KR102018934B1

KR102018934B1 - 핵산의 검출 방법

Info

Publication number: KR102018934B1
Application number: KR1020147025486A
Authority: KR
Inventors: 요지 우에다; 후미오 나카무라
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2012-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2019-09-06
Also published as: CA2865541C; KR20140131960A; CA2865541A1; EP2843047A1; JPWO2013129457A1; EP2843047B1; CN104136611B; EP2843047A4; JP6206181B2; US20150045249A1; WO2013129457A1; CN104136611A

Abstract

핵산 증폭이나 증감 기술을 이용하지 않고, 샌드위치 혼성화로 표적 핵산을 검출하는 경우에도 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 핵산의 검출 방법이 개시되어 있다. 표적 핵산의 검출 방법은 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시켜, 포착 프로브와 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 혼성화시키고, 또한 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 복수의 검출 프로브를 혼성화시켜, 그로 의해, 복수의 검출 프로브를 포착 프로브와 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 통해 지지체에 결합시키는 공정과, 다음으로, 지지체에 결합된 복수의 검출 프로브를 검출하는 공정을 포함한다.

Description

핵산의 검출 방법{NUCLEIC ACID DETECTION METHOD}

본 발명은 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.

각종 생물에 관한 유전 정보 해석의 연구가 시작되었고, 인간 유전자를 비롯하여, 다수의 유전자와 그의 염기 서열, 또한 유전자 서열에 코드화되는 단백질 및 이들 단백질로부터 이차적으로 만들어지는 당쇄에 관한 정보가 급속히 밝혀지는 추세에 있다. 서열이 밝혀진 유전자, 단백질, 당쇄 등과 같은 고분자체의 기능에 대해서는 각종 방법으로 조사할 수 있다. 주된 것으로는 핵산에 대해서는 노던 블로팅, 또는 서던 블로팅과 같은, 각종 핵산/핵산 간의 상보성을 이용하여 각종 유전자와 그의 생체 기능 발현과의 관계를 조사할 수 있다. 단백질에 대해서는 웨스턴 블로팅으로 대표되는 바와 같은, 단백질/단백질 간의 반응을 이용하여 단백질의 기능 및 발현에 대해서 조사할 수 있다.

핵산 검출 방법의 하나로서 샌드위치 혼성화법이 알려져 있다. 샌드위치 혼성화법은 필터 상에 고정된 포착 프로브를 사용한다. 포착 프로브는 표적 핵산의 제1 부분에 상보적이다. 하나의 단계에서, 필터에 결합한 포착 프로브를 표적 핵산 서열에 대해서 조사해야되는 시료에 폭로하고, 또한 표적 핵산의 제2 부분에 상보적인 표지가 달린 검출 프로브에 폭로하는데, 상술한 제2 부분은 제1 프로브가 상보적인 표적 부분과는 별도(즉, 이들과 중복하지 않음)이다(특허문헌 1, 2, 비특허문헌 1). 이 방법은 필터 상에 시료를 고정화하는 데 요구되는 수고를 해소하고, 또한 제1 프로브를 지지체에 적합하도록 선택할 수 있다.

미국 특허 제4,486,539호 일본 특허 공개 (평)7-75600호 공보 특허 공표 (평)9-507121호 공보 WO 99/47705

Sinikka Parkkinen et al., Journal of Medical Virology 20: 279-288(1986)

샌드위치 혼성화법에는 사전에 검체를 PCR법 등의 핵산 증폭 기술을 이용하여 증폭 후에 검출하는 것이 일반적으로 행해지고 있다. 표적 핵산을 증폭함으로써 검출 감도는 증강되지만, 한편으로, 혼입한 이물 DNA도 증폭해 버리기 때문에 의양성 문제가 생기고, 또한 복수의 유전자를 동시에 검출하는 경우에는 유전자 수에 따른 프라이머 세트가 필요해 지고, 그의 품질 관리에 많은 노동력을 필요로 하였다.

한편, PCR법으로 표적 핵산을 증폭하지 않고, 검출하는 방법도 다수 검토가 이루어지고 있다. 표적 핵산을 포착 프로브에 혼성화한 후에, 표지체 또는 태그 서열을 토대로 하여, 다수의 발광체 또는 형광체를 받아들이는 등의 증감 기술이 고안되어 있지만, 특수한 효소나 복잡한 반응, 또는 특수한 지지체(광평면 도파로 등)나 특수한 발광체(소실성 여기 발광)에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하는 라벨이 필요했다(특허문헌 4).

본 발명의 목적은 핵산 증폭이나 증감 기술을 이용하지 않고, 샌드위치 혼성화로 표적 핵산을 검출하는 경우에도 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 핵산의 검출 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구한 결과, 샌드위치 혼성화에 있어서, 표적 핵산이 다른 영역과 각각 혼성화하는 복수의 검출 프로브를 동시에 혼성화시킴으로써, 핵산 증폭이나 증감 기술을 이용하지 않더라도 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.

(1) 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시켜, 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 혼성화시키고, 또한 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 상기 복수의 검출 프로브를 혼성화시키고, 그로 의해, 상기 복수의 검출 프로브를 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 통해 상기 지지체에 결합시키는 공정과,

지지체에 결합된 상기 복수의 검출 프로브를 검출하는 공정을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법.

(2) 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시키는 공정은, 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 복수의 검출 프로브와 혼성화시키고, 이어서 상기 복수의 검출 프로브와 혼성화한 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 상기 포착 프로브를 혼성화시킴으로써 축차적으로 행해지는, (1)에 기재된 방법.

(3) 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물의, 핵산 길이의 최빈치(最頻値)가 100염기 내지 1500염기의 범위인, (1) 또는 (2)에 기재된 방법.

(4) 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물에서의 포착 프로브 결합 위치로부터의 거리가 1500염기의 범위 내에 복수의 검출 프로브를 혼성화시키는, (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(5) 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물에서의 포착 프로브 결합 위치로부터의 거리가 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물의 핵산 길이의 최빈치 이하의 범위로 복수의 검출 프로브를 혼성화시키는, (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(6) 핵산 길이의 최빈치가 100염기 내지 1500염기의 범위에 포함되도록 표적 핵산을 단편화 처리한 표적 핵산의 단편화 처리물을 상기 포착 프로브와 혼성화시키는, (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(7) 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물이 핵산 증폭법에 의한 증폭을 거치지 않는 것인, (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(8) 상기 표적 핵산을 포함하는 인간 유래의 검체를 상기 검출 방법에 제공하고, 상기 검출 방법은 인간 게놈 중에 존재하는 적어도 1종의 반복 서열을 내부표준으로서 검출하는 공정을 추가로 포함하며, 상기 반복 서열은 인간 게놈 단편 중에 포함되는, (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 방법.

(9) 인간 게놈을 단편화하는 공정을 추가로 포함하며, 상기 반복 서열은 단편화된 인간 게놈 중에 포함되는, (8)에 기재된 방법.

(10) 상기 반복 서열이 단분산형 핵내 반복 서열인, (8) 또는 (9)에 기재된 방법.

(11) 상기 단분산형 핵내 반복 서열이 Alu 서열인, 청구항 (10)에 기재된 방법.

본 발명에 따르면, PCR법과 같은 핵산 증폭, 또는 증감 기술을 이용하지 않더라도 고감도로 핵산 검출을 행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법 원리를 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 핵산 길이 분석의 예를 도시하는 도이다.
도 3은 실시예 1에서의 포착 프로브 및 검출 프로브의 위치를 개념적으로 도시한 도면이다.
도 4는 실시예 2에서의 포착 프로브 및 검출 프로브의 위치를 개념적으로 도시한 도면이다.
도 5는 변이 해석에서의 샌드위치 혼성화에 관한 개념도이다.
도 6은 실시예 3 및 실시예 4에서의, k-ras 변이 포착 프로브 및 검출 프로브의 위치를 개념적으로 도시한 도면이다.
도 7은 실시예 3 및 실시예 4에서의, EGFR 변이 포착 프로브 및 검출 프로브의 위치를 개념적으로 도시한 도면이다.
도 8은 내부 표준으로서 인간 유래의 검체 중에 포함되는 인간 게놈 중의 Alu 서열을 이용하여 본 발명의 방법을 행하는 실시 형태를 모식적으로 도시한 도면이다.

본 발명의 검출 방법에 제공되는 표적 핵산으로서는, 예를 들면, 병원균이나 바이러스 등의 유전자나, 유전병의 원인 유전자 등 및 그의 일부분 등을 예로 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 표적 핵산을 포함하는 검체로서는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 변, 수액, 타액, 면봉 채취액, 각종 조직액 등의 체액이나, 각종 조직, 파라핀 포매 검체(FFPE) 및 그의 세그먼트, 각종 음식물 및 이들의 희석물 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 피검 물질이 되는 표적 핵산은 혈액이나 세포로부터 통상의 방법에 의해 추출한 검체 핵산일 수도 있고, 검체로부터 추출한 DNA나 RNA 등을 사용할 수 있다. DNA로는 염색체 DNA, 바이러스 DNA, 세균, 곰팡이 등의 DNA, RNA를 역전사한 cDNA, 이들의 일부인 단편 등을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. RNA로는 메신저 RNA, 리보솜 RNA, small RNA나 이들의 일부인 단편 등을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 화학적으로 합성한 DNA, 또는 RNA 등도 표적 핵산으로서 사용할 수 있다.

검체 핵산에는 측정 대상으로 하는 표적 핵산 이외의 핵산 성분(비표적 핵산)도 포함되어 있는 경우가 있다. 이들 비표적 핵산은 표적 핵산과의 성상 차를 고려하여 제거할 수도 있고, 제거하지 않고 피검 물질로서 사용할 수도 있다.

