JP5597633B2 - 化学的ターゲットと特異的に結合する核酸の迅速な確認のための装置 - Google Patents

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Description

本願は全体として本願に参照文献として統合された2008年8月15日出願された米国仮出願特許番号61/089,291の優先権を主張する。
本発明は、米国科学財団(National Science Foundation)による支援番号ECS−9731293及びECS−9876771で、政府の支援下で行われた。政府は本発明の特定権利を有する。
本発明は、生物学的及び化学的ターゲットと特異的に結合する核酸の迅速な確認のための方法及び装置に関する。
SELEX(Systematic Evolution of ligands by Exponential Enrichment)として知らされているプロセスは多様なオリゴヌクレオチドの巨大なプール(Pools)からリガンドまたはターゲットと結合するアプタマーを同定するために用いられる漸進的なin vitro結合の化学プロセスである。SELEXは特異的にカスタマイズできる結合(specific customizable binding)状態のもとでランダムプールからアプタマーを分離するための優れたシステムである。SELEXプロセスは、与えられたリガンドまたはターゲットと強固に、かつ特異的に結合する一本鎖のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを作るための代替案を提供する(Tuerk et al., Science 249:505-510 (1990); Ellington A., Curr Biol 4:427-429 (1994); Ellington et al., Nature 346:818-822 (1990))。SELEX実験は、核酸の機能的な面及び構造的な面を調べるためによく活用され来ており、同定されたアプタマーは分子診断、分子認識、分子生物学、及び分子進化の研究のための重要なツールとなっている(Uphoff et al., Curr Opin Struct Biol 6:281-288 (1996))。
SELEXにおいて、アプタマー選別は、ターゲット結合及び未結合オリゴヌクレオチドの除去の連続的な工程の繰り返しによってアプタマーの選別性を高め、その次に、選別されたオリゴヌクレオチドの溶出、増幅及び精製工程を経る。SELEXは二つのプロセスの繰り返し工程を含む:(i)親和的な方法によって、低い親和性アプタマーから高い親和性アプタマーの分離または選別、及び(ii)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による選別されたアプタマーの増幅。アプタマーは、一般にSELEXプロセスの分離工程における親和性選別方法によって、ランダムDNAまたはRNA配列(sequence)の巨大なプールまたはライブラリー(≧1015個体)から選別される。いわゆる「アプタマー(aptamer)」と呼ばれる一本鎖のDNAまたはRNAは、高い親和性及び特異性を有する非核酸ターゲット分子と結合できる能力を有する人工特異的オリゴヌクレオチドである(Jenison et al., Science 263:1425 (1994); Patel et al., J Mol Biol 272:645-664 (1997); Clark et al., Electrophoresis 23:1335-1340 (2002))。アプタマーのユニークな特性のために、アプタマーは親和性分離から癌及びウイルス感染のような病気の診断及び治療に至るまで、自然科学及び生命科学の多くの分野に革新をもたらす可能性がある(Tang et al., Anal Chem 79:4900-4907 (2007); Gopinath, S., Archives of Virology 152:2137-57 (2007))。
アプタマーは、抗体と比較して多くの長所を有する。アプタマーは抗体より小さく、より安定的かつ、化学的に合成でき、アプタマーを検出するためにアプタマーの親和性に影響を及ぼすことなく蛍光標識が可能となる。抗体開発と比べて、毒性のあるターゲット(抗体生産のために用いられる時)、または免疫原性が低いか、又は免疫原性のないターゲットのためのアプタマーの開発は実現可能である(Mann et al., Biochem Biophy Res Comm 338:1928-1934 (2005))。さらに、アプタマーの簡単で迅速な製造及び多様な有用性のために、アプタマーは細胞内のターゲット及び細胞以外のターゲットの確認のための有用なツールとなっている(Gopinath, S., Anal Bioanal Chem. 387:171-182 (2007))。アプタマーのセットは、また「hub」タンパク質の関連性のサブセット(subset)を選別的に撹乱(perturbing)する方法を提供することができた(Shi et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:3742-3746 (2007))。
マイクロ流体工学(Microfluidics)はマイクロメーターサイズのチャンネルを利用して非常に小さい体積の液体(〜10−9−10−18リットル)を扱うシステムに関する。小さい体積を扱うことは、分散時間を減少させて超高速の化学的反応を可能にし、要請された位置へ化学物質の移送、交換及びポジショニング(positioning)する間に取得されたサンプル液を正確に調節することを可能にする。微細加工技術と共にマイクロ流体工学は、さらにチップ上において自動化学的プロセスが可能になるように、単一チップにおいてマイクロポンプ(micropump)、マイクロバルブ(microvalve)、マイクロヒータ(microheater)等といった流体要素の統合を実現する。このような理由から、マイクロ流体工学は化学、生物学、医学、及びエンジニアリング分野において超高速及び高処理量でサンプルを分析するのに広く利用できる(Whitesides, G., Nature 442:368-373 (2006))。
発明の要約
従来のSELEXシステムは、実際は反復的でかつ、多くの時間がかかり、ハイスループットの選別のためには不適切であった。SELEXプロセス自体はよくできたものであるが、相対的に低い処理量は、バイオマーカー確認のためのプロテオミクス研究のように多くの区別されるアプタマーを必要とする研究を不可能にする。SELEXによるアプタマー生産の速度及び選別力を増加させるための一つの方法は、プロセスの自動化及び小型化を通して可能となる。最近、迅速でハイスループットの分析の開発のために、マクロスケール(macro-scale)技術の小型化の方向に進歩がなされている。小型化のメリットは、1)少量のサンプル消費、2)ハイスループットな分析能力、3)自家封鎖(self-containment)、4)交差汚染(cross-contamination)の減少、及び5)多機能(multiple functions)の統合を含む(Gopinath, S, Anal Bioanal Chem. 387:171-182 (2007))。特異的RNAアプタマーを分離するために用いられるSELEXプロセスは、目的の特異的ターゲット分子と高い親和性結合ができるオリゴヌクレオチド配列の分離及び増幅のために必要時間を相当減少させ、自動化可能になる。最近、SELEXによるアプタマー生産のために必要な時間を、数ヶ月/数週から、数日に著しく減少させる、種々のマイクロ流体プロトコル(microfluidic protocols)が、より迅速なSELEXプロセスを開発するために紹介された(Hybarger, et al., Anal Bioanal Chem 384:191-198 (2006); Windbichler, et al., Nat. Protoc. 1:637-640 (2006); Eulberg, et al., Nucleic Acids Research 33:e45 (2005))。SELEXプロセスの開発における発展の多くは、選別の効率を改善することを目的としてきた(Bunka et al., Nat Rev Micro 4:588-596 (2006))。しかし、このような研究は小型化、又は多重化された(multiplexed)アプタマー選別を利用していない。
SELEXプロセスは、そのシステムがチップを基盤とし、マイクロ流体環境と統合される場合、迅速な分析、減少した費用及びハイスループットの分析の面において重要なメリットを有しており、潜在的に標準化されることができた。チップを基盤とする酵素分析(Hadd et al., Anal Chem 69:3407-3412 (1997); Joseph W., Electrophoresis 23:713-718 (2002))及び免疫分析(Wang et al., Anal Chem 73:5323-5327 (2001); Sato et al., Anal Chem 73:1213-1218 (2001))は、このような長所を立証した。
従来のSELEX選別方法には、さらに種々の短所がある。従来、選別プロセスが有する一つの問題は、溶液中のフリーのターゲット分子より、固定支持体と結合するターゲット分子に親和性を有するアプタマーが選別されたことである。所望のターゲットに対して親和性を有するアプタマーに収束させるよりも、SELEXの漸進的なプロセスはターゲットと類似する分子(即ち、ターゲットの膜結合誘導体)に結合するアプタマーを選別する。実際に、cAMPを結合するために選別されたアプタマーは、C8位置、ターゲットが固定支持体に結合される同じ位置が修飾されたcAMP類似体に対して強い親和性を有する(Koizumi et al., Biochem. 39:8983-8992 (2000))。より小さいリガンドはアプタマーと相互作用できる官能基(functionalities)の数が限られており、その上、それらの官能基はリガンドを固定支持体に結合させるために、それらの官能基の利用の可能性が減少する。従って、より小さいリガンドに対するアプタマーを選別する場合、固定支持体の影響はより一層大きくなる。
他の問題は、固定支持体自体によって提起された遊離ターゲットの溶液を利用して、活性配列をカラムから除去する、従来のSELEXにおいて用いられる洗浄工程は、ターゲットに対して非常に高い親和性を有するアプタマーに不利な影響を及ぼすと提案された(Klug et al., Mol. Biol. Rep., 1994, 20:37-107 (1994))。クロマトグラフィーカラムから非常に強く相互作用している配列を溶出することが殆ど不可能である点から、重要な関心事はキネティック(kinetic)性向である。ターゲットに対して高い親和性を有する配列は、カラムで簡単に洗浄されない。これは、また溶出が遊離、未結合されたターゲットから形成される間、アプタマーが結合された(固定された)ターゲットに対して非常に特異的な時に発生しうる。従って、選別カラムからピコモル(picomolar)またはさらに低い解離定数を有する配列を回収することは不可能である。
本発明はこのような欠点及び本発明の技術が有する他の欠点を克服するためのものである。
本発明は第一の観点において、注入口と排出口との間に延びている一つ以上の流体チャンネルを有する基板、一つ以上の流体チャンネル内において分子結合部位(前記分子結合部位はターゲット分子を含む)及び分子結合部位に隣接する発熱体(heating element)を含む微小流体装置に関する。望ましくは、分子結合部位はターゲット分子を含む高表面積物質を含む。このような装置を含むキットも本願に開示されている。
本発明は第二の目観点において、一つ以上のターゲット分子と結合する核酸アプタマーを選別する方法に関する。前記方法は本発明の第一の観点に係る微小流体装置を提供する工程及び核酸分子が特異的にターゲット分子と結合する効果的な条件下で微小流体装置に核酸分子の集団(population)を導入する工程を含む。前記方法はターゲット分子と特異的に結合しない全ての核酸分子を微小流体装置から実質的に除去する工程、ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子の変成を誘発するために発熱体を加熱する工程、及びターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を回収する工程をさらに含む。回収された核酸分子は、ターゲット分子と結合するために選別されたアプタマーである。
本発明は第三の観点において、一つ以上のターゲット分子と結合する核酸アプタマーを選別する方法に関する。前記方法は注入口と排出口に延びている一つ以上の流体チャンネルを有する基板及び一つ以上の流体チャンネル内で一つ以上の分子結合部位を含む微小流体装置を提供する工程を含み、前記一つ以上の分子結合部位は各々ターゲット分子を含む。前記方法は核酸分子が特異的に複数のターゲット分子と結合する効果的な条件下で微小流体装置に核酸分子の集団を導入する工程、複数のターゲット分子と特異的に結合しない全ての核酸分子を微小流体装置から実質的に除去する工程、ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を変成する工程、及びターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を回収する工程を含む。回収された核酸分子はターゲット分子と結合するために選別されたアプタマーである。
本発明は第四の観点において、表1〜表8(配列番号24,70及び81を除く)に示されている一つ以上のアプタマーに関する。
本発明は第五の観点において、本発明の微小流体SELEX装置を製造する方法に関する。前記方法は第1ボディー構成要素の表面上にターゲット分子を含むゾル−ゲル(sol-gel)物質を塗布(apply)する工程及び溶液蒸発が起きるようにしてターゲット分子を含む多孔性マトリックスを形成する工程、及び第1ボディー構成要素上に第2ボディー構成要素をシーリング(sealing)する工程を含むが、前記第1及び第2ボディー構成要素は、注入口、排出口、及び注入口と排出口との間に少なくとも一つの微小流体チャンネルを有する微小流体装置を共に規定し、前記多孔性マトリックスは、少なくとも一つの微小流体チャンネルと流体連通(fluid communication)する。
本明細書に説明された微小流体SELEXチップは、SELEXの結果を向上させる多数の重要なメリットを提供する。望ましい実施例の重要なメリットの一つは、微小流体装置の一つ以上の微小流体チャンバーにおいてターゲット分子を固定するために用いられるナノ多孔性ゾル−ゲル物質がターゲットタンパク質に対するアプタマーライブラリー(library)の競争的結合を支援することである。取り込まれた熱源(heat source)は、ターゲットタンパク質と結合する特異的高親和性アプタマーを選別的に溶出するために用いられる。ゾル−ゲルは親和性キャプチャータグ(capture tags)または組み換えタンパク質を要せず、いかなる架橋剤(linking-agent)がなくても天然状態(native state)で多様なタンパク質の封じ込みが可能である。従って、ゾル−ゲル物質中にタンパク質を固定する能力が、ゾル−ゲル物質を小型化された装置のための優秀な候補にしている(Gill I., Chemistry of Materials 13:3404-3421 (2001)、本願に全体として参照文献に組み込まれる)。これは、アプタマーが結合されたターゲットに対して選別されるという従来のSELEXの限界を克服する。これは、強く結合しているアプタマー配列が、絶対ターゲットから溶出しないというキネティックトラップ(kinetic trap)の可能性を低減する。結合したアプタマーから未結合アプタマーの分離(partitioning)または分割(separation)は、重要であり、しばしばSELEXプロセスにおいて律側工程であるため、本発明の微小流体システムは、より一層早くて効果的な代替案になる。
本発明は、さらにハイスループット、及び場合により多重化された選別、及びターゲットに対する特異的なアプタマーの特徴づけを可能にする。微小流体装置は分析時間、サンプルのサイズ及び費用を減少させると同時に処理量を増加させ、連続分析または並列分析に用いられる。また、アプタマーの最適化された分離のための実験手順が開示されている。
本明細書に記載された実施例は、本発明のゾル−ゲル基盤微小流体SELEXシステム、即ち、SELEX−on−a−chipを利用してTATA結合タンパク質(“TBP”,Yokomori et al., Genes & Dev. 8:2313-2323 (1994)、本願に全体として参照文献に組み込まれる)に対する多数のアプタマーの選別を立証する。このような結果は、TBPアプタマーがSELEX−on−a chipを利用して効果的に分離できることを立証し、これは、ハイスループットSELEX方法を支援する前記装置の有用性を確認させる。本発明の微小流体SELEXシステムは、高い親和性のアプタマーを産生するために用いられる選別サイクルの数を50パーセントにまで減少させることによって、選別効率性を効果的に向上させた。本発明の微小流体SELEXシステムの効率性及び有効性の確認として、微小流体SELEXシステムの使用は、従来のフィルターバインディング(filter binding)SELEXによって、以前に分離されたアプタマーと同じまたは相応する高い親和性のTBPアプタマーを産生した。
結果的に、本発明の微小流体SELEXシステムは、自動化されたSELEX機構と組み合わされた単一チップを利用して、多数の区別されるターゲット分子に対するアプタマーをスクリーニングするために用いられる。本発明の微小流体SELEXシステムは、一つ以上の目的のターゲットに対し選別的な新規なアプタマー分子を確認するための能力が、大いに向上している。
