求項11に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの3’側にある、請求項11に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに付随している、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに付着されており、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに共有結合で付着されていてもよい、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーにコンジュゲートされており、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記アプタマーにコンジュゲートされていてもよい、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに非共有結合で付着されている、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して前記アプタマーに付随している、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含み、前記ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、フルオロフォア、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドアプタマーは塩基アナログを含み、前記塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい、請求項19に記載の方法。
- 前記アプタマーは、ペプチドアプタマーを含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随している、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随している、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー組成物は、第1の担体に付随している、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー組成物は、
前記1つもしくは複数のタンパク質標的または前記1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能な第2のアプタマー、および
第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチド
を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、第1の担体に付随している、請求項25に記載の方法。
- 前記アプタマーは、第1の担体に付随しており、前記第2のアプタマーは、第2の担体に付随している、請求項25に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%配列同一性を有する、請求項26または27に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは同一である、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは異なる、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は同一である、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項31に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は異なる、請求項26〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の担体は、
金属ナノ材料であって、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、もしくはそれらの組合せを含んでいてもよい金属ナノ材料、および/または
金ナノ材料であって、金ナノ構造、金ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであってもよい金ナノ材料、および/または
リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、もしくはそれらの組合せ
を含む、請求項22〜33のいずれか1項に記載の方法。 - 前記アプタマーは、前記第1の担体に付着されており、前記アプタマーは、前記第1の担体に共有結合で付着されていてもよい、請求項25〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体にコンジュゲートされており、前記アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記第1の担体にコンジュゲートされていてもよい、請求項25〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体に非共有結合で連結されている、請求項25〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、リンカーを介して前記第1の担体に付随している、請求項25〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体上に固定化されているか、前記第1の担体上に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に固定化されているか、前記第1の担体内に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に封入されているか、前記第1の担体内に部分的に封入されているか、前記第1の担体内に埋め込まれているか、前記第1の担体内に部分的に埋め込まれているか、またはそれらの組合せである、請求項25〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーを前記第1の担体から解離させることを含む、請求項25〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記解離は、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングした後に生じる、請求項40に記載の方法。
- 前記解離は、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングする前に生じる、請求項40に記載の方法。
- 前記複数の試料の各々を前記試料インデックス付与組成物と接触させることは、前記試料の前記1つまたは複数の細胞のうちの細胞を前記試料インデックス付与組成物と接触させることを含む、請求項25〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の担体は、前記細胞へと内部移行され、前記内部移行は、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せによるものであってもよい、請求項43に記載の方法。
- 前記1つもしくは複数のタンパク質標的または前記1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの前記少なくとも1つは、細胞表面上にある、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの未結合試料インデックス付与組成物を除去することを含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記未結合試料インデックス付与組成物の除去は、(a)前記複数の試料の各々に由来する前記1つもしくは複数の細胞を洗浄緩衝液で洗浄すること、(b)フローサイトメトリーを使用して、少なくとも1つのアプタマーに結合している細胞を選択すること、または両方を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記複数の試料の各々に由来する前記1つまたは複数の細胞を溶解することを含む、請求項1〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーから脱離不能であるように構成されている、請求項1〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーから脱離可能であるように構成されている、請求項1〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを前記アプタマーから脱離させることを含み、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの脱離は、UV光切断、化学処理、加熱、酵素処理、またはそれらの任意の組合せにより前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを前記アプタマーから脱離させることを含んでいてもよい、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記1つもしくは複数の細胞のいずれのゲノム配列とも相同性ではないか、種のゲノム配列と相同性であるか、またはそれらの組合せであり、前記種は、非哺乳動物種であってもよい、請求項1〜51のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料のうちの試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項1〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料は、哺乳動物細胞、細菌細胞、ウイルス細胞、酵母細胞、真菌細胞、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項1〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された捕捉配列に相補的な配列を含む、請求項1〜54のいずれか1項に記載の方法。
