JP2013503605A - マイクロアレイの選択のためのデバイス及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Verlag, Heidelberg / Berlin, Germanyから得られるか、又は、種々の温度において、例えば、4℃から120℃の温度で、好ましくは約20℃から100℃の範囲で反応を繰り返すことにより実験的に決定される。本発明に係る反応区域において、特に液体環境において設定又は調整される更なるパラメータはpHであり、これは0から14まで、例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14である。約6.5から8.5の間のpHが好ましく、より好ましくは約7.5のpHである。反応チャンバにおいて設定又は調整される他のパラメータは周囲の材料の流量、特に質量流量である。質量流量は、例えば、約0から1000μg/secまでの間、例えば、0、5、10、50、100、150、500、700、750、800又は1000μg/secである。本発明に係る反応チャンバにおいて設定又は調整される更なるパラメータは、全体の塩又はイオン濃度である。本発明によれば、当業者に既知の任意の適切な全体の塩又はイオン濃度が用いられる。例えば、全体の塩又はイオン濃度は、約0.1mMから1Mの間である。任意のパラメータが、反応区域の全域で均一に存在するか、又は1つ又はそれよりも多い勾配の形で存在する。例えば、反応区域の全域に温度勾配、pH勾配、塩濃度勾配及び/又は流速又は質量流量勾配が存在する。1つよりも多い勾配が存在する場合、それらの勾配は、同じ方向性を持っているか若しくは互いに反対である、又は代替として、種々の方向にあり、例えば、互いに垂直若しくはある角度、例えば、30°、45°、60°を持っている。上記パラメータは、更に、例えばデバイスの使用の過程の間に積極的に変更又は修正されることが可能であり、例えば、ある期間に温度が上昇又は低下する、ある期間にpHが上昇又は低下する及び/又はある期間に流速又は質量流量が上昇又は低下する。反応区域は、閉じられていてもよい、すなわち、キャップ、カバー若しくは蓋を有していてもよいし、開いていてもよい。上記反応区域は、当業者には既知の任意の適切な材料、例えば、金属、ガラス、プラスチック、例えばPMMA又はこれらの任意の誘導体若しくは組み合わせにより構成され得る。加熱/冷却素子の場合、金属材料が用いられる。
2007, Wiley-Vch又はVollhardt等によるOrganische Chemie, 2005, Wiley-Vchのような有機化学のテキストから得られる。上記固定化される捕捉分子内の上記官能基の局在化は、結合の挙動及び/又は捕捉分子の配向を制御する及び作るために用いられ、例えば、官能基は、捕捉分子の末端若しくはテール領域に配されるか、又は捕捉分子の中央に配される。固定化される捕捉分子の典型的な反応相手は、そのような捕捉分子、例えば、アミン官能基化された核酸のような核酸に結合することができる部分を有している。そのような支持体材料の例は、アルデヒド、エポキシ又はNHS基板である。そのような材料は、当業者に既知である。アミン基の導入により化学反応性の高い捕捉分子と支持体材料とのライゲーションを与える官能基は、当業者に既知である。固定化される捕捉分子の代替の反応相手は、例えば、支持体材料上で利用可能な官能基の活性化により化学的に活性化される必要がある。「活性化された支持体材料」という用語は、相互作用する又は反応性の化学官能基が当業者に既知の化学的修飾の手順により使用可能になった又は確立された材料に関係がある。例えば、カルボキシル基を有する基板は、使用する前に活性化されなければならない。また、核酸中に既に存在する特定の部分と反応する官能基を含む利用可能な基板が存在する。これらの反応には、熱又は紫外線により促進されるものもある。一例は基板の表面のアミン基であり、これはDNAの特定の塩基に結合され得る。
Verlag, Heidelberg / Berlin, Germanyのようなテキストから得られる。従って、回収された分子は、その後、更に処理又は分析される。核酸のケースでは、上記分子は、PCRにより更に増幅される及び/又は配列決定手順のために直接的に用いられる。
300μmのピッチを持つアレイ状にPBS中でオリゴヌクレオチド(ON)(19b)を印刷することによって約100マイクロメートルの径のスポットを作った。乾燥後、ONのポリA部を表面に存在するアミノ基に架橋するために紫外線放射により基板を照射し、続いて洗浄ステップを行った。レーザ切断感圧接着剤(PSA)層を用いて基板上にガラスのカバーを配した。PSAの形状は、蛇行状のチャネルが作られるように選択した。これらのデバイスは、3×6mmの領域の6つの個々に制御可能な区域及び集積温度センサを有するパターニングされたヒータデバイス上に配した。
アミノシランマイクロアレイのスライド上において、マイクロチャネル内の(6μl/分の)流れの条件の下でAtto700により標識され、0.1%SDSを加えたSSC3xバッファ中で30分間温度を制御されたPCR産物(114bp)とのハイブリダイゼーション試験を行った。ハイブリダイゼーション後、非特異的結合を低減するために0.2%SDSを伴うSSCバッファ中でマイクロチャネルを5時間洗浄した。共焦点スキャナによって捕捉スポット及び参照スポット上の蛍光強度を測定し、捕捉スポットからのシグナルをバックグラウンド除去して、参照スポットの強度に標準化した。