(A)SELEX微小流体チップの平面図(plain view)である。(B)チップの電極の上に蒸着されたゾル−ゲルの相対的な位置を示した拡大したイメージである。図示されたゾル−ゲルの直径は約300μmである。(C)SELEX微小流体チップに流体の送出を行うための付随のシステムを共に示したSELEX微小流体チップの概念図(分解組立図)である。マイクロチップを通した流体流れの方向は、陰性のゾル−ゲル(N)からスポット4(spot 4)に流れる。アプタマー収集の順序(order)は他の電極を通過するバッファーから不要な加熱を防止するために流体流れの逆方向(4から3、2、1、そしてその次にN)である。 SELEX微小流体チップに対する製造プロセスを示した図式図である。 微小流体SELEXプロセス及び微小流体チップを示した図である。(A)図3Aはゾル−ゲル由来微小流体チップを利用してアプタマースクリーニングプロセスを説明した図である。簡単に説明すると、ランダムRNAアプタマープール、試薬及びバッファーはキャピラリーを通してチップに送られる。特異的結合親和性を有するアプタマーは、微小流体装置のチャンバーに位置するゾル−ゲル液滴(droplets)に(また、分子結合部位と説明される)ターゲット分子によって閉じ込められる。ゾル−ゲル液滴の5セットは、微小流体チャンネルに沿って均等にスポットされた(Nは陰性対照群である;1はトラップされた酵母TATA結合タンパク質(TBP)を有する。2は酵母転写因子IIA(TFIIA)を有する;3は酵母転写因子IIB(TFIIB)を有する;4はヒトヒートショック因子1(HSF1)を有する)。液滴の間の距離は、他の加熱する電極からの望まない加熱の可能性を防止するために1cmに維持された。各々のターゲットに対して結合されたアプタマーは、各々のアルミニウムマイクロヒータ(aluminum microheaters)を加熱することによって順次溶出された。(B)図3Bは、微小に作製された(microfabricated)ゾル−ゲルチップを示した図である。この実施例は5つの区別されるチャンバーを有する微小流体チャンネルを共に限定する(define)リド(lid)及びスライドと共に、アルミニウム電極セット及びPDMSリドを有するガラススライドを含む。PDMSリド上に打ち出された(embossed)微小流体の部分は、170μm深さ及び300μm広さの微小チャンネル(microchannels)及び1mmの側面長さを有する5つの六角形チャンバーを含む。ゾル−ゲルの単一微小液滴(microdroplet)の一般的な大きさは、概略7nLで、各々の液滴はナノ多孔性構造(nanoporous structure)内部に30fmolesのタンパク質を維持することができる。インキュベーション及び反応目的のために、5つの六角形チャンバーが本装置として考案された。六角形チャンバーの体積及びチャンバーの間を連結するチャンネルの体積は、各々0.22μL及び0.4μLである。微小流体チップの仕上がり規格(finished dimension)は75mm×25mm×5mmである。 ゾル−ゲルの走査電子顕微鏡(SEM)イメージを示した図である。二つの他のタイプのポア(pores)が観察された。大きいポアグループの直径は、約100乃至約200nmの間である。小さいポアグループは約20乃至約30nm直径を有する。このようなポアは、ゾル−ゲルの表面にムラなく分布している。イメージに示されたスケールバーは1μmである。 アルミニウム電極の上にゾル−ゲルスポットの蛍光強度を示した図である。ゾル−ゲルスポットでSYBR−GreenI標識されたdsDNA(100bp、1nM)は、各々の電極加熱によって変成された。電極において多様な電力(powers)を有する時間に対する蛍光強度は指数減衰モデル(exponential decay model)に従ってプロットされた(赤線)。各々のグラフには、20秒間隔ごとのゾル−ゲルスポットの蛍光顕微鏡写真のシリーズが添付されている。適切な時間と電力を得るために1ポイントは、各々のグラフの蛍光強度から計算された。図5Aは、100mW、39.5secを示したものである。図5Bは、424mW、7.4sceを示したものである。図5Cは、536mW、3.3secを示したものである。図5Dは、645mW、1.8secを示したものである。 TBPに対するTATA DNAの結合をグラフで示したものである。(A)図6Aは、時間に対する強度のグラフである。固定されたTBPを有するゾル−ゲルに対するTATA DNAの結合のために、時間に対する強度のグラフは指数減衰モデルに適合する。450mWの電力が、電極に伝えられた。強度減少の必要な半減期は6.4秒であった。強度減少は固定されたターゲットタンパク質からのアプタマー放出のためであると判断される。(B)図6BはCy−3標識されたTATA DNAと結合して溶出した後のゾル−ゲルの視野顕微鏡写真を示したものである。 取得されたRNAのゲル電気泳動バンドイメージを示したものである。ゲル電気泳動においてRNAを視覚化するために、RNAはプライマーを利用して逆転写されPCRによって増幅された。互いに異なるRNA濃度を有する4つのサンプルが製造された(図7Aは2.6pmoleを示したものである。図7Bは13pmoleを示したものである。図7Cは77pmoleを示したものである。図7Dは130pmoleを示したものである)。イメージでのバンドの順序は、M(マーカーラダーDNA(marker-ladder DNA))、N(陰性対照群)、1、2、3及び4の順である。陰性バンドは他のバンドと比較して信号を示さないか、又は低い信号を示した。マーカーはゲルに示したバンドの正確なサイズを示す。これはゾル−ゲルでアプタマーがゾル−ゲルその自体に対して非特異的に結合するよりは、例えば、タンパク質のようなターゲットに特異的に結合することを意味する。 他のRNA濃度を有する取得されたサンプルの間におけるバンド強度の比較を示したものである。(A)図8Aは基準マーカー(standard marker、Lane M)の電気泳動度(electropherogram)及び取得されたアプタマー(Lane N,50,30,5)の電気泳動度を示したものである。Lane Nは陰性対照群ゾル−ゲルを示す。アプタマーの初期量は3.56μg(グラフにおいて50に表示)、2.14μg(同30)、及び356ng(同5)である。バンド強度はMatlabプログラムを利用して計算された。強度は選別したアプタマーの量と比例する。陰性対照群からのバンド強度は背景(background)とほとんど同じである。(B)図8Bはバンド強度をグラフで示したものである。 多重化されたゾル−ゲルチップから取得したRNAsの電気泳動移動度変化分析法(EMSA,electrophoretic mobility shift assay)の結果を示したものである。ターゲットタンパク質に対する取得されたアプタマーの親和性がテストされた。全ての取得されたRNAsは放射性同位元素タグであるP32で標識された。このようなRNAsは0nM、50nMのターゲットタンパク質(TBP及びTFIIB)と共にインキュベーションされた。EMSAテストはRNAアプタマーが、ターゲット分子にのみ特異的親和性を示すことを意味する:#12は唯一にTBPにだけ親和性を有し、#4は唯一にTFIIBにだけ親和性を有する。その逆には成立しない)。 改善されたin vitro選別サイクル効率(efficiency)を示したものである。(A)図10Aは微小流体SELEXチップを利用することによってRNAプールの三つの新しい生成物(G5’、G6’及びG7’)が従来のSELEX工程4(G4)、5(G5)及び6(G6)から得られたことを示したものである。TFIIBのための従来のSELEXは2×1015配列の開始プール(starting pool)を用いてスタートした。(B)図10Bは微小流体SELEXチップからP32標識されたRNAプール(G6’及びG7’)を有する電気泳動移動度変化分析法(EMSA)を示したものである。EMSAはTFIIBの濃度を増加させながら(0、2.5、12.5、62.5nM)行われた。(C)図10Cはアプタマー(G7’)がTBPまたはTFIIAには結合していないが、TFIIBには高い親和性を有して結合したEMSAの結果を示したものである。用いられた全てのタンパク質は200nMの濃度を有する。 従来のSELEXプロセスに対し、微小流体SELEXのために用いられたプロセスを比較して示したものである。種々のTBPアプタマーは、フィルターバインディング(filter binding)を用いる従来のSELEXプロセスの11回の工程以後に分離された。本発明の微小流体SELEX方法は、従来のSELEX方法よりさらに少ないSELEXのサイクルが要求された。微小流体SELEXは、フィルターにおける従来のSELEXの二工程以後に行われた。フィルター結合生成物はRNAに変わり、微小流体装置に注入された。本研究の重点は、TBP(TATA結合タンパク質)微小流体SELEXである。TBPアプタマー(ms3、ms4、ms5、及びms6)はSELEXの全てのサイクル以後にシーケンシングされ、これらの配列は表1−4にリスト化された。このような実験は、本発明の微小流体SELEX装置が、ターゲットタンパク質(本実施例ではTBP)に対する特異的アプタマーを固定(hold)及び増幅(enrich)できることを確認させた。従来のSELEXアプタマーと比較して、微小流体SELEXから得られたアプタマーは、二つのグループに分類された(一致するアプタマー及び新しく選別されたアプタマー)。 ゾル−ゲル分析チップを利用したアプタマー結合分析を示したものである。(A)図12Aに示したように、陽性(P)及び陰性(N)対照群と共に、PMMAでコーティングされた96ウェル(well)チップ上に、プリントされたTBPを含むゾル−ゲルスポット(spots)を有する各々のウェル(well)と、分析デザインを示したものである。ms−6工程のためのRNAアプタマープールはCy−3で末端が標識された。(B)図12Bは新しく選別されたアプタマーの各々の結合活性を示したものである。結合活性はゾル−ゲルスポットの蛍光強度を利用して測定された。陰性対照群として、結合分析はアプタマーなしに遂行され、信号強度はTBP液滴の位置で測定された。ms−6.4、ms−6.16及びms−6.38はグループIに属する(別途に標識されたアプタマーと一致)、全ての他のアプタマーは新規なものである。 アプタマー配列に対するMfoldで作られた2次構造(Mfold-generated secondary structures)を示したものである。アプタマー構造の最も低い自由エネルギーは、追加入力した。図14Aはアプタマーms−6.12(△G=−18.5)(配列番号68)を示し、図14Bはms−6.15(△G=−13.9)(配列番号69)を示し、図14Cはms−6.16(△G=−33.7)(配列番号70)を示し、図14Dはms−6.18(△G=−28.23)(配列番号72)を示し、図14Eはms−6.24(△G=−20.80)(配列番号74)を示し、図14Fはms−6.26(△G=−20.60)(配列番号75)を示したものである。各々のアプタマーは、5'末端及び3'末端に一定のプライマー結合領域の49−ヌクレオチド(小文字で表示)が横に配置された、中央に50−ヌクレオチド可変領域(大文字で表示)を有する99のヌクレオチド(nt)で構成されている(配列番号82)。 空圧バルブコントローラー(pneumatic valve controller)及び二つのポンプを有するPDMSポンプバルブシステムを含む96チャンバーマルチプレックス(multiplex)微小流体SELEXチップの概略図を示したものである。 蛍光分析及びTBPに対するアプタマーの結合親和性を示したものである。TBPに対するアプタマーの各々の結合親和性(ms−6.12、ms−6.15、ms−6.16、ms−6.18、ms−6.24、及びms−6.26)はゾル−ゲルチップ分析によって測定された。一つのウェル(well)で、他のタンパク質濃度(0乃至400nM)を有する同じ(duplicate)ゾル−ゲル微小液滴の5類型がスポット(spot)された。一つの液滴の平均体積は、約50nLであった。図13Aは、他の濃度のTBPの分配のための微小液滴位置を示したもので、このようなスポットで蛍光強度が観察された。6つのTBPアプタマーは各々のウェルに添加され、その結果による信号が分析後に示される。図13Bに示したように、結合親和性(K、binding affinities)がスポット強度の平均値によって測定された。全ての分析は繰り返し行われた。アプタマーに対するK価は次のようになる:
Figure 0005597633
本発明は一観点において、変形されたSELEXプロセスを利用してアプタマープールのハイスループットのスクリーニングを遂行するために用いられる微小流体装置に関する。微小流体装置の望ましい実施例はさらに従来のSELEXの種々の欠点を克服し、アプタマーの選別において向上した効率性を提供し、修飾されないターゲット分子と結合するアプタマーの選別を可能にする。
微小流体装置は注入口と排出口との間に延びている一つ以上の流体チャンネルを含む基板、一つ以上の流体チャンネル内の分子結合部位(前記分子結合部位はターゲット分子を含む)及び分子結合部位に隣接した発熱体を含む。
微小流体装置は、共に適切に結合したり、又は連結する際に、本発明の微小流体装置を形成する別個の部品の組合せ、例えば、流体チャンネル(fluid channels)、キャピラリー(capillaries)、ジョイント(joints)、チャンバー(chambers)、層(layers)、及び発熱体(heating elements)を含むが、これに限定されない。微小流体装置は、望ましくは、たとえ必ずしも必要なものではないが、上層部(top portion)、下層部(bottom portion)、及び内部(interior portion)を含み、これらのうち一つ以上が装置のチャンネル及びチャンバーを実質的に限定する。一実施例において、下層部は構造的には概して平面で、実質的に平らな上段表面を有する固体基板である。多様な基板物質が下層部を形成するために用いられる。基板物質は、例えば、フォトリソグラフィ(photolithography)、湿式化学的エッチング(wet chemical etching)、レーザーアブレーション(laser ablation)、空気摩耗(air abrasion)技術、注入モルディング(injection molding)、エンボシング(embossing)、及び他の技術のように公知の微細加工(microfabrication)技術と互換可能であるかを考慮した上で選別されなければならない。基板物質は、また一般的に極端なpH、温度、塩濃度、及び/または電場の印加を含む、微小流体装置が暴露される全体範囲の条件と適合性のあるものが選別される。
望ましい基板物質はガラス(glass)、パイレックス(登録商標)(pyrex(登録商標))、ガラスセラミック(glass ceramic)、重合体物質(polymer materials)、半導体物質(semiconductor materials)、及びこれらの組合せを含むが、これに限定されない。一部の望ましい観点から、基板物質は通常微細加工技術をよく利用する半導体産業と関連した物質、例えば、ガリウム砒化物(gallium arsenide)及びその他の類似するような物質だけでなく、ガラス、石英(quartz)、シリコン(silicon)またはポリシリコン(polysilicon)のようなシリカならなる基板を含む物質を含んでもよい。半導体物質の場合、絶縁(insulating)被覆(coating)または層(layer)、例えば、酸化シリコン(silicon oxide)または窒化シリコン(silicon nitride)を基板物質、特に、電場が印加される部分に提供することが望ましい。
代表的な重合物質は、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(TEFLON(商品名))、ポリビニルクロライド(PVC)、ポリジメチルシロキシサン(PDMS)、及びポリスルホンのようなプラスチックを含むが、これに限定されない。他のプラスチックも用いられる。このような基板は、注入モルディング、エンボシングまたはスタンピング(stamping)のように公知のモルディング技術を利用するかまたはモルド(mold)内で重合体性前駆体(polymeric precursor)を重合することによって微細加工されたマスター(microfabricated masters)から簡単に製造される。このような重合基板物質は、激しい反応条件に対する不活性(inertness)だけでなく、製造の容易さ、安価な費用及び処分可能性(disposability)が、よく知られている。このような重合物質は、微小流体システムにおいてその有用性を向上させたり、または、例えば向上した流動方向を提供するために、処理された表面、例えば、誘導体化されたり(derivatized)、又はコーティングされた表面を含んでもよい。
理想的には、少なくとも部分的に微小流体チャンネルをなす内部を作るために用いられる物質は、さらに生体適合性(biocompatible)を有し、生物付着性(biofouling)に対する抵抗性を有しなければならない。装置の活性表面の部分は、数μmだけであるため、内部を形成するために用いられる物質は、小さい横断面部位チャンネル(約2〜3μmの広さ及び約1〜2μmの高さ程度)及び大きい横断面部位チャンネル(約25〜500μmの広さ及び/または高さ程度、より一層望ましくは、約50〜300μm)全ての構造化が可能な解像度(resolution)を有しなければならない。流体チャンネルの製造のために広く用いられる、いくつかの存在する物質は、このような要求に適合する。
二つのカテゴリーは、次の物質の間において区別される:ガラス、パイレックス(登録商標)、石英等のようなガラス基盤物質(Ymeti et al., Biosens. Bioelectron. 20:1417-1421 (2005)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、及びポリイミド(polyimide)、フォトレジスト(photoresist)、SU−8陰性フォトレジスト、ポリジメチルシロキシサン(PDMS)、シリコンエラストマーPDMS(McDonald et al., Electrophoresis 21:27-40 (2000)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、液体クリスタル重合体(liquid crystal polymer)、テフロン(登録商標)等のような重合体基盤物質。
ガラス物質は優れた化学的及び機械的弾性(resiliency)を有するが、ガラス物質の高価格及び細かいプロセスは、この分野の適用のための使用を少なくしている。対照的に、重合体は流体適用のための選別の物質として、広く受け入れられている。さらに、ボンディング(bonding)、モルディング、エンボシング、融解過程(melt processing)、及びインプリンティング(imprinting)技術のような重合体利用と係る構造技術は、現在開発されている(Mijatovic et al., Lab on a Chip 5:492-500 (2005)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。重合体基盤の微小流体システムのさらなるメリットは、同じ物質で作られたバルブ及びポンプが簡単に統合されることである(Unger et al., Science 288:113-116 (2000)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
微小流体システムの構成のためにPDMS及びSU−8レジストは、特に原料(raw materials)として研究がなされている。2種類共に光学的に透明である反面、機械的及び化学的振る舞い(comportment)は非常に異なる。SU−8はPDMSよりも硬直しており(stiff)(Blanco et al., J Micromechanics Microengineering 16:1006-1016 (2006)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、従って、このような二つの物質の構造技術は異なる。PDMSは、またチャンネルの縦横比によって、壁崩壊(wall collapse)を受けやすい(Delamarche et al., Adv. Materials 9:741-746 (1997)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。PDMS及びSU−8の化学的特性は、所望の用途のための重要な観点になる。二つの物質共に、重合後にPDMS壁(wall)上にタンパク質の付着を誘導することができ、小さい横断面の場合、チャンネルを満たせる疏水性表面を有する。PDMS及びSU−8の表面共に疏水性になるためには、界面活性剤またはプラズマ(plasma)により処理してもよい(Nordstrom et al., J Micromechnics Microengineering 14:1614-1617 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。SU−8の構成要素は、さらに重合後に疏水性になるために構造化以前に変形されてもよい(Chen andLee, J Micromechnics Microengineering 17:1978-1984 (2007)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。非特異的結合によるチャンネル表面の付着(fouling)は、いかなる微小流体適用に対しても明らかに問題となる。事例の証拠は、SU−8がこのような傾向が少ないことを暗示するが、PDMSの性能を向上させるために化学的処理方法も使用可能である点に注意することが重要である(Leeand Voros, Langmuir 21:11957-11962 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