- バーコードは、前記捕捉配列を含む標的結合性領域を含み、前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい、請求項55に記載の方法。
- 前記捕捉配列に相補的な前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含む、請求項55または56に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含み、任意に、(a)前記アラインメント配列は、1もしくはそれよりも長いヌクレオチド長または2もしくはそれよりも長いヌクレオチド長であり、(b)前記アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含み、および/あるいは(c)前記アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含む、請求項57に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含み、前記分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長または5〜50ヌクレオチド長であってもよく、前記ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項1〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は、炭水化物、脂質、タンパク質、細胞外タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、細胞内タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項1〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は、10〜100個の異なるタンパク質標的または細胞成分標的を含む群から選択される、請求項1〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーには、同一の配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーには、異なる試料インデックス付与配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの前記試料インデックス付与組成物は、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していない第2のアプタマーを含む、請求項1〜63のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは同一である、請求項64に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物の各々は、前記アプタマーを含む、請求項1〜65のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの前記試料インデックス付与組成物は、第2のタンパク質結合性アプタマーを含む第2のアプタマー組成物を含み、前記第2のアプタマーは、前記1つもしくは複数のタンパク質標的のうちの少なくとも1つに、または前記1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である、請求項1〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、前記1つもしくは複数のタンパク質標的または前記1つもしくは複数の細胞成分標的の同じタンパク質標的に結合することが可能であり、前記第2のアプタマーには、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していない、請求項67に記載の方法。
- 前記第2のアプタマーには、第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項67に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、配列が少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一である、請求項67〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは同一である、請求項67〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは異なる、請求項67〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、同じタンパク質標的の異なる領域または同じ細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項67〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、前記1つもしくは複数のタンパク質標的の異なるタンパク質標的に、または前記1つもしくは複数の細胞成分標的の異なる細胞成分標的に結合することが可能である、請求項67〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与配列および前記第2の試料インデックス付与配列は同一である、請求項69〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与配列および前記第2の試料インデックス付与配列は異なる、請求項69〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングする前に、前記複数の試料インデックス付与組成物と接触させた前記複数の試料をプールすることを含む、請求項1〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のバーコードのうちのバーコードは、標的結合性領域および分子標識配列を含み、
前記複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードの分子標識配列は、異なる分子標識配列を含む、請求項1〜77のいずれか1項に記載の方法。 - 前記バーコードは、細胞標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項78に記載の方法。
- 前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含む、請求項78または79に記載の方法。
- 前記複数のバーコードは、粒子に付随している、請求項78〜80のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のバーコードのうちの少なくとも1つのバーコードは、前記粒子上に固定化されているか、前記粒子上に部分的に固定化されているか、前記粒子内に封入されているか、前記粒子内に部分的に封入されているか、またはそれらの組合せである、請求項81に記載の方法。
- 前記粒子は、破壊可能であるか、または
前記粒子は、ビーズ、任意に、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴ(dT)コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、ヒドロゲルビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはそれらの任意の組合せを含むか、または
前記粒子は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ヒドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、
