CN114350775B - 一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法：(1)将与固载在芯片上的引物互补的模板杂交到芯片上；所述模板在引物的3’端延伸出n nt；(2)芯片进行荧光发生测序，使每条引物上只延伸一个碱基，得到平均荧光增值int1；(3)解旋；用末端转移酶和ddNTP对引物进行封端；(4)上述封端反应处理后的芯片，再次与模板杂交，进行荧光发生测序，加入的底物中含有A、C、G、T四种碱基，得到平均荧光增值int2；(5)计算得到封堵效率。本发明采用在芯片表面进行荧光发生测序的方法，达到了在芯片表面原位检测固相引物封堵效率的目的。本发明的方法可以推广应用于各种固相表面的引物封堵效率测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，属于基因测序技术领域。
背景技术
芯片固相引物封堵是在芯片上进行扩增时的常用步骤，以Illumina公司桥式扩增为代表的各种扩增技术都会使用该反应，以将固相表面的杂DNA序列的3’端进行封堵，而未被封堵的杂序列会对下游的测序反应造成严重影响，因此，封堵反应是扩增环节中极为重要的一步。目前，封堵效率的验证基本都是通过单独在液相中检测酶活或结合下游的测序质量进行。现有技术中并没有对芯片表面固相引物封堵效率进行直接检测的技术。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，用以解决各种固相扩增过程中引物封堵效率无法在芯片上直接检测的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，包括以下步骤：
(1)将与固载在芯片上的引物互补的模板杂交到芯片上；所述模板在引物的3’端延伸出n nt，以供引物延伸，所述n为大于等于2的整数(优选范围为10～20)；
进一步的，所述引物的长度为20～45nt；
(2)芯片表面进行荧光发生测序反应，使每条引物上只延伸一个碱基，得到平均荧光增值int1，即每条引物上延伸一个碱基时的单位信号；
进一步的，使每条引物上只延伸一个碱基的具体方式为：测序反应时，加入的底物中仅含一种碱基，且该碱基为引物所延伸的第一个碱基；
(3)解旋；用末端转移酶TdT和ddNTP对引物进行封端；引物被成功封端后，其3’端将延伸出一个与模板互补配对的双脱氧核糖核苷酸，因此无法继续在后续的测序反应过程中发生延伸并得到测序信号；
所述封端所用试剂的主要成分为末端转移酶TdT，在适宜的反应条件下它可以将dNTP和ddNTP底物转移到单链或双链DNA的末端；在封端过程中，加入末端转移酶和ddNTP底物等反应试剂，末端转移酶将ddNTP转移到扩增产物和未扩增引物的3’末端，将3’末端进行封堵，从而避免了可能的错误杂交造成的杂序列反应；
(4)上述封端反应处理后的芯片，再次与所述模板杂交，进行荧光发生测序，加入的底物中含有A、C、G、T四种碱基，这样未被封端的引物会将剩余的n-1个碱基全部延伸完，得到平均荧光增值int2；
(5)封堵效率由以下公式计算得到：
进一步的，所述芯片表面固载有微球，微球上连接有引物；再进一步的，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述芯片上有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到芯片上；再进一步的，所述微球的直径为0.3～5微米，优选0.5～4微米，更优选1～2微米。
本发明的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，采用在芯片表面进行荧光发生测序的方法，达到了在芯片表面原位检测固相引物封堵效率的目的。相比于在液相中检测封端液酶活等其他方式，本发明更为直接，直接检测芯片表面上固相引物的封堵效率，而非间接地检测酶活或测序效果；同时本发明的方法可以通过改变模板长度将反应信号放大或缩小，以更好地调整所述方法的检测范围。并且，本发明的方法还可以推广应用于各种固相表面(如玻璃皿或微球表面)的引物封堵效率测定。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：本发明的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法的原理示意图。
图2：实施例3中同一位置的荧光结果图(封端反应前)。
图3：实施例3中同一位置的荧光结果图(封端反应后)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
本发明所述的芯片包括但不限于基因测序芯片。基因测序芯片指的是一般的具有流体出入口，具备反应室的芯片。常见的，申请人之前的发明专利申请中曾多次公开类似的基因测序芯片，例如CN201710574174.2、CN201710630287.X，必要的时候，上述专利申请的内容可以以引用的方式加入本发明。
本发明所述的荧光发生测序指的是，利用荧光发生核苷酸聚合酶反应，检测荧光发生荧光团的荧光改变(光强和光谱)，便可以得到聚合酶发生反应的信息。荧光发生核苷酸聚合酶反应使用荧光发生核苷酸，核酸聚合酶(DNA聚合酶)，磷酸酶，与核酸模板一起。首先DNA聚合酶将荧光发生核苷酸聚合进入核酸模板中，释放出磷酸化的荧光发生荧光团，再进一步被磷酸酶水解去除磷酸，释放荧光状态改变的荧光发生荧光团。
本发明所述的固相引物是本领域的常规描述，指的是结合于固相载体表面的引物，与液相游离引物相区分，所述固相载体包括芯片表面或微球等载体。
本发明方法所用的模板核酸在引物的3’端延伸出n nt，指的是当所述引物与模板杂交时，模板核酸中有n个核苷酸分子未与所述引物发生碱基互补配对，之后最多可以延伸n个核苷酸分子，nt即nucleotide。
本发明中，“封端”或“封堵”是固相扩增中的常见步骤，常见的封端是指利用末端转移酶(TdT)等工具酶将带有不可延伸的3’基团的核苷转移到固相核酸(例如，未延伸的扩增寡核苷酸)3’端的步骤，此末端不可继续反应，从而降低副反应的发生。末端转移酶(TdT)是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。
实施例1芯片表面固相引物封堵效率的检测
步骤如下：
(1)准备需要测试封堵反应效率的芯片。本实施例使用的是赛纳生物提供的芯片，其芯片上有数百万的微阱，微阱内部固载有修饰了引物的微球。该芯片上可以进行文库扩增和荧光发生高通量测序反应。所述引物的序列如下所示：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’。