基板物質は、また一つ以上の流体チャンネルを共に規定する、ガラス支持体またはパイレックス(登録商標)支持体と、重合体リド(lid)との結合であってもよい。微小流体装置のチャンネル及び/またはチャンバーは、前記説明された微細加工技術を利用して、通常基板の表面の上またはポリマーリドの下層(bottom)表面において形成されるくぼみ(indentations)またはマイクロスケール溝(grooves)として製造される。通常第2平面基板を含む微小流体装置の上層部の下面は、下層基板の上に覆われた後、下層基板の表面と結合して二つの構成要素の境界面において装置のチャンネル及び/またはチャンバー(内部)をシーリングする。下層部と上層部の結合は、基板物質の性質に従い、多様な公知の方法を利用して行われる。例えば、ガラス基板の場合、装置の上層部と下層部を結合するために高温及び高圧を使用する熱処理ボンディング(thermal bonding)技術が利用される。重合基板は、基板物質の過度な融解を防止するために用いられる温度が、一般的により低い温度である点を除いては類似する技術を利用して結合できる。音響溶接(acoustic welding)技術、または例えば、UV硬化型接着剤(UV curable adhesives)のような接着剤の使用を含む代替方法も装置の重合部分を結合するために利用してもよい。
発熱体は、熱と電気の両方において良い伝導体であるいずれかの物質で作られる。望ましい実施例によると、発熱体は極限のまたは継続的に変化する化学的及び流体環境、例えば極度のpH、温度、塩濃度、電場印加に対する暴露に耐えられる金属である。膨張が微小流体装置において基板から解離または他の問題を誘導しないためには、発熱体を形成するために用いられる物質の膨張(expansion)及び収縮(contraction)する性質は、基板物質の特性に対応して適合すべきである。代表的な金属は、アルミニウム、銀、金、プラチナ、銅及び、合金(alloys)を含むが、これに限定されない。
一実施例において、本発明の微小流体装置は、さらに流体チャンネルを通過する流体が直接的に発熱体と接触しないようにするために、発熱体を封入(encapsulates)する熱伝導性コーティングを含んでもよい。熱伝導性コーティングは、極限の化学的環境と接触する際に、腐食から発熱体の金属の部分の露出を防止することができる。望ましいコーティング物質は、ガラス、パイレックス(登録商標)、ガラスセラミック、及び重合体物質を含むが、これに限定されない。この目的のために一つの望ましい重合体コーティングは、ポリ(メト)アクリレート(poly (meth) acrylate)またはウレタンアクリレート(urethane-acrylate)コーティング物質である。
本発明の微小流体チップは物理的寸法(physical dimention)において、限定されるものではなく、特定の用途のために、便利な任意の寸法を有してもよい。現在の実験装置に適用させるために、基準顕微鏡スライド外部サイズまたはさらに小さい外部サイズを有する微小流体チップを、簡単に製造することができる。チップが質量分析機のサンプルチャンバーまたはインキュベーターのサンプルチャンバーのような機械で用いられる基準サイズに合わせるために、他の微小流体チップの大きさを変更してもよい。本発明の微小流体チップ内のチャンバーは、長方形、正方形、タマゴ形、円形、または多角形などの形態を有してもよい。微小流体チップにおけるチャンバーまたはチャンネルは、正方形または丸底、V状の底、またはU状の底を有してもよい。チャンバーの底の形態は、特定チップに対し均一にする必要はないが、チップで行われる特定SELEXによる要求によって変化させてもよい。本発明の微小流体チップでチャンバーはいかなる幅と深さの比(width to depth ratio)を有してもよい。本発明の微小流体チップにおいてチャンバー(ウェル)及びチャンネルは用いられるサンプル体積の必要条件に適合する任意の体積または直径を有してもよい。チャンバー(ウェル)またはチャンネルは、貯蔵所(reservoir)、ミキサー(mixer)、または化学的または生物学的反応が起きる場所としての役割を果たす。
本発明の微小流体装置は、望ましくは注入口及び排出口との間に位置した少なくとも一つのチャンバー(chamber)及び一つ以上の流体チャンネルと流体連通(in fluid communication)を含む。分子結合部位は、望ましくは少なくとも一つのチャンバー内に含まれる。
一実施例において、微小流体装置はチャンネル毎に、二つ以上のチャンバーを含む。各々の二つ以上のチャンバーは同じターゲット分子を含んだり、二つ以上のチャンバーは異なるターゲット分子を含んでもよい。従って、多重(multiple)ターゲットがロードされた装置は、多様なターゲットにおけるパラレルなSELEXとして用いられる。本実施例は、ターゲットがゾル−ゲル物質に固定され、密にパックされたチャンバー二つ以上を有する微小流体チップを提供することによって、別々に一つのターゲットでSELEXを行う限界を克服することができる。そして、アプタマー選別は平行して行われる。これは多数のターゲットに対するアプタマーの選別を可能にする。
実施例で立証したように、実施例の一つの形態は単一チャンネルに5つのチャンバーを含むが、これは単一コントロールチャンバーと共に4つの区分される分子ターゲットに対するテトラプレックス(tetra plex)SELEXを可能にする。限定されるものではないが、24−プレックス、96−プレックス、120−プレックス、240−プレックス、及びそれ以上を含む他のマルチプレックス形態も意図されている。このような、より多いSELEXマルチプレックスの考案は、単一流体チャンネルまたは多重流体チャンネルを利用して行われる。多重流体チャンネルが提供されていると、別のチャンネルを、例えば、本発明の微小流体SELEX過程を利用した選別の別の工程において用いることができる。
本発明の望ましい実施例において、分子結合部位はターゲット分子を含む高表面積物質(high surface area material)を含む。ターゲット分子が天然状態(native state)で存在する間、ターゲット分子が核酸アプタマーに効率的に結合できるようにするために、高表面積分子はターゲット分子を含んだり、固定するために用いられる。即ち、好ましくは、表面上の結合サイト(binding sites)の使用可能性に影響を及ぼすいかなる方法よっても、ターゲット分子は化学的に修飾されない。分子結合部位は望ましくは微小流体チップの一つ以上のチャンバーを含む。高表面積物質によって、核酸分子が接触でき、可能であれば高表面積物質に含まれたターゲット分子と特異的に結合できる物質のポアに核酸分子が分散できるように物質が充分に多孔性(porous)になるようにする。
高表面積物質はゾル−ゲル由来生成物(Reetz et al., Biotech Bioeng 49:527-534 (1996); Frenkel-Mullerad, et al., J Amer Chem Soc 127:8077-8081 (2005)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、ポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコールを利用して形成されたようなヒドロゲル(hydrogel)由来生成物(Xu et al., Polymer Bulletin 58(1):53-63 (2007); Gurevitch et al., JALA 6(4):87-91 (2001); Lueking et al., molecular & Cellular Proteomics 2:1342-1349 (2003)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、ポリマーブラシ(polymer brush)由来生成物(Wittemann et al., Analytical Chem. 76(10):2813-2819 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)、ニトロセルロース膜カプセル(nitrocellulose membrane encapsulation)生成物、またはデンドリマー系(dendrimer-based)生成物(Pathak et al., Langmuir 20(15):6075-6079 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)であってもよい。このうち、ゾル−ゲル由来物質が望ましい。
ターゲット分子の固定のためにゾル−ゲル物質を利用することの長所の一つは、ターゲット分子を固定するためにリンカー(linker)またはタグ(tag)の使用を要しないことである。ゾル−ゲル物質は小型化可能であるという容易性を有しているために、ゾル−ゲルの中にターゲット分子を封入できることは大きい長所である。この方法は膜カプセル化のような固定のために利用可能な他の方法よりも実現の可能性が高く、それほど複雑ではない。さらに、ガラスゾル−ゲル物質において、固定は簡単な光度測定(photometry)を利用した多くの酵素反応の光学的モニターを可能にする。このようなゾル−ゲル物質を得る方法は、本願に全体として参照文献で組み込まれている文献[Wright et al., “Sol-Gel Materials:Chemistry and Applications”, CRC Press (2000); Pierre, A., “Introduction to Sol-Gel Processing (The International Series in Sol-Gel Processing: Technology & Applications)”, Spinger (1998); Brinker et al., “Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing”, Academic Press (1990)]に詳細に説明されている。
ゾル−ゲルプロセスは、セラミックまたはガラス物質を作るために用いられる湿式化学的工程(wet chemical process)である。一般に、ゾル−ゲルプロセスは、液体「ゾル(sol)」(多くはコロイド)から固体「ゲル(gel)」状態(phase)への相転移を含む。ゾル−ゲルプロセスの適用は非常に多様な形態:超微細な(ultra-fine)、球形のパウダ(spherical shaped powders)、薄いフィルムコーティング(thin film coatings)、セラミック繊維(ceramic fibers)、微小多孔性無機膜(microporous inorganic membrane)、モノリシック(monolithic)セラミック及びガラス、または極端な多孔性エアロゲル(aerogel)物質の形態にセラミックまたはガラス物質を製造することが可能である。本発明によると、ゾル−ゲルが発熱体に隣接するように、即ち、一つ以上のチャンバー内にあることが望ましいという点から、コーティング及びモノリシック構造が望ましい。
「ゾル」の製造に用いられる開示物質は通常無機金属塩(inorganic metal salts)、または限定されるものではないが、Si、Al、Tiを含む物質及びこれらの組合せを含む金属アルコキシド(metal alkoxides)のような金属有機化合物(metal organic compounds)、である。他の金属オキシド(metal oxides)も用いられる。通常的なゾル−ゲルプロセスにおいて、前駆体はコロイド懸濁液(colloidal suspension)または「ゾル」を形成するために、加水分解及び重合反応が適用される。溶媒を除去するための「ゾル」の追加過程は、前記説明されたタイプの異なる形態のセラミック物質を作ることを可能にする。
ゾル−ゲルプロセスは、無機物質への化学的な付着より、増加している共有ゲルネットワーク(growing covalent gel network)にトラップされるタンパク質などの生分子の固定のために相対的にマイルドな手段を提供する(Gill et al., Annals of the New York Academy of Sciences 799:697-700 (1996); Gill et al., Trends in Biotechnology 18:282-296 (2000)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。多数の研究は、広い範囲のゾル−ゲル由来ナノ複合(nanocomposite)物質を利用した酵素(enzymes)、抗体(antibodies)、調節タンパク質(regulatory proteins)、膜結合受容体(membrane-bound receptors)、核酸アプタマー(nucleic acid aptamers)、さらには全体細胞(whole cells)を含む多様な生分子の封入を記載している(Reetz et al., Biotech Bioeng 49:527-534 (1996); Frenkel-Mullerad, et al., J Amer Chem Soc 127:8077-8081 (2005)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
安全面において、ゾル−ゲルに固定されたタンパク質は一般に熱及び化学的変成に対する向上した抵抗性、及び1ヶ月またはそれ以上の向上した貯蔵性及び操作安定性(operational stability)を示す(Kim et al., J Biomat Sci 16:1521-1535 (2005); Pastor et al., J Phy Chem 111:11603-11610 (2007)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。また、Kim et al.((Analytical Chem 78(21):7392-7396 (2006)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)により開発されたゾル−ゲルマトリックス(matrix)の二重ナノ多孔性物質(dual nanoporous material)はポアに固定されたターゲット分子(タンパク質または化学物質(chemicals))を維持すると共に、アプタマーのような分子の分散を可能にする。SELEX方法にゾル−ゲル物質が適用可能である点は、ゾル−ゲル物質の最も大きいメリットである。
一実施例において、分子結合部位(例えば、固定されたターゲットを有するゾル−ゲル)は、重合体コーティング上に形成される。重合体コーティングは、ポリ(メト)アクリレートまたはPMMAであってもよい(Kwon et al., Clinical Chemistry 54(2):424-428 (2008)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。重合体コーティングは隣接した発熱体から、ゾル−ゲル物質(及びゾル−ゲル物質の固定されたターゲット分子)を物理的に分離させて、ターゲット分子への直接的な熱暴露を防止する。
本発明の他の実施例において、分子結合部位は、一つ以上の流体チャンネルまたは一つ以上のチャンバーの表面を含んでもよく、その表面はリンカー分子を介して表面に結合された一つ以上のターゲット分子によって修飾されてもよい。微小流体アレイ(arrays)は、例えば、平らな表面を提供するガラスまたはパイレックス(登録商標)スライド上に製造される。ターゲットタンパク質または他のターゲット分子は、固体支持体の平らな表面に共有的(covalenlty)または非共有的(non-covalently)に結合される。ターゲットは直接的に固体支持体の平らな表面に結合できたり、リンカー分子または化合物を介して固体支持体に付着できる。リンカーは、固体支持体の表面にターゲットの付着が容易になるように、固体支持体の表面を誘導する(derivatize)ような任意の分子または化合物であってもよい。リンカーは、固体支持体の表面において、ターゲットと共有的にまたは非共有的に結合することができる。さらに、リンカーは無機または有機分子であってもよい。基準ガラスカップリング化学(standard glass coupling chemistry)は、リンカー分子と共に用いられる。望ましいリンカーの例としては、ガラスアミンを含有した化合物が挙げられる。
本発明のターゲットタンパク質及び他のターゲット分子は、さらに一つ以上のチャンバーに設置され、そして保持される基板(例えば、ビーズ)と結合することができる。望ましい基板は、ニトロセルロース(nitrocellulose)粒子、ガラスビーズ(bead)、プラスチックビーズ、マグネチック粒子、及びラテックス粒子を含むが、これに限定されない。望ましくは、ターゲット分子は公知の方法を利用して基板に共有的に付着される。
