ES2633567T3

ES2633567T3 - Métodos y sistemas para el enriquecimiento de secuencias basadas en solución y análisis de regiones genómicas

Info

Publication number: ES2633567T3
Application number: ES12184423.7T
Authority: ES
Inventors: Thomas Albert; Matthew Rodesch
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2008-10-22
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2028-10-22
Also published as: CN101835907A; EP2209913A1; JP2011500069A; EP2535429A1; WO2009053039A1; CA2699835C; US20120046175A1; US10900068B2; ES2522912T3; US20090105081A1; US9790543B2; JP2013150637A; EP2535429B1; CA2699835A1; EP2053132A1; US20180030521A1; EP2209913B1; CN101835907B

Abstract

Un método para reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico, dicho método comprende los pasos de: a) exponer moléculas de ácido nucleico genómico desnaturalizado y fragmentado de dicha población a múltiples y diferentes sondas de oligonucleótidos bajo condiciones hibridantes en solución, seguido por la unión de complejos de moléculas hibridadas a un soporte sólido siendo una población de cuentas para capturar las moléculas de ácidos nucleicos que hibridan específicamente a dichas sondas, en el que dichas moléculas de ácido nucleico desnaturalizado y fragmentado tienen un tamaño medio de entre alrededor de 100 a alrededor de 1000 residuos de nucleótidos, preferiblemente entre alrededor de 250 a alrededor de 800 residuos de nucleótidos, y más preferiblemente entre alrededor de 400 a alrededor de 600 residuos de nucleótidos, y en el que dichas sondas están dirigidas a secuencias en el mismo fragmento que, pero separadas de la secuencia diana actual, y b) separar los ácidos nucleicos no hibridados y los hibridados de forma inespecífica de las moléculas capturadas; c) eluir las moléculas capturadas del soporte sólido, y d) repetir opcionalmente los pasos (a) a (c) durante al menos un ciclo adicional con las moléculas capturadas eluidas, en el que la distribución de las moléculas de ácido nucleico capturadas está normalizado mediante 1) La igualación del rendimiento de hibridación a las múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos ajustando la longitud de la sonda, temperatura de fusión y/o secuencia; e 2) igualando el rendimiento de hibridación ajustando la cantidad de múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos; y/o 3) realizando el paso (d) utilizando las mismas cantidades de las múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos, de forma que todas las sondas de oligonucleótidos están saturadas por las moléculas de ácidos nucleicos hibridadas.

Description

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de la región de captura diana como un todo. El eje y representa el porcentaje de conformidad de secuencia con las secuencias diana conocidas.

DEFINICIONES

Tal como se utiliza en este documento, el término "muestra" se utiliza en su sentido más amplio. En un sentido, se pretende incluir una muestra o cultivo obtenido de cualquier fuente, preferiblemente de una fuente biológica. Las muestras biológicas pueden obtenerse a partir de animales (incluidos los seres humanos) y abarcan: líquidos, sólidos, tejidos y gases. Las muestras biológicas incluyen productos sanguíneos, tales como plasma, suero y similares. Como tal, una "muestra de ácidos nucleicos" o una "muestra de ácido nucleico", una "muestra diana" comprende ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA, RNA, DNAc, RNAm, RNAt, RNAmi, etc.) de cualquier fuente. En la presente solicitud, una muestra de ácido nucleico deriva preferiblemente de una fuente biológica, tal como una célula, tejido y similares de origen humano o no humano. El término "no humano" se refiere a todos los animales no humanos y entidades que incluyen, pero no se limitan a, vertebrados tales como roedores, primates no humanos, ovinos, bovinos, rumiantes, lagomorfos, porcinos, caprinos, equinos, caninos, felinos, aves, etc. No humanos también incluye los invertebrados y organismos procariotas tales como bacterias, plantas, levaduras, virus, y similares. Como tal, una muestra de ácido nucleico usada en los métodos y sistemas de la presente invención es una muestra de ácido nucleico derivado de cualquier organismo, ya sea eucariota o procariota.

Tal como se utiliza aquí, el término "hibridación" se usa en referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (por ejemplo, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) se ve afectada por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones, la temperatura de fusión (Tm) del híbrido formado, y la relación G:C de los ácidos nucleicos. Aunque la invención no se limita a un conjunto particular de condiciones de hibridación, preferiblemente se emplean condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación rigurosas son dependientes de la secuencia y difieren al variar los parámetros ambientales (por ejemplo, concentraciones de sal, presencia de materiales orgánicos, etc.). Generalmente, se seleccionan las condiciones "rigurosas" entre alrededor de 50 °C a aproximadamente 20 °C por debajo de la Tm para la secuencia de ácido nucleico específica a una fuerza iónica y pH definidos. Preferiblemente, las condiciones rigurosas son entre alrededor de 5 °C a 10 ° C por debajo del punto de fusión térmico para un ácido nucleico específico unido a un ácido nucleico complementario. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico diana) se hibrida a una sonda perfectamente coincidente.

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", por ejemplo, puede ser la hibridación en formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sodio, 5x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 mg / ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2% SSC (cloruro sódico / citrato sódico) y 50 % de formamida a 55 °C, seguido de un lavado con 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. A modo de ejemplo, pero no de limitación, se contempla que los tampones que contienen 35% de formamida, 5x SSC, y 0,1% (p / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) son adecuados para hibridarse bajo condiciones moderadamente no rigurosas a 45 °C durante 16-72 horas.

Además, se contempla que la concentración de formamida se puede ajustar adecuadamente entre un rango de 2045% dependiendo de la longitud de la sonda y el nivel de rigurosidad deseado. Ejemplos adicionales de las condiciones de hibridación se proporcionan en varias fuentes, incluyendo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eds. Sambrook et al., Cold Spring Harbour press.

De manera similar, las condiciones de lavado "rigurosas" se determinan empíricamente de forma ordinaria para la hibridación de una diana con una sonda, o en la presente invención, un amplicón derivado de sonda. El amplicón / diana se hibridan (por ejemplo, bajo condiciones de hibridación rigurosas) y después se lavan con tampones que contienen concentraciones de sales sucesivamente más bajas, o mayores concentraciones de detergentes, o a temperaturas incrementales hasta que la relación de señal a ruido para la hibridación inespecífica es lo suficientemente alta para facilitar la detección de la hibridación específica. Las condiciones de temperatura rigurosas generalmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30 °C, más usualmente en exceso de aproximadamente 37 °C, y ocasionalmente en exceso de aproximadamente 45 °C. Las condiciones rigurosas de sal serán normalmente inferiores a aproximadamente 1000 mM, habitualmente inferiores a aproximadamente 500 mM, más habitualmente inferiores a aproximadamente 150 mM (Wetmur et al, 1966, J. Mol. Biol., 31: 349-370; Wetmur, 1991, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26: 227-259.

Tal como se utiliza aquí, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico, (por ejemplo, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como DNA polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El cebador es preferentemente de cadena sencilla para una máxima eficiencia en la amplificación. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de

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porción de las moléculas sean de doble cadena; y descartar las moléculas de doble cadena y c) retener las moléculas de cadena sencilla.

Por lo general, al menos una sonda inmovilizada se hibrida a una región genómica de interés en fragmentos de ácido nucleico en la muestra. Alternativamente, la al menos una sonda inmovilizada puede hibridarse con secuencias en fragmentos de ácido nucleico diana que comprende una región genómica de interés, separando las secuencias de hibridación de la región genómica de interés. Además, está también dentro del alcance de la presente invención, la realización de al menos un segundo paso de hibridación utilizando al menos una sonda de oligonucleótidos relacionada con, pero distinta a la sonda utilizada en la hibridación inicial.

