CN107884580B

CN107884580B - 一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN107884580B
Application number: CN201710961241.6A
Authority: CN
Inventors: 陈俊华; 潘家峰; 周丹华; 陈曼佳
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environmental Science and Technology
Current assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Priority date: 2017-10-13
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: CN107884580A

Abstract

本发明公开了一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒，属于致病菌检测领域。以抗体连接DNA检测单增李斯特菌，抗体捕获单增李斯特菌后拉近DNA序列之间的距离，从而使分割分两部分的G‑四聚体序列靠近，形成具有催化活性的G‑四聚体结构，形成的G四聚体具有类似辣根过氧化物酶催化活性，可催化使无色底物变成蓝色，单增李斯特菌浓度与蓝色变化成正相关，从而可以判断检测体系中的单增李斯特菌浓度。本发明灵敏度高，特异性好，可直接实现对活菌的检测，无需破碎分离过程。本发明检测过程无需检测仪器，结果直接肉眼可见，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于临床样品、环境、食品中单增李斯特菌含量的快速检测。

Description

一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于致病菌检测领域，具体涉及一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。常见的单增李斯特菌检测主要依赖PCR技术，虽然灵敏度高，但是需要精确的温度扩增、昂贵的检测仪器，以及需要对检测菌进行破碎处理，此外，PCR检测不能区分样品中的单细胞增生李斯特菌活菌体和死菌体的数量分别为多少，严重限制了它们的广泛应用。也有报道采用ELISA技术检测单增李斯特菌，但往往需要引入酶进行信号输出，涉及多重的洗涤分离过程，增加了操作步骤。

发明内容

本发明的目的在于一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒，涉及抗体与核酸连接用于单增李斯特菌的可视化快速检测，可实时监测活菌的数量。

本发明所采取的技术方案是：

一种单增李斯特菌的检测试剂盒，包括缓冲液体系、氯高铁血红素、单增李斯特菌抗体、核酸DNA1、核酸DNA2；其中：

核酸DNA1依次具有a区域、b区域、c区域；单增李斯特菌抗体与核酸DNA1的a区域连接；

核酸DNA2依次具有d区域、b*区域、e区域；单增李斯特菌抗体与核酸DNA2的d区域连接；

其中b与b*区域互补，c和e区域是分割成两段的G四聚体序列。

优选的，a和d区域的碱基数为4-8个。

更优选的，a和d区域的碱基数为6个。

优选的，b和b*区域的碱基数为6-9个。

更优选的，b和b*区域的碱基数为7个。

c和e区域是分割成两段的G四聚体序列。一般来说，G四聚体序列是包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。比如，c区域是含两组-GGG-序列，则e区域也含两组-GGG-序列；如果c区域是含一组-GGG-序列，则e区域就含有三组-GGG-序列。c区域与e区域加起来总共包含有四组-GGG-序列。各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。对于中间的非G碱基的数量及构成没有要求。

优选的，c区域的序列为5'-GGGTAGGG-3'，e区域的序列为5'-CGGGTTGGG-3'。

优选的，c区域的序列为5'-TAGGGC-3'，e区域的序列为5'-GGGCGGGTTGGG-3'(SEQID NO：1)。

优选的，单增李斯特菌抗体通过氨基、羧基、生物素等与DNA1的a区域或核酸DNA2的d区域连接，或采用现有技术的其他方式进行连接。

所述单增李斯特菌抗体是以单增李斯特菌为抗原筛选出来的，与目标物特异性结合的。包括单抗和多抗。一个李斯特菌可以结合多个的抗体，其中只要有2个抗体结合就能完成本发明的检测。

优选的，缓冲液体系包括杂交缓冲液和显色缓冲液体系。

优选的，杂交缓冲液为PBS缓冲液，pH7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl。

优选的，显色缓冲液体系包括四甲基联苯胺-双氧水、邻苯二胺-双氧水或(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水体系。