本発明の微小流体SELEX過程は、非常に多様なターゲットに対して望ましい親和性を示すアプタマーを選別するために用いられる。例えば、アプタマーはタンパク質のような巨大な分子ターゲットに結合することで同定されることができる。代表的な巨大な分子ターゲットとしては、lgE、Lrp、E.coli metJタンパク質、エラスターゼ、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素(HIV−RT,human immunodeficiency virus reverse transcriptase)、トロンビン、T4 DNAポリメレース、及びL−セレクチンを含んでもよいが、これに限定されない。アプタマーは、さらにペプチド、アミノ酸、または他の小さい生分子のような小さい分子ターゲットに結合することで確認できる。望ましい小さい分子ターゲットとしては、ATP、L−アルギニン、カナマイシン、リボドマイシン、ネオマイシン、ニコチンアミド(NAD)、N−メチルメソホルフィリン(NMM,N-methylmesoporphyrin)、テオフィリン(theophylline)、トブラマイシン(tobramycin)、D−トリプトファン、L−バリン、ビタミンB12、D−セリン、L−セリン、アミノブチル酸(y−ABA,y-aminobutyric acid)、及び有機染料を含むが、これに限定されない。アプタマーは、さらに、これに限定されるのではないが、例えば、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV,human cytomegalovirus)、バクテリア、真核細胞、細胞器官、及びナノ粒子のような巨大分子(macromolecules)と結合することで確認できる。概略的に、ターゲットとして用いるための適切な生物学的物質は、タンパク質またはポリペプチド、炭水化物、脂質、薬学的製剤(pharmaceutical agent)、有機非薬学的製剤(organic non-pharmaceutical agent)、または巨大分子の複合体(macromolecular complex)を含むが、これに限定されない。炭水化物、多糖類、基質(substrates)、代謝物質(metabolites)、移転類似物(transition-state analogs)、補助因子(cofactor)、薬品分子(drug molecules)、染料(dyes)、栄養分、リポソームも、また微小流体装置、望ましくは多孔性ゾル−ゲルマトリックス内に固定されることさえできればターゲットとして使用可能である。本発明の属する分野における当業者は、本発明のターゲットとして用いられる他の生物学的物質をターゲットリストに簡単に追加することができる。また、生物学的物質は、イオン、リガンド、光学活性化合物、または生物学的または化学的化合物にタグをつけるために通常用いられる構成成分のように、容易に検出することのできる置換体の追加によって、所望のように、標識または修飾することができる。
図1A〜B及び図2を参照して、微小流体装置10の望ましい実施例を説明した。微小流体装置10は、基板12に固定されるPDMSリド14を有するガラス基板12上に形成された。それと同時に、基板12及びリド14は、注入口18及び排出口20の間に形成された微小流体チャンネル16を規定する。チャンネルはチャンネル16の長さに沿って離れている5つのチャンバー22によって特徴付けられる。各々のチャンバー22は、装置の両側にある電気的接触26の間に位置する熱電極24上に位置する。実施例において、熱電極24はポリメタクリレート層28によりチャンバーから物理的に分離される(図2)。基板12上にPDMSリド14を固定する前に、目的のターゲット分子を含むゾル−ゲル物質30は一つ以上のチャンバー22に、望ましくは、熱電極24に隣接したり、又はその上に直接的に蒸着される(図1B)。前記において説明したように、これは各々のチャンバー22にターゲット分子を効果的にトラップする。
図2に示したように、装置10の製造は、基板12の洗浄された表面上に一つ以上の電極24(電極の接触26と共に)を最初にパターニングすることによって行われる。全体の表面は、ポリメタクリレート重合体でスピンコーティングされ、シリコンで(重合体コーティングされた電極上に)マスキング(masking)され、コーティングされた基板は、マスキングされた部分を除いた重合体を除去するためにエッチングされる。重合体層28は微小流体装置内においてチャンバー22から熱電極24を効果的に分離する。エッチング後、目的のターゲット分子を含むゾル−ゲルが形成されることができ、ゾル−ゲル懸濁液はポリマー層28上に蒸着できる。ゾル−ゲル物質の蒸着の後、溶液は蒸発することができるか、または適切な条件下で装置が乾燥させて、それによってゾル−ゲルスポット(spot)30を形成する。次に、基板12は微小流体装置10を形成するために、パターン化されたPDMSリド14で覆われる。
微小流体装置10は図1Cに示された実施例のように、微小流体SELEXシステム40と組合せて用いられる。システム40は、アプタマー集団42(SELEXの事前の工程において選別されたアプタマーの増幅されたプール、またはSELEXを介して選別されたことのない核酸分子ランダム集団)、洗浄バッファー44、ブロッキングバッファー46、及びバインディングバッファー48のための貯蔵所(reservoirs)を含む。貯蔵所は、注入口を通して装置10へ物質の順次の導入のために、マルチポートカップリング(multiport coupling)50及び流体ライン(fluid lines)52を介して共に結合できる。排出口の結合しているものは、バルブ及びマルチポートカップリングを介して、必要により、一つ以上の収集容器(collection containers)56と連結されている、他の流体ライン54である。望ましくは、各々の容器は装置の単一チャンバー、即ち、特定ターゲット分子に対して特異的な単一チャンバーから溶出されたアプタマー集団を受けとる。図1Cに示したように、例えば、容器は陰性チャンバー(Negative Chamber)及びチャンバー1〜4各々に対して提供されている。バルブは特定チャンバーから溶出されるアプタマー集団を、その対応する容器に適切に送るために開閉される。
装置10の内外において多様な流体の移動は、ポンプによって手動で調節され、発熱体の作動(operation)は、各々の電極を介して通電する電流によって手動で調節される。他にも、装置10の内外において流体の移動及び発熱体の作動は、装置中にアプタマープール、洗浄バッファー、ブロッキングバッファー、及び/またはバインディングバッファーの導入を調節する一つ以上のバルブ及び一つ以上のポンプのタイミング及び結合されたアプタマーの溶出及び適切な収集容器にアプタマーの順次の収集のための発熱体作動のタイミングを調節するために設定されたオペレーティングシステム(operating system)を利用して自動的に調節できる。
SELEXプロセスの高い順次的な性質(sequential nature)のため、微小流体チップに係る多様なシステムは、好ましくは自動化されて、コンピュータで作動し、簡単にプログラミング可能となり変更が可能なソフトウェアとつながる。本発明の微小流体システムにおいて、コンピュータはシステムプロセスを調節することができ、解釈(interpretation)のための信号を受信できる。例えば、コンピュータは、SELEXサイクルのために、必要によってストレッジ(storage)からサンプルまたは分析物(analytes)を検索するロボット式のサブシステム(sub-system)を調節することができる。コンピュータは、微小流体装置に受け取るサンプル(smaples)及び試薬(reagents)を引き込む(drawing)順序を指定するために、試料の位置(specimen stations)を調節することができる。圧力差及び電位は、本技術分野において公知のコンピュータインターフェース(computer interfaces)を介したコンピュータによって微小流体装置に適用することができ、これによってシステムの内外において試薬の流れを調節するためのポンプ装置及びバルブを操作することができる。コンピュータは、個別サブシステムであってもよく、マルチアッセイ装置の統合された部品として提供することもでき、モジュール式(modular)サブシステムにおいて個別コンピュータとして分散配置される。
プロセスを調節し、そして検出器信号を解釈するためのコンピュータシステムは、技術分野で公知の任意のシステムであってもよい。コンピュータは、さらにアプタマーが作られて選別されるために、例えば、一つ以上のアプタマーの存在を有する検出信号の分析及び評価、アプタマーを定量するための検出信号の評価、発熱体から消滅した熱の量及び温度を計算するための電力レベルの検出及び評価、融解特性(melting properties)の分析、アプタマーに対するUV吸光度計算に係る有用なソフトウェアプログラムを含む。コンピュータは、チップまたは検出器中において、流体の流れの速度及び方向を調節するために流体の流入(inflow)及び流出(outflow)を調節する一つ以上のバルブ、微小流体チップにある多様な発熱体制御装置(controls)、及び流速コントローラーと機能的に疎通することができる。コンピュータは、さらに電力回路及び機械式駆動器(mechanical actuators)を調節でき、通信線(communication lines)を介して情報を受け入れ、情報を貯蔵でき、検出器信号を解釈でき、相関(correlations)等を作成することができる。
本発明においてシステムは、本明細書で説明された多重分析法(multiple assay method)を行うために、例えば、ソフトウェアシステム中に入力されているデータセット(data sets)及び命令セット(instruction sets)を有するデジタルコンピューターを含む。コンピュータは適切なオペレーティングシステム及びソフトウェアコントロールを有するパソコン、または統合された回路、またはメモリーを有するプロセッサー(processor)のようにシステムの中で統合された簡単な論理素子(logic device)であってもよい。検出器信号の解釈のためにソフトウェアが利用可能で、ソフトウェアはVisual basic、Fortran、Basic、Java(登録商標)、またはその他に類似の標準プログラミング言語を利用する技術の中いずれか一つによって簡単に構成される。
図1Cに示したようにシステム40はアプタマーライブラリーの単一ソース(source)を有する単一チップを含むが、一つ以上のチップにおいて二つ以上のアプタマーライブラリーに対して一つ以上のターゲットを実行することによって、本発明のシステムが、多数のSELEX過程行うために適用されることは当業界において通常の知識を有する者にとっては自明である。このような適用は、多様なアプタマーターゲットの組合せ(combinations)を提供する。マルチSELEXシステムは、例えば、一つ以上のターゲットを固定する一つ以上の反応チャンバーを有する微小流体装置、一つ以上の反応チャンバーにおいてターゲットと接触するために流れる2つ以上のライブラリー、及びターゲットとアプタマーライブラリーとの間の接触から流れる信号を検出するために設定された一つ以上の検出器、シーケンサー(sequencers)または分析装置を有する微小流体装置を含む。この結果による信号(resultant signals)は、アプタマーの存在、配列の決定、またはサンプルからアプタマーを定量するために評価される。前記システムは、ターゲット/アプタマー組合せのマトリックスを分析するのに有用である。
本発明の微小流体チップは、多様なサンプル操作位置(specimen manipulation stations)と流体接触することができる。このようなサンプル位置は、ライブラリー容器を一つ以上のピペッター(pipettors)と並んで配列するために、例えば、順次にまたはランダムで回転できる原形トレーにおいて多数のアプタマーライブラリーを固定するサンプルカルーセル(Carousel)のようなオートサンプラ(autosampler)であってもよい。ピペッターは、サンプリングまたは伝達のためにピペッターチューブを試料に浸すことのできる作動アーム(actuated arms)上にあってもよい。微小流体チップは、さらに、例えば、自動コレクター(auto-collectors)であってもよい溶出コレクターと連結できる。このようなコレクターは、SELEXプロセスの間にチップの多様なチャンバーから溶出された流体を収集することができる。試料の位置は、試料または溶出液(elutions)の一つ以上のマイクロタイタープレート(microtiter plate)を固定するように設定される。位置はピペッターチューブの下のいかなるプレートウェルの位置に対しても動きを記録するX−Yを有するプレートを移せる。
本システムの多様な実施例において、サンプルまたは試薬は、例えば、多くの分子ライブラリーの典型的な量のように非常に小量である。このようなライブラリーまたは溶出したアプタマーからのサンプリング、例えば、マイクロウェルプレートまたはマイクロアレイスライド上におけるサンプリングは、マイクロ試料においてピペッターチップに正確に位置するロボット式システムによって成功した。ライブラリーメンバーが脱水形態で維持された実施例においては、本発明の微小流体装置で取得するためのサンプルを溶かすために、ピペッターから小量の溶媒を抽出することによってサンプリングできることは非常に便利である。
本発明の方法は、微小流体チップを用いたSELEXのための改善された方法に関する。SELEXは、特定のターゲットに対して高い親和性を有するRNAまたはDNA配列を同定するための、in vitro選別(selection)を用いるコンビナトリアルケミストリー(combinatorial chemistry)への「漸進的な(evolutionary)」アプローチである(Joyce, Gene, 82:83-87 (1989); Ellington et al., Nature 346:818-822 (1990); Tuerk et al., Science, 1990, 249:505-510 (1990)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。多様な刊行物が、SELEXプロセスを説明している(Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol., 4:331-336 (1994); Lorsch et al., Acc. Chem. Res., 29:103-110 (1996); Forst, J. Biotech., 64:101-118 (1998); Klug et al., Mol. Biol. Rep., 20:97-107 (1994); U.S. Patent Nos. 5,270,163、5,475,096及び5,707,796 Gold et al.、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。プロセスは低い親和性バインダ(binders)から高い親和性バインダ(binders)を分離する技術を利用して、ランダムDNAまたはRNAプールから高い親和性の機能的な分子を分離する。これらのターゲットに対し高い親和性を有する機能的配列は、特異的な生物学的受容体(receptors)として働くか、または生医学分析またはイメージ分析において用いられる診断試薬として働く薬品としての使用が見出された。
従来のSELEXの一般的な過程は、ランダムにシーケンスされたDNAのプール(約>1014−1015の独立的な配列)をスクリーニングすることを含んでいる。しばしばDNAは、DNAより機能的であるRNAに転写される。そして、RNAプールは、固相(stationary phase)に付着したターゲット分子を有するチャンバーを通過する。固相化されたターゲット分子に対する親和性を有するRNAsは、固相に維持される。ターゲット分子に対して親和性が殆どないか、又は全くないRNAsは洗浄される。結合したRNAsは、フリーのリガンドを含む溶液を利用したり、または結合条件を変化させることによって、固相から溶出される。それから溶出されたRNA分子は、DNAに逆転写され、生成されたDNAはPCRを利用して増幅される。これが何回か繰り返された場合、選別サイクル(selection cycle)は、プールから非活性RNAsを除去し、ターゲット分子に対して特異性及び高い親和性を有する配列のみを残すことになる。SELEXプロセスは、多様なターゲット分子に対する高い親和性を有する分子を選別することに成功した(Wiegand et al., J.Immun., 1996, 157:221-230 (1996); Huizenga et al., Biochem., 1995, 34:656-665 (1995)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
本発明の微小流体SELEX選別過程は、微小流体チップを利用して核酸の候補混合物(candidate mixture)からターゲット分子の核酸リガンドを同定するために利用された。このような核酸の候補混合物は、さらに「ライブラリー」、「組合せライブラリー(combinatorial library)」、「ランダム組合せライブラリー(random combinatorial library)」、「組合せプール(combinatorial pool)」、「ランダムプール(random pool)」、または「ランダムDNAプール(randomized DNA pool)」とも称される。実施例の方法によると、スクリーンするための核酸の候補混合物において各々の核酸配列は、二つのプライマー特異的部位(primer-specific regions)の横に配置されたランダム部位を有してもよい。ランダムヌクレオチドの数はいかなるサイズであってもいいが、一般に10〜80の間のヌクレオチド長、より望ましくは20〜60ヌクレオチド長を有する。プライマー特異的部位は、プライマーとして機能できる任意のサイズであることができるが、一般に10〜40の間のヌクレオチド長、望ましくは約15〜30ヌクレオチド長を有する。ランダム部位におけるヌクレオチド長は、所望により簡単に増加させたり、又は減少させることができる。これと同様に、各々の末端のプライマー配列は、PCRのために要求される条件によって変更してもよい。また、ライブラリーにおいて用いられるプライマー配列は、PCRが進む間、プライマー−プライマー相互作用またはプライマーダイマー(dimers)の形成を最小にするものを選別することができる。プライマーは多様な融解温度を有するようにデザインされる。プライマーをデザインする方法は、当技術分野においてよく知られている。
前記プールは、ターゲット分子に対して親和性を示さない核酸分子だけでなくターゲット分子に対して親和性を示す核酸分子も含む。核酸分子の候補混合物は一本鎖DNAまたは一本鎖RNAのランダムプール(randomized pools)であってもよい。微小流体SELEXのために用いられるライブラリーは、さらに従来のSELEXにおいて用いられたDNAまたはRNAのランダムプールと類似している(He et al., J Mol Biol 255:55-66 (1996); Bock et al., Nature 355:564-566 (1992)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。或いは、微小流体SELEXプロセスに導入するために用いられるプールは、従来のSELEXを一度または多数の工程まで通過した部分的に選別されたプールであってもよい。
図3Aを参照すると、微小流体SELEXプロセスは一つ以上のターゲット分子と結合する核酸アプタマーを選別する方法に関する。前記方法は核酸分子がターゲット分子と特異的に結合する効果的な条件下で微小流体装置に核酸分子集団を導入する工程を含む。前記方法はターゲット分子と特異的に結合しない全ての核酸分子を微小流体装置から実質的に除去する工程、次にターゲット分子と特異的に結合した核酸分子(即ち、アプタマー)の変成を誘発するために発熱体を加熱する工程、及びその後、ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を回収する工程をさらに含む。アプタマーである回収された核酸分子は、ターゲット分子と結合することのために、選別された。
プロセスは任意の回数で、繰り返すことができる。例えば、産生されたターゲット結合核酸分子が濃縮された集団は(必要により)逆転写でき、増幅でき、次に、(i)クローニングされ、シーケンシングされ、(ii)同じターゲット分子をロードされた微小流体SELEX装置を通過できるターゲット結合核酸分子が濃縮されたプールを形成するために転写できる。または(i)、(ii)の二つの過程共に行われてもよい。
