KR102414945B1 - 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법 - Google Patents

핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102414945B1
KR102414945B1 KR1020200125774A KR20200125774A KR102414945B1 KR 102414945 B1 KR102414945 B1 KR 102414945B1 KR 1020200125774 A KR1020200125774 A KR 1020200125774A KR 20200125774 A KR20200125774 A KR 20200125774A KR 102414945 B1 KR102414945 B1 KR 102414945B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sol
gel
nanofilter
target material
Prior art date
Application number
KR1020200125774A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210039956A (ko
Inventor
임민철
최성욱
장현주
임정아
임은섭
Original Assignee
한국식품연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국식품연구원 filed Critical 한국식품연구원
Publication of KR20210039956A publication Critical patent/KR20210039956A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102414945B1 publication Critical patent/KR102414945B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/5375—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by changing the physical or chemical properties of the medium or immunochemicals, e.g. temperature, density, pH, partitioning
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 랜덤 핵산 라이브러리를 졸-겔 나노필터를 통과시켜 즉 필터링 방법을 이용하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 용이하게 추출할 수 있으며, 상하 관통 형성되는 중공을 포함하는 졸-겔이 나노사이즈의 채널 내에 형성되어 랜덤 핵산 라이브러리와 반응하는 졸-겔의 표면적을 크게할 수 있어 핵산 선별 효율을 향상시킬 수 있고, 졸-겔 나노 필터는 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 막(membrane) 형태로 피펫 팁 등에 적용하여 사용될 수 있어 시료 분주 및 반응에 용이한 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법에 대한것이다.

Description

핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법 {Sol-gel nanofilter for nucleic acid screening and nucleic acid screening method using the same}
본 발명은 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 랜덤 핵산 라이브러리를 졸-겔 나노필터를 통과시켜 즉 필터링 방법을 이용하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 용이하게 추출할 수 있으며, 상하 관통 형성되는 중공을 포함하는 졸-겔이 나노사이즈의 채널 내에 형성되어 랜덤 핵산 라이브러리와 반응하는 졸-겔의 표면적을 크게 할 수 있어 핵산 선별 효율을 향상시킬 수 있고, 졸-겔 나노 필터는 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 막(membrane) 형태로 피펫 팁 등에 적용하여 사용될 수 있어 시료 분주 및 반응에 용이한 앱타머 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 앱타머 선별 방법에 대한 것이다.
앱타머(aptamer)는 안정된 삼차구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 등으로, 유해물질의 검출, 질병의 진단 및 치료에 널리 이용되고 있으며, 거의 모든 표적 분자에 대해 높은 특이성과 친화성을 가지며 다양한 변형이 가능하고 화학적으로 합성할 수 있으면서 안정성이 뛰어나 항체의 대체 기술로 주목 받고 있다.
위와 같은 용도로 앱타머를 이용하기 위해서는 표적 물질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하여야 하는데, 일반적으로 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 과정을 통해 표적물질에 특이적 결합하는 앱타머를 선별하게 된다. 하지만, 종래의 SELEX 과정은 주로 화학적 변형을 동반하는 결합 방식을 사용하여 결합력이 떨어지고, 표적물질과 핵산 복합체를 단독으로 존재하는 표적물질 및 핵산과 분리하는 것이 어려워, 일 예로 하기 특허문헌처럼 표적 물질이 담지된 졸-겔을 이용하여 표적물질과 핵산 복합체를 효율적으로 분리하는 방법이 이용되고 있다.
