CN106047990A

CN106047990A - 一种基于两核苷酸合成测序的pcr产物snp分型/突变检测方法

Info

Publication number: CN106047990A
Application number: CN201510691117.3A
Authority: CN
Inventors: 肖鹏峰; 王柳
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2016-10-26

Abstract

本发明提供了一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法。通过循环将两核苷酸同时加入到测序反应中，每个测序反应得到的不是具体的碱基序列，而是加入的两核苷酸种类的编码及其核苷酸合成的编码数目组成的信息，根据每个分析位点的野生型、突变型、杂合型均对应唯一、独特的两类编码及其编码数目的测序信息判断出待测PCR产物的SNP分型/突变类型。利用该测序方法阅读长度的特点，可以实现只需一条测序引物即可获得多个位点的分析，避免了利用多重测序引物进行多个分析。该方法有效减少了SNP分型/突变检测的成本、降低测序所需模板量、提高检测灵敏度、缩短操作时间。

Description

一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种PCR产物的SNP分型/突变检测方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成检测PCR产物的SNP分型/突变，尤其是同一PCR产物中多个SNP分型/突变的方法。

背景技术

近年来，人类基因组中突变的检测引起了广泛的关注。单核苷酸多态性(SNPs，single nucleotide polymorphisms)和点突变在进化研究和在普通疾病的诊断中得到广泛的应用，使得它逐渐成为分子生物学检测中倍受欢迎的分子标记(markers)。不断出现的新方法和技术为SNP/突变的检测提供了可靠的前景。这些技术大部分基于等位基因特异性杂交技术来鉴定SNP/突变位点，比如，高密度基因芯片、padlock探针、或者PCR扩增。尽管各种操作简单的技术相继出现，为SNPs的检测提供了可行、简便的技术，但是DNA测序技术仍然是检测SNP/突变最可靠的技术。作为SNP/突变检测金标准的Sanger DNA测序技术不仅能鉴定突变而且还能提供碱基的具体信息，但是这一技术需要电泳，且需要对DNA样品进行标记，导致测序耗时耗力。另外一种测序技术——焦磷酸测序，它是一种基于酶联级反应的测序技术。该技术通过每次向反应体系中加入一种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，在四种酶的作用下，释放出与核苷酸数量成正比的峰。由于不同类型的SNP/突变特定的峰型，所以通过特定峰的类型可以区分不同的SNP/突变。尽管焦磷酸测序技术被广泛用在临床诊断，科学研究中。但是它仍然拥有几下几个缺点。(1)不同步延伸造成的测序长度较短；(2)有限的测序检测灵敏度。这些问题导致它只能用来检测长度不超过60bp内的几个SNPs。传统的SNPs测序中(每个焦测序反应只检测一个SNP的方法)，每个SNP需要一条测序引物和一对PCR扩增引物，同一条DNA模板上待测的突变数量增加势必导致测序成本大幅。为了降低检测成本，提出了能同时检测同一条DNA模板上几个不同SNPs的多重测序。但是，这种多重焦测序的方法只能同时检测同一条DNA模板上相隔不超过25bp的两个SNPs，并且每个测序反应只能检测不超过3个SNPs。所以，有必要提出一种能利用单次测序反应检测同一条DNA模板上多个不同SNPs的方法。另外，传统焦测序技术中，四个核苷酸(A、G、C、T)轮流加入到聚合反应中。每次加入一个核苷酸，产生一个与加入核苷酸数量成比例的峰信号。尽管这种技术基于灵敏的酶联级反应，但是它仍然需要pmol级的DNA模板量。对于一些模板量较少或者较珍贵的DNA样本，有必要提出一种能基于微量样本的SNPs测序方法。