En particular, se describe un método para determinar la información de la secuencia de ácido nucleico de al menos una región de ácido nucleico genómico en una muestra, comprendiendo el método los pasos de:

-reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con cualquier método como se ha descrito aquí, y -determinar la secuencia de ácido nucleico de las moléculas capturadas por ejemplo, mediante la realización de una reacción de secuenciación. Preferiblemente, dicha reacción de secuenciación es una secuenciación mediante reacción de síntesis.

De acuerdo con esta realización, el DNA genómico se fragmenta preferiblemente mediante estrés mecánico. El tamaño medio deseado de los fragmentos de DNA deberá ser pequeño (<= 1000 pb) y depende del método de secuenciación a aplicar.

La secuenciación por síntesis de acuerdo con la literatura en la técnica (véase, por ejemplo Hyman, E.D., 1988) se define como cualquier método de secuenciación que monitoriza la generación de productos secundarios tras la incorporación de un desoxinucleósido trifosfato específico durante la reacción de secuenciación (véase, por ejemplo Rhonaghi et al., 1998). Una forma de realización particular y más prominente de la secuenciación mediante reacción de síntesis es el método de secuenciación de pirofosfato. En este caso, la generación de pirofosfato durante la incorporación de nucleótidos se controla mediante una cascada enzimática que finalmente resulta en la generación de una señal quimioluminiscente. Por ejemplo, el sistema secuenciador Genome 454 (Roche Applied Science Nº Cat. 04 760 085 001) se basa en la tecnología de secuenciación de pirofosfato. Para la secuenciación en un instrumento 454 GS20 o 454 FLX, el tamaño medio del fragmento de DNA genómico debe estar en el rango de 200

o 600 pb, respectivamente.

Alternativamente, la secuenciación mediante la reacción de síntesis es una reacción de secuenciación de tipo terminador. En este caso, los bloques de construcción dNTP incorporados comprenden un marcador detectable, que es preferiblemente un marcador fluorescente que impide una mayor extensión de la cadena de DNA naciente. Luego se retira el marcaje y se detecta tras la incorporación del bloque de construcción de dNTP en el híbrido de molde / cebador de extensión, por ejemplo, mediante la utilización de una polimerasa de DNA que comprende una exonucleasa 3’-5’ o actividad de corrección de galeradas.

Ventajosamente, el método de la invención de la primera reducción de la complejidad genómica y luego la determinación de múltiples secuencias comprende además el paso de ligación de moléculas adaptadoras para uno o ambos, preferiblemente ambos extremos de las moléculas de ácido nucleico fragmentadas. Las moléculas adaptadoras en el contexto de la presente invención se definen preferentemente como oligonucleótidos de doble cadena con extremos romos. Además, el método de la invención puede comprender además el paso de amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico con al menos un cebador, dicho cebador comprende una secuencia que corresponde a o se hibrida específicamente con la secuencia de dichas moléculas adaptadoras.

Con el fin de ligar moléculas adaptadoras en una molécula diana de doble hebra, se prefiere que esta misma molécula diana sea de extremo romo. Con el fin de lograr esto, las moléculas diana de doble cadena se someten a una reacción de relleno con una polimerasa de DNA, tal como una polimerasa de DNA T4 o la polimerasa Klenow en presencia de desoxinucleósidos trifosfatos, lo que resulta en moléculas diana de extremos romos. Además, por ejemplo la polinucleótido quinasa T4 se añade antes de la ligación con el fin de añadir grupos fosfato al extremo 5' para el posterior paso de ligación. Tras la ligación de los adaptadores (oligonucleótidos de DNA cortos de doble cadena de extremos romos con aproximadamente 3-20 pares de bases) en el DNA diana pulido, puede realizarse de acuerdo con cualquier método que se conoce en la materia, preferiblemente mediante una reacción de ligasa de DNA T4.

Dicha ligación se puede realizar antes o después del paso de exponer una muestra que comprende, moléculas genómicas desnaturalizadas fragmentadas de ácido nucleico a múltiples sondas de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para la captura de moléculas de ácido nucleico diana que se hibridan a dichas sondas. En caso de que la ligación se realice posteriormente, los ácidos nucleicos enriquecidos que se liberan del soporte sólido en forma de cadena sencilla se deben rehibridar primero seguido por una reacción de extensión del cebador y una reacción de relleno de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la materia.

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en el que dichas múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos se ajustan respecto a la longitud de la sonda, temperatura de fusión y/o secuencia; y en el que dichas múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos se ajustan respecto a la cantidad, y en el que dichas múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos están dirigidas a secuencias en el mismo fragmento que, pero separado de la actual secuencia diana.

Preferiblemente, el equipo contiene dos moléculas adaptadoras de doble cadena diferentes. El soporte sólido puede ser cualquiera de una pluralidad de cuentas o un microchip como se describe aquí.

En una realización, dicho equipo comprende además al menos uno o más compuestos a partir de un grupo que consiste en la polimerasa de DNA, polinucleótido quinasa de T4, DNA ligasa de T4, una solución de hibridación de chip, por ejemplo, como se describe aquí, una solución de lavado de chip, en particular, una solución de lavado con SSC, DTT y opcionalmente SDS, por ejemplo, tampón de lavado I (0,2 x SSC, 0,2% (v / v) SDS, DTT 0,1 mM), tampón de lavado II (0,2 x SSC, DTT 0,1 mM) y / o solución de lavado III (0,05x SSC, DTT 0,1 mM), y / o una solución de elución de chip, por ejemplo, agua o una solución que contiene tampón TRIS y / o EDTA.

En una realización específica adicional, sin ser mutuamente exclusivo a la realización descrita en el presente documento, el equipo comprende una segunda molécula adaptadora. Al menos una cadena de oligonucleótido de dicha primera o segunda molécula adaptadora puede llevar una modificación, que permite la inmovilización sobre un soporte sólido. Por ejemplo, tal modificación puede ser un marcador de biotina que se puede utilizar para la inmovilización en un soporte sólido recubierto con estreptavidina. Alternativamente, dicha modificación puede ser un hapteno como digoxigenina, que puede utilizarse para la inmovilización sobre un soporte sólido revestido con un anticuerpo que reconoce haptenos.

Tal como se utiliza aquí, el término "hibridación" se usa en referencia al emparejamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) se ve afectada por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la rigurosidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado, y la proporción G:C de los ácidos nucleicos. Aunque la invención no se limita a un conjunto particular de condiciones de hibridación, preferiblemente se emplean condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes al variar los parámetros ambientales (por ejemplo, concentraciones de sal, y la presencia de materia orgánica). Generalmente, se seleccionan las condiciones "rigurosas" en alrededor de 5 °C a 20 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia de ácido nucleico específica a una fuerza iónica y pH definidos. Preferiblemente, las condiciones rigurosas están entre alrededor de 5 °C y 10 °C más bajas que el punto de fusión térmico para un ácido nucleico específico unido a un ácido nucleico complementario. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual el 50% de un ácido nucleico (por ejemplo, marcaje de ácido nucleico) se hibrida a una sonda perfectamente coincidente.

De manera similar, las condiciones de lavado "rigurosas" se determinan habitualmente de manera empírica para la hibridación de cada conjunto de marcajes con el correspondiente chip de sondas. Los chips se hibridan primero (normalmente bajo condiciones de hibridación rigurosas) y luego se lavan con tampones que contienen concentraciones sucesivamente más bajas de sales, o mayores concentraciones de detergentes, o a temperaturas crecientes hasta que la relación de señal-ruido para la hibridación específico a no específica sea lo suficientemente alta para facilitar la detección de la hibridación específica. Las condiciones de temperatura rigurosas generalmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30 °C, más usualmente en exceso de aproximadamente 37 °C, y ocasionalmente en exceso de aproximadamente 45 °C. Las condiciones de sal rigurosas serán habitualmente inferiores a aproximadamente 1000 mM, habitualmente inferiores a aproximadamente 500 mM, más habitualmente inferiores a aproximadamente 150 mM. Para más información véase, por ejemplo, Wetmur et al. (1966) y Wetmur (1991).

