CN104031832B - 一种核酸测序用微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明旨在提供一种核酸测序用微流控芯片。该芯片包括多个微流控通道组成的一组反应池。微流控芯片主要由三层结构构成，其中上层芯片1为固体材料基板，其表面加工有液体入口2和出口3以及上微通道凹槽4；中层芯片5加工有方形通孔微阵列6，每个方形通孔中捕获一个固定有测序模版的微球7；底层芯片8为透明固体材料基板，其表面加工有下微通道凹槽9。芯片应用过程中，微球上固定有测序模版，测序反应液和洗涤液从微球与方形通孔之间的孔隙流过微通孔阵列。该芯片设计与结构简单，易于制备，有利于微球的固定，加快反应和洗涤的速度，降低试剂的用量，并增强洗涤效果，从而降低核酸测序成本，缩短测序时间。

Description

一种核酸测序用微流控芯片

技术领域

本发明涉及的是一种核酸测序用微流控芯片。它能够广泛用于核酸测序、基因突变检测以及分子诊断等领域。

背景技术

从20世纪70年代中期Sanger法核酸测序技术出现以来，核酸测序技术已经取得了巨大的进展，特别是随着人类基因组计划的完成，核酸测序技术大大改变了生命科学诸多领域的研究面貌。

作为第一代测序技术，Sanger测序法方便简单，可靠性高，测序片段长，也成为人类基因组测序所采用的测序技术，但是Sanger测序法无法进一步的微量化，测序通量也受到限制。随着相关生物技术的发展与深入研究，DNA测序技术也得到了不断的创新与改良，在保证测序精度的前提下，操作程序已经逐步优化，速度逐渐提高，成本也呈下降趋势。新一代的测序技术也就应运而生，这类技术都是将片段化的基因组DNA连接上通用接头，随后应用不同的方法方式来产生上百万甚至更多的单分子多拷贝PCR克隆阵列。之后进行引物杂交与酶的延伸反应，这些反应可以大规模的同时进行，可以实现一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,然后对每一步反应所产生的信号进行同时的检测，以此来获取测序的数据，经过计算机分析获得完整的DNA序列信息。Roche公司本世纪初最先推出了高通量测序平台，开启了高通量测序的新时代。随后是基于合成测序的Solexa技术，以及基于杂交连接测序的SOLiD技术。

454测序技术是将单链DNA文库固定于专门设计的DNA捕获磁珠上，不同的磁珠上固定有不同的单链DNA模版，随后经过乳液PCR扩增，形成单分子多拷贝的分子簇。将磁珠从乳液体系里面释放出来以后放入由PTP板构成的芯片上，PTP板上有只能容纳单个磁珠的微井，在微井中进行后续的测序反应。利用焦磷酸测序基本原理，对每个微井中的DNA片段分子进行准确快速的碱基序列的测定。该技术平台最主要的优点就测序读长较长，目前可以准确进行1000个以上的碱基序列分析。但是缺点在于反应液和洗涤液进入PTP的微井阵列为“漫过式”反应，因此限制了测序速度。

SOLiD测序主要以四色标记的寡核苷酸的连续的合成为基础，这样可以对单拷贝DNA模版进行大规模的扩增和高通量的并行测序。SOLiD测序样品制备方案与其他技术类似，首先进行物理破碎DNA，然后连接通用接头，然后在乳液体系里进行大量的扩增，使大量的单分子多拷贝的DNA分子簇集中于微小的磁珠上，将经过扩增的富含测序文库的磁性微球固定于玻片的表面进行测序生化反应。该反应同样为“漫过式”反应，速度较慢，而且磁珠背景荧光较高，对测序仪器灵敏度要求高。

Solexa测序首先将基因组DNA进行片段化处理，回收段片段DNA(200-500bp)进行通用接头的链接。再将其处理成为单链状态，然后通过与芯片微通道表面的单链引物碱基互补而被固定于芯片微通道的底面上，另一端随机的与附近的另一个引物进行互补，形成“桥”，利用这种方式，进行30个左右循环的扩增后，每个分子会放大上千倍，成为单克隆DNA簇。在后续的测序反应中四种荧光标记的染料边合成边测序，每个循环中，荧光标记的dNTP是可逆终止子，只允许掺入单个碱基，主要就是因为3’羟基末端有可被识别的切割位置。不同碱基用不同荧光标记就可以激发出不同波段的荧光，这样统计每轮反应下来收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。但是该芯片同样为“漫过式”反应，需要试剂浓度较高，而且对于芯片的修饰均匀性要求非常高，测序成本相应增加。

