CN110656159B - 一种拷贝数变异的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拷贝数变异的检测方法。该方法包括杂交和连接(同时进行)、定量PCR检测两个步骤。杂交是指探针和DNA单链靶序列通过互补配对进行结合,所述探针为上游探针和下游探针,上游探针5’端为通用序列,3’端为与靶向序列互补的序列,下游探针5’端为与靶向序列互补的序列,3’端为通用序列;连接是利用特异性DNA连接酶将杂交后相邻的两段探针连接成一条完整的核酸单链;定量PCR利用两对通用引物进行,然后根据CT值计算出原始DNA的拷贝数目。本发明方法可实现拷贝数变异的检测。该方法简单、无局限性、成本低、特异性极高,且引物可以通用,可实现大规模检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种拷贝数变异的检测方法。
背景技术
拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)指大小从1kb到1Mb范围内亚微观片段拷贝数突变,这些拷贝片段的缺失、复制、倒置等的变异都统称为CNVs。
目前CNVs的检测方法主要有以下几个:多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)、微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparative genomics hybridization,array-CGH)、Affymetrix CNV芯片技术及二代测序技术,实时荧光定量PCR技术(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR),荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)等。
其中微阵列比较基因组杂交(array-CGH)、Affymetrix CNV芯片技术,荧光原位杂交技术(FISH)及二代测序技术适用于全基因组CNVs检测,这些技术较先进,准确性较高,但价格昂贵且大部分应用于未知CNVs的检测。
MLPA,如图1所示,主要是针对特定基因或特定区域进行拷贝数检测的技术,其基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交,之后通过连接、PCR扩增产物通过毛细管电泳分离及数据收集,分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论,此方法主要用于CNVs的验证。其中每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段,一个由化学合成,一个由M13噬菌体衍生法制备,其中由M13噬菌体衍生法制备的探针长度在130~480bp范围内,每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。2002年由Schouten等首次报道,可在同一反应管中对50个不同片段的拷贝数进行检测,但探针设计复杂,流程繁琐。在探针设计方面,MLPA只能通过其下游X端(见图1)的探针长度来进行区分,而探针的长度对于合成及其准确性均会产生影响,所以此方法在探针设计方面存在一定的局限性,制约着其发展和应用。在流程方面,MLPA需要经历杂交、PCR、稀释及变性、毛细管电泳等步骤,流程较复杂,且步骤多,复杂的流程及多步骤对验证结果的准确性会产生一定的影响。现有MLPA技术的缺点有:1.探针制备复杂,且有局限性。探针是分上下游两端设计的,由于MLPA的原理是根据片段长度进行分型,而片段长度过高会带来杂交方面等问题,该技术长度限制在130~480bp范围内,从而有一定的局限性。另外,过长的探针在制备过程中,需要借助合成实验等,周期长且消耗试剂和大量的人力,成本较贵;2.需要合成带荧光基团的引物及分子内标试剂;3.操作流程较复杂,需要经历杂交、连接、PCR、变性和毛细管电泳等操作。
RT-qPCR方法,是一种在DNA扩增反应中,以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法技术,以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量的定量。RT-qPCR目前常用的有染料法和探针法两种。基于染料法的荧光定量PCR技术,如图2,主要流程为:利用SBYR Green的特性,每一轮PCR的复性和延伸阶段,有双链DNA形成则荧光被采集到。伴随着PCR的进行,特异性的基因片段不断积累,SBYR Green不断的与新增加的双链DNA片段结合,荧光信号不断累积,这个过程被仪器采集到。基于探针法的荧光定量PCR技术,如图3,主要流程为:设计的带荧光基团和荧光猝灭基团的探针与目标基因区域通过碱基互补配对的方式结合上,随着PCR反应的进行,带荧光基团的一端被酶水解掉,荧光基团被释放到溶液中,发出的荧光被仪器检测到。伴随着PCR的进行,荧光信号不断累积,这个过程被仪器采集到。现有荧光定量PCR技术的缺点有:1.需要根据不同区域设计不同的引物,且设计的引物都需要进行引物效率验证;2.染料法的荧光定量PCR存在非特异性扩增现象,且重复性较差;3.探针法的荧光定量PCR需要合成带荧光基团的探针,成本高,且一次只能针对一个位点,不利于大规模应用。