优选的，核酸DNA1的序列为：5'-AAAAAA-CTGCACA-GGGTAGGG-3'(SEQ ID NO：2)。

优选的，核酸DNA2的序列为：5'-5'-CGGGTTGGG-TCTGCTG-AAAAAA-3'(SEQ ID NO：3)。

一种单增李斯特菌的检测方法，包括下列步骤：

将单增李斯特菌抗体与核酸DNA1、DNA2在杂交缓冲液中混合得到抗体-核酸复合物；其中单增李斯特菌抗体通过氨基、羧基、生物素等与DNA1或DNA2的连接，或采用现有技术的其他方式进行连接；

加入待测样品，充分反应；

加入氯高铁血红素，充分反应；

取适量上述溶液加入到显色缓冲液体系中，根据溶液的颜色来判断结果；

其中，单增李斯特菌抗体、核酸DNA1、核酸DNA2、杂交缓冲液、显色缓冲液体系如上述任一项所述。

本发明方法的反应原理是：

(1)单增李斯特菌抗体分别修饰核酸序列DNA1和DNA2。其中，DNA1包含三部分，分别是a、b以及c部分；DNA2包含三部分，分别是d、b*以及e部分；其中b与b*部分互补(没有单增李斯特菌活菌时，由于b与b*部分配对碱基数太少，难以配对结合)；c和e部分是分割成两段的G四聚体序列。体系没有被检测物单增李斯特菌活菌时，抗体分散在溶液中，DNA1和DNA2分离距离较远，c和e区域无法靠近形成完整结构的G四聚体序列。

(2)当检测物单增李斯特菌(活菌，死菌难以与抗体结合)存在时，抗体结合单增李斯特菌，分散在溶液中的抗体与单增李斯特菌相互作用，从而拉近DNA1和DNA2的距离，此时b与b*互补，从而使c和e部分靠近，c和e部分并列靠着无需对接即可实现G四聚体功能。

(3)c和e靠近后形成完整的G四聚体序列，加入氯高铁血红素(Hemin)后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H₂O₂(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测单增李斯特菌(活菌)的目的。没有单增李斯特菌活菌时，体系是无色的。

本发明的有益效果是：

(1)本发明方法采用抗体与核酸相连用于单增李斯特菌(活菌)的检测，兼备了抗体的高特异性以及核酸用于信号指示的作用，克服了单抗体检测需要涉及酶用于信号指示的缺点，同时克服了单核酸检测往往存在交叉反应的缺点。

(2)本发明方法以核酸G四聚体为信号报告分子，检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器。整个检测过程响应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。

(3)无需修饰，无需分离过程，简单混合即可检测，检测的致病菌无需破碎，可实时监测活菌的数量，在疾病诊断、环境保护以及食品安全方面具有重要意义。

附图说明

图1为本发明检测单增李斯特菌反应原理示意图；

图2为对不同浓度的单增李斯特菌检测结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

本发明方法的原理如下(图1所示)：

(3)c和e靠近后形成完整的G四聚体序列，加入氯高铁血红素(Hemin)后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H₂O₂(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测单增李斯特菌活菌的目的。没有单增李斯特菌活菌时，体系是无色的。

下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但不限于此。

实施例1

一种致病菌单增李斯特菌的检测试剂盒，包括以下成分：

(1)核酸DNA1、DNA2，序列如下：

DNA1：5'-NH₂-AAAAAA(a)-CTGCACA(b)-GGGTAGGG(c)-3'(SEQ ID NO：2)；

DNA2:5'-CGGGTTGGG(e)-TCTGCTG(b*)-AAAAAA(d)-NH₂-3'(SEQ ID NO：3)。

(2)单增李斯特菌抗体；

(3)单增李斯特菌标准液；

(4)PBS缓冲液，pH7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl；

(5)氯高铁血红素溶液；

(6)显色缓冲液，包含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10μL 0.5％的TMB，20μL 30％的H₂O₂，pH＝5.0。

