CN106868158A - 一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒。以沙门氏菌特异性核酸适体为分子识别元件，在沙门氏菌作用下打开茎环结构核酸H1，并与茎环结构核酸H2相互作用，形成部分双链DNA，包含核酸内切酶识别序列，在核酸内切酶的作用下切割H2，释放富含G碱基的核酸序列。在Hemin的作用下，形成具有类似HRP催化活性的G四聚体结构，可催化氧化显色反应，使无色底物变成蓝色。本发明方法具有较高的灵敏度，其检测限位10 cfu/mL；还具有很好的特异性，常见的其他菌对检测不产生影响。整个检测过程可在室温下完成，具有操作简单、经济便宜等优点。检测结果可直接观察，无需使用检测仪器。可直接检测活菌，无需对菌进行裂解。

Description

一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于微生物快速检测领域，具体涉及一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella enteritidis）是肠杆菌科中重要的病原菌属，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一，严重危害食品安全和人体健康。
传统的沙门氏菌检测技术主要包括噬菌体裂解实验、PCR技术、抗体检测等。但往往需要对菌体进行裂解，难以直接检测，或者涉及昂贵仪器的使用，难以大范围推广，以及检测灵敏度有待进一步提高。
因此，迫切需要建立一种操作简单、快速、灵敏度高的沙门氏菌活菌检测方法，并使检测过程无需使用检测仪器，这对于预防和控制沙门氏菌感染，保障食品安全和人体健康具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种沙门氏菌的检测试剂盒，包括氯高铁血红素、杂交缓冲液、显色缓冲液体系、核酸内切酶和下列核酸序列：
核酸序列H1：依次具有A、B、C区域，其中A区是沙门氏菌的核酸适体，C与A部分互补形成茎环结构的茎部分，A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧，B构成茎环结构的环部分，B中包含一段与H2的H区互补配对的核酸序列；
核酸序列H2：依次具有D、F、H、G、E区域，其中D和E区域互补形成茎环结构的茎部分，F和G区域是富含G碱基的序列，H区域为核酸内切酶的识别位点序列；H区域与H1的B区域部分核酸序列互补，形成部分双链DNA。
优选的，A区的核酸序列为 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-5'。
优选的，B区的碱基数为7-15个，更优选的碱基数为13个。
优选的，C区的碱基数6-10个，更优选为8个。
优选的，D和E区域的碱基数为5-10个。
优选的，F和G区域包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。F和G的碱基组成可以一样，也可以不一样。
优选的，F和G的区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG。
优选的，核酸内切酶对应特定的识别序列，通过结合识别序列，对识别序列进行切割；具体包括核酸内切酶Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
优选的，当核酸内切酶为Nt.BbvCI时，H2的H区域的核酸序列为5'-CCTCAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
优选的，当核酸内切酶为Bmtl时，H2的H区域的核酸序列为5'-GCTAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
优选的，显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。
优选的，杂交缓冲液为10 mM Tris-HCl，pH为7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl2以及100μg/ml BSA。
优选的，所述的检测试剂盒，包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：
核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-TTCGGAGTCGCTA-GAGGAGAC-5'（SEQ ID NO：1）；
核酸序列H2: 5'-AGTACTAG-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTCAGC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CTAGTACT-3'（SEQ ID NO：2）。
一种沙门氏菌的检测方法，包括下列步骤：
1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2，将1 M的H1与待测溶液充分混匀，室温反应30分钟；
2)加入1 M的H2，分混匀，室温反应30分钟；
3)加入25 U的核酸内切酶如Nt.BbvCI，充分混匀，室温反应90分钟；
4)加入0.3 M的氯高铁血红素，室温反应30分钟；取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；如果待测溶液含有沙门氏菌时，溶液变色，如果待测溶液不含沙门氏菌时，溶液无色；
其中，杂交缓冲液体系、核酸内切酶、显色缓冲液体系和核酸序列H1、H2如上述任一项所述。
本发明方法的反应原理(见图1)为：
（1）茎环结构核酸H1中的A序列是沙门氏菌的核酸适体，沙门氏菌与A结合后，打开H1，使B暴露出来。B中包含一段与H2的H区互补配对的核酸序列。
（2）H1的B部分核酸序列与H2的H互补，形成部分双链DNA。H的核酸序列为核酸内切酶的识别位点序列。F和G为富含G碱基的序列，F和G的碱基组成可以一样也可以不一样。D和E互补，碱基数为5-10个。
（3）加入核酸内切酶（Nt.BbvCI）后，可识别双链DNA中的酶切位点，在H2的H部分切割H2，使H2分成两部分。H2的F和G变成单链。同时H1的B部分可循环进入下一轮，继续与H2反应，启动酶切割。最后产生大量的单链F和G。核酸内切酶有多种（例如：Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI ），只要替换对应的识别序列，也能完成检测。
（4）F和G是一段富含G碱基的序列。加入氯高铁血红素（Hemin）后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H2O2（四甲基联苯胺-双氧水）、OPD-H2O2（邻苯二胺-双氧水）或ABTS-H2O2（2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水）等检测体系，产生有色底物，结果肉眼可见，从而达到检测沙门氏菌的目的。
本发明的有益效果是：
（1）无需对菌液进行裂解提取，操作简单，可快速检测活菌含量；
（2）只需一种工具酶即可完成信号扩增，成本低廉，响应迅速；
