CN106170559A - 经由dna甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法以及其系统和试剂盒 - Google Patents

经由dna甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法以及其系统和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106170559A
CN106170559A CN201480071229.2A CN201480071229A CN106170559A CN 106170559 A CN106170559 A CN 106170559A CN 201480071229 A CN201480071229 A CN 201480071229A CN 106170559 A CN106170559 A CN 106170559A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
probe
residues
capture
cytosine residues
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480071229.2A
Other languages
English (en)
Inventor
D.布格斯
J.诺顿
T.里奇蒙德
J.温德特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN106170559A publication Critical patent/CN106170559A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本发明包括通过评价DNA甲基化状态，用于评价基因组功能的表观遗传调节的系统、试剂盒和方法。本发明包括转换随后捕获方法，其中未甲基化的胞嘧啶残基首先转换为尿嘧啶残基，并且随后捕获靶DNA用于后续分析。该方法使用新型捕获探针库用于溶液相捕获。

Description

经由DNA甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法 以及其系统和试剂盒
发明领域
本公开内容一般涉及表观遗传学，并且更具体地涉及经由评价DNA甲基化状态来评价基因组功能的表观遗传调节的系统、试剂盒和方法。
发明背景
表观遗传学是表观基因组的研究，其包括发生而不改变基础核苷酸序列的DNA和染色质的功能相关的化学修饰。表观基因组的两个主要组分是DNA甲基化和组蛋白修饰。
表观遗传修饰调节DNA中的基因表达，并且可以通过调节涉及治疗试剂的代谢和区室化的基因表达来影响在个体中的医学治疗的功效，以及可以改变治疗试剂的靶的表达。异常表观遗传变化与许多疾病例如癌症、心血管疾病和神经系统疾病相关。
DNA甲基化是首个发现的表观遗传标记且是研究最多的。在哺乳动物中，它主要涉及甲基（-CH3）对CpG二核苷酸的胞嘧啶残基的碳-5位置的酶促添加，并且阻遏与之结合的转录因子。像这样，DNA的高度甲基化区域趋于是更少转录活性的。
DNA甲基化影响动物中的剂量补偿、印记、基因组稳定性和发育（例如干细胞分化和胚胎发育）。另外，它已与转座子元件沉默和宿主病原体相互作用联系。DNA甲基化对于植物中的基因组完整性同样是重要的。
用于评价DNA甲基化状态（即甲基化组）的目前方法集中于单独基因座，使用方法例如甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）或基质辅助激光解吸/电离时间飞行质谱（MALDI-TOF-MS），或在全基因组规模上使用微阵列、简化的表观亚硫酸氢盐测序（RRBS）或全基因组鸟枪亚硫酸氢盐测序（WGBS）。WGBS是特别有吸引力的，因为它以单碱基对分辨率测量DNA甲基化状态，并且允许评价在基因组中的每个可甲基化位置处的甲基化百分比。然而，当通常仅每个基因组的小部分是感兴趣的时，对于多个个体的整个基因组生成此类数据仍是昂贵的。
评价甲基化的基于DNA测序的方法采用化学处理（例如亚硫酸氢盐（BS））来区分甲基化的胞嘧啶残基与未甲基化的胞嘧啶残基。简言之，BS将DNA中的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基，其在后续扩增或测序反应期间替换为胸腺嘧啶残基。然而，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）残基对转换抗性，并且因此作为胞嘧啶残基保存。像这样，BS转换在DNA中引入特异性变化，取决于各个胞嘧啶残基的甲基化状态，所述特异性变化获得关于DNA序列的甲基化状态的单核苷酸分辨率信息。
不幸的是，BS转换需要大DNA样品（例如>10 µg），因为苛刻条件可降解约90%的样品。另外，它使基因组的尺寸在扩增后有效倍增，因为编码（或有义）和非编码（或反义）链的扩增产物不再是互补的。此外，当仅一些可甲基化胞嘧啶残基实际上是甲基化的时，可发生部分转换，因此使传统探针和测定法设计复杂且混淆后续分析。通过BS转换引入的复杂性已阻碍靶向DNA富集方法的发展，所述靶向DNA富集方法将促进DNA甲基化的研究。
出于前述原因，存在用于经由DNA甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的另外系统、试剂盒和方法的需要。
发明概述
本发明包括经由靶向富集测序评价DNA甲基化状态的“转换随后捕获（convert-then-capture）”方法。有利地，转换随后捕获方法允许使用少量DNA，而不妥协高分子复杂性，同时达到高重现性、减少每个样品所需的成本和时间，并且导致改善的测序覆盖深度。转换随后捕获方法还允许通过全基因组测序（WGS）的评价。
该方法可通过从靶生物获得DNA样品来开始。一旦获得DNA样品，该方法可以包括由样品制备DNA文库。随后，该方法可包括用转换试剂例如亚硫酸氢盐（HSO3 −），将制备的DNA文库中的未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基。然而，5-mC残基不被转换为尿嘧啶残基。可选地或另外，该方法可包括用转换试剂例如高钌酸钾（KRuO4），将制备的DNA文库中的5-hmC残基转换为5-甲酰基胞嘧啶（5-fC）残基。5-fC残基是中间产物，其随后可由亚硫酸氢盐转换为尿嘧啶残基。再次，5-mC残基不被转换为尿嘧啶残基。
在转换胞嘧啶和5-hmC残基且扩增（例如通过PCR）后，该方法包括用如本文描述的基于溶液的捕获探针库从转换的DNA文库中捕获目的片段。在捕获后，该方法可包括扩增且纯化捕获的核酸片段，随后为测序。此外，该方法可包括分析序列以获得关于DNA甲基化状态的信息，并且可以进一步包括比较所捕获的核酸片段的序列和甲基化状态与参考基因组的序列和甲基化状态。
在一个实施方案中，本发明是用于捕获目的核酸序列的溶液相捕获探针库，该探针库包括三类捕获探针：第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；并且第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基和胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针。在该实施方案的变化中，捕获探针是长度约50 bp至约150 bp，例如长度约75 bp。探针可以具有约50% G+C。进一步地，在探针库内，三类捕获探针各自为探针库的约33%。
在另一个实施方案中，本发明是评价目的核酸序列的DNA甲基化状态的方法，该方法包括下述步骤：用捕获探针库溶液中捕获目的核酸序列的转换且扩增的核酸片段，所述捕获探针库包括三类捕获探针，其中：第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；并且第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基和胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；扩增所捕获的核酸片段，以获得所扩增的捕获的核酸片段群体；测序所扩增的捕获的核酸片段，以获得所捕获的核酸片段的核苷酸序列；且分析所捕获的核酸片段的核苷酸序列，以获得关于DNA甲基化状态的信息。在该实施方案的变化中，该方法进一步包括获得基因组DNA样品且由基因组DNA样品制备DNA文库的起始步骤。在该实施方案中，所转换的核酸片段通过用转换试剂例如载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1、亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氨酶、亚硝酸和高钌酸钾，将DNA文库中的未甲基化的胞嘧啶残基和/或5-羟甲基胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基来获得。在其他变化中，该方法进一步包括下述步骤：将所捕获的核酸片段的核苷酸序列和甲基化状态与参考基因组的核苷酸序列和甲基化状态比较。
