CN102605088B - 一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，包括以下步骤：设计一对通用引物，三种TaqMan探针，三对加尾引物，样本检测：分别以待检基因和标准基因为模板，加入三对加尾引物，进行首轮巢式荧光定量PCR，得到首轮PCR产物；以首轮PCR产物为模板，加入通用引物及三种TaqMan探针，进行二轮荧光定量PCR，并在每个循环的反应结束后采集荧光信号；根据采集的荧光信号，定量样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数。本发明在同一反应管中扩增多个目的片段的反应效率能达到高度一致，能准确区分出α-珠蛋白基因11种基因型。本发明操作简单，通量高，只需要2步PCR循环反应，整个过程不超过2h。

Description

一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法。

背景技术

α珠蛋白基因的拷贝数变异(Copy number variation, CNV)在人类基因组中很常见，有研究认为这种现象是人类进行化过程中与疟疾的自然选择相关。α珠蛋白基因缺失和多拷贝，均可导致所编码α珠蛋白表达降低可增高，而导致一系列的生物学性状：基因缺失导致α珠蛋白表达减少而导致α-地贫，基因多拷贝导致α珠蛋白表达增加而加重β-地贫症状。另外，α珠蛋白基因簇中，α1和α2这两个基因为高GC含量，且高度同源，其编码的多肽链完全相同，基因结构中，两者的X、Y、Z盒的DNA序列基本相同，仅在第二内含子及3’端非翻译区有些区别，而且还存在α2与α1基因在缺失情况下的形成融合基因的情况，这种情况在哺乳动物的基因组DNA序列中并不少见。

近年来，多种基于芯片的高通量方法用于识别全基因范围内的CNV，如芯片比较基因组杂交（Array comparative genomic hybridization, Array CGH）、SNP分型芯片（SNP genotyping arrays）以及深度测序方法（Deep sequencing-based approaches）。这些方法具有较高的分辨率，能区别出人类基因组中几kb至几Mb的序列差异，在全基因组范围内筛查和识别CNV，主要应用于CNV图谱的构建和疾病的关联分析，但并不适用于检测针对特异疾病的仅仅几个位点的拷贝数变化。

而针对靶位点CNV的检测方法有以下几种：多重连接探针扩增(MLPA), 多重可扩增探针杂交(MAPH), 短荧光片段多重定量PCR (QMPSF )以及实时荧光定量PCR( Real-time quantitative PCR )。这些方法都是以PCR为基础，适用于对特定靶位点进行定量分析。

MLPA是2002年Schouten首先报导的，可以检测出DNA序列的缺失和重复。该方法高效、特异，在一次反应中可以同时检测45个靶序列拷贝数的改变，已有针对不同遗传病进行诊断。Armour等人报导了一种基于多重可扩增探针杂交的MAPH方法，用于基因拷贝数变异的定量分析。该方法把特定的 PCR产物与固定在尼龙膜上基因组DNA杂交，通过 PCR和电泳技术检测杂交回收探针的量，以实现基因组中对应的 DNA 拷贝数的检测。MAPH与MLPA类似的地方在于，均可以实现40多种靶序列的同时检测，且结果准确、精度高，目前已经有包括乳腺癌等在内的多种遗传病用该方法进行分析的报道。短荧光片段多重定量PCR最早应用于染色体非整倍体的产前基因诊断。这项技术的原理是选取待检基因外显子上的一段短片段序列，用标记荧光的引物同时对多个短片段进行扩增，然后将扩增产物进行毛细管电泳分析，根据图谱中产物峰的长度和面积来计算待测位点的拷贝数。

现有检测特异位点拷贝数的方法普遍存在的缺点包括操作复杂，开放性检测平台容易造成样本间的交叉污染，仪器要求较高等等。以目前应用较广泛的MLPA方法为例，该方法的不足之处在于：1、开放式检测平台，容易造成污染；2、其设计的长探针不能通过普通的化学方法合成，需要通过M13载体克隆的方法获得；3、杂交步骤耗时过长（16小时）。这些都限制了其作为分子筛查方法的推广和应用。而MAPH方法要先固定样本DNA及洗脱未反应的探针，步骤繁琐，难以适应临床诊断的需要。

