CN104772169B - 一种测序用微流控芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程设备制造技术和相关器件领域，具体涉及一种测序用微流控芯片的制备方法。步骤1：取一单面抛光的基片；步骤2：以N,N‑二甲基甲酰胺水浴，水冲洗；吹片烘干；步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形；步骤4：使用干法刻蚀，形成反应池；步骤5：以N,N‑二甲基甲酰胺水浴，以硫酸双氧水混合溶液浸泡，水冲洗；步骤6：完成芯片的制备。本发明避免了杂质或者污物对测序反应的干扰，保证了测序的准确度和效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程设备制造技术和相关器件领域，具体涉及一种测序用微流控芯片的制备方法。
背景技术
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。
Sanger测序法方便简单，可靠性高，测序片段长，也成为人类基因组测序所采用的测序技术，但是Sanger测序法无法进一步的微量化，测序通量也受到限制。随着相关生物技术的发展与深入研究，DNA测序技术也得到了不断的创新与改良，在保证测序精度的前提下，操作程序已经逐步优化，速度逐渐提高，成本也呈下降趋势。454测序技术是将单链DNA文库固定于专门设计的DNA捕获磁珠上，不同的磁珠上固定有不同的单链DNA模版，随后经过乳液PCR扩增，形成单分子多拷贝的分子簇。将磁珠从乳液体系里面释放出来以后放入由PTP板构成的芯片上，PTP板上有只能容纳单个磁珠的微井，在微井中进行后续的测序反应。利用焦磷酸测序基本原理，对每个微井中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列的测定。该技术平台的缺点在于反应液和洗涤液进入PTP的微井阵列为“漫过式”反应，因此限制了测序速度。SOLID测序主要以四色标记的寡核苷酸的连续的合成为基础，这样可以对单拷贝DNA模版进行大规模的扩增和高通量的并行测序。SOLID测序样品制备方案与其他技术类似，首先进行物理破碎DNA，然后连接通用接头，然后在乳液体系里进行大量的扩增，使大量的单分子多拷贝的DNA分子簇集中于微小的磁珠上，将经过扩增的富含测序文库的磁性微球固定于玻片的表面进行测序生化反应。该反应同样为“漫过式”反应，速度较慢，而且磁珠背景荧光较高，对测序仪器灵敏度要求高。现有的微流控基因芯片仍存在测序通量小、精确度低的缺点，需要制备出一种新型的基因芯片以满足实际应用的需求。
发明内容
本发明的一个目的为一种测序用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取单面抛光的基片；
步骤2：以N,N-二甲基甲酰胺水浴，然后用水冲洗，吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形；
步骤4：刻蚀芯片，形成反应池；
步骤5：以N,N-二甲基甲酰胺水浴，以硫酸双氧水混合液浸泡，用水冲洗；
步骤6：完成芯片的制备。
所述芯片上有反应池69-71万个。
所述反应池直径为28-30μm。
所述芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm。
所述芯片的有效面积为27.6x27.6mm2。
所述芯片的材料为光纤。
所述步骤2和步骤5中，水浴时间为20-30min，温度为80℃以上，用水冲洗的时间为1min以上。
所述步骤5中，以硫酸双氧水混合液浸泡时间为30min-60min，硫酸双氧水混合液中H2SO4和H2O2的体积比为3:1。
所述刻蚀芯片采用等离子体刻蚀法。
制得芯片后，在芯片表面均匀喷涂碳化硼涂料。
本发明提供的微流控芯片检测精度高，测序速度快、通量大。芯片的有效面积大，反应池密度大，能够一次性检测69-71万个基因样品。使用了光纤面板，对信号的探测简单、灵敏度高。N,N-二甲基甲酰胺的水浴能够充分溶解和去除附着于芯片基片上的杂质和污物，保证后续步骤进行的准确无误。微流控芯片对制备工艺要求较高，对清洗过程的要求尤其苛刻。本发明的清洗过程避免了杂质或者污物对测序反应的干扰，保证了测序的准确度和效率。
具体实施方式
实施例1
测序用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取一单面抛光的基片，所述芯片的芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm，材料为光纤；
步骤2：以N,N-二甲基甲酰胺水浴20min，温度为90℃，然后用水冲洗1min；吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形，芯片的有效面积为27.6x27.6mm2；
步骤4：采用等离子体刻蚀法刻蚀芯片，形成反应池70-71万个，反应池直径为28μm；
步骤5：以N,N-二甲基甲酰胺水浴30min，以硫酸双氧水混合液浸泡30min，H2SO4和H2O2的体积比为3:1，水冲洗1.5min；
步骤6：完成芯片的制备。在芯片表面均匀喷涂碳化硼涂料。
实施例2
测序用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取一单面抛光的基片，所述芯片的芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm，材料为光纤；
步骤2：以N,N-二甲基甲酰胺水浴30min，温度为85℃，然后用水冲洗2min；吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形，芯片的有效面积为27.6x27.6mm2；
步骤4：刻蚀芯片，形成反应池70-71万个，反应池直径为29μm；
步骤5：以N,N-二甲基甲酰胺水浴20min，以硫酸双氧水混合液浸泡60min，H2SO4和H2O2的体积比为2:1，水冲洗1min；
步骤6：完成芯片的制备。
实施例3
测序用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取一单面抛光的基片，所述芯片的芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm，材料为光纤；
步骤2：以N,N-二甲基甲酰胺水浴25min，温度为100℃，然后用水冲洗4min；吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形，芯片的有效面积为27.6x27.6mm2；
步骤4：采用等离子体刻蚀法刻蚀芯片，形成反应池69-70万个，反应池直径为30μm；
步骤5：以N,N-二甲基甲酰胺水浴20min，以硫酸双氧水混合液浸泡40min，H2SO4和H2O2的体积比为3:1，水冲洗3min；
步骤6：完成芯片的制备。
实施例4
测序用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取一单面抛光的基片，所述芯片的芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm，材料为光纤；
步骤2：以体积比为4:1的N,N-二甲基甲酰胺和异丙醇混合液水浴28min，温度为95℃，然后用水冲洗3min；吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形，芯片的有效面积为27.6x27.6mm2；
步骤4：采用等离子体刻蚀法刻蚀芯片，形成反应池69-70万个，反应池直径为30μm；
步骤5：以N,N-二甲基甲酰胺水浴22min，以硫酸双氧水混合液浸泡50min，H2SO4和H2O2的体积比为1:1，水冲洗5min；
步骤6：完成芯片的制备。在芯片表面均匀喷涂碳化硼涂料。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种测序用微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取单面抛光的光纤基片；
步骤2：在温度为80℃以上的条件下，以N,N-二甲基甲酰胺水浴20-30min，然后用水冲洗1min以上，吹片烘干；
步骤3：在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形；
步骤4：采用等离子刻蚀法刻蚀芯片，形成反应池；
步骤5：在温度为80℃以上的条件下，以N,N-二甲基甲酰胺水浴20-30min，以H2SO4和H2O2体积比为3:1的混合溶液浸泡30-60min，用水冲洗1min以上；
步骤6：完成芯片的制备。
2.如权利要求1所述的测序用微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片上有反应池69-71万个。
3.如权利要求1所述的测序用微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述反应池直径为28-30μm。
4.如权利要求1所述的测序用微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片长为49mm，宽为48mm，厚度为2mm。
5.如权利要求1所述的测序用微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片的有效面积为27.6x27.6mm2。
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