在还另外的实施方案中，本发明是用于评价DNA甲基化状态的系统，该系统包括：具有三类捕获探针的溶液相捕获探针库试剂盒，第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；并且第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基和胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；以及选自下述的至少一种另外的试剂盒：DNA取样试剂盒、DNA文库制备试剂盒、DNA转换试剂盒、DNA扩增试剂盒、DNA测序试剂盒以及生物信息学设计和分析软件。DNA转换试剂盒可以包含选自下述的转换试剂：载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1、亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氢酶、亚硝酸和高钌酸钾。
附图简述
图1显示了比较“转换随后捕获”工作流与替代“捕获随后转换”工作流的示意图，指出三个分子瓶颈步骤（三角形）的系列定位，所述三个分子瓶颈步骤导致在关于后者的序列数据中增加的复制率和大量输入样品DNA的需要。
图2是显示通过亚硫酸氢盐（BS）转换生成的增加的靶序列复杂性的图解，当使用转换随后捕获概念（TCGCAGCGCGA，SEQ.ID. NO: 3）时，所述靶序列复杂性对于探针设计和制造是成问题的。
图3是显示使用“摇摆”核苷酸来改善制造效率且允许捕获比以其他方式可行的更大和更复杂的靶的优点的图解。
图4显示了该方法对三种人细胞系的表现。
图5显示了比较不同量的输入DNA的实验。
图6显示了得自来自相同来源的分开样品的数据，以评价重现性。
图7显示了体外甲基化样品的分析。
发明详述
概述
提供了用于评价（即捕获、测序和分析）关于DNA甲基化状态的信息的示例性系统、试剂盒和方法，并且是基于转换随后捕获概念。该概念与目前方法形成对比，所述目前方法在很大程度上基于首先捕获目的核酸序列，并且随后将目的核酸序列中的未甲基化胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基。虽然已知方法仅需要在捕获期间的简单探针组，但不幸的是，它们需要大量DNA样品，并且仅提供关于就DNA单链而言的DNA甲基化状态的信息。当例如未甲基化的胞嘧啶残基并未完全转换成尿嘧啶残基时，或当胞嘧啶至胸腺嘧啶（C至T）多态性存在于核酸序列中时，这是特别成问题的。在这种情况下，会丧失在另一条链中含有的任何此类信息的利益，并且获得关于DNA甲基化状态的不正确信息。总之，已知方法导致高样品输入（例如>10 µg），并且导致在目的靶向区域上不完全的数据覆盖、低分子复杂性（即高重复读数率）、增加的测序成本和结果的弱重现性。
本文描述的工作因此是显示上文指出的缺点可以通过转换随后捕获概念得到解决的首例。本发明概念经由具有至少三类捕获探针的混合物的溶液相捕获探针库解决了该缺点。靶向甲基化的DNA的一种探针（或多种探针）、靶向未甲基化的DNA的一种探针（或多种探针）、和由于C或T的随机掺入识别两者的一种“摇摆”探针（或多种探针）。此外，每类探针可以包括探针的混合物，所述探针与目的核酸序列的一条或另一条链在溶液中结合/杂交，从而改善测序深度和可靠性。考虑到独特的溶液相捕获探针库，本发明的方法需要低样品输入（例如约1 µg或更少），提供可用于评价DNA甲基化状态的高分子复杂性（即低重复读数率），高样品流通量和高重现性。
系统、试剂盒和方法可用于各种应用例如诊断和研究中。就诊断应用而言，本领域技术人员可以通过经由异常DNA甲基化评价是否存在表观遗传变化，来测定用于受试者的适当医学治疗，所述异常DNA甲基化调节涉及治疗剂的代谢和区室化的基因表达，或甚至调节治疗试剂的靶表达。以相似方式，本领域技术人员可以监控疗法对DNA甲基化模式的作用，以确定治疗功效，预测副作用或检测药物抗性的出现。同样地，本领域技术人员可以经由异常DNA甲基化，来评价受试者是否具有与表观遗传变化连锁的疾病或病症，例如癌症、心血管疾病和神经系统疾病。可选地，本领域技术人员可以鉴定与人或其他生物中的正常表型性状相关或者预测人或其他生物（包括例如农业上重要的动物和植物）中的正常表型性状的甲基化模式。此外，本领域技术人员可以检测由环境因素（例如通过改变基因表达模式引起有害效应的毒素）在生物中引起的甲基化模式中的变化。
就研究应用而言，本领域技术人员可以确定DNA高甲基化或低甲基化对基因表达、染色质结构和稳定性以及表观遗传性状的作用。
就附图而言，本发明包括转换随后捕获概念。图1提供了转换随后捕获工作流与目前实践的捕获随后转换工作流的比较。通过实心三角形指示的工作流步骤是其中发生选择过程的步骤，其减少样品复杂性和因此减少信息含量（“分子瓶颈”）。例如，在MethylSeqLibrary Prep中，由于衔接子连接仅10%-50%有效，所以样品DNA丧失。同样地，在BS转换步骤中，约90%的DNA被严苛的化学过程破坏。此外，在捕获步骤中，并非所有靶向文库片段均被探针捕获。捕获随后转换工作流具有串联的三个分子选择步骤，其是附加的且严重限制通过工作流进行的DNA和信息量。捕获随后转换工作流包括相同的三个步骤，但并非全部串联，使得在前两个选择步骤（MethylSeq Library Prep、BS转换）后的PCR扩增步骤增加存在的文库片段的绝对拷贝数，使得第三个选择步骤（捕获）对样品复杂性具有更少的负面影响，所述样品复杂性已通过来自极小分子群体的取样引起。出于这些原因，转换随后捕获方法在工作流开始时需要少得多的样品DNA输入，并且可以允许更多信息一直流动到结束。
图2显示了在捕获前的BS转换如何增加靶复杂性。显示了假定的十一bp捕获靶，具有在CpG背景下的三个可甲基化的胞嘧啶。小图A显示了对于该11 bp序列的八种可能的甲基化模式（状态）。小图B显示了在BS转换和扩增后，原始DNA的子代链如何不再互补，并且因此潜在靶序列的数目再次倍增至十六。捕获随后转换概念靶向天然DNA，其中DNA的甲基化状态与捕获无关，并且因此仅需要一种（1）探针来靶向该基因座。相比之下，转换随后捕获工作流将需要十六种（16）探针。
图3显示了在寡核苷酸探针制造中的“摇摆”碱基（小图B）降低寡核苷酸数目，所述寡核苷酸必须独立制造，以匹配靶序列的所有可能的部分甲基化模式。在现有方法（小图A）中，匹配部分甲基化模式所需的所有寡核苷酸（探针）分开进行制造。在“摇摆”方法中，C或T的随机掺入生成必要复杂性，同时使用少得多的个别寡核苷酸合成反应。
系统
本发明的系统可以包括溶液相（或溶液中）捕获探针库试剂盒以及下述的至少一种：DNA收集或取样试剂盒；DNA文库制备/扩增试剂盒；DNA转换试剂盒（例如用于化学和/或酶促处理，以给DNA的表观遗传修饰“加上标签”用于后续测量）；扩增/测序试剂盒；以及生物信息学设计和分析软件。
如本文使用的，“试剂盒”意指如本文描述的任何制造（例如包装或容器），其包括至少一种试剂，例如核酸探针或探针库等等，用于特异性扩增、捕获、加上标签/转换或检测DNA。
如本文使用的，“探针”意指能够与特别预期的靶生物分子选择性结合的任何分子，所述靶生物分子例如待由探针结合、捕获或杂交的目的核酸序列。
DNA取样试剂盒可以包括组分例如注射器，手术刀，棉签，收集、制备和/或稳定化缓冲液或稳定材料，和样品容器。用于收集或取样DNA的试剂盒由例如Bode Technology（Lorton，VA）、DNA Genotek Inc.（Ontario，加拿大）、Isohelix，Inc.（Kent，UnitedKingdom）和Norgen Biotek Corp.（Ontario，加拿大）商购可得。
DNA文库制备和扩增试剂盒可以包括组分例如测序衔接子，酶例如裂解酶、末端修复酶混合物或聚合酶、核酸酶，PCR引物，缓冲液，脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，纯化和/或分离柱、珠或基质，以及用于文库制备/扩增的内部对照和质量控制测定。用于制备DNA文库的试剂盒由例如EMD Millipore Corp.（Billerica，Mass.）、Illumina（San Diego，Cal.）、Life Technologies（Grand Island，NY）、Lucigen（Middleton，Wisc.）、New EnglandBioLabs Inc.（Ipswich，Mass.）、Qiagen（Germantown，Md.）、和Roche Molecular Systems（Pleasanton，Cal.）商购可得。
