CN107604042A - 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，其采用的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，单链DNA1的3'末端连接Cy5，单链DNA1的5'末端连接生物素，量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素‑生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；DNA引物为一种DNA序列，DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，单链DNA2能与单链DNA1杂交形成双链DNA；核苷酸外切酶为能够将双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。采用该纳米传感器能够简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。

Description

基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，涉及基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法。

背景技术

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种核内核酸酶，它可以在不需要DNA模板的情况下，将核苷酸随机引入单链多聚脱氧核苷酸链的3'-羟基(3'-OH)末端。通过向T和B细胞中的T和B细胞受体基因的变量(V)，依赖(D)和连接(J)外显子区添加非模板核苷酸(N区)，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以在免疫球蛋白重链基因重组过程中加入基因片段，产生多种形式的连接，为抗原抗体的多样性做出很大的贡献。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性在大多数人体细胞中是抑制的，但在急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞(急性淋巴细胞性白血病(ALL)细胞来源的胸腺依赖型细胞系)，急性骨髓单核细胞白血病细胞和慢性骨髓性白血病(CML)中是非常高的。因此，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以作为人类白血病的生物标志物。此外，由于其能够对单个DNA片段添加高度可变数目的核苷酸，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可被广泛用作检测核苷酸、酶、金属离子以及DNA损伤位点的通用工具。

尽管末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)具有多种生物学功能，但目前已报道的对其检测的方法很少。凝胶电泳法和免疫测定法是检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的标准方法。凝胶电泳检测法是基于将放射性标记的三磷酸脱氧核苷酸聚合到单链DNA(ssDNA)底物的3'-OH末端，但是会遭受到放射性污染和繁琐的操作程序等缺点。免疫学检测法采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)特异性抗体，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性进行定量，但是需要复杂的抗体制备，多步骤的固定和分离，从而造成耗时长，成本高等问题。近些年来，已发展出多种检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的新方法，包括比色法，发光法以及荧光法。在比色法中，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的存在使得单链DNA引物能够延伸得到富含鸟嘌呤(G)的DNA产物。该多鸟嘌呤(G)DNA产物可以与辅因子血红素结合折叠形成G-四链体结构，在过氧化氢(H₂O₂)存在下，ABTS^2-将被氧化成有色的ABTS^-。在发光法中，是基于环金属化铱(III)复合物表现出对双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)上i-基序DNA的高差异的反应性。在荧光法中，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)诱导产生的长链多聚胞嘧啶(C)核苷酸序列可以与Ag⁺离子结合，形成包囊银簇(DNA-AgNCs)，从而产生增强的荧光信号。但是以上这些方法仍然存在一些不可避免的缺点，如检测灵敏度低，材料合成繁琐以及需要复杂的化学反应等。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，采用该纳米传感器能够简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；

所述捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素-生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；

所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；

所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。

本发明中通过生物素和链霉亲和素间的特异性反应，在3'末端修饰Cy5荧光分子的捕获探针单链DNA1将结合在量子点的表面，然后与通过在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下形成的聚合单链DNA2进行杂交，从而形成Cy5-dsDNA-QD纳米结构，导致Cy5荧光分子与量子点之间引发荧光共振能量转移(FRET)。当末端脱氧核苷酸转移酶不存在时，DNA引物无法聚合延伸形成单链DNA2，从而不能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。因此核苷酸外切酶将无法对双链DNA中的单链DNA1进行消化，从而将不会导致Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上进行释放而引发高效率的荧光共振能量转移(FRET)；而当末端脱氧核苷酸转移酶存在时，DNA引物能够聚合延伸形成单链DNA2，从而能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。加入核苷酸外切酶，双链DNA中的单链DNA1将被消化，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，而释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致大量的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)。从而实现简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性的目的。

本发明的目的之二是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的试剂盒，包括上述纳米传感器。

本发明的目的之三是提供一种上述纳米传感器或试剂盒在检测末端脱氧核苷酸转移酶活性中的应用。

所述应用以非疾病的诊断与治疗为目的。

本发明的目的之四是提供一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，采用上述纳米传感器或试剂盒，其过程包括：

(1)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化聚合2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)核苷酸到DNA引物的3'末端形成单链DNA2，单链DNA2与量子点上捕获探针中的单链DNA1杂交形成双链DNA；