目前,亟需一种通用性好、重复性好、操作流程简单、成本低廉的拷贝数检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种拷贝数变异的检测方法。
第一方面,本发明要求保护一种对待测DNA样本中靶标片段的拷贝数进行相对定量的方法。
本发明所提供的一种对待测DNA样本中靶标片段的拷贝数进行相对定量的方法,可包括如下步骤:
(a)根据内参片段和靶标片段设计合成内参探针和检测探针;
所述内参探针为两段断开的短单链核苷酸序列,一段命名为内参上游探针,另一段命名为内参下游探针;所述内参上游探针含位于5’端的通用序列I和位于3’端的能够与所述内参片段完全互补配对的特异性序列I;所述内参下游探针含位于5’端的能够与所述内参片段完全互补配对的特异性序列II和位于3’端的通用序列II的反向互补序列;所述通用序列I和所述通用序列II两者序列不相同,无互补序列,且高度特异。
进一步地,所述特异性序列I中位于3’末端的第一个碱基和所述特异性序列II中位于5’末端的第一个碱基在所述内参片段上为相邻的两个碱基。
所述检测探针为两段断开的短单链核苷酸序列,一段命名为检测上游探针,另一段命名为检测下游探针;所述检测上游探针含位于5’端的通用序列III和位于3’端的能够与所述靶标片段完全互补配对的特异性序列III;所述检测下游探针含位于5’端的能够与所述靶标片段完全互补配对的特异性序列IV和位于3’端的通用序列IV的反向互补序列;所述通用序列III和所述通用序列IV两者序列不相同,无互补序列,且高度特异。
进一步地,所述特异性序列III中位于3’末端的第一个碱基和所述特异性序列IV中位于5’末端的第一个碱基在所述靶标片段上为相邻的两个碱基。
其中,组成所述内参探针和所述检测探针的两段断开的短单链核苷酸序列的具体长度可根据所述内参片段和所述靶标片段的每个拷贝数序列的长度而确定。在本发明的具体实施方式中,组成所述内参探针和所述检测探针的两段断开的短单链核苷酸序列每段长度40~60nt;相应的,所述通用序列I-IV以及所述特异性序列I-IV的长度均在20nt左右。
(b)将所述内参探针和所述检测探针分别对待测DNA样本和参照DNA样本进行杂交,并使用特异性DNA连接酶将完全杂交的相邻探针连接起来,形成完整的DNA链,得到杂交连接产物。
所述特异性DNA连接酶具有如下特性:只有当靶序列(这里的“靶序列”指的是所述待测DNA样本和所述参照DNA样本中的所述内参片段或所述靶标片段)与探针中的特异性序列(这里的“探针中的特异性序列”指的是所述内参探针中的所述特异型性序列I、所述特异性序列II和所述检测探针中的所述特异性序列III和所述特异性序列IV)完全互补,所述特异性DNA连接酶才能将两段杂交后相邻的探针(这里的“两段杂交后相邻的探针”指的是所述内参上游探针和所述内参下游探针,或者所述检测上游探针和所述检测下游探针)连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针中的特异性序列不完全互补,即使只有一个碱基的差别,就会导致杂交不完全,连接反应都无法进行。
(c)分别采用内参引物对和检测引物对对所述杂交连接产物进行同条件下的实时荧光定量PCR检测;所述内参引物对由序列分别如所述通用序列I和所述通用序列II所示的两条单链DNA组成;所述检测引物对由序列分别如所述通用序列III和所述通用序列IV所示的两条单链DNA组成;然后根据CT值对所述待测DNA样本中所述靶标片段进行相对拷贝数计算。
进一步地,可根据拷贝数计算公式:N*2-ΔΔCT(这里的N指物种的理论拷贝数,人类的理论拷贝数为2),其中ΔΔCT计算公式:(待测样本DNA的靶标片段的CT值-待测DNA样本的内参片段的CT值)-(参照DNA样本的靶标片段的CT值-参照DNA样本的内参片段的CT值),计算所述待测DNA样本中所述靶标片段的拷贝数。
进一步地,所述内参下游探针和所述检测下游探针中位于5’末端的第一个碱基进行磷酸化修饰。
进一步地,所述特异性DNA连接酶可为Taq DNA连接酶。Taq DNA连接酶是一种热稳定性连接酶,能够催化磷酸二酯键的形成,使与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5′-磷酸末端和3′-羟基末端通过磷酸二酯键相连。Taq DNA连接酶催化的连接反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对,并且两条寡核苷酸链之间没有空隙的条件下才可发生。Taq DNA连接酶在高温环境具有较强的活性,在95℃条件下,经过90分钟还能保持50%以上的活性,所以可以利用它来同时进行杂交和连接反应。