（3）灵敏度高、选择性好，无需对温度进行精确控制；
（4）无需标记，检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器，适于现场快检测。
附图说明
图1为本发明所述的检测方法的原理图；
图2为对不同浓度的沙门氏菌的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
一种沙门氏菌的检测试剂盒，包括氯高铁血红素、杂交缓冲液、显色缓冲液体系、核酸内切酶和下列核酸序列：
核酸序列H1：依次具有A、B、C区域，其中A区是沙门氏菌的核酸适体，C与A部分互补形成茎环结构的茎部分，A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧，B构成茎环结构的环部分，B中包含一段与H2的H区互补配对的核酸序列；
核酸序列H2：依次具有D、F、H、G、E区域，其中D和E区域互补形成茎环结构的茎部分，F和G区域是富含G碱基的序列，H区域为核酸内切酶的识别位点序列；H区域与H1的B区域部分核酸序列互补，形成部分双链DNA。
优选的，A区的核酸序列为 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-5'。
优选的，B区的碱基数为7-15个，更优选的碱基数为13个。
优选的，C区的碱基数6-10个，更优选为8个。
优选的，D和E区域的碱基数为5-10个。
优选的，F和G区域包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。F和G的碱基组成可以一样，也可以不一样。
优选的，F和G区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG。
优选的，核酸内切酶对应特定的识别序列，通过结合识别序列，对识别序列进行切割；具体包括核酸内切酶Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
优选的，当核酸内切酶为Nt.BbvCI时，H2的H区域的核酸序列为5'-CCTCAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
优选的，当核酸内切酶为Bmtl时，H2的H区域的核酸序列为5'-GCTAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
优选的，显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。
优选的，杂交缓冲液为10 mM Tris-HCl，pH为7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl2以及100μg/ml BSA。
优选的，所述检测试剂盒，包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：
核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-TTCGGAGTCGCTA-GAGGAGAC-5'（SEQ ID NO：1）；
核酸序列H2: 5'-AGTACTAG-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTCAGC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CTAGTACT-3'（SEQ ID NO：2）。
一种沙门氏菌的检测方法，包括下列步骤：
1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2，将1 M的H1与待测溶液充分混匀，室温反应30分钟；
2)加入1 M的H2，分混匀，室温反应30分钟；
3)加入25 U的核酸内切酶如Nt.BbvCI，充分混匀，室温反应90分钟；
4)加入0.3 M的氯高铁血红素，室温反应30分钟；取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；如果待测溶液含有沙门氏菌时，溶液变色，如果待测溶液不含沙门氏菌时，溶液无色；
其中，杂交缓冲液体系、核酸内切酶、显色缓冲液体系和核酸序列H1、H2如上述任一项所述。
本发明方法的反应原理(见图1)为：
（1）茎环结构核酸H1中的A序列是沙门氏菌的核酸适体，沙门氏菌与A结合后，打开H1，使B暴露出来。B中包含一段与H2的H区互补配对的核酸序列。
（2）H1的B部分核酸序列与H2的H互补，形成部分双链DNA。H的核酸序列为核酸内切酶的识别位点序列。F和G为富含G碱基的序列，F和G的碱基组成可以一样也可以不一样。D和E互补，碱基数为5-10个。
（3）加入核酸内切酶（Nt.BbvCI）后，可识别双链DNA中的酶切位点，在H2的H部分切割H2，使H2分成两部分。H2的F和G变成单链。同时H1的B部分可循环进入下一轮，继续与H2反应，启动酶切割。最后产生大量的单链F和G。核酸内切酶有多种（例如：Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI ），只要替换对应的识别序列，也能完成检测。
（4）F和G是一段富含G碱基的序列。加入氯高铁血红素（Hemin）后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H2O2（四甲基联苯胺-双氧水）、OPD-H2O2（邻苯二胺-双氧水）或ABTS-H2O2（2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水）等检测体系，产生有色底物，结果肉眼可见，从而达到检测沙门氏菌的目的。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种沙门氏菌的检测方法，按照如下步骤进行：
（1）先用Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH为7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl2以及100 μg/ml BSA）分别溶解核酸H1和H2。1 M的H1与沙门氏菌充分混匀，室温反应30分钟。
（2）加入1 M的H2，分混匀，室温反应30分钟。
（3）加入25 U的核酸内切酶Nt.BbvCI，充分混匀，室温反应90分钟。
（4）加入0.3 M的Hemin（氯高铁血红素），室温反应30分钟。取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中（含有26.6 mM 柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 L0.5%的TMB，20 L 30%的H2O2，pH=5.0），室温反应15分钟，观察颜色变化。当有沙门氏菌时，溶液变蓝，当没有沙门氏菌时，溶液无色。
实施例2
一种沙门氏菌检测试剂盒包括以下成分：
（1）核酸H1和H2，序列如下：
核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC（A）-TTCGGAGTCGCTA（B）-GAGGAGAC（C）-5'（SEQ ID NO：1）；