請求項81または82に記載の方法。 - 前記粒子は、破壊可能なヒドロゲルビーズを含む、請求項81〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子の前記バーコードは、少なくとも1000個、10000個、またはそれらの組合せの異なる分子標識配列から選択される分子標識配列を含む、請求項81〜84のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バーコードの前記分子標識配列は、ランダム配列を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記粒子は、少なくとも10000個のバーコードを含む、請求項81〜86のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のバーコードを使用して前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングすることは、
前記複数のバーコードを前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドと接触させて、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたバーコードを生成すること、および
前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記バーコードを伸長して、前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成すること
を含む、請求項81〜87のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記バーコードを伸長する前に、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記バーコードをプールすることを含み、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記バーコードを伸長することは、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした前記プールされたバーコードを伸長して、複数のプールされたバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記バーコードの伸長は、DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して前記バーコードを伸長して、前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む、請求項88に記載の方法。
- 前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを増幅して、複数のアンプリコンを産生することを含み、前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、前記分子標識配列の少なくとも一部および前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を増幅することを含んでいてもよい、請求項88〜90のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列決定データを得ることは、前記複数のアンプリコンの配列決定データを得ること、前記分子標識配列の少なくとも一部および前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を配列決定すること、または両方を含む、請求項91に記載の方法。
- 前記複数のバーコードを使用して前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドをバーコーディングして前記複数のバーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを生成することを含む、請求項1〜92のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のバーコードを使用して前記細胞の複数の標的をバーコーディングして、複数のバーコード化標的を生成することであって、前記複数のバーコードの各々は、細胞標識配列を含み、前記複数のバーコードのうちの少なくとも2つのバーコードは、同一の細胞標識配列を含む、こと;および
前記バーコード化標的の配列決定データを得ること
を含む、請求項1〜93のいずれか1項に記載の方法。 - 前記複数のバーコードを使用して前記複数の標的をバーコーディングして前記複数のバーコード化標的を生成することは、
前記標的のコピーを、前記バーコードの標的結合性領域と接触させること;および
前記複数のバーコードを使用して前記複数の標的を逆転写して、複数の逆転写標的を生成すること
を含む、請求項94に記載の方法。 - 前記複数のバーコード化標的の配列決定データを得る前に、前記バーコード化標的を増幅して複数の増幅されたバーコード化標的を生成し、前記バーコード化標的を増幅して前記複数の増幅されたバーコード化標的を生成することは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により前記バーコード化標的を増幅することを含んでいてもよい、請求項94または95に記載の方法。
- 前記複数のバーコードを使用して前記細胞の前記複数の標的をバーコーディングして前記複数のバーコード化標的を生成することは、複数の確率論的バーコードを使用して前記細胞の前記複数の標的を確率論的にバーコーディングして、複数の確率論的バーコード化標的を生成することを含む、請求項94〜96のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の試料インデックス付与組成物であって、
前記複数の試料インデックス付与組成物の各々は、第1の細胞成分結合性アプタマーおよび試料インデックス付与オリゴヌクレオチドを含むアプタマー組成物を含み、
前記細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも1つの細胞成分標的に特異的に結合することが可能であり、
前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、試料の1つまたは複数の細胞の試料起源を識別するための試料インデックス付与配列を含み、
前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも2つの試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、
複数の試料インデックス付与組成物。 - 前記試料インデックス付与配列は、6〜60ヌクレオチド長または50〜500ヌクレオチド長である、請求項98に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの少なくとも10、100、または1000個の試料インデックス付与組成物の試料インデックス付与配列は、異なる配列を含む、請求項98または99に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 単一ポリヌクレオチドは、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドおよび前記細胞成分結合性アプタマーを含む、請求項98〜100のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの5’側にある、請求項101に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの3’側にある、請求項101に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに付随している、請求項98〜103のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに付着されており、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されていてもよい、請求項98〜104のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされており、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい、請求項98〜105のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに非共有結合で付着されている、請求項98〜105のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して、タンパク質結合性アプタマーまたは前記細胞成分結合性アプタマーに付随している、請求項98〜107のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記タンパク質結合性アプタマーまたは前記細胞成分結合性アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含み、前記ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、フルオロフォア、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項98〜108のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記ヌクレオチドアプタマーは塩基アナログを含み、前記塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい、請求項109に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、ペプチドアプタマーを含む、請求項98〜110のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与組成物は、第1の担体に付随している、請求項98〜111のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記複数の試料インデックス付与組成物のうちの異なる試料インデックス付与組成物は、異なる第1の担体に付随している、請求項98〜112のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記アプタマー組成物は、第1の担体に付随している、請求項98〜111のいずれか1項に記載の試料インデックス付与組成物のうちの複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記アプタマー組成物は、
1つもしくは複数のタンパク質標的または1つもしくは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能な第2の細胞成分結合性アプタマー、および
第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチド
を含む、請求項98〜111のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随している、請求項115に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随しており、前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随している、請求項115に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、配列が少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一である、請求項115〜117のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは同一である、請求項116〜118のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは異なる、請求項116〜118のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は同一である、請求項116〜120のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項121に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は異なる、請求項116〜120のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記第1の担体は、
金属ナノ材料であって、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、もしくはそれらの組合せを含んでいてもよい金属ナノ材料、および/または
金ナノ材料であって、金ナノ構造、金ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであってもよい金ナノ材料、および/または
リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、もしくはそれらの組合せ
を含む、請求項112〜123のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に付着されており、前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に共有結合で付着されていてもよい、請求項115〜124のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体にコンジュゲートされており、前記細胞成分結合性アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記第1の担体にコンジュゲートされていてもよい、請求項115〜125のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に非共有結合で連結されている、請求項115〜126のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、リンカーを介して前記第1の担体に付随している、請求項115〜127のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体上に固定化されているか、前記第1の担体上に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に固定化されているか、前記第1の担体内に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に封入されているか、前記第1の担体内に部分的に封入されているか、前記第1の担体内に埋め込まれているか、前記第1の担体内に部分的に埋め込まれているか、またはそれらの組合せである、請求項115〜128のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記第1の担体は、前記細胞へと内部移行され、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより前記細胞へと内部移行されてもよい、請求項112〜129のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記1つまたは複数の細胞のいずれのゲノム配列とも相同性ではない、請求項98〜130のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記複数の試料のうちの少なくとも1つの試料は、1つもしくは複数の単一細胞、複数の細胞、組織、腫瘍試料、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項98〜131のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料は、哺乳動物試料、細菌試料、ウイルス試料、酵母試料、真菌試料、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項105〜132のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された捕捉配列に相補的な配列を含む、請求項98〜133のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- バーコードは、前記捕捉配列を含む標的結合性領域を含む、請求項134に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含む、請求項135に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記捕捉配列に相補的な前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含む、請求項134〜136のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、前記ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含み、任意に、(a)前記アラインメント配列は、1もしくはそれよりも長いヌクレオチド長または2もしくはそれよりも長いヌクレオチド長であり、(b)前記アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含み、および/あるいは(c)前記アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含む、請求項137に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