在本发明的具体实施方式中,所述Taq DNA连接酶具体为HiFi Taq DNA连接酶。该酶具有更高保真性和特异性。
进一步地,步骤(b)中,将所述内参探针和所述检测探针分别对待测DNA样本和参照DNA样本进行杂交为如下:
将所述内参探针、所述检测探针和所述待测DNA样本置于一个体系中进行杂交,将所述内参探针、所述检测探针和所述参照DNA样本置于另一个体系中进行杂交;所述通用序列I、所述通用序列II、所述通用序列III和所述通用序列IV四者序列不相同,无互补序列,且高度特异;
进一步地,步骤(b)中,所述内参探针和所述检测探针在反应体系中是足量的。在本发明的具体实施方式中,各探针(这里的“各探针”指的是所述内参上游探针、所述内参下游探针、所述检测上游探针和所述检测下游探针)与所述待测DNA样本或所述参照DNA样本的质量比均具体为2.5:1。
进一步地,步骤(b)中,还可包括加入EDTA终止反应的步骤。
更进一步地,所述EDTA的终浓度为10mM。
更加具体地,所述(b)可按照如下进行:将探针(这里的“探针”为所述内参探针和所述检测探针)、所述待测DNA样本(或所述参照DNA样本)和所述特异性DNA连接酶置于同一个体系中,然后按照如下程序进行反应:95℃5min;95℃20s,65℃180min,4个循环;98℃2min;4℃保存;反应结束后半小时内加入EDTA至其终浓度为10mM。
进一步地,步骤(c)中进行的所述实时荧光定量PCR可为基于染料法的实时荧光定量PCR。
更进一步地,所述基于染料法的实时荧光定量PCR中所采用的染料可为SBYRGreen试剂。
进一步地,所述通用序列I为SEQ ID No.1的第1-19位;所述通用序列II为SEQ IDNo.2的第23-42位的反向互补序列。所述通用序列III为SEQ ID No.3的第1-20位;所述通用序列IV为SEQ ID No.4的第21-39位的反向互补序列。
在实际操作中,所述内参片段和所述靶标片段均可为一个或多个。相应的,所述内参探针和所述靶标探针也均可为一个或多个。当为多个靶标片段时,既可以针对每个靶标片段采用同样的通用引物设计,然后针对每个靶标片段各配制一个体系进行杂交连接;也可以针对不同靶标片段采用不同的通用引物设计,然后针对不同的靶标片段均配制于同一体系中进行杂交连接。
在本发明的具体实施方式中,所述内参片段具体为5’-GGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCG-3’(SEQ ID No.11),即GADPH基因的坐标:6644720-6644763(reference GRCH37)。所述靶标片段具体为靶标片段1或靶标片段2;所述靶标片段1具体为5’-CTTGCCTGCACAGAAACATACATTGTTGGTGTTGTTGTGACAGC-3’(SEQ ID No.12),即OR4S2基因的坐标:55418932-55418975位点(reference GRCH37);所述靶标片段2具体为5’-GTCACTGTCTCCATAGCAACGATGCCTACCCACTCCATCA AGA-3’(SEQ ID No.13),即GRHL1基因的坐标:10101329-10101371(reference GRCH37)。相应的,所述内参探针的上游探针(即所述内参上游探针)的序列具体为SEQ ID No.1,所述内参探针的下游探针(即所述内参下游探针)的序列具体为SEQ ID No.2;所述检测探针的上游探针(即所述检测上游探针)的序列具体为SEQ ID No.3或SEQ ID No.5,所述检测探针的下游探针(即所述检测下游探针)的序列具体为SEQ ID No.4或SEQ ID No.6(其中,SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为一对,针对的是所述靶标片段1;SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为一对,针对的是所述靶标片段2);所述内参引物对具体为由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的引物对;所述检测引物对具体为由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的引物对。
在本发明的具体实施方式中,所述待测DNA样本为疑似拷贝数变异的患者样本;所述参照DNA样本为正常男性样本。
第二方面,本发明要求保护一种获得内参探针和检测探针的方法。
本发明所提供的获得内参探针和检测探针的方法,包括前文第一方面所述方法中的步骤(a)。
第三方面,本发明要求保护如下任一应用:
(A1)前文第二方面所述方法在对待测DNA样本中靶标片段的拷贝数进行相对定量中的应用;
(A2)前文第一方面所述方法或前文第二方面所述方法在检测拷贝数变异中的应用。
前文第一方面所述方法或前文第二方面所述方法在如下任一领域的应用均理解为本发明的保护范围:RNA文库构建及定量领域;降解DNA的检测领域;SNP分型领域等。