"Condiciones rigurosas" o "condiciones de alta rigurosidad", como se define en este documento, puede ser la hibridación en formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 mg / ml), 0,1% de SDS, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0,2 x SSC (cloruro de sodio / citrato de sodio) y 50% de formamida a 55 °C, seguido de un lavado con 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C.

A modo de ejemplo, pero sin limitación, se contempla que los tampones que contienen 35% de formamida, 5x SSC, y 0,1% (p / v) de dodecil sulfato de sodio son adecuados para hibridar bajo condiciones moderadamente no rigurosas a 45 °C durante 16-72 horas. Además, se prevé que la concentración de formamida se puede ajustar adecuadamente entre un intervalo de 20-45% dependiendo de la longitud de la sonda y el nivel de rigurosidad deseado. También está incluido dentro del alcance de la invención que la optimización de la sonda se puede obtener para sondas más largas (>> 50-mero), mediante el aumento de la temperatura de hibridación o la concentración de formamida para compensar un cambio en la longitud de la sonda. Ejemplos adicionales de condiciones de hibridación se proporcionan en varias fuentes, incluyendo: "Direct selection of cDNAs with large genomic DNA clones", en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2001).

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Se describe un método para aislar y reducir la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprende: proporcionar un soporte sólido en el que dicho soporte sólido comprende sondas de hibridación hibridables con secuencias de ácido nucleico diana, y una muestra de ácido nucleico fragmentado que comprende secuencias de ácido nucleico diana, amplificar dichas sondas de hibridación en el que los productos de amplificación comprenden una porción de unión y en el que dichos productos de amplificación se mantienen en solución, hibridar dicha muestra de ácido nucleico a dichos productos de amplificación en solución de forma que la hibridación entre dichos productos de amplificación y las secuencias de ácidos nucleicos diana se permite que se produzca, separar los complejos de hibridación del ácido nucleico diana / producto de amplificación de los ácidos nucleicos hibridados de forma inespecífica por dicha porción de unión, y eluyendo las secuencias de ácido nucleico diana hibridado del complejo, aislando de este modo y reduciendo la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos.

La presente invención está relacionada con un método para reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácidos nucleicos, el método comprende los pasos de:

a) exponer moléculas de ácido nucleico genómico, desnaturalizadas fragmentadas de dicha población de múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos bajo condiciones hibridantes en solución seguido por la unión de los complejos de moléculas hibridadas a un soporte sólido siendo una población de cuentas para capturar moléculas de ácido nucleico que hibridan específicamente a dichas sondas,

en el que dichas moléculas de ácido nucleico, desnaturalizadas fragmentadas tienen un tamaño medio de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 residuos de nucleótidos, preferiblemente entre aproximadamente 250 a aproximadamente 800 residuos de nucleótidos y lo más preferiblemente entre aproximadamente 400 a aproximadamente 600 residuos de nucleótidos, y en el que dichas sondas están dirigidas a secuencias en el mismo fragmento que, pero separadas de la secuancia diana actual, y

b) separando los ácidos nucleicos no unidos e inespecíficamente hibridados de las moléculas capturadas, c) eluyendo las moléculas capturadas de dicho soporte sólido, y d) repitiendo opcionalmente los pasos (a) a (c) durante al menos un ciclo adicional con las moléculas capturadas eluidas,

en el que la distribución de las moléculas de ácido nucleico capturadas está normalizada por

1) igualar el rendimiento de hibridación a las múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos ajustando la longitud de la sonda, temperatura de fusión y/o secuencia; y 2) igualar el rendimiento de hibridación ajustando la cantidad de múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos; y/o 3) realizar el paso (d) utilizando las mismas cantidades de las múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos, de forma que todas las sondas de oligonucleótidos están saturadas por las moléculas de ácidos nucleicos hibridadas.

En otra realización, se describe el método anterior, que comprende además la secuenciación de las secuencias de ácidos nucleicos diana eluidas.

Se describe un equipo que comprende: secuencias de la sonda de hibridación que comprende una porción de unión en el que dichas secuencias de sondas se diseñan para hibridarse a una o más secuencias diana de ácido nucleico y en el que dichas secuencias de sonda están en solución, un sustrato que comprende una pareja de unión para unirse a dicha porción de unión, y las instrucciones para llevar a cabo los métodos anteriores.

La presente invención está relacionada con un equipo que comprende

-una molécula adaptadora de doble cadena -múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos -un soporte sólido para capturar dichas sondas,

En un método de la presente invención, una muestra que contiene moléculas de ácido nucleico genómico desnaturalizado (por ejemplo, de una sola cadena), ,que son moléculas fragmentadas, se expone bajo condiciones de hibridación a una pluralidad de sondas de oligonucleótidos, en el que la pluralidad de sondas de oligonucleótidos

o amplicones derivados de dichas sondas están en solución, para capturar a partir de las moléculas de ácido nucleico de la muestra secuencias de ácido nucleico diana y separar las regiones no hibridadas del genoma o cualquier otro ácido nucleico de la muestra a partir de las secuencias diana hibridadas, en el que dicha separación comprende la captura a través de una porción de unión (por ejemplo, asociada a la sonda o amplicón derivados de

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la sonda) los complejos de hibridación que se encuentran en solución y lavar los complejos unidos separando de este modo las secuencias diana hibridadas de las secuencias hibridadas no diana inespecíficas (Figura 6).

La presente invención proporciona métodos para reducir la complejidad de una muestra de ácido nucleico genómico grande, tal como una muestra de DNA genómico, para facilitar su posterior procesamiento y análisis genético. En algunas realizaciones de la presente invención, los métodos comprenden la amplificación in situ de sondas de ácido nucleico inmovilizadas (preseleccionadas) en el que los amplicones derivados de la sonda comprenden una porción de unión. La captura de amplicones etiquetados, en solución, secuencias de ácidos nucleicos diana a partir de una muestra mediante la hibridación de la muestra con los amplicones utilizando métodos basados en solución. El complejo híbrido amplicón marcado / ácido nucleico diana es capturado a través de la porción de unión, preferiblemente lavada y el ácido nucleico diana eluido. Las secuencias genómicas eluidas son más susceptibles de análisis genético detallado que una muestra genómica que no haya sido sometida a este procedimiento de enriquecimiento. En consecuencia, los métodos descritos proporcionan una aproximación rentable, flexible y eficiente para reducir la complejidad de una muestra genómica.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para aislar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos y reducir la complejidad de una muestra de ácido nucleico mediante la hibridación de la muestra con amplicones de sondas de ácido nucleico en solución bajo condiciones preferiblemente rigurosas suficientes para soportar la hibridación entre la amplicones de la sonda y las regiones complementarias de la muestra de ácido nucleico. Los complejos de amplicón de sonda / ácido nucleico diana se lavan bajo condiciones suficientes para eliminar los ácidos nucleicos unidos de forma inespecífica. Las secuencias de ácidos nucleicos diana hibridados se eluyen de los amplicones derivados de sonda y pueden opcionalmente amplificarse posteriormente (por ejemplo, mediante LM-PCR), por ejemplo para aplicaciones posteriores tales como resecuenciación.

