CN103805706A - 一种快速检测snp位点的四重荧光定量试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种直接使用TaqMan探针检测SNP位点的试剂盒，涉及到10个常染色体SNP位点。每个SNP位点对应于两条上下游引物及特异性的两条TaqMan探针，并且将10个SNP位点分为5组体系，于单管反应体系中同时对2个SNP位点进行检测。探针选择FAM，HEX，CY5，ROX四种通道。本发明试剂盒采用四重探针检测技术，通过特异性扩增，于单个反应体系中检测出两个SNP位点的信息。此试剂盒用于法医个体诊断，检测快捷迅速，个体识别率高达98.14%；又因适用于试剂盒的定量PCR仪器携带方便，可车载直接用于犯罪现场进行勘测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种四重（四种探针）实时荧光定量PCR在同一反应管内同时检测两个SNP位点的检测方法，总共检测10个SNP位点。可应用于法医现场快速检测。
背景技术
SNP是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在群体中的发生频率不小于1%。包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。所谓转换是指同型碱基之间的转换，如嘌呤与嘌呤(G→A)、嘧啶与嘧啶(T→C)间的替换；所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A→T、A→C、C→G、G→T)之间的替换。依据排列组合原理，SNP一共可以有6种替换情况，即A/G、A/T、A/C、C/G、C/T和G/T，但事实上，转换的发生频率占多数，而且是C/T转换为主，其原因是CpG的C是甲基化的，容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T，CpG也因此变为突变热点。
随着人类基因组序列的绘制完成,生命科学领域的研究热点正迅速转向对基因功能、表达调控、多个基因间以及基因和环境间相互作用等方面。对基因组序列中单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)的研究是该阶段的重要研究内容之一。
SNP作为人类的第三代分子标记，具有数量多、密度大、分布广等特点，可用于疾病基因的定位与克隆、关联分析等，并在疾病的早期诊断、预防和治疗等方面体现重要功能和应用价值。SNP具有丰富的位点，在基因组中的分布几乎遍及整个基因组。据估计，平均约1000bp就会出现一个SNP，但不同基因组之间、同一基因组不同的染色体之间，编码区及非编码区的SNP分布频率都不同。在人类基因中，平均每1900个碱基对出现1个SNP。
因此，SNP标记在个体识别中亦能提供重要的遗传数据，于法医检测分析中也极具重要性。现今SNP的分型检测技术种类繁多，各有利弊，探索和建立准确、快速、高通量的SNP检测方法仍然十分必要。
TaqMan探针技术是一种通过检测PCR过程中和PCR之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP检测技术。为特异地识别待检SNP位点，需要一对TaqMan探针及其对应上下引物。这对探针分别检测SNP位点的两种等位基因，其3’端连有荧光淬灭剂，5’端分别连有两种不同的荧光染料。在PCR扩增过程中，利用Taq酶5’核酸酶活性降解与目标序列完全互补的探针，并使荧光剂与淬灭剂分离而发出荧光。如果探针与目标序列间存在错配，就会大大减少荧光的释放量。TaqMan探针技术最突出的优点是不需要分离或洗脱等PCR后处理过程，从而提高了检测速度。
荧光定量PCR技术是一项发展较为成熟的核酸检测方法。其优势在于：操作性强，因闭盖操作可减少污染，结果分析快捷。只要选择体积较小便携式的仪器，则可实现实时现场的案件侦测。故采用荧光定量PCR技术及TaqMan探针方法检测多重SNP位点。
Thermo PikoReal荧光定量PCR仪器拥有5通道，分别是FAM，HEX，CY5，ROX，SYBGreen等。单个位点检测需要两种荧光标记的探针分别对应于FAM，HEX通道或者CY5，ROX通道。
发明内容
本发明的目的是提供一种四重实时荧光定量PCR的SNP检测试剂盒，其可以实现快速的检测，能用于法医现场快速检测SNP位点。具体的技术方案如下：
