CN103205357B - 一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法及其加样装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，包括以下步骤：步骤a，通过一加样元件插入任一dNTP试剂中使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；其中：所述加样元件包括一实心加样针及其驱动装置。本发明采用一结构简单的加样元件即可实现dNTP试剂的微量给样，摒弃了传动的中空针管抽喷式的给样方式，仅通过所述加样元件的加样针与液体间的吸附力及其在不同液体中的移动速度差异的控制即可实现微量取样加样，加样重复精度大于95%，且最小加样量可达0.1μL。
Description
技术领域
本发明涉及一种生化检测技术中的微量加样方法，具体说，是涉及一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法及其装置。
背景技术
一、焦磷酸测序概况
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是于1987年发展起来的、基于DNA合成过程中释放的焦磷酸(PPi)检测的测序技术，焦磷酸测序反应在一系列酶的催化作用下的，其过程中会产生与脱氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合数目成比例的可见光，通过对可见光检测可达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序有两种实现方法：液相焦磷酸测序法(Liquid PhasePyrosequencing)和固相焦磷酸测序法(Solid Phase Pyrosequencing)。
液相焦磷酸测序是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sμLfurylase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)协同作用下，将引物DNA上每一个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的(马永平等，焦磷酸测序技术及其在分子生物学领域的应用[J].国外医学分子生物学分册2003，25(2):115-117)。
液相焦磷酸测序的反应体系由反应底物、待测单链、特异性测序引物和酶构成，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS)和荧光素(1uciferin)。液相焦磷酸测序反应过程是一个向反应体系中轮流加入4种dNTP参与反应的过程，每轮反应只有一种dNTP参加。如果加入的dNTP刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则其在DNA聚合酶的作用下被添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS结合形成ATP；在荧光素酶的作用下，生成的ATP又和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。如果加入的这种dNTP刚好能和DNA模板的下面连续n个相同碱基匹配，根据反应方程式可知，释放出的可见光强度应是只有1个碱基匹配时的n倍，也即反应过程中释放的光强度与相匹配的碱基数目成比例关系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一个碱基不匹配，则上述反应不会发生，也没有可见光的释放。未参加反应的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。
每轮反应释放出的可见光通过微弱光检测装置转化，再被处理为数字信号，经PC软件处理即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低应和相匹配的碱基数目成比例关系。
待上一轮反应结束后，加入另一种dNTP，重复进行上述反应。最终可根据获得的光强度峰值图即可读取的待测DNA序列信息。
需要注意的是：dATP的降解产物脱氧单磷酸鸟苷(dAMP)是荧光素酶的抑制剂，随着反应的进行，其浓度会越来越高，会阻碍焦磷酸测序化学发光反应的继续进行。这也是焦磷酸测序法测序长度较短(通常为20bp～30bp)的主要原因(Shendure J，et a1.Advancedsequencing technologies:Methods and goals，Nat.Rev Genet.，2004，5(5):335-44)。
固相焦磷酸测序是由3种酶催化的化学发光反应，与液相焦磷酸测序相比，没有三磷酸腺苷双磷酸酶参加。固相焦磷酸测序反应过程如下：结合了引物的DNA模板被固定于支撑物上并在反应过程中保持位置不变；加入一种dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和荧光素酶协同作用下发生反应，除了没有降解反应发生，其他反应与液相焦磷酸测序完全相同；在加入下一种dNTP前有一个冲洗步骤(washing step)将上轮反应残留物完全冲走，不会有抑制性产物的堆积。