표적 핵산은 이 표적 핵산을 주형으로서 PCR 등의 핵산 증폭법에 의해서 증폭한 것일 수도 있고, 측정 감도를 대폭 향상시키는 것이 가능하다. 핵산 증폭 산물을 표적 핵산으로 하는 경우에는 형광 물질 등으로 표지한 뉴클레옥시드 삼인산의 존재 하에서 증폭을 행함으로써, 증폭 핵산을 표지하는 것이 가능하다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따르면, 핵산 증폭법을 이용하지 않더라도 충분한 감도로 표적 핵산의 검출을 행할 수 있고, 또한 핵산 증폭법을 이용하면, 의양성 문제나 조작에 시간이 걸리는 등의 문제가 생기기 때문에, 본 발명은 핵산 증폭법에 의한 증폭을 거치지 않은 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물에 적용되는 경우에 특히 위력을 발휘하는 것이다.

본 발명의 방법은 표적 핵산의 유무, 바이러스의 유전자형, 세균 종 및 세균주, 곰팡이 종 및 곰팡이 주 등을 구별한 검출, SNP(일염기다형)의 검출, 메신저 RNA의 검출, miRNA의 검출, CGH, 복사 수의 변동, 게놈 DNA 서열의 누락·중복·융합, 또는 전사 산물의 누락·중복·융합의 검출에 사용할 수 있다. 또한, 검출 프로브로부터의 신호 강도를 측정함으로써 표적 핵산의 정량에도 적용할 수 있다. 또한, 표적 핵산의 정량을 행하면, 필연적으로 표적 핵산의 검출이 이루어지게 되기 때문에, 본 발명의 「검출 방법」은 정량을 수반하는 경우도 포함한다.

본 발명의 방법에는 표적 핵산을 그대로 적용하는 것도 가능하고, 표적 핵산의 단편화 처리물을 적용하는 것도 가능하다. 더욱이, 표적 핵산이 긴 경우(1500염기 이상, 특히 4000염기 이상의 경우)에는 단편화 처리에 의해, 후술하는 바와 같이 적절한 길이로 단편화한 단편화 처리물을 적용하는 것이 바람직하다. 단편화 처리물은 생성된 핵산 단편으로부터 특정한 핵산 단편을 선택할 필요는 없고, 단편화 처리물을 그대로 본 발명의 방법에 제공할 수 있고, 그에 의해 검출 감도를 높이는 것이 가능하다.

단편화를 위해 표적 핵산을 절단하는 방법으로서는 초음파를 조사하여 절단하는 방법, 효소로 절단하는 방법, 제한 효소로 절단하는 방법, 네뷸라이저를 이용하는 방법, 산이나 알칼리로 절단하는 방법 등을 사용할 수 있다. 초음파로 절단하는 방법의 경우, 표적 핵산에 조사하는 초음파의 출력 강도와 조사 시간을 제어함으로써, 원하는 길이로 절단하는 것이 가능하다.

처리한 표적 핵산은 이하에 기술하는 전기영동법 등의 분석 수단을 이용하여 단편화의 정도를 분석할 수 있다. 분석한 결과, 초음파 처리가 불충분하면, 초음파 처리를 추가로 실시하여, 원하는 조건의 표적 핵산이 얻어질 때까지 처리를 행할 수 있다. 초음파 처리 장치의 예로서, 어쿠스틱스 솔루빌라이져(acoustics solubilizer)(코배리스(Covaris)사 제조), 바이오럽터(Bioruptor)-(토쇼덴끼(東湘電氣) 제조), 초음파식 분쇄기(다이테크사, VP-050) 등을 예시할 수 있다. 코배리스사의 어쿠스틱스 솔루빌라이져 S 220은 Duty Factor, Peak incident power, Cycles per burst, time의 4개의 매개변수를 설정함으로써 원하는 길이까지 절단할 수 있다. 핵산 길이의 최빈치를 400염기로 하고자 하는 경우에는, Duty Factor를 10％, Peak incident power를 140, Cycles per burst를 200, time을 55로 설정하면 된다. 그 밖의 길이로 절단하고자 할 때에는 코배리스사의 권장 설정에 따르면 된다.

효소로 절단하는 방법으로서, dSDNAshearase(자이모 리서치(ZYMO RESEARCH)사)나 제한 효소 등을 사용하여, 가온 시간의 가감에 의해 원하는 길이의 핵산 단편을 얻을 수 있다. 일례로서, dSDNAshearase를 사용하는 경우에는 메이커 권장의 가온 시간에 따르면 된다. 예를 들면, 핵산 길이의 최빈치를 300염기로 하고 싶은 경우에는, 37℃에서 40분간 인큐베이션하면 된다고 되어 있다. 그 밖의 DNA 절단 방법에 대해서도 마찬가지로, 처리 조건을 가감함으로써 절단 단편의 길이를 제어할 수 있다.

단편화 처리한 표적 핵산은 핵산 길이의 최빈치를 지표로 평가할 수 있다. 핵산 길이의 최빈치란, 단편화한 핵산을 아가로스겔 전기영동이나 바이오분석기(애질런트사, DNA7500키트, RNA6000nano 키트)라는 전기영동법을 이용하여 얻어지는 피크톱값을 가리킨다. 전기영동한 결과를 일렉트로페로그람으로 표시하고, 파형이 가장 높은 위치를 피크톱으로 하여, 피크톱에서 내린 수선과 x축이 이루는 교점의 값을 핵산 길이의 최빈치라 정의한다. 핵산 길이의 분석 방법은 특허 제4619202호 등을 참조할 수 있다. 아가로스겔 전기영동으로 분석하는 경우에는 DNA 래더(다카라바이오사 모델 번호: 3415A 등)를 동시에 영동하고, 그의 이동도를 지표로, 절단 단편의 피크톱을 측정할 수 있다. 도 2A는 래더 마커로 절단한 핵산의 아가로스겔 전기영동 상이다. 이 화상을 NIH Image(NIH)와 같은 화상 처리 소프트를 사용하여, 휘도를 파형으로 표시시킨다. 이때, 래더 마커마다 전기영동의 원점으로부터의 거리를 구한다. 절단한 핵산의 경우에는 피크톱, 즉 가장 휘도가 높은 부분까지의 거리를 구한다. 래더 마커로부터 얻어진 거리를 바탕으로, 도 2C에 나타낸 바와 같은 검량선과 회귀식이 얻어진다. 회귀식에 거리 Y를 대입함으로써 절단한 표적 핵산의 최빈치를 구할 수 있다. 이상과 같이 하여 분석하면, 도 2에서 사용한 절단한 표적 핵산의 핵산 길이의 최빈치는 158염기가 된다.

파형의 형상은 어떠하더라도 상관없지만, 넓은 것보다 날카로운 쪽이 보다 바람직한 결과를 가져온다.

상기한 여러 가지 방법에 의해서, 원하는 핵산 길이의 최빈치를 갖는 절단 단편을 얻을 수 있다. 핵산 길이의 최빈치에 대한 바람직한 범위는 100염기 내지 1500염기 사이이다. 보다 바람직한 범위는 250염기 내지 500염기이다.

비표적 핵산이 혼입한 피검 물질을 이용하는 경우에 있어서도, 상기와 같이 단편화 처리를 하여, 핵산 길이의 최빈치를 평가할 수 있다.

지지체는 슬라이드 유리나 막질, 비드 등을 사용할 수 있다. 지지체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 유리, 세라믹, 실리콘 등의 무기 재료, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 아세트산셀룰로오스, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 실리콘 고무 등의 중합체 등을 들 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 따르면, 종래부터 이 분야에서 상용되고 있는 지지체를 이용하는 것이 가능하고, 광평면 도파로와 같은 특수한 지지체를 사용할 필요는 없다. 비용면이나 번잡성을 회피하는 관점에서, 지지체는 광평면 도파로가 아닌 것이 바람직하다.

포착 프로브란, 피검 시료에 포함되는 표적 핵산과 직접적으로, 선택적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서는, 구체적으로 DNA, RNA, PNA, LNA(Locked Nucleic Acid) 등의 핵산 유도체를 사용할 수 있다. 여기서 유도체란, 핵산의 경우, 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면, 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자에의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등의 화학 수식 유도체를 의미한다.

특정한 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산은 상기 염기 서열 또는 그의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산과 선택적으로 혼성화하여 결합하기 때문에, 본 발명에서 말하는 포착 프로브에 해당한다. 본 발명에 사용하는 포착 프로브는 시판되고 있는 것일 수도 있고, 또한 생세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 포착 프로브로서, 특히 바람직한 것은 핵산이다. 이 핵산 중에서도, 올리고핵산이라고 불리는 길이가 200염기까지의 핵산은 합성기로 용이하게 인공적으로 합성이 가능하다.

포착 프로브는 표적 핵산 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있으면 되고, 어떤 영역을 선택하더라도 된다. 이하에서 기술하는 검출 프로브의 서열과 중복하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 표적 핵산이 다른 영역과 혼성화하는 복수 종류의 포착 프로브를 이용할 수도 있다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따르면, 포착 프로브는 1 종류라도 만족할 수 있는 검출 감도가 얻어지기 때문에, 포착 프로브는 각 표적 핵산에 대하여 1종류인 것이 단순하여 바람직하다.

