CN109536577A

CN109536577A - 一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法与应用

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Publication number: CN109536577A
Application number: CN201811391599.0A
Authority: CN
Inventors: 邢曦雯; 王静茹; 赖淑妍; 吴纯; 刘奋勇
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109536577B

Abstract

本发明公开了一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)设计一条单链DNA作为DNA探针；(2)将不同终浓度的TdT分别与DNA探针、CoCl₂、dTTPs以及缓冲溶液进行孵育，得到富含poly‑T序列的单链探针DNA溶液；然后加入汞盐进行孵育，得到T‑Hg^II‑T结构介导的双链DNA溶液；再加入核酸染料，得到混合溶液；最后检测混合溶液的荧光强度信号，并根据荧光强度信号与TdT的终浓度绘制检测曲线；(5)将待测样品替换TdT，重复上述步骤，然后将检测结果与检测曲线对照，计算出待测样品中TdT的含量。该方法具有高灵敏度和良好的选择性，为医学检测和生物学研究提供了新的手段。

Description

一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法与应用。

背景技术

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以无模板方式在ssDNA的3'-OH末端随机添加脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，是许多领域中广泛使用的工具酶，用于靶DNA、RNA、金属离子、凋亡细胞、修饰酶等生物样品的检测。并且，TdT的异常表达与白血病和癌症密切相关，在大约90％急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)的病例中过度表达。许多临床研究表明，TdT的异常表达在癌症发展中有重要作用，可能会降低癌症对抗癌化疗的反应。此外，胚细胞中的TdT活性也作为一种重要的生物标志物。因此，它对癌症相关的药物开发和基础生化研究具有重要意义。

传统的TdT活性检测方法基于生化分析、免疫学测定和凝胶电泳。这些方法需要多次使用放射性或荧光标记的DNA或核苷酸过程，相对耗时且耗力。因此现在迫切需要开发一种灵敏度高、有选择性、分析迅速、操作也简单的TdT检测技术。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法。

本发明的另一目的在于提供所述末端脱氧核酸酶活力的测定方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法，包括如下步骤：

(1)设计一条单链DNA作为DNA探针；

(2)将不同终浓度的TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)分别与步骤(1)中的DNA探针、CoCl₂、dTTPs(脱氧胸苷三磷酸)以及缓冲溶液进行孵育，得到富含poly-T序列的单链探针DNA溶液；

(3)将汞盐加入到步骤(2)中得到的富含poly-T序列的单链探针DNA中进行孵育，得到T-Hg^II-T结构介导的双链DNA溶液；

(4)将核酸染料加入到步骤(3)中得到的T-Hg^II-T结构介导的双链DNA中，得到混合溶液；然后检测混合溶液的荧光强度信号，记为F；同时，以步骤(2)中不添加TdT为对照(即步骤(2)中不添加TdT，重复上述步骤)，检测其荧光强度信号，记为F₀；再根据荧光信号增强倍数F/F₀与TdT的终浓度绘制检测曲线；

(5)将待测样品替换步骤(2)中的TdT，重复步骤(2)～(4)，然后将检测结果与步骤(4)中得到的检测曲线对照，计算出待测样品中TdT的含量。

步骤(1)中所述的单链DNA为任意设计的一条短链DNA，其不具备很强的序列选择性；单链DNA的大小优选为14nt～34nt(价格低廉)，可通过本领域常规方法获得，或委托生物公司合成(如生工生物工程(上海)股份有限公司)；其核苷酸序列优选为：5'-ACCCCCCACCCCCA-3'。

步骤(2)中所述的TdT的浓度范围为0～500U/mL。

步骤(2)中所述的TdT的终浓度为0.5U/mL，1U/mL，2.5U/mL，5U/mL，10U/mL，25U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL。

步骤(2)中所述的DNA探针为过量的DNA探针，其用量为按其在反应体系的终浓度为2.5～5μM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为2.5μM计算。

步骤(2)中所述的CoCl₂的添加量为按其在反应体系的终浓度为200μM～300μM；优选为按其在反应体系的终浓度为250μM计算。

步骤(2)中所述的dTTPs的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.6～1mM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为0.75mM计算。

步骤(2)中所述的缓冲溶液为1×TdT工作缓冲液(1×TdT buffer)，其配方为：20mM Tris-HAc，50mM KAc，10mM Mg(Ac)₂，pH 7.9。

步骤(2)中所述的孵育的条件为：先在37℃孵育10～80min，然后在72℃孵育10min；优选为：先在37℃孵育70～80min，然后在72℃孵育10min；更优选为：先在37℃孵育70min，然后在72℃孵育10min。