通常情况下，人们所说的焦磷酸测序法指的是液相焦磷酸测序法，因为其四酶反应系统使得焦磷酸测序可以很方便地在单管中实现。
Ronaghi等利用dATPαS替代dATP提高焦磷酸测序的信噪比(Ronaghi M.et a1.Real-time DNA sequencing using detection of PPi release；Anal.Biochem，1996，242(1):84-89)。因为dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于阅读富含T的区域。dATPαS是两种异构体Sp-dATPαS和Rp-dATPαS的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATPαS。为了得到最佳反应效率，必须在反应体系中保持最佳浓度的Sp-dATPαS，与此同时Rp-dATPαS的浓度也在增加。dATPαS被Apyrase降解后仍会产生荧光素酶的抑制物，因此dATPαS的加入并没有提高读序能力。
Gharizadeh等人对此进行了改进，他们在反应中只加入纯的Sp-dATPαS，而不加入无用的Rp-dATPαS，提高了反应的效率，大大降低了抑制产物的浓度，使得荧光素酶能够维持较长时间的活性，使焦磷酸测序法的测序长度增加到50bp～100bp，测序长度的增加也使得焦磷酸测序技术有了许多新的应用(Gharizadeh B.et al.，Long-read pyrosequencing usingpure2’-deoxyadenosine-5’-0’-(1-thiotriphosphate)Sp-isomer；Anal Binchem，2002.301:82-90)。
在2000年举办的第十二届基因组测序和分析会议(12th International GenomeSequencing and Analysis Conference)上，Ronaghi等人提出了一种移除抑制产物、减小稀释效应的方法，将测序长度增加到200bp。
与sanger双脱氧链终止测序法相比，焦磷酸测序法具有快速、准确、经济、实时检测的特点；它不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，具有很高的可重复性；能实现高度的并行性和高度的自动化。
二、焦磷酸测序技术的应用进展
1在单核苷酸多态性研究中的应用
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是近年来出现的第三代遗传标记，它指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少的一种在群体的频率不小于1%。SNPs是生物的基因组中最为常见的遗传多态型，它可以在任何一个待研究基因的内部或附近提供一系列标记；而正是这种基因组中的多态性，即基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性、对药物与环境因子不同反应的遗传学基础。
SNP的研究主要包括两个方面：一是SNP数据库的构建，主要是发现特定种类生物基因组的全部或部分SNP。二是SNP功能研究，发现SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger测序技术已成为大规模、准确、快速发现SNP的主流技术。而对数据库中已有SNP进行序列验证分析和频率分析，擅长短序列测序和验证的焦磷酸测序技术是很好的选择，采用焦磷酸测序技术进行SNP研究，更可以节约时间并降低消耗。
Nordfors等分别采用Taqman荧光定量法和焦磷酸测序技术对高达1022个样本进行SNP基因分型研究，获得了相同的结果，此对照实验表明焦磷酸测序技术是进行高通量、大样本的SNPs的高效、高准确度的方法。Wasson等利用焦磷酸测序技术来进行DNA池(DNA pools)的SNP等位基因频率分析。Rickert等采用焦磷酸测序技术对4倍体马铃薯进行基因型研究，在对94个多态性位点检测中，有76个等位基因位点可用焦磷酸测序技术鉴别，有效率达81%。蒋思文等利用焦磷酸测序技术进行了鉴别猪线粒体细胞色素b基因单倍型的工作。袁建林等利用焦磷酸测序技术进行HLA-DRB基因型分析研究，实验表明，将焦磷酸测序结果与HLA数据库的基因序列比较后可准确进行基因分型，该方法可应用于临床器官移植的供体/受体筛查。
2在病原微生物快速鉴定中的应用
Jonasson等用焦磷酸测序技术检测病原菌16S rRNA基因，快速鉴定出临床标本中抗生素抵抗菌。Monstein等用焦磷酸测序技术成功检测幽门螺杆菌16S rRNA基因易变的V1和V3区序列，证明该技术可满足对临床病原菌标本的快速鉴定和分型。Unnerstad等利用该技术对106株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌进行了分型，利用焦磷酸测序技术在短时间内完成大量的样本测序，其并行性和高效率非常显著。Gharizadeh等用此技术对67个人乳头瘤病毒样品进行了鉴定和分型，证明该技术也非常适于HPV等病原体的大规模鉴定、分型和突变的研究。程绍辉等从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA，采用焦磷酸测序技术对多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点，确定了该病毒为北京流行株。
