CN105002269A - 一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法 - Google Patents

一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法 Download PDF

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蔡义林
顾晨瑶
邵小敏
王立梅
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Abstract

本发明涉及一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，包括：（1）DNA片段P1和P2的前半段通过碱基互补配对结合成P1-P2复合体；（2）能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段P和P2的后半段在待测样品中汞离子的作用下，通过形成T-Hg2+-T结构相结合；（3）核酸外切酶III从P2的5’端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出P1和汞离子；（4）P1和血红素结合后催化ABTS盐与双氧水反应；（5）通过检测体系中的吸光值确定汞离子的浓度。本发明设计了一张汞离子生物传感器，用以实现水中汞离子的简单、快速、高灵敏检测。

Description

一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法
技术领域
    本发明属于食品安全技术和分析化学技术领域，涉及一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法。
背景技术
汞离子是一种在环境中普遍存在的污染物，其毒性非常大，不易被降解，并能通过甲基化作用转化成有机汞，并通过食物链产生富集效果，最终导致在人体内积累，对人类的健康和生命造成严重的威胁，例如：对 DNA 的破坏，对肾和肝脏的破坏，对大脑以及引起中枢神经的破坏、使心肌梗死的危险增大等。汞离子的长时间沉积会造成土壤和水域环境的不可逆性污染，水溶性汞离子是其中最常见也是最稳当的汞污染物。因此，对于检测水溶性汞离子进行检测与监控十分必要，相关的技术的开发随之而来。
目前对汞离子的检测主要以仪器检测方法为主，如原子吸收光谱法、质谱法等，这些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求。近年来核酸适体得到了广泛的研究与应用。利用核酸适体高特异性结合目标物的特性发展的生物传感器对代谢物、DNA、蛋白质等物质进行临床疾病的快速、准确的检测与监控，是分析化学中非常热门的研究课题之一。
研究人员发现，二价的金属汞离子能够与核酸中的两个胸腺嘧啶碱基（T）形成非常稳定的T-Hg2+-T配合物结构。基于此特异性作用，研究者已经构建了一系列对汞离子检测的生物传感器，这类传感器具有选择性好，特异性好的优点。在以往的研究中，借助此特异性作用而建立的比色方法也得到了很多的研究，但其依赖于对核酸的标记，而且信号容易受到环境的影响。以免标记配子建立的检测方法具有操作简便，节约成本的特点，其已经得到研究者的普遍关注。虽然此类非标记检测方法具有高的灵敏度与特异性，为了进一步提高其检测限，人们研究了一些以酶，磁纳米粒子，靶物质诱导的变构组装等辅助信号放大系统以分析目标物。
为满足免标记、简单、快速分析检测低浓度汞离子的要求，基于核酸适体对汞离子的强亲合力和高识别性（T-Hg2+-T），借助外切酶Ⅲ的循环信号放大系统，我们开发了一种操作简单、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中汞离子的含量，极大地提高了汞离子的检测限。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，实现水中汞离子的高灵敏度、高选择性检测。
本发明通过以下技术方案来实现：一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，包括：
（1）DNA片段P1和P2的前半段通过碱基互补配对结合成P1-P2复合体；
（2）能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段P和P2的后半段在待测样品中汞离子的作用下，通过形成T-Hg2+-T结构相结合；
（3）核酸外切酶III从P2的5’端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出P1和汞离子；
（4）P1和血红素结合后催化ABTS盐与双氧水反应；
（5）通过检测体系中的吸光值确定汞离子的浓度。
进一步的，所述的DNA片段P、P1和P2的序列分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的DNA片段P1的浓度为0.5 μM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的核酸外切酶III的用量为100U。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的汞离子的浓度为0-1000nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，所述的汞离子的浓度为1-500nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度：
Y=0.111+0.0016X，
Y为不同汞离子浓度下吸收值A421，x为相应汞离子的浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
本发明的作用机理为：
（1）P1为可以形成四联体的DNA片段，其能与血红素结合形成具有催化ABTS盐与双氧水反应的催化剂，不同量的催化剂所导致的体系光信号的变化不同；
（2）P1能与P2的前半段由于碱基互补配对相结合形成P1-P2复合体，并在3’端多出几个碱基，使得P1与P2的结合体不能被外切酶Ⅲ剪切，因为核酸外切酶Ⅲ只能作用于双链DNA的无悬挂3’端，对互补链的5’端形成剪切作用，将互补链剪切成单个碱基。当DNA的3’端有多余的碱基时，则外切酶Ⅲ不能对双链DNA形成剪切作用。由于此时体系中无自由状态P1与血红素形成四联体催化剂，不能启动反应；
（3）在没有汞离子存在下，P不能与P2的后半段相结合。当有汞离子存在时，由于少有的几个碱基互补配对作用，和汞离子的T-Hg2+-T作用，使得P与P2的后半段相结合，这种结合使得外切酶III能够从P2的5’端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出P1和汞离子。释放出的汞离子可以循环参与到体系中的反应，使P继续与溶液中的P1-P2复合体反应，进一步产生P1。释放出的P1与体系中的血红素形成催化剂，催化ABTS盐与双氧水反应，引起体系光信号的改变，通过检测体系中的吸光值即可进行定量。
根据本发明的实施例，确定所述样品中的汞离子浓度是通过将所述体系的吸光值、与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知汞离子浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是汞离子检测标准图谱；
图2是汞离子检测标准曲线；
图3是特异性检测图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段
通过查阅相关文献，结合核酸外切酶Ⅲ循环信号放大系统的构建需要，设计能够通过T-Hg2+-T反应对汞离子特异性识别的DNA片段，以及参与循环系统所需的DNA片段。序列通过DNA合成仪制备。
P: CAT TCC TCT CTC GCG（SEQ ID NO：1）
P1: CAC TGG GTT GGG CGG GAT GGG GCG C（SEQ ID NO：2）
P2: C GAT CCC GCC CAA CCC AGT GAG TGT GGT TTG（SEQ ID NO：3）
实施例2相关反应条件的优化
为使实验传感条件最优化，需要确定四联体P1的量和外切酶Ⅲ的最佳用量。首先，取6个PCR管，加入180μL的Tris-HCl（pH 8.0,50 mM NaCl，10 mM MgCl2）缓冲液，并依次加入10μL 不同浓度的P1,使其终浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 μM，然后向各管中加入5μL 100μM的血红素，用移液枪将其混合均匀，30℃下培养60min, 再向各管中加入10μL 75mM的2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）,以及5nM 的H2O2溶液，5min后测试其紫外吸光度，其紫外吸光谱图显示，当P1的浓度为0.5 μM时，溶液的吸光值变化较为合理，故P1的最优浓度为0.5μM。为确定最佳外切酶Ⅲ用量，取6个PCR管，分别加入10μL的10μM P1和P2，混匀并在室温下反应20min，依次加入0.5 μM P和10μg/mL的汞离子，然后在各管加入5μL reaction buffer，以及终浓度分别为20、60、100、160、200U的外切酶Ⅲ，并以超纯水维持反应体系在50μL，混匀并37℃下反应90min，然后80℃下10min, 然后向各管中加入5μL 100μM的血红素，以Tris-HCl缓冲液使反应体系维持在185μL，然后用移液枪将其混合均匀，30℃下培养60min, 再向各管中加入10μL 75mM的ABTS溶液,以及5nM 的H2O2溶液，5min后测试其紫外吸光度，吸光值变化规律表明，外切酶Ⅲ最佳用量为100U。
实施例3复合反应及标准曲线的建立
取9个PCR管，分别加入10μL的10μM P1和P2，混匀并在室温下反应20min，依次加入0.5 μM P、5μL reaction buffer、100U的外切酶Ⅲ，然后在各管加入终浓度分别为0、1、10、100、200、500、800、1000 ng/mL的汞离子溶液，并以超纯水维持反应体系在50μL，混匀并37℃下反应90min，然后80℃下10min, 然后向各管中加入5μL 100μM的血红素，以Tris-HCl缓冲液使反应体系维持在185μL，然后用移液枪将其混合均匀，30℃下培养60min, 再向各管中加入10μL 75mM的ABTS溶液,以及5nM 的H2O2溶液，5min后测试其紫外吸光度。根据测定的吸光值变化规律，绘制汞离子浓度的标准曲线。本传感器的线性范围1-500ng/mL，标准曲线的线性方程为Y=0.111+0.0016X，Y为不同汞离子浓度下吸收值A421，x为相应汞离子的浓度，线性相关性>0.99。
实施例4汞离子的特异性测定
取9个PCR管，分别加入10μL的10μM P1和P2，混匀并在室温下反应20min，依次加入0.5 μM P、5μL reaction buffer、100U的外切酶Ⅲ，然后在各管加入500ng/mL 的Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Mn2+溶液，并以超纯水维持反应体系在50μL，混匀并37℃下反应90min，然后80℃下10min, 然后向各管中加入5μL 100μM的血红素，以Tris-HCl缓冲液使反应体系维持在185μL，然后用移液枪将其混合均匀，30℃下培养60min, 再向各管中加入10μL 75mM的ABTS溶液,以及5nM 的H2O2溶液，5min后测试其紫外吸光度。由实验结果得知这种基于核酸外切酶Ⅲ及T-Hg2+-T特异性结合的汞离子检测技术具有较好的特异性。
实施例5实际添加样品的测定
向自来水样品中分别添加10 、100、200及500 ng/mL的汞离子，采用基于上述技术的汞离子检测新方法测定实际样本中的汞离子的添加回收率在96.70%-105.05%之间，标准差小于4.01%，能够完全满足现实生活中对汞离子的检测需求。结果如表1：
表1：实际样品的添加测定
序列表
 
