RU2609431C1 - Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты - Google Patents
Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2609431C1 RU2609431C1 RU2015145879A RU2015145879A RU2609431C1 RU 2609431 C1 RU2609431 C1 RU 2609431C1 RU 2015145879 A RU2015145879 A RU 2015145879A RU 2015145879 A RU2015145879 A RU 2015145879A RU 2609431 C1 RU2609431 C1 RU 2609431C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- products
- hydrolysis
- acetonitrile
- minutes
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) включает хроматографическое определение продуктов гидролиза. При этом анализ проводят на хроматографической колонке с фазой, представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С. Причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скоростью элюирования 0,6 мл/мин. Техническим результатом является обеспечение возможности приемлемого разделения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.
Description
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
В последние годы интенсивно развивается направление выявления маркеров, так или иначе связанных с ДНК опухолевых клеток. К этим маркерам относятся опухоле-специфичные мутации, метилированные фрагменты ДНК и аддукты ДНК. Аддукты ДНК аддукты могут быть потенциальными маркерами риска возникновения рака легкого, так как их содержание в тканях является результирующей взаимодействия канцерогенных факторов и реакцией организма с учетом индивидуальных особенностей систем метаболизма и репарации. Наличие патогенетически значимых для опухоли изменений ДНК в циркулирующих ДНК крови идентифицируют и количественно определяют методами масс-спектрометрии (TOF/TOF, TOF/MS, реже MS/MS). Для масс-спектрометрического анализа аддукты ДНК необходимо высвободить в виде отдельных модифицированных азотистых оснований и/или нуклеозидов. Для этого ДНК подвергается термическому, химическому или энзиматическому гидролизу. В то время как многие аддукты ДНК, включая 7-алкил-гуанин‚ 3-алкил-аденин и 8-нитро-гуанин, термически неустойчивы и могут быть селективно высвобождены из структуры ДНК путем нагрева [1, 2], другие повреждения ДНК стабильны и требуют расщепления. Этот шаг может быть выполнен либо путем ферментативного, либо путем химического гидролиза. При химическом гидролизе ДНК расщепляется путем разрыва обеих эфирных связей и фосфатных N-гликозидных между дезоксирибозой и пуриновым (пиримидиновым) основанием. В ходе такого гидролиза в смеси наблюдается большой набор соединений различных классов, но сходных по физико-химическим свойствам, что затрудняет их хроматографическое разделение. При этом очевидно, что без хроматографического разделения смеси невозможно корректно идентифицировать продукты гидролиза, в том числе и аддукты ДНК методами масс-спектрометрии.
Известны различные способы разделения продуктов химического гидролиза ДНК методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) – обращенно-фазовая хроматография и хроматография гидрофильного взаимодействия. Каждый из методов имеет ряд недостатков. Обращенно-фазовая хроматография не способна качественно разделить полярные компоненты, что вынуждает использовать более длинные колонки для увеличения времени удерживания, что приводит к удорожанию анализа, а также уменьшению стабильности масс-спектрометрической системы при дальнейшей идентификации аддуктов ДНК. Хроматография гидрофильного взаимодействия позволяет эффективно разделить все продукты гидролиза ДНК, но при этом требует длительной пробоподготовки, в ходе которой есть вероятность потери аддуктов ДНК и других продуктов гидролиза.
Известен способ хроматографического разделения продуктов гидролиза ДНК продуктов с помощью хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) - варианта нормальнофазной хроматографии на специальных колонках [3]. В качестве неподвижной фазы используется амидная колонка TSKgel Amide-80 2,0×150 мм с размером зерна 3 мкм. В качестве элюентов используется ацетонитрил и 10 миллимоль ацетата аммония в воде. Общее время анализа составляет 100 минут. Для проведения хроматографического разделения образец должен представлять собой смесь продуктов гидролиза в ацетонитриле или метаноле, для чего образец содержащий продукты гидролиза ДНК, упаривают под током азота и затем сухой остаток растворяют в ацетонитриле. Существенными недостатками данного метода являются трудоемкость пробоподготовки, а так же длительное время разделения продуктов гидролиза - 100 минут, что увеличивает стоимость одного анализа в несколько раз. Кроме того, для идентификации продуктов гидролиза необходимо растворение стандартных образцов веществ в ацетонитриле или метаноле, что не представляется возможным для некоторых соединений.