一种快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，包括有用于扩增如下10个SNP位点所对应的引物：rs921115(NT_022184)、rs1009480(NT_022517)、rs560681(NT_079484)、rs1019029(NT_007819)、rs7205345(NT_010552)、rs315791(NT_023133)、rs1979255(NT_022792)、rs7015070(NT_030737)、rs985492(NT_010966)、rs354439(NT_009952)。括号内为genebank登记号。
以上10个SNP位点均查询自美国国立生物技术信息中心（NCBI），属于非疾病相关基因，均为单碱基替换的SNP位点，在亚洲人群中存在较高的多态性；选择的位点的双等位基因出现的机会较为均等（见表1），以提高个体识别率。
进一步，每个位点所对应的引物中包括有上、下游引物和TaqMan探针。
进一步，上述的10个SNP位点对应的引物可以以2个为一组进行复合扩增。采用这样的目的是可以提高检测效率，在尽量短的、简洁的步骤之内就可以完成10个位点的检测。在设计引物时，需要针对位点所在的序列分别设计一条上游引物和下游引物，另外，还需要针对SNP的位点分别设计一条针对野生型的引物探针和一条针对变异型的引物探针，那么对于一个位点就会有4条引物，当使用在单管内同时对2个位点进行多重扩增时，就会有8条引物在同一个扩增体系中。
进一步，在试剂盒中还包括有纯合子标准品和杂合子标准品。单个SNP位点具有3种分型，两种纯合子型以及一种杂合子型。针对一组体系，应用到两种纯合子标准品及一种杂合子标准品。此时，该纯合子标准品同时对应于两个SNP位点的纯合子型，而杂合子标准品则对应于两个SNP位点的杂合子型。标准品均由含SNP位点扩增片段的质粒组成。故一组体系的纯合子标准品则由2种质粒构成，而杂合子标准品则有4种质粒构成。体系1的纯合子标准品1由rs921115C型及rs1009480C型组成，其对应的检测荧光报告基团分别为FAM及CY5，纯合子标准品2由rs921115G型及rs1009480T型组成，其检测荧光报告基团分别为HEX及ROX，杂合子标准品3则由rs921115C型，rs921115G型，rs1009480C型，及rs1009480T型四种质粒标准品混合而成，其检测荧光报告集团分别为FAM，HEX，CY5及ROX。其他体系的质粒标准品组合与此类似。标准品中同种质粒的拷贝数一致。表1即为质粒标准品的拷贝数统计。标准品的制备可以根据已经公开的SNP序列采用常规的T-A克隆方法制备得到。
表1各个质粒标准品的拷贝数
进一步，各个位点的分组如下：第1组，rs921115、rs1009480；第2组，rs560681、rs1019029；第3组，rs7205345、rs315791；第4组，rs1979255、rs7015070；第5组，rs985492、rs354439。
进一步，在同一个组中的4个引物探针是用不同荧光色进行标记的。
进一步，4个引物探针的荧光标记色选自FAM、HEX、CY5、ROX。SNP位点探针所对应的SNP分型及对应的等位基因频率如下表（表2）所示。单组体系检测通过四重荧光定量PCR实现，故使用5’端荧光标记基团为FAM，HEX，CY5，ROX的探针进行SNP分型检测。FAM，HEX探针对应于一个SNP位点，CY5，ROX探针用于检测另一个SNP位点。
表2各个SNP位点对应的探针的等位基因及其频率
最终探针引物的设计及浓度如表3。
表3各个SNP位点对应的引物和探针的序列和浓度
有益效果
此试剂盒用于法医个体诊断，检测快捷迅速，根据表2各SNP位点的等位基因频率Pi，参照公式个体识别率(PD)高达98.14%（样本数N=1000，中国汉族人群）；又因适用于试剂盒的定量PCR仪器携带方便，可车载直接用于犯罪现场进行勘测。样本检测时间较为短暂，检测时间控制在70min以内。
附图说明
图1a与图1b是对照例1中样本于rs354439位点的扩增曲线图的比对（图1a的T型等位基因采用最初的探针，图1b为T型等位基因探针修改后的扩增曲线）
图2a与图2b是对照例2种样本于rs1979255位点的扩增曲线图的比对（图2a的C型等位基因的探针浓度为0.25μM，图2b的C型等位基因的探针浓度为1μM）
图3是实施例2中样本于rs921115位点扩增曲线图
图4是实施例2中样本于rs1009480位点的扩增曲线图
图5是实施例2中样本于rs921115位点的SNP分型散点图