표적 핵산이 2본쇄 DNA 인 경우, 와트슨 쇄(센스 쇄), 클릭 쇄(안티센스 쇄) 중 어느 쇄에 대하여 상보적인 서열을 포착 프로브로서 선택할 수 있다. 이하에서 기술하는 검출 프로브와 포착 프로브는 동일 쇄의 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

검체 핵산에 포함되는 다른 표적 핵산을 구별하여 검출하는 경우에는 예를 들면, 환자에게 감염된 바이러스의 형을 구별하여 검출하는 등, 검체 핵산에 포함될 수 있는 핵산 서열 중에서 특이성이 높은 서열 영역을 선택하는 것이 바람직하다. 즉, 포착 프로브로서 선택한 서열이 검체 핵산에 포함되는 모든 서열에 있어서, 해당 영역 이외에 상동성이 높은 서열이 없는 것을 의미한다.

일염기다형의 검출에 이용할 수 있는 포착 프로브의 설계에 대해서, 특허문헌 3에서 제안되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 변이가 의심되는 염기를, 포착 프로브의 중앙에 배치하고, 그의 전후로 10염기를 부가하여, 전체 길이 21염기의 포착 프로브로 한다. 변이가 의심되는 염기 부분에 A를 배치한 포착 프로브와, 변이가 의심되는 염기 부분에 T를 배치한 포착 프로브와, 변이가 의심되는 염기 부분에 G를 배치한 포착 프로브와, 변이가 의심되는 염기 부분에 C를 배치한 포착 프로브를 포착 프로브 세트로서 사용할 수 있다(도 5). 또한, 복수의 SNP를 검출하는 경우에 있어서는 포착 프로브 세트 사이에서 Tm값이 가깝게 되는 바와 같은 서열을 선택하는 것이 보다 바람직하다. 포착 프로브 서열의 길이를 조정하는, LNA 등의 인공 핵산을 사용하는 방법을 이용할 수 있다.

상동성(％)은 해당 분야에서 관용의 호몰로지 검색 프로그램(예를 들면, BLAST, FASTA 등)을 초기 설정으로 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 별도의 국면에서는 상동성(％)은 해당 분야에서 공지된 임의의 알고리즘, 예를 들면, Needleman 등(1970)(J.Mol.Biol.48: 444-453), Myers 및 Miller(CABIOS, 1988, 4: 11-17)의 알고리즘 등을 사용하여 결정할 수 있다. Needleman 등의 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(software package)(www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 삽입되어 있고, 상동성(％)은, 예를 들면 BLOSUM 62 matrix 또는 PAM250 matrix, 및 gap weight: 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 length weight: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 것을 사용함으로써 결정할 수 있다. 또한, Myers 및 Miller의 알고리즘은 GCG 서열 얼라인먼트 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램에 삽입되어 있다.

검출 프로브란, 피검 시료에 포함되는 표적 핵산과 직접적으로 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 표적 핵산을 검출하는 방법에 있어서는 구체적으로는 DNA, RNA, PNA, LNA(Locked Nucleic Acid) 등의 핵산 유도체를 사용할 수 있다. 여기서 유도체란, 핵산의 경우, 형광단 등에 의한 라벨화 유도체, 수식 뉴클레오티드(예를 들면, 할로겐, 메틸 등의 알킬, 메톡시 등의 알콕시, 티오, 카르복시메틸 등의 기를 포함하는 뉴클레오티드 및 염기의 재구성, 이중 결합의 포화, 탈아미노화, 산소 분자의 황 분자에의 치환 등을 받은 뉴클레오티드 등)를 포함하는 유도체 등의 화학 수식 유도체를 의미한다.

특정한 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산은 상기 염기 서열 또는 그의 일부와 상보적인 염기 서열을 갖는 1본쇄 핵산과 선택적으로 혼성화하여 결합하기 때문에, 본 발명에서 말하는 검출 프로브에 해당한다. 본 발명에 사용하는 검출 프로브는 시판되고 있는 것일 수도 있고, 또한 생세포 등으로부터 얻어진 것일 수도 있다. 검출 프로브로서, 특히 바람직한 것은 핵산이다. 이 핵산 중에서도, 올리고핵산이라고 불리는, 길이가 200염기까지의 핵산은 합성기로 용이하게 인공적으로 합성이 가능하다.

표적 핵산이 2본쇄 DNA인 경우, 와트슨 쇄, 클릭 쇄 중 어느 쇄에 대하여 상보적인 서열을 검출 프로브로서 선택할 수 있다. 상술한 포착 프로브와 검출 프로브는 동일 쇄의 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

검출 프로브는 표적 핵산 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있으면 되고, 어떤 영역을 선택하더라도 된다. 다만, 상술한 포착 프로브의 서열과 중복하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 포착 프로브 설계 위치에서 1500염기 이내의 범위를 갖는 서열을 선택하는 것이 바람직하다.

검출 프로브의 서열은 포착 프로브와 상동성이 낮은 것이 바람직하고, 상동성이 80％ 이하가 되는 것이 바람직한데, 혼성화 시의 엄격함을 감안하여 결정할 수 있다.

혼성화 시의 엄격함은 온도, 염 농도, 프로브의 쇄길이, 프로브의 뉴클레오티드 서열의 GC 함량 및 혼성화 완충액 내의 카오트로픽제의 농도 함수인 것이 알려져 있다. 엄격한 조건으로서는 예를 들면, Sambrook, J. et al.(1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 기재된 조건 등을 사용할 수 있다. 엄격한 온도 조건은 약 30℃ 이상이다. 그 밖의 조건으로서는 혼성화 시간, 세정제(예를 들면, SDS)의 농도, 및 캐리어 DNA의 존부 등이고, 이들 조건을 조합함으로써, 여러 가지 엄격함을 설정할 수 있다. 당업자는 원하는 표적 핵산의 검출을 위해 준비한 포착 프로브, 및 검출 프로브로서의 기능을 얻기 위한 조건을 적절하게 결정할 수 있다.

검체 핵산에 포함되는, 복수 종류의 표적 핵산을 검출하는 경우, 검출 대상의 표적 핵산 사이에서 상동성이 100％ 인 서열을, 공통 검출 프로브로서 사용할 수 있다. 공통 검출 프로브는 검출 대상의 표적 핵산 사이에서 상동성이 100％가 아닌 경우, 축중 서열을 사용할 수도 있다. 축중 서열에 대해서는 「바이오 실험 일러스트레이티드 정말로 늘어나는 PCR」, (1999년), 나카야마 히로키 편, (주)슈쥰샤 발행, 121페이지 내지 125페이지를 참고로 할 수 있다.

검출 프로브에는 표지체를 결합시킬 수 있다. 검출 프로브가 핵산인 경우, 5' 말단 또는 3' 말단 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 표지체를 결합시킬 수 있다. 또한, 검출 프로브 내부에도 표지체를 도입하는 것이 가능하다. 표지체의 결합에는 화학 반응, 효소 반응 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 화학 반응을 이용하여 반응시킨다. 더욱 바람직하게는, 검출 프로브를 화학 합성할 때에, 말단에 표지체를 결합시킨다. 검출 프로브의 내부에도 표지체를 결합시킬 수 있다. 표지체의 결합에는 화학 반응을 사용할 수 있고, 합성기로 비오틴 표지를 삽입할 수 있다. Biotin-TEG, Biotin-ON, Biotin-dT 등을 삽입할 수 있다(https://www.operon.jp/index.php).

본 발명에서 사용할 수 있는 표지체로서는 단백질 결합성 물질, 형광 색소, 인광 색소, 방사선 동위체 등, 표지에 사용하는 공지된 물질을 사용할 수 있다. 바람직한 것은 단백질 결합성 물질이다. 단백질 결합성 물질의 예로서 비오틴을 들 수 있다. 비오틴은 아비딘 또는 스트렙토아비딘과 결합할 수 있다. 아비딘 또는 스트렙토아비딘에 형광 색소가 결합한 것, 알칼리포스파타아제나 호스래디쉬 퍼옥시다아제 등의 효소가 결합한 것을 사용할 수 있다. 알칼리포스파타아제나 호스래디쉬 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 각각의 기질을 첨가하고, 기질과 효소가 반응한 결과, 발광 반응이 생긴다. 발광 반응은 플레이트 리더나 CCD 카메라 등을 이용하여 검출한다.

또한, 이와 같이, 본 발명에 따르면, 종래부터 이 분야에서 상용되고 있는 표지를 이용하는 것이 가능하고, 소실성 여기 발광에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하는 라벨과 같은 특수한 표지를 이용할 필요는 없다. 비용면이나 번잡성을 회피하는 관점에서, 표지는 소실성 여기 발광에 의해 검출 가능한 시그널을 제공하는 라벨이 아닌 것이 바람직하다.

표지체로서, 측정이 간편하고, 신호가 검출하기 쉬운 형광 색소를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, 시아닌(시아닌2), 아미노메틸쿠마린, 플루오로세인, 인도카르보시아닌(시아닌3), 시아닌3.5, 테트라메틸로다민, 로다민레드, 텍사스레드, 인도카르보시아닌(시아닌5), 시아닌5.5, 시아닌7, 오이스터, BODIPY계 색소, 피코에리스린 등의 공지된 형광 색소를 들 수 있다.

또한, 표지체로서 발광성을 갖는 반도체 미립자를 사용할 수도 있다. 이러한 반도체 미립자로서는 예를 들면, 카드뮴셀레늄(CdSe), 카드뮴텔루륨(CdTe), 인듐갈륨인(InGaP), 카르코파이라이트계 미립자, 실리콘(Si) 등을 들 수 있다. 형광 색소의 검출은 형광 현미경이나 형광 스캐너 등에 의해 행할 수 있다.

검출된 시그널은 주변 노이즈와 비교된다. 구체적으로는 포착 프로브가 고정되어 있는 위치에서 얻어진 시그널값과, 그 이외의 위치에서 얻어진 시그널값을 비교하여, 전자의 수치가 상회하고 있는 경우를 검출되었다고 한다.