(2)模板杂交：将测序模板用5x SSC缓冲液稀释至2μM，然后加入到芯片中。将芯片置于测序仪上进行模板杂交，杂交流程为：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。杂交流程结束后，取出芯片，用荧光发生测序缓冲液冲洗芯片。
所述模板的序列如下所示：
5’-TACGTCCGTCCTCAGATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTC-3’。
(3)封端反应前测序反应液的配制：由上述引物、模板的序列可知，引物延伸的第一个碱基为C碱基，因此，配制仅含C碱基的荧光发生测序反应液：荧光基团修饰的dC碱基(初始浓度5.47mM，终浓度23μM)12.6μL，荧光发生测序酶混合液161μL，荧光发生测序缓冲液2826.4μL，总体积3000μL。
(4)封端反应前的测序反应：将清洗后的芯片放置在赛纳生物的BOOTES测序仪上，然后将配制好的测序反应液放置在测序仪对应位置处。选择测序仪的测序脚本并运行，测序仪会进入相应试剂进行一次延伸反应并记录荧光值int1。
(5)解旋：测序反应结束后，取下芯片，用1mL荧光发生测序缓冲液冲洗芯片，加入1mL甲酰胺室温反应3min解旋后，再次用1mL荧光发生测序缓冲液清洗芯片。
(6)封端反应：将封端反应液加入芯片内。然后将芯片置于测序仪上进行反应，37℃反应60min。反应结束后，取出芯片，用荧光发生测序缓冲液冲洗芯片。
所述封端反应液的组分为：TdT酶4μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水308μL，总体积400μL。
(7)模板杂交：将测序模板用5x SSC缓冲液稀释至2μM，然后加入到芯片中。将芯片置于平板PCR仪或测序仪上进行模板杂交，杂交流程为：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。杂交流程结束后，取出芯片，用荧光发生测序缓冲液冲洗芯片。
(8)封端反应后测序反应液的配制，组分为：荧光基团修饰的dA碱基(初始浓度5.5mM，终浓度24.5μM)13.4μL，荧光基团修饰的dT碱基(初始浓度4.41mM，终浓度27μM)18.4μL，荧光基团修饰的dC碱基(初始浓度5.47mM，终浓度23μM)12.6μL，荧光基团修饰的dG碱基(初始浓度4.37mM，终浓度为26μM)17.8μL，荧光发生测序酶混合液161μL，荧光发生测序缓冲液2776.8μL，总体积3000μL。
(9)封端反应后的测序反应：将清洗后的芯片放置在赛纳生物的BOOTES测序仪上，然后将配制好的测序反应液放置在测序仪对应位置处。选择测序仪的测序脚本并运行，测序仪会进入相应试剂进行延伸反应并记录荧光值int2。
(10)按照下述公式计算封堵效率，其中n为固相引物3’端总共可延伸的碱基数目(n＝15)。
结果：封堵效率为98.7％。
实施例2芯片表面固相引物封堵效率的检测
封端反应液的组分为：TdT酶2.2μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水309.8μL，总体积400μL。其他同实施例1。
结果：封堵效率为92.3％。
实施例3芯片表面固相引物封堵效率的检测
封端反应液的组分为：TdT酶20μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，甘油160μL，水132μL，总体积400μL。其他同实施例1。
结果：封堵效率为99.4％。
同一位置的荧光结果图如图2、图3所示，其中荧光强度已经调整到同一对比度。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施及使用所主张的实施方案，而不是用于限制本发明公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (6)
1.一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将与固载在芯片上的引物互补的模板杂交到芯片上；所述模板在引物的3’端延伸出n nt，以供引物延伸；所述引物的长度为20～45nt，所述n的取值范围为10～20的整数；
(2)芯片表面进行荧光发生测序反应，使每条引物上只延伸一个碱基，得到平均荧光增值int1；
(3)解旋；用末端转移酶TdT和ddNTP对引物进行封端；
(4)上述封端反应处理后的芯片，再次与所述模板杂交，进行荧光发生测序，加入的底物中含有A、C、G、T四种碱基，得到平均荧光增值int2；
(5)封堵效率由以下公式计算得到：
2.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述使每条引物上只延伸一个碱基的具体方式为：测序反应时，加入的底物中仅含一种碱基，且该碱基为所述引物所延伸的第一个碱基。
3.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述封端所用试剂的组分为：TdT酶4μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水308μL，总体积400μL；
或：TdT酶2.2μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水309.8μL，总体积400μL；
或：TdT酶20μL，10x缓冲液40μL，CoCl2 40μL，ddNTP(10mM)8μL，甘油160μL，水132μL，总体积400μL。
4.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：封端反应后进行荧光发生测序反应时，加入的测序反应液由以下组分组成：荧光基团修饰的dA碱基，荧光基团修饰的dT碱基，荧光基团修饰的dC碱基，荧光基团修饰的dG碱基，荧光发生测序酶混合液和荧光发生测序缓冲液。
5.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述芯片表面固载有微球，所述微球上连接有引物。
6.根据权利要求5所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述芯片上有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到芯片上。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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