实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台。实时荧光定量PCR具备了传统PCR的优点，同时又克服了传统PCR的许多缺点。首先，操作简便，快速高效，具有很高的敏感性和特异性；其次，是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，有效的避免污染，而且直接检测结果，无需扩增后操作；另外，多荧光通道允许在同一反应体系中同时对多个靶序列进行扩增检测。但是多重PCR本身存在一些问题。不同引物对之间的错配扩增，不同靶序列扩增效率不一致导致效率低的靶点被扩增效率较高的靶点所抑制，这些都会影响拷贝数定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法。

本发明所采取的技术方案为：

一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，包括以下步骤： 

1)      设计一对通用引物，包括上游通用引物和下游通用引物；

2)      分别设计三种TaqMan探针，分别作为α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的TaqMan探针；

3)      分别设计上述α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的加尾引物，上游加尾引物从5’至3’端的序列依次为上游通用引物的结合序列、相应基因的TaqMan探针的结合序列、基因特异识别序列，下游加尾引物从5’至3’端的序列依次为下游通用引物的结合序列、基因特异识别序列；

4)      样本检测：

以待检样品基因/标准样品基因为模板，加入上述三对加尾引物，进行首轮巢式荧光定量PCR，得到首轮PCR产物；

分别以首轮PCR产物为模板，加入上述通用引物及三种TaqMan探针，进行二轮荧光定量PCR，并在每个循环的反应结束后采集荧光信号；

根据采集的荧光信号，计算待检样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数。

优选的，通用引物为随机组合的18～24bp寡核苷酸链，Tm值为58～64℃。

优选的，TaqMan探针序列的长度为22～24bp，5’端第一个碱基不为G，GC含量40～70%，Tm值比通用引物高5～10℃。

优选的，内参基因为看家基因β-actin。

优选的，加尾引物的各结合序列、基因特异识别序列之间随机插入1～3个核苷酸，减少序列位阻。

优选的，所述通用引物为common-F和common-R，其序列为：

common-F：5’-ggcagcaccgacgtagac-3’（SEQ ID NO.1），

common-R：5’- gccgacgccactgtactc-3’ （SEQ ID NO.2）；

所述α1珠蛋白基因的加尾引物为α1-FT和α1-RT，其序列为：

α1-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacAGcacgaactgacggccatcaa gcacctctgtgtgtacttgtg

tgatg-3’ （SEQ ID NO.3），

α1-RT：5’-gccgacgccactgtactcctctgggaggtaggcagtcctct-3’ （SEQ ID NO.4），

所述α1珠蛋白基因的TaqMan探针：

α1-P：5’- Cy5-cacgaactgacggccatcaagc -BHQ2-3’ （SEQ ID NO.5）；

所述α2珠蛋白基因的加尾引物为α2-FT和α2-RT，其序列为：

α2-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacATcctgaggtcaccgagctgcacTctcccctgcatccctttcag-3’ （SEQ ID NO.6），

α2-RT：5’-gccgacgccactgtactcAAtggcgcagagctgaatgaac-3’ （SEQ ID NO.7），

所述α2珠蛋白基因的TaqMan探针为α2-P，其序列为：

α2-P：5’- HEX - cctgaggtcaccgagctgcactc –BHQ1-3’ （SEQ ID NO.8）；

所述β-actin的加尾引物为β-actin-FT和β-actin-RT，其序列为：

β-actin-FT：5’- ggcagcaccgacgtagacAGTccatcaacttgcgtccacgctcagc tcaggcaggaaa

gacac-3’ （SEQ ID NO.9），

β-actin-RT：5’-gccgacgccactgtactcacccagcacaatgaagatcaag-3’ （SEQ ID NO.10），

所述β-actin的TaqMan探针：

β-actin-P：5’- ROX- ccatcaacttgcgtccacgctc–BHQ2-3’ （SEQ ID NO.11）。

优选的，TaqMan探针的5’末端和3’ 末端分别标记荧光基团、淬灭基团。

优选的，α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的TaqMan探针分别对应的荧光基团为Cy5、HEX和ROX。