지지체에 포착 프로브를 고정화하는 방법으로서는 지지체 상면부에서 올리고 DNA를 합성하는 방법과, 미리 합성하여 놓은 올리고 DNA를 지지체 상면부에 적하하여 고정하는 방법이 알려져 있다. 전자의 방법에는 Ronald 등의 방법(미국 특허 제5705610호 명세서), Michel 등의 방법(미국 특허 제6142266호 명세서), Francesco 등의 방법(미국 특허 제7037659호 명세서)이 있다. 이들 방법으로서는 DNA 합성 반응시에 유기 용매를 사용하기 때문에, 담체는 유기 용매에 내성이 있는 재질인 것이 바람직하다. 예를 들면, 특허 공표 (평)10-503841호 공보에 기재된 방법을 이용하여 제작한 요철 구조를 가진 유리 담체를 사용할 수 있다. 특히 Francesco 등의 방법에 있어서는 담체의 이면에서 광을 조사하여, DNA 합성을 제어하기 때문에, 담체는 투광성을 갖는 재질인 것이 바람직하다. 후자의 방법에는 히로다 등(특허 제3922454호)의 방법이나 유리 모세관을 사용할 수 있다. 유리 모세관의 일례로서는 자작한 유리 모세관이나 마이크로피펫((주)마이크로서포트사 제조; MP-005) 등의 시판 제품을 사용할 수 있지만, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다.

생세포로부터의 DNA 또는 RNA의 제조는 공지된 방법, 예를 들면, DNA의 추출에 대해서는 Blin 등의 방법(Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)) 등에 의해, 또한 RNA의 추출에 대해서는 Favaloro 등의 방법(Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)) 등에 의해 행할 수 있다. 고정화하는 핵산으로서는 또한 쇄상 또는 환상의 플라스미드 DNA나 염색체 DNA, 이들을 제한 효소에 의해 또는 화학적으로 절단한 DNA 단편, 시험관 내에서 효소 등에 의해 합성된 DNA, 또는 화학 합성한 올리고뉴클레오티드 등을 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 샌드위치 혼성화이기 때문에, 기본적인 조작 자체는 공지된 샌드위치 혼성화와 동일하다. 즉, 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시켜, 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 혼성화시키고, 또한 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 상기 복수의 검출 프로브를 혼성화시키고, 그로 의해, 상기 복수의 검출 프로브를, 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 통해 상기 지지체에 결합시키고, 이어서 지지체에 결합된 상기 복수의 검출 프로브를 검출하다. 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시키는 공정은 (1) 우선 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브를 접촉시켜 혼성화시키고, 다음으로, 복수의 검출 프로브와 혼성화한 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 지지체 상에 고정화된 포착 프로브와 접촉시켜 혼성화시킬 수도 있고, (2) 반대로, 우선 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 지지체 상에 고정화된 포착 프로브와 접촉시켜 혼성화시키고, 다음으로 포착 프로브와 혼성화한 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 복수의 검출 프로브를 접촉시켜 혼성화시킬 수도 있고, (3) 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 동시에 접촉시켜 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 혼성화시키고, 또한 상기 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물과 상기 복수의 검출 프로브를 혼성화시킬 수도 있다. 이들 중에서, 상기 (1)의 방법에 의해 축차적으로 접촉시키는 방법이 검출 감도가 높아지는 경우가 많기 때문에 바람직하다.

각 혼성화 공정은 종래와 마찬가지로 행할 수 있다. 반응 온도 및 시간은 혼성화시키는 핵산의 쇄 길이에 따라서 적절하게 선택되지만, 핵산의 혼성화의 경우, 통상 30℃ 내지 70℃ 정도로 1분간 내지 십수 시간, 면역 반응의 경우에는, 통상 실온 내지 40℃ 정도로 1분간 내지 수시간 정도이다.

도 1을 이용하여 본 발명의 개념을 설명한다. 예로서, 전체 길이로 3000염기가 있는 표적 핵산을 사용하여 검출하는 것으로 한다.

포착 프로브는 표적 핵산의 어떤 부분에 설계해도 되지만, 이 예에서는 표적 핵산의 선두로부터 2200번째 염기 내지 2230번째 염기까지를 포착 프로브가 결합하는 서열로서 사용하였다. 검출 프로브는 포착 프로브가 결합하는 영역에서 1500염기의 범위에 포함되는 영역에 4개를 설계하였다. 각 검출 프로브와 서열 영역은 다음과 같다. 검출 프로브 1: 2000염기 내지 2019번째 염기, 검출 프로브 2: 2100번째 염기 내지 2119번째 염기, 검출 프로브 3: 2319번째 염기 내지 2330번째 염기, 검출 프로브 4: 2419번째 염기 내지 2430번째 염기.

포착 프로브로부터의 거리는 표적 핵산 서열상에 포착 프로브 결합 위치 및 검출 프로브 결합 위치를 배치하여, 가장 먼 염기를 단부로서 그 사이의 염기 수를 센다. 도 1B의 예를 이용하여 설명한다. 검출 프로브 2: 2100번째 염기 내지 2119번째 염기와, 포착 프로브: 2200염기 내지 2230번째 염기의 거리는 가장 먼 염기의 위치를 단부로서 세기 때문에, 거리는 131염기가 된다. 검출 프로브 3: 2319번째 염기 내지 2330번째 염기와, 포착 프로브: 2200염기 내지 2230번째 염기의 거리는 가장 먼 염기의 위치를 단부로서 세기 때문에, 거리는 131염기가 된다. 이와 같이 계산하면, 검출 프로브 1, 4와 포착 프로브의 거리는 모두 231염기가 된다.

다음으로 표적 핵산을, 핵산의 최빈치가 250염기가 되도록 절단한다. 이 표적 핵산과, 검출 프로브 1, 2, 3, 4와, 포착 프로브를 혼성화시킨 모식도가 도 1A, 도 1B, 도 1C이다.

표적 핵산은 임의의 위치에서 절단되어 있기 때문에, 도 1과 같이 여러 가지의 결합 형태가 생길 수 있다.

도 1A는 표적 핵산이 2231번째 염기 이후에서 절단된 단편의 혼성화 형태를 나타내고 있다. 표적 핵산에 검출 프로브 1과 검출 프로브 2를 결합할 수 있다.

도 1B는 표적 핵산이 2100번째 염기 앞과, 2330번째 염기 뒤에서 절단된 단편의 혼성화 형태를 나타내고 있다. 표적 핵산에 검출 프로브 2, 검출 프로브 3을 결합할 수 있다.

도 1C는 표적 핵산이 2200번째 염기 앞과, 2430번째 염기 뒤에서 절단된 단편의 혼성화 형태를 나타내고 있다. 표적 핵산에, 검출 프로브3, 검출 프로브 4를 결합할 수 있다.

검출 프로브를 복수 개 준비하고, 또한 표적 핵산을 핵산 길이의 최빈치를 250염기가 되도록 절단함으로써 도 1 중 어느 형태로 검출할 수 있다.

한편, 검출 프로브를 1개만 준비한 경우에는 어느 하나의 경우에 있어서, 검출할 수 없다. 예를 들면, 검출 프로브 1만 이라면, 도 1B, 도 1C의 경우에는 검출할 수 없기 때문에, 검출 감도는 저하된다.

또한, 핵산 길이의 최빈치를 150염기로 한 경우에는, 포착 프로브에 결합한 표적 핵산에 결합할 수 있는 검출 프로브는 검출 프로브 2와 검출 프로브 3이다. 그 때문에, 검출 감도는 저하된다.

또한, 도 1에 있어서는 포착 프로브의 양측에 검출 프로브를 설계한 예시를 했지만, 검출 프로브는 포착 프로브의 3' 말단측만, 또는 5' 말단측만일 수도 있다.

일반적으로, 본 발명과 같은 핵산의 검출 방법에 있어서는 검출 방법 자체가 정확하게 행해졌는지의 여부를 확인하기 위해서, 내부 표준도 동시에 검출하고 있다. 즉, 검출 방법에 의해서, 표적 핵산이 검출되지 않은 경우, 피검 시료 중에 표적 핵산이 존재하지 않았던가, 검출 방법이 정확하게 행해지지 않았는지의 판별을 할 수 없다. 이 때문에, 피검 시료 중에 보편적으로 존재하는 핵산 영역을 내부 표준으로서 사용하여, 이 내부 표준이 검출되면 검출 방법은 정확하게 행해졌다고 판단하고, 내부 표준이 검출되지 않으면 검출 방법이 정확하게 행해지지 않았다고 판단하는 것이 행해지고 있다. 피검 시료가 인간 유래의 경우, 내부 표준으로서는, 액틴이나 글로빈이 일반적으로 사용되고 있다. 본 발명의 방법에 있어서도, 종래의 방법과 마찬가지로, 액틴 유전자나 글로빈 유전자를 내부 표준으로서 사용할 수 있고, 특히 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물을 PCR 등에 의해 증폭하는 경우에는 종래의 방법과 마찬가지인 내부 표준을 문제없이 사용할 수 있다.

그러나, 본 발명의 검출 방법은 상기와 같이, 핵산 증폭법을 행하지 않더라도 충분한 감도로 표적 핵산을 검출할 수 있다는 우수한 효과를 발휘하는 방법이다. 핵산 증폭법을 행하지 않는 경우, 액틴 유전자나 글로빈 유전자는 게놈 중에 1복사 밖에 없기 때문에, 감도가 불충분해져, 검출 방법이 정확하게 행해졌음에도 불구하고, 내부 표준이 검출되지 않을 우려가 생긴다.

