CN104894111A - 用于白血病染色体畸变高通量测序的dna靶向捕获阵列 - Google Patents

用于白血病染色体畸变高通量测序的dna靶向捕获阵列 Download PDF

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李卫东
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Abstract

本发明公开了一种用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获检测的DNA阵列，在本DNA阵列中，包含的探针能够特异性靶向捕获37个染色体畸变所涉及的18个基因。将样品与本DNA阵列杂交靶向捕获染色畸变所涉及的基因序列，然后对捕获的序列进行测序，将测序的结果进行分析筛查出存在的染色体畸变类型。该DNA阵列包含的探针特异性结合涉及37个染色体畸变的18个基因，实现对与白血病相关的染色体易位进行快速的筛查；芯片检测一次可检测多个样本，费用较低；对待检测的37个位点准确率接近100％；不需要细胞遗传学专业人员对结果进行判读。

Description

用于白血病染色体畸变高通量测序的DNA靶向捕获阵列
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于白血病染色体畸变高通量测序的DNA靶向捕获阵列。
背景技术
随着分子细胞遗传学技术的发展，已经证实某些染色体的特异性改变与白血病的发生发展以及预后有着密切的关系。染色体异常的检测为白血病的临床诊断、分期、治疗、预后的判断以及微小残留病变的治疗提供重要依据。
目前，国内外对于白血病染色体畸变的检测采用高分辨率的显带技术、荧光原位杂交技术(FISH)等，染色体显带技术(chromosome banding technology)指借助特殊的处理程序，使染色体的一定部位显示出深浅不同的染色体带纹。这些带纹具有物种及染色体的特异性，可更有效地鉴别染色体和研究染色体的结构和功能。荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)，是根据已知的特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与被检测的染色体的DNA分子杂交，如果被检测的染色体上的靶DNA与所用的探针是同源互补的，即可形成靶DNA与探针的杂交体，经荧光检测体系检测杂交信号；这些对技术操作和判读都有较高要求，染色体荧光原位杂交探针价格昂贵，且只针对单一位点；并且染色体技术只适用于检测分裂相的细胞，分辨率较低，结果的准确判读需要长期的专业训练。染色体荧光原位杂交技术虽然能检测分裂期细胞和分裂间 期细胞，但其每次只能用一种已知探针检出一种异常，漏检率很高，且对技术操作要求严格、费用较高。
高通量测序又称第二代测序，是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA片段进行序列测定。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面(即Flow cell)，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。目标序列捕获测序技术是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用，这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。该技术为白血病染色体畸变的检测提供了合适的解决方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种用于白血病染色体畸变高通量靶向测序的DNA捕获阵列，对37个与诊断、预后和治疗有关的白血病/淋巴瘤染色体畸变位点DNA进行捕获，用来进行高通量靶向测序的快速筛查，可以有效地一次性检出37种染色体畸变。
本发明所采用的技术方案是：一种用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获检测的DNA阵列，该DNA阵列包含的探针特异性结合涉及37个染色体畸变的18个基因，所捕获的18个基因片段分别为：
编号 基因 染色体 起始位点 终止位点 区域大小(bp)
1 ABL1(ABL) 9 133589258 133763072 173815
[0008] 
2 ETV6(TEL) 12 11802778 12048335 24558
3 IGHD(IGH) 14 106303089 106312020 8932
4 KAT6A(MOZ) 8 41786987 41909515 122529
5 KMT2A(MLL) 11 118307195 118397549 90355
6 MECOM(EVI1) 3 168801277 169381573 580297
7 MYH11 16 15796982 15950900 153919
8 NPM1(NPM) 5 170814110 170838151 24042
9 NUP214(CAN) 9 134000938 134110067 109130
10 NUP98 11 3696230 3819032 122803
11 PDGFRA 4 55095254 55164424 69171
12 PDGFRB 5 149493390 149535433 42044
13 RARα 17 38465413 38513905 48493
14 RBM15(OTT) 1 110881118 110889313 8196
15 RUNX1(AML) 21 36160088 37357057 1196970
16 TAL1 1 47681953 47697902 15950
17 TCF3(E2A) 19 1609279 1652338 43060
18 TLX1(HOX11) 10 102890252 102897556 7305
37个白血病染色体畸变分别为：
本发明的有益效果是：实现对与白血病相关的染色体易位进行快速的筛查；芯片检测一次可检测多个样本，费用较低；对待检测的37个位点准确率接近100％；不需要细胞遗传学专业人员对结果进行判读。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获测序的DNA阵列的设计
采用Agilent SureSelect DNA Design Tool设计针对染色体畸变所涉及的 18个基因(见表2)的探针。参数设置如下：
Species：H.sapiens，hg19，GRCH37，February2009；Databases：RefSeq，Ensembl，CCDS，Gencode，VEGA，SNP，
CytoBand；Region：Entire Transcribed Region；Region Extension：10 bases from 3’end and 10 bases from 5’end；Tiling density：2×；Masking：Least Stringent；Boosting：Balanced.
表2 探针靶向捕获的基因片段
编号 基因 染色体 起始位点 终止位点 区域大小(bp)
1 ABL1(ABL) 9 133589258 133763072 173815
2 ETV6(TEL) 12 11802778 12048335 24558
3 IGHD(IGH) 14 106303089 106312020 8932
4 KAT6A(MOZ) 8 41786987 41909515 122529
5 KMT2A(MLL) 11 118307195 118397549 90355
6 MECOM(EVI1) 3 168801277 169381573 580297
7 MYH11 16 15796982 15950900 153919
8 NPM1(NPM) 5 170814110 170838151 24042
9 NUP214(CAN) 9 134000938 134110067 109130
10 NUP98 11 3696230 3819032 122803
11 PDGFRA 4 55095254 55164424 69171
12 PDGFRB 5 149493390 149535433 42044
13 RARα 17 38465413 38513905 48493
14 RBM15(OTT) 1 110881118 110889313 8196
15 RUNX1(AML) 21 36160088 37357057 1196970
16 TAL1 1 47681953 47697902 15950
17 TCF3(E2A) 19 1609279 1652338 43060
18 TLX1(HOX11) 10 102890252 102897556 7305
实施例2使用本发明检测临床样品
1.提取骨髓或外周血标本提取基因组DNA。
2.杂交前准备 
2.1 将基因组DNA打成几百碱基的小片段建立文库。
2.2 使用Agencourt AMPure XP beads对样品进行纯化。
2.3 在DNA片段的3’端加碱基“A”。
2.4 使用Agencourt AMPure XP beads对样品进行纯化。
2.5 加双末端接头。
2.6 使用Agencourt AMPure XP beads对样品进行纯化。
2.7 扩增加接头的文库。
2.8 使用Agencourt AMPure XP beads对样品进行纯化。
2.9 评估文库的质量。
3.将该产品与建立的文库进行杂交捕获。
4.将捕获的DNA片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构。添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。将扩增片段进行测序，加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
5.数据分析。将测序片段进行排列，与人参考基因组序列进行比对，找出易位的片段。
本发明用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获测序的DNA阵列由一系列100碱基左右、序列部分重合的寡聚核苷酸组成，覆盖300万(3Mb)碱基的染色体畸变区域，共37个靶点(见表1)。采用200倍测序覆盖度(即平 均每个靶序列测序200次)，一个阵列检测25个样品，阵列的总测序容量在15Gb。本发明选择37个与白血病诊断分型、预后和治疗效果有关的染色体畸变(见表1)，针对其易位点建立靶向捕获测序阵列。对于易位点附近的靶序列，根据易位点是否相对固定，确定每个靶序列的大小，针对靶序列合成寡聚核苷酸标签，固定在芯片上制成阵列，与基因组特定区域互补达到“捕获”，对捕获的DNA序列进行“边合成边测序”，再将测序结果的短片段进行排列，找出染色体易位的位点。
表1 37个染色体畸变以及形成的融合基因
本发明针对37个与诊断、预后和治疗有关的白血病/淋巴瘤染色体易位，设计了覆盖这些易位点的靶向捕获测序阵列。应用这个阵列，可以对白血病患者外周血或骨髓标本的DNA进行靶向捕获测序，对靶向测序的结果进行排列比对后，找出可能的染色体易位点。本发明靶向测序捕获的范围为3Mb，以200倍覆盖率进行边合成边测序，每次检测25个样品，总数据量为15G(150亿碱基)。