DNA转换试剂盒含有用于获得转换的DNA样品的试剂。如本文使用的，“转换的DNA”意指其中一个或多个未甲基化的胞嘧啶残基已脱氨以变成尿嘧啶残基的DNA分子。“转换的DNA”意指其中一个或多个5-hmC残基已氧化以变成5-fmC残基的DNA分子。例如，5-hmC已显示在BS转换期间表现如同它的前体5-mC。因此，可能需要再访问BS测序数据，以验证检测到的经修饰的碱基是5-mC还是5-hmC残基。这些试剂盒可包括但不限于组分例如转换试剂、裂解缓冲液、旋转柱或其他反应容器、蛋白酶K、其他试剂例如DNA保护缓冲液等等。用于转换胞嘧啶残基的试剂盒由例如Life Technologies，New England BioLabs Inc.，Qiagen和Zymo Research（Irvine，Cal.）商购可得。
DNA转换试剂盒还可以包括用于将5-hmC转换为对用BS的转换敏感的中间形式的组分，以区分5-mC和5-hmC残基。这些试剂盒可以包括但不限于组分例如对照序列（例如5-mC和5-hmC对照），蛋白酶K，核苷酸，酶例如Mspl和HpaII、T4 β-葡糖基转移酶、DNA聚合酶，UDP-葡萄糖，引物，缓冲液，反应容器等等。用于转换5-hmC残基的试剂盒由例如CambridgeEpigenetix（Cambridge，United Kingdom）、Enzo Life Sciences（Farmingdale，NY）、NewEngland BioLabs Inc.和Thermo Scientific（Waltham，Mass.）商购可得。
DNA测序试剂盒可以包括组分例如酶（聚合酶、核酸酶），引物，稀释、反应和洗涤缓冲液，磁珠和核苷酸。用于测序核酸分子的试剂盒由Affymetrix（Santa Clara，Cal.）Fisher Scientific、Life Technologies、Pacific Biosciences和Qiagen商购可得。
系统可以包括生物信息学设计和分析软件。参见例如美国专利申请公开号2006/0014164和2010/0161607。设计软件可以用于计算机芯片设计探针，其以所需特异性与靶向、转换基因组中的目的区域结合/杂交，并且可以包括用于避免重复区且利用“摇摆”碱基以解决扩增后的转换靶序列的序列复杂性的方法。分析软件可以用于例如修剪来自实验的序列读数输出的文库衔接子序列，比对/作图序列读数与其在参考基因组中的位置，测量在各个可甲基化位点处的甲基化速率，分析与系统中包括的对照相关的数据，并且鉴定相对于参考序列在样品DNA中的序列变体。用于分析来自BS转换的DNA的序列数据的软件由例如Novocraft（Selangor，Malaysia）和CLC bio（Cambridge，Mass）商购可得。
如本文使用的，“可甲基化的胞嘧啶残基”意指在CG二核苷酸的背景下或CHG和CHH（其中H是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）或胸腺嘧啶（T）残基）的非CG背景下的那些残基。
考虑到前文，考虑示例性系统包括DNA取样试剂盒、DNA文库制备/扩增试剂盒、DNA转换试剂盒、扩增/测序试剂盒、溶液相捕获探针库试剂盒、以及生物信息学设计和分析软件的完全补足。
阳性对照和阴性对照可以包括在试剂盒中，以验证依照本发明概念采用的试剂的活性和正确使用。对照可以包括已知对于DNA甲基化的存在阳性或阴性的样品，例如来自组织或细胞系的DNA或RNA制剂等等。对照的设计和使用是标准的并且完全在本领域技术人员的常规能力内。
试剂盒
如上文指出的，涵盖本发明的试剂盒（分开或作为上文描述的系统的部分）可以包括用于转换的DNA的靶向、溶液相捕获的探针库，其具有至少三个（3）探针类型，其各自针对目的核酸序列，并且靶向序列中的CG、CHG和/或CHH位点（其中H是A、C或T残基）。
探针可以通过本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。同样地，探针可以特别设计为标记的。可以用作探针的分子的例子包括但不限于多核苷酸例如RNA或DNA，以及蛋白质、抗体和有机分子。
合成用于用作探针的多核苷酸的方法是本领域众所周知的，例如适当序列的克隆和消化，以及直接化学合成（例如喷墨沉积和电化学合成）。克隆多核苷酸的方法例如在Copeland等人（2001）Nat. Rev. Genet. 2:769-779；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons 1995）；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版（Sambrook & Russell编辑，Cold Spring Harbor Press2001）；和PCR Cloning Protocols，第2版（Chen & Janes编辑，Humana Press 2002）中描述。指导多核苷酸的直接化学合成的方法包括但不限于Reese（1978）Tetrahedron 34:3143-3179和Narang等人（1979）Methods Enzymol. 68:90-98的磷酸三酯法；Brown等人（1979）Methods Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人（1981）Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的氨基磷酸二乙酯法；以及Fodor等人（1991）Science 251:767-773；Pease等人（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026；和Singh-Gasson等人（1999）Nature Biotechnol. 17:974-978；以及美国专利号4,485,066的固体支持物法。还参见Peattie（1979）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1760-1764；以及EP专利号1721908；国际专利申请公开号WO 2004/022770和WO 2005/082923；美国专利申请公开号2009/0062521和2011/0092685；以及美国专利号6,521,427；6,818,395；7,521,178和7,910,726。
考虑到探针库特别是关于第三种探针类型的复杂性和多样性，合成用于探针库的探针的优选方法是通过光刻技术。
两种光刻技术是本领域已知的。在一种技术中，光刻掩模用于将光导向合成表面的特定区域，以实现光不稳定的保护基团（PLPG）的局限性脱保护。PLPG的使用提供了用于生物聚合物（例如多核苷酸）微阵列的基于光刻合成的基础，是本领域众所周知的。用于基于光刻的生物聚合物合成的常用PLPG包括但不限于α-甲基-6-硝基胡椒基-氧羰基（MeNPOC；Pease等人（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026）、2-（2-硝基苯基）-丙氧羰基（NPPOC；Hasan等人（1997）Tetrahedron 53:4247-4264）、硝基藜芦基氧羰基（NVOC；Fodor等人（1991）Science 251:767-773）和2-硝基苄氧羰基（NBOC；Patchornik等人（1970）21:6333-6335）。还参见美国专利号7,598,019；7,759,513和8,445,734。
“掩蔽”法因此包括利用支架（mount）（例如“掩模”）合成聚合物，所述支架衔接基质且提供了在基质和支架之间的反应器间距。参见例如美国专利号5,143,854和5,445,934。
其他技术是MAS，其中光通过数字投影技术例如数字微镜装置（DMD）导向合成表面的特异性区域，实现PLPG的局限性脱保护。还参见Singh-Gasson等人（1999），同上。采用小型铝镜的固态阵列的典型DMD可以形成约786,000至约4.2百万各个光像素的图案。DMD因此产生替代传统微阵列中使用的物理掩模的“虚拟掩模”。