ポリ(dA)領域、またはそれらの組合せを含み、前記分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であってもよく、前記ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であってもよく、または両方であってもよく、前記ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項98〜138のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分標的は、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項98〜139のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分標的は、10〜100個の異なる細胞成分標的を含む群から選択される、請求項98〜140のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーには、同一の配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項98〜141のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーには、異なる試料インデックス付与配列を有する2つまたはそれよりも多くの試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項98〜141のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与組成物は、第2の細胞成分結合性アプタマーを含み、前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、前記1つまたは複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である、請求項98〜143のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、前記1つまたは複数の細胞成分標的の同じ細胞成分標的に結合することが可能であり、前記第2の細胞成分結合性アプタマーには、前記試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随していない、請求項144に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記第2の細胞成分結合性アプタマーには、第2の試料インデックス付与配列を含む第2の試料インデックス付与オリゴヌクレオチドが付随している、請求項144に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%配列同一性を有する、請求項145または146に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは同一である、請求項145〜147のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、同じタンパク質標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項144〜148のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、前記1つまたは複数のタンパク質標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項149に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与配列および前記第2の試料インデックス付与配列は同一である、請求項146〜150のいずれか1項に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 前記試料インデックス付与配列および前記第2の試料インデックス付与配列は異なる、請求項151に記載の複数の試料インデックス付与組成物。
- 細胞におけるタンパク質発現を測定するための方法であって、
複数のタンパク質結合性アプタマーを、複数のタンパク質標的を含む複数の細胞と接触させることであって、前記複数のタンパク質結合性アプタマーの各々は、細胞成分結合性アプタマーのための固有識別子配列を含むアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含み、前記タンパク質結合性アプタマーは、前記複数のタンパク質標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である、こと;
前記複数のタンパク質結合性アプタマーが付随している前記複数の細胞を複数の区画に分配することであって、前記複数の区画のうちの区画は、前記タンパク質結合性アプタマーが付随している前記複数の細胞に由来する単一細胞を含む、こと;
前記単一細胞を含む区画において、バーコーディング粒子を、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記バーコーディング粒子は、各々が、標的結合性領域、および多様なセットの固有バーコード配列から選択されるバーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、こと;
前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを伸長して、複数の標識化核酸を産生することであって、前記標識化核酸の各々は、固有識別子配列またはその相補配列およびバーコード配列を含む、こと;および
前記複数の標識化核酸またはその一部の配列情報を得て、前記複数の細胞の1つまたは複数における、前記複数のタンパク質標的の1つまたは複数の量を決定すること
を含む方法。 - 細胞における細胞成分発現を測定するための方法であって、
複数の細胞成分結合性アプタマーを、複数の細胞成分標的を含む複数の細胞と接触させることであって、前記複数の細胞成分結合性アプタマーの各々は、前記細胞成分結合性アプタマーのための固有識別子配列を含むアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含み、前記細胞成分結合性アプタマーは、前記複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である、こと;
前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを伸長して、複数の標識化核酸を産生することであって、前記標識化核酸の各々は、固有識別子配列またはその相補配列およびバーコード配列を含む、こと;ならびに
前記複数の標識化核酸またはその一部の配列情報を得て、前記複数の細胞の1つまたは複数における、前記複数の細胞成分標的の1つまたは複数の量を決定すること
を含む方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブを伸長する前に、
前記複数の細胞成分結合性アプタマーが付随している前記複数の細胞を複数の区画に分配することであって、前記複数の区画のうちの区画は、前記細胞成分結合性アプタマーが付随している前記複数の細胞に由来する単一細胞を含む、こと;
前記単一細胞を含む区画において、バーコーディング粒子を、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドと接触させることであって、前記バーコーディング粒子は、各々が、標的結合性領域、および多様なセットの固有バーコード配列から選択されるバーコード配列を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む、こと