步骤(3)中所述的汞盐优选为氯化汞(HgCl₂)。

步骤(3)中所述的汞盐的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.5～10μM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为2.5～10μM计算；更优选为按其在反应体系的终浓度为2.5μM计算。

步骤(3)中所述的孵育的条件为：在室温下孵育10～30min；优选为：在室温下孵育20min。

步骤(4)中所述的核酸染料优选为SYBR green I染料。

所述的SYBR green I染料的添加量优选为按其在反最终体系的终浓度为0.245μM计算。

步骤(4)中所述的检测为采用荧光分光光度计进行检测；优选为采用F-7000荧光分光光度计进行检测。

步骤(5)中所述的待测样品为含有TdT的待测样品；包括血清样品和含有癌细胞的样品等；优选为含有癌细胞的样品。

所述的含有癌细胞的样品优选为癌细胞裂解液。

所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法在检测末端脱氧核酸酶或检测痕量汞中的应用。

一种检测痕量汞的方法，包括如下步骤：

(a)设计一条单链DNA作为DNA探针；

(b)将不同终浓度的TdT分别与步骤(a)中的DNA探针、CoCl₂、dTTPs(脱氧胸苷三磷酸)以及缓冲溶液进行孵育，得到富含poly-T序列的单链探针DNA溶液；

(c)将汞盐加入到步骤(b)中得到的富含poly-T序列的单链探针DNA中进行孵育，得到T-Hg^II-T结构介导的双链DNA溶液；

(d)将核酸染料加入到步骤(c)中得到的T-Hg^II-T结构介导的双链DNA中，得到混合溶液；然后检测混合溶液的荧光强度信号，记为F；同时，以步骤(b)中不添加TdT为对照(即步骤(b)中不添加TdT，重复上述步骤)，检测其荧光强度信号，记为F₀；再根据荧光信号增强倍数F/F₀与TdT的终浓度绘制检测曲线；

(e)将含有Hg²⁺的待测样品替换步骤(c)中的汞盐，重复步骤(b)～(d)，然后将检测结果与步骤(d)中得到的检测曲线对照，计算出待测样品中Hg²⁺的含量。

步骤(a)中所述的单链DNA的大小优选为14nt～34nt。

步骤(a)中所述的单链DNA的核苷酸序列为：5'-ACCCCCCACCCCCA-3'。

步骤(b)中所述的TdT的浓度范围为0～500U/mL。

步骤(b)中所述的TdT的终浓度优选为0.5U/mL，1U/mL，2.5U/mL，5U/mL，10U/mL，25U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL。

步骤(b)中所述的DNA探针为过量的DNA探针，其用量为按其在反应体系的终浓度为2.5～5μM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为2.5μM计算。

步骤(b)中所述的CoCl₂的添加量为按其在反应体系的终浓度为200μM～300μM；优选为按其在反应体系的终浓度为250μM计算。

步骤(b)中所述的dTTPs的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.6～1mM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为0.75mM计算。

步骤(b)中所述的缓冲溶液为1×TdT工作缓冲液(1×TdT buffer)，其配方为：20mM Tris-HAc，50mM KAc，10mM Mg(Ac)₂，pH 7.9。

步骤(b)中所述的孵育的条件为：先在37℃孵育10～80min，然后在72℃孵育10min；优选为：先在37℃孵育70～80min，然后在72℃孵育10min；更优选为：先在37℃孵育70min，然后在72℃孵育10min。

步骤(c)中所述的汞盐优选为氯化汞(HgCl₂)。

步骤(c)中所述的汞盐的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.5～10μM计算；优选为按其在反应体系的终浓度为2.5～10μM计算；更优选为按其在反应体系的终浓度为2.5μM计算。

步骤(c)中所述的孵育的条件为：在室温下孵育10～30min；优选为：在室温下孵育20min。

步骤(d)中所述的核酸染料优选为SYBR green I染料。

步骤(d)中所述的检测为采用荧光分光光度计进行检测；优选为采用F-7000荧光分光光度计进行检测。

步骤(e)中所述的待测样品优选为含有痕量汞的待测样品。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提供一种基于T-Hg^Ⅱ-T结构的TdT酶活力测定方法，该方法基于末端脱氧核酸酶TdT可以在纯脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的条件下向单链引物primer的3’-OH末端添加多聚脱氧核苷(poly-T)尾巴，具有poly-T尾巴的ssDNA可以通过添加Hg²⁺形成稳定的T-Hg^Ⅱ-T结构，而形成的DNA双链体会导致SG的荧光强度的明显增强，实现了对生物样品中的末端脱氧核酸酶活性的快速检测，为医学检测和生物学研究提供了新的手段。

