CN113088564A - 一种基于pcr检测汞离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于PCR检测汞离子的方法，属于汞离子检测技术领域。该方法，包括：S1、将含有多种不同已知浓度的汞离子溶液分别添加至缓冲液得到多种混合物；S2、加入外切核酸酶III继续反应；S3、向多个混合物中加入模板，dNTP，Taq聚合酶并进行PCR反应；S4、向PCR反应后的多种混合物中分别加入SG I；S5、检测加入SG I后的多种混合物的荧光信号，根据荧光信号与汞离子的已知浓度得到两者的线性关系式；S6、将待测液与缓冲液混合进行混合反应，之后检测待测液在529nm的荧光信号，结合步骤S5的线性关系式得到待测液中汞离子的浓度。该方法灵敏度高、对汞离子的选择性好且回收率高。

Description

一种基于PCR检测汞离子的方法

技术领域

本发明涉及汞离子检测技术领域，具体涉及一种基于PCR检测汞离子的方法。

背景技术

汞是一种环境污染物，在环境中它能以单质，无机和有机形式存在。由于汞离子(Hg²⁺)分布范围广，化学性质稳定且水溶性好，所以Hg²⁺是无机形式中不可忽略的一种形式。Hg²⁺能够与蛋白质的巯基形成强亲和力的Hg-S键，从而导致呼吸道，胃肠道和神经系统方面的疾病。汞离子还具有生物积累效应，可以通过食物链进入人体。因此，即使在低浓度下，它也可能对人类健康造成严重的损害。世界卫生组织规定饮用水中Hg²⁺的最高含量为30nM。因此，建立一种高灵敏度的Hg²⁺检测方法十分迫切。到目前为止，已经开发了许多技术和方法来检测Hg²⁺，这些方法大致分为仪器方法(例如电感耦合等离子体质谱和原子吸收光谱法)，化学小分子探针，蛋白质生物传感器和DNA生物传感器。其中，DNA生物传感器因其具有高稳定性，可以商业化生产和易于修改的优点得到了更多关注。对于DNA生物传感器检测Hg²⁺来说，提高其灵敏度一直是一个研究热点。如何获得检测汞离子灵敏度高、选择性好并且回收率高的方法是目前的一大难题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种基于PCR检测汞离子的方法，解决现有技术中在检测汞离子时，不能同时兼顾灵敏度、选择性和回收率的技术问题。

为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种基于PCR检测汞离子的方法。

本发明提出一种检测汞离子浓度的方法，包括以下步骤：

S1、将多种不同已知浓度的汞离子溶液分别添加至含有T7pro、T7terpro和Helper的缓冲液进行混合反应得到多种混合物；所述T7pro的序列为：TAATACGACTCACTATAGGGATTCTTTCTT；所述T7terpro的序列为：TGCTAGTTATTGCTCAGCGGATTCTTTCTT；所述Helper的序列为TTGTTTGTTTGGGG；

S2、分别向多种所述混合物中加入外切核酸酶III继续反应；

S3、向加入外切核酸酶III后的多种混合物中分别继续加入模板，dNTP和Taq聚合酶并进行PCR反应；

S4、向进行PCR反应后的多种混合物中分别加入SG I；

S5、检测加入SG I后的多种混合物的荧光信号，根据所述荧光信号与所述汞离子的已知浓度得到两者的线性关系式；

S6、将待测液与所述含有T7pro、T7terpro和Helper的缓冲液混合进行混合反应，之后执行步骤S2-S4，之后检测所述待测液的荧光信号，结合步骤S5的线性关系式得到所述待测液中汞离子的浓度。