优选的，淬灭基团选择BHQ系列染料。

优选的，首轮巢式荧光定量PCR的反应体系为：30 ng DNA模板，50 nM三对加尾引物混合物，20 mM Tris–HCl，50 mM KCl， 2.0 mM MgCl₂，1.0 U TaqHS聚合酶，250 μM dNTPs，超纯水补足至20μL。

优选的，首轮巢式荧光定量PCR的反应程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，62℃45s，循环2次；92℃ 30s，70℃ 15s，循环15次。

优选的，二轮荧光定量PCR的反应体系为：1 μL首轮PCR产物，375 nM通用引物，100 nM 三种TaqMan探针混合物，20 mM Tris–HCl，50 mM KCl，3.3 mM MgCl₂，1.25 U Taq 聚合酶，300 μM dNTPs，超纯水补足至20μL。

优选的，二轮荧光定量PCR的反应程序为：95℃ 3min，93℃ 30s，58℃ 1min，循环35次。

本发明根据采集的荧光信号，采用2^-??Cq法，计算样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数，对α-珠蛋白基因的缺失及重复进行诊断，对未知基因型的样品进行拷贝数定量。这其中涉及两种待检测基因，分别为α1和α2珠蛋白基因，另一种内参基因作为内标，还涉及两种样品，分别为待检测样品和标准样品，标准样品作为外标，是已知α1/α2均为2拷贝的正常基因组样品，我们采用2^-??Cq的公式来定量未知样品的基因拷贝数，需要采集以下四个数据值：

标准样品中内参基因的扩增Cq值即?Cq内参基因_{（标准样品）}，

待检样品中内参基因的扩增Cq值即?Cq内参基因_{（待检样品）}，

标准样品中待测基因的扩增Cq值即?Cq待检基因_{（标准样品）}，

待检样品中待测基因的扩增Cq值即?Cq待检基因_{（待检样品）}，

按以下公式计算：

??Cq = [?Cq内参基因_{（标准样品）}–?Cq待检基因_{（标准样品）}] – [?Cq内参基因_{（待检样品）}–?Cq待检基因_{（待检样品）}]，

待检样品中待检基因拷贝数相对定量值：2^-??Cq。

上述Cq值均是每个样品重复三次得到的平均值，最后得到的结果2^-??Cq是该待测基因相对于内参基因拷贝数的倍数值。例如，对于基因型为-α^3.7/αα的样本来说，其包含1个拷贝的α1，那么用正常2拷贝α1的标准样本（基因型为αα/αα）标化后的拷贝数比值为0.5。同理，对于基因型为ααα^anti3.7/αα的样本来说，其包含3个拷贝的α1，标化后的拷贝数比值为1.5。

实际检测中因为操作过程及仪器本身的误差，得到的数值与理论值有偏差，一般用标准偏差SD来衡量。根据大部分基于实时荧光定量PCR方法的文献报导，SD = 0.25是可以接受的误差值范围。在本研究中，我们将0.25定为一个检测范围标准，用来判断待检基因的拷贝数。例如，我们得到α1的CN值为0.57，该数值位于理论值0.5±0.25的范围内，于是我们将该样本α1的拷贝数确定为1个拷贝。

本发明的原理是针对α-珠蛋白基因和看家基因β-actin序列设计加尾引物， 加尾引物包含通用引物结合序列，TaqMan探针结合序列和基因特异识别序列。经过有限循环的扩增后，位点的拷贝数等比例转化为包含通用引物结合序列的扩增产物的数目。然后加入通用引物及TaqMan探针，对不同位点的扩增产物同时进行荧光定量PCR反应，由于各目的片段都与同一种通用引物结合，故扩增多个目的片段的反应效率能达到高度一致。 