在第一方面、第二方面和第三方面中,所述待测DNA样本均可为基因组DNA样本。
另外,本发明是在分子领域,在拷贝数变异检测方面,可能会在探针方面、杂交和连接方面存在改进或变形;可能在内参方面会做双内参或多内参的方法,来做替换或变形;另外在检测方面,可能会存在用更先进的检测设备,如数字PCR仪等进行检测;可能会在多重探针方面做更多通用引物及相应的探针通用序列的改进。以上均属于本发明的保护范围。
本发明方法可实现拷贝数变异的检测。该方法简单、无局限性、成本低、特异性极高,且引物可以通用,可实现大规模检测。其有益效果具体如下:
1、不存在局限性,制备简单:克服了探针长短受限的问题,使探针的制备更简单更方便,利用常规的引物合成即可做到探针的合成。
2、成本低:检测成本更低,由于不需要合成带荧光基团的引物或探针,且不需要分子内标等试剂及变性剂,使得成本大大的降低。
3、通用性好:操作更简便快捷,通用的引物使得不需要每个位点设计一对引物,以及省去了每对引物效率验证等操作,节省了时间,同时通用的引物使得在进行定量PCR时操作更简便。
4、特异性好:结果更准确,特异性的引物,使得不存在非特异性的扩增,从而提高了结果的准确性。
5、工序更节省:此方法使用HiFi Taq DNA连接酶把杂交和连接快速的结合在一起进行,同时使用荧光定量PCR方法使检测和定量同时进行,使得工序更加节省,快捷,效率大大的提升。
附图说明
图1为MLPA的原理图。
图2为基于SBYR green染料法的实时荧光定量PCR的原理图。
图3为基于taqman探针法的的实时荧光定量PCR原理图。
图4为本发明的原理图。
图5为拷贝数计算结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中探针和引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司;1×TE缓冲液为AMBION公司的TE(PH 8.0)缓冲液;Taq连接酶及其缓冲液为New England Biolabs(NEB)的HiFi Taq DNA Ligase;荧光定量预混试剂为TAKARA的TB GreenTMPremix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus);qubit HS试剂为INVITROGEN的Qubit dsDNA HS Assay kit2.0Fluorometer。
实施例1、拷贝数变异检测方法的建立
本发明原理图如图4,包括杂交和连接(同时进行)、定量PCR检测两个步骤。
本发明的杂交是指探针和DNA单链靶序列通过互补配对进行结合。进一步的,杂交是在缓冲液存在的情况下进行的探针和单链DNA靶序列的结合;再进一步的,所述探针为两段短的单链核苷酸序列,每段长度约40~60nt左右,左端的为上游探针,右端的为下游探针。进一步的,上游探针含5’端约20nt通用序列(P1或P3相同的序列)和3’端约20nt与靶向序列互补的序列(A1或A3);进一步的,下游探针含5’端约20nt与靶向序列互补的序列(A2或A4)和3’端约20nt通用序列(P2或P4相同的序列的反向互补序列)。
本发明的连接是利用特异性的连接酶进行的反应。进一步的,这种特异指只有当两个探针与靶序列完全杂交,即靶序列与探针特异性序列完全互补,连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有一个碱基的差别,就会导致杂交不完全,使连接反应无法进行。进一步的,本发明采用的连接酶是Taq DNA连接酶。Taq DNA连接酶是,是一种热稳定性连接酶,能够催化磷酸二酯键的形成,使与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5′-磷酸末端和3′-羟基末端通过磷酸二酯键相连。Taq DNA连接酶催化的连接反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对,并且两条寡核苷酸链之间没有空隙的条件下才可发生。Taq DNA连接酶在高温环境具有较强的活性,在95℃条件下,经过90分钟还能保持50%以上的活性,所以可以利用它来同时进行杂交和连接反应。
本发明的定量PCR,是利用染料,进一步的,染料是SBYR Green试剂,利用两对通用引物进行定量PCR实验,然后根据CT值计算出原始DNA的拷贝数目。这两对通用引物序列不相同,无互补序列,且高度特异。
基于以上原理可实现拷贝数变异的检测。该方法简单、无局限性、成本低、特异性极高,且引物可以通用,可实现大规模检测。
下面将详述采用50ng基因组DNA用量进行方法测试的情况。
1、设计和订购探针和引物,探针有A、B、C、D,引物有公用引物对1的左引物、公用引物对1的右引物、公用引物对2的左引物、公用引物对2的右引物,序列(5’-3’)如下:
A序列:CGCACCTTCAGGACCTCAAGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAG
B序列:磷酸化TTGGAAAAGGACATTTCCACCGACTACGAGAACTACCGCTGC
C序列:CAAGCAGAAGACGGCATACG(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX)
D序列:磷酸化XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCGGTGGTCGCCGTATCATT
公用引物对1的左引物序列(P1):CGCACCTTCAGGACCTCAA(SEQ ID No.7);
公用引物对1的右引物序列(P2):GCAGCGGTAGTTCTCGTAGT(SEQ ID No.8);
公用引物对2的左引物序列(P3):CAAGCAGAAGACGGCATACG(SEQ ID No.9);
公用引物对2的右引物序列(P4):AATGATACGGCGACCACCG(SEQ ID No.10);
其中,A和B分别为内参探针的上游探针和下游探针,下划线部分为通用序列或其反向互补序列;C和D分别为检测探针的上游探针和下游探针,下划线部分为通用序列或其反向互补序列。C序列和D序列中的X代表不确定的序列,需要根据具体序列设计。
内参探针所针对的内参片段为GADPH基因的坐标:6644720-6644763(referenceGRCH37),具体序列如下:
5’-GGAGAAGCTGAGTCATGGGTAGTTGGAAAAGGACATTTCCACCG-3’(SEQ ID No.11)。
2、杂交和连接
(1)样本准备:将待测样本(编号SZCH033)和参照样本(编号ZTD)DNA(基因组DNA)用qubit HS试剂进行精确定量,然后稀释至20ng/μl作为待测DNA样本待用。其中,待测样本为疑似拷贝数变异的患者样本;参照样本为检测区域无拷贝数变化的正常男性样本。
(2)按如下表1中体系制备50ng基因组DNA杂交和连接体系:
表1 50ng基因组DNA杂交和连接体系
组分 | 用量 |
1×TE | 4.25μl |
探针混合液(10pmol/μl) | 1μl |
10×Hifi Taq连接缓冲液 | 2μl |
待测样本或参照样本(20ng/μl) | 2.5μl |
Hifi Taq连接酶 | 0.4μl |
ddH2O | 9.85μl |
注:A-D四个探针在探针混合液中的终浓度均为10pmol/μl。根据thermofisher提供的ssDNA换算方式,40nt的ssDNA,81.25pmol约为1μg,所以10pmol探针,就约为125ng,所以本反应体系中探针和待测样本或参照样本的质量比约为2.5:1。该体系中只要探针量足够即可。
进一步地,本实施例的探针混合液包含如下序列(5’-3’)的NO.1、NO.2、NO.3、NO.4或者NO.1、NO.2、NO.5、NO.6:
No.1:CGCACCTTCAGGACCTCAAGGAGAAGCTGAGTCATGGGTAG(SEQ ID No.1);
No.2:磷酸化TTGGAAAAGGACATTTCCACCGACTACGAGAACTACCGCTGC(SEQ ID No.2);
No.3:CAAGCAGAAGACGGCATACGCTTGCCTGCACAGAAACATACATT(SEQ ID No.3);
No.4:磷酸化GTTGGTGTTGTTGTGACAGCCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID No.4);
No.5:CAAGCAGAAGACGGCATACGGTCACTGTCTCCATAGCAACGAT(SEQ ID No.5);
No.6:磷酸化GCCTACCCACTCCATCAAGACGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ ID No.6)。
其中,No.1和No.2分别为内参探针的上游探针和下游探针,下划线部分为通用序列或其反向互补序列;No.3和No.4分别为针对检测区域1的检测探针的上游探针和下游探针,下划线部分为通用序列或其反向互补序列;No.5和No.6分别为针对检测区域2的检测探针的上游探针和下游探针,下划线部分为通用序列或其反向互补序列。
检测区域1为OR4S2基因的坐标:55418932-55418975位点(reference GRCH37),其具体序列如下:
5’-CTTGCCTGCACAGAAACATACATTGTTGGTGTTGTTGTGACAGC-3’(SEQ ID No.12)。
检测区域2为GRHL1基因的坐标:10101329-10101371(reference GRCH37),其具体序列如下:
5’-GTCACTGTCTCCATAGCAACGATGCCTACCCACTCCATCA AGA-3’(SEQ ID No.13)。
震荡混匀后将PCR管置于PCR仪中,按如下表2中程序进行反应:
表2杂交连接反应程序
反应结束后半小时内加入1μl浓度为400mM的EDTA,然后加水19μl(EDTA的终浓度为10mM),混匀。
3、实时荧光定量PCR检测