Life公司近年来针对临床应用推出了SOLiD的继承者IonTorrent技术，该技术在类似PTP板的微井阵列中检测测序反应中释放的氢离子带来的PH的变化，简便快速，读长长，非常适合用于临床检测，但是该芯片价格较高。除此之外还有很多针对单分子的测序技术的发展，比如Pacific技术和纳米孔测序技术等等，虽然这些技术还存在这样那样的问题，但已经在不断研究应用中逐步改善，有望在将来的测序中大规模的应用。

尽管测序技术的发展日新月异，但是目前所有的测序平台都是基于芯片的生物分子检测，芯片的设计与制备对于测序的效率和速度至关重要，目前主流的芯片主要是微流通道和微孔结构，而且需要复杂的基底修饰和昂贵的原材料。研究新的能够高效快速的进行生化反应、选择成本低，稳定性好的材料制备用于DNA测序的微流芯片对于新一代高通量测序技术的发展提升和成本的进一步控制意义重大。

发明内容

技术问题:本发明的目的是提供一种用于核酸测序的微流体芯片。该芯片将微球捕获在具定在方形微通孔阵列中，微球上固定有测序模版，测序反应液和洗涤液从微球与方形通孔之间的孔隙流过微通孔阵列，有利于微球的固定，加快反应的速度，降低试剂的用量，并增强洗涤效果，从而降低检测成本。

技术方案:本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明的用于核酸测序的微流控芯片整体由上层芯片、中层芯片、底层芯片三个片层构成一组反应池，其中：上层芯片为固体材料基板，其表面加工有液体入口和液体出口以及上微通道凹槽；中层芯片加工有多个并列的方形通孔微阵列，每个方形通孔中捕获一个固定有测序模版的微球；底层芯片为透明固体材料基板，其上表面加工有下微通道凹槽。

所述的反应池由上微通道凹槽，方形通孔微阵列和下微通道凹槽顺序串联组成；反应液和洗涤液通过上层的上微通道凹槽流经方形通孔微阵列，通过下微通道凹槽到达出口。

所述的微球直径大于方形通孔微阵列中方形通孔的边长，小于两个相邻方形通孔中心距。

所述的微球通过液体入口进入微通道凹槽，并被方形通孔微阵列捕获，一个方形微孔中捕获一个微球。

所述的微球是玻璃微球、金属微球、陶瓷微球、聚合物微球或者复合结构微球之一；其表面通过化学键固定有核酸分子测序模版、核酸探针分子、蛋白探针分子或者之一。

所述上层芯片的固体材料为玻璃、石英、硅、金属、高分子、陶瓷或橡胶之一。

所述的底层芯片为透明的玻璃、石英、高分子材料之一。

所述的微流控芯片三个片层结构通过键合工艺封合或者粘合胶封合。

其工作原理是：

a)固定有测序模版的微球，通过液体入口进入芯片，被液体带入方形通孔微阵列并被捕获在微孔内，固定有测序模版的微球的直径略大于方形微孔的边长，略小于相邻微孔的中心距，每个微孔捕获一个微球；

b)测序反应溶液从上层芯片流经通孔微阵列与固定有测序模版的微球之间的空隙进入底层芯片，开始固定有测序模版的微球表面的测序反应，反应温度由上层芯片外侧的控温装置控制；

c)每一轮反应过后，洗涤液从上层芯片流经通孔微阵列与固定有测序模版的微球之间的空隙进入底层芯片，完成洗涤；

d)每一轮洗涤过程过后，从底层芯片下方进行光学成像，采集测序数据；

有益效果：根据本发明微流控芯片，利用方形微通孔阵列，在微通道中固定负载有测序模版的微球，进行流过式测序反应和洗涤，具有以下优点：

(1)微球固定简单：测序反应需要将模版位置固定。因为本芯片含有方形微通孔阵列，流体从阵列的上方通道流经阵列至下方通道流出，把测序模版负载到微球上之后，通过流体的驱动作用，非常容易将微球均匀捕获到方形通孔之中，形成一个微孔一个微球，并且由于微球直径比微孔边长略大，微球陷入微孔中，固定十分牢固，不容易移动，提高了测序的准确性；