Se describe un método para aislar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos y reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico, comprendiendo el método los pasos de exponer moléculas de ácido nucleico fragmentadas, desnaturalizados de una población diana a múltiples, amplicones derivados de sondas de oligonucleótido diferentes en la que los amplicones están en solución y en el que los amplicones comprenden además una porción de unión, en condiciones de hibridación para capturar moléculas de ácido nucleico que hibridan específicamente con los amplicones de la sonda, uniendo o capturando los complejos de moléculas hibridadas mediante la unión de la porción de unión encontrada en el amplicón de sonda a su pareja de unión (por ejemplo, biotina / SA, digoxigenina / anti-digoxigenina, 6HIS / níquel, etc.), en el que las moléculas de ácido nucleico, desnaturalizadas fragmentadas tienen un tamaño medio de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 residuos de nucleótidos, preferiblemente entre aproximadamente 250 a aproximadamente 800 residuos de nucleótidos y lo más preferiblemente entre aproximadamente 400 a aproximadamente 600 residuos de nucleótidos, separando los ácidos nucleicos no unidos e inespecíficamente hibridados de los amplicones de sonda unidos, eluyendo las moléculas diana hibridadas de los amplicones, y secuenciando opcionalmente las moléculas diana.

Como tal, realizaciones de la presente invención proporcionan métodos basados en solución para reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico. Los métodos de la presente invención comprenden exponer, secuencias de muestras de ácidos nucleicos genómicos desnaturalizados fragmentados, que pueden comprender o no uno o más adaptadores de ligación en uno o en ambos extremos de la muestra de ácido nucleico fragmentado antes de la desnaturalización, en múltiples, amplicones de sondas de hibridación diferentes en solución en el que dichos amplicones derivan de diferentes sondas de hibridación múltiples, prediseñadas en el que dichos amplicones comprenden una porción de unión o secuencia y, opcionalmente, un sitio de endonucleasa de restricción (RE), en condiciones de hibridación suficientes para hibridar las secuencias de ácido nucleico diana desnaturalizadas con los amplicones derivados de sonda (por ejemplo, en solución), en el que las secuencias de ácidos nucleicos fragmentadas, desnaturalizadas tienen un tamaño medio de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 residuos de nucleótidos, preferiblemente tienen entre aproximadamente 250 a aproximadamente 800 residuos de nucleótidos y lo más preferiblemente entre aproximadamente 400 a aproximadamente 600 residuos de nucleótidos, separando los ácidos nucleicos no unidos e hibridados de forma inespecífica de los amplicones derivados de sonda mediante la unión de los complejos amplicón / objetivo a través de la porción de unión y lavando los complejos unidos, eluyendo las secuencias de ácidos nucleicos diana del complejo unido en el que la diana secuenciada demuestra una reducción de la complejidad genética en relación a la muestra original y opcionalmente repetir los pasos de hibridación, lavado y elución utilizando las secuencias de ácido nucleico diana iniciales enriquecidas eluidas para enriquecer aún más las secuencias de ácido nucleico diana.

Las sondas están dirigidas a secuenciasen el mismo fragmento que, pero separado de la actual secuencia diana. La distribución de las moléculas de ácido nucleico capturadas está normalizada por

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fluorescente que impide una mayor extensión de la cadena de DNA naciente. Luego se retira la señal y se detecta tras la incorporación del bloque de construcción ddNTP en el híbrido de extensión de molde/ cebador, por ejemplo, mediante el uso de una polimerasa de DNA que comprende una actividad exonucleasa 3'-5 o de corrección de pruebas.

En el caso del flujo de trabajo del Genome Sequencer (Roche Applied Science Nº Catálogo 04 896 548 001), en una primera etapa (clonal) se lleva a cabo la amplificación mediante una PCR en emulsión. Por lo tanto, esto también está dentro del alcance de la presente invención, porque el paso de amplificación se realiza por métodos de PCR en emulsión. Las cuentas que son portadoras de los ácidos nucleicos diana amplificados de forma clonal puede entonces transferirse arbitrariamente a una placa picotitulada de acuerdo con el protocolo del fabricante y someterse a una reacción de secuenciación pirofosfato para determinación de la secuencia.

Se describe un equipo que comprende reactivos y materiales para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la presente invención. Tal equipo puede incluir uno o más sustratos de microchip sobre los que se inmovilizan una pluralidad de sondas de hibridación específicas de una o más secuencias de ácidos nucleicos diana a partir de uno o más loci genéticos de destino (por ejemplo, específicos de exones, intrones, secuencias de SNP, etc.), una pluralidad de sondas que definen un chip de secuencias contiguas diseñado para capturar la secuencia completa de al menos un cromosoma completo, los cebadores de amplificación, los reactivos para realizar los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (por ejemplo, soluciones salinas, polimerasas, dNTP, tampones de amplificación, etc.), los reactivos para realizar las reacciones de ligación (por ejemplo, adaptadores de la ligación, quinasa de polinucleótidos de T4, ligasa, tampones, etc.), los sustratos que comprenden una porción pareja de unión, tubos, soluciones de hibridación, soluciones de lavado, soluciones de elución, imán (s), y el tubo titulares.

135 Se describe un sistema (por ejemplo, un equipo) para realizar un método o una parte de un método de acuerdo con la presente invención como se describe aquí. Por lo tanto, se describe un equipo que comprende una (primera) molécula adaptadora bicatenaria y múltiples amplicones derivados de la sonda en solución, en el que los amplicones derivados de la sonda se amplifican a partir de una pluralidad de sondas que define una pluralidad de exones, intrones y/ o secuencias reguladoras a partir de una pluralidad de loci genéticos; y/ o una pluralidad de amplicones derivados de sonda en solución que define la secuencia completa de al menos un locus genético único, y dicho locus que tiene un tamaño de al menos 100 kb, preferiblemente al menos 1 Mb o un tamaño como el que se especifica en el presente documento, y/ o una pluralidad de amplicones derivados de sondas que definen puntos que se conoce contienen SNP, y/ o una pluralidad de amplicones derivados de una sonda que define un chip, en particular un chip de secuencias contiguas especialmente diseñado para capturar la secuencia completa de al menos un cromosoma completo. En algunas formas de realización, un equipo comprende además dos moléculas adaptadoras diferentes de doble cadena.

La presente invención está relacionada con un equipo que comprende

En algunas realizaciones, un equipo comprende una o más moléculas o compuestos de captura. Por ejemplo, al menos una sonda de oligonucleótido comprende una modificación que permite la inmovilización sobre un soporte sólido. Por ejemplo, una sonda comprende una porción biotina para su inmovilización sobre una partícula paramagnética recubierta con estreptavidina. Otro ejemplo es un hapteno, tal como la digoxigenina, que se asocia con una sonda para la inmovilización sobre un soporte sólido utilizando un anticuerpo que reconozca el hapteno (por ejemplo, anti-digoxigenina).

En algunas realizaciones, un equipo comprende además al menos uno o más compuestos a partir de un grupo que consiste en una polimerasa de DNA, una quinasa de polinucleótidos de T4, ligasa de DNA de T4, una o más soluciones de hibridación del chip, y/ o uno o más soluciones de lavado del chip. En realizaciones preferibles, tres soluciones de lavado se incluyen en un equipo de la presente invención, y estas soluciones de lavado comprenden SSC, DTT y opcionalmente SDS. Por ejemplo, los equipos de la presente invención comprenden el tampón de lavado I (SSC al 0,2%, SDS al 0,2% (v/v), DTT 0,1 mM), Tampón de lavado II (SSC al 0,2%, DTT 0,1 mM,) y/ o tampón de lavado III (SSC al 0,05%, DTT 0,1 mM). En algunas realizaciones, los sistemas de la presente invención comprenden además una solución de elución, por ejemplo agua o una solución que contenga tampón TRIS y/ o EDTA.