3在病因学研究中的应用
Kittles等利用焦磷酸测序技术，对尼日利亚人、欧洲裔美国人和非洲裔美国人三个不同种群的CYPl7基因多态性进行分析，研究非洲裔美国人的CYPl7基因多态性与前列腺癌之间的关系和临床表现。研究结果表明，序列为CC的CYPl7基因型的非洲裔美国人比序列为TT的CYPl7基因型非洲裔美国人患前列腺癌的几率要高，证明这类人群中的碱基为C的CYPl7基因多态性与前列腺癌的发病率关系密切，为高危人群。众多线索表明，位于染色体22q11的COMT基因与精神分裂症的发病存在重要联系，而科学家的研究工作一直没能提出有力的证据；Shifman等提出了一种有效的方法，他们利用焦磷酸测序技术，对大样本的德系犹太人群进行相关的单核苷酸多态性分析，证实精神分裂症的发生与CMOT基因之间存在高度的关联。这种方法也能适用于其他疾病的基因分析研究。
4在法医鉴定中的应用
用Sanger测序法对线粒体DNA(mtDNA)变异分析，不能实现对由含有污染物、多个个体DNA等组成的mtDNA混合物的精确量化分析，而Andreasson等提出了一种针对mtDNA混合分析的基于焦磷酸测序技术的新颖的量化方法，可以很容易地从法庭证物混合样本中快速、准确地检测出主要的和次要的mtDNA成分。Balitzki-Korte利用焦磷酸测序技术对线粒体12S rRNA基因进行测序分析，在149bp长度的基因片断上进行长度为20bp的检测，通过参考数据库序列，就能够充分确定对象的生物学起源，比如说，能够确定一块皮肤组织究竟是来自失踪人员还是动物身上。
三、焦磷酸测序装置及发展
焦磷酸测序技术的应用依赖于焦磷酸测序装置的研究与开发。不论何种焦磷酸测序装置，其主要结构都应包含两个部分：反应器部分和微弱光检测部分。反应器提供反应进行的场所，微弱光检测部分负责检测反应发出的可见光。在人们对焦磷酸测序技术的研究和应用过程中，设计和使用的反应器主要可以分为3类：微量板反应器、微流控芯片反应器和微阵列芯片反应器。
而商业化的焦磷酸测序仪在国外已面世，然而国内相关仪器本身研究的报道甚少，更无相应的产品问世。国外产品的一个典型代表是Pyrosequencing AB公司的PSQ96，它是该公司2001年推出的产品，系统能够同时进行96路或者384路DNA样本的独立测序，当测序长度不超过300bp时一般所用时间在1小时45分钟，准确性和可靠性达到99%，具有高通量、快速、经济的优势。PSQ96系统已经广泛用在基础医学研究和临床分子诊断当中。
国外仪器研究另外一个代表是美国454Life Science公司2005年推出的GenomeSequencer20(GS20)。它走向了有着更高技术含量的微型化方向，即利用MEMS技术将微滤腔作为焦磷酸测序反应的反应环境，将惊人的上百万数目的反应阵列集成进7cm×8cm的面积内，并使每个反应舱能独立同时进行测序级联反应，仪器具有的高灵敏度和分辨率的CCD能够捕捉到每个单反应舱产生的微弱荧光信号，最终能够得到每个标本DNA的序列信息。GS20仅需4.5个小时即可实现高密度测序反应，经过并行计算得到每个标本的序列信息。优点是可以节省反应试剂的消耗，降低测序成本，为基因组大规模测序提供可能。
目前国内的仪器研究刚刚起步，国产化的道路漫长，面对方方面面的问题，在权衡测序系统所需要的各种硬件条件后，发现首要面对的问题和挑战是微量加样子系统的研制问题。
四、焦磷酸测序中加样系统的重要性
焦磷酸测序技术及其产品为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台，是后基因组时代进行基因序列分析研究的有力工具。焦磷酸测序技术正被越来越多的研究人员接受和采用，随着国际上焦磷酸测序技术应用的兴起和商品化焦磷酸测序仪器的发展，我国的焦磷酸测序技术应用方兴未艾。但是在现阶段，国内焦磷酸测序技术的应用和推广存在几个制约因素：(1)现有的商品化焦磷酸测序仪器如PSQ96、GS20价格昂贵；(2)商业化的焦磷酸测序服务等待时间长且很不方便；(3)虽然目前有些实验室在进行诸如焦磷酸测序芯片等装置的研究，一些实验室有自制的、结构简单的焦磷酸测序试验装置，但国内没有面向低端的、价格便宜的、商品化的基于焦磷酸测序技术的序列检测仪器，是制约焦磷酸测序技术应用发展的关键问题。
焦磷酸测序系统是在微量环境中进行的，通常反应体系仅在50μL，所需的反应底物、DNA模板以及脱氧核苷酸等试剂的量非常微小；同时，单次加样量的多少直接影响循环反应的可持续性，过大的单次加样量会使反应溶液体积迅速变大，因此造成模板浓度下降过快。由于扩散作用产生的反应延迟非线性增加，得到的微弱荧光信号在时间轴上延伸，强度在纵坐标上降低，最终导致严重缩短核酸的可测序长度。一般认为由于后续加样造成的反应体系增加如果在10%之内，对实验结果的影响是在可以接受的范围内。假如要对一段20bp长度的DNA片断进行测序，那么在50μL的反应体系中，允许的单次加样量只能不超过0.3μL。
此外，除了加样精度，加样间隔的时间准确性也同样重要。只有在等时间间隔内加入单循环所需的dNTP，才能使每次的残留dNTP的降解程度相当，那么对下次反应造成的影响也将相等。等时间段才能给每个周期的信号提供基准，便于后续根据荧光信号强度计算核苷酸结合数目的自动化分析。