2、本发明的方法基于TdT的特性，引入dATP，随机在非标记普通单链DNA的3’末端产生多聚腺嘌呤尾巴(poly-T tail)。多聚胸腺嘧啶延伸物可在汞离子的作用下形成T-Hg^Ⅱ-T错配的DNA双联，并与双链荧光染料SYBR Green I结合发出荧光。由此现象可作为检测体系中TdT含量及活性标定的方法基础。随后本单位通过筛选并优化该方法的具体步骤，使方法的检测灵敏度大大增强，并可以对复杂生物样品中的TdT进行直接标定。在最佳条件下，在此体系中可以用来定量监测TdT活性和动态范围从0.5到500unit/mL，最小检测值为0.5unit/mL。该方法具有极高的灵敏度和良好的选择性，并且是现有TdT检测方法中最为简便，耗时最短的，对未来在以TdT为靶标的疾病诊断和药物发现提供了新的检测手段。

3、本发明操作和仪器要求比较简单，且无标签，可靠，快捷、方便、灵敏度高，成本低，呈现较好的线性响应。

附图说明

图1为本发明的TdT的检测示意图。

图2为末端脱氧核苷转移酶延伸可行性验证图；其中，泳道1：引物ssDNA-1；泳道2：引物ssDNA-1+dTTPs+0.5U TdT；泳道3：引物ssDNA-1+dTTPs+1U TdT；泳道4：引物ssDNA-1+dTTPs+2U TdT；泳道5：引物ssDNA-1+dTTPs+5U TdT。

图3为T-Hg^II-T结构形成可行性验证图。

图4为本发明方法可行性的荧光发射光谱图(1：ssDNA-1+Hg²⁺+SG；2：ssDNA-1+TdT+SG；3：ssDNA-1+TdT+Hg²⁺+SG)。

图5为TdT和Hg²⁺浓度优化图；其中；图a为TdT孵育时间的优化图；图b为Hg²⁺浓度的优化图。

图6为不同浓度的TdT荧光发光光谱图；其中，图A为高绝对量(0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10U)TdT荧光发光光谱图；图B为低绝对量(0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5U)TdT荧光发光光谱图。

图7为本发明方法的特异性检测结果图。

图8为不同浓度的Hg²⁺荧光发光光谱图；其中，图A为高浓度Hg²⁺(125，250，500，750，1000，1250，2500，5000，7500，10000nM)荧光发光光谱图；图B为低浓度Hg²⁺(125，250，500，750，1000，1250nM)TdT荧光发光光谱图。

图9为对Hg²⁺特异性的检测示意图。

图10为癌细胞中不同含量的内源性TdT与荧光信号增强度的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明中“U”和“unit”为酶活力单位，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量为1U。

本发明中所涉及的TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)购于纽英伦生物技术(北京)有限公司。

实施例1本发明方法的原理和可行性验证

1、本发明的TdT(Terminal deoxynucleotidyl transferase，末端脱氧核苷酸转移酶)的检测示意图如图1所示。TdT可以以无模板的方式在ssDNA的3'-OH末端进行催化加成反应，其具体实施过程如下：

(1)设计一条14nt的引物ssDNA1(5'ACC CCC CAC CCC CA 3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)将含有2.5μM引物ssDNA-1，1×TdT buffer(20mM Tris-HAc，50mM KAc，10mMMg(Ac)₂，pH 7.9)，250μM CoCl₂，0.75mM dTTPs，和不同浓度的TdT(加入量为：0U，0.5U，1U，2U，5U；使体系中TdT的浓度是0U/mL,25U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL)的样品在37℃条件下孵育80min，然后在72℃孵育10min(使TdT失活)，得到五种样品(1：引物ssDNA1；2：引物ssDNA1+dTTPs+0.5U TdT；3：引物ssDNA1+dTTPs+1U TdT；4：引物ssDNA 1+dTTPs+2U TdT；5：引物ssDNA1+dTTPs+5U TdT)。