进一步地，在步骤S1中，进行所述混合反应的温度为35-37℃，进行所述混合反应的时间为40-60min。

进一步地，在步骤S2中，反应的温度为35-37℃。

进一步地，在步骤S2中，反应的时间为20-30min。

进一步地，在步骤S3中，加入所述SG I后进行反应的温度为35-37℃。

进一步地，在步骤S3中，加入所述SG I后进行反应的时间为30-40min。

进一步地，在步骤S1中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

进一步地，在步骤S3中，所述模板为pET28a质粒。

进一步地，在步骤S5中，所述线性关系式为Y＝5473580+703818.26373X，其中Y为荧光信号，X为汞离子浓度。

进一步地，在步骤S5中，检测加入SG I后的多种所述混合物在529nm处的荧光信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明涉及设计了三条单链DNA(ssDNA)：T7pro，T7Terpro和Helper。T7pro和T7terpro的3'-末端含有七个T碱基，可以与Helper结合以通过T-Hg(II)-T错配来形成双链结构(dsDNA)。T7pro和T7terpro的5'-末端可以与模板杂交，但是由于3'-末端不能与模板配对，所以T7pro和T7terpro是无效的引物，不能启动模板的PCR反应。在Hg²⁺的存在下，T7pro，T7terpro和Helper可以通过T-Hg(II)-T错配形成T7pro-Helper和T7terpro-Helper的双链结构。此结构可以被外切核酸酶III(ExoIII)所识别，然后从3'-5'方向切去核苷酸。T7pro和T7terpro的3'末端降解后形成有效的引物T7(序列为TAATACGACTCACTATAGGG)和T7Ter(序列为TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)。但由于Exo III的酶切底物为双链DNA，且降解方向为从3'端到5'端，所以Helper不能被降解，它和汞离子被重新释放，进入下一轮循环，继续和无效引物T7pro、T7terpro结合，产生更多的有效引物T7和T7Ter。产生的有效引物T7和T7ter进入PCR反应体系，引发PCR反应扩增pET28a质粒的目标片段，当加入DNA染料(SG I)时，在529nm处发出强荧光信号，从而可根据不同汞离子浓度与荧光信号的对应关系得到两者的关系式，从而通过检测待测液的在529nm处的荧光信号达到检测Hg²⁺的目的，最低检测线为1.46nM，本发明通过结合外切核酸酶III和PCR双放大策略实现了对汞离子的检测，检测线低至1.46nM，回收率在92.3％-109％，而且对汞离子具有选择性，灵敏度高。

附图说明

图1是本发明检测汞离子的原理示意图。

图2是有汞离子和无汞离子的的荧光光谱图。

图3A是本发明实施例1中存在不同Hg²⁺浓度存在的荧光发射光谱。

图3B是本发明实施例1中在不同浓度的Hg²⁺中在529nm处的荧光信号；插图为荧光信号在18-42nm Hg²⁺浓度范围内拟合线性关系。误差棒表示三次重复测量中的相对标准偏差。

图4A是实施例1中在不同金属离子存在下的荧光发射光谱图(包括40nm的汞离子)。

图4B是实施例1中529nm处不同金属离子的荧光信号结果。

具体实施方式

本具体实施方式提供了一种基于PCR检测汞离子的方法，包括以下步骤：

S1、将多种不同已知浓度的汞离子溶液分别添加至含有T7pro、T7terpro和Helper的Tris-HCl缓冲液在35-37℃下进行混合反应40-60min得到多种混合物；所述T7pro的序列为：TAATACGACTCACTATAGGGATTCTTTCTT；所述T7terpro的序列为：TGCTAGTTATTGCTCAGCGGATTCTTTCTT；所述Helper的序列为TTGTTTGTTTGGGG；

S2、分别向多种所述混合物中加入外切核酸酶III继续在35-37℃下反应40-60min；

S3、向加入外切核酸酶III后的多种混合物中分别继续加入模板，dNTP，Taq聚合酶并在35-37℃进行PCR反应30-40min；所述模板为pET28a质粒；

S4、向进行PCR反应后的多种混合物中分别加入SG I；

S5、检测加入SG I后的多种混合物在529nm处的荧光信号，根据所述荧光信号与所述汞离子的已知浓度得到两者的线性关系式；所述线性关系式为Y＝5473580+703818.26373X，其中Y为荧光信号，X为汞离子浓度；

