CN111593095A - 基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于银离子检测领域,具体涉及一种基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法,包括下述步骤:1)DNA探针与SiO2微球的偶联;将氨基化修饰的SiO2微球与DNA探针P1在偶联剂作用下进行偶联,得到SiO2‑P1;2)定量检测Ag+;将SiO2‑P1与DNA探针P2,加入到缓冲液中,混匀,然后加入杂交链反应探针H1和荧光探针Cy5‑H2,加入待检测目标Ag+,充分混匀,孵育;在反应完成后,通过使用离心机离心除去上清液,并将沉淀物重悬于水中,测量Cy5荧光信号强度。本发明通过在SiO2微球上偶联核酸杂交信号,开发了一种简单,高效且灵敏的检测Ag+的方法。
Description
技术领域
本发明属于银离子检测领域,具体涉及一种基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法。
背景技术
银元素是人体的组成物质之一,少量的Ag+是无毒的,但人体摄入过多的Ag+是有害的,世界卫生组织(WHO)建议饮用水中允许的最大浓度为0.1mg/L(约为 927nM),美国环境保护署(EPA)建议最大浓度为0.05mg/L(464nM)。、Ag+的毒害作用主要为以下几点:一、使人体的蛋白质以及各种酶变性。当过量的Ag+在血液中运输时,由于Ag+可与巯基结合从而使相应的含巯基酶失效,从而影响人体新陈代谢,严重危害身体健康。二、由于Ag+的强氧化性,进入人体的Ag+会引起诸如内脏水肿等症状,甚至导致死亡。由于人体没有有效的排银机制,过多摄入的Ag+会沉积在牙龈、皮肤、肝脏等组织或器官内。并且Ag+中毒目前是没有有效的解毒剂的,因此,亟需建立一种高选择性、高灵敏度的Ag+识别和检测方法,这对环境监测以及医疗健康等方面具有重要意义。
传统的Ag+检测方法主要有电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法、溶出伏安法等等。这些方法在特定的时代为Ag+检测做出了巨大的贡献,并且它们由于具有较高的灵敏度以及稳定的检测手段沿用至今。但是由于这些方法的不可移植性、高昂的仪器成本、复杂的材料准备以及对专业操作的需要,它们的应用范围也受到了高度限制。因此,我们亟需一种开发简单、快速、廉价的检测Ag+的方法来弥补传统方法的不足。而近来,人们发现Ag+可通过配位作用与胞嘧啶特异性结合形成C-Ag+-C特殊结构,实现DNA之间的错配,此现象已经广泛的用于Ag+的检测。而随着科技的进步、生产力的发展,我们有了越来越多的用于检测微量或者痕量物质的方法和手段,例如比色法、荧光法、电化学分析法等等。这些方法比起传统方法更加快捷、方便,在灵敏度和特异性上也十分可靠,不需要冗杂的准备阶段以及昂贵的仪器设施,更加符合当前世界科学实验的需要。
杂交链式反应(hybridizationchainreaction,HCR)是由Pierce和Dirks 在2004年首次发现并报道的一种无酶等温核酸扩增技术,并且是一个可以在体外进行的核酸扩增技术,广泛应用于特定DNA序列、蛋白质和小分子等物质的高灵敏度检测。杂交链式反应最大的优点在于不需要酶的参与,所以不需要像聚合酶链式反应(PCR)一般经历变形、退火、延伸三步的循环往复,所以很少出现非特异性扩增影响实验的现象,也就极大避免了假阴性和假阳性结果。杂交链式反应易于控制,整个反应条件也比较温和,仅需一步反应即可迅速得到扩增的短链DNA。杂交链式反应这一信号扩增技术与各种检测分析方法皆可较好地搭配。基于上述优势,科研工作者经常利用杂交链式反应提升蛋白、核酸等生物分子以及重金属、其他小分子检测的灵敏度。与其他核酸链式扩增反应相比较,对于研究人员而言,杂交链式反应所带来的最大优点是整个过程无酶参与,这为以后的工作带来了极大的便利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于SiO2微球的核酸探针和杂交链信号放大的 Ag+检测方法。
本发明为实现上述目的,采用以下技术方案:
一种基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag+检测方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)DNA探针与SiO2微球的偶联;将氨基化修饰的SiO2微球与DNA探针P1在偶联剂作用下进行偶联,得到SiO2-P1;
2)定量检测Ag+;将SiO2-P1与DNA探针P2,加入到缓冲液中,混匀,然后加入杂交链反应探针H1和荧光探针Cy5-H2,加入待检测目标Ag+,充分混匀,孵育;在反应完成后,通过使用离心机离心除去上清液,并将沉淀物重悬于水中,测量Cy5荧光信号强度。