图6是实施例2中样本于rs1009480位点的SNP分型散点图
图7犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs921115位点的分型结果
图8犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs1009480位点的分型结果
图9犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs560681位点的分型结果
图10犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs1019029位点的分型结果
图11犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs7205345位点的分型结果
图12犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs315791位点的分型结果
图13犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs1979255位点的分型结果
图14犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs7015070位点的分型结果
图15犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs985492位点的分型结果
图16犯罪嫌疑人与疑犯儿子在rs354439位点的分型结果
图17为采用TaqMan探针法检测一个SNP的过程示意图
图5～图16中，为样本检测结果的分型散点图，图中靠近X和Y坐标轴的标示有实心圆（框）的连线为纯合子标准品测定的标准曲线，斜向的标示有实心圆(框)的连线为杂合子标准品测定的标准曲线。图中的空心框或者空心圆为待测样本的测定散点。标准曲线坐标值即为最终检测的荧光信号RFU。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1试剂盒中各个位点对应的引物设计，以及试剂盒组成、扩增程序的确定
引物及探针的设计直接关系到SNP位点的准确分型。其遵守设计原则：①探针5’端尽可能靠近上游引物②因G碱基的荧光淬灭作用，5’端避免用G碱基③整条探针的C碱基高于G碱基④因使用探针检测SNP位点的特异性，探针中包含有SNP位点，一般将SNP位点放于探针3’端2个碱基的前方⑤探针需要绝对的保守。检测同一SNP位点的两条探针除待检测的碱基的区分外，其长度及组成碱基稍有区别，以提高探针的单一性及特异性。⑥探针的退火温度高于上下游引物的退火温度，一般为10度；为保证单管内每个反应的同步性，引物的退火温度尽量保持一致（一般60℃左右，oligo6.0计算）。
为保证检测的准确性，单个位点的两条探针的扩增效率尽量保持一致。探针与模板的结合能力及探针的特异性是保证检测准确的重要的因素，但结合能力强的探针特异性偏弱，可能引发非特异扩增，影响到最终的分型结果。当待检模板为杂合子时，两条探针为竞争关系；而在检测纯合子模板时，探针的特异性尤为重要，否则会引发纯合子误判为杂合子的错误分型。探针的退火温度，定量体系中探针的浓度选择，以及SNP位点在探针碱基组成的位置均与探针模板间结合速率，探针特异识别模板的能力有直接的相关性。探针中SNP位点与5’端的距离关系到探针特异识别能力，一般将SNP位点放置于距3’端1/3处；探针的退火温度影响到探针与对应模板的结合速率，退火温度的增加有益于探针与模板的结合速率。故两条探针的位置错开，以使退火温度尽量保持一致；探针的浓度则体现为最终收集的荧光RFU值。探针浓度升高，最终收集荧光值亦会增加。
综合考虑以上三个关键因素，对引物探针的设计及浓度进行优化，以杂合子检测的均衡性（两种探针的荧光RFU值的差异不低于70%），纯合子的检测特异性（另一等位基因所对应的扩增曲线的RFU值低于50）为基本评判标准，最终探针引物的设计、以及引物和探针浓度如表2。10个位点对应的引物和探针分为5组，每组2个位点，在同一个体系中进行多重扩增。其中，第1组，rs921115、rs1009480；第2组，rs560681、rs1019029；第3组，rs7205345、rs315791；第4组，rs1979255、rs7015070；第5组，rs985492、rs354439。根据oligo6.0对各引物探针的性能的评价，将10个SNP位点进行上述分组时，可保证基因座间的引物二聚体，发夹结构等参数在一定范围内，以减少引物非特异结合或扩增的消耗。(在本发明中，以上各组在进行复合体系扩增时，每组亦可被称为体系，例如：第1组在复合扩增时称为体系1)