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Los siguientes ejemplos se proporcionan como ilustraciones adicionales no limitantes de las realizaciones particulares de la invención.

EXPERIMENTACIÓN

Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma.

Cuando se proporcione un rango de valores, se entiende que está englobado específicamente dentro de la invención cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, y también entre los límites superior e inferior de ese rango. Cada uno de los rangos menores entre cualquier valor establecido o valor que interviene en un intervalo indicado, y cualquier otro valor establecido o valor intermedio en ese intervalo establecido están incluidos en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden independientemente ser incluidos o excluidos del rango, ya cada campo donde sea, ni bien ambos límites se incluyen en los rangos más pequeños también se engloban dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos de los límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.

Ejemplo 1 -Descubrimiento de nuevos polimorfismos y mutaciones en las grandes regiones genómicas

Este ejemplo genérico describe cómo llevar a cabo la selección que permite el descubrimiento rápido y eficiente de nuevos polimorfismos y mutaciones en grandes regiones genómicas. Se utilizan microchips que tienen sondas inmovilizadas, en una o múltiples rondas de hibridación de selección con una diana de DNA genómico total, y las secuencias seleccionadas se amplifican mediante LM-PCR (véanse las Figs. 1 y 2).

a) Preparación del DNA genómico y de los enlazantes de doble cadena

Se fragmenta el DNA mediante sonicación hasta un tamaño medio de ~500 pares de bases. Una reacción para pulir los extremos de los fragmentos de DNA sonicados se realizó con:

fragmentos de DNA 41 l polimerasa de DNA de T4 20 l mezcla de reacción de la polimerasa de DNA de T4 20 l agua 10 l

La reacción se incubó a 11°C durante 30 min. La reacción se sometió entonces a procedimientos de extracción con fenol/cloroformo y el DNA se recuperó mediante una precipitación con etanol. El sedimento precipitado se disolvió en 10 l de agua (para proporcionar una concentración final de 2 g/l).

Dos oligonucleótidos complementarios se hibridan para crear un enlazante de doble cadena, mezclando lo siguiente:

oligonucleótido 1 (1 g/l) 22,5 l (5'-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3 ') (Id. de Sec. Nº: 1) oligonucleótido 2 (1 g/l) 22,5 l (5'-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3 ') (Id. de Sec. Nº: 2) tampón de rehibridación 10x 5 l agua hasta 50 l

La reacción se calentó a 65°C durante 10 min; luego se dejó enfriar a 15-25°C durante 2 horas. La longitud de los dos oligonucleótidos complementarios 1 y 2 fue de entre 12 y 24 nucleótidos, y la secuencia se seleccionó dependiendo de la funcionalidad deseada por el usuario. El enlazante de doble cadena se purificó a continuación por cromatografía en columna a través de una columna de centrifugación de Sephadex G-50. La solución de enlazante purificada se concentró a continuación mediante liofilización a una concentración de 2 g/l.

b) ligación de enlazantes a los fragmentos de DNA genómico

Se configuró la siguiente reacción para ligar los enlazantes a los fragmentos de DNA genómico. La reacción se

incubó a 14°C durante toda la noche.

Enlazantes hibridados del paso a) (20 g): 10 l

DNA genómico del paso a) (10 l): 5 l

DNA ligasa de T4: 10 U

Tampón de ligación 10x: 2 l

Agua hasta: 20 l

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El volumen de reacción se ajustó a 500 l con agua y se ligó el DNA genómico se purificó usando un equipo de purificación de PCR QIAquick. El DNA purificado se almacenó a una concentración de 1 g/l.

c) selección primaria y captura de híbridos

Para preparar la muestra de DNA genómico para su hibridación con el microchip, se resuspendió el DNA genómico modificado enlazante (10 g) en 3,5 l de agua libre de nucleasas y se combinó con 31.5 l de tampón de hibridación NimbleGen (Roche Nim Blegen, Inc., Madison, WI), 9 l de aditivo de hibridación (Roche NimbleGen, Inc), en un volumen final de 45 l. Las muestras se desnaturalizaron con calor a 95°C durante 5 minutos y se transfirieron a un bloque de calor a 42°C.

Para capturar el DNA genómico diana en el microchip, las muestras se hibridaron con chips de CGH de NimbleGen, fabricados como se describe en la US 6.375.903 (Roche NimbleGen, Inc.). La fabricación sin máscara de oligonucleótidos de captura en los microchips se realizó mediante síntesis de oligonucleótidos dirigida por luz utilizando un microespejo digital como se describe en Singh-Gasson et al. (1999, Nat Biotech 17: 974 a 978, tal y como se realiza con un sintetizador de chips sin máscara. El análisis de la expresión génica usando chips de oligonucleótidos producidos mediante fotolitografía sin máscara se describe en Nuwaysir et al (2002, Genome Res

12: 1749-1755). La hibridación se realizó en un sistema de hibridación MAUI (BioMicro Systems, Inc., Salt Lake City, UT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 16 horas a 42°C utilizando el modo de mezcla B. Tras la hibridación, los chips se lavaron dos veces con tampón de lavado I (0,2 x SSC, SDS al 0,2% (v/v), DTT 0,1 mM, NimbleGen Systems) un total de 2,5 minutos. Los chips se lavaron a continuación durante 1 minuto, en tampón de lavado II (0,2 x SSC, DTT 0,1 mM, NimbleGen Systems) seguido de un lavado de 15 segundos en tampón de lavado III (SSC 0,05 x, DTT 0,1 mM, Roche NimbleGen, Inc.).

Para eluir el DNA genómico hibridado al microchip, los chips se incubaron dos veces durante 5 minutos en agua a 95°C. El DNA eluido se secó y separó usando centrifugación al vacío.

d) amplificación del DNA seleccionado inicialmente

El DNA genómico seleccionado inicialmente se amplificó tal como se describe a continuación. Se realizaron diez réplicas independientes de la reacción de amplificación en tubos de PCR de 200 l. Sólo se requiere un cebador oligonucleótido, ya que cada fragmento tiene el mismo enlazante ligado a cada extremo:

Reactivos de reacción:

molde: selección primaria material 5 l oligonucleótido 1 (200 ng/l) 1 l (5'-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3') (Id. de Sec. Nº: 1) dNTP (25 mM cada uno) 0,4 l Tampón de reacción de la polimerasa de DNA Pfu HF Ultra 10x 5 l polimerasa de DNA Pfu HF Ultra 10x 2,5 U agua hasta 50 l

Las reacciones se amplificaron de acuerdo con el siguiente programa:

Número de ciclo Desnaturalización Hibridación Polimerización 1 2 min. a 95°C 2-31 30 s a 95°C 30 s a 55°C 1 min. a 72°C

Los productos de reacción se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Los productos de amplificación se purificaron usando un equipo de purificación de PCR QIAquick. Las muestras eluidas se agruparon y la concentración del DNA seleccionado primario amplificado se determinó por espectrofotometría. Un volumen de DNA en las muestras agrupadas equivalente a 1 g se reduce a 5 l en un concentrador de velocidad en vacío. Se reservó 1 l (al menos 200 ng) de la materia prima seleccionada para la comparación con los productos de selección secundaria. Si es necesario, se realizan subsiguientes rondas de enriquecimiento mediante adicionales de hibridación del chip y amplificación de la muestra eluida.

e) preparación de sondas de oligonucleótidos diana para su liberación de los microchips y su inmovilización en un soporte

Las sondas se sintetizaron sobre un microchip, luego se liberaron mediante un grupo base lábil Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo). Las sondas se marcaron con biotina y después se inmovilizaron sobre la superficie de un soporte sólido de estreptavidina utilizando métodos conocidos para la unión covalente o no covalente.