虽然国产化的加样设备已比较丰富，但是国内现有的微量加样装置都有不足。比如上海复日的加样平台，作为大型自动化样本池处理设备，能够进行标准96孔板的加样、振荡、清洗工作，但是这套系统由于喷嘴加工工艺的限制，加样微精度最小只有1μL，无法满足焦磷酸测序要求的nL级别。经过调研，限制于国内应用和制造水平，国产化的加样装置都无法满足焦磷酸测序中对加样量以及重复精度的高要求。
东南大学葛健徽等公开了一种以微弱光检测模块和微量dNTP加样模块为关键模块的液相焦磷酸测序装置，其中公开了一气压控制微量dNTP加样模块，可实现96路dNTP溶液的同时加样，最小加样量为1.2μL，最大误差为13%；但信号噪声较大，仍需更一步改进(葛健徽等，基于焦磷酸测序的基因检测装置的研制，东南大学，硕士学位论文，2006)。
王春林等公开了一种采用压电陶瓷喷头的焦磷酸核酸测序仪中微量加样系统，该可以在步进电机驱动下，对96孔标准板样本分别进行4种dNTP试剂的轮流加样，加样重复精度大于95%，单次加样最小量能达到0.lμL。上述两类较佳的焦磷酸核酸测序仪中所用的微量加样系统结构比较复杂，且加样针易堵，dNTP通过不同的方式喷入测序反应液内并不与反应液接触使得与反应液混合不充分反应不完全，对dNTP要求量也较高且数据易不准确；此外，拆装麻烦，成本高且不利于特殊条件下应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，包括以下了步骤：
步骤a，通过一加样元件蘸取任一一种dNTP试剂使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；
步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；
其中：所述加样元件包括一实心加样针及其驱动装置。
其中，为实现完成测序，优选为将4种dNTP试剂任一或多个依待测序列而定以何种顺序加入测序反应液中，例如：仅检测单个碱基是否变异时，可根据已知的前后序列先确定待测碱基位置后，依次重复上述步骤4次加样（加入4种dNTP试剂），分别加入同一测序反应液中检测该碱基。
优选地，所述加样针直径小于0.5cm，优选为0.5mm～2mm。
更优选地，所述加样针的针体为圆柱体或长方体。
更优选地，所述加样针的加样端面为平面、半球体或锥体。
更优选地，所述加样针的表面光滑度小于Ra50，优选为小于Ra10。
优选地，所述加样元件的驱动装置用于实现所述加样针沿X、Y、Z轴向运动，或沿一圆心转动。
优选地，所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为5～50cm/s，优选为10～15cm/s。
优选地，所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度小于5cm/s，优选为0.4～1cm/s。
优选地，所述步骤b中所述加样元件或加样针在所述测序反应液中反复移动至少5次后离开所述测序反应液；优选为8～15次；其中加样元件或加样针可在测序反应液内上下移动，或小幅度左右转动，也可低速旋转，以达到搅拌作用。
优选地，所述加样方法还包括加样元件的清洗和/或干燥。
一种用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，包括一加样平台和用于转移dNTP试剂的加样元件，所述加样元件包括至少一实心加样针及其驱动装置。
优选地，所述加样平台上依次设有dNTP试剂槽（优选为4个，以放置四种dNTP试剂槽）、清洗槽和样品槽，所述样品槽用于放置至少一组测序反应液，更优选地还可设有干燥区，所述干燥区位于所述清洗槽和dNTP试剂槽之间。
优选地，所述驱动装置为一设有转轴的圆形加样针架，所述加样针贯穿所述加样针架上的通孔且通过所述加样针的固定端限位固定，所述加样针的固定端直径大于所述加样针架上的通孔直径，所述圆形加样针架通过所述转轴转动、或呈X、Y、Z轴方向平动、或同另一转动驱动装置呈连动转动。
其中优选的实施方式是所述加样平台为方形，所述dNTP试剂槽、清洗槽和样品槽呈线性排列，此时所述圆形加样针架既可通过所述转轴转动，又可呈X、Y、Z轴方向平动；另外一种为实现更快测序的实施方式是，所述加样平台呈圆环或圆形，所述dNTP试剂槽、清洗槽和样品槽沿圆心依次设置，此时所述圆形加样针架既可通过所述转轴转动，又同另一转动驱动装置呈连动转动；上述设置用于实现所述加样元件既可在所述样品槽中不同的测序反应液中加样（通过圆形加样针架通过转轴转动）；又可在所述加样平台上不同位置的移动实现加样、清洗、干燥以及取样等多种功能；
更优选地，所述加样针架上的通孔对应测序样品槽设置，为实现多样品检测，所述样品槽位于所述样品台的一端沿一圆心呈一系列同心圆排列，且所述加样针架上的通孔亦为一系列同心圆孔排列。
更优选地，所述样品槽连接焦磷酸核酸检测装置，优选为一生物发光检测装置，用于检测样品中的核酸序列。
上述用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置的应用，为与任一焦磷酸核酸测序装置联用成一测序仪。