最终确定了一种快速检测SNP位点的四重荧光定量检测试剂盒，包括5组SNP位点检测体系。每组体系均有Reaction Mix，引物及探针混合物，标准品。Reaction Mix即为2.5*的定量PCR反应液，反应体系的配制：Reaction Mix取8μl，引物和探针的混合液4μl，c-Taq酶0.6μl，DNA提取液0.5ng-2ng，补水至20μl。反应液置于仪器配套的八联管中，闭管检测。Reaction Mix组成（终浓度为1×）：Tris-HCl浓度为50mM，KCl50mM，BSA1.2mg/ml，MgCl2为2.4mM，dNTP为0.2mM，甜菜碱0.6M，Tween-20体积占2%，剩余成分为水。一个SNP位点具有一对上下游引物及一对针对双等位基因的特异性探针。故一组体系的引物及探针混合物包含4条上下游引物及4条特异性探针，5’端的报告基因分别为FAM，HEX，CY5及ROX。一组体系使用一组标准品，包括两种纯合子标准品及一种杂合子标准品，均由已知分型结果的质粒以一定的浓度构成。纯合子标准品用于识别纯合子型，杂合子标准品则可用于鉴定杂合子基因型。对标准品进行检测，杂合子标准品的扩增曲线的均衡型较好，而纯合子标准品的扩增特异性良好，无非特异扩增曲线。故本试剂盒对标准品的分型结果良好。
最终确定的扩增程序是：25℃1min收集荧光；95℃2min热变性；95℃15s，60℃50s，共进行40个循环；25℃1min收集荧光。
使用此试剂盒对样本进行SNP分型时，需要3种标准品及一个阴性对照。标准品及阴性对照生成标准曲线，通过对样本的荧光信号的数据进行统计并分区，从而得到SNP分型结果。试剂盒保存于-20℃。
对照例
在试验过程中，引物及探针的设计直接影响到最终的结果判断，尤其体现在探针的设计及浓度选择上。探针包含的SNP位点与5’端的距离，探针浓度的选择及其退火温度对于检测的准确性极为重要。非特异扩增曲线或杂合子扩增曲线的不均衡有可能导致分型结果的误判，但可通过调节探针浓度及寡核苷酸序列进行修正，通过大量试验及分析，最终获得了如实施例1中所示的扩增引物及探针序列。以下列举在试验过程中的其它一些例证：
对照例1：体系五（rs985492，rs354439）检测一例受试者（以下称为人体样本A）（DNA模板浓度0.5ng/μl），取2μl于25μl反应体系中检测。结果显示人体样本A于rs985492位点为C型等位基因，于rs354439位点的检测结果为T/A型杂合子（图1a）。rs985492位点的测序结果与检测结果一致，而于rs354439位点测序结果为显示为T型纯合子，出现了误判。后修改rs354439位点检测T型等位基因的探针（原探针序列5’-CACATTCCTTTTAAG-3’，SEQID NO.41)，向5’端移动2个碱基，同时探针碱基数增至17以提高退火温度(现探针序列5’-CACATTCCTTTTAAGCA-3’)，最终扩增曲线显示其为T型纯合子（图1b），使其检测结果与标准品一致。
对照例2：体系四(rs1979255,rs7015070)检测另一例受试者（以下称为人体样本B）（DNA模板浓度0.5ng/μl），取2μl于25μl反应体系中检测。其理论分型结果(测序证明)应为rs1979255位点C/G型，rs7015070位点T/C型，检测结果为rs1979255位点G型（因C型的RFU值较G型低，仪器默认为G型，图2a），rs7015070位点T/C型。后增加rs1979255位点C型的探针浓度从0.25μM增加至1μM，可有效增加C型等位基因的扩增效率，并确保分型的准确性（图2b）。
实施例2人体样本B于体系1的SNP分型
反应模板提取：采用磁珠法抽提试剂盒对样本（FTA卡，血滤纸等）。加入裂解液，盖住样本为宜，并于95℃热处理。待细胞完全裂解后，向裂解液中添加磁珠。后将吸附有DNA的磁珠置于磁力架上，吸弃上清；再次添加裂解液，重复之前的步骤；后于洗涤剂中清洗2次，并吸弃上清。待磁珠晾干后，添加DNA缓冲液并于56℃加热处理10min，便于DNA的溶解。离心后得到的上清即为提取DNA模板。
人体样本B，浓度为0.5ng/μl，检测其SNP分型结果。取2μl配制扩增体系。标准品加样亦为2μl。选择体系1的SNP分型位点rs921115，rs1009480；选用仪器为Thermo PikoReal24。检测试剂盒的组成及扩增程序同实施例1。