하지만, 종래의 졸-겔을 이용해 앱타머를 선별하는 방법은 지지체의 스팃팅되는 졸-겔 조성물(액적)의 부피가 커서, 졸-겔이 굳는 과정에서 균열이 발생하기 쉽고, 졸-겔의 표면적이 적어, 앱타머 선별 효율이 떨어지는 문제가 있다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0035893호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 랜덤 핵산 라이브러리를 졸-겔 나노필터를 통과시켜, 즉 필터링 방법을 이용하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 용이하게 추출할 수 있는 핵산 선별 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상하 관통 형성되는 중공을 포함하는 졸-겔이 나노 사이즈의 채널 내에 형성되어, 랜덤 핵산 라이브러리와 반응하는 졸-겔의 표면적을 크게 할 수 있고, 졸-겔에 형성된 공동(cavity)에서 핵산과 표적물질 간의 상호작용이 잘 일어날 수 있어, 핵산 선별 효율을 향상시킬 수 있는 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 막(membrane) 형태로 피펫 팁 등에 적용하여 사용될 수 있어 시료 분주 및 반응에 용이한 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별용 졸-겔 나노필터는 나노 사이즈의 크기를 가지는 채널이 복수 개가 형성된 몸체부와; 상기 채널에 위치하며, 상하 관통형성된 중공을 가지고, 내부에 표적 물질이 포함된 졸-겔을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별용 졸-겔 나노필터에 있어서 랜덤 핵산 라이브러리가 상기 중공을 통과하도록 하면, 핵산이 졸-겔 내로 유입되고, 이 중 표적 물질에 특이적으로 결합하는 핵산은 상기 표적 물질과 결합하여, 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별용 졸-겔 나노필터는 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 용이하게 시료를 분주 및 반응시킬 수 있는 막(membrane)의 형태를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별 방법은 상기 핵산 선별용 졸-겔 나노필터를 이용하여 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액을 필터링하는 여과단계와, 상기 여과단계가 진행되는 과정에서 핵산이 졸-겔 내부로 유입되어 이 중 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질과 결합하여 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 반응단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별 방법은 상기 반응단계를 마친 후 졸-겔 나노필터를 워싱하여 표적물질에 특이적으로 결합하지 않은 핵산을 제거하는 워싱단계와, 워싱된 졸-겔 나노필터의 졸-겔이 열에 의해 파쇄되어 표적물질에 특징으로 결합하는 핵산이 표적물질에서 분리되도록 하는 가열단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별 방법에 있어서 상기 워싱단계 후, 졸-겔의 내부에는 표적물질-핵산 복합체만 분포하여, 표적물질-핵산 복합체를 단독으로 존재하는 핵산과 용이하게 분리할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 선별 방법에 있어서 상기 가열단계에서는 상기 졸-겔 나노필터에 열을 가해 졸-겔이 파쇄되어 고온의 용출 용액을 통해 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 분리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 랜덤 핵산 라이브러리를 졸-겔 나노필터를 통과시켜, 즉 필터링 방법을 이용하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 용이하게 추출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상하 관통 형성되는 중공을 포함하는 졸-겔이 나노 사이즈의 채널 내에 형성되어, 랜덤 핵산 라이브러리와 반응하는 졸-겔의 표면적을 크게 할 수 있고, 졸-겔에 형성된 공동(cavity)에서 핵산과 표적물질 간의 상호작용이 잘 일어날 수 있어, 핵산 선별 효율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 졸-겔 나노 필터가 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 막(membrane) 형태로 피펫 팁 등에 적용하여 사용될 수 있어, 용이하게 시료를 분주 및 반응시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터의 사시도.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 다른 졸-겔 나노필터의 단면도.
도 3은 도 1의 졸-겔 나노필터를 이용하여 핵산을 선별하는 방법을 나타내는 순서도.
도 4는 채널에 졸-겔을 코팅하는 방법을 나타내는 도면.
도 5는 앱타머와 졸-겔 나노필터(AAO 멤브레인)의 결합 반응 후, 형광 현미경으로 이를 확인한 사진(도 5a: 졸-겔 코팅되지 않은 깨끗한 AAO 멤브레인, 도 5b: 베어(bare) 졸-겔로 코팅된 AAO 멤브레인, 도 5c: 비-표적인 아트라진을 함유하는 졸-겔로 코팅된 AAO 멤브레인, 도 5d: 표적물질인 다이아지논을 함유하는 졸-겔로 코팅된 AAO 멤브레인).
도 6은 열처리를 통한 앱타머 용출 전과 후의 AAO 멤브레인 형광 현미경 사진(도 6a 및 6b) 및 용출된 앱타머의 전기영동 결과 사진(도 6c).