与现有技术相比，本发明采用一结构简单的加样元件即可实现dNTP试剂的微量给样，摒弃了传动的中空针管抽喷式的给样方式，仅通过所述加样元件的加样针与液体间的吸附力及其在不同液体中的移动速度差异的控制即可实现微量取样加样，且仅通过加样元件在测序反应液内上下运动数次即可实现搅拌使得酶反应更为完全结果准确，本加样方法及其装置适用于任何检测装置中，拆卸简便，清洗简单便捷，且不会发生堵针等多种现有技术中的加样装置的不足，加样重复精度大于95%，且最小加样量可达0.1μL，加样均一性好，测序时间大为缩短且结果准确性极高；此外可通过所联用的检测装置对样品核酸序列进行定性定量检测；因此其应用前景十分广阔。
附图说明
图1为本发明提供的用于焦磷酸测序仪的加样装置结构示意图；
图2为本发明提供的用于焦磷酸测序仪的加样装置结构中的加样针示意图；
图3为实施例1中采用本发明提供的用于焦磷酸测序仪的加样装置测得的序列谱图
具体实施方式
下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。
图1为本发明提供的加样装置的一种实施方式，但并非唯一的实施方式，如图1所示：该加样装置包括一加样平台1和用于转移dNTP试剂的加样元件，所述加样元件包括至少一实心加样针2及其驱动装置；所述加样平台上依次设有dNTP试剂槽3、干燥区4、清洗槽5和样品槽6，所述干燥区为真空干燥区；所述驱动装置为一设有转轴701的圆形加样针架7，所述加样针贯穿所述加样针架上的通孔8且通过所述加样针的固定端201固定，所述加样针的固定端直径大于所述加样针架上的通孔直径，所述圆形加样针架通过所述转轴转动、或呈X、Y、Z轴方向平动；为实现多样品检测，所述样品槽位9于所述样品台的一端沿一圆心呈一系列同心圆排列，且所述加样针架上的通孔亦为一系列同心圆孔排列；所述样品槽连接一生物发光检测装置10，用于检测样品中的核酸序列，所述生物发光检测装置为市售iKon-M深度制冷影像CCD相机，且连接一电脑并呈现检测的谱图；此处的加样平台仅为一种实例，并非独一的选择，仅仅用于考察本发明提供的加样方法及其装置。
实施例1
图2为加样针的结构示意图，其中所述加样针的端面202为半圆体；采用上述的加样装置检测已知序列的样品序列为(CAATATTCGCCAGGT)，其中所述加样元件的加样针直径为1.5mm，表面光洁度为Ra0.8；加样方法包括：步骤a，通过所述加样元件插入样品槽的dNTP试剂使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入样品槽测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为10cm/s，所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度为1cm/s，在测序反应液内上下运动8次后离开测序反应液。
图3为本实施例的加样方法及其装置联用焦磷酸核酸测序检测装置所得的测序谱图，由图3可知，其中依次加入dNTP的顺序TCATATTCGCCAGT，其中首次加入T时未出峰，以及后续与实际序列不符的dNTP试剂液也未出峰（图3中用圆圈标出，即T、T、C），其测得的序列为CAATATTCGCCAGGT，与样品实际序列完全一致，精确度为100%，且；检测单个碱基的时间小于1.5分钟，此序列大约耗时25分钟，且最小加样量可达0.1μL。
重复上述加样10次，其加样重复精度为95%。
实施例2
本对比例与实施例1的区别仅在于：所述加样针的端面为平面，直径为1.5mm，表面光洁度为Ra3.2，且加样方法中所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为50cm/s，所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度为0.4cm/s，在测序反应液内上下运动5次后离开测序反应液。
本实施例所得测序谱图及其他实验结果数据测序时间、加样重复精度、均一性与实施例1所得数据为理论误差范围内的一致性，其加样重复精度为96%。
实施例3
本对比例与实施例1的区别仅在于：所述加样针的端面为圆锥体，直径为1.6mm，锥度60度，表面光洁度为Ra9.8，且加样方法中所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为5cm/s，所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度为4.5cm/s，在测序反应液内上下运动12次后离开测序反应液。
本实施例所得测序谱图及其他实验结果数据测序时间、加样重复精度、均一性与实施例1所得数据为理论误差范围内的一致性，其加样重复精度为95%。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (26)
1.一种用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a，通过一加样元件插入任一一种dNTP试剂使得所述加样元件外周附着所述dNTP试剂；
步骤b，将附着所述dNTP试剂的加样元件插入测序反应液中，再使所述加样元件离开所述测序反应液；
其中：所述加样元件包括一实心加样针及其驱动装置,所述加样针的直径小于0.5cm和表面光滑度小于Ra50。
2.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：将4种dNTP试剂任一或多个依待测序列而定以何种顺序加入测序反应液中。