实施例2

一种致病菌单增李斯特菌的检测方法，按照如下步骤进行：

(1)单增李斯特菌抗体与氨基修饰的核酸DNA1、DNA2相连：6mg/mL的抗体用PBS缓冲液(pH7.4，含有200mM NaCl以及50mM KCl)充分溶解后加入20mM EDC以及5mM NHS(EDC和NHS反应形成酰胺键，从而可以把氨基修饰的核酸连接在抗体上)，充分混匀，4℃反应2小时，随后加5M氨基修饰的DNA1、DNA2，充分混匀，4℃反应12小时，形成抗体-核酸复合物。

(2)在步骤(1)加入不同浓度的单增李斯特菌活菌菌液或待测溶液，充分混匀，室温反应40分钟。

(3)加入0.5M的hemin溶液(氯高铁血红素)，充分混匀，室温反应30分钟。

(4)取出步骤(3)中的50L反应液，加入到950L显色缓冲液中(含有26.6mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，25mM KCl，10L 0.5％的TMB，20L 30％的H₂O₂，pH＝5.0)，室温反应15分钟，观察颜色变化。当有单增李斯特菌活菌时，溶液变蓝，当没有单增李斯特菌活菌(死菌或空白溶液)时，溶液无色。

实施例3

对不同浓度单增李斯特菌的检测：

配制单增李斯特菌(活菌)标准溶液，菌数分别1x10³CFU/mL、1x10⁴CFU/mL、1x10⁵CFU/mL、1x10⁶CFU/mL、1x10⁷CFU/mL、1x10⁸CFU/mL。

将不同单增李斯特菌溶液分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，1x10³CFU/mL的单增李斯特菌可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为1x10³CFU/mL。随着单增李斯特菌浓度增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。

实施例4

特异性实验：

配制1x10⁵CFU/mL不同菌种标准溶液，它们分别是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、希瓦式菌、空肠弯曲杆菌以及结肠弯曲杆菌。

将1x10⁵CFU/mL的不同菌种干扰物和1x10⁵CFU/mL的单增李斯特菌溶液(活菌)分别加到实施例2中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，1x10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、希瓦式菌、空肠弯曲杆菌以及结肠弯曲杆菌没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入单增李斯特菌溶液后才会产生蓝色，这证明该方法对单增李斯特菌的检测具有很好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省生态环境技术研究所

<120> 一种致病性单增李斯特菌的检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggcgggttg gg 12

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaaaactgc acagggtagg g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgggttgggt ctgctgaaaa aa 22

Claims

1.一种单增李斯特菌的检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液体系、氯高铁血红素、单增李斯特菌抗体、核酸DNA1、核酸DNA2；其中：

核酸DNA1依次具有a区域、b区域、c区域；单增李斯特菌抗体与核酸DNA1的a区域连接；核酸DNA1的序列为：5'-AAAAAA-CTGCACA-GGGTAGGG-3'；

核酸DNA2依次具有d区域、b*区域、e区域；单增李斯特菌抗体与核酸DNA2的d区域连接；核酸DNA2的序列为：5'- 5'-CGGGTTGGG-TCTGCTG-AAAAAA-3'；

其中b与b*区域互补，c和e区域是分割成两段的G四聚体序列。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲液体系包括杂交缓冲液和显色缓冲液体系，杂交缓冲液为PBS缓冲液，pH7.4，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲液体系包括杂交缓冲液和显色缓冲液体系，显色缓冲液体系包括四甲基联苯胺-双氧水、邻苯二胺-双氧水或（2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水体系。

4.一种单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)将单增李斯特菌抗体与核酸DNA1、DNA2在杂交缓冲液中混合得到抗体-核酸复合物；

2)加入待测样品，充分反应；

3)加入氯高铁血红素，充分反应；

4)取适量上述溶液加入到显色缓冲液体系中，根据溶液的颜色来判断结果；

其中，单增李斯特菌抗体、核酸DNA1、核酸DNA2、杂交缓冲液、显色缓冲液体系如权利要求1-3任一项所述。