(2)核苷酸外切酶将从所述双链DNA中的单链DNA1的3’羟基末端方向逐步切去单核苷酸，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致捕获探针的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)；

(3)通过对整个反应后的产物进行了荧光光谱和强度的测量，从而定量检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。

本发明的有益效果为：

1.高灵敏性：本发明具有超高灵敏性，可归因于(1)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的高效聚合反应，(2)量子点(QD)供体与多个Cy5受体之间的高效的荧光共振能量传递(FRET)，(3)核苷酸外切酶介导的捕获探针的高效循环消化，(4)高灵敏的单分子检测。因此本方案可以实现高效、灵敏地检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。

2.特异性好：由于本发明是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以将核苷酸随机引入单链(ss)多脱氧核苷酸链的3'-羟基(OH)末端，而不需要DNA模板。其能够向单个DNA片段添加高度可变数目的核苷酸，从而保证了该方法的高度特异性。另外，对本发明中的各反应条件也都进行了详细的优化。因此在DNA引物的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化聚合反应中，极少发生非特异性反应，而且核酸外切酶III(Exo III)只能从双链DNA(dsDNA)底物的3'凹端逐步去除单核苷酸，这也大大减少了该方法检测的非特异性。

3.操作简单：由于本发明中的反应无需任何分离步骤，简单快速，整个实验反应时间为50分钟。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为本发明的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的原理图；

图2为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在不同反应时间催化产生聚合DNA产物的结果表征图，图2A为在不同反应时间下末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化产生聚合DNA产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中，泳道M为参照DNA，泳道1为不加TdT的产物，泳道2为聚合物时间为30分钟的产物，泳道3为聚合时间为20分钟的产物，泳道4为聚合时间为10分钟的产物，泳道5为聚合时间为5分钟的产物，图2B不同聚合时间的荧光强度曲线图；

图3为基于全内反射荧光(TIRF)的605QD和Cy5的荧光成像，其中，A、B、C为不存在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的荧光成像，D、E、F为存在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的荧光成像；

图4为在不同TdT浓度下的Cy5数目的变化曲线；

图5为在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及非特异性酶反应后的Cy5数目的柱状图，其中，酶的浓度均为0.01单位每微升。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本申请中所述的Cy5(花菁5)是一种常用的荧光染料。

本申请所述的杂交为两个单链DNA形成双链DNA的过程。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对于检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)灵敏度低、耗时长，材料合成繁琐和化学反应复杂等的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法。

本申请的一种典型实施方式，提供了一种检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；

所述捕获探针包括Cy5、生物素和DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素-生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；

所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；

所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。

本发明中通过生物素和链霉亲和素间的特异性反应，在3'末端修饰Cy5荧光分子和5’末端修饰生物素的捕获探针单链DNA1与表面修饰有链霉亲和素的量子点进行特异性反应，然后与在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下形成的单链DNA2进行杂交，从而形成Cy5-dsDNA-QD纳米结构，使Cy5荧光分子与量子点之间引发荧光共振能量转移(FRET)。当末端脱氧核苷酸转移酶不存在时，DNA引物无法延伸形成单链DNA2，从而不能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。因此核苷酸外切酶将无法对双链DNA中的单链DNA1进行消化，从而将不会导致Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上进行释放而引发高效率的荧光共振能量转移(FRET)；而当末端脱氧核苷酸转移酶存在时，DNA引物能够聚合延伸形成单链DNA2，从而能与单链DNA1进行杂交形成双链DNA。加入核苷酸外切酶III，能够将双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端逐步消化单核苷酸，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2能够同时被释放，而释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致大量的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)，最终实现简单、快速、灵敏的检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的活性的目的。

优选的，所述单链DNA1的DNA序列从5'到3'依次为AAA AAA AAA AAA。

优选的，所述量子点QD为605QDs。所述605QDs为链霉亲和素结合的CdSe/ZnS量子点，其最大发射波长在605nm。

优选的，所述DNA引物的DNA序列从5'到3'依次为ATG GGC GGC A。

优选的，所述核苷酸外切酶为核酸外切酶III(Exo III)，该酶作用于双链DNA，从3’羟基末端方向逐步切去单核苷酸。

优选的，所述双链DNA为所述的单链DNA2与所述的单链DNA1杂交形成双链DNA，其所述的双链DNA的3'末端为凹端。

本申请的另一种典型实施方式，提供了一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的试剂盒，包括上述纳米传感器。

