CN105352924B

CN105352924B - 一种铜离子检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN105352924B
Application number: CN201510698864.XA
Authority: CN
Inventors: 陈俊华; 周顺桂
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Current assignee: Guangdong Institute of Eco Environmental Science and Technology
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2018-06-19
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN105352924A

Abstract

本发明公开了一种铜离子检测方法及检测试剂盒，利用一个分子的叠氮基团和另外一个分子的炔基基团在一价铜离子的催化下，通过环加成反应，形成一个三唑五元环而被连接在一起，从而引发核酸序列打开荧光探针的发夹结构，并通过等温信号扩增实现了铜离子的检测，具有稳定性好、灵敏度高，选择性好，抗干扰能力强，成本低廉且无毒害，实用性强等优点，特别适用于环境样品的检测分析。

Description

一种铜离子检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种铜离子检测方法和检测试剂盒，尤其涉及一种基于点击化学和等温信号扩增用于铜离子的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

铜离子（Cu²⁺）是生物体必须的微量元素之一，过高或过低的Cu²⁺将会对生物体产生有害影响。Cu²⁺过量通常是由于环境重金属离子污染造成的，通过食物链在生物体富集，影响肝肾的正常代谢，造成神经退行性疾病以及引发癌症。因此，对Cu²⁺检测在生态环境保护以及食品安全方面具有重要意义，美国环境保护署规定饮用水中Cu²⁺浓度不能超过20mM。传统的Cu²⁺检测方法主要是石墨烯原子吸收光谱法以及电感耦合等离子体质谱法等。然而这些方法使用的仪器昂贵，需要专业的操作人员，限制了它们在基层实验室的使用。因此，有必要构建一种操作检测、经济便宜、灵敏度高的Cu²⁺检测方法和检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于点击化学和等温信号扩增用于铜离子的检测方法和检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种铜离子检测试剂盒，包括还原剂、dNTP、聚合酶、检测核酸序列和缓冲体系，检测核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成，其中：

核酸序列A为茎环结构DNA，两端分别修饰荧光基团和淬灭基团；

核酸序列B和C分别和核酸序列A环结构左右两侧序列互补配对，其配对后相邻的两端分别修饰有叠氮基团和炔基基团；

核酸序列D为核酸序列A的引物序列。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列A的茎杆长度为6～9bp。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列A的环长度为16～24个碱基。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列B和C的长度差不超过4个碱基。更佳的，核酸序列B和C的长度相同或相差一个碱基。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，还原剂选自维生素C、抗坏血酸盐、柠檬酸盐。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液。

本发明的有益效果是：

（1）基于点击化学检测铜离子，只需要在两段核酸序列分别修饰叠氮基团和炔基基团即可，无需铜离子特异的核酸酶，稳定性好，背景值低。

（2）基于聚合酶等温信号放大，可在室温下完成反应，无需温度控制，操作简单，扩增高效，可实现高灵敏铜离子检测。

（3）选择性好，抗干扰能力强，成本低廉且无毒害，实用性强，能用于环境样品的检测分析。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度的Cu²⁺检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

核酸序列D为核酸序列A的引物序列。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列A的茎杆长度为6～9bp，优选为7bp。这是因为序列过短的话难以成环，过长的话，难以打开茎环结构。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列A的环长度为16～24个碱基，优选为20个碱基。这是因为序列过短的话难以成环，过长的话，难以打开茎环结构。

作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，核酸序列B和C的长度差不超过4个碱基。更佳的，核酸序列B和C的长度相同或相差一个碱基。这样可以更好地保证核酸序列B和C与环区的结合力相近，保证其可以更好地反应。

核酸序列D的碱基数为8-12个，优选的为9个。

还原剂的作用在于将Cu²⁺还原为Cu⁺，一般选用弱还原剂。作为上述铜离子检测试剂盒的进一步改进，还原剂选自维生素C、抗坏血酸盐、柠檬酸盐。

本发明检测试剂的原理如图1所示，具体如下：

1)核酸A是一种茎环结构DNA，两端分别修饰荧光基团和淬灭基团。在A溶液中加入叠氮基团修饰的核酸B以及炔基基团修饰的核酸C，充分混匀。此时，B和C分别与A的环部分杂交，但由于B和C无法连在一起，A保持茎环结构状态。荧光处于淬灭状态，荧光强度较弱；