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imagen19

imagen20

Tabla 4:

Tamaño de contigüidad (kb): Selección Promedio sonda Vidrieros Densidad Rendimiento del FLX (Mb) Porcentaje de lecturas que mapan de forma única en el genoma Porcentaje de lecturas totales que mapan en las dianas de selección Mediana de la cobertura de porción única de la región

200: 1 pb 102 55% 14% 79

500: 1 pb 85,0 61% 36% 93

1000: 2 pb 96,7 56% 35% 38

2000: 3 pb 112,6 81% 60% 37

5000: 7 pb 140 81% 64% 18

Estos datos ilustran el poder de los métodos de selección directa basada en microchips para el enriquecimiento de secuencias específicas. El inventor utilizó una plataforma de chips de alta densidad programable con 385.000 5 sondas que eran capaces de capturar fácilmente al menos 5 Mb de la secuencia total. Además de la especificidad del ensayo, los altos rendimientos de los pasos posteriores de secuenciación de DNA fueron superiores de forma consistente al funcionamiento promedio de rutina utilizando fuentes de DNA no capturadas. Esto se atribuye al proceso de enriquecimiento por captura que proporciona una purificación útil de secuencias únicas lejos de las repeticiones y otras impurezas que pueden confundir, por ejemplo, en la primera etapa de PCR en emulsión del

10 proceso de secuenciación en el 454.

Ejemplo 4 -Captura y resecuenciación en fase de solución

La muestra de los Ejemplos 2 y 3 se analizó utilizando sondas de captura sintetizadas tras liberarse de un soporte

15 sólido, de forma que el enriquecimiento fue ejecutó de forma ventajosa en fase de solución. Los diseños de microchips estándar (por ejemplo, el chip de secuencia contigua BRCA1 200K y los chips de captura exónica humanos de los ejemplos anteriores) fueron modificados mediante la adición de secuencias de cebadores 15meros terminales que contienen un sitio de reconocimiento Mlyl, lo que facilita la eliminación enzimática del cebador, dejando la secuencia de oligonucleótidos de captura intacta.

20 Los chips se sintetizaron mediante la adición de un reactivo de fosforilación química (Glen Research) tras el enlazante T5 inicial y antes de la secuencia del cebador 3'. Se llevaron a cabo tres acoplamientos individuales para maximizar la posterior escisión de las sondas de captura de los chips.

25 Las sondas de captura inmovilizadas en el chip se trataron con hidróxido de amonio al 30% (NH4OH, Aldrich). Después de la síntesis, los chips se colocaron en una cámara húmeda y se añadieron aproximadamente 700 l de NH4OH en la zona de síntesis a temperatura ambiente durante 20 minutos para escindir las sondas del chip. El NH4OH se mantuvo en gran medida dentro del área de la zona de síntesis debido a las diferencias de hidrofobicidad entre la zona de reacción y el vidrio circundante. La solución se retiró con una pipeta y se retuvo. Se añadieron 700

30 l adicionales de NH4OH fresco a la superficie. El proceso se repitió un total de 3 veces (60 min. y 2,1 ml en total). Las sondas de captura de oligonucleótidos escindidos se secaron entonces mediante centrifugación al vacío en condiciones estándar conocidas en la técnica.

Las sondas de captura escindidas se amplificaron bajo condiciones estándar. Las sondas secas se volvieron a

35 resuspender en 30 l de agua desionizada (diH2O) y se alicuotaron en 30 reacciones de PCR individuales como sigue:

Reactivos de reacción:

40 Tampón 10X 2,5 l dNTP 25 mM 0,125 l Cebador 1A 20 M 1,25 l Cebador 1b 20 M biotinilado 1,25 l HotStart Taq 0,25 l

45 MgCl 1 l Muestra 1 l H2O 17,625 l Volumen total 25 l

50 Cebador la: 5'-TGCCGGAGTCAGCGT-3 '(Id. de Sec. Nº: 19)

Cebador 1b: 5'-biotina-AGTCAGAGTCGCCAC-3 '(Id. de Sec. Nº: 20)

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Las reacciones se amplificaron de acuerdo con el siguiente programa: Número de ciclo Desnaturalización Hibridación Polimerización

1 15 min. a 95 ° C

2-31 20 s a 95°C 45 s a 48°C 20 s a 72°C

Los productos de PCR se purificaron de los componentes de reacción utilizando el equipo de eliminación de nucleótidos QiaQuick (Qiagen), se secaron y se resuspendieron en 20 l de diH2O. El rendimiento típico después de la purificación fue de aproximadamente 400-700 ng/ reacción por Nanodrop. Los amplicones pueden comprobarse en un gel de agarosa al 3%. Dependiendo de los requisitos de cantidad de sondas de captura, se realizaron rondas adicionales de PCR como las anteriores produciendo aproximadamente 200 ng de muestra por reacción. Los amplicones se purificaron y se caracterizaron como se ha indicado anteriormente.

La ronda final de amplificación de las sondas de captura se realizó mediante una PCR asimétrica. El protocolo fue como el anterior, excepto que mientras que concentración de cebador biotinilado sigue siendo la misma, la concentración de cebador no biotinilado se redujo a 0,001x de la concentración original. El protocolo se extendió a 35 ciclos para permitir una amplificación no exponencial. Los amplicones se secaron, se resuspendieron en 20 l de diH2O y se caracterizaron.

La muestra de DNA genómico se preparó según el protocolo estándar; 20 g de la muestra de AGC con enlazantes se secó con 100 g de DNA Cot-1 y se resuspendió en 7,5 l de tampón de hibridación y 3 l de formamida. Una alícuota de 2 g de las sondas de captura se secó y se resuspendió en 4,5 l de diH2O. La solución de muestra se mezcló con la solución de sondas de captura y se incubó a 95°C durante 10 minutos. A continuación, la mezcla se transfirió a un tubo de PCR y se colocó en un termociclador durante 3 días a 42°C para su hibridación y formar dúplex.

Después de la hibridación, los dúplex se unieron a cuentas paramagnéticas (Dynal). 25 l de cuentas se lavaron tres veces en tampón BW 2x (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 M), y las cuentas se resuspendieron en la mezcla de hibridación. La unión se produjo a lo largo de 45 minutos a 42°C con mezclado suave ocasional.

Las cuentas unidas se aislaron utilizando un imán y se lavaron brevemente con 40 l de tampón de lavado I, se incubaron durante 2 x 5 minutos en tampón de lavado riguroso a 47°C, se lavó con tampón de lavado I durante aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente, con tampón de lavado II durante aproximadamente 1 minuto, y con tampón de lavado III durante aproximadamente 30 segundos.

Para eluir los fragmentos capturados, la solución que contenía cuentas en tampón de lavado III se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Las cuentas se aislaron con un imán. El tampón de lavado se eliminó y se añadieron ~100 l de diH2O a 95°C. La solución se incubó a 95°C durante 5 minutos, después de lo cual las cuentas se unieron a un imán y se lavaron suavemente con diH2O a 95°C. A continuación, el líquido de lavado se eliminó y se conservó, y se reemplazó con diH2O fresca a 95°C. La incubación y lavado se repitió durante un total de 3 veces (15 minutos, aproximadamente 300 l de eluido). Después del lavado final, el tubo Eppendorf que contenía el eluido se colocó en un soporte magnético durante aproximadamente 5 minutos para aislar cualquier cuenta aspirada durante la elución. La solución se secó a temperatura elevada en un tubo Eppendorf. Los fragmentos capturados eluidos se volvieron a resuspender en 263 l de diH2O antes de la LM-PCR estándar.