优选的，包括所述DNA引物延伸反应溶液，所述DNA引物延伸反应溶液中含有氯化钴，2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)核苷酸和1×末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液。

本发明的第三种实施方式，提供了一种上述纳米传感器或试剂盒在检测末端脱氧核苷酸转移酶活性中的应用。

所述应用以非疾病的诊断与治疗为目的。

本发明的第四种典型实施方式，提供了一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，采用上述纳米传感器或试剂盒，其过程包括：

(1)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)核苷酸到DNA引物的3'末端延伸形成单链DNA2，单链DNA2与量子点上结合的捕获探针单链DNA1杂交形成双链DNA；

(2)核酸外切酶III将从上述所述双链DNA中的单链DNA1的3’羟基末端方向逐步切去单核苷酸，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致捕获探针上的Cy5荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移(FRET)；

(3)通过对整个反应后的产物进行荧光光谱和强度测量，从而定量检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。

优选的，其步骤为：

一、将DNA引物加入至含有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)及2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)核苷酸的延伸反应溶液中进行聚合延伸；

二、取上述步骤一的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的聚合产物加入到量子点QD与捕获探针的孵育溶液中，形成Cy5-dsDNA-605QD纳米结构；

三、将核酸外切酶III(Exo III)和核酸外切酶III反应缓冲液加入到步骤二的孵育溶液中，反应后使Cy5-dsDNA-QD纳米结构中的Cy5分子得到释放；

四、将步骤三获得的反应产物采用荧光分光光度计进行荧光光谱和强度测定。

测量了488nm激发波长处所述的QD和Cy5的相应发射光谱。

为了使步骤二中的孵育反应的进行，本申请进一步优选的，步骤二所述的量子点QD与捕获探针的孵育溶液中包括捕获探针、605QDs、氯化镁(MgCl₂)、硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 8.0。

为了使步骤三中的核酸外切酶III(Exo III)能在605QDs与捕获探针DNA1的孵育溶液中高效的反应，在上述溶液中加入了核酸外切酶III反应缓冲液，本申请进一步优选的，步骤三中的核酸外切酶III反应缓冲液包括双三羟甲基氨基甲烷丙烷-盐酸(Bis TrisPropane-HCl)、氯化镁(MgCl₂)、二硫苏糖醇(DTT)，pH 7.0。

为了使步骤一中的反应完全，步骤一的反应条件为37±0.5℃，反应20±2分钟，然后在75±2℃加热10±1分钟来终止反应。

更进一步优选的，步骤二所述的孵育条件为室温孵育时间为10±1min。所述室温为25±0.5℃。

更进一步优选的，步骤三的反应条件为37±0.5℃，反应时间为20±2分钟。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

其中，ssDNA代表单链DNA，dsDNA代表双链DNA。

更进一步优选的，所有步骤中溶液的溶剂均为来自Millipore过滤系统的超纯水。

更进一步优选的，实验所有寡核苷酸均购买于中国大连Takara BiotechnologyCo.Ltd。单链DNA1从5’到3’依次是AAA AAA AAA AAA(SEQ ID NO.1)，3'末端连接Cy5荧光分子，5'末端连接生物素；DNA引物序列从5'到3'依次为ATG GGC GGC A(SEQ ID NO.2)；单链DNA2从5’到3’依次是ATG GGC GGC ATT TTT TTT TTT TTT TTT T(SEQ ID NO.3)。

细胞提取物准备：人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)和人类白血病T细胞系(Molt-4细胞)分别在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)和1％青霉素-链霉素(PS，Gibco，USA)的Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM，Gibco，USA)和RPMI培养基1640(Gibco，USA)中培养，并且均放在含有5％CO₂的培养箱中于37℃进行培养。在细胞生长的指数阶段，通过用冰冷的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次收集的细胞，并以1000rpm离心5分钟。将收集的细胞悬浮在500μL细胞裂解缓冲液中，在冰上孵育30分钟，并每5分钟涡旋30秒。然后将裂解的产物在4℃以12000rpm离心20分钟，将上清液转移到新鲜管中进行末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的测定。

为了使细胞能够进行提取，本申请进一步优选的，步骤中所述的磷酸盐缓冲溶液中包括137mM氯化钠(NaCl)、2.7mM氯化钾(KCl)、10mM磷酸盐缓冲液(phosphate buffer)，pH7.4；所述的细胞裂解缓冲液包括15mM氯化钠(NaCl)、100mM乙二胺四乙酸(EDTA)、50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1％辛基酚聚氧乙烯醚(Triton)。

