CN102643893A

CN102643893A - 基于引物阵列芯片的dna测序方法

Info

Publication number: CN102643893A
Application number: CN2011100389919A
Authority: CN
Inventors: 陈国燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-02-16
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2012-08-22

Abstract

本发明涉及一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法，其特征在于把一组序列已知的引物固定在芯片上，然后把4张相同的芯片，分别放入4个分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸的反应体系中，与待测DNA进行退火杂交，使引物延伸1个核苷酸，检测芯片的荧光信号得到一组由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列。

Description

基于引物阵列芯片的DNA测序方法

技术领域

本发明属于DNA测序技术领域，特别是一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法。

技术背景

目前DNA测序技术的研究主要集中在高通量大规模的测序技术方面，迄今为止已经发展了第二代测序技术的合成测序和第三代的单分子测序技术。但是，以Sanger末端终止测序法为代表的第一代测序技术，仍然在常规的生物学研究中有着重要的应用。

1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。但是Sanger法需要毛细管电泳分析，仪器和试剂昂贵，测序耗时长，复杂结构DNA的测序容易出套峰或无信号。为解决这些问题，20世纪九十年代发展了基于探针阵列的杂交测序技术(SBH)，然而SBH技术由错误率高和稳定性低在应用上还受到很大的限制，目前SBH技术主要用于突变的检测中。

为了克服Sanger法测序和SBH的缺点，本发明提出一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法，该方法能够实现操作简便、低成本、快速、和准确地测序，可以在普通实验室的小规模快速测序中发挥重要作用。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于提供一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法，能够克服传统探针阵列芯片杂交测序方法使用探针数量巨大、成本高、假阳性率高的缺点，能够实现操作简便、低成本、快速、和准确地测定长片段单链或双链DNA序列，而不需要进行复杂的制备单链DNA模板过程，对于双链DNA的测序是双向进行的，大大增加了可靠性，不需要特殊的仪器设备，所涉及的试剂均是分子生物学常规的试剂。

技术方案：本发明涉及一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法，其特征在于把一组序列已知的引物固定在芯片上，然后把4张相同的芯片，分别放入4个分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸的反应体系中，与待测DNA进行退火杂交，使引物延伸1个核苷酸，检测芯片的荧光信号得到一组由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列，包括如下步骤：

步骤1)将一组序列已知的引物的5’端固定在基片上预设的位置排列成引物阵列芯片；

步骤2)把4张相同的芯片，分别放入4个分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸ddATP，ddCTP，ddGTP和ddUTP的反应体系中，体系中还含有PCR缓冲液、DNA聚合酶和待测的双链DNA或单链DNA；

步骤3)反应体系在PCR仪、芯片杂交仪或者其它可以改变和控制温度的仪器上，进行模板DNA变性温度、引物与模板DNA结合温度、引物延伸温度的温度变化过程，循环1～10次，使部分与待测DNA能杂交的引物延伸1个荧光标记核苷酸并终止延伸；

步骤4)把芯片从反应体系中取出来，冲洗后，检测芯片的各基点的荧光信号，得到一组不同的由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列。

上述方案中，所述的引物3’末端为5～6个碱基组成的序列，其序列是四种碱基A，T，C，G的全部排列序列的其中一种；引物中间为3～10个碱基组成的兼并序列，这些碱基为四种碱基A，T，C，G的混合物；5’端为10～30个任意碱基组成的序列。

上述方案中，所述的3’末端为反向互补序列的引物，它们被固定在基片上相邻的位置，所述的反向互补序列是指按照A-T、C-G的碱基互补配对原则，两条核苷酸序列分别从5’端至3’端、3’端至5’端的碱基顺序互补。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明的测序方法准确性高，主要体现在A.在传统的探针阵列芯片杂交测序方法中，荧光标记是结合在待测DNA上的，冲洗芯片时，很容易被误洗脱或者残留，造成假阴性或假阳性，所以冲洗芯片的条件要非常严格，很难掌握，而在本发明的测序方法中，荧光标记是结合在双脱氧核苷酸上的，荧光标记双脱氧核苷酸在引物上延伸后，以磷酸二酯键与引物牢固结合，引物是固定在芯片上的，所以荧光标记很难被洗脱，避免了冲洗造成的假阴性或假阳性。B.在传统的探针阵列芯片杂交测序方法中，容易发生碱基错配得到错误的信号，而在本发明的测序方法中，除了引物3’末端与待测DNA的杂交，还加上引物延伸1个核苷酸，延伸通常是很准确的，因此大大提高了准确性。C.在本发明的测序方法中，采用4块芯片同时进行测序，不同芯片相同位点的荧光信号可以互相印证，大大提高了准确性。

2、本发明的测序方法成本低。传统的探针阵列芯片杂交测序方法，通常需要8～12聚体核苷酸的探针阵列，需要合成65536～16777216种探针，而本发明的测序方法引物3’末端为5～6聚体核苷酸的引物阵列，只需要合成1024～4096种引物，大大降低了芯片的制作成本。