这些虚拟掩模用通过计算机控制的各个可寻址铝镜反映紫外（UV）线的所需模式。DMD控制例如在反应室中的显微镜载玻片上投射的UV光模式，其与DNA合成仪联接。UV光选择性切割在精确位置处的UV不稳定的保护基团，在所述精确位置中将偶联下一个核苷酸。模式以平行的组合方式用DNA合成化学进行协调，使得可以在单一微阵列中合成最高达约4.2百万独特的探针特征。参见美国专利号5,096,279；5,535,047；5,583,688；5,600,383；6,375,903；6,493,867 7,037,659；7,183,406. 7,785,863；7,846,660；8,008,005；8,026,094；8,030,056和8,415,101；以及美国专利申请公开号2001/0010843；2004/0110212和2007/0140906。还参见Hornbeck，“Digital Light Processing and MEMs:Reflecting theDigital Display Needs of the Networked Society,” SPIE/EOS European Symposiumon Lasers，Optics and Vision for Productivity and Manufacturing I（Besancon，France Jun. 10-14 1996）。
MAS因此消除了关于曝光掩模的耗时和昂贵生产的需要。应理解本文公开的系统、试剂盒和方法可以包括和/或利用上文描述的各种探针合成技术中的任一种；然而，考虑到第三种探针库的复杂性，在微阵列上的MAS是优选技术。
一旦合成，核酸探针就从微阵列表面处切割/取出且掺入试剂盒内。从微阵列表面处取出核酸探针的方法是本领域众所周知的，并且可以包括化学切割、酶促切割、来自DNA寡核苷酸模板的RNA转录和原位PCR。参见例如Saboulard等人（2005）Biotechniques 39:363-368。
如本文使用的，“微阵列”意指在固体或半固体支持物的表面上的二维特征排列。单一微阵列或在一些情况下，多重微阵列（例如3、4、5个或更多个微阵列）可以定位在一个固体支持物上。微阵列的大小取决于在一个固体支持物上的微阵列数目。微阵列数目/固体支持物越高，阵列必须越小以适合在固体支持物上。微阵列可以以任何形状进行设计，但优选是正方形或矩形。
如本文使用的，“特征”意指在微阵列表面上的限定区域，具有生物分子例如肽、核酸、碳水化合物等等与之附着。当与其他特征相比较时，一个特征可以含有具有不同特性例如不同序列或取向的生物分子。特征的大小由两个因素决定：（1）阵列上的特征数目，阵列上的特征数目越大，每个单一特征越小；和（2）用于照射一个特征的各个可寻址铝镜元件的数目。用于照射一个特征的镜元件数目越高，每个单一特征越大。微阵列上的特征数目受限于DMD中存在的镜元件（像素）数目。来自Texas Instruments，Inc.的DMD目前含有4.2百万镜元件（像素）。在一个单一微阵列内的特征数目因此目前受限于该数目。
如本文使用的，“固体支持物”或“半固体支持物”意指任何固体材料，其具有有机分子可以通过键形成附着或者通过电子或静电相互作用例如共价键或通过特异性官能团的复合物形成吸附的表面积。载体可以是材料的组合，例如在玻璃上的塑料、在玻璃上的碳等等，并且可以用作用于构建三个探针类型的微阵列的表面。功能表面可以是简单的有机分子，但还可以包含共聚物、树枝状聚合物、分子刷等等。
如本文使用的，“塑料”意指合成材料，例如具有官能化表面的有机构件块（单体）的同共聚物或异共聚物，使得有机分子可以通过共价键形成附着或者通过电子或静电相互作用例如通过经由官能团的键形成吸附。优选地，“塑料”意指聚烯烃，其为通过烯烃（例如乙烯丙烯二烯单体聚合物、聚异丁烯）聚合衍生的聚合物。更优选地，塑料是具有限定光学特性的聚烯烃，如Topas®（Topas Advanced Polymers，Inc.；Florence，Ky.）或Zeonor/Ex®（Zeon Chemicals L.P.；Louisville，Ky.）。
如本文使用的，“官能团”意指众多原子组合中的任一种，其形成化学分子的部分，自身经历特征性反应，并且影响分子的剩余部分的反应性。典型的官能团包括但不限于羟基、羧基、醛基、羰基、氨基、叠氮基、炔基、巯基和腈。潜在反应性官能团包括例如胺、羧酸、醇、双键等等。
像这样，第一类探针是可以结合目的核酸序列的一条链或另一条链的探针，其中所有胞嘧啶残基均为未甲基化的，并且因此在转换期间转换为尿嘧啶残基。探针长度的范围可以从长度约50 bp到约150 bp，并且具有任何核苷酸组成，具有约10%至约90% G+C的范围。
第二类是可以结合目的核酸序列的一条链或另一条链的探针，其中所有胞嘧啶残基均为甲基化的，并且因此不转换为尿嘧啶残基。探针长度的范围可以从长度约50 bp到约150 bp，并且具有任何核苷酸组成，具有约10%至约90% G+C的范围。
第三类是可以结合目的核酸序列的一条链或另一条链的探针，其中一些胞嘧啶残基是未甲基化的，并且因此转换为尿嘧啶残基，并且其他是甲基化的，并且因此不转换为尿嘧啶残基（即“摇摆”探针）。如本文使用的，“摇摆探针”意指其中与CG、CHG和CHH的每个可甲基化位点互补的残基可变地由用于每种探针分子的胞嘧啶或胸腺嘧啶残基组成的那些探针。这些探针的制造可以通过下述来完成：当合成探针的该位置时，引入C和T核苷酸的混合物（例如亚磷酰胺（phosporamidites）），使得C或T随机掺入。像这样，摇摆探针帮助捕获部分甲基化的DNA片段，而无需分开合成与所有可能部分甲基化的靶互补的所有可能探针。探针长度的范围可以从长度约50 bp到约150 bp，并且具有任何核苷酸组成，具有约10%至约90% G+C的范围。
通常，通过三个探针类型靶向的目的核酸序列可以具有任何大小，例如范围为约100个碱基对（bp）至约250百万个碱基对（Mbp）。
捕获探针试剂盒的其他组分包括杂交缓冲液、阻断试剂（例如cot1 DNA、来自人或其他生物的完整基因组DNA、捕获对照DNA片段或克隆、衔接子阻断寡核苷酸）、PCR引物、酶和缓冲液、DNA纯化柱或珠、和链霉亲和素包被的顺磁珠。考虑其他类型的探针还可以包括在试剂盒中。其他探针的例子包括但不限于对照探针。阳性对照和/或阴性对照可以包括在试剂盒中，以验证依照本发明概念采用的试剂的活性和正确使用。对照可以包括已知对于DNA甲基化的一种或多种形式的存在阳性或阴性的样品，例如来自组织或细胞系的DNA或RNA制剂等等，真核生物或原核生物。对照的设计和使用是标准的并且完全在本领域技术人员的常规能力内。
方法
考虑到前述系统和试剂盒，涵盖本发明概念的体外方法包括评价DNA甲基化状态（即捕获、测序和分析DNA）。该方法一般通过从受试者例如动物或植物中收集或获得DNA样品开始。然而，在一些情况下，DNA样品可以得自诸如培养细胞或者甚至原核细胞或病毒的来源。在其他情况下，DNA样品可以是合成核酸分子。
如本文使用的，“样品”意指可以从其中提取或分离基因组DNA的细胞、组织、器官或体液的任何收集。样品同样可以意指从其中可以获得DNA的实验室制剂。此类样品的例子包括细胞、组织或器官、体液和涂片的标本。样品可以通过各种技术包括刮擦或擦拭区域、使用针抽吸细胞或体液、或取出组织样品来收集或获得。当样品是体液时，它可以包括从其中可以分离基因组DNA的血液、淋巴、尿、唾液、抽吸物或任何其他身体分泌物或其衍生物。用于收集各种机体样品或活组织检查样本的方法是本领域众所周知的，并且无需详细描述。
取决于样品类型，基因组DNA可能需要从细胞组分中提取或分离。分离多核苷酸例如DNA的方法是本领域众所周知的。参见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版（Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor Press 2001）；和Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons 1995）。
在获得分离的DNA样品后，该方法可以包括用甲基化的（或未甲基化的）衔接子和尿嘧啶耐受性聚合酶，由DNA样品制备DNA文库。制备DNA文库用于测序甲基化模式的方法是本领域众所周知的。参见例如Carless（2009）Methods Mol. Biol. 523:217-234；Feng等人（2011）Methods Mol. Biol. 733:223-238；和Zhang等人（2009）Methods Mol Biol. 507:177-187。通常，制备DNA文库的方法可以分成下述阶段：（1）使DNA样品破碎；（2）需要时使破碎的DNA样品末端钝化；（3）将甲基化的或未甲基化的寡核苷酸衔接子与目的核酸序列连接；（4）纯化衔接子连接的目的核酸序列；和（5）用例如尿嘧啶耐受性聚合酶扩增纯化的、衔接子连接的目的核酸序列。优选使用甲基化的衔接子，因为它们不受后续转换影响。
如本文使用的，“尿嘧啶耐受性聚合酶”意指在扩增（例如PCR）期间可以耐受具有dUTP的核酸模板的酶（即，具有减少的扩增偏差或具有改善的预读功能）。尿嘧啶耐受性聚合酶由例如Cambridge Epigenetix（Cambridge，UK），Enzymatics Inc.（Beverly，Mass.）和Kapa Biosystems（Woburn，Mass.）商购可得。