2)加入铜离子以及抗坏血酸钠溶液，充分混匀，二价铜离子会被还原成一价铜离子，一价铜离子可催化叠氮基团和炔基基团进行环加成反应，形成一个三唑五元环，从而把B和C连接在一起，形成一条完成的核酸链，从而把A的茎环结构打开，荧光基团和淬灭基团分开，发出较强的荧光；

3)加入核酸D作为引物序列，在dNTP和聚合酶的作用，可以以打开后的A为模板进行聚合反应，从而把B-C置换下来，B-C又可以重新和A杂交，从而可以不断的打开A，到达信号放大的目的，形成较强的荧光强度，铜离子浓度与荧光强度呈正相关，从而可以达到高灵敏检测铜离子的目的。

下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。

一种铜离子的检测试剂盒，包括以下成分：

核酸序列A、B、C、D，其中A的两端分别修饰荧光基团（FAM）和淬灭基团（DABCYL）；B的一端修饰叠氮基团（N₃）；C的一端修饰炔基基团（CH≡CH）。具体序列如下：

A：5’-(DABCYL)-CCTCTCTGTGTCTCGTGGCTTCCCGTCAGAGAGG-(FAM)-3’（SEQ ID NO：1），下划线标记的部分为茎环结构的茎杆区，中间序列为环区；

B：5’-CACGAGACAC-N₃-3’（SEQ ID NO：2）；

C：5’-CH≡CH-GACGGGAAGC-3’（SEQ ID NO：3）

D：5’-CCTCTCTGA-3’（SEQ ID NO：4）。

抗坏血酸钠标准溶液。

dNTPs和核酸聚合酶。

20 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.4，含有100 mM NaCl，5 mM MgCl₂）。

具体的铜离子检测方法如下：

1)500 nM的A用20 mM Tris-HCl缓冲液（pH7.4，含有100 mM NaCl，5 mM MgCl₂）溶解，然后分别加入100 nM的B和C，充分混匀，室温反应30分钟；

2)加入待测样品，以及五倍浓度的抗坏血酸钠标准溶液，室温反应90分钟；

3)加入D以及dNTPS和聚合酶，室温反应90分钟。反应完成后，体系在495 nm激发光的激发下，记录525 nm处的荧光发射光强度。荧光发射光强度与铜离子浓度呈正相关。

对不同浓度Cu²⁺的检测

配制Cu²⁺标准溶液，浓度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、200 nM、400 nM以及800 nM，室温保存。

将不同浓度的Cu²⁺溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图2所示，随着Cu²⁺浓度的增加，对应的荧光强度逐渐增强，当Cu²⁺浓度超过400nM时，逐渐达到饱和。以Cu²⁺浓度的对数（lgC）为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从0.1 nM到400 nM，线性方程是：F = 130.45 +213.24 lgC (R²=0.974)（F为荧光强度，C为汞离子浓度），按照3倍信噪比标准（3S/N），检测限为0.05 nM。

特异性实验

配制浓度为100 nM的不同干扰物标准溶液，分别是Pb²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺和Cr³⁺。

将100 nM的不同干扰物标准溶液和100 nM Cu²⁺标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100 nM的Pb²⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺和Cr³⁺的荧光强度与空白样品相比，变化不大，对检测不产生影响。只有当加入Cu²⁺才会使荧光强度明显增加，这证明该方法对Cu²⁺的检测具有很好的特异性。

<110> 广东省生态环境与土壤研究所

<120> 一种铜离子检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctctctgtg tctcgtggct tcccgtcaga gagg 34

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacgagacac 10

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacgggaagc 10

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctctctga 9

Claims

1.一种铜离子检测试剂盒，包括还原剂、dNTP、聚合酶、检测核酸序列和缓冲体系，其特征在于：检测核酸序列由核酸序列A、B、C、D组成，其中：

核酸序列A为茎环结构DNA，茎杆长度为6～9bp，环长度为16～24个碱基，两端分别修饰荧光基团和淬灭基团；

核酸序列D为核酸序列A的引物序列，长度为8～12个碱基。

2.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：核酸序列B和C的长度差不超过4个碱基。

3.根据权利要求1所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：核酸序列B和C的长度相同或相差一个碱基。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：还原剂选自维生素C、抗坏血酸盐、柠檬酸盐。

5.根据权利要求1～3任意一项所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液。

6.根据权利要求1～3任意一项所述的铜离子检测试剂盒，其特征在于：核酸序列A的环长度为19～21个碱基。