3、本发明的测序方法不需要复杂仪器，主要体现在A.在本发明的测序方法中，使用的荧光标记可以是单色的，而且芯片是低密度的，因此可以使用芯片扫描仪、紫外检测仪、荧光显微镜等多种仪器检测荧光，便于在普通的实验室推广使用。B.在本发明的测序方法中，由于引物的数目比较少，所以芯片的面积可以做得比较小，可以放入PCR反应管中在普通的PCR仪上进行反应，而不必使用芯片杂交仪，实现低成本高通量的测序。

4、本发明的测序方法操作简单，可以同时进行双链DNA的双向测序，不必经过麻烦的单链DNA制备过程。传统的探针阵列芯片杂交测序方法，需要先制备单链DNA，而本发明的测序方法由于每条引物都会有它的反向互补序列引物，引物延伸是从5’端往3’端方向的，所以通过对短序列的拼接和分析，可以判断每条短序列在双链DNA的哪一条链上，可以同时进行双链DNA的双向测序。

附图说明

图1是本发明基于引物阵列芯片的DNA测序方法的示意图

其中：1为基片；2为引物；3为待测DNA；4为延伸的荧光标记核苷酸

具体实施方式

实施例一

如图1，将一组序列已知的引物的5’端固定在基片上预设的位置排列成引物阵列芯片，引物的3’末端为5个碱基共4⁵＝1024种所有排列的序列，其中3’末端序列为反向互补的引物，它们被固定在基片上相邻的位置，引物的中间为5个碱基的兼并序列，其碱基为四种碱基A，T，C，G的混合物，引物的5’端为10个碱基A，芯片的面积小于3mm×5mm，可以放入200ul的PCR反应管中。

把4张相同的芯片，分别放入4个分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸(ddATP，ddCTP，ddGTP和ddUTP)的200ul的PCR反应管中，反应管中还含有PCR缓冲液、DNA聚合酶和待测双链DNA，待测双链DNA的制备是通过常规PCR扩增获得的产物经过无水乙醇沉淀、75％乙醇洗涤、干燥、纯水溶解得到的。

把4个反应管都放入PCR仪，进行94℃变性30秒钟，36℃退火2分钟，72℃延伸10秒钟，循环10次，使部分与待测DNA能杂交的引物延伸1个荧光标记核苷酸并终止延伸。

把芯片从反应管中取出来，用去离子纯水冲洗后，用芯片扫描仪检测芯片的各基点的荧光信号，得到一组不同的由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，通过对短序列的拼接和分析，判断每条短序列在双链DNA的哪一条链上，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列。

实施例二

将一组序列已知的引物的5’端固定在基片上预设的位置排列成引物阵列芯片，引物的3’末端为6个碱基共46＝4096种所有排列的序列，其中3’末端序列为反向互补的引物，它们被固定在基片上相邻的位置，引物的中间为5个碱基的兼并序列，其碱基为四种碱基A，T，C，G的混合物，引物的5’端为10个碱基A。

把4张相同的芯片，分别加一滴分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸(ddATP，ddCTP，ddGTP和ddUT)、PCR缓冲液、DNA聚合酶和待测单链DNA的反应液到芯片的表面上，待测单链DNA的制备是通过不对称PCR扩增获得的产物经过无水乙醇沉淀、75％乙醇洗涤、干燥、纯水溶解得到的。

把上述4张芯片都放入芯片杂交仪，进行94℃变性30秒钟，36℃退火2分钟，72℃延伸10秒钟，循环10次，使部分与待测DNA能杂交的引物延伸1个荧光标记核苷酸并终止延伸。

把芯片从芯片杂交仪中取出来，用去离子纯水冲洗后，用芯片扫描仪检测芯片的各基点的荧光信号，得到一组不同的由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，通过对短序列的拼接和分析，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列。

Claims

1.一种基于引物阵列芯片的DNA测序方法，其特征在于把一组序列已知的引物固定在芯片上，然后把4张相同的芯片，分别放入4个分别含有荧光标记的四种不同双脱氧核苷酸的反应体系中，与待测DNA进行退火杂交，使引物延伸1个核苷酸，检测芯片的荧光信号得到一组由引物末端序列和延伸核苷酸组成的短序列，将彼此重叠的短序列拼接成待测DNA的完整序列，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的DNA测序方法，其特征在于所述的引物3’末端为5～6个碱基组成的序列，其序列是四种碱基A，T，C，G的全部排列序列的其中一种；引物中间为3～10个碱基组成的兼并序列，这些碱基为四种碱基A，T，C，G的混合物；5’端为10～40个任意碱基组成的序列。

3.根据权利要求1所述的DNA测序方法，其中3’末端为反向互补序列的引物，它们被固定在基片上相邻的位置，所述的反向互补序列是指按照A-T、C-G的碱基互补配对原则，两条核苷酸序列分别从5’端至3’端、3’端至5’端的碱基顺序互补。