(3)将上述样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，在100V电压下电泳80min。

(4)将上述凝胶在1×SYBR gold核酸染料泡染1h后置于伯乐凝胶成像仪上成像。

结果如图2所示，ssDNA-1的长度随着TdT量的增加而增加，这证实了TdT可以在ssDNA的3'-OH末端以无模板的方式进行催化加成反应。

2.T-Hg^II-T结构的形成，其具体实施过程如下：

(1)设计一条34nt的引物(ssDNA-2)(5'ACC CCC CAC CCC CAT TTT TTT TTT TTTTTT TTT T 3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)用ssDNA-2与氯化汞混合在Chirascan的圆二色谱仪测量其结构随着Hg²⁺浓度而发生的变化；其中，混合体系中ssDNA-2的浓度为0.125μM；氯化汞的终浓度为：5，10，20，25，30，35，40，45，50，60，65，70nM。

如图3所示，随着Hg²⁺的添加，ssDNA-2的负峰逐渐从250nm转移到280nm，得出T-Hg^II-T介导的金属DNA双链的形成。

3.此发明可行性验证，其具体实施过程如下：

(1)设计一条14nt ssDNA片段作为DNA探针(5'ACC CCC CAC CCC CA3')，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)将含有2.5μM的ssDNA，TdT(加入量分别为0，5unit；即终浓度为0，250U/mL)，1×TdT buffer(50mM Tris-HCl，1mM MgCl₂，pH 9.0)，250μM CoCl₂，0.75mM dTTPs混合在37℃孵育70min，72℃孵育10min，共得到2个样品(ssDNA与ssDNA+TdT)；

(3)将HgCl₂(终浓度0，2.5μM)与上述样品在室温下孵育20min，共得到3个样品(ssDNA+TdT，ssDNA+Hg²⁺与ssDNA+TdT+Hg²⁺)。

(4)在上述反应体系中加入终浓度0.245μM的SYBR green I染料(SG)，共得到3个样品ssDNA+TdT+SG，ssDNA+Hg²⁺+SG与ssDNA+TdT+Hg²⁺+SG)立即使用Hitachi F-7000荧光分光光度计测量待测体系的荧光强度信号。

结果如图4所示，TdT和Hg²⁺同时存在时，SYBR green I的信号可被增强，这也证实了此发明的可行性。

实施例2实验体系的优化

1.TdT的孵育时间的优化

TdT的延伸孵育时间对于poly-T序列的形成的产量及其后续的检测的荧光信号相应值的影响有决定性作用。因此我们对TdT的最佳孵育时间进行了一次系统的探究。具体步骤如下：

按实施例1.3(可行性验证)中的方法(其中步骤(2)中TdT的终浓度为250U/mL，步骤(3)中HgCl₂的终浓度为2.5μM)，不同之处在于：步骤(2)中TdT的孵育条件为先在37℃孵育0，10，20，30，40，50，60，70，80min，然后在72℃孵育10min。

结果如图5a所示：由图5a可知随着时间的增加(0，10，20，30，40，50，60，70，80min)，荧光检测信号随之增强，但在70min之后达到一个平台期。因此，为使实验高效，我们确定70min为TdT的最佳孵育时间。

2.Hg²⁺最佳浓度的优化

在此系统中DNA双链形成的过程中，Hg²⁺的浓度对T-Hg^II-T结构的形成尤为重要。由此，我们研究了Hg²⁺的浓度对T-Hg^II-T结构的影响，具体步骤如下：

按实施例1.3(可行性验证)中的方法(步骤(2)中TdT的终浓度为250U/mL)，步骤(4)的反应体系中Hg²⁺的浓度设为125，250，500，750，1000，1250，2500，5000，7500，10000nM。

结果如图5b所示：荧光信号与Hg²⁺浓度在0到2500nM范围内呈良好的线性关系，在2500nM左右浓度内达到平稳。因此，为了提高实验效率，我们确定2500nM为Hg²⁺的最佳浓度。

实施例3 TdT活性的检测

作为白血病疾病和核酸修饰工具的生物标志物，TdT活性的检测具有临床和分子生物学意义。因此，我们对TDT的活性进行检测。具体实施过程如下：

(1)将含有2.5μM引物探针ssDNA，不同绝对量的TdT(0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10U)1×TdT buffer，250μM CoCl₂，0.75mM dTTPs的样品混合后在37℃孵育70min，然后在72℃孵育10min。其中，样品总量为20μL，即样品中TdT的浓度为0.5U/mL，1U/mL，2.5U/mL，5U/mL，10U/mL，25U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL。