通过三个探针类型靶向的目的核酸序列可以来自人基因组或任何其他生物，对于其部分或完全基因组DNA、或者部分或完全转录物序列是可获得的，或可以由相关生物推断。同样地，通过三个探针类型靶向的目的核酸序列可以包括一种或多种基因的编码区或调节区，并且在人或其他脊椎动物中，一般将包括尤其是在涉及关键途径的基因中或附近的多个CpG位点。
在本发明的方法中，约0.5 µg至约1.0 µg DNA可以用作起始材料。用于监控例如BS转换或捕获过程自身的功效的对照核酸可以在此时加入。如果并非已经破碎，则样品中的DNA可以使用机械剪切方法（例如超声处理），破碎至约180 bp至约220 bp的平均大小。片段末端可以使用聚合酶及其他酶（例如DNA聚合酶和Klenow片段）的混合物进行修复，以产生平端的5'磷酸化的片段。dAMP可以加入dsDNA文库片段的3'末端（即“A-加尾”），以促进甲基化文库衔接子的后续连接。具有3’-dTMP突出端的甲基化的dsDNA文库衔接子随后可以与A-加尾的文库片段连接。
在制备DNA文库后，该方法可以包括经由用转换试剂转换，将衔接子连接的目的核酸序列中的未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基。将未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基的方法是本领域众所周知的。参见例如Frommer等人（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831；Hayatsu等人（1970）J. Am. Chem. Soc. 92:724-726；Hayatsu等人（1970）Biochem. 9:2858-2865；Shapiro等人（1970）J. Am. Chem.Soc. 92:422-424；和Shiraishi & Hayatsu（2004）DNA Res. 11:409-415.See also，Boyd & Zon（2004）Anal. Biochem. 326:278-280；Callinan & Feinberg（2006）Hum. Mol. Genet. 15:R95-R101；El-Maarri（2003）Adv. Exp. Med. Biol. 544:197-204；Fraga & Esteller（2002）BioTechniques 33:632，634，636-649；Grunau等人（2001）Nucleic Acids Res. 29:E65；Ivanov等人（2013）Nucleic Acids Res. 41:e72；Laird（2003）Nat. Rev. Cancer 3:253-266；Hayatsu等人（2004）Acids Symp. Ser.（Oxf）261-262；Mill等人（2006）Biotechniques41:603-607；和Shiraishi & Hayatsu（2004）DNA Res. 11:409-415。
如本文使用的，“转换试剂”意指使胞嘧啶脱氨为尿嘧啶残基的试剂。转换试剂因此将未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基，但不转换5-mC残基。转换试剂的例子包括但不限于载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1（APOBEC1）、亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氢酶和亚硝酸。
在一些情况下，例如用于区分5-mC与5-hmC残基，可以使用另外的转换试剂。通常，转换5-hmC残基的方法可以分成下述阶段：（1）变性，（2）转换，和（3）清洁/纯化所转换的核酸序列。转换试剂盒是商购可得的，可用于将5-hmC转换为5-fmC，并且包括但不限于TrueMethyl™ Kit（Cambridge Epigenetix）、BioArray™ 5-hmC Methylation Kit（EnzoLife Sciences）、EpiMark® 5-hmC和5-mC Analysis Kit（New England BioLabs）、EpiJET5-hmC Analysis Kit（Thermo Scientific）。
在将未甲基化的胞嘧啶残基（和/或5-hmC残基）转换为尿嘧啶残基后，转换的DNA文库可以通过连接介导的PCR（LM-PCR）使用尿嘧啶耐受性聚合酶进行扩增。
在扩增后，该方法可以包括用如本文描述的溶液相捕获探针库试剂盒，从扩增且转换的DNA文库中溶液中捕获一种或多种目的核酸序列/片段。通常，捕获转换的核酸序列的方法可以分成下述阶段：（1）变性，（2）捕获，和（3）纯化/分离。溶液中捕获的方法是本领域众所周知的，并且在例如美国专利申请公开号2009/0105081和2009/0246788中描述。
转换且捕获的核酸序列/片段随后可以进行扩增。扩增核酸序列的方法是本领域众所周知的。参见例如Saiki等人（1988）Science 239: 487-491；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons 1995）；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版（Sambrook & Russell编辑，Cold Spring Harbor Press2001）；和PCR Cloning Protocols，第2版（Chen & Janes eds.，Humana Press 2002）。
扩增、捕获的核酸序列/片段随后可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行测序，以研究目的区域中的DNA甲基化模式。在测序后，捕获的片段可以进行分析，以获得关于DNA甲基化状态的信息，并且可以进一步包括比较捕获的核酸片段的序列和甲基化状态与参考基因组的序列和甲基化状态。如上所述，生物信息学分析软件是本领域众所周知的。
实施例
实施例1
转换随后捕获概念的基准技术表现
约0.5 µg至约1.0 µg DNA可以用作起始材料。用于监控例如BS转换或捕获过程自身的功效的对照核酸可以在此时加入。DNA样品可以使用机械剪切方法（例如超声处理），破碎至约180 bp至约220 bp的平均大小。片段末端可以使用聚合酶及其他酶（例如DNA聚合酶和Klenow片段）的混合物进行修复，以产生平端的5'磷酸化的片段。dAMP可以加入dsDNA文库片段的3'末端（即“A-加尾”），以促进甲基化文库衔接子的后续连接。具有3’-dTMP突出端的甲基化的dsDNA文库衔接子随后可以在反应中与A-加尾的文库片段连接，所述反应含有连接缓冲液、A-加尾的DNA、DNA连接酶（通常为1个单位）、和具有3’-dTMP突出端的甲基化的dsDNA文库衔接子（通常为1-5 μM终浓度）。连接反应可以在约20℃下温育约20分钟。衔接的文库片段可以使用DNA纯化柱或珠由缓冲液、盐和未连接的衔接子进行纯化。
在制备DNA文库后，该方法可以包括经由用转换试剂（例如载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1（APOBEC1）、BS、胞嘧啶脱氢酶和亚硝酸）转换，将衔接子连接的目的核酸序列中的未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基。在一些情况下，例如用于区分5-mC与5-hmC残基，可以使用另外的转换试剂。
在将未甲基化的胞嘧啶残基（和/或5-hmC残基）转换为尿嘧啶残基后，转换的DNA文库可以通过连接介导的PCR（LM-PCR）使用尿嘧啶耐受性聚合酶在反应中进行扩增，所述反应包括：约20 ul转换的DNA文库、约25 ul 2x尿嘧啶耐受性聚合酶主混合物（含有聚合酶、dNTP和缓冲液）、约3 ul两种LM-PCR引物的混合物（5 uM原料浓度；引物序列：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ – SEQ ID NO:1和
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’ – SEQ ID NO:2）
和约2 ul水。
示例性热循环条件可以如下：
•步骤1：在约95℃下约2分钟；
•步骤2：在约98℃下约30秒；
•步骤3：在约60℃下约30秒；
•步骤4：在约72℃下约4分钟；
•步骤5：回到步骤2且重复十一（11）次；
•步骤6：在约72℃下约10分钟；和
•步骤7：在4℃下保持。