を含む、請求項154に記載の方法。 - 前記複数の細胞成分標的は、複数のタンパク質標的を含み、前記細胞成分結合性アプタマーは、前記複数のタンパク質標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である、請求項154または155に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよび前記アプタマーは、単一ポリヌクレオチドを形成する、請求項153〜156のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの5’側にある、請求項157に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの3’側にある、請求項157に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに付随している、請求項153〜159のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに付着されている、請求項153〜160のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに共有結合で付着されている、請求項153〜161のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーに非共有結合で付着されている、請求項153〜161のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーにコンジュゲートされており、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記アプタマーにコンジュゲートされていてもよい、請求項153〜163のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含み、前記ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、フルオロフォア、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項153〜164のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドアプタマーは塩基アナログを含み、前記塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい、請求項165に記載の方法。
- 前記アプタマーは、ペプチドアプタマーを含む、請求項153〜166のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質結合性アプタマーは、第2のタンパク質結合性アプタマーを含むか、または前記複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む、
請求項153〜156のいずれか1項に記載の方法。 - 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、第1の担体に付随している、
請求項168に記載の方法。 - 前記アプタマーは、第1の担体に付随しており、
前記第2のアプタマーは、第2の担体に付随している、
請求項168に記載の方法。 - 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、配列が少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%同一である、請求項168〜170のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のタンパク質結合性アプタマーは同一である、請求項168〜171のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは異なる、請求項168〜170のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は同一である、請求項173に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項173に記載の方法。
- 前記アプタマーおよび前記第2のアプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は異なる、請求項173に記載の方法。
- 前記第1の担体は、
金属ナノ材料であって、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであてもよい金属ナノ材料、および/または
金ナノ材料であって、金ナノ構造、金ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであってもよい金ナノ材料、および/または
リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、もしくはそれらの組合せ
を含む、請求項168〜176のいずれか1項に記載の方法。 - 前記アプタマーは、前記第1の担体に付着されており、前記アプタマーは、前記第1の担体に共有結合で付着されていてもよい、請求項168〜177のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体にコンジュゲートされており、前記アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記第1の担体にコンジュゲートされていてもよい、請求項168〜178のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体に非共有結合で連結されている、請求項168〜179のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、リンカーを介して前記第1の担体に付随している、請求項168〜180のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーは、前記第1の担体上に固定化されているか、前記第1の担体上に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に固定化されているか、前記第1の担体内に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に封入されているか、前記第1の担体内に部分的に封入されているか、前記第1の担体内に埋め込まれているか、前記第1の担体内に部分的に埋め込まれているか、またはそれらの組合せである、請求項168〜181のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマーを前記第1の担体から解離させることを含む、請求項168〜182のいずれか1項に記載の方法。
- 前記解離は、前記単一細胞を含む前記区画での接触後に生じる、請求項183に記載の方法。
- 前記解離は、前記単一細胞を含む前記区画での接触前に生じる、請求項183に記載の方法。
- 前記複数のアプタマーを前記複数の細胞と接触させることは、前記アプタマーを含む前記第1の担体を、前記複数のタンパク質標的を含む前記複数の細胞のうちの細胞と接触させることを含む、請求項168〜185のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1の担体は、前記細胞へと内部移行され、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより前記細胞へと内部移行されてもよい、請求項186に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された捕捉配列に相補的な配列を含む、請求項168〜187のいずれか1項に記載の方法。
- バーコードは、前記捕捉配列を含む標的結合性領域を含み、前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい、請求項188に記載の方法。
- 前記捕捉配列に相補的な前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含む、請求項188または189に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーが、前記複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの前記少なくとも1つと接触すると、前記ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、前記ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する、請求項190に記載の方法。
- 前記第1のコンフォメーションの前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの前記ポリ(dA)領域は、ヘアピン構造を構成し、前記ヘアピン構造を伴う前記ポリ(dA)領域は、前記バーコードの前記標的結合性領域の前記ポリ(dT)領域に接近可能である、請求項191に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの前記ポリ(dA)領域と前記オリゴヌクレオチドプローブの前記ポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションにより前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項190〜192のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含み、任意に、(a)前記アラインメント配列は、1もしくはそれよりも長いヌクレオチド長または2もしくはそれよりも長いヌクレオチド長であり、(b)前記アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含み、および/あるいは(c)前記アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含む、請求項190〜193のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含み、前記分子標識配列は2〜20ヌクレオチド長であってもよく、または前記ユニバーサルプライマーは5〜50ヌクレオチド長であってもよく、または両方であってもよい、請求項168〜194のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含む、請求項195に記載の方法。
