CN114317679B - 一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，利用单链DNA以及单链DNA结合染料，将末端脱氧核苷酸转移酶的活性与荧光强度相对应。本方法具有易操作、灵敏度高、稳定性好、检测范围大等特点，相比于传统的检测方法，本方法不涉及放射性同位素，对环境更友好。
Description
技术领域
本发明涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，属于生物化学领域。
背景技术
酶活表征是一种作为酶的功能研究以及酶的生产质检技术，在酶的性能以及酶质检中有着重要的意义。随着基因测序技术的发展，对酶的功能研究也越发重要，尤其是对于具有3’OH末端单链延伸功能的酶。在测序技术中，对于具有3’OH末端延伸功能的酶的应用越来越广泛。本发明的酶活检测方法可对具有3’OH脱氧核糖核苷酸末端单链延伸的酶具有很好的检测和表征，应用本方法不局限于对末端脱氧核苷酸转移酶进行活性检测，还可以对MLV逆转录酶，RNA聚合酶以及具有dA-Tailing活性的，单链延伸活性的酶进行检测。
发明内容
本发明公开一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度与单链DNA浓度的相对关系；
2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；
3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。
根据优选的实施方式，所述单链DNA染料是可以结合单链DNA的荧光染料，包括OliGreen ssDNA reagent、 ssDNA Dye、Qubit ssDNA Assay kit中的染料。
根据优选的实施方式，所述单链DNA的长度为7～50nt，优选的为10～30nt。
根据优选的实施方式，所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系为标准曲线。
根据优选的实施方式，所述反应体系内还包括反应正常进行所需的缓冲液组分。
根据优选的实施方式，步骤1)中所述的多个反应体系，优选为3个及以上，更优选为5个及以上。
根据优选的实施方式，所述脱氧核苷酸底物优选的由脱氧腺苷三磷酸(dATP)和/或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)组成。
根据优选的实施方式，所述方法还适用于对MLV逆转录酶，RNA聚合酶以及具有dA-Tailing活性的、单链延伸活性的酶进行活性检测。
有益效果
本发明的酶活检测方法，根据末端脱氧核苷酸转移酶具有的3’OH脱氧核糖核苷酸末端延伸碱基的功能，对该功能进行检测。本方法具有易操作、灵敏度高、稳定性好、重复性高、检测范围大等特点，相比于传统的检测方法，本方法不涉及放射性同位素，不会对环境造成污染，更不会对研究人员造成伤害。
附图说明
图1.单链DNA浓度与荧光强度的标准曲线，所述单链DNA染料为OliGreen荧光染料，激发光波长为480nm，发射光波长为520nm。
图2.本发明方法对末端脱氧核苷酸转移酶活性的检测范围。
图3.不同末端脱氧核苷酸转移酶突变体的活性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施方式。本领域的技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
下述实施方式中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施方式中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
除非另外定义，否则本文使用的所有科学和技术术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是遗传工程中的重要工具酶之一，是一种特殊的DNA聚合酶，可以在没有模板存在的条件下催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。此外，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。
TdT在分子生物学中应用广泛，例如，该酶可用于cDNA末端的快速扩增(RACE)中添加核苷酸，并可以用来作为在后续PCR的引物的模板；在检测细胞凋亡常用的TUNEL检测中，该酶也可以用于添加标记放射性同位素的核苷酸；在基因测序中，可使用该酶在3’末端加双脱氧核苷酸封端，以此降低测序反应的杂信号的产生。因此，对TdT的活性进行准确检测有重要的实际应用价值。
对此，本发明提供了一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，根据末端转移酶具有的以单链DNA为模板，在3’OH脱氧核糖核苷酸末端催化延伸的功能，可以延伸合成新的碱基，而新合成的单链DNA可以与单链DNA染料结合，在特定波长的激发光和发射光处有特定的荧光信号，酶的活性与荧光信号的强度成正比。
具体的，本发明提供一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度与单链DNA浓度的相对关系；
2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；
3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。