本发明的有益效果：

本发明建立一种基于多重加尾引物扩增的巢式实时荧光定量PCR方法，用于检测特定基因位点的拷贝数变异，更好的利用了实时定量PCR的优势，同时又避免多重PCR扩增效率不一致的缺点，本发明在同一反应管中扩增多个目的片段的反应效率能达到高度一致，准确性及特异性高，能准确区分出α-珠蛋白基因11种基因型。

本发明操作简单，通量高，只需要2步PCR循环反应，整个过程不超过2h，且在PCR仪上的96孔板上进行反应，按每个样品重复三次，至少可同时检测30个样品，到达中等通量要求，有望成为一种针对已知位点进行拷贝数检测的通用方法。

本发明方法的建立是基于实时荧光定量平台，有效避免交叉污染。

附图说明

图1是加尾引物和TaqMan探针示意图；

图2是本发明样品检测方法流程图。

具体实施方式

一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法，包括以下步骤： 

1)      设计一对通用引物，包括上游通用引物和下游通用引物；

2)      分别设计三种TaqMan探针，分别作为α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的TaqMan探针；

3)      分别设计上述α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因和内参基因的加尾引物，上游加尾引物从5’至3’端的序列依次为上游通用引物的结合序列、相应基因的TaqMan探针的结合序列、基因特异识别序列，下游加尾引物从5’至3’端的序列依次为下游通用引物的结合序列、相应基因的特异识别序列；

4)      样本检测：

分别以待检样品基因、标准样品基因作为模板，分别加入上述三对加尾引物，进行首轮巢式荧光定量PCR，得到首轮PCR产物；

分别以首轮PCR产物为模板，加入上述通用引物及三种TaqMan探针，进行二轮荧光定量PCR，并在每个循环的反应结束后采集荧光信号；

根据采集的荧光信号，计算待检样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数。

优选的，通用引物为随机组合的18～24bp寡核苷酸链，Tm值为58～64℃。

优选的，TaqMan探针序列的长度为22～24bp，5’端第一个碱基不为G，GC含量40～70%，Tm值比通用引物高5～10℃。

优选的，内参基因为看家基因β-actin。

优选的，加尾引物的各结合序列、基因特异识别序列之间随机插入1～3个核苷酸，减少序列位阻。

优选的，标准样品基因为α1和α2拷贝数均为2的正常基因组样品。

本发明设计的加尾引物和TaqMan探针示意图见图1，注：A为加尾引物，B为TaqMan探针。由图可知，加尾引物和TaqMan探针的组成部分。

本发明样品检测的步骤参见图2，图2为上述样品检测步骤中PCR流程，通过第一步有限循环的扩增，将通用引物结合序列引入到扩增产物中，并作为第二步通用引物扩增的模板；第二步加入通用引物和检测探针，进行荧光定量PCR反应。

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。

实施例按上述方法所设计的所有引物和探针序列如下，其中“FT”表示上游加尾引物，“RT”表示下游加尾引物，“P”表示TaqMan探针，序列中，下划线部分为基因组特异序列，斜体部分为TaqMan探针序列，其余为通用引物序列，大写字母为随机插入的核苷酸，以减少序列位阻：

所述通用引物为common-F和common-R，其序列为：

common-F：5’-ggcagcaccgacgtagac-3’（SEQ ID NO.1），

common-R：5’- gccgacgccactgtactc-3’ （SEQ ID NO.2）；

所述α1珠蛋白基因的加尾引物为α1-FT和α1-RT，其序列为：

α1-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacAGcacgaactgacggccatcaa gcacctctgtgtgtacttgtg

tgatg-3’ （SEQ ID NO.3），

α1-RT：5’-gccgacgccactgtactcctctgggaggtaggcagtcctct-3’ （SEQ ID NO.4），

所述α1珠蛋白基因的TaqMan探针：

α1-P：5’- Cy5-cacgaactgacggccatcaagc -BHQ2-3’ （SEQ ID NO.5）；

所述α2珠蛋白基因的加尾引物为α2-FT和α2-RT，其序列为：

α2-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacATcctgaggtcaccgagctgcacTctcccctgcatccctttcag-3’ （SEQ ID NO.6），