Claims (2)

1.一种用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获检测的DNA阵列，其特征在于，该DNA阵列包含的探针特异性结合涉及37个染色体畸变的18个基因，所捕获的18个基因片段分别为：
编号 基因 染色体 起始位点 终止位点 区域大小(bp) 1 ABL1(ABL) 9 133589258 133763072 173815 2 ETV6(TEL) 12 11802778 12048335 24558 3 IGHD(IGH) 14 106303089 106312020 8932 4 KAT6A(MOZ) 8 41786987 41909515 122529 5 KMT2A(MLL) 11 118307195 118397549 90355 6 MECOM(EVI1) 3 168801277 169381573 580297 7 MYH11 16 15796982 15950900 153919 8 NPM1(NPM) 5 170814110 l70838151 24042 9 NUP214(CAN) 9 134000938 134110067 109130 10 NUP98 11 3696230 3819032 122803 11 PDGFRA 4 55095254 55164424 69171 12 PDGFRB 5 149493390 149535433 42044 13 RARα 17 38465413 38513905 48493 14 RBM15(OTT) 1 110881118 110889313 8196 15 RUNX1(AML) 21 36160088 37357057 1196970 16 TAL1 1 47681953 47697902 15950 17 TCF3(E2A) 19 1609279 1652338 43060 18 TLX1(HOX11) 10 102890252 102897556 7305
2.根据权利要求1所述的用于白血病染色体畸变高通量靶向捕获检测的DNA阵列，其特征在于，所述37个白血病染色体畸变分别为：
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