CN104977280A

CN104977280A - 基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN104977280A
Application number: CN201510282593.XA
Authority: CN
Inventors: 陈俊华; 周顺桂
Original assignee: Guangdong Institute of Eco Environment and Soil Sciences
Current assignee: Guangdong Institute of Eco Environmental Science and Technology
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2035-05-28
Also published as: CN104977280B

Abstract

本发明公开了一种基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒。设计富含T碱基的核酸为分子识别元件，通过T-Hg²⁺-T配对，与捕获探针结合，从而固定在磁珠上，磁珠分离后加入首尾互补的两条核酸探针，通过不断杂交互补，从而形成很长的双链DNA，磁珠分离后加入荧光嵌入剂Sybr Green I，它与双链DNA结合后具有很强的荧光特性，荧光强度与汞离子浓度具有很好的相关性，从而达到检测汞离子的目的。本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对Hg²⁺的检测限为2pM，具有很好的特异性，常见的其他干扰离子对检测不产生影响。信号放大过程源于DNA探针的首尾不断互补，无需使用蛋白酶，操作简单，成本低廉。

Description

基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于重金属离子检测领域，涉及一种汞离子检测技术，尤其涉及一种基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

汞离子（Hg²⁺）是一种具有致癌、致畸、致突变性的环境污染源，对生态环境和人体安全危害严重，是环境检测的重要指标。汞离子接触富集可导致肾脏衰竭、大脑受损、神经系统以及免疫系统损伤，因此，对Hg²⁺检测具有重要意义。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过10 nM。目前，汞离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用汞离子能与DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特异性地结合，形成T-Hg²⁺-T复合物，设计了一系列传感器用于汞离子的检测。但是潜在的缺点是检测灵敏度低，难以满足环境样品检测的需要，因此需要通过信号放大来提高检测灵敏度。目前常采用工具酶（核酸外切酶、核酸内切酶、DNA聚合酶等）来放大检测信号，但是这些蛋白酶的使用不但增加了实验成本，而且操作麻烦，酶容易受反应体系和环境因素的影响，不适应用于快速检测。因此，迫切需要建立一种无需蛋白酶参与的信号扩增技术用于Hg²⁺的高灵敏检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明旨在利用核酸探针首尾互补策略放大检测信号，建立一种汞离子高灵敏快速检测方法和检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种汞离子的检测试剂盒，其包括：

（1）分离介质

（2）DNA1，所述DNA1固定在分离介质上，其至少含有3个T碱基；

（3）DNA2，在Hg²⁺存在的情况下，DNA2中至少有3个T碱基与DNA1中的3个T碱基形成T-Hg²⁺-T复合物，从而把DNA2捕获在分离介质上；

（4）DNA3和DNA4，DNA3的5'端与DNA4的5'端互补，DNA3的3'端与DNA4的3'端互补，DNA3的3'端与DNA2的3’端互补；

（5）Sybr Green I荧光染料。

作为优选的，所述DNA3的3'端至少有8个碱基与DNA4的5'端互补；DNA3的5'端至少有8个碱基与DNA4的3'端互补。

作为优选的，DNA3的3'端至少有8个碱基与DNA2的3’端互补。

进一步优选的，各DNA序列如下所示：

（1）DNA1的序列如下：

5'-CAGTTTGGTTTTCTCTTGC -3'；

（2）DNA2的序列如下：

5'-GCTTGAGATTTTCCATTCTGACTACTAGGGTCTGAGGG-3'；

（3）DNA3的序列如下所示：

5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTAGTAGT-3；

（4）DNA4的序列如下所示：

5'-GCACCTGGGGGAGTAACTACTAGGGTCTGAGGG-3'。

作为优选的，所述分离介质包括磁珠、金纳米颗粒中的任一种；所述磁珠与DNA1通过链霉亲和素-生物素连接；所述金纳米与DNA1通过巯基连接。

作为优选的，所述试剂盒中还包括pH7.5的Tris-醋酸缓冲液。

一种汞离子的检测方法，包括如下步骤：

（1）将DNA1固定在分离介质上，然后分散于缓冲溶液中；

（2）加入DNA2和待检样品，混匀，分离分离介质，去除多余的DNA2；

（3）加入DNA3和DNA4，混匀，分离分离介质，去除多余的DAN3和DNA4；

（4）加入Sybr Green I荧光染料，混匀，检测荧光强度，根据事先建立的标准曲线，计算待检样品中汞离子的浓度；

其中，DNA1～DNA4的序列组成如上所示。

作为优选的，所示缓冲液为pH7.5的Tris-醋酸缓冲液。

步骤（4）是在495 nm光源激发下，测525 nm处的荧光强度。

本发明的有益效果是：

本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对Hg²⁺的检测限为2 pM，具有很好的特异性，常见的其他干扰离子对检测不产生影响。信号放大过程源于DNA探针的首尾不断互补，无需使用蛋白酶，操作简单，成本低廉。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度的Hg²⁺检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

基于核酸探针首尾互补策略用于汞离子的检测试剂盒，包括以下成分：

（1）链霉亲和素修饰的磁珠；

（2）生物素修饰的DNA1，序列如下：

5'-CAGTTTGGTTTTCTCTTGC-Biotin-3'（SEQ ID NO.1）

（3）DNA2，序列如下：

5'-GCTTGAGATTTTCCATTCTGACTACTAGGGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO.2）

（4）DNA3和DNA4，序列如下：

DNA3：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTAGTAGT-3'（SEQ ID NO.3）；

DNA4：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTACTAGGGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO.4）。