도 7은 AAO 디스크가 장착된 피펫 팁 제조 방법을 나타낸 사진(도 7a), 상기 피펫 팁에서 앱타머 선별을 위해 용액을 반응시키는 과정을 나타낸 사진(도 7b), AAO 디스크에 앱타머가 결합한 것을 확인한 형광 현미경 사진(도 7c), 및 열처리 후 앱타머가 용출됨을 확인한 형광 현미경 사진(도 7d).
이하에서는 본 발명에 따른 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법을 첨부된 도면을 참조하여 설명한다. 특별한 정의가 없는한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터의 사시도이며, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터의 단면도이고, 도 3은 도 1의 졸-겔 나노필터를 이용하여 핵산을 선별하는 방법을 나타내는 순서도이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터의 채널에 졸-겔을 코팅하는 방법을 나타내는 도면이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터와 앱타머를 반응시킨 후 촬영한 형광 현미경 사진이다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터에 열처리를 한 후 촬영한 형광 현미경 사진 및 (도 6a 및 6b) 및 용출된 앱타머의 전기영동 결과 사진(도 6c)이다. 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터를 디스크 형태로 만들어 피펫 팁에 장착하여 실험을 진행한 사진이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 졸-겔 나노필터를 도 1 내지 2를 참조하여 설명하면, 상기 졸-겔 나노필터는 나노 사이즈의 채널(11)을 가지는 몸체부(1)와, 상기 채널(11)에 위치하며, 상하 관통형성된 중공(21)을 가지고, 내부에 표적 물질(22)이 포함된 졸-겔(2)을 포함하여, 랜덤 핵산 라이브러리를 중공(21)을 통과시키면 졸-겔(2) 내부에서 표적물질(22)과 상기 표적물질에 특이적인 핵산이 결합된 표적물질-핵산 복합체를 형성되게 된다.
상기 핵산은 뉴클레오티드를 단위체로 하여 구성된 중합체로, 단일가닥이나 2중가닥의 DNA, RNA와 그 화학적 수식체를 의미한다. 이러한 수식은 선별된 핵산의 증폭을 간섭하지 않는 것으로, 백본(backbone) 수식, 메틸화, 이상 염기상 조합, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 졸-겔 나노필터로 선별하는 핵산은 앱타머일 수 있고, 앱타머는 표적 물질에 친화적, 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다.
상기 몸체부(1)는 졸-겔 나노필터의 외형을 형성하는 구성으로, 상기 몸체부(1)는 상하 관통 형성되며 단면의 모양이 원, 삼각형, 사각형 등의 모양을 가지는 복수 개의 채널(11)을 포함한다. 상기 채널(11)은 폭은 나노사이즈를 가지는 것이 바람직하며 예컨대 10 내지 200nm의 사이즈를 가질 수 있으며, 상기 채널(11)의 길이는 나노 또는 마이크로 사이즈를 가지는 것이 바람직한다. 상기 몸체부(1)는 다수의 채널(11)을 가지는 입체적 형상을 형성할 수 있는 종래의 소재 및 성형 방법이 이용될 수 있으며, 예컨대 AAO(anodized/anodic aluminum oxide) 등을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 졸-겔(2)은 상기 채널(11)에 위치하며, 상하 관통형성된 중공(21)을 가지고, 내부에 표적 물질(22)이 포함된 구성으로, 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액이 상기 중공(21)을 통과하도록 하면, 핵산이 졸-겔 내로 유입되고 이 중 표적 물질(22)에 특이적으로 결합하는 핵산은 상기 표적 물질(22)과 결합하여, 표적물질-핵산 복합체를 형성하게 된다. 상기 표적 물질의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대 다이아지논 등과 같은 작은 분자도 사용할 수 있다. 상기 졸-겔은 다양한 화학적 조성과 준비 반응을 통해 나노 스케일에서 마이크로 스케일까지의 기공(pore) 크기를 형성하는 실리케이트(silicate) 기반 화합물이다. 이러한 기공은 핵산 또는 앱타머가 공동(cavity)에서 표적 물질과 결합할 수 있도록하여, 표적-특이적 결합 반응에 따라 핵산을 선별할 수 있게 한다. 