根据优选的实施方式，所述单链DNA染料是可以结合单链DNA的荧光染料，包括OliGreen ssDNA reagent、 ssDNA Dye、Qubit ssDNA Assay kit中的染料。其中，OliGreen ssDNA reagent，简称为OliGreen，是一种对溶液中的寡核苷酸和单链DNA(ssDNA)进行定量的超灵敏绿色荧光核酸染色剂。OliGreen可以与单链DNA结合并在激发光480nm、发射光520nm处有荧光，且在一定范围内，结合的单链DNA的量与荧光强度成正比。 ssDNA Dye包含了一种荧光的单链DNA结合染料，其激发波长和发射波长分别为492nm和528nm，这种染料也可以实现对溶液中少量单链DNA的定量，从而用于单链DNA结合蛋白的活性定量。
根据优选的实施方式，所述单链DNA的长度为7～50nt，优选的为10～30nt。nt表示的是核苷酸，所述单链DNA的长度不能太短，对于OliGreen和Qubit ssDNAAssay kit中的染料，当核苷酸的个数小于等于6时，所述荧光染料无法与之结合，从而不会产生荧光，因此，需要将单链DNA的长度适当地设计得长一些；所述单链DNA的长度也不宜过长，最长为50个核苷酸，以降低成本。
根据优选的实施方式，步骤1)中所述的多个反应体系，优选为3个及以上，更优选为5个及以上。所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系为标准曲线。本发明的活性检测方法严格依赖于标准曲线，因此必须保证标准曲线的准确度，为此需设置3个及以上或者5个及以上的浓度梯度。所述不同浓度梯度的单链DNA，优选的是线性的浓度梯度，例如的，从高到低依次是：500ng/ul、400ng/ul、300ng/ul、200ng/ul、100ng/ul、0ng/ul。
根据优选的实施方式，所述反应体系内还包括反应正常进行所需的缓冲液组分，例如TE缓冲液等。由于本发明的一些反应体系包括TdT，相对应的，所述缓冲液可以是适宜于TdT发挥功能的缓冲液。
本发明中，步骤2)中的反应体系1，实际上就是一个空白对照组，其稳定情况下的荧光强度1反映的是体系内的单链DNA的量，而反应体系2中测得的荧光强度2，除了包含此部分的荧光值，更多的是在TdT催化作用下发生碱基延伸的单链DNA的量，而这部分荧光强度才能准确反映待测TdT的活性，所以荧光强度2与荧光强度1的差值对应的是待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性。
根据优选的实施方式，所述脱氧核苷酸底物优选的由脱氧腺苷三磷酸(dATP)和/或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)组成，dATP和dTTP的比例可以调整，例如的二者的数量比可以为1:1或者2:1或者3:1，等等。
根据优选的实施方式，所述方法还适用于MLV逆转录酶，RNA聚合酶以及具有dA-Tailing活性的、单链延伸活性的酶进行活性检测。MLV逆转录酶能以RNA或单链DNA为模板，由引物起始合成一条互补的DNA链。
实施例1
荧光值与单链DNA(ssDNA)浓度的标准曲线的建立
1.单链DNA定量：本实验选取PCR引物作为单链DNA，加90.1uL水，用涡旋混匀仪混匀后，用nanodrop测浓度，并分别稀释至50uM、25uM、12.5uM、6.25uM、3.125uM、0uM。
2.按照下表配制反应体系：
| 组分 | 体积 |
| 10×Terminal Transferase Reaction Buffer | 5ul |
| OliGreen | 2ul |
| H2O | 42ul |
| Total | 49ul |
振荡混匀，冰上放置。
3.测量
1)取Costar全黑酶标板一块，将配制的反应液分到酶标板中，每孔49ul。
2)用移液器分别取1ul步骤1稀释好的单链DNA加入到酶标板的反应液中，用涡旋混匀仪混匀。
3)盖上盖子，将酶标板放在恒温培养箱中，设置温度37℃，10min后取出。
4)去掉盖子，将酶标板放在酶标仪上读数，设置温度37℃，激发光480nm，发射光520nm。
4.绘制标准曲线
取每个样品对应的3个重复孔的平均值作为该样品对应的荧光强度，以荧光值为纵坐标，以单链DNA浓度为横坐标作图，线性回归后得到标准曲线以及拟合方程。所述标准曲线参见图1，拟合方程为y＝549.85x-214.58，可见在单链DNA浓度为0-50uM的范围内，荧光强度与所述单链DNA的量呈线性关系。
实施例2
TdT末端转移酶的活性检测
1.取NEB TdT末端转移酶，进行梯度稀释，终浓度分别为10U/ul、5U/ul、2.5U/ul、1.25U/ul、0.625U/ul、0.3125U/ul、0.15625U/ul、0.078125U/ul，以及一个酶浓度为0的对照体系。
2.按照下表配制反应体系：
| 组分 | 体积 |
| ssDNA(5uM) | 2ul |
| dNTPs(5mM each) | 2ul |
| 10×Terminal Transferase Reaction Buffer | 5ul |
| 10×CoCl2 | 5ul |
| OliGreen | 2ul |
| H2O | 33ul |
| Total | 49ul |
振荡混匀，冰上放置。
3.测量
1)取Costar全黑酶标板一块，将配制的反应液分到酶标板中，每孔49ul。
2)用移液器分别取1ul步骤1稀释好的TdT末端转移酶加入到酶标板的反应液中，用涡旋混匀仪混匀。
3)盖上盖子，将酶标板放在恒温培养箱中，设置温度37℃，30min后取出。
4)去掉盖子，将酶标板放在酶标仪上读数，设置温度37℃，激发光480nm，发射光520nm。
4.数据处理
以酶浓度为0的体系得到的荧光强度作为荧光强度1，不同浓度的末端转移酶的体系得到的荧光强度为荧光强度2，分别求出不同浓度的末端转移酶的荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，再以末端转移酶的活性为横坐标，对应的荧光差值为纵坐标绘图，线性回归后得到拟合方程。所述结果图参见图2，可见在5U-0.15625U这个范围内，荧光差值与末端转移酶的活性呈线性正相关，即末端转移酶的活性越高，其催化延伸的单链DNA越多，导致荧光差值越大。
实施例3
不同末端转移酶突变体活性的比较