最近，我们实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法，该方法通过每次反应同时加入未标记的两种dNPTs实时测序，得到两组编码，解码这两组编码便能确定测序片段的具体碱基信息(肖鹏峰等，中国发明专利：ZL 2012 1 0128597.6)。该方法具有大幅提高测序长度，且测序得到的峰谱信号比传单核苷酸合成测序的峰谱信号强等特点。诚然，两核苷酸合成焦测序不能测定具体的碱基信息，只能获得由两类编码及其编码数目构成的信息。然而，对比传统的单核苷酸加入的焦测序，对于未知的多模板DNA序列，它原理上同样不能给出Sanger测序方法清晰的“杂合”图谱，只能给出依据核苷酸加入方式得到的具有先后次序的“杂合型”碱基序列，即传统焦测序也不是真正意义上的测序(对碱基序列的识别)，而是对序列“峰型”的识别。基于同样的原理，对于待测序列大致已知、且只有几种可能的序列，如果每种类型PCR产物的一次循环两核苷酸合成焦测序得到由两类编码及其编码数目构成的信息具有唯一性，那么基于“模式”的判断就同样具有唯一性，也就可以用于PCR产物的SNP分型和突变检测。本发明利用两核苷酸实时合成测序得到的一组编码信息的特点，使得PCR产物中不同DNA模板序列得到不同的峰谱图。也就是说，PCR产物中分析位点的不同类型在一次两核苷酸合成测序的信息中具有唯一性，从而实现对不同DNA模板类型的区分。

本发明的目的是提供一种一次两核苷酸合成测序对PCR产物中SNP分型/突变得检测方法。通过两核苷酸同时加入到测序反应中，得到一系列峰谱信息图。在峰谱图中，同一个分析位点的不同类型得到的测序峰型和(或者)峰信号强度不同，根据信号峰型和(或者)峰信号强度不同来判定所分析位点的类型。该方法能有效提高SNP/突变检测的灵敏度、缩短操作时间、节省测序费用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，尤其是PCR产物中多个SNP/突变位点的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)PCR扩增获得目的片段；

(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应，所述的两核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中选择的两种不同的核苷酸；

(4)由测序图谱得到的SNP位点处的峰型确定SNP分型/突变类型。

步骤(3)中，对SNPs位点进行测序时，加入的两核苷酸中只能含有一个可能的突变碱基的互补碱基；对非SNPs位点的碱基进行测序时，从(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)(简写成AG/CT)、(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)(简写成AC/GT)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP)(简写成AT/CG)中任意选择一种循环加入或几种交替加入。

为了保证在分析位点后的DNA模板序列能同步延伸，分析位点处用两个测序反应分析，首先加入的两核苷酸中包含一个(且只能是一个)可能的突变碱基的互补碱基类型，其次再加入含有另一个可能突变碱基的互补碱基类型的两核苷酸。例如，G/T的突变位点中，首先加入含有其中一个互补碱基(如T的互补碱基A)的AT或者AG中的一种，然后再加入含有另一个互补碱基(如G的互补碱基C)的CT、CG中的一种两核苷酸组合。非分析位点的DNA模板序列可以循环加入AG/CT，AC/GT，或者AT/CG中的一种，也可以三种方式交替使用。

步骤(2)中，PCR扩增获得目的片段的长度小于500bp。

步骤(2)中，PCR所用正向引物的5’端用生物素标记。

步骤(3)的具体操作方法如下：

(3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板；

(3-2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；

(3-3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应。

步骤(4)中，判断SNP分型/突变类型的方法是根据峰的类型(两核苷酸的种类)、峰的高度以及峰的排列形式构成测序图谱确定。

进一步，dNTPs合成实时释放与插入到DNA模板中核苷酸量相同的检测分子，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。

加入两核苷酸实施测序反应后，测序反应得到的峰的类型(两核苷酸的种类)、峰的高度，以及峰的排列形式构成测序图谱。两核苷酸测序反应鉴定依据为同一个分析位点不同类型(如SNP中“纯合子”、“杂合子”，点突变中的“野生型”、“突变型” 等)具有不同的测序图谱类型，根据测序所得的测序图谱即可得到待测位点的突变类型。

不管测序引物的位置，对于同一个分析位点在不同的两核苷酸合成反应中(AG/CT，AT/CG和AC/GT中的任意一种)总可以找到不同类型对应的不同测序图谱，核苷酸加入的顺序则可以依据该原理选择合适的两核苷酸合成反应进行检测。