按如下表3中体系制备荧光定量PCR体系(1个反应的体系):
表3荧光定量PCR体系(1个反应的体系)
震荡混匀后将PCR管置于PCR仪中,选择相对定量、SBYR@green试剂及cDNA模式,按如下表4中程序进行反应:
表4实时荧光定量PCR反应程序
4、数据分析及计算
查看溶解曲线,扩增曲线,阈值,基线等信息,如遇到阈值或基线不正常时进行手工校正。根据拷贝数的相对定量计算公式计算出待测样本的拷贝数值。
拷贝数=N*2-ΔΔCT,N指物种的理论拷贝数,这里N指人类的理论拷贝数,该理论拷贝数为2;
另外ΔΔCT计算公式:(待测样本靶标CT值-待测样本内参CT值)-(参照样本靶标CT值-参照样本内参CT值);
上述步骤3得到的荧光定量的CT值如表5所示。测试包含待测样本和参照样本各1例,共2例样本,分别命名为SZCH033和ZTD;测试设置2个待检测区域,分别命名为target1,target2;另外本次测试每个样本重复3次。
表5荧光定量的CT值结果
最终计算结果如图5所示。该结果经CMA结果检测(染色体芯片分析技术,由南京市妇幼保健院完成,该技术是现有领域公知的技术,在业内作为拷贝数变异检测公认的技术),结果一致(即SZCH033的CMA结果在55386216-55452964这个区域的检测结果,与本发明的SZCH033-targert1结果一致,即都是del;同理,SZCH033的CMA结果在107121377-107325985这个区域的检测结果,与本发明的SZCH033-targert2结果一致,即都是dup),结果见表6。以上结果说明,本实施例所用的方法能够成功应用于拷贝数变异检测。
表6染色体基因芯片分析(Chromosomal Microarray Analysis,CMA)检测结果
本实施例只提供3个检测区域(含内参),此技术可以涉及更多重的检测。
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<160> 13
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<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cgcaccttca ggacctcaag gagaagctga gtcatgggta g 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ttggaaaagg acatttccac cgactacgag aactaccgct gc 42
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
caagcagaag acggcatacg cttgcctgca cagaaacata catt 44
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gttggtgttg ttgtgacagc cggtggtcgc cgtatcatt 39
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
caagcagaag acggcatacg gtcactgtct ccatagcaac gat 43
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gcctacccac tccatcaaga cggtggtcgc cgtatcatt 39
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cgcaccttca ggacctcaa 19
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gcagcggtag ttctcgtagt 20
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
caagcagaag acggcatacg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
aatgatacgg cgaccaccg 19
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ggagaagctg agtcatgggt agttggaaaa ggacatttcc accg 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
cttgcctgca cagaaacata cattgttggt gttgttgtga cagc 44
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gtcactgtct ccatagcaac gatgcctacc cactccatca aga 43
Claims (11)