<110>  常熟理工学院
 
<120>  一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法
 
<130>  xb15062901
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  15
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  P
 
<400>  1
cattcctctc tcgcg                                                      15
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  P1
 
<400>  2
cactgggttg ggcgggatgg ggcgc                                           25
 
 
<210>  3
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  P2
 
<400>  3
cgatcccgcc caacccagtg agtgtggttt g

Claims (7)

1.一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于，包括：
（1）DNA片段P1和P2的前半段通过碱基互补配对结合成P1-P2复合体；
（2）能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段P和P2的后半段在待测样品中汞离子的作用下，通过形成T-Hg2+-T结构相结合；
（3）核酸外切酶III从P2的5’端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出P1和汞离子；
（4）P1和血红素结合后催化ABTS盐与双氧水反应；
（5）通过检测体系中的吸光值确定汞离子的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：所述的DNA片段P、P1和P2的序列分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：所述的DNA片段P1的浓度为0.5 μM。
4.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：所述的核酸外切酶III的用量为100U。
5.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：所述的汞离子的浓度为0-1000nM。
6.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：所述的汞离子的浓度为1-500nM。
7.根据权利要求1所述的基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于：基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度：
Y=0.111+0.0016X，
Y为不同汞离子浓度下吸收值A421，x为相应汞离子的浓度。
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