通过循环将两核苷酸同时加入到测序反应中，每个测序反应得到的不是具体的碱基序列，而是加入的两核苷酸种类的编码及其核苷酸合成的编码数目组成的信息，根据每个分析位点的野生型、突变型、杂合型均对应唯一、独特的两类编码及其编码数目的测序信息判断出待测PCR产物的SNP分型/突变类型。两个核苷酸同时加入到测序反应中时，每次反应有一个或者多个核苷酸参与合成反应，使得反应信号得到明显增加，提高SNP分型/突变检测的灵敏度和减少测序所需要的DNA模板量。同时，利用该测序方法阅读长度的特点，可以实现只需一条测序引物即可获得多个位点的分析，避免了利用多重测序引物进行多个分析。

有益效果：

本发明应用两核苷酸同时加入到反应中的一次循环测序信息，根据同一个分析位点中不同类型具有不同的峰谱信号类型的原理，检测PCR产物中的SNP/突变位点，同时利用测序长度的特征能有效测定同一PCR产物中的多个SNP/突变位点，避免了一个分析位点需要一条测序引物甚至一对PCR扩增引物的不足。此外，通过核苷酸加入方式的选择可以使某些合成信号放大，这一特征可以减少对分析样品量的要求，或者减少对PCR产物量的要求，或者用于提高某些低丰度DNA模板量检测的灵敏度。

1.本发明一次循环测序所得的峰谱图信息来检测分析位点的类型。

2.本发明直接采用商品化、非标记的天然核苷酸进行合成测序，在提高测序长度的同时还降低了测序成本。

3.本发明的最大优点是能同时测定同一PCR产物的多个分析位点。

4.本发明与传统测序SNP检测方法相比，不仅减少所需测序引物数量，而且减少了PCR扩增的引物对数，可以有效降低检测成本及时间。

5.本发明与传统测序SNP检测方法相比，不仅减少反应次数，而且对微量样本具有较高的灵敏性，可以用于微量样本的SNPs检测。

6.本发明操作简单。它可以在任何基于实时合成测序的测序平台进行，操作简单、易行。

附图说明

图1是一种基于两核苷酸合成同时检测多个SNPs方法的原理图，图中1为PCR产物，2为微球，3为测序引物，4为循环测序反应(a)测序引物的延伸链。

图2根据可能的PCR产物序列模拟出部分DNA片段焦测序所得的峰谱图。

本发明中采用长度为268bp的PCR片段来作为目标分析片段，该片段测序引物后的待测序列为5’-GGATTACTGGTTATTTTTCTTTTCTCATGCATTTATGCAGCACACGCAATGAAGGCTGTGTGTGTGAA-3’。其中，框内的序列表示待测的SNP突变位点。由于待测片段中总共含有3个SNPs，可以构成27种不同的测序图谱。图2显示了其中9种。因为第二个SNP(G/A)的突变频率较低，我们实验中的样本为纯合子G，所以只有纯合子G的分型得到充分考虑，其他两种分型我们并未给出。图谱中，横坐标表示每次测序反应所加入的两种核苷酸的种类为(dATPαS+dCTP)、(dTTP+dGTP)、(dGTP+dCTP)和(dGTP+dTTP)。纵坐标表示每次测序反应得到的峰谱信号强度(即峰的高度或者合成的碱基数目)。

图3为所选DNA片段的两核苷酸实时焦测序所获得的峰谱信息图。该图横坐标上，A代表加入dATPαS和dCTP的混合物进行测序；T代表加入dGTP和dTTP的混合物进行测序。同理，G代表加入dGTP和dCTP的混合物进行测序；C代表加入dCTP和dTTP的混合物进行测序。纵坐标表示测序反应的信号强度。峰谱上方的箭头指出SNPs位点处峰的信号强度和峰的类型。例如，图3a中，第一二个箭头表示第一个SNP位点，其峰高为1.5、1.5。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

当PCR产物如果含有尿苷二磷酸葡糖苷酸转移酶UGT1A1基因中一个SNP(rs988748)位点，PCR产物中就可能含有下列两种DNA模板之一，或者两者均存在。 DNA模板1(SEQ ID NO：1)：5’-AGAATTCTTCTTTAGCACTTAGACAADNA模板2(SEQ ID NO：2)：5’-AGAATTCTTCTTTAGCACTTAGACAC