本発明の微小流体SELEXプロセスは、各々固有の配列を有するアプタマー類と称される生成物の部類を産生する。本明細書において使われた「アプタマー(aptamers)」とは、ターゲット化合物または分子と特異的に結合する特性を有する核酸リガンド(nucleic acid ligands)である。しかし、用語「アプタマー」はターゲットに対する核酸の親和性を定量化するものではない。本発明の目的のために、ターゲットに対して高い親和性を有するアプタマーが低い親和性アプタマーのプールから選別された。従って、アプタマーはターゲットに対して高い結合親和性を有し、分子認識(molecular recognition)を示すことができる。選別されたアプタマーは、クローニングされてシーケンシングされ、単一に分離され、そして精製された大量のアプタマーの産生を可能にする。
本発明の一実施例において、核酸アプタマーはRNAで構成され、SELEX方法は選別されたアプタマー集団の逆転写増幅を行うことをさらに含む。微小流体SELEXプロセス後に得られた選別されたRNAアプタマーは、既知の技術である標準の逆転写技術を利用してDNAに逆転写される。逆転写は一本鎖のRNA配列を一本鎖のDNA配列に酵素的に変換させる方法である。逆転写のために用いられる酵素は、RNA依存DNA重合酵素(RNA dependent DNA polymerases)として知られている(U.S. Patent Nos. 5,322,770及び5,641,864 Gelfand、U.S. Patent No. 6,013,488 Hayashizaki、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
本発明の他の実施例において、核酸アプタマーは、DNAで構成され、アプタマーの増幅されたプールの場合、直接増幅されて、所望によりクローニング及びシーケンシング、及び同じターゲット分子をロードされた微小流体SELEX装置を介して再導入(re-introduced)できる。
前記方法は増幅されたアプタマー集団を精製及びシーケンシングする工程をさらに含む。微小流体SELSX過程において得られた生成物である増幅されたアプタマーは、依然として、ターゲット分子に対し類似の結合親和性を有するアプタマー配列の混合物である。このような親和性の差は、小さかったり(例えば、アプタマーに他の位置に現れる類似する配列)または完全に異なる結合メカニズムを示す(ターゲット分子で他のサイトに結合する)。クローニング及びシーケンシングは、各々のアプタマーをキャラクタライズし、及びバインディングモチーフ(binding motifs)の同定(identification)を容易にするために用いられる。当業者に既知である多様なクローニング及びシーケンシング方法は、いずれも各々のアプタマーをキャラクタライズするために用いられる。
特異的信号を発生させたり、又は発生させない反応混合物を形成するために、共に混合されたアプタマー及び試薬がターゲット分子と接触するように、微小流体装置はターゲット分子を含むチャンバーと流体接触するチャンバー及びチャンネルを有するように設計してもよい。ターゲットチャンバーは、微小流体装置の他のチャンバーにおいて試薬と流体接触でき、また、望ましくは試薬またはアプタマーライブラリープールまたは連続または同時に多重試薬、反応物、または生成物を受け取ったり、又は伝達する流体操作位置と流体接触する。
試薬はSELEXプロセスにおいて有用な組成物、例えば、アプタマーまたはターゲット分子と相互作用できて、反応条件を調節できたり、または感知可能な信号を発生できる化学物質または生体分子であってもよい。試薬は、一般にチャンバーにあるターゲットと接触して流れたり、またはアプタマーまたはアプタマープールと接触できる、微小流体チップ上に固定されたり、又は溶液中にある一つ以上の分子である。例えば、試薬は洗浄バッファー、バインディングバッファー、またはブロッキングバッファーであってもよい。他の試薬は変化した光学的信号を提供するためにターゲットと反応する発色団(chromophore)を含む。システムにおいて試薬は、さらに媒質(例えば、ゲルまたは固体支持体)に付着した分子を含み、ターゲットとアプタマーと相互作用することができる。例えば、試薬は固体支持体に親和性物質であってもよい。一つ以上の試薬は、感知可能な信号の発生と係ってもよい。本発明のシステムにおいて一般的な試薬は、例えば、場所特異的試薬(locus specific reagent)、PCRプライマー、標識されたリガンド、発色団、抗体、蛍光団(fluorophore)、酵素、蛍光共鳴エネルギー移転(FRET,fluorescent resonant energy transfer)プローブ、分子ビーコン(molecular beacon)、放射性核種(radionuclide)、及び/またはこれと類似するもの等を含む。
微小流体装置内部は、ターゲット分子が特異的試薬及びアプタマーと接触する部分のチャンバーである。このようなチャンバーは、またターゲット及びアプタマーの間の接触から発生する感知可能な信号を提供するために必要な条件を提供したり、または非特異的またはさらに低い親和性アプタマーから特異的または高い親和性のアプタマーの分離のための条件を提供するために設定される。ターゲット分子に対するアプタマーの親和性は、各々の個別ターゲット、反応条件、及び使用されたアプタマープールに依存する。例えば、反応チャンバーは流れを誘導するための力(forces)を受けることができ、結合または溶出を誘導するために温度を調節でき、流れる間に適当なインキュベーション時間を提供するために十分な長さを有する反応構成成分を固定したり、捉えるための固体支持体を有することができ、選別的な媒質(media)を固定でき、及び/またはその他の類似することが可能である。装置は信号反応チャンバーまたは多重反応チャンバーを有してもよい。
反応チャンバーは、さらに、例えば、チャンバーに反応混合物が存在する間、プログラミングが可能な温度分布を何度も循環(cycle)するサーモサイクラー増幅チャンバー(thermocycler amplification chambers)であってもよい。サーモサイクリングチャンバーにおける増幅反応は、一般にサンプルから少量の又は希釈された核酸配列を増幅してこれらを検出したりシーケンシングするためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。PCR及び他の増幅反応を行うために多くのハイスループットな処理方法は、例えば、装置において増幅された核酸を検出して分析するための方法だけでなく、微小流体装置において増幅反応を含む方法が開発されてきた(U.S. Pat. No. 6,444,461 Knapp, et al.; U.S.Pat. No. 6,406,893 Knapp, et al.; U.S. Pat. No. 6,391,622 Knapp, et al.; U.S.Pat. No. 6,303,343 Kopf-Sill; U.S.Pat. No. 6,171,850 Nagle, et al.; U.S. Pat. No. 5,939,291 Loewy, et al.; U.S.Pat. No. 5,955,029 Wilding, et al.; U.S. Pat. No. 5,965,410 Chow, et al.; Zhang et al. Anal Chem. 71:1138-1145 (1999)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
ある場合には、反応チャンバーは結合形態を形成するための多様な試薬、例えば、特異的にターゲットと反応する化学物質または生体分子のためのインキュベーター及び/またはミキサーとしての役割を果たしてもよい。他の場合、反応チャンバーは選別的な媒質(selective media)の形態で試薬を含んでもよい。選別的な媒質は、サイズ選別的な媒質(例えば、サイズ排除媒質または電気泳動ゲル)、等電点電気泳動(IEF,isoelectric focusing)技術において用いられる両性電解質(ampholyte)バッファー、イオン交換(ion exchange)媒質、親和性媒質(例えば、レクチンレジン(lectin resins)、固体支持体に付着した抗体、金属イオンレジン等)、疏水性相互作用レジン、キレート(chelator)レジン、及び/またはその他の類似するもののような既知の媒質であってもよい。例えば、サイズ排除媒質試薬とサンプルの接触は、他の構成要素から目的の核酸アプタマーを分析できるため、予測された留置時間(retention time)以後に吸光度信号が解釈されて、サンプルにおける核酸の存在または量を測定することができるようにする。
微小流体装置は、さらに、例えば、アプタマーとターゲットの接触した結果、サンプル分析物と反応した試薬からの信号、検出可能な信号の不在(例えば、検出器の感度から信号を発生するのに十分なレベルでサンプル分析物の不在のような解釈可能な信号)、サンプル分析物の量と係る信号の振幅、及び/またはその他の類似するもの等を、信号を検出する検出器によってモニターできる検出領域を有してもよい。検出領域はセンサーと機能的に接触する、一つ以上のチャンネル、チャンバー部分、またはチャンバーであってもよい。例えば、検出領域はpH電極、伝導度測定(conductivity meter)電極のようなセンサーを含んでもよい。検出領域は吸光度、蛍光放出、化学発光、及びその他の類似する光信号(light signals)が測定できるように光波長(light wavelengths)に対し透明な一つ以上のチャンバーを含む。検出器は微小流体装置中または試薬と接触したサンプルから発生する信号を受信できる方向である装置の隣接部に位置してもよい。検出器は、例えば、核酸シーケンサー、蛍光度測定機(fluorometer)、電荷結合素子(charge coupled divece)、レーザー、光電子増幅チューブ(photo multiplier Tube)、分光計、スキャニング検出器(scanning detector)、顕微鏡、またはガルボスキャナー(galvo-scanner)を含んでもよい。試薬及びサンプルの相互作用から検出された信号は、例えば、光波長の吸光度、光放出、放射性、電気伝導度、光の屈折等であってもよい。信号の特性、例えば、振幅、周波数、持続時間(duration)、数値(counts)及びその他の類似する特性が検出される。
検出器は信号を測定できることから、点、線、表面、または体積のような物理的サイズで示される検出地域から信号を検出することができる。多くの実施例において、検出器は反応混合物が反応チャンネルから流れる地点であるチャンネルに沿っている地点(point)の検出地域をモニターする。他の実施例において、検出器は反応混合物が流れたり止まっている間、チャンネルの長さに沿って検出地域をスキャンすることができる。さらに他の実施例において、検出器は試薬とサンプルの相互作用によって示される信号に対して表面または体積のイメージをスキャンすることができる。例えば、検出器は一度に他の多くの分析結果を検出するために多重分析から反応混合物を通過させる多数の平行したチャンネルを同時にイメージ化することができる。
検出器は受信された、結果信号の特性を示す検出信号を伝達できる。例えば、検出器はアナログまたはデジタルゲージ(gage)のように、得られた信号強度に比例する値を表示する出力装置と連結できる。検出器はディスプレー、貯蔵、評価、相関及びその他の類似するもの等に対するアナログまたはデジタル検出信号を送るためにデータ送信線を介してコンピュータと連結できる。
前記の説明された実施例においても、発熱体はターゲット分子と結合した核酸を変成させるために用いられる。本発明の他の実施例において、微小流体装置は発熱体を除外し、代わりに核酸アプタマーの化学的変成を効果的に誘発する強い洗浄剤を含む貯蔵所を含むように変更できる。変成は、核酸が外部ストレスまたは強塩またはホルムアミド(formamide)、グアニジニウム(guanidinium)、またはウレア(urea)のようなカオトロピック剤(chaotropic agent)のような化学物質の適用によって、この三次及び二次構造を失うようにするためのプロセスである。DNAまたはRNAのような核酸の変成は、高温のために生じる。二次構造において、変成は二本鎖を二つの一本鎖に分離する。このような分離は二つの鎖の間の水素結合が切れる時に起きる。三次構造において、RNAの多様な部分の間の水素結合と同じ相互作用は変成によって影響を受ける。
本発明の方法は、回収、逆転写、増幅、精製、及び/またはシーケンシングが、本発明の微小流体装置と流体連通して連結した一つ以上の分離した流体装置で行われることであってもよい。このような装置は、例えば、サーモサイクラー増幅(thermocycler amplification)チャンバー、クロマトグラフィーチャンバー、インキュベーションチャンバー、親和性キャプチャー(affinity capture)チャンバー、配列検出(sequence detection)チャンバーまたは類似する役割を果たす装置であってもよい。チャンバーは検出領域を含み、または、例えば、シーケンシング反応による信号の検出のための検出領域に続く。生成された信号は、任意の適切な検出器によって検出される。検出器は2つ以上の反応チャンバーから信号を各々連続的にまたは同時に検出することができる。サンプルからアプタマーまたはターゲットまたは他の分析物に対する情報を提供する生成された信号は、例えば、サンプルアプタマーと反応した試薬から検出可能な信号またはターゲットとアプタマーの結合による信号、検出可能な信号の不在、及び/またはターゲットと結合したアプタマーの量と係る振幅であってもよい。検出器は、例えば、蛍光度測定機(fluorometer)、電荷結合素子(charge coupled divece)、レーザー、酵素、酵素気質、光電子増幅チューブ(photo multiplier Tube)、分光計、スキャニング検出器(scanning detector)、顕微鏡、またはカルボスキャナー(galvo-scanner)、質量分析機(mass spectrometer)、液体クロマトグラフィー質量分析機、高圧液体クロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィー検出方法、及び/またはその他の類似する検出器であってもよい。
本発明のアプタマーは分析化学ツールとして、広い範囲の診断分析に、そして生医学及び健康研究を含む多くの範囲の研究に有用である。例えば、増加した結合効率性及び/または増加した結合選別性は、特異的生物学的受容体に作用するアプタマー薬剤の開発に有用である。向上した結合効率性及び選別性を有するアプタマーは、副作用が少なく、増加した薬理活性(pharmacological activity)を立証するするものである。向上したアプタマーは、さらに検出限界が結合親和性と関連している点で、診断分析の開発に有用である。改善されたアプタマーは、また多くの分野において、例えば、医学分析、in vivoイメージ及びバイオセンサーにおいて診断マーカーとして用いられる。選別性の向上は、さらに複合体マトリックスに存在するターゲットの定量化(quantization)に有用である。アプタマーは、分析物に対する分析と同様に他のアプタマー−基盤分析に使用するために開発される。アプタマーを使用するための多様な方法は、先行技術から説明され、そして本発明で説明された方法はこのような適用によって簡単に延長できる(German et al. Anal. Chem., 70:4540-4545 (1998); Jhaveri et al., J. Amer Chem. Soc., 122:2469-2473 (2000); Leeet al., Anal. Biochem., 282:142-146 (2000); Bruno et al., Biosens. Bioelec., 14:457-464 (1999); Blank et al., J. Biol. Chem., 279:16464-16468 (2001); Stojanovic et al., J. Am. Chem. Soc., 123:4928-4931 (2001)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
本発明の微小流体SELEXプロセスは、さらに、神経ペプチド(neuropeptide)またはグルタミン酸塩(glutamate)、亜鉛(zinc)のような小さい分子神経伝達物質(neuromessenger)のように目的の神経化合物に対する診断分析を開発するために用いられる。アプタマー基盤の診断分析は、さらにin vivoでピコモル(picomolar)濃度に存在する神経ペプチドの分析を可能にするものである。アプタマーは薬剤として使用され、特定生物学的受容体に対する親和性を有する分子を選別することによって設計される(Osborne et al., Chem. Rev., 97:349-370 (1997); Brody et al., Rev. Mol. Biotech., 74:5-13 (2000); White et al., J. Clin. Invest., 106:929-934 (2000)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。このようなアプタマー薬剤は、生物学的経路を変更するために用いられたり、またはウイルスまたは癌細胞のような病原体を除去するためにターゲッティングするために用いられる。例えば、IgEと結合したアプタマーは、免疫反応を抑制してアレルギー反応及び喘息を治療するのに有用である(Wiegand et al., J Immun., 1996, 157:221-230 (1996)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。本発明のSELEX方法は、ターゲット分子と結合するだけではなく、触媒としての役割を果たすRNAsまたはDNAsの選別に用いられる(Lorsch et al., Acc.Chem.Res., 29:103-110 (1996)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。本発明のアプタマーは、向上したin vivo安定性または向上した伝達特性のように核酸リガンドで向上した特性を有する修飾された核酸を含むアプタマーを含む。このような変形の実施例は、リボース(ribose)及び/または燐酸(phosphate)及び/または塩基位置(base positions)で化学的置換を含んでもよいが、これに限定されない。
本発明のまた他の観点は、本明細書で説明された微小流体SELEXプロセスを行うための手引きであるだけでなく、本発明の微体流体装置またはチップ、及び選別的に一つ以上の核酸分子のランダムプール、洗浄バッファー、バインディングバッファー、ブロッキングバッファー、逆転写、PCR、及び/または転写を行える試薬を含むキットに関する。本発明の微小流体装置またはチップは区別されるチャンバーにおいて一つ以上のターゲット分子が既にロードされている装置の場合、完全に組み立てられた形態でキットに提供できる。そうでなければ、キットがターゲット分子を固相化するための試薬、(望ましくは、高表面積物質(例えば、ゾル−ゲル試薬))、及び装置またはチップの固定及び組み立てを行うための手引きを含める場合、微小流体装置またはチップは組み立てられない形態でキットに提供される。