- 前記複数のアプタマーを前記複数の細胞と接触させた後、前記複数の細胞と接触していないアプタマーを除去することを含む、請求項168〜196のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の細胞と接触していないアプタマーの除去は、前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含む、請求項197に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの除去は、アプタマースポンジを使用して、前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含み、前記アプタマースポンジは、前記アプタマーの配列に相補的な複数の配列を含んでいてもよい、請求項198に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーは、前記アプタマースポンジの複数の配列にハイブリダイズする、請求項199に記載の方法。
- 前記アプタマーは相補配列を含む、請求項198に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーは、互いにハイブリダイズして凝集体を形成し、前記凝集体は、前記細胞での分解の標的とされてもよい、請求項201に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの除去は、複数のアンチセンスアプタマーを使用して、前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーを除去することを含み、
前記複数のアンチセンスアプタマーの各アンチセンスアプタマーは、前記複数のタンパク質標的の対応する少なくとも1つと接触していないアプタマーの1つのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの相補配列またはその一部を含むアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含む第2のアプタマーを含み、
前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよび前記アンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、二本鎖のまたは部分的に二本鎖のデオキシリボ核酸(DNA)分子を形成する、
請求項198に記載の方法。 - 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドを、前記アプタマーから脱離させることを含む、請求項153〜203のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の細胞の分配は、前記複数のアプタマーが付随している前記複数の細胞および前記バーコーディング粒子を含む複数のバーコーディング粒子を前記複数の区画に分配することを含み、前記複数の区画のうちの前記区画は、オリゴヌクレオチドコンジュゲートアプタマーおよび前記バーコーディング粒子が付随している前記複数の細胞に由来する前記単一細胞を含む、請求項153〜204のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の標識化核酸またはそれらの一部の配列決定情報を得ることは、前記標識化核酸を1つまたは複数の反応に供して、核酸配列決定のための1セットの核酸を生成することを含む、請求項153〜205のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のタンパク質標的は、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、B細胞受容体、T細胞受容体、抗体、主要組織適合遺伝子複合体、腫瘍抗原、受容体、またはそれらの組合せを含む、請求項153〜206のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの各々は、細胞標識、ユニバーサルプライマーの結合部位、増幅アダプター、配列決定アダプター、またはそれらの組合せを含む、請求項153〜207のいずれか1項に記載の方法。
- 前記バーコーディング粒子は、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、ヒドロゲルビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはヒドロゲルビーズである、請求項153〜208のいずれか1項に記載の方法。
- 前記区画は、ウェルまたは液滴である、請求項153〜209のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数の細胞は、T細胞、B細胞、腫瘍細胞、骨髄性細胞、血液細胞、正常細胞、胎児細胞、母体細胞、またはそれらの混合物を含む、請求項153〜210のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の細胞成分結合性アプタマーを含む組成物であって、前記複数の細胞成分結合性アプタマーの各々は、前記細胞成分結合性アプタマーのための固有識別子配列を含むアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含み、前記細胞成分結合性アプタマーは、複数の細胞成分標的のうちの少なくとも1つに特異的に結合することが可能である組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよび前記アプタマーは、単一ポリヌクレオチドを形成する、請求項212に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの5’側にあるか、または前記細胞成分結合性アプタマーは、前記単一ポリヌクレオチドにおいて前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの3’側にある、請求項213に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに付随している、請求項212〜214のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに付着されている、請求項212〜215のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されている、請求項216に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに非共有結合で付着されている、請求項216に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされており、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記細胞成分結合性アプタマーにコンジュゲートされていてもよい、請求項212〜218のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記細胞成分結合性アプタマーに共有結合で付着されている、請求項212〜219のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、ヌクレオチドアプタマーを含み、前記ヌクレオチドアプタマーは、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ゼノ核酸(XNA)、フルオロフォア、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項212〜220のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ヌクレオチドアプタマーは塩基アナログを含み、前記塩基アナログは、蛍光性塩基アナログを含んでいてもよい、請求項221に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、ペプチドアプタマーを含む、請求項212または222に記載の組成物。
- 前記複数の細胞成分結合性アプタマーは、第2の細胞成分結合性アプタマーを含む、
請求項212〜223のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随している、
請求項224に記載の組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーは、第1の担体に付随しており、
