CN107748148A - 基于石墨烯氧化物双氨基固定多t序列检测汞离子的方法 - Google Patents

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高力
邓泽斌
黎雪琴
李娆琪
施海峰
周阳
张春霞
时海霞
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Abstract

本发明基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法，属于环境检测领域中重金属的生物学检测方法。先利用NHS/EDC对GO进行活化,暴露出GO表面的羧基，以利于DNA序列的结合，加入双氨基的多T部分双链序列和活化GO，使得双氨基的多T序列固定化结合在GO表面。加入不同浓度的Hg2+，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析汞离子浓度。本发明充分利用活化氧化石墨烯表面羧基高效固定双氨基修饰的多T序列，汞离子能与多T序列形成‑T‑Hg2+‑T‑配对，导致DNA序列构象变化，荧光强度发生相应变化。汞离子加入的量与荧光变化值呈正相关，基于此检测汞离子浓度，提高了对汞离子检测的信噪比。

Description

基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法
技术领域：
本发明属于环境检测领域中重金属的生物学检测方法，基于氧化石墨烯(GO)固定双氨基化的多T序列(羧基荧光素—FAM标记)，来高灵敏性检测重金属汞离子。
背景技术：
重金属离子对自然环境以及人类健康生活存在着巨大的威胁，其中的汞离子(Hg2 +)广泛分布于空气、水域、土壤之中，因而被认为是危害生态环境最严重的金属阳离子之一。一系列的自然或人为过程导致了汞离子的毒性污染，如火山喷发、采矿、固体废弃物焚烧、燃烧化石燃料等。Hg2+在生物体内富集，会造成多种疾病，如大脑肾脏损伤、严重的认知和运动功能障碍、植物神经紊乱、水俣病等。(Mingjian Yuan et al.A Colorimetric andFluorometric Dual-Modal Assay for Mercury Ion by a Molecule.Org.Lett.2007,9,2313-2316；Jianjun Du et al.Colorimetric Detection of Mercury Ions Based onPlasmonic Nanoparticles.Small.2013,9,1467-1481)。因此，对人类息息相关的生态环境中汞离子的检测是非常重要的，发展一种高效、快速、低成本检测汞离子的技术至关重要。
氧化石墨烯是石墨烯的一种衍生物，制作简单且成本较低，二维结构的氧化石墨烯表面积大，为DNA提供了众多的结合位点。使用NHS/EDC[N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]活化GO表面，使得GO表面羧基化。双氨基修饰的多T序列特异性结合在活化的GO表面，由于汞离子能与多T序列形成-T-Hg2+-T-配对，导致DNA序列形成发夹结构，FAM标记的一端远离石墨烯表面，荧光恢复，随着汞离子加入的浓度不同，荧光发生相应的变化，本实验以此来检测汞离子。
发明内容：
一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，按照下述步骤进行：
(1)氧化石墨烯(GO)活化：配制含50mM NHS与200mM EDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/ml GO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱。
(2)双氨基序列固定:在10mM的PBS缓冲溶液，加入部分双链的双氨基多T序列和活化10ug/ml GO，4℃，过夜，离心，去上清，再加入等体积PBS缓冲液，混匀，测量其荧光强度。
(3)汞离子检测及分析：向(2)中液体里加入不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析汞离子浓度，确定该传感器的灵敏度；再于(2)中的体系中加入适量的长江水，检测其汞离子浓度。
步骤(2)中所述部分双链的双氨基多T|序列为
5’NH2-GAT AGC TTT GCT TGT TGC GCT TCT TGC TTT-FAM-3’；
|||||||
5’NH2-CTA TCG-3’。
步骤(2)中所述的GO浓度为10μg/ml。
步骤(2)中所述的双氨基的多T部分双链序列浓度为50nM。
本发明充分利用活化氧化石墨烯表面的羧基与修饰在多T序列上的双氨基特异性结合，大大增强了固定化效率。而汞离子能与多T序列形成-T-Hg2+-T-配对，导致DNA序列构象变化，形成发夹结构，FAM标记的一端远离石墨烯表面，荧光恢复。汞离子加入的量与荧光变化值呈正相关，基于此检测汞离子浓度。
本发明具有以下优点：
(1)本发明中氧化石墨烯纳米材料易于获得，方法简单、成本低。利用荧光共振能量转移(FRET)的原理，GO对DNA上的FAM荧光具有高效淬灭效率，双氨基修饰的多T列固定化效率高，利于汞离子检测。
(2)本发明基于汞离子与多T序列的特异性，引起DNA构象变化，发夹结构形成时，FAM会远离GO表面，荧光强度有不同程度回复。
(3)双氨基固定结合DNA构象变化能有效提高检测的信噪比，而实现对汞离子快速、低成本检测。
附图说明
图1该传感器检测0-10uM的汞离子的荧光图；
图2该传感器检测0-10uM汞离子的回复率图；
图3该传感器检测100nM同浓度的其它重金属离子与汞离子回复效果的对比；
图4该传感器检测主要步骤示意图；(1.离心去除未吸附的DNA；2.加入可卡因,DNA构象变化,荧光恢复；3.注释)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
实施例：
(1)合成特异的DNA序列：
多T序列1：5’NH2-GAT AGC TTT GCT TGT TGC GCT TCT TGC TTT-FAM-3’；
多T序列2：5’NH2-CTA TCG-3’。将同浓度的这两条单链序列于95度高温下五分钟，室温下静置两小时，杂交成部分双链DNA。
(2)GO活化：配制含50mM NHS与200mM EDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/ml GO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱。
(3)双氨基序列固定:200μl 10mM PBS溶液，加入50nM双氨基的多T部分双链序列和10ug/ml活化GO，4℃，过夜，取出，10000rpm离心20min，去除上清液，加入等体积10mM PBS缓冲液，混匀。并测量其荧光强度。
(4)汞离子检测及分析：首先向(2)中液体里加不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析该传感器的灵敏度。取适量长江水，经过滤去除其沉淀物。在200μl 10mM PBS溶液加入50nM双氨基的多T部分双链序列和10ug/ml活化GO，4℃，过夜，取出，10000rpm离心20min，去除上清液，加入200μl长江水，混匀。测量其荧光强度，分析其汞离子浓度。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gatagctttg cttgttgcgc ttcttgcttt 30
<210> 2
<211> 6
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
ctatcg 6

Claims (4)

1.一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)氧化石墨烯(GO)活化：配制含50mM NHS与200mM EDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/ml GO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱；
(2)双氨基序列固定:在10mM的PBS缓冲溶液，加入部分双链的双氨基多T序列和活化10ug/ml GO，4℃，过夜，离心，去上清，再加入等体积PBS缓冲液，混匀，测量其荧光强度；
(3)汞离子检测及分析：向(2)中液体里加入不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析汞离子浓度，确定该传感器的灵敏度；再于(2)中的体系中加入适量的长江水，检测其汞离子浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于步骤(2)中所述部分双链的双氨基多T|序列为
5’NH2-GAT AGC TTT GCT TGT TGC GCT TCT TGC TTT-FAM-3’；
|||||||
5’NH2-CTA TCG-3’。
3.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于步骤(2)中所述的GO浓度为10μg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于步骤(2)中所述的双氨基的多T部分双链序列浓度为50nM。
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