이 문제를 극복하기 위해서, 본 발명의 바람직한 실시 형태에서는 상기 표적 핵산을 포함하는, 인간 등의 동물 유래의 검체를 상기 검출 방법에 제공하고, 동물 게놈 중에 존재하는 적어도 1종의 반복 서열을 내부 표준으로서 검출한다. 이 반복 서열은 동물 게놈 단편 중에 포함된다. 동물 게놈 단편은 동물 게놈의 단편화 처리에 의해 생긴 것일 수도 있고, 자연히 생긴 단편일 수도 있다. 게놈 단편의 바람직한 길이는 상기한 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물의 바람직한 길이와 마찬가지이다. 동물로서는 인간; 개나 고양이 등의 애완 동물; 돼지, 소, 말, 양, 염소 등의 가축; 원숭이, 마우스, 래트 등의 실험 동물 등의 포유동물이 바람직하고, 특히 인간이 바람직한데, 이들에 반복 서열이 존재하는 다른 동물일 수도 있다. 반복 서열로서는 레트로트랜스포존, 특히 단분산형 핵내 반복 서열(short interspersed nuclear sequence, SINE)이 바람직하고, 특히 인간 게놈 중에 100만복사 존재하는 Alu 서열이 바람직하다. Alu 서열 자체는 주지의 서열이고, 그의 염기 서열도 주지이다(서열번호 47).

표적 핵산이 바이러스 DNA이고, 인간 게놈을 포함하는 인간 유래 검체를 검출 방법에 제공하는 경우의 본 발명의 방법의 원리를 설명하기 위한 개념도를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타내는 방법에서는 내부 표준으로서 인간 Alu 서열을 이용하고 있다. Alu 서열을 보충하는 인간 Alu 서열 포착 프로브를 지지체에 고정화하고, 포착된 인간 DNA를 검출하는 복수 종류의 인간 Alu 서열 검출용 프로브를 포착된 인간 Alu 서열과 혼성화시켜, 포착된 인간 Alu 서열을 검출한다. 여기서, 인간 Alu 서열 등의 동물 DNA의 검출은 상기한 표적 핵산 또는 그의 단편화 처리물의 검출 방법과 마찬가지로 행할 수 있고, 바람직한 조건도 상기와 마찬가지이다.

실시예 1

본 발명을, 환자에게 감염된 바이러스형을 구별하여 검출하는 예로서, 인간 파필로마바이러스 검출의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

인간 파필로마바이러스는 자궁경부암의 원인 바이러스로서 알려져 있다. 인간 파필로마바이러스에는 100종 이상의 형이 존재하고, 그 중에서도 자궁경부암의 원인이 되는 악성도가 높은 형으로서 13종이 존재하고 있다. 자궁경부암의 예방의학에 있어서, 피험자가 어떤 형의 바이러스에 감염해 있는지 아는 것은 치료 방침을 생각하는 데에 있어서 중요한 정보가 된다. 인간 파필로마바이러스의 형 판별은 자궁경부의 면봉 채취로부터 행해진다. 혼성 캡쳐법, PCR법 등이 알려져 있다. 본 발명을 인간 파필로마바이러스의 검출에 적용함으로써, 피험자가 감염해 있는 바이러스 형을 고감도로 특정할 수 있다.

(포착 프로브, 검출 프로브의 설계)

인간 파필로마바이러스 형 판별의 연구는 예전부터 행해지고 있고, 포착 프로브는 그의 연구 성과를 활용할 수 있다. 여기서는, 일례로서 문헌 (j.clin.microbiol, 1995. p.901-905)에서 보고된 포착 프로브 서열을 이용하였다(표 1). 이 문헌에서는 인간 파필로마바이러스의 L1 유전자 영역의 서열을 이용하여 형을 판별할 수 있도록 포착 프로브를 설계하고 있고, 형에 공통의 PCR 프라이머 MY11, MY09를 이용하여 대상 서열을 증폭한 후, 각 형에 특이적으로 결합하는 포착 프로브를 고정한 필터에 혼성화시켜, 검출한다는 구조이다. 그 때문에, 포착 프로브의 설계 위치는 어떤 형이라도 L1 유전자의 거의 동일 영역에 위치하고 있다. 본 발명에서는 포착 프로브의 위치와 공통 프라이머의 서열에 주목하여, 공통 프라이머를 공통의 검출 프로브로서 이용함으로써 포착 프로브로부터의 거리는 형 사이에서 거의 동일하게 되게 하였다(도 3, 표 2). 상기 서열을 가진 포착 프로브는 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA를 오페론사에서 합성하였다. 검출 프로브는 3' 말단, 및 5' 말단에 비오틴 표지를 한 것을 오페론사에서 합성하였다.

(DNA 칩의 제작)

DNA 칩 "3D-Gene"(등록상표)(http://www.3d-gene.com/en/products/pro_ 009.html)의 기판에, 표 1의 포착 프로브의 모두를 고정한 DNA 칩을 제작하였다. 상세는 이하에 적는다.

(DNA 고정화 담체의 제작)

공지된 방법인 LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung) 공정을 이용하여 사출 성형용 형을 제작하고, 사출 성형법에 의해 후술하는 바와 같은 형상을 갖는 PMMA제 담체를 얻었다. PMMA 중에는 1 중량％의 비율로, 카본 블랙(미쯔비시 가가꾸사, #3050B)을 함유시키고 있고, 담체는 흑색이다. 담체의 형상은 크기가 세로 76 mm, 가로 26 mm, 두께 1 mm이고, 담체의 중앙부를 제외한 표면은 평탄하였다. 담체의 중앙에는 직경 10 mm, 깊이 0.2 mm의 오목한 부분이 형성되어 있고, 이 오목부 속에 직경 0.2 mm, 높이 0.2 mm의 볼록부를 64(8×8)개소 형성하였다. 요철부 볼록부의 피치(볼록부 중앙부에서 인접한 볼록부 중앙부까지의 거리)는 0.6 mm였다.

(프로브 DNA의 고정화)

표 1의 포착 프로브 DNA는 순수에 0.3 nmol/μL의 농도로 용해하여, 스톡솔루션으로 하였다. 담체에 점착할 때는 PBS(NaCl을 8 g, Na₂HPO₄·12H₂O를 2.9 g, KCl을 0.2 g, KH₂PO₄를 0.2 g 순수에 용해하여 1L로 메스업한 것에 pH 조정용의 염산을 가한 것, pH5.5)로 프로브 DNA의 최종 농도를 0.03 nmol/μL로 하고, 또한 담체 표면의 카르복실산과 프로브 DNA의 말단 아미노기를 축합시키기 위해서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)를 가하고, 그의 최종 농도를 50 mg/mL로 하였다. 그리고, 이들 혼합 용액을 유리 모세관으로 담체 볼록부 상면에 점착하였다. 이어서, 담체를 밀폐한 플라스틱 용기에 넣어, 37℃, 습도 100％의 조건으로 20시간 정도 인큐베이팅하여, 순수로 세정하였다. 포착 프로브 DNA를 고정화 후, DNA 칩의 중앙부에 커버를 첩부하고, DNA 칩과 커버 사이에, 혼성화 반응시의 용액 교반용으로 지르코니아제 비드를 봉입하였다.

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서, 인간 파필로마바이러스의 게놈 DNA가 클로닝된 재조합 플라스미드pHPV16을 휴먼사이언스 연구자원뱅크에서 구입하여 이용하였다. pHPV16은 전체 길이 16, 600염기쌍이었다. 1염기쌍의 분자량을 680으로 하면, 1μg은 89 nmol이 된다.

검체 DNA의 제조 방법을 이하에 나타내었다. 1μg의 pHPV16은 초음파 처리(코배리스, s220)에 의해서 단편화했다. 단편화 처리 조건은 메이커 권장 방법에 따라서, 100염기, 150염기, 250염기, 400염기, 1500염기, 4000염기가 되도록 설정하였다. 단편의 길이는 바이오분석기(애질런트사)를 이용하여 평가하여, 각 처리 조건으로 얻어진 단편화 핵산의 피크톱은 100염기, 150염기, 250염기, 400염기, 1500염기, 4000염기였다. 절단한 검체 DNA의 농도는 나노드롭(서모 피셔사, ND-1000)을 이용하여 측정하여, 핵산 농도를 구하였다. 핵산 농도로부터, 각 절단한 용액에 포함되는 절단한 DNA를 1 amol/μL까지 1 X 혼성화 용액으로 희석하여, 검체 DNA로 하였다.

(검출 프로브 용액의 제조)

검출 프로브는 농도가 100 fmol/μL가 되도록 멸균수로 희석하였다. 복수의 검출 프로브를 혼화하여 사용하는 경우에도, 마찬가지로 각 검출 프로브의 농도는 100 fmol/μL가 되도록 멸균수로 희석하였다.

(혼성화)

검체 DNA 5μL에 희석한 검출 프로브액 1μL를 혼화하고, 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 실온으로 되돌아갈 때까지, 책상 위에 2분간 정치하였다. 이 용액에, 1 X 혼성화 용액(1 중량％ BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1 중량％ SDS(도데실황산나트륨), 50 ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5 중량％ 덱스트란황산나트륨, 30％ 포름아미드)을 35μL 가하여, 혼성화 용액으로 하였다. 전량을 DNA 칩에 주입하여, 32℃에서 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 "3 D-Gene"의 표준 프로토콜에 따라서 250 rpm에서 선회 교반을 하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리스린(프로자임사)을 염색 용액(50 ng/μl 스트렙토아비딘피코에리스린, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 중량％ Tween20, 2 mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하고, DNA 칩 상에 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃로 가온한 세정액(6 X SSPE, 0.01 중량％ Tween20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색이 끝난 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100％, 포토멀티플레이어의 전압 설정을 70％로 하였다.