在传统的单核苷酸合成焦测序时，按照G/T的第一种加入顺序方式，和T/G的第二种加入方式，检测样本峰型或者峰高会不一样(如下表)。但这两种加入方式根据每个位点的野生型、突变型、杂合型均对应唯一、独特的峰信号类型均可以判断出样本SNP信息：在G/T加入方式中，“C”纯合型独特测序信息为G¹T¹，“A”纯合型为G⁰T²，“C/A”杂合型为G^0.5T^1.5；而在T/G加入方式中，“C”纯合型独特测序信息为T⁰G¹，“A”纯合型信息为T²G¹，“C/A”杂合型信息为G¹T¹。

同样的，两核苷酸加入的方式不同，测序得信息也可能不同，但同样可以按照“根据每个位点的野生型、突变型、杂合型均对应唯一、独特的峰信号类型判断出待测PCR产物的SNP分型/突变类型”，可以判断出样本SNP信息。如上述rs988748位点，当采用CT/AG加入时，“C”纯合型独特测序信息为CT⁰AG¹(这里的CT、AG称为编码，上标0、1分别为上述编码对应的数目，以下类推)，“A”纯合型为CT²AG¹，“C/A”杂合型为CT¹AG¹；而在AT/CG加入方式中，“C”纯合型独特测序信息为AT⁰CG¹，“A”纯合型信息为AT²CG¹，“C/A”杂合型信息为AT¹CG¹。

实施例2：两核苷酸实时合成测序同时检测3个SNPs位点。

1、SNPs位点处测序方式的选择：

以包含3个SNPs位点的DNA模板为例，阐述两核苷酸实时测序同时检测3个SNPs的方法。该例中PCR产物长度为268bp，测序引物后待分析序列为5’-GGATTACTGGTTATTTTTCTTTTCTCATGCATTTATGCAGCACACGCAATGAAGGCTGTGTGTGTGAA-3’，SEQ ID NO：3中只给出了其中一种可能的序列。

其中，框内的序列表示待测的SNP突变位点。首先，确定SNP位点处碱基加入方式：为保证SNPs突变位点后面的序列能同步延伸，每个SNP位点处用两个测序反应分析，每个测序反应中加入的两核苷酸中含有一个可能的突变碱基的互补碱基进行测序反应。使每个SNP位点的野生型、突变型、杂合型均具有唯一的特征测序信息。

例如，对于SNP1(G>A)，如果待测序列为纯合子G，则序列为：5’-GCGATT…..-3’，为保证SNPs突变位点后面的序列能同步延伸，首先加入(dGTP+dTTP)，由于该突变类型为G/A，所以第一次加入的两核苷酸组合中含有一个可能的突变型A的互补碱基。第二次测序反应时，加入碱基(dGTP+dCTP)。这是因为另一个可能的突变类型的互补碱基是碱基C。如果该位点为纯合子G，那么这两次测序反应得到峰信号强度为1和2；纯合子A得到峰信号强度为2和1；杂合子的峰信号强度为1.5和1.5。

对于SNP2(G/A)，首先加入(dATP+dCTP)，由于该突变类型为G/A，所以第一次加入的两核苷酸组合中含有一个可能的突变型C的互补碱基。第二次测序反应时，加入碱基(dGTP+dTTP)。这是因为另一个可能的突变类型的互补碱基是碱基A。如果该位点为纯合子G，那么这两次测序反应得到峰信号强度为3和1；纯合子A得到峰信号强度为2和2；杂合子的峰信号强度为2.5和1.5。

对于SNP3(T/C)，首先加入(dATP+dCTP)，由于该突变类型为T/C，所以第一次加入的两核苷酸组合中含有一个可能的突变型A的互补碱基。第二次测序反应时，加入碱基(dGTP+dCTP)。这是因为另一个可能的突变类型的互补碱基是碱基G。如果该位点为纯合子T，那么这两次测序反应得到峰信号强度为2和0；纯合子C得到峰信号强度为1和1；杂合子的峰信号强度为1.5和0.5。