S6、将待测液与所述含有T7pro、T7terpro和Helper的缓冲液混合进行混合反应，之后执行步骤S2-S4，之后检测所述待测液在529nm的荧光信号，结合步骤S5的线性关系式得到所述待测液中汞离子的浓度。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

首先，设计了三条单链DNA(ssDNA)：T7pro，T7Terpro和Helper(如表1)。T7pro和T7terpro的3'-末端含有七个T碱基，可以与Helper结合以通过T-Hg(II)-T错配来形成双链结构(dsDNA)。T7pro和T7terpro的5'-末端可以与pET28a质粒杂交,但是由于3'-末端不能与模板配对，所以T7pro和T7terpro是无效的引物，不能启动PCR反应。

在Hg²⁺的存在下，T7pro，T7terpro和Helper可以通过T-Hg(II)-T错配形成T7pro-Helper和T7terpro-Helper的双链结构(如图1)。此结构可以被Exo III所识别，然后从3'-5'方向切去核苷酸。T7pro和T7terpro的3'末端降解后形成有效的引物T7和T7Ter。但由于Exo III的酶切底物为双链DNA，且降解方向为从3'端到5'端，所以Helper不能被降解，它和汞离子被重新释放，进入下一轮循环，继续和无效引物T7pro、T7terpro结合，产生更多的有效引物T7和T7Ter。随后，T7和T7ter进入PCR反应体系，引发PCR反应扩增pET28a质粒的目标片段，当加入DNA染料(SG I)时，发出强荧光信号，从而达到检测Hg²⁺的目的。

表1寡核苷酸DNA序列

名称	序列(从5’到3’)
		T7pro	TAATACGACTCACTATAGGGATTCTTTCTT
T7	TAATACGACTCACTATAGGG
		T7terpro	TGCTAGTTATTGCTCAGCGGATTCTTTCTT
T7ter	TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
		Helper	TTGTTTGTTTGGGG

在上述原理的基础上，本实施例主要包括以下步骤：

研究方法的可行性；检测方法的灵敏度和线性检测范围；检测方法的选择性；对水中的Hg²⁺进行检测。

方法的可行性：

首先，我们准备两组样品。分别为500nM T7pro+500nM T7terpro+1μM Helper+0.5μL Exo III(200U/μL)+PCR反应液+3×SG I(5.88μM)+60nM Hg²⁺,500nM T7pro+500nMT7terpro+1μM Helper+0.5μL Exo III(200U/μL)+PCR反应液+3×SG I(5.88μM)。每组样品中T7pro+T7terpro+Helper+Hg²⁺混合在Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.5)中37℃下反应40min，加入Exo III，37℃下反应20min，然后，加入模板(pET28a质粒)，dNTP，Taq聚合酶，在PCR仪上进行PCR反应。PCR过程设置为94℃8min，35个循环{94℃30s，46.6℃30s，70℃15s}，70℃10min。最后分别加SG I，混合均匀，37℃下反应30min。最后，每组样品取100μL加入到96孔酶标板中，用酶标仪记录荧光信号。结果如图2所示，曲线a为T7pro/T7terpro/Helper+Exo III+PCR+Hg²⁺；曲线b为T7pro/T7terpro/Helper+Exo III+PCR，在没有Hg²⁺的情况下，b线529nm处的荧光信号很弱；在存在Hg²⁺的时候，a线中529nm处的荧光信号强。这些结果与原理一致。此实验结果表明我们设计的新方法是可行的。

方法的灵敏度和线性检测范围：

首先，我们把不同浓度的Hg²⁺(0，3，9，15，18，21，24，27，33，39，42，45，50nM)加入到含有500nM T7pro+500nM T7terpro+1μM Helper的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7.9)，充分混匀，37℃反应30min。加入Exo III，37℃反应20min，然后，加入模板(pET28a质粒)，dNTP，Taq聚合酶以开始在PCR仪上进行PCR反应。PCR过程设置为94℃8min，35个循环{94℃30s，46.6℃30s，70℃15s}，70℃10min。最后分别加3×SG I(5.88μM)，混合均匀，37℃反应30min。最后，用酶标仪记录光谱变化，并计算Hg²⁺浓度和荧光信号的关系。