상기 졸-겔은 기존 SELEX 기술에서 사용하던 졸-겔을 사용할 수 있으며, 일 예로 사마리움을 함유한 티탄산 비스무스 강유전체(BSmT; 일예로 Bi3.35Sm0.65Ti3O12의 화학식을 갖는 조성물을 포함함), 테트라메틸오르토실리케이트 (TMOS), 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 메틸트리메톡시실란 (MTMOS), 에틸트리에톡시실란 (ETrEOS), 트리메톡시실란 (TMS), 메틸트리메톡시실리케이트 (MTMS) 및 3-아미노프로필트리메톡시 실리케이트(3-ATMS)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 실리케이트 단량체, 폴리 글리세릴 실리케이트 (PGS), 다이글리세릴 실란(DGS), 3-글리시드옥시 프로필 트리 메톡시 실란(GPTMOS), (N-트리에톡시실릴프로필)-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(PEOU), 글리세롤 및 분자량 100~10,000의 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 첨가제를 여러 비율로 혼합하여 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시예는 상기 졸-겔 나노필터를 이용하여 핵산을 선별하는 방법에 대한 것으로, 상기 졸-겔 나노필터를 이용하여 핵산을 선별하는 방법을 도 1 내지 3을 참조하여 설명하면, 상기 방법은 상기 졸-겔 나노필터를 이용하여 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액을 필터링하는 여과단계(S1)와, 상기 여과단계(S1)가 진행되는 과정에서 핵산이 졸-겔 내부로 유입되어 이 중 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질과 결합하여 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 반응단계(S2)와, 상기 반응단계(S2)를 마친 후 졸-겔 나노필터를 워싱하여 표적물질에 특이적으로 결합하지 않은 핵산을 제거하는 워싱단계(S3)와, 워싱된 졸-겔 나노필터의 졸-겔(2)이 열에 의해 파쇄되고 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질에서 분리되도록 하는 가열단계(S4) 등을 포함한다.
상기 여과단계(S1)는 상기 졸-겔 나노필터를 이용하여 핵산을 선별하는 방법은 상기 졸-겔 나노필터를 이용하여 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액을 필터링하는 단계로, 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액이 중공(22)을 통과하도록 하여 필터링이 이루어지게 된다.
상기 반응단계(S2)는 여과단계(S1)가 진행되는 과정에서 핵산이 졸-겔 내부로 유입되어 이 중 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질과 결합하여 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 단계로, 랜덤 핵산 라이브러리가 중공(22)을 통과하는 과정에서 핵산은 졸-겔 내부로 유입되고, 이중 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산은 표적물질과 결합하여 복합체를 형성하게 된다.
상기 워싱단계(S3)는 상기 반응단계(S2)를 마친 후 졸-겔 나노필터를 워싱하여 표적물질에 특이적으로 결합하지 않은 핵산을 제거하는 단계로, 졸-겔 나노필터를 워싱하는 경우 졸-겔의 내부에는 상대적으로 표적물질-핵산 복합체만 남게 되어, 졸-겔 나노필터를 이용하는 경우 표적물질과 핵산 복합체를 단독으로 존재하는 핵산과 분리를 용이하게 할 수 있게 된다.
상기 가열단계(S4)는 워싱된 졸-겔 나노필터의 졸-겔(2)이 열에 의해 파쇄되고 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질에서 분리되도록 하는 단계이다. 상기 가열단계(S4)는 상기 졸-겔 나노필터에 열을 가해 졸-겔(2)이 파쇄되어 높은 온도의 용출 용액을 통해 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 분리할 수 있다. 본 발명은 랜덤 핵산 라이브러리를 졸-겔 나노필터를 통과시켜, 즉 필터링 방법을 이용하여 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 용이하게 추출할 수 있으며, 상하 관통 형성되는 중공을 포함하는 졸-겔이 나노사이즈의 채널 내에 형성되어 랜덤 핵산 라이브러리와 반응하는 졸-겔의 표면적을 크게 할 수 있어 핵산 선별 효율을 향상시킬 수 있고, 별도의 펌프나 밸브 등의 제어장치부 없이 졸-겔 나노필터를 막(membrane) 형태로 피펫 팁 등에 적용하여 사용할 수 있어 용이하게 시료를 분주 및 반응시킬 수 있다.