(2)将2.5μM HgCl₂(终浓度)与步骤(1)中获得的所得样品在室温下孵育20min。

(3)最后向步骤(2)中获得的反应体系中加入0.245μM SYBR green I染料后，立即使用Hitachi F-7000荧光分光光度计测量待测体系的荧光强度信号。其激发波长为495nm，光谱记录在500nm到600nm之间，采用530nm的荧光强度进行数据分析。

我们的分析系统显示出TdT的活性，如图6所示，荧光响应随着TdT的增加而逐渐增加，并且当TdT的量在0到5U之间时观察到良好的线性响应(其线性关系为：y＝11.83x-1.17.线性相关系数R²＝0.97；其中，x为TdT的终浓度，y为荧光信号增强倍数，y＝F/F₀，F代表的是加TdT的样品荧光强度，F₀代表的是没有加TdT的样品荧光强度(即步骤(1)中不添加TdT，其余步骤相同)；F/F₀代表的是荧光信号增强倍数)，TdT的检测限低至，0.01U，信噪比(S/N)为3。

实施例4 TDT特异性的检测

为了研究本发明方法对TDT检测的特异性，我们添加TdT和其他DNA聚合酶进行对比，包括PFU(Pfu聚合酶)，PrimerStar，T4 polymerase(T4 DNA聚合酶)和T4 ligase(T4DNA连接酶)(聚合酶均可通过常规市售获得)。方法同实施例3，其中，PFU，PrimerStarhe和T4 polymerase的用量均为1U和10U；T4 ligase和TdT用量均为1U)。

结果如图7所示，只有TdT可以诱导显著的荧光增强，而其他酶即使加入的浓度比TdT高10倍，也没有明显的荧光变化，表明TdT活性测定系统表现出优异的特异性。

实施例5应用于Hg²⁺的检测

由于社会中汞的使用导致环境污染的增加，汞的检测具有越来越重要的意义。同样，本发明的分析方法可以进一步用于检测痕量汞，具体步骤如下：

(1)将含有2.5μM引物探针ssDNA中，500U/mL TdT，1×TdT buffer，250μM CoCl₂，0.75mM dTTPs混合后在37℃孵育70min，然后在72℃孵育10min。

(2)将不同浓度HgCl₂与步骤(1)中获得的所得样品在室温下孵育20min；其中，所得样品中HgCl₂的终浓度为125，250，500，750，1000，1250，2500，5000，7500，10000nM。

(3)最后向步骤(2)中获得的反应体系中加入终浓度0.245μM的SYBR green I染料后，立即使用Hitachi F-7000荧光分光光度计测量待测体系的荧光强度信号。其激发波长为495nm，光谱记录在500nm到600nm之间，采用530nm的荧光强度进行数据分析。

结果如图8所示，当Hg²⁺的量在125到1250nM之间时，获得了良好的线性响应，并且基于信噪比计算出检测限为22.97nM。

此外，为了评估选择性，在提出的Hg²⁺检测方法中，研究了一系列可能的其他金属离子，包括Ca²⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Pb²⁺，Ba²⁺，Cd²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Zn²⁺和Sr²⁺，其浓度均为2.5μM。图9显示了我们的Hg²⁺方法对其他金属离子的高选择性，这可归因于高度特异性的T-Hg^Ⅱ-T结构。结果表明我们的方法可用于检测Hg²⁺。

实施例6实际样本检测分析

为了证明在临床诊断中提出分析方法的潜在应用，我们在大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2h3细胞)中检测了TdT活性；其中，RBL-2h3细胞从中科院上海细胞库购买得到。

1.细胞裂解液的获取

(1)将1mL RBL-2h3细胞冻存液加入到含有9mL DMEM细胞培养液的培养皿中，37℃培养至细胞铺满培养皿。

(2)弃去培养液，用PBS缓冲液冲洗两次，胰酶消化两分钟，加入10mL DMEM细胞培养液，制备成细胞悬液。

(3)细胞悬液移入10mL离心管中，1000rpm离心10min。

(5)弃去上清，加入预冷的PBS缓冲液，1000rpm离心10min，弃上清，重复该步操作一次。

(6)弃上清，加入200uL细胞裂解液，置于冰上裂解40min～1h，然后10000rpm离心5min。

(7)上清移至EP管中，-20℃保存。

2、RBL-2h3细胞中TdT的检测

RBL-2h3细胞细胞裂解液中TdT的检测方法与实施例3中TdT活性检测方法相同，只是TdT被不同含量的RBL-2h3细胞裂解液所取代(浓度为1μg/μL,5μg/μL,10μg/μL,20μg/μL,50μg/μL)。