表1 3个SNPs位点处两次测序反应的峰信号强度值

2、SNPs位点间DNA序列测序方式的选择：

对于SNPs位点间的DNA序列，可以从AG/CT，AC/GT，和AT/CG碱基的加入方式中任意选择一种循环加入，或者几种加入方式交替使用。本例中，我们选择AT/CG 的加入方式测定SNP1和SNP2，SNP2和SNP3之间的序列。SNP3后面的序列我们选择了CT/GT的测序方式。所以，本例中的测序方式为TGATATATATATATATATATATATATAGCT。其中，T代表的是(dGTP+dTTP)；G代表的是(dCTP+dGTP)；A代表的是(dATPαS+dCTP)；C代表的是(dCTP+dTTP)。

3、3个SNPs位点的同时确定：

根据上述方法，我们模拟出9种焦测序所得的峰谱信息(图2)。由于待测片段中总共含有3个SNPs位点，可以构成27种不同的测序图谱。但是第二个SNP(G/A)的突变频率较低，我们实验中的样本为均纯合子G，所以只有纯合子G的分型得到充分考虑，其他两种分型我们并未给出。图2显示了其中9种类型的测序图。

图2a，d，g中，第一个SNP位点处的峰信号强度分别为1和2、2和1、1.5和1.5；由此可知，不同的突变类型能得到不同的峰信号强度。这是这一特点奠定了该方法检测SNPs的基础。对照表1可知，图2a，d，g分别对应第一个SNP的突变类型分别为纯合子G、纯合子A和杂合子G/A的测序峰信号图。图2a～i中，SNP位点处的峰信号强度为均为3和1，由此可知九个图中的SNP2的突变类型相同。由于在SNP2位点前一次反应加入了(dGTP+dTTP)，SNP2位点处原计划也是加入(dGTP+dTTP)。但是第一次加入(dGTP+dTTP)时，突变的DNA模板已经参与合成反应，使峰信号的强度和SNP2前一个反应和在了一起变成了3。对照表1可知，图2中SNP2的突变类型为纯合子G。图2a，d，g中，第三个SNP位点SNP3的峰信号强度分别为2和0、1和1、1.5和0.5。由于在SNP3位点前一次反应加入了(dATPαS+dCTP)，所以SNP2位点处不必重复再加入(dATPαS+dCTP)。对照表1可知，图2a，b，c分别对应第一个SNP的突变类型分别为纯合子T、纯合子C和杂合子T/C的测序峰信号图。同理，图2d，e，f分别对应第一个SNP的突变类型分别为纯合子T、纯合子C和杂合子T/C的测序峰信号图；图2g，h，i分别对应第一个SNP的突变类型分别为纯合子T、纯合子C和杂合子T/C的测序峰信号图。由此可知，根据不同碱基加入方式下，不同的SNP突变类型具有特定的峰信号强度，可以鉴定出各个SNP分型。由于两个核苷酸同时加入到测序反应中，使得每次参与合成反应的核苷酸数量增加，测序长度能大幅提高，所以该方法能实现同时测定一条DNA模板上的多个SNPs位点。

实施例3：基于焦磷酸测序平台的两核苷酸合成同时检测同一条模板上的多个SNPs位点。

1、DNA样本制备

首先，从人血液中提取基因组DNA，保存在-20℃待用。在聚合酶的作用下PCR扩增待测序片段。该片段中选取3个SNPs，且这3个SNPs覆盖了58bp的长度。为了有较好的焦测序结果，该片段最好小于250bp。扩增引物为：引物F(SEQ ID NO：4):5’-biotin-ACTGGTGTCGCATTTATTTC-3’；引物R(SEQ ID NO：5)：5’-GAGTAGAAGAAAGAGTGTTAGC-3’。其中，正向引物5’端标记生物素以获得测序所需的PCR样本。每个样本用5μL的链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液清洗两遍，弃上清。再加入5μL链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液在斡旋振荡仪上振荡使磁珠悬浮。在45μL的PCR产物中加入50μL结合反应缓冲液和磁珠的混合物，震常温震荡混合15分钟，使生物素标记的PCR样本和链霉亲和素包裹的磁珠进行连接。利用真空样本制备系统将磁珠释放到96孔样本板，得到单链的测序模板。然后，单链测序模板、测序引物(5’-GTTATTTCTGGGCGAT-3’，SEQ ID NO：6)和结合反应缓冲液的混合物在加热板上80℃加热2分钟，使测序模板和测序引物进行结合，以进行焦测序。