在扩增后，该方法可以包括用如本文描述的溶液相捕获探针库试剂盒，从扩增且转换的DNA文库中溶液中捕获一种或多种目的核酸序列/片段。转换且捕获的核酸序列/片段随后可以通过在两个相同反应中（以保持体积很低）的PCR进行扩增，其中每个反应可以包括：约20 ul捕获的DNA文库、约25 ul 2x尿嘧啶耐受性聚合酶主混合物（含有聚合酶、dNTP和缓冲液）、和约5 ul两种LM-PCR引物的混合物（5 uM原料浓度：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’ – SEQ ID NO:1和
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’ – SEQ ID NO:2）。
示例性热循环条件可以如下：
•步骤1：在约98℃下约45秒；
•步骤2：在约98℃下约15秒；
•步骤3：在约60℃下约30秒；
•步骤4：在约72℃下约30秒；
•步骤5：回到步骤2且重复十五（15）次；
•步骤6：在约72℃下约1分钟；和
•步骤7：在4℃下保持。
扩增、捕获的核酸序列/片段随后可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行测序，以研究目的区域中的DNA甲基化模式。在测序后，捕获的片段可以进行分析，以获得关于DNA甲基化状态的信息。
实施例2
将本发明的方法应用于一系列人细胞系
将如实施例1中所述的方法应用于从几个人细胞系中分离的DNA。构建针对人基因组hg19中的目的区域的3.2 Mbp捕获设计。目的区域包括来自细胞系IMR90（正常人肺成纤维细胞），跨越一系列经由roadmap MethylC Seq预测的甲基化占据的500种基因启动子。图4显示了捕获测定的表现。测定捕获431个预测的二价结构域，且鉴定在基因CDKN2A、H19-IGF2、XIST以及Y染色体上的区域中的4个大的连续印迹区域。
实施例3
比较三个人细胞系中的甲基化模式
图5显示了关于三个人细胞系IMR90（成纤维细胞）、NA04671（伯基特氏淋巴瘤）和NA12762（正常B淋巴细胞）中的甲基化序列的鉴定的数据。DNA样品及其混合物基本上如实施例1中所述进行分析。数据显示几乎理想的表现（822倍富集相对于972倍可能的最大值）；基因组DNA的低的最低限度可接受的输入（750 ug）；低重复读数率（<10%）；在>10x 读数深度时靶序列的>83%覆盖，仅具有2.6 M读数。结果指出与关于IMR90公开的数据（Lister等人（2009）Nature 462:315-322）相比较的2.5x覆盖。该方法进一步揭示与正常细胞相比较，在癌症中的高甲基化和低甲基化区域（数据未示出）。图6显示了得自来自相同来源（NA04671）的分开样品的数据的高重现性。
实施例4
将该方法应用于体外甲基化的DNA
该实施例利用具有基因DNMT1和DNMT3A的双重敲除的甲基化缺陷人结肠直肠癌细胞系HCT116。从细胞系中分离的DNA与CG甲基转移酶一起温育0、15和60分钟，以获得各种程度的甲基化。所得到的DNA样品及其混合物（0 + 60分钟温育的50/50混合物）基本上如实施例1中所述进行分析。图7上的结果显示如预期的，在与CG甲基转移酶的增加温育后，检测到增加的甲基化程度。
虽然本发明已就具体实例而言进行详细描述，但对于本领域技术人员显而易见的是可以在本发明的范围内作出各种修饰。因此，本发明的范围不应受本文描述的实例限制，而是受下文呈现的权利要求限制。

Claims (12)

1.一种溶液相捕获探针库，其用于捕获目的核酸序列，所述探针库包括三类捕获探针：
其中第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；
其中第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；和
其中第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基且含有胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针。
2.权利要求1的探针库，其中所述捕获探针是长度约50 bp至约150 bp。
3.权利要求1的探针库，其中所述捕获探针是长度约75 bp。
4.权利要求1的探针库，其中所述捕获探针具有约50% G+C。
5.权利要求1的探针库，其中所述三类捕获探针各自为所述探针库的约33%。
6.一种评价目的核酸序列的DNA甲基化状态的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）用捕获探针库溶液中捕获目的核酸序列的转换且扩增的核酸片段，所述捕获探针库包括三类捕获探针：
第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；
第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；和
第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基且含有胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；
（b）扩增所捕获的核酸片段，以获得所扩增的捕获的核酸片段群体；
（c）测序所扩增的捕获的核酸片段，以获得所捕获的核酸片段的核苷酸序列；和
（d）分析所捕获的核酸片段的核苷酸序列，以获得关于DNA甲基化状态的信息。
7.权利要求6的方法，其中在步骤（a）之前，所述方法包括获得基因组DNA样品且由所述基因组DNA样品制备DNA文库的步骤。
8.权利要求6的方法，其中所述所转换的核酸片段通过用转换试剂，将所述DNA文库中的未甲基化的胞嘧啶残基和/或5-羟甲基胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基来获得。
9.权利要求8的方法，其中所述转换试剂选自载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1、亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氢酶、亚硝酸和高钌酸钾。
10.权利要求6的方法，其进一步包括步骤（e）：比较所述所捕获的核酸片段的核苷酸序列和甲基化状态与参考基因组的核苷酸序列和甲基化状态。
11.一种用于评价DNA甲基化状态的试剂盒组合物，所述系统包括：
具有三类捕获探针的溶液相捕获探针库试剂盒，第一类是可以与仅含有尿嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；第二类是可以与仅含有胞嘧啶残基代替可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；并且第三类是可以与含有尿嘧啶残基代替一些可甲基化的胞嘧啶残基且含有胞嘧啶残基代替其他可甲基化的胞嘧啶残基的目的序列杂交的探针；和
选自下述的至少一种另外的试剂盒：DNA取样试剂盒、DNA文库制备试剂盒、DNA转换试剂盒、DNA扩增试剂盒、DNA测序试剂盒以及生物信息学设计和分析软件。
12.权利要求11的组合物，其中所述DNA转换试剂盒包含选自下述的转换试剂：载脂蛋白B编辑复杂催化亚基1、亚硫酸氢盐、胞嘧啶脱氢酶、亚硝酸和高钌酸钾。
CN201480071229.2A 2013-12-31 2014-12-19 经由dna甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法以及其系统和试剂盒 Pending CN106170559A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361922266P 2013-12-31 2013-12-31
US61/922,266 2013-12-31
PCT/EP2014/078660 WO2015101515A2 (en) 2013-12-31 2014-12-19 Methods of assessing epigenetic regulation of genome function via dna methylation status and systems and kits therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106170559A true CN106170559A (zh) 2016-11-30

Family

ID=52875092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480071229.2A Pending CN106170559A (zh) 2013-12-31 2014-12-19 经由dna甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法以及其系统和试剂盒