rs921115位点双等位基因为C/G型；rs1009480位点双等位基因为C/T。5’端标记FAM色探针对应于rs921115的C型；HEX色探针对应于rs921115的G型；CY5色探针对应于rs1009480的A型；ROX色探针对应于rs1009480的G型。纯合子标准品1对应于rs921115位点的C型及rs1009480的C型；纯合子标准品2对应于rs921115的G型及rs1009480的T型；杂合子标准品对应于rs921115及rs1009480的杂合型。
人体样本B于rs921115，rs1009480的扩增曲线如图3，图4。人体样本B于rs921115位点为杂合子C/G型，于rs1009480位点为C型。
人体样本B于rs921115，rs1009480两位点的SNP分型散点图如图5，图6。人体样本B于rs921115为杂合子C/G型，于rs1009480位点为C型。扩增曲线的结果于SNP分型散点图。
在分型散点图中，标准线由3条曲线构成。通过扩增曲线图的RFU荧光数值统计为坐标值。若某位点的检测探针为FAM，HEX。则横坐标及纵坐标分别为FAM，HEX的RFU荧光数值。以三种标准品的扩增曲线的RFU值为坐标数据作图。如图5，图6所示。标准曲线的X轴及Y轴均出自纯合子标准品，而中轴（于X轴与Y轴中间）则根据杂合子标准品所得。
人体样本B分型结果：计算机对人体样本B于rs921115位点的分型结果为杂合子C/G，分型效率(Call Efficiency)为80.3；计算机对人体样本B于rs1009480位点的分型最终结果为纯合子C，分型效率为93.7，与扩增曲线图及SNP分型散点图的结果一致。分型效率(CallEfficiency)为综合考虑样品坐标点与标准品坐标点的距离及与标准曲线的垂直距离所得的参数。Call Efficiency的数值直接体现了SNP分型准确的效率，愈高愈佳，100%为最佳。
实施例3本发明在司法鉴定中的作用
发明所提供的试剂盒最重要的一个特点即是在司法鉴定中辅助STR检测结果。因其扩增更为快捷，故可先于STR毛细管电泳检测得到分型结果。使用本发明提供的能同时检测10个SNP位点的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒对犯案潜逃多年的犯罪嫌疑人及疑犯老家的儿子做个体识别鉴定，以确定该嫌疑人的真实身份（其对应扩增曲线图见图7-图16）。检测试剂盒的组成及扩增程序同实施例1，采用实施例2中的方法鉴定犯罪嫌疑人及疑犯老家儿子的关系，5个体系均进行测试，并统计分型结果，如表4：
表4犯罪嫌疑人于疑犯儿子的10个SNP位点分型
结果显示，犯罪嫌疑人于疑犯儿子的常染色体SNP呈准确的遗传关系，不排除两人间存在父子关系，可推断犯罪嫌疑人即为疑犯的可能性较大。但由于常染色体SNP位点提供的遗传信息有限，并不能完全确定他们两人间的父子关系。所以，本发明的试剂盒一般在司法鉴定中起到辅助作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggagttccca ccagtttctt tc 22
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gcacccttgg gtcatctcta tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgaatcata gcttgtgttg gtcag 25
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cctatggatc agcaag 16
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aagggagcag tggaagagaa atg 23
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catgaggtga gcccagagga c 21
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<213> 人工序列
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cacattcctt ttaagca 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cacattcctt ttaag 15