α2-RT：5’-gccgacgccactgtactcAAtggcgcagagctgaatgaac-3’ （SEQ ID NO.7），

所述α2珠蛋白基因的TaqMan探针为α2-P，其序列为：

α2-P：5’- HEX - cctgaggtcaccgagctgcactc –BHQ1-3’ （SEQ ID NO.8）；

所述β-actin的加尾引物为β-actin-FT和β-actin-RT，其序列为：

β-actin-FT：5’- ggcagcaccgacgtagacAGTccatcaacttgcgtccacgctcagc tcaggcaggaaaga

cac-3’ （SEQ ID NO.9），

β-actin-RT：5’-gccgacgccactgtactcacccagcacaatgaagatcaag-3’ （SEQ ID NO.10），

所述β-actin的TaqMan探针：

β-actin-P：5’- ROX- ccatcaacttgcgtccacgctc–BHQ2-3’ （SEQ ID NO.11）。

上述引物、加尾引物和探针中，三对加尾引物的Tm值均为65℃，三对加尾引物扩增待检基因后的基因组序列均为50bp左右的短片段；通用引物是随机组合18bp的寡核苷酸链，Tm值为55℃；三种TaqMan探针序列长度为22bp，Tm值约为65℃。

实施例1

检测96例已知基因型的DNA样本，包括如下步骤，其中，标准样品基因作为外标，是已知α1/α2均为2拷贝的正常人基因组样品：

1)   分别以待检样品基因、标准样品基因为模板，加入三对加尾引物，进行首轮巢式荧光定量PCR，反应体系为：30 ng DNA模板，50 nM三对加尾引物混合物（α1-FT/α1-RT、α2-FT/α2-RT、β-actin-FT/β-actin-RT，且各上、下游加尾引物的用量均相同），20 mM Tris–HCl (pH8.4)，50 mM KCl， 2.0 mM MgCl₂，1.0 U TaqHS聚合酶，250 μM dNTPs，超纯水补足至20μL；反应程序为：95℃ 5min；94℃ 45s，62℃45s，循环2次；92℃ 30s，70℃ 15s，循环15次；得到首轮PCR产物；

2)   分别以首轮PCR产物为模板，加入通用引物及三种TaqMan探针，进行二轮荧光定量PCR，反应体系为：1 μL首轮PCR产物，375 nM通用引物(common-F/ common-R)，100 nM 三种TaqMan探针混合物（α1-P、α2-P、β-actin- P，各种TaqMan探针用量均相同），20 mM Tris–HCl (pH8.4)，50 mM KCl，3.3 mM MgCl₂，1.25 U Taq 聚合酶，300 μM dNTPs，超纯水补足至20μL；反应程序为：95℃ 3min，93℃ 30s，58℃ 1min；循环35次，并在每个循环的58℃反应结束后进行荧光信号采集；

3)   采用2^-??Cq法定量样品的α1、α2珠蛋白基因拷贝数，从而对α-珠蛋白基因的基因型做出分析，所有样本的CN值数据统计分析结果见表1。拷贝数实际检测值为2^-??Cq。

本实施例得到的待检基因的CN（拷贝数）的实测值均在CN_预测值 ± 0.2的范围内，所有样本的拷贝数检测结果均与实际样本的基因型一致，准确性及特异性均为100%。

实施例2

选取基因型为αα/αα、-α^3.7/αα、ααα^anti3.7/αα、-α^4.2/αα、ααα^anti4.2/αα五种DNA样本各一例对本方法检测的重复性进行检验。

将已知基因型为αα/αα的标准样品（30ng）作为参考模板，同时设立无模板的阴性对照，每个样本重复5次，按实施例1的步骤进行检测，对检测的实验结果进行统计，从而对本方法检测的重复性进行考核，统计分析结果见表2。由表可知，基因型符合率为100%。

本实施例的实验的标准差SD为0.038～0.095，重复性变异系数CV%值为6.09%～12.77%，说明本方法检测的重复性较好。

<110>  南方医科大学

 