DNA探针P1为:TCAGCCCGGC或者AAAAATCAGCCCGGC;DNA探针P2为: AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAGCCCCCCTGA或者 AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAAAAAAGCCCCCCTGA。
所述的缓冲液为柠檬酸钠缓冲溶液。
优选的,步骤2)的具体步骤为:将步骤1)中连接的10μL DNA-SiO2探针和0.7μL 10μmol/L DNA探针P2)加入到25μL柠檬酸钠SSC缓冲液中,充分混匀,然后加入1.5μL的1μM杂交链反应探针H1和1.5μL的1μmol/L Cy5-H2;最后,加入目标Ag+,充分混匀,在37℃下孵育60分钟;在反应完成后,通过使用离心机以11,000rpm离心10分钟,除去上清液,并将沉淀物重悬于50 μL水中,并通过AzureC600测量Cy5荧光信号强度。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明通过在SiO2微球上偶联核酸杂交信号,开发了一种简单,高效且灵敏的检测Ag+的方法。由于C-Ag+-C结构具有强而特异性的结合相互作用,因此设计了两个末端带有多个胞嘧啶碱基的DNA探针来检测Ag+,这可以显著提高传感器的特异性。同时,借助于HCR的无酶等温核酸扩增,通过检测标记在组分 H2上的Cy5的荧光信号,可以实现Ag+的高检测灵敏度和较大分析范围。最后,我们还验证了传感器的特异性和在实际样品中的检测能力,并将其与标准的Ag+检测方法ICP-MS进行了比较。基于此设计的传感器可以实现低成本,高特异性和超灵敏的检测Ag+的能力。本发明首次将C-Ag+-C结构与杂交链式反应相结合,可检测出pM级别的Ag+,实现了Ag+高效、快捷的检测。
附图说明:
图1示出Ag+检测原理图;
图2示出基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法灵敏度拟合图;
图3示出制备的基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法条件优化实验图;
图4示出制备的基于SiO2核酸探针和杂交链信号放大的Ag+检测方法特异性实验图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明的技术方法实现对Ag+高效、快捷、灵敏度、特异性的检测,具体说明如下:C-Ag+-C结构是一种近年来发现的、具有强而特异性的结合相互作用,可以运用在Ag+的检测。但是因此转换而来的核酸信号却很难检测,所以需要一种手段来放大检测信号。近年来,发展简单、快速、高效、廉价的信号放大技术在生化分析和生物医药等领域具有重要的意义。目前,信号放大机制可分为变温信号放大(如聚合酶链式反应、连接酶链式反应等)和等温信号放大(如滚环复制、DNA链取代反应等)两大类。与变温信号放大机制相比,等温信号放大的方法避免了繁琐的变温程序,操作过程简单易行,已受到广大科研工作者的青睐。杂交链式反应是一种基于DNA链取代反应的等温信号放大技术。在HCR 体系中,靶分子引发两种DNA茎环交替开环,自组装得到包含大量重复单元的线性双链DNA纳米结构,具有恒温、免酶、放大效率高等优点。本发明基于在SiO2微球上偶联杂交链式反应信号,将C-Ag+-C转换的核酸信号进一步放大,使得低成本,高特异性和超灵敏的检测Ag+的方法得以实现。
本发明的检测策略具体如下如图1示出:(1)SiO2微球作为检测平台用P1 探针修饰。P1和P2均具有三个连续的胞嘧啶。在Ag+存在时,P1和P2可以通过形成C-Ag+-C结构结合。由于P2的后半部分是杂交链式反应的引发链,使得 SiO2-P1-P2耦合物可以连续打开H1和H2茎环结构来引发HCR,从而使得整个HCR 产物都连接在了SiO2微球上。由于H2上标记了荧光染料Cy5。因此经过离心分离后,在存在Ag+的情况下,沉淀中会检测到Cy5的荧光信号,并且荧光强度与Ag+的浓度成正比。通过分析的荧光强度,可以定量检测Ag+的浓度。当Ag+不存在时, SiO2微球上没有偶联HCR产物,从而无法检测到Cy5荧光信号。(2)在这项发明中,我们使用AzureC600来量化荧光强度,使得检测限到达了pM级别,并且对本发明进行了特异性检测,证明了它良好的特异性。
实施例1:(1)DNA探针与SiO2微球的偶联:将DNA探针P1和P2配置成100 μM,稀释至10μM,并在4℃下保存。称取1mg的1-(3-二甲基氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)并放入1.5mL圆底离心管中,然后加入500μ L 5mg/mL氨基化修饰的SiO2微球(购于NewMaterTM Nanotechnology),最后加入10μM P1。混合后,将离心管用锡箔纸包裹,EDC被光防止分解,并孵育10小时。反应完成后,以10,000rpm离心10分钟,除去上清液,用200 μL水重悬,重复三次,最终获得SiO2-DNA探针1结合物(SiO2-P1),并在4℃下保存。P1为:TCAGCCCGGC;P2为:AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAGCCCCCCTGA;