검출 결과를 표 3에 나타내었다. 4 종류의 검출 프로브를 혼화하여 검출한 결과로부터, 절단하지 않은 경우, 4000염기로 절단한 경우에 비해, 1500염기 이하로 절단한 검체에서는 우위에 검출 시그널이 향상하고 있는 것을 알 수 있다. 특히, 250염기, 500염기에서 가장 감도가 높아지고, 또한 짧게 절단하면 감도가 저하하기 시작하는 것을 알 수 있다.

다음으로, 검출 프로브를 개별로 사용하여 검출한 결과에서는 GP5 및 GP6에 대해서는, 상기 4종 혼합으로 검출했을 때와 마찬가지의 거동을 보이고 있다. MY11에 대해서도 같은 거동인데, 검출 프로브의 결합도가 낮기 때문인지, GP5, GP6과 비교하여 시그널 강도는 떨어지고 있다. MY09는 포착 프로브로부터 340염기 떨어진 장소에 설계된 검출 프로브로, DNA 길이가 250염기 이하로 절단한 경우에는, 표적 핵산에 결합하는 영역이 없고, 검출 프로브로서 기능하지 않는 것이 예상되었다. 실시예에서도, 500염기 및 1500염기에서는 시그널이 얻어지고 있지만, 250염기 이하에서는 시그널이 얻어지고 있지 않다.

개별의 검출 프로브로 얻어지는 시그널 강도의 합이 4종을 혼합하여 사용했을 때의 시그널 강도와 동등한 것은 용이하게 추측된다. 표 3의 최하단에 개별의 검출 프로브로 얻어진 시그널 강도의 합을 나타내었다. 이에 비하여, 표적 핵산을 1500염기 이하로 절단한 경우에 있어서, 4종 혼합으로 사용한 경우의 시그널 강도는 매우 큰 값을 보이고 있다. 이것은 복수의 검출 프로브가 결합함으로써, 포착 프로브와 표적 핵산과의 혼성화가 강화된 것으로 추측되었다.

실시예 2

본 발명을 인간 파필로마바이러스 검출의 다른 실시 형태에 의해서 더욱 상세히 설명한다. 또한, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(포착 프로브, 검출 프로브의 설계)

포착 프로브는 실시예 1과 같이 문헌에서 보고가 있는 서열을 사용하였다(j.clin. microbiol, 1995. p.901-905, 표 1). 일반적으로, 핵산의 혼성화 결합 강도는 긴 쪽이 강해진다. 따라서, 검출 프로브를 도 4 및 표 4에 도시한 바와 같이 포착 프로브의 전후 서열에 80 내지 86염기의 길이를 갖는 서열을 5 영역분 준비하였다.

상기 서열을 가진 포착 프로브는 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA를 오페론사에서 합성하였다. 검출 프로브는 내부에 비오틴 표지를 도입한 것을 오페론사에서 합성하였다(표 4).

(DNA 칩의 제작)

표 1의 모든 포착 프로브를 고정한 DNA 칩을 제작하였다. DNA 칩의 제작 방법은 실시예 1과 동일하다.

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서 인간 파필로마바이러스의 게놈 DNA가 클로닝된 재조합 플라스미드 pHPV16을 휴먼사이언스 연구자원뱅크에서 구입하여 이용하였다. pHPV16은 전체 길이 16, 600염기쌍이었다. 1염기쌍의 분자량을 680으로 하면, 1μg은 89 nmol이 된다.

검체 DNA의 제조 방법을 이하에 나타내었다. 5μg의 pHPV16은 초음파 처리(코배리스, s220)에 의해서 단편화했다. 단편화의 처리 조건은 메이커 권장 방법에 따라서, 150염기, 250염기가 되도록 설정하였다. 단편의 길이는 바이오분석기(애질런트사)를 이용하여 평가하고, 각 처리 조건으로 얻어진 단편화 핵산의 피크톱은 150염기, 250염기였다. 절단한 검체 DNA의 농도는 나노드롭(서모 피셔사, ND-1000)을 이용하여 측정하여, 핵산의 농도를 구하였다. 핵산 농도로부터, 각 절단한 용액에 포함되는 절단한 DNA를 1 amol/μL까지 1 X 혼성화 용액으로 희석하여, 검체 DNA로 하였다.

(검출 프로브 용액의 제조)

(혼성화)

검체 DNA 5μL에 희석한 검출 프로브액 1μL를 혼화하고, 서멀 사이클러를 이용하여 95℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 실온으로 되돌아갈 때까지, 책상 위에 2분간 정치하였다. 이 용액에, 혼성화 용액 1 X 혼성화 용액(1 중량％ BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1 중량％ SDS(도데실황산나트륨), 50 ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5 중량％ 덱스트란황산나트륨, 30％ 포름아미드)을 35μL 가하여, 혼성화 용액으로 하였다. 전량을 DNA 칩에 주입하여, 32℃에서 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 "3 D-Gene"의 표준 프로토콜에 따라서, 250 rpm에서 선회 교반을 하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리스린(프로자임사)을 염색 용액(50 ng/μl 스트렙토아비딘피코에리스린, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 중량％ Tween20, 2 mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하고, DNA 칩 상에 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃로 가온한 세정액(6 X SSPE, 0.01 중량％ Tween20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색이 끝난 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100％, 포토멀티플레이어의 전압 설정을 70％로 하였다.

검출 결과를 표 5에 나타내었다. 5 종류의 검출 프로브를 혼화(5종 혼합)하여 검출한 결과로부터, 150염기와 비교하여 250염기의 시그널 강도가 높다. 150염기로 절단한 경우에 유효한 검출 프로브는 2개인데 대하여 250염기로 절단한 경우에 유효한 검출 프로브는 3개이다. 결합할 수 있었던 검출 프로브의 개수의 차에 의해, 시그널 강도의 차가 생겼다고 할 수 있다. 한편, 250염기로 절단한 표적 핵산을, 4종 혼합과 5종 혼합으로 검출한 결과를 비교하면, 5종 혼합 쪽이 시그널 강도가 높다. 이것은 4종 혼합을 이용한 경우의 유효한 검출 프로브가 2개인데 대하여 5종 혼합에서는 3개이다. 결합할 수 있었던 검출 프로브의 개수의 차에 의해, 시그널 강도의 차가 생겼다고 할 수 있다.

이상과 같이, 복수의 검출 프로브를 준비하고, 또한 검출 프로브의 결합 영역을 고려한 표적 핵산의 절단을 행함으로써, 특히 충분한 시그널 강도를 얻을 수 있다. 또한, 5종 혼합의 검출 프로브를 사용한 경우, 표적 핵산은 400염기 전후(± 50염기 정도), 또한 400염기로 절단하는 것이 바람직하다.

실시예 3

본 발명을 SNPs(single nucleotide polymorphisms) 검출에 의해서 더욱 상세히 설명한다. 더욱이, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 암 환자에 있어서, EGFR 유전자나 k-ras 유전자 변이의 유무에 따라서, 항암제의 주공율이 다른 것이 알려져 있고, 항암제 투여의 판단 재료로 되어 있다. 기존 기술에서는 PCR로 증폭한 후에 여러 가지 방법을 이용하여 검출하고 있다.

(포착 프로브, 검출 프로브의 설계)

SNP 검출의 포착 프로브는 SNP 사이트를 프로브의 중앙에 위치시킨다. 구체적으로는, SNP 사이트의 전후 10염기를 포착 프로브 서열로서 사용한다. SNP 검출의 경우, 포착 프로브는 SNP 사이트를 모든 염기의 조합을 준비하여, 포착 프로브세트로서 사용한다. 구체적으로는, 야생형: G, 변이형: A의 SNP 사이트의 경우, G 또는 A의 전후 10염기를 포함하는 21염기를 포착 프로브로서 사용한다. 또한, 비교 대상으로 하기 위해서, 프로브의 중앙부를 T 또는 C로 하고, 전후 10염기를 포함하는 21염기를 포착 프로브로 한다. 이상의 4 서열을 포착 프로브 세트로서 사용한다. 이와 같이 하여, k-ras 변이인 Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys 및 EGFR 변이인 T 790 M에 대한 포착 프로브 세트를 준비하였다(표 6).

검출 프로브는 포착 프로브 설계로부터의 거리를 고려한 뒤에, 도 6 및 도 7의 위치에 설계하였다. 검출 프로브의 서열 및 포착 프로브로부터의 거리를 표 7, 표 8에 나타내었다.

상기 서열을 가진 포착 프로브는 5' 말단에 아미노기 수식을 넣은 합성 DNA를 오페론사에서 합성하였다. 검출 프로브는 3' 말단, 및 5' 말단에 비오틴 표지를 한 것을 오페론사에서 합성하였다.

(DNA 칩의 제작)

표 6의 모든 포착 프로브를 고정한 DNA 칩을 제작하였다. DNA 칩의 제작 방법은 실시예 1과 동일하다.

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서 A549 세포로부터 추출한 DNA를 사용하였다. A549 세포는 폐암 조직 유래의 배양 세포이고, Gly12Ser의 변이가 들어가 있는 것이 알려져 있다. A549 세포로부터 추출한 5μg의 DNA를 초음파 처리(코배리스, s220)에 의해서 단편화했다. 단편화의 처리 조건은 메이커 권장 방법에 따랐다. 단편의 길이는 바이오분석기(애질런트사)를 이용하여 평가하였다. 핵산 길이의 최빈치는 750염기였다. 절단한 DNA의 전량을 검체 DNA로서 사용하였다.

(검출 프로브 용액의 제조)

검출 프로브는 혼화하여, 각각의 농도가 100 fmol/μL가 되도록 멸균수로 희석하였다.