Después de LM-PCR, los fragmentos capturados fueron sometidos a secuenciación estándar ultra-profunda utilizando la plataforma 454 FLX, como anteriormente. Alternativamente, se puede evitar la LM-PCR mediante la ligación de secuencias adaptadoras de secuenciación en 454 en la muestra de pre-enriquecimiento. En ese caso, las secuencias enriquecidas eluidas se pueden añadir directamente en la PCR de emulsión para la secuenciación ultra-profunda.

Los datos indicaron que el 83,8% de las lecturas mapaban en las regiones diana, lo que es comparable e indistinguible de los resultados obtenidos mediante protocolos de captura basados en chips.

Ejemplo 5 -Captura en la fase solución utilizando amplificación in situ de sondas de captura

Un diseño estándar de microchips se modificó mediante la adición de una secuencia de cebador 15-mero terminal que contenía un sitio de reconocimiento Mlyl (GAGTC(5/5)). La incorporación de una diana Mlyl en la secuencia del cebador facilita la eliminación enzimática del cebador dejando intactas las secuencias de oligonucleótidos de captura. Los chips se sintetizaron mediante métodos de síntesis de chips sin máscara estándar conocidos por los expertos en la materia.

Las sondas de captura se amplificaron utilizando la reacción en cadena de la polimerasa in situ (PCR) sobre un chip en un termociclador usando una cámara de hibridación de sellado (Grace Bio-Labs, Inc., Bend, OR) y Adaptador de plancha deslizante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se añadieron los constituyentes de la reacción de PCR (25

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l de tampón 10X de polimerasa, 1,25 l de cada dNTP 25 mM, 12,5 l de cada cebador 20 M 1a y 1b, 2,5 l de polimerasa Taq Hotstart, 10 l de MgCl2 25 mM y 176,5 l de diH2O, el volumen total de reacción es de 250 L) a las cámaras de hibridación de microchips y la PCR se realizó usando las condiciones; 100 °C durante 30 segundos, 97 °C durante 15 min., 30 ciclos de 100 °C durante 30 segundos, 47,5 °C durante 45 segundos, 78 °C durante 30 segundos, seguido por el enfriamiento de las reacciones hasta 1 °C durante 30 segundos y a 3,5 °C para mantener. Las secuencias de cebadores fueron para el cebador 1a 5'-TGCCGGAGTCAGCGT-3 '(Id. de Sec. Nº: 19) y el cebador 1b 5'-Biotina-AGTCAGAGTCGCCAC-3' (Id. de Sec. Nº: 20), lo que refleja sitios de unión a cebador que fueron incorporados a las secuencias de la sonda.

Los amplicones de sonda de captura de la reacción en cadena de la polimerasa se purificaron a partir de los componentes de reacción utilizando el equipo de eliminación de nucleótidos QIAquick® (Qiagen, Inc., Valencia, CA), se secaron y se resuspendieron en 20 l de diH2O. El rendimiento de amplificación fue de aproximadamente 5 g en total, medido mediante espectrofotometría NanoDrop® (Thermo Fisher Scientific). Se pueden realizar rondas de amplificación adicionales, siguiendo el protocolo anterior, si se necesita una cantidad de amplicón adicional (por ejemplo, utilizando el protocolo anterior y 100 ng de muestra por reacción).

La ronda final de la amplificación de las sondas de captura se realizó mediante PCR asimétrica; 2,5 l de tampón polimerasa 10X, 0,125 l de dNTPs 25 mM, 0,0125 l de cebador 1a 20um, 1,25 l de cebador 1b 20 m, 0,25 l de Taq Hotstart, 1 l MgCl2 25 mM y 18,86 l de diH2O (volumen de reacción total de 25 l). Los amplicones se purificaron de los componentes de reacción utilizando las columnas Qiagen MinElute ™ y se cuantificaron como se describe anteriormente.

Una muestra de DNA genómico se preparó según el protocolo estándar. Veinte g de la muestra con enlazantes unidos se secaron con 100 g de DNA Cot-1 y se resuspendieron en 7,5 l de tampón de hibridación (Roche NimbleGen, Madison, WI) y 3 L de formamida. Una alícuota de 1 g de las sondas de captura se secó y se resuspendió en 4,5 l de diH2O. La solución de muestra se incubó a 95 °C durante 10 min. para desnaturalizar el DNA y se añadió a la solución de sonda de captura. La mezcla se transfirió a un tubo de PCR y se colocó en un ciclador térmico a 42 °C durante 3 días para permitir que se produzca la formación de dúplex.

Después de la hibridación, los dúplex estaban unidos a cuentas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal®, Invitrogen, Carlsbad, CA). Cien microlitros de cuentas se lavaron tres veces con tampón 2X BW (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2 M) y se resuspendieron en la mezcla de dúplex de hibridación. Se permitió que se produjera la unión entre las cuentas y el dúplex durante 45 min. a 42 °C con agitación suave ocasional. Las c uentas unidas se aislaron utilizando un imán y se lavaron brevemente en tampón de lavado I (0,2 X SSC, 0,2% (v / v) SDS, DTT 0,1 mM) a temperatura ambiente, seguido de dos lavados (cada lavado durante 5 min. a 47 °C) en 200 l de tampón de lavado riguroso (MES 0,1 M pH 6,65, NaCl 0,1 M, 0,1% de Tween 20), un lavado adicional en el tampón de lavado I durante 2 min. a temperatura ambiente, una vez con tampón de lavado II (SSC 0,2x, DTT 0,1 mM) durante 1 min. a temperatura ambiente y finalmente durante 30 seg. en tampón de lavado III (SSC 0,05x, DTT 0,1 mM) a temperatura ambiente.

Los fragmentos capturados se eluyeron de las cuentas. La solución de cuentas lavadas en tampón de lavado III se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml, las cuentas se aislaron con un imán, el tampón de lavado eliminado y reemplazado con 100 l de diH2O a 95 °C y las cuentas se liberaron del imán. Las cuentas suspendidas se incubaron a 95 °C durante 5 min. después de lo cual se capturaron las cuentas y se lavaron suavemente con diH2O a 95 °C para eluir los fragmentos capturados. El eluato se eliminó y las cuentas se lavaron de nuevo, para un total de tres lavados con agua; total de 10 min. con volumen final del conjunto de eluatos de aproximadamente 300 l. Después del lavado final, las cuentas magnéticas residuales se eliminaron a partir del conjunto de eluatos mediante una captura magnética adicional y se transfirió el eluato a un tubo nuevo. La solución se secó y los fragmentos eluidos capturados, se resuspendieron en 263 l de diH2O en preparación para la posterior LM-PCR. La ligación se realizó mediante protocolos establecidos conocidos por los expertos en la materia, usando un ligador de secuencia 5'-CTCGAGAATTCTGGATCC-3 '(Id. de Sec. Nº: 21).

Después de LM-PCR, los fragmentos capturados se sometieron a secuenciación ultraprofunda utilizando la plataforma 454 FLX (454 Life Sciences, Branford, CT). Alternativamente, la LM-PCR se puede evitar mediante la ligación de las secuencias adaptadoras 454 de la secuenciación con la muestra de pre-enriquecimiento. En este último caso, las secuencias enriquecidas eluidas se pueden añadir directamente en la emulsión de PCR de la plataforma 454 FLX.