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20150259743A1 (zh)
EP (1) EP3090061A2 (zh)
JP (1) JP2017501730A (zh)
CN (1) CN106170559A (zh)
CA (1) CA2933514A1 (zh)
WO (1) WO2015101515A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108509769A (zh) * 2017-03-13 2018-09-07 北京林业大学 确定预定物种的基因表达和甲基化修饰调控的关系的方法
CN110527708A (zh) * 2019-07-11 2019-12-03 武汉伯远生物科技有限公司 一种区分dna中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法
CN112226486A (zh) * 2020-09-24 2021-01-15 上海英基生物科技有限公司 基因组甲基化dna靶向富集的文库构建方法及其应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
WO2016100049A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Edico Genome Corporation Chemically-sensitive field effect transistor
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
EP3459115A4 (en) 2016-05-16 2020-04-08 Agilome, Inc. GRAPHEN-FET DEVICES, SYSTEMS AND METHODS FOR USE THEREOF FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS
EP3612646A1 (en) * 2017-04-18 2020-02-26 Dovetail Genomics, LLC Nucleic acid characteristics as guides for sequence assembly
WO2019217785A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. High-throughput method for characterizing the genome-wide activity of editing nucleases in vitro
AU2019351130A1 (en) 2018-09-27 2021-04-08 Grail, Llc Methylation markers and targeted methylation probe panel
PT3914736T (pt) * 2019-01-25 2024-03-27 Grail Inc Deteção de cancro, tecido do cancro de origem e/ou um tipo de celula de cancro

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032748A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-22 Agency For Science, Technology & Research Method for detecting dna methylation

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4485066A (en) 1983-02-08 1984-11-27 International Business Machines Corporation Method of making elastomer-coated hot roll
US5096279A (en) 1984-08-31 1992-03-17 Texas Instruments Incorporated Spatial light modulator and method
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5083857A (en) 1990-06-29 1992-01-28 Texas Instruments Incorporated Multi-level deformable mirror device
US5583688A (en) 1993-12-21 1996-12-10 Texas Instruments Incorporated Multi-level digital micromirror device
US5535047A (en) 1995-04-18 1996-07-09 Texas Instruments Incorporated Active yoke hidden hinge digital micromirror device
ATE462004T1 (de) 1997-09-16 2010-04-15 Centocor Inc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
EP2259046A3 (en) 1998-02-23 2011-11-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for synthesis of arrays of dna probes
US7521178B1 (en) 1998-04-23 2009-04-21 Takara Bio Inc. Method for synthesizing DNA
US6295153B1 (en) 1998-06-04 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Digital optical chemistry micromirror imager
EP2360270B1 (en) * 1999-05-20 2016-11-09 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6493867B1 (en) 2000-08-08 2002-12-10 Ball Semiconductor, Inc. Digital photolithography system for making smooth diagonal components
IL158487A0 (en) 2001-05-18 2004-05-12 Wisconsin Alumni Res Found Method for the synthesis of dna sequences
US7037659B2 (en) 2002-01-31 2006-05-02 Nimblegen Systems Inc. Apparatus for constructing DNA probes having a prismatic and kaleidoscopic light homogenizer
US7083975B2 (en) 2002-02-01 2006-08-01 Roland Green Microarray synthesis instrument and method
DE10209203A1 (de) 2002-03-04 2003-09-25 Ulrich Steiner Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus chemischen Verbindungen
WO2004022770A2 (en) 2002-09-05 2004-03-18 Invitrogen Corporation Compositions and methods for synthesizing nucleic acids
US20040110212A1 (en) 2002-09-30 2004-06-10 Mccormick Mark Microarrays with visual alignment marks
AU2003277059A1 (en) 2002-10-01 2004-04-23 Nimblegen Systems, Inc. Microarrays having multiple oligonucleotides in single array features