(2)定量检测Ag+:将步骤(1)中连接的10μL DNA-SiO2探针和0.7μL 10μmol/L DNA探针2(P2)加入到25μL柠檬酸钠(SSC)缓冲液中,充分混匀,然后加入1.5μL的1μM杂交链反应探针1(H1)和1.5μL的1μmol/ L Cy5-H2。最后,加入目标Ag+银离子,充分混匀,在37℃下孵育60分钟。在反应完成后,通过使用离心机以11,000rpm离心10分钟,除去上清液,并将沉淀物重悬于50μL水中,并通过Azure C600测量Cy5荧光信号强度。
为了在实验开始前验证检测方法是否可以用于检测Ag+,我们分别检测了纯 SiO2微球、SiO2-P1-P2-HCR偶联体、1μmol/L DNA探针P1以及P2的紫外吸光度值,结果表明,纯SiO2微球在240nm到290nm之间几乎没有任何光吸收;在连接了DNA探针与HCR体系后,由于HCR反应形成数百甚至数千bp长的DNA 双链结构,所以SiO2-P1-P2-HCR偶联体在240nm到290nm之间的吸光度相比于前者有了巨大增长,并且在260nm处有明显的吸收峰;而纯DNA探针的吸光度也在260nm处达到顶峰且基本趋势与偶联体相似。所以在本检测法中,DNA 探针与HCR体系很好地连接在了纯SiO2微球上,也说明纯SiO2微球、DNA探针、 SiO2-P1-P2-HCR偶联体在物理性质上会有很大的差别。
实施例2:纳米材料载体的研究:磁球-DNA探针的制备:取1mg的EDC,置于1.5mL圆底离心管中,之后加入500μL氨基化修饰的磁性微球与10μM的DNA 探针P1。超声混匀后,将离心管用锡箔纸包裹作为避光处理,旋培孵育10h。之后11000rpm离心10min,去掉上清液,加200μL水重悬,4℃保存。取2支 1.5mL离心管,分别加入25μL SCC缓冲液,0.5μL的10μM探针P2,0.5μL 的1μM H1和Cy5-H2以及10μL的1μM AgNO3溶液。1号离心管加入10μL SiO2-P1,2号离心管加入10μL磁球-P1偶联体。37℃孵育60min,1号离心管 11000rpm离心10min,2号离心管利用磁铁分离沉淀和上清。弃上清后重悬超声,检测两管荧光强度,结果表明SiO2-P1具有更好的荧光强度。
实施例3:DNA探针的研究:取2支1.5mL离心管,编号1-2,每一支均加入25μL SCC缓冲液,0.5μL的1μM H1和Cy5-H2以及10μL的1μM AgNO3 溶液。1号离心管加入10μL SiO2-P1和0.5μL的10μM的P2,2号离心管加入SiO2-P1’和0.5μL的10ΜmP2’。37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心 10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度,P1’探针为AAAAATCAGCCCGGC;P2’AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAAAAAAGCCCCCCTGA;
结果表明:探针P1与P2的效果要好于探针P1’与P2’。而实际上,探针 P1、P2与探针P1’、P2’之间的区别有两处:一,P1'相较于探针1在5’端增加了五个A碱基;二,P2’相较于P2在22bp位置增加了6个A碱基。这些碱基是为了保护、隔离探针中各个功能区而设计的,但由于碱基的随意增加影响了C-Ag+-C的错配甚至影响了后续HCR反应的进行,从而使得探针1’与2’的效果反而不如探针1、2。
实施例4:SiO2-P1用量的研究。取6支1.5mL离心管,编号1-6,每一支均加入25μLSCC缓冲液,0.5μL的10μΜP2,1μL 10μM H1和H2以及10μL的1μM AgNO3溶液,之后分别向1-6号离心管中加入2μL,5μL,7 μL,10μL,15μL,20μL SiO2-P1。37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心 10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度。结果表明,15μLSiO2-P1是最合适的用量。依据结果,比较了与SiO2-P1与不同P2的摩尔比,图 3中C表明最终选取15μL时为反应的最佳用量,即SiO2-P1与P2的摩尔比为 15:0.5。