1.一种对待测DNA样本中靶标片段的拷贝数进行相对定量的非疾病诊断治疗方法,包括如下步骤:
(a)根据内参片段和靶标片段设计合成内参探针和检测探针;
所述内参探针为两段断开的短单链核苷酸序列,一段命名为内参上游探针,另一段命名为内参下游探针;所述内参上游探针含位于5’端的通用序列I和位于3’端的能够与所述内参片段完全互补配对的特异性序列I;所述内参下游探针含位于5’端的能够与所述内参片段完全互补配对的特异性序列II和位于3’端的通用序列II的反向互补序列;所述通用序列I和所述通用序列II两者序列不相同,无互补序列;
所述特异性序列I中位于3’末端的第一个碱基和所述特异性序列II中位于5’末端的第一个碱基在所述内参片段上为相邻的两个碱基;
所述检测探针为两段断开的短单链核苷酸序列,一段命名为检测上游探针,另一段命名为检测下游探针;所述检测上游探针含位于5’端的通用序列III和位于3’端的能够与所述靶标片段完全互补配对的特异性序列III;所述检测下游探针含位于5’端的能够与所述靶标片段完全互补配对的特异性序列IV和位于3’端的通用序列IV的反向互补序列;所述通用序列III和所述通用序列IV两者序列不相同,无互补序列;
所述特异性序列III中位于3’末端的第一个碱基和所述特异性序列IV中位于5’末端的第一个碱基在所述靶标片段上为相邻的两个碱基;
组成所述内参探针和所述检测探针的两段断开的短单链核苷酸序列每段长度40~60nt;(b)将所述内参探针和所述检测探针对待测DNA样本进行杂交,并使用特异性DNA连接酶将完全杂交的相邻探针连接起来,形成完整的DNA链,得到杂交连接产物I;将所述内参探针和所述检测探针对参照DNA样本进行杂交,并使用所述特异性DNA连接酶将完全杂交的相邻探针连接起来,形成完整的DNA链,得到杂交连接产物II;
所述特异性DNA连接酶具有如下特性:只有当靶序列与探针中的特异性序列完全互补,所述特异性DNA连接酶才能将两段杂交后相邻的探针连接成一条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针中的特异性序列不完全互补,连接反应无法进行;
(c)针对所述杂交连接产物I和所述杂交连接产物II,均采用内参引物对和检测引物对分别进行同条件下的实时荧光定量PCR检测;所述内参引物对由序列分别如所述通用序列I和所述通用序列II所示的两条单链DNA组成;所述检测引物对由序列分别如所述通用序列III和所述通用序列IV所示的两条单链DNA组成;然后根据CT值对所述待测DNA样本中所述靶标片段进行相对拷贝数计算;
所述特异性DNA连接酶为Taq DNA连接酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述内参下游探针和所述检测下游探针中位于5’末端的第一个碱基进行磷酸化修饰。
3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述Taq DNA连接酶为HiFi Taq DNA连接酶。
4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述(b)是按照如下进行的:将所述内参探针、所述检测探针、所述待测DNA样本,以及所述特异性DNA连接酶置于一个体系中;将所述内参探针、所述检测探针、所述参照DNA样本,以及所述特异性DNA连接酶置于另一个体系中;然后两个体系均按照如下程序进行反应:95℃ 5min;95℃ 20s,65℃ 180min,4个循环;98℃ 2min。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(b)中,还包括加入EDTA终止反应的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述EDTA的终浓度为10mM。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(c)中进行的所述实时荧光定量PCR为基于染料法的实时荧光定量PCR。
8. 根据权利要求7所述的方法,其特征在于:所述基于染料法的实时荧光定量PCR中所采用的染料为SBYR Green试剂。
9. 根据权利要求1-8中任一所述的方法,其特征在于:所述通用序列I为SEQ ID No.1的第1-19位;所述通用序列II为SEQ ID No.2的第23-42位的反向互补序列。
10. 根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述通用序列III为SEQ ID No.3的第1-20位;所述通用序列IV为SEQ ID No.4的第21-39位的反向互补序列。
11.权利要求1-10中任一所述方法在检测拷贝数变异中的非疾病诊断治疗应用。
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CN110656159A (zh) | 2020-01-07 |
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