基于聚合反应引发的核苷酸外切酶辅助的基于单个量子点(QD)的荧光共振能量转移(FRET)的纳米传感器对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的检测:一，将100nM DNA引物加入到含有各种浓度的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，0.25mM氯化钴，5mM 2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)和1×末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液(50mM乙酸钾(KAc)、20mM三羟甲基氨基甲烷-乙酸酯(Tris-Ac))、10mM醋酸镁(Mg(Ac)2)、pH7.9)的20微升聚合反应溶液中，在37℃温育20分钟，然后在75℃加热10分钟来终止反应。二，将10微升末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的延伸产物加入到孵育溶液(0.1μM捕获探针DNA1，2.78nM 605QDs，3mM氯化镁(MgCl₂)，10mM硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和100mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH 8.0)中，并在室温孵育10分钟，形成Cy5-dsDNA-605QD纳米结构。三，将20U和核酸外切酶III(ExoIII)和6微升的10×核酸外切酶III反应缓冲液(双三羟甲基氨基甲烷丙烷-盐酸(Bis TrisPropane-HCl)、氯化镁(MgCl₂)、二硫苏糖醇(DTT)，pH 7.0)加入到孵育混合物中，并在37℃反应20分钟，使Cy5-dsDNA-605QD纳米结构中的Cy5分子得到释放。

荧光光谱测量：将60微升的反应产物用超纯水稀释至100微升，用荧光分光光度计在室温下进行荧光光谱和强度的测定。

实验原理(如图1所示)：

该方法设计了一个含有10个碱基的DNA引物，通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的聚合延伸重复加入2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)至DNA引物的3'-OH末端。捕获探针是一个含有15个腺嘌呤(A)碱基的序列，且在其的3'和5'末端分别修饰了Cy5和生物素。通过生物素-链霉亲和素之间的特异性反应，捕获探针将被结合在605QD的表面，形成Cy5-ssDNA-605QD的纳米结构。在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在下，2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)将不断重复聚合到DNA引物的3'-OH末端，形成长链的富含胸苷(T)的序列。通过加入修饰捕获探针的605QDs，富含胸苷(T)的序列可以与富含腺嘌呤(A)的捕获探针特异性杂交形成具有3'凹端的稳定的双链(dsDNA)。稳定的双链(dsDNA)作为核苷酸外切酶III(Exo III)的底物，单核苷酸不断的被从3'凹端逐步移去，从而导致Cy5-dsDNA-605QD纳米结构中释放出Cy5分子和富含多胸苷(T)的DNA序列。释放的富含多胸苷(T)的DNA序列可以与新的捕获探针杂交以引发杂交-消化-释放的循环，从而导致从Cy5-dsDNA-605QD纳米结构中释放大量的Cy5分子。在没有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在的情况下，没有2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)聚合到DNA引物的3'-OH末端，不会产生富含多胸苷(T)的长链DNA序列，从而没有Cy5-dsDNA-605QD纳米结构形成，因此不会发生核酸外切酶III(Exo III)介导的Cy5-dsDNA-605QD纳米结构中的Cy5分子的循环释放，所以荧光共振能量传递(FRET)的效率不会降低。由于Cy5-dsDNA-605QD纳米结构中高效率的荧光共振能量转移(FRET)，核酸外切酶III(Exo III)介导的高效率的循环消化和基于全内反射荧光(TIRF)的高灵敏的单分子检测，本方法可以用来对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性进行高灵敏的检测。