Claims (10)
1.一种快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：包括有用于扩增如下10个SNP位点所对应的引物：rs921115、rs1009480、rs560681、rs1019029、rs7205345、rs315791、rs1979255、rs7015070、rs985492和rs354439。
2.根据权利要求1所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：还包括有检测所述的SNP位点的TaqMan探针。
3.根据权利要求2所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：10个SNP位点对应的引物以2个为一组进行复合扩增。
4.根据权利要求3所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：位点的分组如下：第1组，rs921115、rs1009480；第2组，rs560681、rs1019029；第3组，rs7205345、rs315791；第4组，rs1979255、rs7015070；第5组，rs985492、rs354439。
5.根据权利要求2所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：每个SNP的位点都对应一条针对野生型的引物探针和一条针对变异型的引物探针，以及一对上、下游引物。
6.根据权利要求5所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：在同一个组中的4个引物探针是用不同荧光色进行标记的，4个引物探针的荧光标记色选自FAM、HEX、CY5或ROX。
7.根据权利要求5所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于，各个SNP位点对应的上、下游引物以及引物探针的序列如下：rs921115、上下游引物SEQ ID NO.1～2，引物探针引物SEQ ID NO.3～4；rs1009480、上下游引物SEQ ID NO.5～6，引物探针引物SEQ ID NO.7～8；rs560681、上下游引物SEQ ID NO.9～10，引物探针引物SEQ IDNO.11～12；rs1019029、上下游引物SEQ ID NO.13～14，引物探针引物SEQ ID NO.15～16；rs7205345、上下游引物SEQ ID NO.17～18，引物探针引物SEQ ID NO.19～20；rs315791、上下游引物SEQ ID NO.21～22，引物探针引物SEQ ID NO.23～24；rs1979255、上下游引物SEQ ID NO.25～26，引物探针引物SEQ ID NO.27～28；rs7015070、上下游引物SEQ ID NO.29～30，引物探针引物SEQ ID NO.31～32；rs985492、上下游引物SEQ IDNO.33～34，引物探针引物SEQ ID NO.35～36；rs354439、上下游引物SEQ ID NO.37～38，引物探针引物SEQ ID NO.39～40。
8.根据权利要求7所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：各个引物在扩增体系中的浓度是：
9.根据权利要求7所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于，试剂盒的反应体系由如下组成：反应混合物8μl，上下游引物和引物探针混合液4μl，c-Taq0.6μl，DNA提取液0.5ng～2ng，补水至20μl；所述的反应混合物的组成是Tris-HCl50mM，KCl50mM，BSA1.2mg/ml，MgCl2为2.4mM，dNTP为0.2mM，甜菜碱0.6M，Tween-20体积占2%，剩余成分为水。
10.根据权利要求1所述的快速检测SNP位点的四重荧光定量试剂盒，其特征在于：扩增程序是：25℃1min收集荧光；95℃2min热变性；95℃15s，60℃50s，共进行40个循环；25℃1min收集荧光。
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