(A)この実験の設定では、試料は、50℃に保持されて入り口からハイブリダイゼーションステップまで100μmのチャネル内を流れ、90℃の変性区域中を流れた後、試料は第2のハイブリダイゼーション区域に導入され、ここで、高効率で50℃においてハイブリダイゼーションが生じ、最後に出口を通って出る。
(B)グラフは、(A)の捕捉スポットの上部の行のことを指しており、蛍光シグナルは、まとめられた変性が生じてハイブリダイゼーションが生じると、100倍増えている。
(C)ハイブリダイゼーションチャネルデバイス内でまとめられた変性により得られたハイブリダイゼーションの効率の向上は、90℃で10分の外部における変性ステップの後、デバイスに注入される試料により生成されたハイブリダイゼーションシグナルと比較して150%蛍光シグナル強度を増加させている。
Claims (15)
- (a)1つ又はそれよりも多い種類の捕捉分子が固定化された基板を有するマイクロアレイを有する少なくとも1つの反応区域であって、反応区域内の温度を制御及び/又は調節する1つ又はそれよりも多い温度制御及び/又は調節ユニットを更に有する当該反応区域と、
(b)非反応区域内の温度を制御及び/又は調節する1つ又はそれよりも多い温度制御及び/又は調節ユニットを有する少なくとも1つの非反応区域であって、前記反応区域と流体接続している当該非反応区域と、
(c)前記反応区域と1つ又はそれよりも多い温度制御及び/又は調節ユニットを有する前記非反応区域との間の流体の流れを発生させる及び/又は調節することができる少なくとも1つの輸送手段と
を有する、標的分子の特異的選択のためのデバイス。 - 前記非反応区域内の温度を制御及び/又は調節する前記温度制御及び/又は調節ユニットが、前記非反応区域内に組み込まれた、請求項1記載のデバイス。
- 前記反応区域、前記非反応区域及び前記輸送手段が、閉ループで設けられた、請求項1又は2記載のデバイス。
- 前記閉ループが、前記反応区域と前記非反応区域との間の流体の連続的なやり取りを可能にする、請求項3記載のデバイス。
- 混合手段を追加として有し、好ましくは前記反応区域と前記非反応区域との間の流体接続の領域内に有する、請求項1ないし4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 蛇行流路を有する、請求項1ないし5のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記反応区域が、前記捕捉分子との核酸のハイブリダイゼーションを可能にすることができるハイブリダイジング区域である、請求項1ないし6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 温度制御及び/又は調節ユニットを有する前記非反応区域が、核酸の変性を仲介することができる変性区域である、請求項1ないし7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記固定化された捕捉分子が、スポット、細長いスポット及び/又はラインの形態で前記マイクロアレイに設けられた、請求項1ないし8のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記ラインが、流路に対して約20°から90°の間の角度で配された、請求項9記載のデバイス。
- 前記ラインが、約300nmから30μmの間の幅を有する及び/又は約500nmないし100μmのライン間の距離に配された、請求項9又は10記載のデバイス。
- 前記捕捉分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、糖鎖及び/又はその類似体を有する群から選択された分子である、請求項1ないし11のいずれか一項に記載のデバイス。
- 標的分子を特異的に選択する方法であって、
(a)請求項1ないし12のいずれか一項に記載のデバイスの区域に1つ又はそれよりも多い標的分子を含む媒体を導入するステップと、
(b)反応区域において前記標的分子と固定化された捕捉分子との相互作用反応を行うステップと、
(c)相互作用していない又は結合していない標的分子を1つ又はそれよりも多い温度制御及び/又は調節ユニットを有する非反応区域に輸送するステップと、
(d)1つ又はそれよりも多い温度制御及び/又は調節ユニットを有する前記非反応区域において前記標的分子を再活性化するステップと、
(e)再活性化された標的分子を前記反応区域に輸送するステップであって、従って、ステップ(b)に従う前記標的分子と固定化された捕捉分子との更なる相互作用を可能にする当該ステップと
を有する、当該方法。 - ステップ(b)ないし(e)が、少なくとも2回繰り返される請求項13記載の方法。
- 標的分子を特異的に選択するための請求項1ないし12のいずれか一項に記載のデバイスの使用。
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