DNA3的5'端与DNA4的5'端互补，DNA3的3'端与DNA4的3'端互补，DNA3的3'端与DNA2的3’端互补；。

（5）20 mMTris-醋酸缓冲液（pH 7.5，含有50 mM醋酸钠）。

（6）Sybr Green I 溶液。

本试剂盒的工作原理为：

1）通过链霉亲和素-生物素相互作用，DNA1被固定在磁珠上，通过磁珠分离，去除多余的DNA1。

2）在Hg²⁺存在的情况下，DNA2中至少有3个T碱基与DNA1中的3个T碱基形成T-Hg²⁺-T复合物，从而把DNA2捕获在磁珠上，通过磁珠分离，去除多余的DNA2。

3）DNA3的3'端通过与DNA2互补，被捕获在磁珠上，随后通过DNA3和DNA4不断的首尾互补杂交，形成很长的双链DNA，通过磁珠分离，去除多余的DNA3和DNA4。

4）加入Sybr Green I荧光染料，它能与双链DNA特异性结合，在495 nm光激发下，在525 nm处有很强的荧光。荧光强度与Hg²⁺浓度具有相关性，从而可达到检测Hg²⁺的目的。如果没有Hg²⁺存在，DNA2无法捕获在磁珠上，从而DNA3和DNA4无法在磁珠上组装，磁珠分离后，体系荧光很弱，只有背景荧光。

实施例2

基于核酸探针首尾互补策略用于汞离子的检测方法，按照如下步骤进行：

（1）将1 mM生物素修饰的DNA1加入到链霉亲和素修饰的磁珠溶液中，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离，去除多余的DNA1。

（2）磁珠-DNA1混合物用20 mMTris-醋酸缓冲液（pH 7.5，含有50 mM醋酸钠）重悬，然后加入1 mM的DNA2，以及Hg²⁺，充分混匀，室温反应30分钟，磁珠分离，去除多余的DNA2。

（3）上述混合物再次用20 mMTris-醋酸缓冲液（pH 7.5，含有50 mM醋酸钠）重悬，再加入2mM DNA3和2mM DNA4，室温反应60分钟，磁珠分离，去除多余的DNA3和DNA4。

（4）上述混合物再次用20 mMTris-醋酸缓冲液（pH 7.5，含有50 mM醋酸钠）重悬，再加入Sybr Green I溶液，在495 nm光源激发下，测525 nm处的荧光强度。荧光强度与Hg²⁺浓度具有相关性。

实施例3

对不同浓度Hg²⁺的检测：

配制Hg²⁺标准溶液，浓度分别为10pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM和500 nM，室温保存。

将不同浓度的Hg²⁺溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图2所示，随着Hg²⁺浓度的增加，对应的荧光强度也增加，当Hg²⁺浓度超过100 nM时，逐渐达到饱和。以Hg²⁺浓度的对数（lg^{汞离子浓度}）为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，二者具有很好的线性关系，线性范围是从10pM到100 nM，线性方程是：F = 191.8 lgC + 18.4 （R=0.989），按照3倍信噪比标准（3S/N），检测限为2 pM。

实施例4

特异性实验：

配制浓度为100 nM的不同干扰物标准溶液，分别是Cu²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cd²⁺和Zn²⁺。

将100 nM的不同干扰物标准溶液和100pM Hg²⁺标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后检测荧光强度，如图3所示，100 nM的Cu²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Cd²⁺和Zn²⁺的荧光强度很弱，对检测不产生影响。只有当加入Hg²⁺才会使荧光强度明显增加，这证明该方法对Hg²⁺的检测具有很好的特异性。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东省生态环境与土壤研究所

<120> 基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagtttggtt ttctcttgc 19

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttgagatt ttccattctg actactaggg tctgaggg 38

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tactccccca ggtgcccctc agaccctagt agt 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcacctgggg gagtaactac tagggtctga ggg 33

Claims

1.一种汞离子的检测试剂盒，其包括：

（1）分离介质

（5）Sybr Green I荧光染料。

2.根据权利要求1所述的汞离子的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA3的3'端至少有8个碱基与DNA4的5'端互补；DNA3的5'端至少有8个碱基与DNA4的3'端互补。

3.根据权利要求1所述的汞离子的检测试剂盒，其特征在于，DNA3的3'端至少有8个碱基与DNA2的3’端互补。

4.根据权利要求1所述的汞离子的检测试剂盒，其特征在于：

（1）DNA1的序列如下：

5'-CAGTTTGGTTTTCTCTTGC-3'；

（2）DNA2的序列如下：

5'-GCTTGAGATTTTCCATTCTGACTACTAGGGTCTGAGGG-3'；

（3）DNA3的序列如下所示：

5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTAGTAGT-3；

（4）DNA4的序列如下所示：

5'-GCACCTGGGGGAGTAACTACTAGGGTCTGAGGG-3'。

5.根据权利要求1所述的汞离子的检测试剂盒，其特征在于，所述分离介质包括磁珠、金纳米颗粒中的任一种；所述磁珠与DNA1通过链霉亲和素-生物素连接；所述金纳米与DNA1通过巯基连接。

6.根据权利要求1-5任一项所述的汞离子的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括pH7.5的Tris-醋酸缓冲液。

7.一种汞离子的检测方法，包括如下步骤：

（1）将DNA1固定在分离介质上，然后分散于缓冲溶液中；

其中，DNA1～DNA4的序列组成如权利要求1-4任一项所示。

8.根据权利要求7所述的汞离子的检测方法，其特征在于，所述分离介质包括磁珠、金纳米颗粒中的任一种；所述磁珠与DNA1通过链霉亲和素-生物素连接；所述金纳米与DNA1通过巯基连接。

9.根据权利要求7所述的汞离子的检测方法，其特征在于，所示缓冲液为pH7.5的Tris-醋酸缓冲液。

10.根据权利要求7所述的汞离子的检测方法，其特征在于，步骤（4）是在495 nm光源激发下，测525 nm处的荧光强度。