结果如图3A和3B所示：荧光信号随着Hg²⁺浓度的增加而增加，但是当Hg²⁺浓度增加到42nM时，荧光信号增加变得比较缓慢。随后我们对低浓度Hg²⁺的信号变化做了分析，发现Hg²⁺在18nM-42nM范围内，Hg²⁺浓度和荧光信号呈线性关系。线性方程为Y＝5473580+703818.26373X(R2＝0.99503)，Y为荧光信号，X为汞离子浓度。根据3倍空白误差/斜率，我们计算得出该方法的最低检测线为1.46nM。

该方法对Hg²⁺的选择性：

首先，我们把40nM的Hg²⁺和40nM的干扰物质(Ba²⁺、Ca²⁺、Cr²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)分别加入到含有500nM T7pro+500nM T7terpro+1μM Helper的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH7.9)，充分混匀，37℃反应30min。加入Exo III，37℃反应20min，然后，加入模板(pET28a质粒)，dNTP，Taq聚合酶以开始在PCR仪上进行PCR反应。PCR过程设置为94℃8min，35个循环{94℃30s，46.6℃30s，70℃15s}，70℃10min。最后分别加3×SG I(5.88μM)，混合均匀，37℃反应30min。最后，用酶标仪记录光谱变化。

结果如图4A和4B所示，我们的新方法除了对Hg²⁺有强烈的响应外，加入其他物质荧光信号几乎没有变化。说明我们的方法对Hg²⁺具有很好的选择性。

对自然水体环境样品中的Hg²⁺进行检测：

采用标准添加法，制备不同Hg²⁺浓度的水样(18、27和39nM)。然后，用我们的新方法测量，最后，通过线性方程Y＝5473580+703818.26373X计算样品中Hg²⁺的水平。

结果如表2所示，我们方法的回收率在92.3％-109％之间，可以用于实际样品的检测。

表2水中Hg²⁺的浓度和回收实验结果

样品	Hg<sup>2+</sup>的浓度(nM)	检测结果(nM)	回收率(％)
				1	18	17.898±4.41	99.4
2	27	29.433±4.47	109
				3	39	35.997±4.579	92.3

其他有益效果：

本发明外切核酸酶III和PCR双扩增策略检测Hg²⁺且可应用于实际样品的检测，为检测水中Hg²⁺提供了一种新的方法。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于PCR检测汞离子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将多种不同已知浓度的汞离子溶液分别添加至含有T7pro、T7terpro和Helper的缓冲液进行混合反应得到多种混合物；所述T7pro的序列为：TAATACGACTCACTATAGGGATTCTTTCTT；所述T7terpro的序列为：TGCTAGTTATTGCTCAGCGGATTCTTTCTT；所述Helper的序列为TTGTTTGTTTGGGG；

S2、分别向多种所述混合物中加入外切核酸酶III继续反应；

S3、向加入外切核酸酶III后的多种混合物中分别继续加入模板，dNTP和Taq聚合酶并进行PCR反应；

S4、向进行PCR反应后的多种混合物中分别加入SGI；

S5、检测加入SGI后的多种混合物的荧光信号，根据所述荧光信号与所述汞离子的已知浓度得到两者的线性关系式；

S6、将待测液与所述含有T7pro、T7terpro和Helper的缓冲液混合进行混合反应，之后执行步骤S2-S4，之后检测所述待测液的荧光信号，结合步骤S5的线性关系式得到所述待测液中汞离子的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，进行所述混合反应的温度为35-37℃，进行所述混合反应的时间为40-60min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，反应的温度为35-37℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，反应的时间为20-30min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，加入所述SGI后进行反应的温度为35-37℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，加入所述SG I后进行反应的时间为30-40min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S1中，所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述模板为pET28a质粒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述线性关系式为Y＝5473580+703818.26373X，其中Y为荧光信号，X为汞离子浓度。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S5中，检测加入SGI后的多种所述混合物在529nm处的荧光信号。

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