실시예 1: 앱타머 선별용 졸-겔 나노필터 제조
나노 사이즈의 크기를 가지는 채널이 복수개가 형성된 몸체부(멤브레인)는 AAO(anodized/anodic aluminum oxide)를 이용하여 제조되었으며, 채널 내부의 졸-겔 코팅 공정은 도 4에 나타내었다.
졸-겔의 조성 및 제조 방법은 SolB complete kit (PCL Inc., Seoul, Korea)에 있는 제조업체 매뉴얼을 따랐다. 졸-겔 조성물을 제조하기 위해 SolB1 (22μL), SolB2 (8μL), SolBH (10μL), SolBS (10μL) 및 증류수 (20 μL)를 준비하고, 이 혼합물을 짧게 스핀다운(spin down)시킨 후, -20℃ 냉동고에서 30분동안 배양하였다.
졸-겔 내부에 표적 물질인 다이아지논(diazinon)을 포함시키기위해, 다이아지논(AccuStand, New Haven, CT, USA)을 50% 디메틸포름아미드(dimethylformamide)에 100ppm으로 희석하고, 제조된 졸-겔과 1:7의 부피비로 혼합한 뒤, 짧게 스핀다운 하였다.
0.2 μm 직경의 채널을 갖는 AAO 멤브레인(Anodisc, 25-mm diameter, 60-μm thickness, Whatman, Maidstone, UK)을 스핀 코터(spin coater) (ACE-200, Dong Ah Tech, Seoul, Korea)에 고정시킨 후, 3000rpm에서 30 초 동안 단일 단계 스핀 코팅 공정을 통해 80μL의 다이아지논 함유 졸-겔을 AAO 멤브레인 채널 내에 증착시켰다. 높은 습도(90% RH) 및 실온에서 밤새 겔화(post-gelation) 시킨 후, 졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인을 6mm 펀치(Acu-punch; Acuderm, Fort Lauderdale, FL, USA)로 절단하였다. 직경 6mm의 AAO 멤브레인 조각은 결합 및 용출 실험에서 앱타머 선별 기질로서 사용되었다.
실험예 1: 졸-겔 나노필터를 이용한 앱타머 결합분석법(aptamer binding assay) 실시
다이아지논 특이적 앱타머와 졸-겔 나노필터의 결합 반응
앱타머 결합분석을 위해, 텍사스 레드로 표지된 다이아지논 특이적 앱타머를 화학 합성을 통해 수득하고, 바이오니아(Daejeon, Korea)에서 HPLC-정제하였다.
안티-다이아지논 앱타머는 다음 서열을 갖는 72-mer 올리고뉴클레오티드를 사용하였다:
5'-ATC CGT CAC ACC TGC TCT AAT ATA GAG GTA TTG CTC TTG GAC AAG GTA CAG GGA TGG TGT TGG CTC CCG TAT-Texas Red-3'(서열번호 1).
앱타머 용액은 1 Х SELEX 버퍼(50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.01% Tween-20, 및 pH 7.5)에서 제조하였고, 1μM의 최종농도에서 이를 사용하였다.
직경 6mm의 졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인 조각을 실온에서 두시간 동안 1 × PBS (phosphate-buffered saline) (pH 7.4)에서 20 μg/mL 이스트(yeast) tRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 처리하여 졸-겔의 표면을 차단하였고, 0.2 % Tween-20을 포함하는 1 Х PBS와 1 × PBS 버퍼 용액 순서로 세척하였다.