US7759513B2 (en) 2003-02-21 2010-07-20 Nigu Chemie Gmbh Photolabile protective groups for improved processes to prepare oligonucleotide arrays
ES2292110T3 (es) 2004-01-26 2008-03-01 Nimblegen Systems, Inc. Programa de ordenador para ayudar en la identificacion de snps (polimorfismos de un solo nucleotido) con microformaciones.
WO2005082923A1 (ja) 2004-03-01 2005-09-09 Japan Science And Technology Agency 塩基部無保護法による新規核酸合成法
JP4499141B2 (ja) 2007-09-05 2010-07-07 富士通株式会社 修飾核酸合成用アミダイド及び修飾核酸合成方法
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
US20090246788A1 (en) 2008-04-01 2009-10-01 Roche Nimblegen, Inc. Methods and Assays for Capture of Nucleic Acids
US20100161607A1 (en) 2008-12-22 2010-06-24 Jasjit Singh System and method for analyzing genome data
WO2010085343A1 (en) * 2009-01-23 2010-07-29 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and arrays for profiling dna methylation
US20150141256A1 (en) * 2013-07-29 2015-05-21 Roche Nimblegen, Inc. Compositions and methods for bisulfite converted sequence capture

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007032748A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-22 Agency For Science, Technology & Research Method for detecting dna methylation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL BURGESS: "SeqCap Epi-Ultra-high complexity oligonucleotide probe pools for targeted enrichment-based bisulfate sequencing: A new technology for DNA methylation analysis", 《CONIFER GIGA-GENOMES FINALLY REVEAL THEIR SECRETS主题会议》 *
MAXIM IVANOV等: "In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108509769A (zh) * 2017-03-13 2018-09-07 北京林业大学 确定预定物种的基因表达和甲基化修饰调控的关系的方法
CN108509769B (zh) * 2017-03-13 2021-06-22 北京林业大学 确定预定物种的基因表达和甲基化修饰调控的关系的方法
CN110527708A (zh) * 2019-07-11 2019-12-03 武汉伯远生物科技有限公司 一种区分dna中5-甲基化胞嘧啶和5-羟甲基化胞嘧啶的方法
CN112226486A (zh) * 2020-09-24 2021-01-15 上海英基生物科技有限公司 基因组甲基化dna靶向富集的文库构建方法及其应用
CN112226486B (zh) * 2020-09-24 2021-11-30 上海英基生物科技有限公司 基因组甲基化dna靶向富集的文库构建方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20150259743A1 (en) 2015-09-17
JP2017501730A (ja) 2017-01-19
EP3090061A2 (en) 2016-11-09
CA2933514A1 (en) 2015-07-09
WO2015101515A3 (en) 2015-08-20
WO2015101515A2 (en) 2015-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106170559A (zh) 经由dna甲基化状态评价基因组功能的表观遗传调节的方法以及其系统和试剂盒
Plongthongkum et al. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond
CN104404134B (zh) 多重核酸检测方法和系统
Hodges et al. High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing
CN103827321B (zh) 用于检测核苷酸修饰的方法
Zuo et al. Methods in DNA methylation profiling
US20080076674A1 (en) Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of non coding RNAs associated with cancer
CN107002117A (zh) 核酸测序方法
CN115461473A (zh) 空间分辨单细胞rna测序方法
KR20210142690A (ko) 시스템
US20030170637A1 (en) Method of analyzing mRNA splice variants
AU2021293238A1 (en) Compositions and methods for in situ single cell analysis using enzymatic nucleic acid extension
Teng et al. Perspectives of DNA microarray and next-generation DNA sequencing technologies
CN106520917A (zh) 一种基因的大片段缺失/重复检测的方法
Wei et al. Single-cell sequencing and its applications in bladder cancer
CN108192957B (zh) Dna合成测序方法与测序系统
Zhang et al. Designing highly multiplex PCR primer sets with simulated annealing design using dimer likelihood estimation (SADDLE)
CN113373207A (zh) 确定胞嘧啶修饰的方法
CN106047990A (zh) 一种基于两核苷酸合成测序的pcr产物snp分型/突变检测方法
Chun et al. Second-generation sequencing for cancer genome analysis
US11788137B2 (en) Diagnostic and/or sequencing method and kit
WO2023082251A1 (zh) 一种基于标签序列和链置换的全基因组甲基建库测序方法
US20220025430A1 (en) Sequence based imaging
Kozulin et al. Single-cell technologies in stem cell epigenetics
Al-Turkmani et al. Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161130