实施例5:P2用量的研究。取5支1.5mL离心管,编号1-5,每一支均加入25μL SCC缓冲液,15μL SiO2-P1,2μL 10μM H1和H2以及10μL的1 μM AgNO3溶液,之后分别向1-5号离心管中加入0.1μL,0.3μL,0.5μL,0.7 μL,1μL的10μM P2。37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度。结果表明,0.7μL 10μM P2 是反应的最佳用量。依据结果,比较了与SiO2-P1分别为1:150,1:50,1: 30,7:150,1:15的P2,图3中D示出最终选取7:150时为反应的最佳用量。
实施例6:HCR反应元件H1、H2用量的研究。H1与H2的序列经过设计后如下,H1:5’-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG-3’;H2:5’- AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-3’。由于H1、H2均具有茎环结构,需要高温打开茎环结构后进行反应,将原浓度为100μM的H1、H2 稀释至10μM。95℃加热7min后,逐渐降至室温。冷却后4℃储存备用。取5 支1.5mL离心管,编号1-5,每一支均加入25μL SCC缓冲液,15μLSiO2-P1, 0.7μL的10μΜP2,2.5μL 10μM H2和10μL的1μM AgNO3溶液,之后分别向1-5号离心管中加入0.5μL,1μL,1.5μL,2μL,2.5μL的10μM的H1。 37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度。再另取5支1.5mL离心管,编号6-10,每一支均加入25μL SCC缓冲液,15μL SiO2-P1,0.7μL的10μΜP2,1.5μL 10 μM H1和10μL的1μM AgNO3溶液,之后分别向6-10号离心管中加入0.5μ L,1μL,1.5μL,2μL,2.5μL的10μM的H2。37℃孵育60min,结束后11000 rpm,离心10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度。图3 中E、F表明,1.5μL 10μM H1与2μL 10μM H2是反应的最佳用量。依据结果,比较了H1与H2用量比分别为1:5,2:5,3:5,4:5,1:1以及3:1,3: 2,3:4时的结果,最终选取H1与H2用量比为3:4为反应的最佳用量。
实施例7:反应体系缓冲液的研究。分别配制1×柠檬酸钠缓冲溶液(SCC)、DEPCH2O、0.01M的磷酸缓冲盐溶液(PBS)、0.02M磷酸缓冲液(PB)。取5支 1.5mL离心管,编号1-5,分别依次加入25μL1×SCC、ddH2O、DEPCH2O、0.01MPBS、 0.02MPB。向1-5号离心管分别加入15μLSiO2-P1,0.7μL的10μM P2,1.5μL的10μM H1和2μL的10μM Cy5-H2。37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度,结果表明这五种Buffer溶液相对荧光强度结果从高到低分别为:SCC、PBS、ddH2O、DEPC H2O、 PB。所以在其他条件等同的情况下,使用SCC作为缓冲液要优于其他试剂。选取最佳的反应Buffer溶液。
实施例8:反应时间的优化:取5支1.5mL离心管,编号1-5,每一支均加入15μLSiO2-P1,0.7μL的10μM P2,1.5μL的10μM H1和2μL的10μM Cy5-H2 以及10μL 1μM AgNO3溶液。1-5号离心管分别在37℃下反应10min、30min、 45min、60min、90min后11000rpm离心10min,弃上清重悬超声后检测各管荧光强度,不同反应时间下反应的结果也不相同,荧光强度由高到低分别为60min、 90min、30min、45min、10min。由于整个检测过程的限速步骤为HCR反应, HCR反应至少要进行1h,所以30min、45min、10min这三组由于HCR反应尚未完成所以荧光强度很低。5号由于时间过长导致HCR体系部分解离,所以最终荧光强度降低。图3中B示出在其他条件等同的情况下,60min为最佳反应时间。
实施例9:反应温度的优化:取5支1.5mL离心管,编号1-5,每一支均加入15μLSiO2-P1,0.7μL的10μM P2,1.5μL的10μM H1和2μL的10μM Cy5-H2 以及10μL 1μM AgNO3溶液。1-5号离心管分别在4℃、25℃、37℃、45℃、60℃下60min,之后以11000rpm离心10min,弃上清重悬超声后检测各管荧光强度,结果显示37℃为最佳反应温度。