La Figura 7 ilustra un experimento de resecuenciación a partir de fragmentos capturados en solución usando los métodos descritos anteriormente. Los controles de qPCR que utilizan secuencias de cebador control de PCR indican una media de enriquecimiento de 2600 veces a lo largo de los cuatro loci control. Secuencias de cebador control de qPCR:

qPCR gSel-0210F GACCCTCTTACCTTGGCATTCTC (Id. de Sec. Nº: 22) qPCR gSel-0210R GCTGGTACCCATTGGCAACT (Id. de Sec. Nº: 23)

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qPCR gSel-0271F GGAGTGAGTGGTTTTTCTTCATTTTT (Id. de Sec. Nº: 24) qPCR gSel-0271R GCGCCACAAAGAGACATTCA (Id. de Sec. Nº: 25)

qPCR gSel-0266F AAGGCCATACTTGGGTGAACTG (Id. de Sec. Nº: 26) qPCR gSel-0266R GCTCTGATTGGTGGCTTCGT (Id. de Sec. Nº: 27)

qPCR gSel-0283F TGCTTGCAGGTGTCTCTCAGA (Id. de Sec. Nº: 28) qPCR gSel-0283R CAGTGAGATATTTGGTACCATGGTGTA (Id. de Sec. Nº: 29)

De hecho, la conformación en la que el porcentaje de lo que se espera tras la secuenciación con lo que se realiza tras la resecuenciación es de aproximadamente el 100% parta casi todas las regiones resecuenciadas.

Se describe lo siguiente

1. Un método para reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico, dicho método comprende los pasos de:

a) exponer moléculas de ácido nucleico genómico desnaturalizado y fragmentado de dicha población a múltiples y diferentes sondas de oligonucleótidos bajo condiciones hibridantes en solución, seguido por la unión de complejos de moléculas hibridadas a un soporte sólido siendo una población de cuentas para capturar las moléculas de ácidos nucleicos que hibridan específicamente a dichas sondas, en el que dichas moléculas de ácido nucleico desnaturalizado y fragmentado tienen un tamaño medio de entre alrededor de 100 a alrededor de 1000 residuos de nucleótidos, preferiblemente entre alrededor de 250 a alrededor de 800 residuos de nucleótidos, y más preferiblemente entre alrededor de 400 a alrededor de 600 residuos de nucleótidos, y

b) separar los ácidos nucleicos no hibridados y los hibridados de forma inespecífica de las moléculas

capturadas; c) eluir las moléculas capturadas del soporte sólido, y d) repetir opcionalmente los pasos (a) a (c) durante al menos un ciclo adicional con las moléculas capturadas

eluidas,

2.: El método de acuerdo con 1, en el que las múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos contienen cada una un grupo químico o enlazante capaz de unirse a un soporte sólido.

3.: El método de acuerdo con 1 o 2, que comprende además el paso de ligar moléculas adaptadoras a uno o ambos extremos, preferiblemente ambos extremos de las moléculas de ácido nucleico antes o después del paso (a).

4.: El método de acuerdo con 3, que comprende además el paso de amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico con al menos un cebador, dicho cebador comprende una secuencia que hibrida específicamente a la secuencia de de dicha(s) molécula adaptadora.

5.: El método de acuerdo con cualquiera de 1 a 4, en el que dicha población de moléculas de ácido nucleico es una población de moléculas de DNA genómico.

6.: El método de acuerdo con cualquiera de 1 a 5, en el que dicho soporte sólido puede ser un chip de ácidos nucleicos o una población de cuentas.

7.: Un método para aislar y reducir la complejidad de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que comprende:

a) proporcionar:

i) un soporte sólido que comprende sondas de hibridación que pueden hibridarse con secuencias de ácido nucleico diana, ii) una muestra de ácido nucleico que comprende las secuencias de ácidos nucleicos diana,

b) amplificar dichas sondas de hibridación de forma que los productos de amplificación comprendan una porción de unión y en el que dichos productos de amplificación se mantengan en solución,

c) hibridar dicha muestra de ácido nucleico a dichos productos de amplificación en solución de forma que se permita que se produzca la hibridación entre dichos productos de amplificación y las secuencias de ácidos nucleicos diana,

d) separar los complejos de hibridación de los ácidos nucleicos diana / producto de amplificación de los ácidos nucleicos hibridados no específicamente mediante dicha matriz de unión, y

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23. Un método para determinar la información de una secuencia de ácido nucleico de al menos una región de ácido nucleico, en particular de ácido nucleico genómico, y el método comprende los pasos de:

1.: reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con un método de acuerdo con cualquiera de 1 a 22, y

2.: determinar la secuencia de ácido nucleico de las moléculas capturadas, en particular mediante la realización de una secuenciación mediante reacciones de síntesis.

24. Un método para detectar la variación en la región de codificación en relación a un genoma de referencia, que comprende el método los pasos de:

1.: reducir la complejidad genética de una población de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con un método de acuerdo con cualquiera de 1 a 22,

2.: determinar la secuencia de ácido nucleico de las moléculas capturadas, y

3.: comparar la secuencia determinada con las secuencias en una base de datos del genoma de referencia, en particular, con las secuencias en una base de datos de polimorfismos en el genoma de referencia para identificar las variantes del genoma de referencia.

25.: Un equipo que comprende

-moléculas adaptadoras de doble cadena, y -un soporte sólido con múltiples, diferentes sondas de oligonucleótidos, en el que dichas sondas se seleccionan de: -una pluralidad de sondas que definen una pluralidad de exones, intrones o secuencias reguladoras a partir de una pluralidad de loci genéticos -una pluralidad de sondas que definen la secuencia completa de al menos un locus genético único, dicho locus posee un tamaño de al menos 100 kb, preferiblemente al menos 1 Mb o un tamaño tal como se ha especificado en este documento, -una pluralidad de sondas que definen sitios conocidos por contener SNP, o -una pluralidad de sondas que definen un microchip de secuencia contigua especialmente diseñado para capturar la secuencia completa de al menos un cromosoma completo.

26.: El equipo de acuerdo con 25, en el que el equipo contiene dos moléculas adaptadoras diferentes de doble cadena.

27.: El equipo de acuerdo con 25 o 26, en el que dicho soporte sólido es tanto una pluralidad de cuentas o un microchip.`

28.: El equipo de acuerdo con cualquiera de 25 a 27, que comprende además al menos uno o más componentes seleccionados de polimerasa de DNA, polinucleótido quinasa T4, ligasa de DNA T4, una solución de hibridación de chips, una solución de lavado de chips, y/o una solución de elución de chips.

29.: Un equipo que comprende

a) secuencias de hibridación de sondas que comprenden una porción de unión en el que dichas secuencias de sondas están diseñadas para hibridar a una o más secuencias de ácido nucleico y en el que dichas secuencias de sonda están en solución, b) un sustrato que comprende una pareja de unión para unir dicha porción de unión, e c) instrucciones para realizar los métodos de 7.

30.: El equipo de acuerdo con 29, que comprende además una o más de solución de hibridación, solución de lavado y solución de elución.

31.: El equipo de acuerdo con 30, que comprende además un imán.

Listado de referencias

Altschul, S.F. et al. (1990) J. Mol. Biol.215,403-410 Hyman, E. D. (1988), Anal.Biochem.174, 423-436 Lovett et al. (1991) PNAS USA, 88, 9628-9632 Morgulis, A. et al. (2006) Bioinformatics, 15, 134-41 Nuwaysir, E.F., et al., (2002) Genome Res.12, 1749-1755 Rhonaghi et al. (1998), Science 281, 363-365 Soares, et al. (1994) PNAS, 91, 9228-9232 Singh-Gasson, S., et al. (1999) Nat.Biotechnol.17, 974-978 Wetmur (1991) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 26(34):227-59 Wetmur et al. (1966) J. Mol.Biol., 31, 349-70

Claims

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