以下、本発明の望ましい実施例によってより一層詳細に説明する。
実施例1−8のための物質及び方法
化学物質及び物質:SU−8 2075及びPMMA A11は、Microchem(Newton, MA)から購入した。平面ガラススライド(Plain glass slides)は、VWR(Batavia, IL)から得られた。マルチチップ製造のための4インチ径のパイレックス(登録商標)ウェハーは、Corning(Corning, NY)により提供された。組み換え酵母TATA−結合タンパク質(TBP)及び酵母TFIIB(Transcription Factor IIB)タンパク質は公知の通り製造された(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。SDS−PAGEゲル電気泳動は、タンパク質の発現を確認するために使われた。SDS−PAGEゲルを製造するために、2mLの30%アクリルアミド混合物、1.25mLの1.5Mトリスバッファー(pH8.8)、1.7mLの蒸溜水、100μLの10%SDS及び100μLの10%APSが混合して、アクリルアミドゲルの最終濃度が12%になるようにした。PDMS製造のためのSylgard184シリコンエラストマーキット(Sylgard 184 silicone elastomer kit)は、Dow Corning Corporation(Midland, MI)から得られた。ルアーラック(lure lock)、キャピラリー(capillary)及びコネクター(connectors)を含む全てのキャピラリー消耗品(capillary supplies)は、Upchurch Scientific(Oak Harbor, WA)から得られた。RNAアプタマーを注入するために50μL及び25μLシリンジをHamilton(Reno, NV)から購入した。微小流体装置へバッファーを流すためのシリンジ(1mL及び3mL)は、Aria Medical(San Antonio, TX)から得られた。
タンパク質製造:TBP(TATA結合タンパク質)、TFIIB(Transcription Factor II)、及びhHSFI(human Heat Shock Transcription Factor I)の全長His−タグバージョン(versions)は、標準のHis−タグのタンパク質精製プロトコル(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004); Sevilimedu et al., Nucleic Acids Res. 36:3118-3127 (2008); Zhao et al., Nuclec Acids Res. 34:3755-3761 (2006)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)に従ってBL21−DE3細胞から精製された。酵母TFIIA(Transcription Factor IIA)の場合、組み換えタンパク質はS.Hahn(Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle)から得られた方法を利用して精製されたが、ここで、サブユニット(subunits)Toa1及びToa2はE.coliで各々発現し、8Mウレアで変成されて、ウレアを透析することによって結合されて再生された(Hahn et al., Cell, 58:1173-1181 (1989)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。透析膜(MW10,000)は製造者の指示とおり製造した。精製されたターゲットタンパク質分画は、1L透析バッファー(20mM Tric−HCL、50mM KCl、及び10%グリセロール、pH8.0)に対し4℃で一晩透析した。このようなタンパク質の発現及び精製は、SDS−PAGEで確認した。
[実施例1]SELEX−on−a−Chipのための微小流体装置の製造
図1A〜Bに説明されたタイプの微小流体チップは、微小流体チャンネルまたはチャンバーを有するPDMS(polydimethylsiloxane, Dow Corning, MI)リド(lid)、及びアルミニウム電極セットを有するガラスまたはパイレックス(登録商標)スライドを含む。Sylgard184キットは、PDMSリドを製造するための硬化剤(curing agent)及びシリコンエラストマー塩基(silicon elastomer base)を提供した。硬化剤対エラストマー塩基の比(1:10 w/w)は、PDMSリドの良好な性能及び弾性をもたらした。硬化剤及びエラストマー塩基を混合して混合物のガスを除去した後、この混合物は既に製造されているSU−8(SU−8 2075、Microchem)マスターに注入された。前記SU−8マスターは、標準の光学リソグラフィを利用して、1mm厚さシリコンウェハー上にパターン化された。PDMSリド上にエンボシングされた微小流体部品は、170μm深さ及び300μm広さの微小チャンネル及び5つの六角形チャンバーまたは1mmの横長さを有するウェル(wells)であった。PDMSリドの厚さは約5mmである(図3B)。
アルミニウムの柔軟性は、ミクロン(micron)の厚い層以上の応力がない蒸着物(stress-free deposition)を許容するため、アルミニウムが加熱器金属として選別された。平面ガラススライド及び4インチパイレックス(登録商標)ウェハー共にアルミニウムを蒸着するための基板物質として使われたが(そして、非常に多くの電極組立体はパイレックス(登録商標)ウェハー上に導入される)、SELEX−on−a−chipのために製造された装置は、5電極組立体にパターン化された平面ガラスグラスを使った。ガラススライドは、RCA洗浄法を利用して洗浄された。RCA洗浄法は、NHOH、H、及びHOの1:1:5溶液を有して、75℃で行われる第一工程、HCl、H、及びHOの1:1:6溶液を有して75℃で行われる第二工程を含む。この過程は、ガラススライドの表面上有機汚染物を除去した。次に、ガラススライドは、フォトレジストで覆われた。基準フォトリソグラフィーは、フォトレジスト層をパターンするために使われた。次に、アルミニウムは、フォトレジスト層の表面上に蒸着された。電子ビーム蒸着器(Evaporator-CHA MARK 50)を利用して、1.2μmの全体厚さを有するアルミニウム層を得た。蒸着後、フォトレジストは、N−メチルピロリドン、リフト−オフ(lift-off)溶媒(Microposit 1165, Microchem)により24時間かけて順次除去された。このように作られた電極は、タンパク質結合アレイの選別された要素から結合されたアプタマーを放出するために局部的な熱源として作動する。これは図2に示した。
ガラススライド表面上にアルミニウム電極の蒸着後、1.4μmの厚さのポリメチルメタクリレート(PMMA,polymethyl-methacrylate)層が基準フォトリソグラフィー及びPlasma Therm 72(Qualtx Technology Inc., TX)を利用した反応性イオンエチングプロセスを利用してパターン化された。これも図2に示した。
PDMSリドの結合以前に、ターゲット分子を含むゾル−ゲル混合物はアルミニウム電極の上部の上にパターン化されたPMMA表面上に蒸着された(図1B及び2)。ゾル−ゲル物質は、以前に公知の方法により若干変形して製造された(Kim, et al., J. Biomat Sci. 16:1521-1535 (2005)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
下記実施例2〜4の装置のため、TBPだけゾル−ゲルにロードされた。実施例5の装置のため、TFIIBだけゾル−ゲルにロードされた。
実施例6の装置のため、タンパク質yTBP、yTFIIA、yTFIIB及びhHSF1を含むゾル−ゲル液滴は、ピン−タイプスポッタ(pin-type spotter, Stealth Solid pin,SNS6)を利用して各々単一アルミニウム電極加熱器の中央上にスポットされた。このような4つのタンパク質がロードされたゾル−ゲルは、図3Aに示したように、チャンバー1−4に置かれた。5番目のチャンバーNは、陰性対照群として維持しタンパク質がロードされなかった。ゲル化(gelation)のために、チップは12時間かけて、湿気チャンバー(humidity chamber、〜80%湿度)に残っていた。パターン化されたPMMA層は、表面に対するゾル−ゲルネットワークの付着性を向上させる。その上、電気的に接触する間、電気化学的エッチング(electrochemical etching)からアルミニウム層を保護する。シリケートゾル−ゲルネットワークのスポットは、通常約7nLの体積を有し、約300μm径を有する。
ゲル化の完成後、伝導性金属層(約20nm)は、リフト−オフ蒸着プロセスを利用して、ゾル−ゲルスポットの表面上に蒸着された。電子ビーム蒸着器(Evaporator-CHA MARK 50)が使われた。次に、ゾル−ゲルスポットの表面は走査電子顕微鏡(scanning electron microscope, Zeiss Ultra, Carl Zeiss, Germany)を利用して観察された。
二つの異なるタイプのポアが観察された。小さいポアは約20〜30nmの径を有し、大きいポアは約100〜200nmの径を有する(図4)。全体ゾル−ゲル表面に亘ってムラなく分散されたこのようなポアは、内部に固相化されたタンパク質に行く分子通路として作用する。5つのゾル−ゲルセットは、微小流体チャンネルに沿って均等にスポットされた。
チャンバーと電極の位置に基づいたゾル−ゲルの間の距離は、他の電極によるバッファーの好ましくない加熱を防止するために1cmで維持された。インキュベーション及び反応目的のために、六角形のチャンバーがゾル−ゲル周囲に置かれた。六角形のチャンバー及びチャンバーの間を連結するチャンネルの体積は、各々0.22μL及び0.41μLであった。
ゾル−ゲルがゲル化状態にある間、PDMSは、SU−8マスター上に注入された。結合する前に、ゾル−ゲルスポットは、PDMS細胞培養ウェル(cell culture wells)及びPDMSプラスチックリド(Culture well, Grace Bio-Lab)で覆われて酸素プラズマ損傷から保護された。ガラス基板及びPDMSリドは、酸素プラズマ処理下で結合される。図2は詳細にマイクロチップ製造過程の図面を示す。完成された微小流体装置及び実験装置構成(experimental set up)は、図1A〜C及び3Bに示した。微小流体チップの仕上がり規格は75mm×25mm×5mmであった。
[実施例2]加熱器電極設計及び特性化
5つの加熱器電極のセットは、前記説明したように、微小流体チップ中で統合された。このような電極は、プローブステーション(probe station)使用のために二つのパッド(pad)部分及び熱を発生させるための狭いレジスターの部分を含む。電極の全体抵抗は、厚さにより約2<5Ωであった。加熱器電極を特性化するために、81.5℃の融解温度を有するTATA DNAは、TBPを含むゾル−ゲル状で多様な条件で加熱した。TBPはよく定義されたテストシステムであるため、タンパク質−アプタマーカップル(pair)として酵母TATA結合タンパク質(TBP)及びTATA DNA領域が使われた。TBPは最も重要な真核生物のコアプロモーターモチーフ(core promoter motifs)、TATA配列(TATA element)を認識する。TBPは酵母で全てのRNA重合酵素による転写のために必須である。TBP及び挿入性(intercalating)SYBR Green(商品名) I(Invitrogen, molecular Probes)染料で標識されたTATA DNAは、ゾル−ゲルが製造される間に混合物中に含まれた。TATA DNA融解温度は、定量化PCR機を利用して測定された。完全ゲル化後、90μL/min流れのバインディングバッファーを有する微小流体チャンバーでゾル−ゲルは、22Wまで電力を生産できるKeithley 2400ソースメータ(Cleveland, OH)を利用して、電極に電流を印加することによって加熱した。加熱の影響は、蛍光顕微鏡(fluorescence microscope)で同時に観察された。IP−Labソフトウェアは、5分かけて30連続した蛍光イメージを得るために使われた。各々のゾル−ゲルスポットの蛍光強度は、Matlabプログラムを利用して分析された。
図5A〜Dに示したように、多様な電位が電極に印加された。ゾル−ゲルの該当する蛍光イメージは、各々のグラフに貼付した。独立的に、2分内にPBSバッファー液滴(<10μL)をボイルするための電極の能力が確認された。これを基にして、100mW、424mW、536mW、645mWの電力は各々のゾル−ゲルに伝達された。電力が伝達される間に続く蛍光イメージ(イメージの間は20秒間隔)が得られ、各々のイメージの強度は、時間に応じてプロットされた。このような強度の挙動は指数減衰モデル(exponential decay model)に従うように思われる。従って、データはモデルに適していた。
I=I+I−t/τ
前記式で、Iはゾル−ゲルの強度、Iはゾル−ゲルに対する蛍光分子の非特異的結合の強度、Iはゾル−ゲルの初期強度及びτは強度の半減期を意味する。全ての4つのグラフは、得られたデータの間で良好な一致を示し、高い相関(100、424、536、645mWに対し各々R<0.9853、0.9905、0.9969、0.9976)を有する前記方程式のモデルに適している。また、強度減少に対する半減期は、100mW、424mW、536mW及び645mWに対し各々約39.4秒、7.4秒、3.4秒及び1.8秒であった。このような結果は、400mW以上の電力が電極に伝達される時、アルミニウム電極は、TATA DNAの融解温度(81.5℃)以上でゾル−ゲルを加熱したことを意味する。
[実施例3]固相化されたタンパク質と核酸の相互作用の視角化(Visualization)
TBPを有するゾル−ゲルは、PDMSリドで囲まれた。カプセル化以後、チャンネルはシリンジポンプ(Pump 11, Harvard Apparatus, Holliston, MA)と主要チャンネル(main channel)の一端を連結することによって、PBSバッファー(バインディングバッファー)で広範囲に洗浄された。予め洗浄する工程の次に、シリケートゲルスポットは5%脱脂乳と25mM Tris−Cl(pH8)、100mM NaCl、25mM KCl及び10mM MgClが含まれた1Xバインディングバッファーで1時間ブロッキングされた。ブロッキングバッファーは反応混合物で非特異的競争者として作用して高い親和性分子の選別ができるように助ける。その次に、5'−Cy3−GGGAA TTCGG GCTAT AAAAG GGGGA TCCGG−3’(配列番号1)及び5’−CCGGA TCCCC CTTTT ATAGC CCGAA TTCCC−3’(200pmole)(配列番号2)の核酸配列を有する合成された相補的なTATA DNAはアニーリングバッファー(annealing buffer,20mM Tris−Cl(pH7.5)、10mM MgCl、及び50mM NaCl)に最終体積50μLを有するように混合され、95℃で5分間インキュベーションされ、その次に室温でゆっくり冷やされた。Cy−3、シアニン染料は通常二重らせんDNAの融解温度を測定するために使われる。Cy−3で標識されたTATA DNAは微小流体チャンバーに導入され、DNAは2時間インキュベーションされた。そして、洗浄バッファーで洗浄工程が進められた。結合後、固相化されたTBPタンパク質とCy−3標識されたTATA DNAの相互作用は蛍光顕微鏡によって観察された。
Cy−3標識されたTATA DNAは、従来選別されたアプタマーと同様にTBPに対して高い親和性を有する。TBPとTATA DNAの結合分析はゾル−ゲル微小流体チップで行われた。実施例において、TBPだけゲル化する間、ゾル−ゲルに固定された。25μL反応体積に200pmoleのTATA DNAは微小流体チャンバーに導入された。TATA DNAの測定された融解温度は72℃であった。2時間インキュベーション後、全体微小流体チャンネル及びチャンバーは以前と同様に、30分間15μL/minの洗浄バッファーを有して全体的に洗浄された。陰性(negative)ゾル−ゲルを除いたゾル−ゲルの蛍光強度は、蛍光顕微鏡で検出された(図6)。これは、TATA DNAが確実にゾル−ゲルで固定されたタンパク質と結合したことを意味する。図5A〜Dに示したように、ゾル−ゲルの強度は時間が過ぎると共に指数的に減少した。従って、結合したTATA DNAは、電力が伝達される間、ターゲットタンパク質、TBPから放出されたことと思われる。得られたデータは、実施例2に示し方程式と合致するため、強度減少の半減期は以前の実験と比較して、異なる構造(TATA DNA−Cy3+TBP)を使ったが、受け入れ可能な値である450mWの電力、6.4±1.55秒で測定された。このような結果は、アプタマーが微小流体装置に位置したゾル−ゲルネットワークでターゲット分子と共に固定されて、周囲の温度がアプタマーの融解温度を超える時、放出され易いことを意味する。また、アプタマーの固定及び放出は、微小流体装置を利用することによって正確に調節される。
[実施例4]選別的な溶出からのRNAアプタマーの確認
実施例2及び3の結果を基に、ゾル−ゲルマトリックスに固定された生分子の変成温度以上に加熱するための十分な電力が伝達される時、固相化されたタンパク質と結合したRNAアプタマーは溶出すると予測される。RNAアプタマーがゾル−ゲルマトリックスに非特異的に結合する代わりにターゲットタンパク質と結合することを立証するために、固相化されたTBPを有する4つのゾル−ゲル及び陰性対照群実験のためのブランク(blank)ゾル−ゲルは、微小流体装置に点として置かれた。TATA DNAと結合するTBP'と関連した分類1 RNAアプタマーは、TPBに対する高い親和性のために反応サンプルとして選別された。図7A〜Dより、電気泳動度(electropherogram)は、次のことを立証した:1)結合したアプタマーは、成功裡にゾル−ゲルから放出された。基準ラダーであるDNAマーカーは、各々のゾル−ゲルのバンドがRNAアプタマーのバンドの大きさ(<100bp)と一致することを示す、2)バンドがなかったり弱い信号は、ブランクゾル−ゲル(陰性対照群)から検出されたため、RNAアプタマーはゾル−ゲルマトリックスと強く結合しなが、その代りにTBPとは強く結合する、3)与えられたPCRサイクルでアプタマーを分析するための濃度の限界は、約2.6pmole乃至13pmoleである。図8A〜Bは、同じアガローズゲルで各々のサンプルからバンドの強度を比較した。バンド強度は注入されたRNAアプタマーに比例する。これはRNAアプタマーがゾル−ゲルネットワークでターゲットタンパク質と結合する重要な証拠である。
[実施例5]SELEXサイクル効率性テスト