实施例10:对不同浓度Ag+样本的检测,制作标准曲线。称取0.3397gAgNO3,溶于2mL水中制得1M的AgNO3溶液,之后分别稀释至10-12M,10-11M,10-10M,10-9M, 10-8M,得到一系列浓度梯度的Ag+溶液。取6支1.5mL离心管,编号1-6,分别加入 25μL1×柠檬酸钠(SCC)缓冲液作为整个反应体系Buffer溶液。取步骤(1)中制备好的15μLSiO2-P1探针和0.7μL 10μM DNA探针P2加入到25μL 1×柠檬酸钠(SSC)缓冲液中,充分混匀,然后加入1.5μL的10μM H1和2μL的10μM Cy5-H2。分别向1-5号离心管中加入上述系列浓度梯度Ag+,另外向6号离心管作为对照加入10μL SCC缓冲液,以补足反应体系。将6支离心管37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心10min,弃掉上清,50μL水重悬沉淀,超声使沉淀分散均匀,最后使用AzurecSceries成像系统检测每个离心管中Cy5荧光强度。根据荧光强度检测结果,做出荧光强度关于Ag+浓度标准曲线,并将荧光强度的变化和Ag+浓度的对数之间的线性关系进行拟合,得到了标准曲线图2示出(ΔF=
19045.99+1318.95lgC,R2=0.9948)。对于Ag+的检测限达到了pM级别,远低于 EPA允许的在饮用水中Ag+的阈值(460nM)。
实施例11:特异性研究:配制适量的NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、CdCl2溶液,并将其分别稀释至10μM备用。取7支1.5mL离心管,编号1-7,分别加入25μL SCC 缓冲液,15μL SiO2-P1,0.7μL的10μM P2,1.5μL的10μM H1和2μL的10μM Cy5-H2。分别向1-7号离心管加入10μL10-7MAgNO3、MgCl2、NaCl、KCl、CaCl2、 CdCl2溶液、ddH2O。37℃孵育60min,结束后11000rpm,离心10min,弃掉上清, 50μL水重悬沉淀,检测各管荧光强度,验证本方法特异性。如图4示出,与10-7 M Ag+相比,以下任何金属离子(包括Mg2+,Na+,K+,Ca2+,Cd2+)都不会对传感器产生明显的响应。显然,该结果表明这些与环境有关的金属离子对传感器的干扰可以忽略不计;该传感器具有出色的特异性。
以上内容仅为本发明的较佳实施例,对于本领域的普通技术人员,依据本发明的思想,在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处,本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (4)
1.一种基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag+检测方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)DNA探针与SiO2微球的偶联;将氨基化修饰的SiO2微球与DNA探针P1在偶联剂作用下进行偶联,得到SiO2-P1;
2)定量检测Ag+;将SiO2-P1与DNA探针P2,加入到缓冲液中,混匀,然后加入杂交链反应探针H1和荧光探针Cy5-H2,加入待检测目标Ag+,充分混匀,孵育;在反应完成后,通过使用离心机离心除去上清液,并将沉淀物重悬于水中,测量Cy5荧光信号强度。
2.根据权利要求1所述的基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag+检测方法,其特征在于,DNA探针P1为:TCAGCCCGGC或者AAAAATCAGCCCGGC;DNA探针P2为:AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAGCCCCCCTGA或者AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAAAAAAAGCCCCCCTGA。
3.根据权利要求1所述的基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag+检测方法,其特征在于,所述的缓冲液为柠檬酸钠缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的基于SiO2核酸探针以及杂交链信号放大的Ag+检测方法,其特征在于,步骤2)的具体步骤为:将步骤1)中连接的10μL DNA-SiO2探针和0.7μL 10μmol/LDNA探针P2)加入到25μL柠檬酸钠SSC缓冲液中,充分混匀,然后加入1.5μL的1μM杂交链反应探针H1和1.5μL的1μmol/L Cy5-H2;最后,加入目标Ag+,充分混匀,在37℃下孵育60分钟;在反应完成后,通过使用离心机以11,000rpm离心10分钟,除去上清液,并将沉淀物重悬于50μL水中,并通过AzureC600测量Cy5荧光信号强度。
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