3.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：仅检测单个碱基是否变异时，根据已知的前后序列先确定待测碱基位置后，依次将4种dNTP试剂分别加入同一测序反应液中检测所述待测碱基。
4.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样针的直径为0.5mm～2mm。
5.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样针的针体为圆柱体或长方体。
6.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样针的加样端面为平面、半圆体或锥体。
7.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样针的表面光滑度小于Ra10。
8.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样元件的驱动装置用于实现所述加样针沿X、Y、Z轴向运动，或沿一圆心转动。
9.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为5～50cm/s。
10.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤a中所述加样元件离开所述dNTP试剂液时的移动速度为10～15cm/s。
11.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度小于5cm/s。
12.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤b中所述加样元件离开所述测序反应液时的移动速度为0.4～1cm/s。
13.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述加样方法还包括加样元件的清洗和/或干燥。
14.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤b中所述加样元件或加样针在所述测序反应液中反复移动至少5次后离开所述测序反应液。
15.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：所述步骤b中所述加样元件或加样针在所述测序反应液中反复移动8～15次后离开所述测序反应液。
16.根据权利要求1所述的用于焦磷酸核酸测序仪的微量加样方法，其特征在于：其中加样元件或加样针在测序反应液内上下移动，或小幅度左右转动，或低速旋转。
17.一种用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：包括一加样平台和用于转移dNTP试剂的加样元件，所述加样元件包括至少一实心加样针及其驱动装置，所述加样针为权利要求1、4～7任一所述加样针。
18.根据权利要求17所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述加样平台上依次设有dNTP试剂槽、清洗槽和样品槽；所述驱动装置为一设有转轴的圆形加样针架，所述加样针贯穿所述加样针架上的通孔且通过所述加样针的固定端固定，所述加样针的固定端直径大于所述加样针架上的通孔直径，所述圆形加样针架通过所述转轴转动、或呈X、Y、Z轴方向平动、或同另一转动驱动装置呈连动转动。
19.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置还设有干燥区，所述干燥区位于所述清洗槽和dNTP试剂槽之间。
20.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述样品槽用于放置至少一组测序反应液。
21.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述加样平台为方形，所述dNTP试剂槽、清洗槽和样品槽呈线性排列，此时所述圆形加样针架既可通过所述转轴转动，又可呈X、Y、Z轴方向平动。
22.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述加样平台呈圆环或圆形，所述dNTP试剂槽、清洗槽和样品槽沿圆心依次设置，此时所述圆形加样针架既可通过所述转轴转动，又同另一转动驱动装置呈连动转动。
23.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述加样针架上的通孔对应测序样品槽设置。
24.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述样品槽位于所述样品台的一端沿一圆心呈一系列同心圆排列，且所述加样针架上的通孔亦为一系列同心圆孔排列。
25.根据权利要求18所述的用于焦磷酸核酸测序仪的加样装置，其特征在于：所述样品槽连接焦磷酸核酸检测装置。
26.权利要求17～25任一所述加样装置的应用，其特征在于：所述加样装置与任一焦磷酸核酸测序装置联用成一焦磷酸核酸测序仪。
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