结果如图10所示，随着细胞裂解液浓度的增加，荧光信号明显增强，表明细胞裂解液中的TdT活性越强，说明该方法依旧具有很好的信号响应，可用于直接的生物样品检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNA探针

<400> 1

accccccacc ccca 14

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssDNA-2

<400> 2

accccccacc cccatttttt tttttttttt tttt 34

Claims

1.一种末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计一条单链DNA作为DNA探针；

(2)将不同终浓度的TdT分别与步骤(1)中的DNA探针、CoCl₂、dTTPs以及缓冲溶液进行孵育，得到富含poly-T序列的单链探针DNA溶液；

(4)将核酸染料加入到步骤(3)中得到的T-Hg^II-T结构介导的双链DNA中，得到混合溶液；然后检测混合溶液的荧光强度信号，记为F；同时，以步骤(2)中不添加TdT为对照，检测其荧光强度信号，记为F₀；再根据荧光信号增强倍数F/F₀与TdT的终浓度绘制检测曲线；

2.根据权利要求1所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的单链DNA的核苷酸序列为：5'-ACCCCCCACCCCCA-3'。

3.根据权利要求1所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的TdT的浓度范围为0～500U/mL；

步骤(2)中所述的DNA探针的用量为按其在反应体系的终浓度为2.5～5μM计算；

步骤(2)中所述的CoCl₂的添加量为按其在反应体系的终浓度为200μM～300μM；

步骤(2)中所述的dTTPs的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.6～1mM计算；

步骤(3)中所述的汞盐的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.5～10μM计算。

4.根据权利要求1所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的TdT的终浓度为0.5U/mL，1U/mL，2.5U/mL，5U/mL，10U/mL，25U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL；

步骤(2)中所述的缓冲溶液为1×TdT工作缓冲液，其配方为：20mM Tris-HAc，50mMKAc，10mM Mg(Ac)₂，pH 7.9；

步骤(3)中所述的汞盐为氯化汞；

步骤(4)中所述的核酸染料为SYBR green I染料；

步骤(5)中所述的待测样品为含有TdT的待测样品。

5.根据权利要求1所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的孵育的条件为：先在37℃孵育10～80min，然后在72℃孵育10min；

步骤(3)中所述的孵育的条件为：在室温下孵育10～30min。

6.根据权利要求1所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的孵育的条件为：先在37℃孵育70～80min，然后在72℃孵育10min；

步骤(3)中所述的孵育的条件为：在室温下孵育20min。

7.权利要求1～6任一项所述的末端脱氧核酸酶活力的测定方法在检测末端脱氧核酸酶或检测痕量汞中的应用。

8.一种检测痕量汞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(a)设计一条单链DNA作为DNA探针；

(b)将不同终浓度的TdT分别与步骤(a)中的DNA探针、CoCl₂、dTTPs以及缓冲溶液进行孵育，得到富含poly-T序列的单链探针DNA溶液；

(d)将核酸染料加入到步骤(c)中得到的T-Hg^II-T结构介导的双链DNA中，得到混合溶液；然后检测混合溶液的荧光强度信号，记为F；同时，以步骤(b)中不添加TdT为对照，检测其荧光强度信号，记为F₀；再根据荧光信号增强倍数F/F₀与TdT的终浓度绘制检测曲线；

9.根据权利要求8所述的检测痕量汞的方法，其特征在于：

步骤(a)中所述的单链DNA的核苷酸序列为：5'-ACCCCCCACCCCCA-3'；

步骤(b)中所述的TdT的浓度范围为0～500U/mL；

步骤(b)中所述的DNA探针的用量为按其在反应体系的终浓度为2.5～5μM计算；

步骤(b)中所述的CoCl₂的添加量为按其在反应体系的终浓度为200μM～300μM；

步骤(b)中所述的dTTPs的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.6～1mM计算；

步骤(c)中所述的汞盐的添加量为按其在反应体系的终浓度为0.5～10μM计算。

10.根据权利要求8所述的检测痕量汞的方法，其特征在于：

步骤(b)中所述的孵育的条件为：先在37℃孵育10～80min，然后在72℃孵育10min；

步骤(b)中所述的缓冲溶液为1×TdT工作缓冲液，其配方为：20mM Tris-HAc，50mMKAc，10mM Mg(Ac)₂，pH 7.9；

步骤(c)中所述的汞盐为氯化汞；

步骤(c)中所述的孵育的条件为：在室温下孵育10～30min；

步骤(d)中所述的核酸染料为SYBR green I染料。