<120>  一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的方法

 

<130> 

 

<160>  11   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  1

ggcagcaccg acgtagac                                                     18

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  2

gccgacgcca ctgtactc                                                     18

 

 

<210>  3

<211>  66

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  3

ggcagcaccg acgtagacag cacgaactga cggccatcaa gcacctctgt gtgtacttgt       60

 

gtgatg                                                                  66

 

 

<210>  4

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  4

gccgacgcca ctgtactcct ctgggaggta ggcagtcctc t                           41

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cacgaactga cggccatcaa gc                                                22

 

 

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<211>  62

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ggcagcaccg acgtagacat cctgaggtca ccgagctgca ctctcccctg catccctttc       60

 

ag                                                                      62

 

 

<210>  7

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gccgacgcca ctgtactcaa tggcgcagag ctgaatgaac                             40

 

 

<210>  8

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cctgaggtca ccgagctgca ctc                                               23

 

 

<210>  9

<211>  63

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  9

ggcagcaccg acgtagacag tccatcaact tgcgtccacg ctcagctcag gcaggaaaga       60

 

cac                                                                     63

 

 

<210>  10

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工引物

 

<400>  10

gccgacgcca ctgtactcac ccagcacaat gaagatcaag                             40

 

 

<210>  11

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ccatcaactt gcgtccacgc tc                                                22

Claims (1)

1.一种快速检测α-珠蛋白基因簇拷贝数变异的试剂，该试剂包括一对通用引物、三种TaqMan探针和三对加尾引物，其特征在于：所述三种TaqMan探针为α1珠蛋白基因的TaqMan探针、α2珠蛋白基因的TaqMan探针、内参基因β-actin的TaqMan探针，所述三对加尾引物为一对α1珠蛋白基因的加尾引物、一对α2珠蛋白基因的加尾引物、一对内参基因β-actin的加尾引物，其中，

所述通用引物为common-F和common-R，其序列为：

common-F：5’-ggcagcaccgacgtagac-3’，如 SEQ ID NO.1所示，

common-R：5’- gccgacgccactgtactc-3’ ，如SEQ ID NO.2所示；

所述α1珠蛋白基因的加尾引物为α1-FT和α1-RT，其序列为：

α1-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacAGcacgaactgacggccatcaa gcacctctgtgtgtacttgtg

tgatg-3’ ，如SEQ ID NO.3所示，

α1-RT：5’-gccgacgccactgtactcctctgggaggtaggcagtcctct-3’ ，如SEQ ID NO.4所示，

所述α1珠蛋白基因的TaqMan探针：

α1-P：5’- Cy5-cacgaactgacggccatcaagc -BHQ2-3’ ，如SEQ ID NO.5所示；

所述α2珠蛋白基因的加尾引物为α2-FT和α2-RT，其序列为：

α2-FT：5’-ggcagcaccgacgtagacATcctgaggtcaccgagctgcacTctcccctgcatccctttcag-3’，如SEQ ID NO.6所示，

α2-RT：5’-gccgacgccactgtactcAAtggcgcagagctgaatgaac-3’ ，如SEQ ID NO.7所示，

所述α2珠蛋白基因的TaqMan探针为α2-P，其序列为：

α2-P：5’- HEX - cctgaggtcaccgagctgcactc –BHQ1-3’ ，如SEQ ID NO.8所示；

所述β-actin的加尾引物为β-actin-FT和β-actin-RT，其序列为：

β-actin-FT：5’- ggcagcaccgacgtagacAGTccatcaacttgcgtccacgctcagc tcaggcaggaaa

gacac-3’ ，如SEQ ID NO.9所示，

β-actin-RT：5’-gccgacgccactgtactcacccagcacaatgaagatcaag-3’ ，如SEQ ID NO.10 所示，

所述β-actin的TaqMan探针：

β-actin-P：5’- ROX- ccatcaacttgcgtccacgctc–BHQ2-3’ ，如SEQ ID NO.11所示。

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