2、两核苷酸实时合成测序

在试剂仓中加入测序所需的各种试剂(PyroMark Gold Q96 SQA Reagents(5×96))，将包含磁珠固定PCR样本的96孔板和试剂仓放入测序仪中，并设定测序参数。此处，dNTPs试剂中分别加入(dATPαS+dCTP)，(dGTP+dTTP)，(dATPαS+dTTP)，(dCTP+dGTP)，(dATPαS+dGTP)或者(dCTP+dTTP)中的任意四组进行的两核苷酸同时合成测序反应。设置测序方式为TGATATATATATATATATATATATATAGCT，并点击开始按钮，开始测序。其中，T代表的是(dGTP+dTTP)；G代表的是(dCTP+dGTP)；A代表的是(dATPαS+dCTP)；C代表的是(dCTP+dTTP)。

3、同时鉴定3个SNPs位点

图3为DNA样本的两核苷酸实时焦测序所获得的峰谱信息。该图横坐标上，A代表加入dATPαS和dCTP的混合物进行测序；T代表加入dGTP和dTTP的混合物进行测序。同理，G代表加入dGTP和dCTP的混合物进行测序；C代表加入dCTP和dTTP的混合物进行测序。纵坐标表示测序反应的信号强度。峰谱上方的箭头指出SNPs位点处峰的信号强度。将测序所得到的图谱和表1预测的SNPs位点处峰高信号作对比，即可得出3个SNPs的突变类型。图3a中，SNP1的峰信号强度为1.5和1.5。对比表1可知，杂合子G/A的峰信号强度为1.5和1.5。所以，SNP1为杂合子G/A。对于SNP2，突变位点处的峰信号强度为3和1，对比表1可知，SNP2为纯合子G。同理，对于SNP3，突变位点处的峰信号强度为1.5和0.5，对比表1可知，SNP2为杂合子T/C。图3b中，SNP1的峰信号强度为1和2。对比表1可知，纯合子G的峰信号强度为1和2。所以，SNP1为纯合子G。对于SNP2，突变位点处的峰信号强度为3和1，对比表1可知，SNP2为纯合子G。同理，对于SNP3，突变位点处的峰信号强度为1和1，对比表1可知， SNP2为纯合子C。由此可见，分析焦测序所得的图谱，以及比较焦测序图谱和预测分析所得的峰谱信号，我们可以正确地分析同一条DNA模板上几个SNPs位点。

SEQUENCE LISTING

<110> 东南大学

<120> 一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法

<130> SG20151021002

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA模板1

<400> 1

agaattcttc tttagcactt agacaa 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DNA模板2

<400> 2

agaattcttc tttagcactt agacac 26

<210> 3

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例2中包含3个SNPs位点的序列

<400> 3

gcgattactg gttatttttc ttttctcatg catttatgca tgcacacgca atgaaggcat 60

gtgtgtgtga a 71

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例3中引物F

<400> 4

actggtgtcg catttatttc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例3中引物R

<400> 5

gagtagaaga aagagtgtta gc 22

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例3中测序引物

<400> 6

gttatttctg ggcgat 16

Claims

1.一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取样本的基因组DNA；

(2)PCR扩增获得目的片段；

(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应，所述的两核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中选择的两种不同的核苷酸，每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸的种类信息、以及核苷酸合成的数目信息；

(4)由测序图谱得到的SNP位点处的峰型确定SNP分型/突变类型。

2.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(3)中，两核苷酸同时合成测序反应从(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)、(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP)中任意选择一种循环加入或几种交替加入。

3.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增获得目的片段的长度小于500bp。

4.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR所用正向引物的5’端用生物素标记。

5.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(3)按照如下方法进行：

(3-2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；

6.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(4)中，判断SNP分型/突变类型的方法根据峰的类型、峰的高度、以及峰的排列形式构成测序图谱确定。

7.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，dNTPs合成实时释放与插入到DNA模板中核苷酸量相同的检测分子，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐、电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。