前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、第2の担体に付随している、
請求項224に記載の組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、少なくとも60%、70%、80%、90%、または95%配列同一性を有する、請求項224〜226に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび第2のタンパク質結合性アプタマーは同一である、請求項224〜227のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは異なる、請求項224〜226のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーのタンパク質標的または細胞成分標的は同一である、請求項229に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーは、タンパク質標的または細胞成分標的の異なる領域に結合することが可能である、請求項229に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーおよび前記第2の細胞成分結合性アプタマーの前記タンパク質標的または前記細胞成分標的は異なる、請求項229に記載の組成物。
- 前記第1の担体は、
金属ナノ材料であって、金属ナノ構造、金属ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであってもよい金属ナノ材料、および/または
金ナノ材料であって、金ナノ構造、金ナノ粒子、もしくはそれらの組合せであってもよい金ナノ材料を含み、ならびに/または
前記第1の担体は、リソソーム、ミセル、小胞、脂質膜、脂質二重層、脂質単層、もしくはそれらの組合せを含む
請求項225〜232のいずれか1項に記載の組成物。 - 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に付着されており、前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に共有結合で付着されていてもよい、請求項225〜233のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体にコンジュゲートされており、前記細胞成分結合性アプタマーは、UV光切断可能基、ストレプトアビジン、ビオチン、アミン、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学基を介して前記第1の担体にコンジュゲートされていてもよい、請求項225〜233のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体に非共有結合で連結されている、請求項225〜235のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、リンカーを介して前記第1の担体に付随している、請求項225〜236のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞成分結合性アプタマーは、前記第1の担体上に固定化されているか、前記第1の担体上に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に固定化されているか、前記第1の担体内に部分的に固定化されているか、前記第1の担体内に封入されているか、前記第1の担体内に部分的に封入されているか、前記第1の担体内に埋め込まれているか、前記第1の担体内に部分的に埋め込まれているか、またはそれらの組合せである、請求項225〜237のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記第1の担体は、細胞へと内部移行されるように構成されており、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ナノピノサイトーシス、マイクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、膜融合、クラスリン媒介性内部移行、カベオリン媒介性内部移行、受容体依存性内部移行、受容体非依存性内部移行、またはそれらの組合せにより細胞へと内部移行されるように構成されていてもよい、請求項225〜238のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成された捕捉配列に相補的な配列を含む、請求項212〜239のいずれか1項に記載の組成物。
- バーコードは、前記捕捉配列を含む標的結合性領域を含み、前記標的結合性領域は、ポリ(dT)領域を含んでいてもよい、請求項240に記載の方法。
- 前記捕捉配列に相補的な前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの配列は、ポリ(dA)領域を含む、請求項240または241に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記アプタマーが、複数のタンパク質標的または細胞成分標的のうちの少なくとも1つと接触すると、前記ポリ(dA)領域が接近不能である第1のコンフォメーションから、前記ポリ(dA)領域が接近可能である第2のコンフォメーションへと変化する、請求項242に記載の組成物。
- 前記第1のコンフォメーションの前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの前記ポリ(dA)領域は、ヘアピン構造を構成し、前記ヘアピン構造を伴う前記ポリ(dA)領域は、前記バーコードの前記標的結合性領域の前記ポリ(dT)領域に接近可能であってもよい、請求項243に記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドプローブは、前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドの前記ポリ(dA)領域と前記オリゴヌクレオチドプローブの前記ポリ(dT)領域とのハイブリダイゼーションにより前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、請求項243〜244のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、前記ポリ(dA)領域に隣接するアラインメント配列を含み、任意に、(a)前記アラインメント配列は、1もしくはそれよりも長いヌクレオチド長または2ヌクレオチド長であり、(b)前記アラインメント配列は、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、またはそれらの組合せを含み、および/あるいは(c)前記アラインメント配列は、ポリ(dT)領域、ポリ(dG)領域、ポリ(dC)領域、ポリ(dU)領域、またはそれらの組合せを含む、請求項242〜245のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、分子標識配列、ユニバーサルプライマーの結合部位、または両方を含み、前記ユニバーサルプライマーは、増幅プライマー、配列決定プライマー、またはそれらの組合せを含んでいてもよい、請求項212〜246のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記分子標識配列は、2〜20ヌクレオチド長であるか、前記ユニバーサルプライマーは、5〜50ヌクレオチド長であるか、または両方である、請求項247に記載の組成物。
- アプタマースポンジを含み、前記アプタマースポンジは、前記アプタマーの配列に相補的な複数の配列を含んでいてもよい、請求項212〜248のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマーは相補配列を含む、請求項212〜248のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記アプタマーは、互いにハイブリダイズして凝集体を形成するように構成されており、前記凝集体は、前記細胞での分解の標的とされてもよい、請求項250に記載の組成物。
- 複数のアンチセンスアプタマーを含み、
前記複数のアンチセンスアプタマーの各アンチセンスアプタマーは、前記アプタマーの1つのアプタマー特異的オリゴヌクレオチドの相補配列またはその一部を含むアンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドを含む第2のアプタマーを含み、
前記アプタマー特異的オリゴヌクレオチドおよび前記アンチセンスアプタマー特異的オリゴヌクレオチドは、二本鎖のまたは部分的に二本鎖のデオキシリボ核酸(DNA)分子を形成する、
請求項212〜248のいずれか1項に記載の組成物。
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