核酸序列H2:5'-AGTACTAG（D）-GGGTAGGGCGGGTTGGG（F）-CC↓TCAGC（H）-GGGTAGGGCGGGTTGGG（G）-CTAGTACT（E）-3'（SEQ ID NO：2）；（箭头表示切割位点）；
（2）核酸内切酶Nt.BbvCI；
（3）杂交缓冲液，包含10 mM Tris-HCl，pH为7.9，含有50 mM NaCl，10 mM MgCl2以及100 μg/ml BSA；
（4）氯高铁血红素；
（5）显色缓冲液体系，包含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 L0.5%的TMB，20 L 30%的H2O2，pH=5.0。
实施例3
对不同浓度沙门氏菌的检测：
配制沙门氏菌标准溶液，浓度分别为1x101 cfu/mL、 1x102 cfu/mL、 1x103cfu/mL、1x104 cfu/mL、1x105cfu/mL、1x106 cfu/mL 4℃保存。将不同浓度的沙门氏菌溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，10 cfu/mL的沙门氏菌可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为10 cfu/mL。随着沙门氏菌浓度增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。
实施例4
特异性实验：
配制浓度为1x103 cfu/mL的不同菌溶液，分别是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、地杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌。将1x103 cfu/mL的不同菌溶液和1x103 cfu/mL沙门氏菌溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，1x103 cfu/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、地杆菌、志贺氏菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌。没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入沙门氏菌溶液后才会产生蓝色，这证明该方法对沙门氏菌的检测具有很好的特异性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省生态环境技术研究所
<120> 一种沙门氏菌的检测方法及检测试剂盒
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgatggctgt agtgtttccg ggttatcact agtttggtgg caccaatgtc agtctcctct 60
tcggagtcgc tagaggagac 80
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtactaggg gtagggcggg ttgggcctca gcgggtaggg cgggttgggc tagtact 57

Claims (10)

1.一种沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，包括氯高铁血红素、杂交缓冲液、显色缓冲液体系、核酸内切酶和下列核酸序列：
核酸序列H1：依次具有A、B、C区域，其中A区是沙门氏菌的核酸适体，C与A部分互补形成茎环结构的茎部分，A与C不互补的序列凸起于茎环结构外侧，B构成茎环结构的环部分，B中包含一段与H2的H区互补配对的核酸序列；
核酸序列H2：依次具有D、F、H、G、E区域，其中D和E区域互补形成茎环结构的茎部分，F和G区域是富含G碱基的序列，H区域为核酸内切酶的识别位点序列；H区域与H1的B区域部分核酸序列互补，形成部分双链DNA。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：A区的核酸序列为 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-5'。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：B区的碱基数为7-15个，C区的碱基数6-10个，D和E区的碱基数为5-10个。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：F和G区域包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：核酸内切酶包括Nt.BbvCI、Bmtl、BseYI 、BstUI 。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：当核酸内切酶为Nt.BbvCI时，H2的H区域的核酸序列为5'-CCTCAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTGAGG-3'序列。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：当核酸内切酶为Bmtl时，H2的H区域的核酸序列为5'-GCTAGC-3'，H1的B区域中包含一段与之互补的5'-GCTAGC-3'序列。
8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。
9.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，包括核酸内切酶Nt.BbvCI和下列核酸序列：
核酸序列H1: 3'-TGATGGCTGTAGTGTTTCCGGGTTATCACTAGTTTGGTGGCACCAATGTCAGTCTCCTC-TTCGGAGTCGCTA-GAGGAGAC-5'；
核酸序列H2: 5'-AGTACTAG-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTCAGC-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CTAGTACT-3'。
10.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)先用杂交缓冲液分别溶解核酸H1和H2，将1 M的H1与待测溶液充分混匀，室温反应30分钟；
2)加入1 M的H2，分混匀，室温反应30分钟；
3)加入25 U的核酸内切酶，充分混匀，室温反应90分钟；
4)加入0.3 M的氯高铁血红素，室温反应30分钟；取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；如果待测溶液含有沙门氏菌时，溶液变色，如果待测溶液不含沙门氏菌时，溶液无色；
其中，杂交缓冲液体系、核酸内切酶、显色缓冲液体系和核酸序列H1、H2如权利要求1-9任一项所述。
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