選別で微小流体SELEXチップのサイクル効率性を確認するため、他の工程においてRNAプールからアプタマーを選別する能力がテストされた。以前の実験においてTFIIB及び選別されたアプタマープールの間の主要結合親和性は、SELEXの8番目工程(G8)で初めて示されることを確認した。比較のために、微小流体SELEXは、TFIIB選別のために既知RNAアプタマープールのG4、G5及びG6工程から始まった。このようなRNAプールは、従来のSELEXフィルター結合分析によるスタートプール(各々<2×1015個体)を有して開発された。in vitroで選別実験のサイクルの一つは、ターゲットとして微小流体SELEX装置で4つのゾル−ゲルで固相化されたTFIIBタンパク質を有して行われた。反応マイクロチャンバーで1時間インキュベーション、熱溶出(heat elution)及び転写後、各々の工程(G4、G5、及びG6)から生成物は、G5’、G6’及びG7’と命名した。TFIIBに対するこのような生成物の親和性は、EMSAを利用してテストした。結果は、図9〜図10に示した。G5'を除いたG6'及びG7’では、RNAプール及びTFIIBの間には親和性がある(図10B)。G7’RNAプールは、G6'の親和性よりさらに高い親和性を示した。従って、微小流体SELEXチップは、従来フィルター結合分析の選別効率性より良い選別効率性(2サイクルほど迅速)を示した。実際に生成物が他と結合せず、TFIIBと結合するということは、3個の異なるタンパク質を有するEMSAから確認した(図10C)。TFIIBは重合酵素II転写機構の構成成分であり、DNA、TBP及びTFIIAと四次複合体(quaternary complex)を形成するため、TFIIA及びTBPが選別された。このような3つのタンパク質は互いに非常に関連しているが、G7'生成物はTFIIBにだけに対して親和性を示した。これは、一つのサイクル微小流体SELEX生成物は、TFIIBに特異的に結合することを意味する。
[実施例6]微小流体SELEX−on−a−chip装置上に多重ターゲットタンパク質に対するRNAアプタマーのin vitro選別
全般的な実験構成に対する図式図表は図2に示した。4つの独立的な実験(4つのターゲットタンパク質)は、4つの他のアプタマー濃度を有して行われた。5つのゾル−ゲル液滴は、実施例1で説明したように、微小流体チャンネルに沿って均等にスポットされた。120fmoleの全体(4つのタンパク質に対する)が一つの微小流体装置に固定化されるように、各々のゾル−ゲル液滴は約30fmoleタンパク質を固相化することができる。
開示プールは〜1015個の他のRNA分子を含んでいる。プールメンバーの構造は、PCRによる増幅を促進するための5’−T7プロモーターを含む二つの一定の領域が、側面に配置されている中央に長さ50bpのランダム部位を含む(図14A〜F)。選別及び増幅の初めの二つのサイクルは、既知の従来ニトロセルロースフィルター結合分析を利用して行われた(Yokomori et al., Genes & Dev 8:2313-2323 (1994); Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004); Sevilimedu et al., Nucleic Acids Res 36:3118-3127 (2008)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。各々のRNA−タンパク質混合物は、1Xバインディングバッファー(12mM HEPES pH7.9、150−200mM NaCl、1−10mM MgCl2、1mM DTT)でインキューベションされ、ニトロセルロースフィルターを利用して分離し、結合したRNAはフェノールを有して抽出によって回収され、次のサイクルのために増幅されたプールを取得するために増幅された。これは図11に示した。
二番目のサイクル以後、in vitro選別の4つのサイクル及び増幅は、実施例1の微小流体SELEXプラットフォーム(platform)を利用して行われた(図3A、図11)。微小流体装置に反応サンプルの注入前に、微小チャンネル及び反応チャンバーは、バインディングバッファーで浸され、ゾル−ゲルまたは微小流体装置に対するアプタマーの可能な非特異的結合を防止するために1時間ブロッキングされる。その次に、25μLの体積を有する反応サンプルは、装置に注入され、2時間室温でインキュベーションされた。3.46μL反応体積でRNA種(RNA species)の約1.2pmoleは微小流体チャンバーに導入された。
このようなチップにおいて、全ての反応及び洗浄過程は、シリンジポンプを利用して行われた。インキュベーション及び洗浄以後、90μL/min流れのバインディングバッファーを有する微小流体チャンバーにおいてゾル−ゲル液滴は、Keithley2400ソースメータ(Cleveland, OH)を利用して、電極に電流を印加することによって加熱した。最適の電力(1.5V、450mW)は、hHSF1液滴(排出口に最も近いチャンバー4)から始まって、TBP液滴(チャンバー1)及び陰性対照群(注入口に最も近いチャンバーN)まで熱溶出のために2分間アルミニウム電極に印加された。このようなゾル−ゲルスポットを含むチャンバーの相対的な位置は図3Aに示した。このような順序で加熱を行うことは、その後のチャンバーに好ましくない熱影響を防止した。
各々溶出されたRNAアプタマーは回収され、cDNAで逆転写され、増幅された後、従来のSELEXと共にRNAアプタマーで転写した(図3A)。逆転写反応は、逆転写キット(Invitrogen, CA)を利用して行われた。cDNAは直接PCR工程(15サイクル)に移動した。フォワード及びリバースプライマーの配列は次のようになる:
フォワード(Forward)(配列番号3)
5'−GTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCAACTGCCATCTA−3'
リバース(Reverse)(配列番号4)
5'−ACCGAGTCCAGAAGCTTGTAGT−3'
PCR生成物のバンド大きさ(〜100bp)は、8Mウレアポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。各々のPCR生成物は、QIAquick PCR精製キット(Qiagen, Germany)を利用して精製され、MEGAshortscriptキット(Ambion, USA)を利用してRNAアプタマーに変換された。TBP、TFIIA、TFIIB、及びhHSF1に対する同じモル(Equimolar)のRNAアプタマーは、次の選別工程のために微小流体チップに導入された(図3A)。
以前実験においては、アプタマーは特異的にアプタマー各々のタンパク質ターゲットと結合して微小−加熱(micro-heating)により選別的に溶出できることを立証した。SELEX−on−a−chip戦略に基づいて、最初のタンパク質SELEXは従来フィルター結合SELEXを利用してアプタマーのために選別された酵母TBPを利用して行われた。図3Aに示したように、陰性(negative)SELEX工程を行わずに非常に特異的なアプタマーを得るためにTBPタンパク質は三つのさらに多いタンパク質(TFIIA、TFIIB、及びhHSF1)及び一つの陰性対照群(タンパク質なし)と共に固相化された。これは、また従来のSELEXと比較してサイクルの数を減少する(Jenison et al., Science (New York, N.Y) 263:1425-1429 (1994)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。
高い親和性及び特異的アプタマーを得るために、従来マクロスケールSELEXの場合、ランダムアプタマープールの全体セット(約1015〜1.7nM)が追加された。競争はプールの間でアプタマーの選別性を増加させるため、従来マクロスケールSELEXはタンパク質の量よりさらに多量のプールを使用する。従って、SELEXのための微小流体装置は、少なくとも(プールより1000倍少ない)1.7pMでターゲットタンパク質を固相化することができる。しかし、SELEX微小流体装置は、各々の7nLのゾル−ゲル液滴でTBPタンパク質の30fmole(0.6ng)のみを固相化でき、従って全体120fmoleのタンパク質は、図3Bに示したように固相化される。微小流体装置またはチップ基盤の小型化された分析の場合、プールの複合性(complexity)を失うため、小量の固相化されたターゲットタンパク質(約14倍少ない)はさらに多くの問題を有することになる。従って、微小流体SELEXの初期工程の間、フィルター結合SELEXが使われ、アプタマーの豊富なプールを得た後、特異的でかつ全体の多様なアプタマーを得るために微小流体SELEXが始まった。さらに多くの多重化された装置を使うことは、従来のSELEXを先に行う必要はなくても、ランダム核酸プールの直接的なスクリーニングを可能にする。
図11に示したように、TBPアプタマー選別は、微小流体SELEXを利用して行われ、結果は従来フィルター結合SELEXと比較された(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。二つの工程の初期フィルター結合SELEX以後、微小流体SELEXの引き続いた4工程が行われた。酵母TBPの従来のSELEXの場合、TBPアプタマーは、多くの追加的な陰性選別サイクルと共にSELEXの11サイクル以後に得られる。このような実施例において、非常に選別的でかつ強い親和性アプタマーは、陰性SELEXなしに、やっと微小流体SELEXの3サイクル以後に得られた。このような結果によるアプタマー集団は、前記実施例5で知らされたアプタマーと比較された。TBPターゲットタンパク質は、競争者としてTFIIA(位置2)、TFIIB(位置3)及びhHSF1(位置4)を含む他のゾル−ゲル液滴とタンパク質を持たない液滴(N)を含有する最初位置で固定されたため、追加的な陰性SELEX工程を要しない。これは、微小流体SELEXのサイクルを追加的に減少させて、選別されたアプタマーの選別性を増加させる(図3A)。
6回目の工程(ms−6)から最終的に選別されたアプタマーを利用して、38個の各々のアプタマーが得られてシーケンシングされる。このような各々のアプタマーは、20個のクローン(clones)に属してクローンの配列は、下記表5にリスト化された。
リスト化されたクローンの配列は、シーケンスアラインメント(sequence alignment)を利用する従来フィルター結合(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 101:6934-6939 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)により選別された以前のアプタマーの配列と微小流体SELEXから分離したアプタマーの配列との間で前記言及された比較を基にし、グループI及びグループIIにリスト化された新しく分離したアプタマー配列と共にリスト化されたクローンの配列は、各々100%相同性(aptTBP−#17/ms−6.16及びaptTBP−#1/ms−6.38)及び98%相同性(aptTBP#13/ms6.4)を有する。ms−6.7を除いた、これらのクローンの間では重複した共通配列(consensus sequence)はない。ms6−#4の場合、微小流体SELEXの最も豊富な配列(38個中8個)は以前の研究から分離した(一つの塩基対機構を有する)高い親和性アプタマーであった(Fan et al., Proc. Nat’l, Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。このような結果は、アプタマーの成功的な分離が微小流体SELEXを利用して可能であることを示す。
[実施例7]ゾル−ゲル基盤アレイチップを利用したタンパク質−アプタマー結合分析
微小流体SELEX実験でTBPアプタマーの濃縮(enriching)工程は追加的に研究された。TBPに対する各々の工程(round)のアプタマープール(ms−3、ms−4及びms−5)が収集され、クローニングされてシーケンシングされる。配列は、下記表1−4に示した。驚くべきことに、アプタマー(TBP apt#1)は、3サイクル(微小流体SELEXの最初の工程)以後に選別できる。また、微小流体SELEX−on−a−chipの最初のサイクルで観察される三つのアプタマー分類、ms−3(ms−3.1、ms−3.2、及びms−3.25)は、60%以上(50nt中30nt)が共有された。クローンms−3.1の場合、23各々で4回分類された。さらに、クローンms−3.3は完全にms−4.20、ms−5.4、ms−6.38及びaptTBP−#1と重複した。ms−3.15及びms−3.23によって重複した7つのヌクレオチドは、非常によく保存され、配列データで広く観察された。従って微小流体SELEXを利用して、高い親和性アプタマーは微小流体SELEXの最初のサイクル以後に得られる。
微小流体SELEXから新しく分離したアプタマーの結合活性を追加的に調べるために、アプタマーは各々Cy−3で標識された。TBPに対して選別された各々のアプタマーは、MEGAshortscriptキット(Ambion, USA)を利用して、初めて転写した。簡単に、アプタマー構造DNAsを増幅するPCR以後、増幅された鋳型の1μgはin vitro転写のために製造者の方法に従って用いられた。その次に、アプタマーは、末端デオキシヌクレオチド伝達酵素(TdT,terminal deoxynucleotidyl transferase)を利用してCy3−dUTPで標識された。RNAアプタマー(1nmole)は、全体体積20μLで2nmoleCy3−dUTP(E-biogen, Korea)、200mMポタシウムカゴジレート(potassium cacodylate)にある20ユニット(units)のTdT(Fermentas)、25mM Tris/HCl(pH6.6)、0.25mg/mL牛血清アルブミン(bovine serum albumin)、5mM CoCl及び0.5mM dNTP(deoxynucleotide triphosphate)と共に37℃で4時間インキュベーションされた。10ユニットRNase抑制剤(Boehringer Mannheim)は添加された。反応はEDTAの添加によって停止した。標識されたRNAは、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(phenol/chloroform/isoamylalchol)処理によって抽出され、0.3Mソジウムアセテート(sodium acetate)の存在でエタノール沈殿(precipitation)により回収された。
TBPに対するRNAプールの結合は、ゾル−ゲルチップ分析を利用してテストされた。96−ウェルタイププレート(SPL, Korea)の8直径ウェル(wells)の中で、六つの同じスポットは陰性対照群(タンパク質なし)及び陽性対照群(Cy−3標識されたタンパク質)と共にプリンティングされた。ゾル−ゲルタンパク質チッププリンティング方法は、公知の技術で使用された(Kim et al., Anal Chem 78:7392-7396 (2006)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。ウェルは100μLのPBS溶液に浸され2時間ブロッキングバッファー(20μg/mL tRNAを含むバインディングバッファー)とインキュベーションされた。洗浄以、Cy−3(TdT酵素によって標識された)で標識されたアプタマーは、各ウェルで2時間インキュベーションされた後、15分間3回洗浄された。その結果によるプレートチップウェルは、スキャンされ96−ウェル蛍光スキャナー及び適切なソフトウェアプログラム(FLA−5100及びMulti-gauge, Fuji Japan)を利用して分析された。バックグラウンドの強度(background intensity)は、各スポットの信号強度から引かれた(LAU/mm2)。
各結合活性は、ゾル−ゲル微小液滴の蛍光強度によって測定された(図12A)。結果は図12Bに示した。一部ms−6アプタマーは、従来フィルター結合によって選別された従来のアプタマーより一層特異的にTBPタンパク質と結合した(図12B)。興味深いことに、アプタマーms−6.16は、アプタマーms−6.4よりさらに高い結合活性を示した。このような結果は、TBPapt−#17及びTBPapt−#13間で解離定数(K)が比較される時妥当である(Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6934-6939 (2004)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。それと同時に、このような結果は、微小流体装置が最初の工程の選別以後においてもアプタマーを増幅できるということを確認するものであった。
Figure 0005597633
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[実施例8]選別されたアプタマーの結合親和性(K)測定
結合測定分析のために、5つの他の濃度のTBP(0乃至800nM)は製造され、ゾル−ゲルマトリックスを含むタンパク質は、96−ウェルの表面に滴下された。このようなゾル−ゲルは、製造者の方法に従って非接触分散機械(sciFLEXARRAYER, Scienion)を利用して配置された。単一スポット体積は、約50nLであり、選別されたアプタマーは末端標識方法(end labeling method)により標識された。各々のアプタマー(200pmole)は1Xバインディングバッファー(12mM HEPES pH7.9、150mM NaCl、1mM MgCl、1mM DTT)で1時間室温でキュベーションされた。Xバインディングバッファーで処理された0.2%Tween20で3回洗浄した後、その結果によるスポットは、FLA−5100スキャナーによってスキャンされ分析された。解離定数(K)はTBP濃度に対する結合したアプタマーの蛍光強度をプロットすることで計算され、前記データポイントを非成形回帰分析(non-linear regression analysis)にフィッティング(fitting)することは、下記方程式と共にSigmaplot10.0ソフトウェアを利用して行われた。
y=(Bmax・RNAアプタマー)/(K+ssDNA)
前記yは飽和図(degree of saturation)であり、Bmaxは最大蛍光活性の数で、Kは解離定数である。
結合親和性計算のために、ゾル−ゲルアレイから最も大きい蛍光強度を有する六つのms−アプタマー(ms−6.12、15、16、18、24m、及び26)が選別された。非接触分散アレイアは、前記の通りに使われた。ピンタイプアレイングシステム(pin type arraying system)でK計算のための分析が完了したが、低い濃度範囲で区別可能な信号は現れなかった。このような現象は、検出体積、単一スポットでタンパク質種の数、及び探査物質(probing material)の感度と関連する。図13A〜Bに示したように、スケールが10倍大きくなったゾル−ゲルは交差スポット(cross spot)の間の汚染なしでよく落とされた。Cy−3標識されたアプタマーの結合親和性測定のためにこのような液滴は、ターゲットタンパク質(0〜800nM)を十分に固相化することができる。