(2)检测通量大：本芯片利用微球作为测序模版的载体，先将测序模版固定到微球上，然后将微球捕获在方形微通孔阵列中，微通孔尺寸可以小至几个微米，因此可以使微球在芯片内形成非常高密度的排布，大大提高检测的通量；

(3)“流过式”反应和洗涤：由于微球与方形通孔之间具有缝隙，测序反应溶液和洗涤液只能通过该缝隙流经通孔和微球，形成流过式反应和洗涤，相比于454技术等常用的“漫过式”反应和洗涤，本芯片的反应和洗涤效率更高，因此更能节省试剂的消耗，加快测序速度，降低成本；

(3)检测灵敏度高：芯片通过微孔阵列对微球进行固定捕获和隔离，降低了微球相互之间影响，不会出现微球重叠现象，方便成像系统的分辨和成像，同时微球的比表面积大，流过式反应提高了信号强度，因此芯片的测序检测灵敏度高；

(4)可扩展性高：本芯片的基于微球的流过式微流控测序芯片，微球和方形微孔的尺寸方便选择，因此微球排布密度易于调整，微球间距和大小的可调整性强，因此本芯片不但适用于高通量测序，同样适用于低通量测序，以及高、低通量的分子检测；

(5)芯片制备成本低：芯片结构简单，可以采用成熟的MEMS微加工工艺批量制备，降低了制备成本。

附图说明

图1为本发明芯片的侧视截面图。

图2为本发明芯片俯视图。

图3为本发明芯片测序应用示意图。

以上的图中有:上层芯片1，液体入口2，液体出口3，上微通道凹槽4，中层芯片5，方形通孔微阵列6，固定有测序模版的微球7；底层芯片8，下微通道凹槽9，芯片控温装置10、光学成像装置11。

具体实施方式

该测序微流控芯片包括多个微流控通道组成的一组反应池。微流控芯片主要由三个片层构成，如图1所示，其中上层芯片1为固体材料基板，其表面加工有液体入口2和出口3以及上微通道凹槽4；中层芯片5加工有方形通孔微阵列6，每个方形通孔中捕获一个固定有测序模版的微球7；底层芯片8为透明固体材料基板，其表面加工有下微通道凹槽9。多个反应池之间可以通过外部的芯片固定装置和管道串联或者并联在一起。

所述的上层芯片1内，通过机械切削、机械钻孔、干法刻蚀、湿法刻蚀、激光微加工或者超声波加工加工液体入口2和出口3以及上微通道凹槽4。

所述的底层芯片8内，通过机械切削、机械钻孔、干法刻蚀、湿法刻蚀、激光微加工或者超声波加工加工下微通道凹槽9。

所述的上层芯片1和底层芯片8为平片结构，通过丝网印刷在其表面制备由粘合胶构成的上微通道凹槽4和下微通道凹槽9，通过粘合胶将上层芯片1，中层芯片5和底层芯片8封装。

所述的上层芯片1和底层芯片8为复合结构，通过镀膜或者甩胶工艺在其表面制备间隔层，在间隔层内通过机械加工或者光刻制备上微通道凹槽4和下微通道凹槽9，液体入口2和出口3；上层芯片1中层芯片5和底层芯片8通过键合或者胶合工艺封装。

实施例一：

a)上层芯片制备：采用3cm×7cm的石英片，通过激光微加工在石英片中切削出3条长5.2cm，宽5mm，深50μm的微通道，三个通道间隔2mm，并打出直径1mm的液体出口和入口。

b)中间层芯片制备：采用3cm×7cm金属镍膜，在与上层芯片微通道对应的位置，通过电化学刻蚀得到方形通孔微阵列，微孔大小8μm×8μm，微孔中心间距20μm，微孔阵列边缘距离通道边缘4μm，距离通道出入口2mm。

c)下层芯片制备：采用3cm×7cm的石英片，通过激光微加工在石英片中切削出3条长5.2cm，宽5mm，深50μm的微通道。

d)芯片组装：三层芯片通过5μm厚的胶水连接在一起，并通过液体入口与出口与外围管道相连接。

e)测序应用：通过液体入口向芯片内装载固定有测序模版的9μm的玻璃微球，将微球固定到微孔阵列中。芯片上表面加控温装置，置于光学成像系统上进行基于荧光标记的测序反应并采集测序数据。