준비된 다이아지논 특이적 앱타머 용액을 95℃ 에서 10 분 동안 가열하고, 실온에서 2 내지 3시간 동안 냉각하고, t-RNA로 차단된 졸-겔 코팅된 AAO 기질에 실온에서 1시간 동안 처리한 다음, 0.2% Tween-20을 포함하는 1 Х PBS 및 1 Х PBS 버퍼 용액으로 3회 세척하였다.
그 후, 세척된 AAO 멤브레인을 어두운 곳에서 1시간 동안 건조시키고, Nikon Eclipse 80i w/DS-Fi1, epi-fluorescence microscopy w/DS-Fi1 camera head (Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 Ex: 560 nm 및 Em: 630 nm에서 형광 이미지를 얻었다.
졸-겔에서 열반응성 압타머 용출
표적물질 특이적 앱타머의 결합 반응 후, 졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인을 95℃에서 5분 동안 50 μL의 탈이온 증류수에서 가열하였다. 그 후, AAO 멤브레인을 1 Х PBS 버퍼 용액을 사용하여 2회 세척하고, 앱타머 선별 기질을 Ex: 560 nm 및 Em: 630 nm에서 형광 현미경(Eclipse 80i, Nikon, Tokyo, Japan)으로 재분석하였다.
열-용출된 앱타머를 정방향 프라이머 (5'- ATC CGT CAC ACC TGC TCT AAT-3 '(서열번호 2)), 역방향 프라이머 (5'-ATA CGG GAG CCA ACA CCA T-3'(서열번호 3)) 및 premix Taq™ (Ex Taq Version 2.0, Takara, Otsu, Shiga, Japan)을 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 전체 앱타머(72 bp)를 커버하기 위해 NCBI 프라이머-블라스트를 사용하여 프라이머를 선택하였으며, 리버스 프라이머의 경우, 사용된 앱타머의 3' 말단을 커버하는 프라이머이다. PCR 사이클은 다음과 같았다: 5분 동안 94℃로 초기 가열; 30초 동안 94℃, 30초 동안 54℃ 및 30초 동안 72℃로 25 사이클; 및 10분 동안 72℃에서 최종 신장. PCR 앰플리콘은 5% (w/v) 아가로스 젤에서 전기영동으로 분석하였다.
다이아지논 특이적 앱타머와 졸-겔 나노필터의 결합 반응 결과
다이아지논 특이적 앱타머 용액을 AAO 멤브레인과 반응시키고, 결합하지 않은 DNA 분자를 세척하여 형광 현미경으로 AAO 멤브레인을 관찰한 결과, 표적 특이적 앱타머를 다이아지논이 함유된 졸-겔로 코팅된 AAO 멤브레인에 처리하였을 때, Texas Red 염료로 인해 강한 적색 형광을 나타내었다(도 5d). 반면, 깨끗한 AAO 멤브레인과 베어(bare) 졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인은 형광 태그된 다이아지논 앱타머로 처리하고 세척한 후에 형광신호를 나타내지 않았다(도 5a 및 5b). 또한, 비-표적인 아트라진을 함유하는 졸-겔로 코팅된 AAO 멤브레인을 다이아지논 특이적 앱타머로 처리한 경우에도 형광신호를 나타내지 않았다(도 5c). 이러한 결과는 본 발명에 따른 앱타머 선별용 졸-겔 나노필터에서 졸-겔에 포함된 표적물질과 DNA 분자가 선택적으로 결합될 수 있음을 나타낸다.
졸-겔에서 열반응성 압타머 용출 결과
졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인 내 표적물질인 다이아지논에 결합된 앱타머를 열처리를 통해 용출하였고, 용출액은 PCR의 주형으로 사용하여 앱타머 검출 여부를 확인하였다.
졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인의 열처리 전/후 형광 현미경 이미지를 비교한 결과, 열처리 전에는 Texas Red로 표지된 앱타머에 의해 적색 형광이 관찰되나(도 6a), 열처리에 의한 용출 후에는 적색 형광이 사라져 다이아지논에 결합한 앱타머가 졸-겔에서 떨어졌음을 확인하였다(도 6b)
용출된 앱타머를 PCR로 증폭시키고, 증폭된 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과, 목적하는 앱타머가 선별되었음을 확인하였다(도 6c).
