CN109355365A - 一种小rna高通量测序检测微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的通过RNA捕获‑小RNA高通量测序(RNA capture and sRNA‑seq,RC&sRNA‑seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。该方法可以一次性检测样品中几千种微生物,并可以达到极高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体提出了一种基于小RNA高通量测序(small RNAsequencing,sRNA-seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。根据本发明的方法可以一次性检测样本中几千种微生物,并可以达到极高的灵敏度。这种方法由南开大学高山和中国农科院陈泽等在国际上首次提出,并命名为RNA捕获-小RNA高通量测序(RNA captureand sRNA-seq,RC&sRNA-seq)。
背景技术
基于高通量测序检测微生物的方法具有灵敏度高、覆盖种类多和能够检测新病毒等优势,已成为微生物检测领域的一类重要方法。小RNA(small RNA,sRNA)是长度在200nt以下的RNA分子的总称,小RNA高通量测序是高通量测序的一种。2013年,南开大学高山等在国际微生物大会(WCM 2013)上首次提出小RNA高通量测序可以用于临床病毒检测,并通过大数据挖掘检测到六类严重危害人类健康的病毒,分别是人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)和EB病毒(EBV)。但是,由于哺乳动物(特别是人类等高级哺乳动物)生命系统的复杂性,常规的小RNA高通量测序检测的信噪比(病毒序列与宿主序列比例)一直难以提高。直到2016年,南开大学高山和中国农科院陈泽等通过开发新的RNA捕获-小RNA高通量测序的方法,将病毒检测信噪比大大提高,并推广到可以检测细菌和真菌,为这一方法的广泛应用奠定了基础。
发明内容
本发明提供了一种通过RNA捕获-小RNA测序(RNA capture and sRNA-seq,RC&sRNA-seq)检测微生物的方法。所述方法包括以下步骤:
(1)提取生物样品中的总RNA,通过酶切或物理打断得到片段化的RNA;
(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物(如生物素Biotin)的DNA探针进行杂交,得到经标记的RNA-DNA杂交产物;
(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体(如链霉亲和素Streptavidin,SAV)的磁珠混合,使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物,洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物;
(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性,洗脱回收RNA,向回收物中加入DNA酶降解DNA片段;
(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端,得到带有3′端接头的RNA;
(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交,得到RNA-引物杂交产物;
(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端,得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物;
(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR,得到扩增的cDNA片段,选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序,测序长度在50bp以上;
(9)去除步骤(8)中测序获得的序列(即原始读段)3′端的测序接头,再去除15bp长度以下的序列,得到清理后的序列;
(10)使用bowtie或BWA软件,将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对,将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列;对目标小RNA序列进行计数,将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次;如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值,则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。
优选地,其中步骤(8)中扩增cDNA片段所用的引物为Illumina公司的PCR引物。
优选地,所述目标小RNA序列与所述目标微生物基因组序列的比对区域完全相同。
优选地,所述微生物包括病毒、细菌和真菌。
优选地,所述DNA探针的序列为来自病毒、细菌和/或真菌基因的特异序列;优选地,所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。
优选地,所述DNA探针的序列与步骤(10)中所述目标微生物基因组序列来源的微生物种类相同。
优选地,当所述目标微生物为病毒时,其指定阈值为100;当所述目标微生物为细菌和真菌时,其指定阈值为1000。
在某些优选实施方案中,所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系;更优选地,为血液或患病组织。
在某些优选实施方案中,所述病毒包括人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)、EB病毒(EBV)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV);优选地,所述细菌为布鲁氏菌;优选地,所述真菌为烟曲霉菌。
在某些优选实施方案中,所述特异序列包括病毒特异序列、细菌特异序列或真菌特异序列;优选地,所述病毒特异序列包括人乳头状瘤病毒(HPV)特异序列、乙肝病毒(HBV)特异序列、丙肝病毒(HCV)特异序列、艾滋病病毒(HIV)特异序列、松鼠猴病毒(SMRV)特异序列、EB病毒(EBV)特异序列和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)特异序列;优选地,所述细菌特异序列为布鲁氏菌特异序列;优选地,所述真菌特异序列为烟曲霉菌特异序列。
发明的有益效果
本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法可以一次性检测样品中几千种微生物;且与常规的通过小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)检测微生物的方法相比,可以提高病毒、细菌和真菌检测的信噪比,从而具有更高的灵敏度。
附图说明
图1为本发明的小RNA高通量测序检测微生物的方法的流程图。
具体实施方式
实施例1