实施例二：

a)上层芯片制备：采用3cm×7cm的硅片，通过湿法刻蚀在硅片中制备出3条长5.2cm，宽5mm，深20μm的微通道，三个通道间隔2mm，并打出直径1mm的液体出口和入口。

b)中间层芯片制备：采用3cm×7cm硅片，在与上层芯片微通道对应的位置，通过干法刻蚀得到方形通孔微阵列，微孔大小3μm×3μm，微孔中心间距9μm，微孔阵列边缘距离通道边缘4μm，距离通道出入口2mm。

c)下层芯片制备：采用3cm×7cm的石英片，通过激光微加工在石英片中切削出3条长5.2cm，宽5mm，深20μm的微通道。

d)芯片组装：三层芯片通过键合工艺连接在一起，并通过液体入口与出口与外围管道相连接。

e)测序应用：通过液体入口向芯片内装载固定有测序模版的4μm的聚苯乙烯微球，将微球固定到微孔阵列中。芯片上表面加控温装置，置于光学成像系统上进行基于荧光标记的测序反应并采集测序数据。

实施例三：

a)上层芯片制备：采用3cm×7cm的硅片，并通过丝网印刷工艺在石英片上印刷含3条长5.2cm，宽5mm，深100μm微通道的粘合胶，三个通道间隔2mm，并打出直径1mm的液体出口和入口。

b)中间层芯片制备：采用3cm×7cm的硅片，在与上层芯片微通道对应的位置，通过湿法刻蚀得到方形通孔微阵列，微孔大小8μm×8μm，微孔中心间距20μm，微孔阵列边缘距离通道边缘4μm，距离通道出入口2mm。

c)下层芯片制备：采用3cm×7cm的玻璃片，并通过丝网印刷工艺在石英片上印刷含3条长5.2cm，宽5mm，深100μm微通道的粘合胶，三个通道间隔2mm。

d)芯片组装：三层芯片通过粘合胶贴合封装，并通过液体入口与出口与外围管道相连接。

e)测序应用：通过液体入口向芯片内装载固定有测序模版的9μm的聚苯乙烯微球，将微球固定到微孔阵列中。芯片上表面加控温装置，置于光学成像系统上进行基于荧光标记的测序反应并采集测序数据。

Claims (4)

1.一种核酸测序用微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片整体由上层芯片(1)、中层芯片(5)、底层芯片(8)三个片层构成一组反应池，其中：上层芯片(1)为固体材料基板，其表面加工有液体入口(2)和液体出口(3)以及上微通道凹槽(4)；中层芯片(5)加工有多个并列的方形通孔微阵列(6)，每个方形通孔中捕获一个固定有测序模版的微球(7)；底层芯片(8)为透明固体材料基板，其上表面加工有下微通道凹槽(9)；

所述的反应池由上微通道凹槽(4)，方形通孔微阵列(6)和下微通道凹槽(9)顺序串联组成；反应液和洗涤液通过上层的上微通道凹槽(4)流经方形通孔微阵列(6)，通过下微通道凹槽(9)到达出口(3)；

所述的微球(7)直径大于方形通孔微阵列(6)中方形通孔的边长，小于两个相邻方形通孔中心距；

所述的微球(7)通过液体入口(2)进入上微通道凹槽(4)，并被方形通孔微阵列(6)捕获，一个方形微孔中捕获一个微球(7)；

所述的微球(7)是玻璃微球、金属微球、陶瓷微球、聚合物微球或者复合结构微球之一；其表面通过化学键固定有核酸分子测序模版、核酸探针分子、蛋白探针分子或者之一。

2.根据权利要求1所述的核酸测序用微流控芯片，其特征在于所述上层芯片(1)的固体材料为玻璃、石英、硅、金属、高分子、陶瓷或橡胶之一。

3.根据权利要求1所述的核酸测序用微流控芯片，其特征在于所述的底层芯片(8)为透明的玻璃、石英、高分子材料之一。

4.根据权利要求1所述的核酸测序用微流控芯片，其特征在于所述的微流控芯片三个片层结构通过键合工艺封合或者粘合胶封合。