Известен другой способ разделения продуктов гидролиза ДНК с помощью обращенно-фазной хроматографии на колонках С18 [4]. Данный способ находит более широкое применение, так как анализируемая проба и стандарты веществ находятся в водном растворе. В качестве колонки для разделения используется Restec Ultra C18 4,6×250 мм с размером зерна 5 мкм. В качестве элюентов используются ацетонитрил и 85 миллимолярного ацетата аммония в воде. Недостатком данного способа недостаточное удерживание на колонке полярных компонентов, поэтому для улучшения разделения полярных компонентов в данном способе предлагается использовать более длинные колонки, но при этом увеличивается время анализа и расход элюентов, что также увеличивает стоимость разделения.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа хроматографического разделения и определения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК.
Поставленная задача решается тем, что способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включает хроматографическое определение продуктов гидролиза, но в отличие от прототипа, анализ проводят на хроматографической колонке с фазой представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С, причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скорость элюирования 0,6 мл/мин.
При скорости потока 0,6 мл/мин, используют спектрофотометрический детектор с длиной волны 260 нм с последующим определением времени удержания и площадей хроматографических пиков продуктов химического гидролиза ДНК.
Для анализа используют колонки с сорбентом Luna PFP(2), обеспечивающим выдающуюся селективность для сильнополярных соединений, сложных природных продуктов, изомеров и других близко родственных соединений. Это достигается за счёт использования пентафлуорофенила на пропильном линкере, который обеспечивает множество механизмов удерживания в отличие от традиционных носителей с обратной фазой (С18, С8), в которых селективность обеспечивается только одним механизмом взаимодействия.
Механизмы взаимодействия, обеспечивающие селективность
колонкам Luna PFP(2):
колонкам Luna PFP(2):
• Водородные граничные взаимодействия;
• Диполь-дипольные взаимодействия;
• Ароматические и π-π взаимодействия;
• Гидрофобные взаимодействия.
Основными преимуществами Luna PFP(2) является превосходная селективность, достигаемая за счёт 4 механизмов взаимодействия и ортогональную селективность даже при использовании традиционных обращённо-фазовых систем с подвижной фазой.
Применение муравьиной кислоты позволяет использовать данный способ разделения продуктов гидролиза ДНК для масс-спектрометрического детектирования продуктов гидролиза ДНК, в отличие от фосфатных буферов. Также применение муравьиной кислоты позволяет повысить эффективность ионизации продуктов гидролиза в положительном режиме при масс-спектрометрическом детектировании.
Использование градиентного режима позволяет последовательно десорбировать компоненты смеси с неподвижной фазы, а также применение ацетонитрила до 25 % в качестве элюента позволяет существенно сократить стоимость анализа.
Использование заявляемых условий позволяет добиться приемлемого разделения продуктов химического гидролиза ДНК с целью идентификации аддуктов ДНК.
В дальнейшем способ поясняется примерами.
ПРИМЕР 1. Путем растворения готовят водный раствор стандартных веществ: аденин, гуанин, цитизин, цитидин, тимин, тимидин, 2-дезоксигуанозин. Далее из анализируемой смеси отбирают пробу объёмом 1 мкл и вводят в жидкостной хроматограф. Для разделения смеси используют колонку Phenomenex Luna PFP(2) 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, где разделение проводят в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой. Скорость элюирования 0,6 мл/мин. Детекция продуктов гидролиза осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны 260 нм. В результате анализа определяют времена удерживания продуктов гидролиза для идентификации: аденин (время удержания = 2,727 мин), гуанин (время удержания = 4,187 мин), цитизин (время удержания = 4,873 мин), цитидин (время удержания = 5,807 мин), тимин (время удержания = 7,940 мин), тимидин (время удержания = 8,073 мин), 2-дезоксигуанозин (время удержания = 8,560 мин).
На рисунке 1 представлена хроматограмма стандартных веществ, характерных для химического гидролиза ДНК.