1.提供不同末端转移酶：WT野生型、突变体1、突变体2及突变体3，分别将其稀释至0.74mg/ml。
2.按照下表配制反应体系：
| 组分 | 体积 |
| ssDNA(5uM) | 2ul |
| dNTPs(5mM each) | 2ul |
| 10×Terminal Transferase Reaction Buffer | 5ul |
| 10×CoCl2 | 5ul |
| OliGreen | 2ul |
| H2O | 33ul |
| Total | 49ul |
振荡混匀，冰上放置。
3.测量
1)取Costar全黑酶标板一块，将配制的反应液分到酶标板中，每孔49ul。
2)用移液器分别取1ul步骤1稀释好的不同的末端转移酶加入到酶标板的反应液中，其中一个反应体系内不加末端转移酶，用1ul H2O代替(空白对照)，用涡旋混匀仪混匀。
3)盖上盖子，将酶标板放在恒温培养箱中，设置温度37℃，10min后取出。
4)去掉盖子，将酶标板放在酶标仪上读数，设置温度37℃，激发光480nm，发射光520nm。
4.数据处理
上述4个有末端转移酶的反应体系得到的荧光强度分别减去空白对照组得到的荧光强度，将得到的荧光差值代入实施例1的拟合方程中，得到对应的延伸的单链DNA的量，见图3。
Claims (6)
1.一种末端脱氧核苷酸转移酶的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立多个反应体系，每一反应体系包括单链DNA以及过量的单链DNA染料，所述多个反应体系具有不同的单链DNA浓度，测定每一反应体系对应的荧光强度，获得荧光强度与单链DNA浓度的相对关系；
2)建立反应体系1和反应体系2，其中，所述反应体系1包括一定量的所述单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，反应稳定后，得到荧光强度1；所述反应体系2包括与反应体系1等量的单链DNA，过量的所述单链DNA染料，过量的脱氧核苷酸底物，以及一定量的待测末端脱氧核苷酸转移酶，反应稳定后，得到荧光强度2；
3)计算荧光强度2与荧光强度1的荧光差值，结合所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系，计算得到待测末端脱氧核苷酸转移酶催化延伸的单链DNA的量，则得到所述待测末端脱氧核苷酸转移酶的活性；
所述单链DNA染料是可以结合单链DNA的荧光染料OliGreen ssDNA
reagent。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链DNA的长度为7～50nt。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光强度与单链DNA浓度的相对关系为标准曲线。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系内还包括反应正常进行所需的缓冲液组分。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的多个反应体系，为3个或3个以上反应体系。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱氧核苷酸底物由脱氧腺苷三磷酸和/或脱氧胸苷三磷酸组成。
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Citations (4)
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| CN107604042A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-19 | 山东师范大学 | 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法 |
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Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN104293883A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-01-21 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种末端脱氧核苷酰转移酶活性测定方法 |
| CN107541508A (zh) * | 2016-06-24 | 2018-01-05 | 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 | 模板‑引物核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒 |
| CN107604042A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-19 | 山东师范大学 | 基于单个量子点的检测末端脱氧核苷酸转移酶活性的方法 |
| CN112980923A (zh) * | 2019-12-17 | 2021-06-18 | 华为技术有限公司 | 酶活性的检测方法、检测装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Randomly arrayed G-quadruplexes for label-free and real-time assay of enzyme activity;Zhuoliang Liu等;《Chem. Commun》;第6875页右栏-第6877页、Scheme 1、Fig.2-3 * |
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