原理的实验验证

为了高灵敏检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性，对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的聚合延伸做了一系列的验证。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的聚合时间是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)评估中的重要因素。聚合时间越长，多胸苷(T)的DNA产物的长度越长。但是如果聚合DNA产物的长度太长，则可能对其与修饰在605QD的捕获探针的后续杂交产生明显的阻碍。另一方面，如果长度太短，则不能有效地与捕获探针杂交以形成稳定的双链DNA(dsDNA)结构。考虑到DNA产物的序列长度和所涉及的实验时间，优化了末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的聚合时间，以获得长度适宜的多胸苷(T)的DNA产物。用2％琼脂凝胶来分析DNA聚合产物，以SYBR Gold作为荧光指示剂。从图2A中可看出，在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)不存在时，第1条泳道可看到一条10nt的条带，表明没有发生聚合反应。相比之下，加入0.01单位每微升末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)时，在第2～5条泳道中观察到多胸苷(T)的DNA条带的尺寸随着聚合时间(5～30min)延长而逐渐增大，表明通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化产生了多胸苷(T)的长链序列。为了进一步研究聚合时间对测定性能的影响，在DNA引物的不同聚合时间的反应体系中，将捕获探针修饰的量子点和核酸外切酶III(ExoIII)添加到反应体系中，并测量了在激发波长为488nm处的605QD和Cy5的相应发射光谱。从图2B中可看出，在没有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在的情况下，将Cy5标记的捕获探针组装到605QD的表面上导致形成Cy5-ssDNA-605QD纳米结构，可清楚地观察到由于发生荧光共振能量传递(FRET)而引起的605QD荧光信号的明显的降低和同时增加的Cy5荧光信号。在0.01单位每微升末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在的情况下，多胸苷(T)的DNA产物可与Cy5标记的捕获探针杂交形成稳定的双链DNA(dsDNA)，其可以被核酸外切酶III(Exo III)循环消化，使得大量的Cy5分子得到循环释放，从而降低荧光共振能量传递(FRET)的效率，从而最终观察到605QD荧光信号的增加和Cy5荧光信号的同时降低。从图2B中的插图可以看出，荧光共振能量传递(FRET)效率随着聚合时间(5～20min)延长而逐步下降，超过20分钟时，观察到30分钟的荧光共振能量传递(FRET)效率大大提高，其原因是由于在30分钟的聚合反应，产生较长的多胸苷(T)DNA产物(泳道2，图2A)，限制了双链DNA(dsDNA)的形成，最终导致从Cy5-dsDNA-605QD纳米结构释放出有限的Cy5分子，从而进一步导致荧光共振能量传递(FRET)效率的提高。因此，20分钟被选为最佳聚合时间，实验中使用的20分钟聚合时间可以显著降低末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)检测的时间成本。从图1中的凝胶电泳和荧光实验中可以看出基于单个量子点(QD)的荧光共振能量传递(FRET)由于聚合反应而引发的淬灭可有效反应末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的大小，表明Cy5荧光信号可用于准确地检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性。

通过全内反射荧光(TIRF)成像检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性实验

用基于全内反射荧光(TIRF)的荧光成像来检测Cy5荧光信号。从图3中的对照组可以看出，在没有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)存在的情况下，可以观察到图3A中绿色的605QD和图3B中红色的Cy5的荧光信号，通过605QD和Cy5荧光成像的完全重叠，可以证明形成了Cy5-ssDNA-605QD纳米结构，且发生了从605QD到Cy5的高效荧光共振能量传递(FRET)。从图3中的实验组可以看出，当存在0.01单位每微升末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的情况下，观察到图3D中更强的605QD荧光信号，但没有检测到图3E中的Cy5荧光信号，表明由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)引发的核酸外切酶III(Exo III)介导的605QD和Cy5之间的荧光共振能量传递(FRET)没有发生，这些结果与图2B中的整体荧光检测的结果保持一致。

灵敏度实验

为了评估本方案检测末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)活性的灵敏度，在最佳实验条件下，测量了不同浓度末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)下的Cy5数目，如图4所示，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)浓度越高，Cy5数目减少越多。为了评估其定量分析能力，对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的浓度取对数，观察到Cy5计数与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)浓度对数值在1×10^-6单位每微升至1×10^-3单位每微升的浓度范围内呈现出良好的线性关系，且检测限可达1×10^-6单位每微升。因此证明本发明具有超高的检测灵敏度。

特异性实验

为了评估本方案的特异性，选用了Bst.DNA聚合酶和四种非特异性DNA修复酶(即Endo IV，Exo III，T4DNA连接酶和UDG)作为阴性对照样品，以研究该方法的选择特异性，结果如图5所示。从该图可以看出，反应缓冲液、Bst.DNA聚合酶和四种非特异性DNA修复酶不能引发聚合反应，从而没有观察到Cy5数目的显著降低，而末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可以催化加入2'-脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP)至单链DNA(ssDNA)引物的3'-羟基(OH)并产生多胸苷(T)的DNA产物，从而引发核酸外切酶III(Exo III)介导的Cy5循环释放，引起Cy5数目的大大减少。这些结果证明本方法对末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的检测具有很高的特异性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaaaaaaaa aa 12