根据来自HPV-18病毒基因组参考序列(GenBank数据库索引为M20325.1)的2个25bp的特异性片段(ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAACAC和AGATTAGCAGGTAGTAGAATAATGA)制备探针。从感染HPV-18病毒的Hela细胞中提取总RNA,然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测HPV-18病毒,步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪,测序方式为单端50bp。其中,步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为15,210,932条,进一步经步骤(9)得到的清理后的序列为12,076,158条,上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为6,038。因此确定该样品的HPV-18病毒检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比,得到根据本发明的方法检测HPV-18病毒的信噪比为0.05%(6,038/12,076,158),显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测HPV-18病毒的信噪比0.01%(1,228/12,285,476)。
实施例2
根据来自布鲁氏菌基因组参考序列(GenBank数据库索引为CP013964.1)的3个25bp长度的特异性片段(AGGGAAACTTGTGCTAATACCGTAT、GAGTGATCAAGTGTCTTAAGGGCAT和CCTGGTGGTTATGGCGGAGCGGCTG)制备探针。从感染布鲁氏菌的猪的血液中提取总RNA,然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测布鲁氏菌,步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪,测序方式为单端50bp。其中,步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)21,504,891条,进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列18,461,371条,上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为960,613。因此确定该样品的布鲁氏菌检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列计数值与所述清理后的序列数量之比为信噪比,得到根据本发明的方法检测布鲁氏菌的信噪比为5.2%(960,613/18,461,371),显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测布鲁氏菌的信噪比0.93%(160,613/17,260,345)。
实施例3
根据来自烟曲霉菌基因组参考序列(GenBank数据库索引为NC_007194.1)的一个20bp长度的特异性片段(UGGCUCAGAAUUCUGAGCCA)制备探针。从感染烟曲霉菌基因组的细胞中提取总RNA,然后根据本发明提供的通过RNA捕获-小RNA高通量测序检测微生物的方法的步骤(1)到(10)检测烟曲霉菌,步骤(8)中高通量测序使用Illumina公司的Hiseq 2000测序仪,测序方式为单端50bp。其中,步骤(8)经测序得到的序列(即原始读段)为16,014,040条,进一步经步骤(9)得到所述清理后的序列13,951,269条,上述清理后的序列经步骤(10)处理后得到的目标小RNA序列计数值为960,613。因此确定该样品的烟曲霉菌检测结果呈阳性。定义所述目标小RNA序列与所述清理后的序列数量之比为信噪比,得到根据本发明的方法检测烟曲霉菌的信噪比为0.8%(112,003/13,951,269),显著高于常规的小RNA高通量测序(不经过RNA捕获)方法检测烟曲霉菌的信噪比0.53%(72,003/13,564,430)。
Claims (6)
1.一种通过RNA捕获-小RNA测序检测微生物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取生物样品中的总RNA,通过酶切或物理打断得到片段化的RNA;
(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物的DNA探针进行杂交,得到经标记的RNA-DNA杂交产物;
(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体的磁珠混合,使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物,洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物;
(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性,洗脱回收RNA,向回收物中加入DNA酶降解DNA片段;
(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端,得到带有3′端接头的RNA;
(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交,得到RNA-引物杂交产物;
(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端,得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物;
(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR,得到扩增的cDNA片段,选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序,测序长度在50bp以上;
(9)去除步骤(8)中测序获得的序列3′端的测序接头,再去除15bp长度以下的序列,得到清理后的序列;
(10)使用bowtie或BWA软件,将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对,将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列;对目标小RNA序列进行计数,将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次;如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值,则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述微生物包括病毒、细菌和真菌;优选地,所述病毒包括人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)、EB病毒(EBV)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV);优选地,所述细菌为布鲁氏菌;优选地,所述真菌为烟曲霉菌。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系;更优选地,为血液或患病组织。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述标记物为生物素,所述配体为链霉亲和素。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述DNA探针的序列为来自病毒、细菌或真菌基因的特异序列;优选地,所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。。
6.根据权利要求1所述的方法,其中当所述目标微生物为病毒时,其指定阈值为100;当所述目标微生物为细菌和真菌时,其指定阈值为100。
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