全てのアプタマーの解離定数(K)は、ms−6.24[ms−6.12、2.7nM、ms−6.15、13.2nM、ms−6.16、8.3nM、ms−6.18、4.5nM、ms−6.24、92.53nM、ms−6.26、10.56nM]に対するKを除いては低いナノモル(nanomolar)範囲であることを確認した。配列比較の部分で前記言及されたように、ms−6.16は以前に選別されたTBPアプタマー#17と一致した。#17の場合、結合親和性はEMSAによって測定され、#17のKは〜3乃至10nM範囲を示した。興味深いことに、ms−6.16は本明細書で説明されたゾル−ゲルチップ分析で〜8nMのKを有する。また、ms−6.12はこの分析によって測定された2.7nMのK値を有しながら最も高い親和性を示した。このような結果は、結合活性テストと関係があることを示す(図12B)。
アプタマーの二次構造モデルは、Mfoldプログラムを有して予測され、最も安定した予測された折り畳みは、図14に示した。六つのアプタマーの間で明白な配列または2次構造−類似性は観察されなかった。
[実施例9]TFIIA−、TFIIB−、及びhHSF1−特異的アプタマーの確認
実施例6のテトラ−プレックス選別過程は、さらにTFIIA、TFIIB、及びhHSF1に対する特異的アプタマー集団を提供した。6回目の工程選別のアプタマー集団は、シーケンシングされ、下記表6−8で確認された。
Figure 0005597633
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実施例1−9のディスカッション(Discussion)
全てのSELEX接近法において、主な目的は、特定タンパク質、普通タンパク質に対して結合するアプタマーを得るためである。アプタマーは他のタンパク質ドメイン、酵素活性位及び気質−結合センター、等に対するリガンドであってもよい。しかし、ターゲット生分子は、熱または溶媒によって変性されやすいため、ターゲット安定性はSELEX実験で重要な問題である。ゾル−ゲル技術は、生物学的活性形態でターゲット分子固相化のために適用可能であることが立証され、ターゲット化合物に対して高表面積密度を提供した。また、ゾル−ゲルプロセシングは免疫キット、薬品伝達システム及びバイオセンサーのような用途に対して巨大な潜在力を有する(Fouque et al., Biosensors & Bioelectronics 22:2151-2157 (2007)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。このようなゾル−ゲルの最も重要な長所の一つは、ナノサイズのポア形成である。二つの異なるタイプのポアは、ゾル−ゲル表面で観察された(データは図示しない)。全体ゾル−ゲル表面に亘ってムラなく分散したこのようなポアは、内部に固相化されたタンパク質に行く分子通路として作用する。即ち、ゾル−ゲルマトリックスのナノ多孔性構造は、アプタマーのような一部分子の分散を可能にするが、ゾル−ゲルマトリックスのナノ多孔性構造は、ポアに固相化されたターゲット分子、生分子を維持させる。
これに基づいて、ゾル−ゲル由来SELEX−on−a−chip装置を利用してアプタマーを選別する戦略が説明された。重合酵素−II転写機構の構成成分であるTBPに対するアプタマー選別はテストされた。TBPはSELEX−on−a−chipで競争者としてTFIIA、TFIIB、及びhHSF1と共に固相化された。従来のSELEX及び微小流体SELEXによって選別されたTBPアプタマーの間の一致は、タンパク質またはできるだけ小さい分子ターゲットに対するアプタマーのin vitro選別を行うための微小流体装置を利用することの効率性を立証した。TBPアプタマー選別で、微小流体SELEXは6までサイクルの数を減少させることによって選別の効率性を向上させる。従来結合分析を有して高い親和性TBPアプタマープールを得るためには11サイクルかかる。さらに、アプタマーは陰性選別サイクルなくても微小流体SELEXの最初のサイクル以後に選別される。スポット体積調節、チャンバー空間変形、微小流体チップで微小ポンプを利用したアプタマーライブラリーの制限のない循環、及び他のマイクロスケール分離サービス(microscale separation service)との連結によってより大きいタンパク質固定のための変形が簡単に形成され、テストされる。
最近、SELEXプロセスは、多重端末で試薬を除去するためにPCR機及びロボット式操作機で構成されるマクロロボット式システム(macrorobotic systems)の開発と共に自動化されてきた(Cox et al., Bioorg Med Chem 9:2525-2531 (2001); Zhang et al., Nucleic Acids Symposium Series 219-220 (2000)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。プラットフォーム(platform)開発以外にも、SELEXの魅力的な特徴は、小型化されたプラットホームの接続である。Hybarger et al.は自動化された微小ライン/バルブ基盤「開示から終了まで(Start to finish)」SELEX装置を研究してきた(Hybarger et al., Anal Bioanal Chem 384:191-198 (2006)、本願において全体的に参照文献として組み込まれる)。SELEXは依然として単一ターゲットを狙った方法と見なされる。しかし、本明細書では多重化されたSELEX接近法が紹介された。TFIIA、TFIIB、及びhHSF1に対するアプタマーは、4つの異なるタンパク質の各々のアプタマーセットの間で配列を比較するためにTBPアプタマーと共にシーケンシングされて分析された。TFIIA、TFIIB、及びhHSF1に対する三つのセットの間では共通した一つの種(species)があった(配列番号84、表6〜8)。一部種は微小流体SELEXサイクルから豊富であると見られる。理論的には、微小流体システム容量に伴う多数のタンパク質は本システムで固定される。また、多くのタンパク質は他のアプタマーの選別のために競争者として互いに作用することができる。競争を通して、特異的タンパク質に対する高い親和性アプタマーがin vitro選別で多重サイクル以後に存在することができる。
[実施例10]96−チャンバーフォーマットを有するた作動可能な微小流体装置の設計
96−ウェルフォーマットは96個まで区別されるターゲットに対してマルチプレックスSELEXを行うための微小流体チップ及びシステムの構造を可能にする。図15に説明されたシステム設計は、各々のチャンバーが微小発熱体と隣接して各々のチャンバー内外で流体を移動させるための注入口のカップル及び排出口のカップルを含む。一つの注入口及び一つの排出口は、選別されたアプタマー集団の溶出及び回収のために提供された。流体移動に対する調節は、一つの空圧バルブ(pneumatic valve)コントローラー及び二つのポンプを含むPDMSポンプバルブシステムによって調節される。この装置はランダムアプタマー集団または従来のSELEXの二工程によって選別された前のアプタマー集団をスクリーニングするための個別実験で構成されて用いられる。
以上、本発明内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、本発明の思想を逸脱しない多様な変形、追加、置換及びその他の類似する変形が可能であることは明白であり、従って、本発明の範囲は添付された請求範囲によって定義されると見なされる。また、引用されたプロセシング要素または配列の並べ順序、または数字、文字、または他の名称の使用は、請求範囲で明示される順序を除いた他の順序に対しては請求されたプロセスを制限しない。本発明はまた組合せが確実に排除されない限り、本明細書で各々説明されていたとしても他の特徴の組合せを含む。

Claims (41)

  1. 注入口と排出口との間に延びている一つ以上の流体チャンネルを有する基板、
    一つ以上の流体チャンネル内における複数の分子結合部位であって、前記複数の分子結合部位がターゲット分子を含む高表面積物質を含み、前記ターゲット分子は高表面積物質に固定される、分子結合部位;及び
    前記個別の分子結合部位に隣接する発熱体を含む微小流体装置。
  2. 前記発熱体が、前記基板の表面に備えられた電極を含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  3. 前記基板はガラス、パイレックス(登録商標)、ガラスセラミック及び重合体物質の一つ以上を含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  4. 前記基板は一つ以上の流体チャンネルを共に限定する、ガラス支持体またはパイレックス(登録商標)支持体と、重合体リドとの結合体である、請求項3に記載の微小流体装置。
  5. 流体チャンネルを通過する流体が直接的に発熱体と接触しないようにするために、発熱体を封入する重合体コーティングをさらに含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  6. 前記分子結合部位が、重合体コーティングの上に形成される、請求項1に記載の微小流体装置。
  7. 前記重合体コーティングが、ポリ(メチルメタクリレート)である、請求項6に記載の微小流体装置。
  8. 前記高表面積物質はゾル−ゲル由来生成物、ヒドロゲル由来生成物、ポリマーブラシ由来生成物、ニトロセルロース膜カプセル生成物、またはデンドリマー系生成物である、請求項に記載の微小流体装置。
  9. 前記分子結合部位は、前記部位内で表面にターゲット分子を固定する一つ以上のリンカー分子を含む一つ以上の流体チャンネルの表面を含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  10. 前記ターゲット分子が、タンパク質またはポリペプチド、炭水化物、脂質、薬学的製剤、有機非薬学的製剤、または巨大分子の複合体である、請求項1に記載の微小流体装置。
  11. 前記注入口及び排出口との間に位置し、そして前記一つ以上の流体チャンネルと流体連通する、少なくとも一つのチャンバー、及び発熱体に隣接した一つ以上のチャンバー内に位置するゾル−ゲル物質をさらに含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  12. 前記少なくとも一つのチャンバーが、二つ以上のチャンバーである、請求項11に記載の微小流体装置。
  13. 前記二つ以上のチャンバーが、同じターゲット分子を含む、請求項12に記載の微小流体装置。
  14. 前記二つ以上のチャンバーが、異なるターゲット分子を含む、請求項12に記載の微小流体装置。
  15. 前記注入口と連通したマルチポートカップリングをさらに含む、請求項1に記載の微小流体装置。
  16. 前記マルチポートカップリングと連通した一つ以上の貯蔵所をさらに含む微小流体装置であって、前記一つ以上の貯蔵所が、洗浄バッファー溶液、ブロッキングバッファー溶液、バインディングバッファー溶液または核酸分子集団を含む溶液を各々含む、請求項15に記載の微小流体装置。
  17. 次の工程を含む、一つ以上のターゲット分子と結合する核酸アプタマーを選別する方法:
    請求項1〜16のいずれか1項に記載の微小流体装置を提供する工程;
    核酸分子が特異的にターゲット分子と結合する効果的な条件下で前記微小流体装置に核酸分子の集団を導入する工程;
    ターゲット分子と特異的に結合しない全ての核酸分子を前記微小流体装置から実質的に除去する工程;
    ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子の変成を誘発するために発熱体を加熱する工程;及び
    ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を回収する工程であって、回収された核酸分子は、前記ターゲット分子と結合するアプタマーとして選別する工程。
  18. 前記核酸アプタマーが、RNAアプタマーを含み、前記方法が、選別されたアプタマー集団の逆転写増幅を行うことをさらに含む、請求項17に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  19. 前記増幅されたアプタマー集団を精製する工程及びシーケンシングする工程をさらに含む、請求項18に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  20. 前記回収する工程、前記逆転写増幅を行う工程、前記精製する工程及び/またはシーケンシングする工程が、前記微小流体装置と流体連通しながら連結された一つ以上の個別流体装置において行う、請求項19に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  21. 前記導入する工程、除去する工程、加熱する工程、及び回収する工程が各々自動化されている、請求項17に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  22. 次の工程を含む、一つ以上のターゲット分子と結合する核酸アプタマーを選別する方法:
    注入口と排出口に延びている一つ以上の流体チャンネルを有する基板、及び前記一つ以上の流体チャンネル内における分子結合部位であって、前記分子結合部位は各々ターゲット分子を含む高表面積物質を含み、前記ターゲット分子は高表面積物質に固定される分子結合部位、を含む微小流体装置を提供する工程;
    核酸分子が前記複数のターゲット分子と特異的に結合する効果的な条件下で前記微小流体装置に核酸分子の集団を導入する工程;
    ターゲット分子と特異的に結合しない全ての核酸分子を前記微小流体装置から実質的に除去する工程;
    ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を変成する工程であって、前記変成はターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を、個別の分子結合部位に隣接する発熱体で局所的に加熱しておこなう前記工程;及び
    ターゲット分子と特異的に結合した核酸分子を回収する工程であって、ここで、回収された核酸分子は前記ターゲット分子と結合するアプタマーとして選別する工程。
  23. 記分子結合部位が、二つ以上の分子結合部位を含む、請求項22に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  24. 前記二つ以上の分子結合部位は別の位置にある、請求項23に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  25. 前記二つ以上の分子結合部位が、同じターゲット分子を含む、請求項24に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  26. 前記二つ以上の分子結合部位が、異なるターゲット分子を含む、請求項24に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  27. 記部位は二つ以上のターゲット分子を含む分子複合体を含む、請求項22に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  28. 前記変成する工程及び回収する工程は分子結合部位の各々に対して個別に行う、請求項22に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  29. 前記核酸アプタマーはRNAアプタマーを含み、前記方法は選別されたアプタマー集団の逆転写増幅を行うことをさらに含む、請求項22に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  30. 前記増幅されたアプタマー集団を精製する工程及びシーケンシングする工程をさらに含む、請求項29に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  31. 前記回収する工程、前記逆転写増幅を行う工程、前記精製する工程及び/またはシーケンシングする工程は前記微小流体装置と流体連通しながら連結された一つ以上の個別流体装置において行う、請求項30に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  32. 前記導入する工程、除去する工程、変性する工程、及び回収する工程が各々自動化されている、請求項22に記載の核酸アプタマーを選別する方法。
  33. 次の工程を含む、微小流体SELEX装置を製造する方法:
    第1ボディー構成要素に対して発熱体を適用し、そして重合体で発熱体を覆い、それによってゾルーゲル物質が塗布された表面を形成する工程;
    第1ボディー構成要素の前記表面上にターゲット分子を含む前記ゾル−ゲル物質を塗布して、溶液蒸発が起きるようにして、それに固定された前記ターゲット分子を含む多孔性マトリックスを形成する工程;及び
    第1ボディー構成要素上に第2ボディー構成要素をシーリングする工程、それによって前記第1及び第2ボディー構成要素は、注入口、排出口、及び注入口と排出口との間に少なくとも一つの微細流体チャンネルを有する微小流体装置、及び個別の分子結合部位に隣接する発熱体を共に限定し、前記多孔性マトリックスが前記一つ以上の微細流体チャンネルと流体連通する工程。
  34. 前記発熱体が電極である、請求項33に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法。
  35. 前記電極は金属電極である、請求項34に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法。
  36. 前記電極を備える工程が、次の工程を含む、請求項34に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法:
    パターン化されたフォトレジスト層を前記第1ボディー構成要素の上に塗布する工程;
    前記フォトレジスト層上に金属を蒸着する工程;
    前記フォトレジスト層を欠失した第1ボディー構成要素の部位に金属層を形成させるため、第1ボディー構成要素を電子ビーム蒸着機に露出させる工程;及び
    前記フォトレジスト層を除去する工程。
  37. 前記重合体はポリ(メチルメタクリレート)である、請求項34に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法。
  38. 前記第1ボディー構成要素はガラス、パイレックス(登録商標)、ガラスセラミックまたは重合体物質から形成され、前記第2ボディー構成要素は重合体物質から形成されている、請求項33に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法。
  39. 前記第2ボディー構成要素は、注入口、排出口、及び少なくとも一つの微細流体チャンネルを形成するリリーフパターン(relief pattern)を含む、請求項33に記載の微小流体SELEX装置を製造する方法。
  40. 請求項1に記載の微小流体装置を含むキット。
  41. 核酸分子、洗浄バッファー、バインディングバッファー、ブロッキングバッファー、逆転写増幅、PCR、及び/または転写を行うための試薬、及び微細流体SELEXを行うための指針書からなる群から選択される一つ以上をさらに含む、請求項40に記載のキット。
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