ПРИМЕР 2. ДНК выделенную колоночным методом подвергают химическому гидролизу 0,1 М соляной кислотой при 70 °С в течение 4 часов. После охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют эквимолярным количеством гидроксида натрия. Далее из анализируемой смеси отбирают пробу объёмом 1 мкл и вводят в жидкостной хроматограф. Для разделения смеси используют колонку Phenomenex Luna PFP(2) 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, где разделение проводят в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой. Скорость элюирования 0,6 мл/мин. Детекция продуктов гидролиза осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны 260 нм. В результате анализа определяют времена удерживания продуктов гидролиза для идентификации: аденин (время удержания = 2,727 мин), гуанин (время удержания = 4,007 мин), цитизин (время удержания = 4,847 мин), цитидин (время удержания = 5,747 мин), тимин (время удержания = 7,933 мин), тимидин (время удержания = 8,180 мин), 2-дезоксигуанозин (время удержания = 8,607 мин).
На рисунке 2 представлена хроматограмма продуктов химического гидролиза ДНК.
Источники информации
1. Googin M., Loeber R., Prk S., Walker V., Wickliffe J., and Tretyakova N. HPLC-ESI+-MS/MS analysis of N7-gunine-N7-guanine DNA cross-links in tissues of mice exposed to 1,3-butadiene. 2007 // Chemical Research in Toxicology. 20, 5: 839-847.
2. Singer B., and Grunberger D. Molecular Biology of Mutagens and Carcinogens. 1983. Plenum Press, New York and London.
3. Chen P., Li W., Li Q., Wang Y., Li Z., Ni Y., Koike K.
4. Kelly M.C., White B., Smyth M.R. Separation of oxidatively damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18 columns by HPLC-UV-EC // Journal of Chromatography B. 863 (2008) 181-186.
Claims (2)
1. Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), включающий хроматографическое определение продуктов гидролиза, отличающийся тем, что анализ проводят на хроматографической колонке с фазой, представляющей собой диоксид кремния, модифицированный пентафторфенилом 4.6×150 мм с размером зерна 5 мкм, при 28 °С, причем адсорбировавшиеся на продукты гидролиза ДНК элюируют смесью воды с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила в градиентном режиме: на первом этапе градиент ацетонитрила изменяется линейно от 0 до 25 % за 6 минут, затем в течение 4 минут выдерживается режим с 25 % ацетонитрилом, на заключительном этапе происходит уравновешивание фазы в течение 4 минут 100 % водой с 0,1 % муравьиной кислотой со скорость элюирования 0,6 мл/мин.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при скорости потока 0,6 мл/мин используют спектрофотометрический детектор с длиной волны 260 нм с последующим определением времени удержания и площадей хроматографических пиков продуктов химического гидролиза ДНК.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015145879A RU2609431C1 (ru) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015145879A RU2609431C1 (ru) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2609431C1 true RU2609431C1 (ru) | 2017-02-01 |
Family
ID=58457139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015145879A RU2609431C1 (ru) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2609431C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1239588A1 (ru) * | 1984-09-27 | 1986-06-23 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Способ разделени нуклеиновых кислот |
| RU2004136875A (ru) * | 2004-12-16 | 2006-05-27 | Федеральное государственное унитарное предпри тие"Московское машиностроительное производственное предпри тие "Салют" (RU) | Способ определения молекулярно-массового распределения олигомеров этоксисилоксанов в гидролизованных и негидролизованных этилсиликатах |
| CN104977280A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-14 | 广东省生态环境与土壤研究所 | 基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒 |
-
2015
- 2015-10-27 RU RU2015145879A patent/RU2609431C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1239588A1 (ru) * | 1984-09-27 | 1986-06-23 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Способ разделени нуклеиновых кислот |
| RU2004136875A (ru) * | 2004-12-16 | 2006-05-27 | Федеральное государственное унитарное предпри тие"Московское машиностроительное производственное предпри тие "Салют" (RU) | Способ определения молекулярно-массового распределения олигомеров этоксисилоксанов в гидролизованных и негидролизованных этилсиликатах |