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgggcggca 10

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggcggca tttttttttt tttttttt 28

Claims (10)

1.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的纳米传感器，包括捕获探针、DNA引物、量子点QD及核苷酸外切酶；

所述捕获探针包括Cy5、生物素和单链DNA1，所述单链DNA1的3'末端连接Cy5，所述单链DNA1的5'末端连接生物素，所述量子点QD为链霉亲和素结合的量子点，通过链霉亲和素-生物素相互作用将捕获探针修饰到量子点QD的表面；

所述DNA引物为一种DNA序列，所述DNA序列能够在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下将脱氧核苷酸添加至所述DNA序列的3'末端，聚合延伸形成单链DNA2，所述单链DNA2能与所述单链DNA1杂交形成双链DNA；

所述核苷酸外切酶为能够将所述双链DNA中的单链DNA1从3'羟基末端进行消化掉的酶。

2.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，捕获探针单链DNA1将通过生物素和链霉亲和素的特异性反应结合在量子点的表面，每个单链DNA1的3'末端修饰Cy5荧光分子。

3.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述单链DNA1的DNA序列从5'到3'依次为AAA AAA AAA AAA；

或，所述DNA引物的DNA序列从5'到3'依次为ATG GGC GGC A；

或，所述核苷酸外切酶为核酸外切酶III。

4.如权利要求1所述的纳米传感器，其特征是，所述双链DNA为所述的单链DNA2与所述的单链DNA1杂交形成双链DNA，其所述的双链DNA的3'末端为凹端。

5.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的试剂盒，其特征是，包括权利要求1～4任一所述的组合物；

优选的，包括所述DNA引物延伸反应溶液，所述DNA引物延伸反应溶液中含有氯化钴，2'-脱氧胸苷5'-三磷酸核苷酸和1×末端脱氧核苷酸转移酶反应缓冲液。

6.一种权利要求1～4任一所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒在检测末端脱氧核苷酸转移酶活性中的应用。

7.一种检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法，其特征是，采用权利要求1～4任一所述的组合物或权利要求5所述的试剂盒，其过程包括：

(1)末端脱氧核苷酸转移酶催化聚合2'-脱氧胸苷5'-三磷酸核苷酸到DNA引物的3'末端形成单链DNA2，单链DNA2与量子点上捕获探针中的单链DNA1杂交形成双链DNA；

(2)核苷酸外切酶将从所述双链DNA中的单链DNA1的3’羟基末端方向逐步切去单核苷酸，使得Cy5-dsDNA-QD纳米结构上的Cy5荧光分子和单链DNA2同时被释放，释放的单链DNA2将会与新的单链DNA1引发新一轮的杂交、消化和释放，从而导致捕获探针的Cy5 荧光分子从Cy5-dsDNA-QD纳米结构上被释放出来，造成低效率的荧光共振能量转移；

(3)通过对整个反应后的产物进行荧光光谱和强度测量，从而定量检测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是，其步骤为：

一、将DNA引物加入至含有末端脱氧核苷酸转移酶及2'-脱氧胸苷5'-三磷酸核苷酸的延伸反应溶液中进行聚合延伸；

二、取上述步骤一的末端脱氧核苷酸转移酶催化的聚合产物加入到量子点QD与捕获探针的孵育溶液中，形成Cy5-dsDNA-QD纳米结构；

三、将核酸外切酶III和核酸外切酶III反应缓冲液加入到步骤二的孵育溶液中，反应后使Cy5-dsDNA-QD纳米结构中的Cy5分子得到释放；

四、将步骤三获得的反应产物采用荧光分光光度计进行荧光光谱和强度测定。

9.如权利要求8所述的方法，其特征是，步骤一的反应条件为37±0.5℃，反应20±3分钟，然后在75±2℃加热10±1分钟来终止反应。

10.如权利要求8所述的方法，其特征是，步骤二所述的量子点QD与捕获探针的孵育溶液中包括捕获探针、605QDs、氯化镁，硫酸铵和三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；

或，步骤二所述的孵育条件为室温孵育时间为10±1分钟；

或，步骤三的反应条件为反应温度为37±0.5℃，反应时间20±2分钟。