실시예 2: AAO 디스크가 장착된 피펫 팁 제조
SELEX 플랫폼으로서 졸-겔 코팅된 AAO 멤브레인의 실제 적용을 위해, AAO 멤브레인을 표적물질인 다이아지논으로 졸-겔 코팅한 후, 직경 3mm의 시편 펀치(specimen punch)를 사용하여 원형 디스크로 절단하였다. 이어서, 준비된 AAO 디스크를 접착제를 사용하여 1mL 피펫 팁의 가장 자리에 붙이고 데시케이터에서 밤새 보관하였다(도 7a).
실험예 2: AAO 디스크가 장착된 피펫 팁을 이용한 앱타머 결합 확인
상기 실험예 1에 설명된 바와 같이, 앱타머 용액, 워싱 버퍼 및 용출 버퍼 등을 사용하여 앱타머의 다이아지논 특이적 결합 반응 및 열반응성 용출을 AAO 디스크가 장착된 피펫 팁에서 수행하고(도 7b), 형광 현미경으로 그 결과를 확인하였다.
그 결과, 다이아지논 특이적 앱타머는 졸-겔 코팅된 AAO 디스크에 결합할 수 있음을 확인하였고(도 7c), 열처리에 후에는 졸-겔 내 표적에 결합하였던 앱타머가 분리되어 용출됨을 확인하였다(도 7d).
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
1: 몸체부 2: 졸-겔 11: 채널 21: 중공 22: 표적물질
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Sol-gel nanofilter for aptamer screening and Aptamer screening method using the same <130> KPA01543 <150> KR 10-2019-0122146 <151> 2019-10-02 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 atccgtcaca cctgctctaa tatagaggta ttgctcttgg acaaggtaca gggatggtgt 60 tggctcccgt at 72 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 atccgtcaca cctgctctaa t 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 atacgggagc caacaccat 19

Claims (7)

  1. 나노 사이즈의 크기를 가지는 채널이 복수 개가 형성된 몸체부와; 상기 채널에 위치하며, 상하 관통형성된 중공을 가지고, 내부에 표적 물질이 포함된 졸-겔을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 선별용 졸-겔 나노필터.
  2. 제1항에 있어서,
    랜덤 핵산 라이브러리가 상기 중공을 통과하도록 하면, 핵산이 졸-겔 내로 유입되고, 이 중 표적 물질에 특이적으로 결합하는 핵산은 상기 표적 물질과 결합하여, 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 핵산 선별용 졸-겔 나노필터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노필터는 막(membrane)의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 핵산 선별용 졸-겔 나노필터.
  4. 졸-겔 나노필터를 이용하여 랜덤 핵산 라이브러리가 포함된 용액을 필터링하는 여과단계와, 상기 여과단계가 진행되는 과정에서 핵산이 졸-겔 내부로 유입되어 이 중 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산이 표적물질과 결합하여 표적물질-핵산 복합체를 형성하는 반응단계를 포함하며,
    상기 졸-겔 나노필터는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 졸-겔 나노필터가 사용되는 것을 특징으로 하는 핵산 선별 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 핵산 선별 방법은 상기 반응단계를 마친 후 졸-겔 나노필터를 워싱하여 표적물질에 특이적으로 결합하지 않은 핵산을 제거하는 워싱단계와, 워싱된 졸-겔 나노필터의 졸-겔이 열에 의해 파쇄되어 표적물질에 특징으로 결합하는 핵산이 표적물질에서 분리되도록 하는 가열단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 선별 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 워싱단계 후, 졸-겔의 내부에는 표적물질-핵산 복합체만 분포하여, 표적물질-핵산 복합체를 단독으로 존재하는 핵산과 용이하게 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는, 핵산 선별 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 가열단계에서는 상기 졸-겔 나노필터에 열을 가해 졸-겔이 파쇄되어 고온의 용출 용액을 통해 표적물질에 특이적으로 결합하는 핵산을 분리하는 것을 특징으로 하는, 핵산 선별 방법.