(혼성화)

검체 DNA 5μL에 희석한 검출 프로브액 1μL를 혼화하고, 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 실온으로 되돌아갈 때까지, 책상 위에 2분간 정치하였다. 이 용액에 혼성화 용액(조성 확인. 1 중량％ BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨), 0.01 중량％ 연어 정자 DNA의 용액)을 35μL 가하여, 혼성화 용액으로 하였다. 전량을 DNA 칩에 주입하여, 32℃에서 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 "3 D-Gene"의 표준 프로토콜에 따라서, 250 rpm에서 선회 교반을 하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리스린(프로자임사)을 염색 용액(50 ng/μl 스트렙토아비딘피코에리스린, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 중량％ Tween20, 2 mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하고, DNA 칩 상에 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃로 가온한 세정액(6 X SSPE, 0.01 중량％ Tween20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색이 끝난 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100％, 포토멀티플레이어의 전압 설정을 70％로 하였다.

검출 결과를 표 9에 나타내었다. EGFR 포착 프로브 세트에서는 야생형 프로브가 가장 시그널 강도가 높기 때문에, A549 세포에 있어서 T790M 변이는 생기지 않았다고 생각된다. K-RAS 포착 프로브에서는 Gly12Ser의 프로브의 시그널 강도가 가장 높다. A 549 세포는 Gly12Ser 변이가 들어가 있는 것이 알려져 있고, 본 검출 결과와 일치하였다.

이상과 같이, 샌드위치 혼성화를 이용함으로써 PCR 증폭하는 일 없이 SNP를 정확하게 검출할 수 있었다.

실시예 4

실시예 3에서 나타낸 K-ras 유전자 변이나 EGFR 유전자 변이는 항암제 투여의 중요한 지표인데, 이들 유전자 발현의 유무를 별도의 방법으로 확인하는 것도 중요하다. 본 발명은 RNA를 직접 검출할 수도 있고, 또한 그 RNA 중의 변이를 검출할 수 있다. 지금까지의 RNA 기술은 역전사 효소로 cDNA로 한 후, PCR법으로 증폭할 필요가 있었다. 역전사하는 경우에 사용되는 역전사 효소는 일반적으로 변이가 들어가기 쉽기 때문에, 오류 검출의 원인이 될 가능성이 있다. 이하에 상세에 대해서 적지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(포착 프로브, 검출 프로브의 설계)

실시예 3과 같은 포착 프로브 세트, 및 검출 프로브를 사용하였다.

(DNA 칩의 제작)

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서 A549 세포로부터 추출한 total RNA를 이용하였다. A549 세포는 폐암 조직 유래의 배양 세포이고, Gly12Ser의 변이가 들어가 있는 것이 알려져 있다. A549 세포로부터 추출한 5μg의 total RNA를 초음파 처리(코배리스사, s220)에 의해서 단편화했다. 단편화의 처리 조건은 메이커 권장 방법에 따랐다. 단편의 길이는 바이오분석기(애질런트사)를 이용하여 평가하였다. 핵산 길이의 최빈치는 250염기였다. 절단한 RNA의 전량을 검체 RNA로서 사용하였다.

(검출 프로브 용액의 제조)

검출 프로브는 혼화하고, 각각의 농도가 100 fmol/μL가 되도록 멸균수로 희석하였다.

(혼성화)

검체 RNA 5μL에 희석한 검출 프로브액 1μL를 혼화하고, 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 실온으로 되돌아갈 때까지, 책상 위에 2분간 정치하였다. 이 용액에 혼성화 용액(조성 확인. 1 중량％ BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨), 0.01 중량％ 연어 정자 DNA의 용액)을 35μL 가하여, 혼성화 용액으로 하였다. 전량을 DNA 칩에 주입하여, 32℃에서 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 "3 D-Gene"의 표준 프로토콜에 따라서, 250 rpm에서 선회 교반을 하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리스린(프로자임사)를 염색 용액(50 ng/μl 스트렙토아비딘피코에리스린, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 중량％ Tween20, 2 mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하여, DNA 칩 상에 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃로 가온한 세정액(6 X SSPE, 0.01 중량％ Tween20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠)를 이용하여 건조하였다. 염색이 끝난 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100％, 포토멀티플레이어의 전압 설정을 70％로 하였다.

검출 결과를 표 10에 나타내었다. EGFR 포착 프로브 세트에서는 야생형 프로브가 가장 시그널 강도가 높기 때문에, A549 세포에 있어서 T790M 변이는 생기지 않았다고 생각된다. K-ras 포착 프로브에서는 Gly12Ser의 프로브의 시그널 강도가 가장 높다. A549 세포는 Gly12Ser 변이가 들어가 있는 것이 알려져 있고, 본 검출 결과와 일치하였다.

이상과 같이, 샌드위치 혼성화를 이용함으로써 RNA를 역전사하지 않고, 직접 검출할 수 있고, 또한 SNP를 정확하게 검출할 수 있었다.

실시예 5

본 발명을 인간 파필로마바이러스 검출의 다른 실시 형태에 의해서 더욱 상세히 설명한다. 상술한 실시예 1 및 실시예 2에서는 인간 파필로마바이러스 DNA를 검출하였다. 인간 검체로부터 핵산을 추출하여, 해석하는 경우에 있어서, 검출 시그널이 얻어지지 않았을 때에는 인간 검체에 파필로마바이러스가 존재하지 않았다 는 해석과, 핵산의 추출 작업이나 검출 작업에 실패했다는 해석의 양쪽이 생각된다. 어느 쪽인지 구별하는 것은 곤란하다. 이러한 문제는 내부 표준을 사용함으로써 해소할 수 있다.

인간 검체로부터 인간 파필로마바이러스 DNA를 추출할 때에는 미량인 인간 DNA가 검체 용액에 포함되는 것이 알려져 있다. 인간 파필로마바이러스에 감염되지 않은 인간 검체로부터는 인간 파필로마바이러스 DNA는 취득할 수 없지만, 인간 DNA를 얻을 수 있다. 이 성질을 이용하여, 인간 검체로부터 추출한 검체 용액에 포함되는 인간 DNA를 검출함으로써 인간 파필로마바이러스 DNA 검출의 내부 표준으로서 사용할 수 있다. 여기서는 파필로마바이러스의 염기 서열이 삽입된 플라스미드 DNA와 인간 게놈 DNA를 혼화한 검체를, 의사적으로 이용한다. 더욱이, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(포착 프로브, 검출 프로브의 설계)

포착 프로브는 실시예 1과 같이 문헌에서 보고가 있는 서열을 사용하였다(j.clin.microbiol, 1995. p.901-905, 표 1). 일반적으로, 핵산의 혼성 결합 강도는 긴 쪽이 강해진다. 따라서, 검출 프로브를, 도 4 및 표 4에 도시한 바와 같이 포착 프로브의 전후 서열에 80 내지 86염기의 길이를 갖는 서열을 5 영역분 준비하였다.

인간 게놈 중에 반복하여 존재하는 Alu 서열에 대한 포착 프로브 및 검출 프로브를 표 11에 나타내었다. 상기 서열을 가진 포착 프로브는 5' 말단에 아미노기수식을 넣은 합성 DNA를 오페론사에서 합성하였다. 검출 프로브는 5' 말단과 3` 말단에 비오틴 표지를 도입한 것을 오페론사에서 합성하였다.

(DNA 칩의 제작)

표 1의 모든 포착 프로브 및 표 11 서열번호 46의 포착 프로브를 고정한 DNA 칩을 제작하였다. DNA 칩의 제작 방법은 실시예 1과 동일하다.

(검체 DNA의 제조)

검체 DNA로서 인간 파필로마바이러스의 게놈 DNA가 클로닝된 재조합 플라스미드 pHPV16을 휴먼사이언스 연구자원뱅크(재단법인 휴먼사이언스 진흥재단)에서 구입하여 사용하였다. pHPV16은 전체 길이 16, 600염기쌍이었다. 1염기쌍의 분자량을 680으로 하면, 1μg은 89 nmol이 된다. 인간 게놈 DNA는 클론텍크사에서 구입한 것을 사용하였다.

검체 DNA의 제조 방법을 이하에 나타내었다. 5μg의 pHPV16 및 인간 게놈 DNA는 초음파 처리(코배리스사, 모델 번호: s220)에 의해서 단편화했다. 단편화의 처리 조건은 메이커 권장 방법에 따라서, 250염기가 되도록 설정하였다. 단편의 길이는 바이오분석기(애질런트사)를 이용하여 평가하고, 각 처리 조건으로 얻어진 단편화핵산의 피크톱은 250염기였다. 절단한 검체 DNA의 농도는 나노드롭(서모 피셔사, 모델 번호: ND-1000)을 이용하여 측정하여, 핵산의 농도를 구하였다. 핵산 농도로부터 각 절단한 용액에 포함되는 절단한 DNA를, pHPV16은 1 amol/uL, 인간 게놈 DNA는 5 ng/uL가 되게 1 X 혼성화 용액으로 희석하였다.

(검출 프로브 용액의 제조)

표 4 및 표 11의 검출 프로브는 멸균수로 용해시킨 후, 각각의 농도가 100 fmol/μL가 되도록 혼화하여, 검출 프로브액으로 하였다.

(혼성화)

절단한 pHPV16과 인간 게놈 DNA를 표 12의 조성이 되도록 혼화한 검체 DNA 5μL에 희석한 검출 프로브액 1μL를 혼화하고, 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 5분간 가열하였다. 가열 후, 실온으로 되돌아갈 때까지 책상 위에 2분간 정치하였다. 이 용액에 1 X 혼성화 용액(1 중량％ BSA(소 혈청 알부민), 5×SSC, 1 중량％ SDS(도데실황산나트륨), 50 ng/ml 연어 정자 DNA의 용액, 5 중량％ 덱스트란황산나트륨, 30％ 포름아미드)을 35μL 가하여, 혼성화 용액으로 하였다. 전량을 DNA 칩에 주입하여, 32℃에서 가온한 인큐베이터에 세팅하였다. 혼성화는 "3 D-Gene"의 표준 프로토콜에 따라서, 250 rpm에서 선회 교반을 하면서, 32℃에서 2시간 행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 30℃로 가온한 세정액(0.5×SSC, 0.1 중량％ SDS(도데실황산나트륨))으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠사)를 이용하여 건조하였다. 또한, 스트렙토아비딘피코에리스린(프로자임사)을 염색 용액(50 ng/μl 스트렙토아비딘피코에리스린, 100 mM MES, 1M NaCl, 0.05 중량％ Tween20, 2 mg/ml BSA(소 혈청 알부민))에 첨가한 용액을 준비하여, DNA 칩 상에 적하하였다. 35℃에서 5분간 인큐베이션하였다. 30℃로 가온한 세정액(6 X SSPE, 0.01 중량％ Tween20)으로 5분간 세정한 후, 스핀 드라이어(와켄야쿠사)를 이용하여 건조하였다. 염색이 끝난 DNA 칩은 DNA 칩 스캐너(도레이사)를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 스캐너의 설정은 레이저 출력 100％, 포토멀티플레이어의 전압 설정을 70％로 하였다.

검출 결과를 표 12에 나타내었다.

검체1(인간 게놈 DNA 5 ng)은 포착 프로브 Probe Alu에서만 시그널이 검출되었다. 이 검체에는 pHPV16의 DNA가 포함되어 있지 않기 때문에, 포착 프로브 Probe 16에서는 시그널이 얻어지지 않았다.

검체3(pHPV16 1 amol)은 포착 프로브 Probe 16에서만 시그널이 검출되었다. 이 검체에는 인간 게놈 DNA가 포함되어 있지 않기 때문에, 포착 프로브 Probe Alu에서는 시그널이 얻어지지 않았다. 이상의 결과로부터, pHPV16용 포착 프로브 및 검출 프로브와, Alu 서열용 검출 프로브 및 포착 프로브는 서로 잘못된 혼성화를 하지 않은 것을 알 수 있다.

검체2(pHPV16 1 amol, 인간 게놈 DNA 5 ng)는 포착 프로브 Probe 16 및 Probe Alu에서 시그널이 얻어졌다. 이 점에서, pHPV16과 인간 게놈 DNA를 동시에 검출할 수 있는 것을 알았다.

이상과 같이, 인간 파필로마바이러스 DNA의 유무에 관계없이, 검체 용액에 포함되는 인간 DNA의 Alu 서열을 검출할 수 있었던 점에서, 인간 DNA를 내부 표준으로서 사용할 수 있는 것을 알 수 있었다. 인간 검체로부터 핵산을 추출하여 해석하는 경우에 있어서도 본 기법은 유효하다고 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Method of detecting nucleic acids <130> PF477-PCT <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 6 <400> 1 atccgtaact acatcttcca catacaccaa 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 11 <400> 2 atctgtgtct aaatctgcta catacactaa 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 16 <400> 3 gtcattatgt gctgccatat ctacttcaga 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 18 <400> 4 tgcttctaca cagtctcctg tacctgggca 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 31 <400> 5 tgtttgtgct gcaattgcaa acagtgatac 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 33 <400> 6 tttatgcaca caagtaacta gtgacagtac 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 34 <400> 7 tacacaatcc acaagtacaa atgcaccata 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 35 <400> 8 gtctgtgtgt tctgctgtgt cttctagtga 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 39 <400> 9 tctacctcta tagagtcttc cataccttct 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 40 <400> 10 gctgccacac agtcccccac accaacccca 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 42 <400> 11 ctgcaacatc tggtgataca tatacagctg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 43 <400> 12 tctactgacc ctactgtgcc cagtacatat 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 44 <400> 13 gccactacac agtcccctcc gtctacatat 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 45 <400> 14 acacaaaatc ctgtgccaag tacatatgac 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 51 <400> 15 agcactgcca ctgctgcggt ttccccaaca 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 52 <400> 16 tgctgaggtt aaaaaggaaa gcacatataa 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 54 <400> 17 tacagcatcc acgcaggata gctttaataa 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 56 <400> 18 gtactgctac agaacagtta agtaaatatg 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 58 <400> 19 attatgcact gaagtaacta aggaaggtac 30 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> biotinylated base <400> 20 gcmcagggwc ataayaatgg 20 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> biotinylated base <400> 21 gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> biotinylated base <400> 22 tttgttactg tggtagatac tac 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> biotinylated base <400> 23 gatcagtwtc cyytdggacg 20 <210> 24 <211> 80 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> n is biotinylated base <400> 24 gcacagggcn acaataatgg catttgttgn ggtaaccaac tatttgttac ngttgttgat 60 actacacgca ntacaaatat 80 <210> 25 <211> 86 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n is biotinylated base <400> 25 aactacatan aaaaatacta actttaaggn gtacctacga catggggagg aatatgnttt 60 acagtttatt tttcaantgt gcaaaa 86 <210> 26 <211> 86 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> n is biotinylated base <400> 26 taaccttaan tgcagacgtt atgacatacn tacattctat gaattccacn attttggagg 60 actggaattn tggtctacaa cctccc 86 <210> 27 <211> 86 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (77)..(77) <223> n is biotinylated base <400> 27 ccaggaggcn cactagaaga tacttatagn tttgtaacat cccaggcaat tgcttgncaa 60 aaacatacac ctccagnacc taaaga 86 <210> 28 <211> 84 <212> DNA <213> human papillomavirus <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> n is biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is biotinylated base <400> 28 agatcccctn aaaaaataca ctttttgggn agtaaattta aaggaaaagt tttcngcaga 60 cctagatcag tttcntttag gacg 84 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agttggagct ggtggcgtag g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 agttggagct agtggcgtag g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 agttggagct cgtggcgtag g 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 agttggagct tgtggcgtag g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 caactcatca cgcagctcat g 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 caactcatca tgcagctcat g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 caactcatca agcagctcat g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 caactcatca ggcagctcat g 21 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> biotinylated base <400> 37 gatcatattc gtccacaaaa tgattctgaa ttagctgtat 40 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> biotinylated base <400> 38 ccaagagaca ggtttctcca tcaattacta cttgcttcct 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> biotinylated base <400> 39 tcctcatgta ctggtccctc attgcactgt actcctcttg 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> biotinylated base <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> biotinylated base <400> 40 aattttaact ttctcacctt ctgggatcca gagtccctta 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 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45 actcgggagg ctgaggcagg agaatggcg 29 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cggatcacga ggtcaggaga tcgagaccat cctggctaac 40 <210> 47 <211> 287 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ggccgggcgc ggtggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcgggcgga 60 tcacgaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacacgg tgaaaccccg tctctactaa 120 aaatacaaaa aattagccgg gcgtggtggc gggcgcctgt agtcccagct actcgggagg 180 ctgaggcagg agaatggcgt gaacccggga ggcggagctt gcagtgagcc gagatcgcgc 240 cactgcactc cagcctgggc gacagagcga gactccgtct caaaaaa 287

Claims

표적 핵산의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시켜, 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산의 단편화 처리물을 혼성화시키고, 또한 상기 표적 핵산의 단편화 처리물과 상기 복수의 검출 프로브를 혼성화시키고, 그로 인해, 상기 복수의 검출 프로브를 상기 포착 프로브와 상기 표적 핵산의 단편화 처리물을 통해 상기 지지체에 결합시키는 공정과,
지지체에 결합된 상기 복수의 검출 프로브를 검출하는 공정을 포함하는, 표적 핵산의 검출 방법으로서,
상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산의 단편화 처리물에서의 포착 프로브 결합 위치로부터의 거리가 상기 표적 핵산의 단편화 처리물의 핵산 길이의 최빈치(最頻値) 이하의 범위에 복수의 검출 프로브를 혼성화시키고,
상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산의 단편화 처리물의, 핵산 길이의 최빈치가 100염기 내지 1500염기의 범위인, 표적 핵산의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 핵산의 단편화 처리물과, 복수의 검출 프로브와, 지지체에 고정한 포착 프로브를 축차적으로 또는 동시에 접촉시키는 공정은, 상기 표적 핵산의 단편화 처리물을 복수의 검출 프로브와 혼성화시키고, 이어서 상기 복수의 검출 프로브와 혼성화한 상기 표적 핵산의 단편화 처리물과 상기 포착 프로브를 혼성화시킴으로써 축차적으로 행해지는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산의 단편화 처리물에서의 포착 프로브 결합 위치로부터의 거리가 1500염기의 범위 내에 복수의 검출 프로브를 혼성화시키는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 길이의 최빈치가 100염기 내지 1500염기의 범위에 포함되도록 표적 핵산을 단편화 처리한 표적 핵산의 단편화 처리물을 상기 포착 프로브와 혼성화시키는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포착 프로브와 혼성화시키는 상기 표적 핵산의 단편화 처리물이 핵산 증폭법에 의한 증폭을 거치지 않은 것인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표적 핵산을 포함하는 동물 유래의 검체를 상기 검출 방법에 제공하고, 상기 검출 방법은 동물 게놈 중에 존재하는 적어도 1종의 반복 서열을 내부 표준으로서 검출하는 공정을 추가로 포함하며, 상기 반복 서열은 동물 게놈 단편 중에 포함되는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 동물 게놈을 단편화하는 공정을 추가로 포함하며, 상기 반복 서열은 단편화된 동물 게놈 중에 포함되는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 동물이 인간인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 반복 서열이 단분산형 핵내 반복 서열인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 단분산형 핵내 반복 서열이 Alu 서열인, 방법.
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