| CN104977280A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-10-14 | 广东省生态环境与土壤研究所 | 基于核酸探针首尾互补策略的汞离子的检测方法及检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Googin M. et al, HPLC-ESI+-MS/MS analysis of N7-gunine-N7-guanine DNA cross-links in tissues of mice exposed to 1,3-butadiene, Chemical Research in Toxicology, 839-847, 20(5), 2007; * |
| Kelly M.C. et al, Separation of oxidatively damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18 columns by HPLC-UV-EC, Journal of Chromatography B. Pages 181-;186, Volume 863, 15.02.2008; * |
| Kelly M.C. et al, Separation of oxidatively damaged DNA nucleobases and nucleosides on packed and monolith C18 columns by HPLC-UV-EC, Journal of Chromatography B. Pages 181-;186, Volume 863, 15.02.2008;SU 1239588 A1 23.06.1986;RU 2004136875 A 27.05.2006;Googin M. et al, HPLC-ESI+-MS/MS analysis of N7-gunine-N7-guanine DNA cross-links in tissues of mice exposed to 1,3-butadiene, Chemical Research in Toxicology, 839-847, 20(5), 2007;CN 104977280 A 14.10.2015. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hsieh | Potential of HILIC‐MS in quantitative bioanalysis of drugs and drug metabolites | |
| Vellaichamy et al. | Size-sorting combined with improved nanocapillary liquid chromatography− mass spectrometry for identification of intact proteins up to 80 kDa | |
| Rojo et al. | LC–MS metabolomics of polar compounds | |
| Xing et al. | Liquid chromatographic analysis of nucleosides and their mono‐, di‐and triphosphates using porous graphitic carbon stationary phase coupled with electrospray mass spectrometry | |
| Klaene et al. | The analysis of DNA adducts: The transition from 32P-postlabeling to mass spectrometry | |
| Karch et al. | Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry | |
| Manig et al. | The why and how of amino acid analytics in cancer diagnostics and therapy | |
| Levin et al. | Combining ion pairing agents for enhanced analysis of oligonucleotide therapeutics by reversed phase-ion pairing ultra performance liquid chromatography (UPLC) | |
| Zheng et al. | UPLC-ESI-MS-MS determination of three β 2-agonists in pork | |
| Neubauer et al. | Mass spectrometry based analysis of nucleotides, nucleosides, and nucleobases—application to feed supplements | |
| Qin et al. | Quantification of nucleotides and their sugar conjugates in biological samples: purposes, instruments and applications | |
| Langridge et al. | Gas chromatography/mass spectrometric analysis of urinary nucleosides in cancer patients; potential of modified nucleosides as tumour markers | |
| Lioupi et al. | State-of-the-art in LC–MS Approaches for Probing the Polar Metabolome | |
| Hsieh et al. | Supercritical fluid chromatography/tandem mass spectrometric method for analysis of pharmaceutical compounds in metabolic stability samples | |
| RU2609431C1 (ru) | Способ определения продуктов химического гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты | |
| US9441053B2 (en) | Analytical method for detecting sulfated oligosaccharides | |
| Giessing et al. | A nano-chip-LC/MS n based strategy for characterization of modified nucleosides using reduced porous graphitic carbon as a stationary phase | |
| Mess et al. | Selection of HILIC columns to handle matrix effect due to phospholipids | |
| Guo et al. | Graphene as adsorbent for highly efficient extraction of modified nucleosides in urine prior to liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis | |
| Murakami et al. | Facile and effective pretreatment using stop and go extraction tips for LC-MS/MS analysis of trace amounts of DNA adducts | |
| Lai et al. | Nucleoside reverse transcriptase inhibitors and their phosphorylated metabolites in human immunodeficiency virus-infected human matrices | |
| Li et al. | Analysis of modified nucleosides in the urine of patients with malignant cancer by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry | |
| Hackett et al. | Extraction and analysis of clonazepam and 7-aminoclonazepam in whole blood using a dual internal standard methodology | |
| Sun et al. | High-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of cytarabine and its valyl prodrug valcytarabine in rat plasma | |
| Stephanson et al. | Determination of urinary 5-hydroxytryptophol glucuronide by liquid chromatography–mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180110 Effective date: 20180110 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180110 Effective date: 20220209 |