KR1020200125774A 2019-10-02 2020-09-28 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법 KR102414945B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190122146 2019-10-02
KR1020190122146 2019-10-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210039956A KR20210039956A (ko) 2021-04-12
KR102414945B1 true KR102414945B1 (ko) 2022-07-05

Family

ID=75440027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200125774A KR102414945B1 (ko) 2019-10-02 2020-09-28 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102414945B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101423032B1 (ko) 2010-10-05 2014-07-28 동국대학교 산학협력단 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법
KR101569891B1 (ko) 2012-02-13 2015-11-27 동국대학교 산학협력단 다공성 지지체를 이용한 저분자 포집용 졸-겔 칩 및 이를 이용한 저분자 특이적 물질의 스크리닝 방법
KR101769743B1 (ko) 2008-08-15 2017-08-21 코넬 유니버시티 특이적 화학적 타겟과 결합하는 핵산의 신속한 확인을 위한 장치

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101769743B1 (ko) 2008-08-15 2017-08-21 코넬 유니버시티 특이적 화학적 타겟과 결합하는 핵산의 신속한 확인을 위한 장치
KR101423032B1 (ko) 2010-10-05 2014-07-28 동국대학교 산학협력단 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법
KR101569891B1 (ko) 2012-02-13 2015-11-27 동국대학교 산학협력단 다공성 지지체를 이용한 저분자 포집용 졸-겔 칩 및 이를 이용한 저분자 특이적 물질의 스크리닝 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nitsche et al., BMC Biotechnology, Vol. 7, No. 48, 2007.
Szeto et al., Applied Physics Reviews, Vol. 1, 2014.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210039956A (ko) 2021-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6885549B2 (ja) 溶液混合容器、流体デバイス、及び流体システム
JP7499241B2 (ja) 固相ｄｎａハイブリダイゼーションおよび増幅の改善のための低結合支持体
Reedy et al. Solid phase extraction of DNA from biological samples in a post-based, high surface area poly (methyl methacrylate)(PMMA) microdevice
ES2633567T3 (es) Métodos y sistemas para el enriquecimiento de secuencias basadas en solución y análisis de regiones genómicas
EP1972688B1 (en) Method of amplifying nucleic acid from microorganism using nonplanar solid substrate
US7615347B2 (en) Method for trapping nucleic acids using divalent metal ions
JP6562389B2 (ja) 核酸の精製方法
JP2003524416A5 (ko)
JP2014517691A (ja) 核酸の単離
JPWO2003006650A1 (ja) 不織布を用いた核酸精製法及び検出法
US9487774B2 (en) Compositions, methods, and kits for identifying candidate molecules from encoded chemical libraries
JP2011516062A5 (ko)
CN105209639B (zh) 在固相载体扩增核酸的方法
JP2013059320A (ja) 標的核酸の検出方法
KR102414945B1 (ko) 핵산 선별용 졸-겔 나노 필터 및 이를 이용한 핵산 선별 방법
US11602747B2 (en) Multifunctional microfluidic device for capturing target cells and analyzing genomic DNA isolated from the target cells while under flow conditions
JP4934679B2 (ja) ９種の呼吸器疾患と関連するバクテリア種を特異的に検出するためのプライマー、プローブ、マイクロアレイおよびその方法
JP2017529069A (ja) 核酸濃縮用のハイブリダイゼーションカラム
JP2023511465A (ja) キット、システム、及びフローセル
US20130130917A1 (en) Method for specific enrichment of nucleic acid sequences
KR100647315B1 (ko) 실란화된 고상 물질을 이용한 핵산의 분리 및 증폭 방법
JP2006055166A (ja) 偽陽性結果を低下させる方法
KR20120092938A (ko) 알파태아단백질에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 및 이의 용도
JP4871881B2 (ja) ｃＲＮＡの調製方法
WO2024033174A1 (en) Barcoding of nucleic acids from single cells

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant