CN107723353A - 一种白血病驱动基因的高通量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白血病基因突变和基因融合的高通量检测方法，本方法选取目前白血病最常见的突变基因和融合基因，结合第二代高通量测序技术，更全面的检测白血病的基因突变和融合情况。第二代高通量测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法检通量大、测序时间段、精确度高、费用低和信息量丰富，可以在短时间内对目标基因进行精确定位和分析。本方法在高通量检测技术的帮助下，可以为临床医生提供更为详尽的基因突变和融合谱来综合判断白血病的预后、指导个性化治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种白血病驱动基因的高通量检测方法，尤其涉及一种白血病基因突变情况的检测方法。
背景技术
白血病(leukemia)也称作“血癌”，是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病(clonaldisorder)。几乎所有年龄段的人们都有患上白血病的可能。2012年全世界范围内大约352000人患有不同类型的白血病，其中265000人死于这种恶性肿瘤。在所有白血病患者中，大约90％是成年人。白血病在儿科恶性肿瘤的发病率中居第一位，它的死亡率在导致儿童及35岁以下成年人死亡的恶性肿瘤中排首位。
白血病有多种类型，按照病程进展的速度分为急性和慢性，主要包括四种类型：慢性骨髓性白血病(Chronic Myelocytic Leukemia,CML)，慢性淋巴性白血病(ChronicLymphocytic Leukemia,CLL)，急性骨髓性白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)和急性淋巴性白血病(Acute Lymphocytic Leukemia,ALL)。白血病病因是由于细胞内DNA变异形成的骨髓中造血组织生成大量不成熟、无法正常工作的白细胞，妨碍骨髓的其他功能，使白细胞、红细胞、血小板减少进而导致其他生理功能失调。白血病能够扩散到淋巴结、脾、肝、中枢神经系统和人体其它器官，使得白血病症状繁多。白血病发生基因突变的基因一般有：CEBPA、DNMT3A、IDH1、KIT、KRAS、NPM1、TET2、FBXW7、FLT3、JAK1、NOTCH、SH2B3(LNK)、MPL等，而近年来，由于细胞生物学和分子生物学技术的发展，已经认识到大部分的白血病中存在着染色体畸变。迄今报道白血病至少涉及50种以上的染色体畸变，累及数目更多的融合基因，这些异常已经成为不同类型白血病的分子生物学特异性标志。对白血病相关融合基因进行常规检测，可以为白血病诊断、分型、临床治疗选择和预后判断提供重要依据。目前白血病常见融合基因有：CBFB/MYH11、AML1/ETO、PML/RARа、E2A/PBX1、MLL/AF4、BCR/ABL、TEL/AML1、SIL/TAL1、MLL/AF10、MLL/AF9、MLL/ENL、NPM1/ALK、NPM/MLF1、MLL/ELL、MLL/AFX、MLL/AF1q、MLL/AF1p、PLZF/RARа等。由于白血病分型和预后分层复杂，因此没有千篇一律的治疗方法，需要结合细致的分型和预后分层制定治疗方案。目前主要有下列几类治疗方法：化学治疗﹑放射治疗﹑干细胞移植等。化学治疗是白血病重要的治疗手段之一。近年来新的化疗药物不断涌现，化疗方案不断更新，然而白血病总的完全缓解率和长期生存率仍然低下，究其原因，主要是白血病细胞对化疗药物的多药耐药。
随着肿瘤分子生物学的发展，白血病的分子靶向治疗，日益成为临床医生首选治疗方式。然后，由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，大多数白血病患者无法利用之相匹配的精准治疗方案，从而使患者错失了治疗的最优方案。80～90％急性白血病有克隆型染色体异常。我国白血病的诊断已经引入了WHO新分类的概念，这一新分类将具有特殊遗传学异常的白血病独立划分出来，而这些特殊的遗传学异常与FAB分型之间具有交叉性。以往的实际操作中，如果怀疑某些白血病患者涉及哪项融合基因，就进行这一项融合基因的检测。但是通常白血病临床进展很快，这种检测方法往往可能会导致选择错误，贻误病情。
目前，靶向治疗方案越来越多，相应的靶向位点也在增加。因此，癌症基因突变检测对于癌症的个体化治疗具有重要的意义。目前常用的基因突变检测有测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR以及第二代高通量测序技术(NGS)等。其中测序法、PCR-SSCP、ARMS、数字PCR癌症基因检测技术，都只能提供几个基因的少数位点的突变信息。而利用第二代高通量测序技术，可以一次检测全部所需基因，获取基因全部的突变信息，有助于医生更准确制定治疗方案。本专利利用二代高通量测序技术检测白血病患者基因突变位点和发生融合的基因，有如下优势：缩短了检测所需时间，可以一次检测全部所需基因和融合基因，获取基因全部的突变信息，可以为更好治疗白血病提供更全面的诊断信息，有助于医生更准确制定治疗方案，减少白血病患者的痛苦。
发明内容
本发明提供一种准确度高、临床意义明确的白血病基因突变和基因融合的筛查方法。
实现本发明目的的一种白血病基因突变和基因融合的筛查方法，包括如下步骤:
(1)根据人类基因组HG19，调取白血病高频突变基因和融合基因的外显子和内含子序列。常见白血病基因列表如下：
| ABL | ATM | ASXL1 | BCL2 | BCL6 |
| BCOR | BIRC3 | BRAF | CARD11 | CBL |
| CBL-B | CCND1 | CDKN2A | CEBPA | CREBBP |
| CSF3R | DNMT3A | EP300 | ETV6 | EZH2 |
| FBXW7 | FLT3 | FOXO1 | GNA13 | GATA1 |
| GATA2 | HRAS | IDH1 | IDH2 | ID3 |
| IL7R | JAK1 | JAK2 | JAK3 | IKZF1 |
| KDM6A | KIT | KRAS | MEF2B | MLL |
| MLL2 | MPL | MYC | MYD88 | NOTCH1 |
| NOTCH2 | NPM1 | NRAS | PAX5 | PHF6 |
| PRDM1 | PTEN | PTPN11 | RAD21 | RUNX1 |
| SETBP1 | SF3B1 | SMC1A | SMC3 | SOCS1 |
| SRSF2 | STAG2 | STAT3 | SUZ12 | TCF3 |
| TET2 | TNFAIP3 | TNFRSF14 | TP53 | U2AF1 |
| WT1 | ZRSR2 |
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子和内含子区域；
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp；
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作白血病基因高通量检测试剂盒；
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者血液中提取3-5ug基因组DNA，然后利用白血病常见基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，进而分析，找出与肺癌相关基因的所有突变信息，从而得到患者肺癌的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)、基因融合和大片段扩增缺失分析流程；
所述单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核苷酸多态性(SNP)的信息；
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核苷酸；
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；
所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k-H 50-w 10-E 0.6-a 8-M 10-m 10-d 100-A 50)；
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变)；
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；
所述大片段扩增确和缺失分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。
所述基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到基因融合结果。
本发明的一种白血病驱动基因的检测方法的有益效果如下:
本发明的一种白血病驱动基因的检测方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序，因此，样品DNA的部分降解对最后的结果几乎不会产生影响，而过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，其灵敏度相对于其他方法要高出许多。本方法以患者血液基因组DNA为样本，采取高深度测序的方法(1000X)检测其驱动基因的突变情况。相比于临床上传统的病理学诊断而言，本方法有以下优势:
1、无创检测：本方法只需抽取患者血液(2ml)既可完成整个的诊断流程，而不需要取个体患处的组织或细胞。
2、预测性强：临床诊断通常只能在患者身体己经出现病理改变(出现肿块，蛋白改变)时做出诊断，因此，临床上肿瘤患者的发现，特别是恶性肿瘤，往往发现时病人己经处于中晚期。而基因诊断不仅可以对己患病的个体进行准确的诊断。
3、采取高深度测序，平均要达到1000X，保证低频突变能够检测出，能检测每个位点1％以上的基因突变。准确度高；本方法的提供的白血病驱动基因捕获试剂盒覆盖了目前最新的白血病高频突变基因的所有外显子区域。
具体实施方式
本发明的一种白血病驱动基因的检测方法，包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、超声片段化：起始量为3ug，加无核酶的水到100ul稀释到30ng/ul。采用SCIENTZ08-Ⅲ杯式超声波细胞粉碎机进行超声片段化，设定参数为：功率70％，打断3s，停止1s，循环30-60min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取180ul磁珠加入超声打断后的PCR产物中，抽打混匀，温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上，静置5min，去上清，保持PCR管在磁力架上，加入80％乙醇(新配)200ul漂洗，静置30s后去上清，80％乙醇漂洗两遍，室温干燥10min(还有2min时用小抢头吸残液)，直至无乙醇残留。
(4)将PCR管从磁力架上取出，加入65ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清60ul于新的PCR管中。
(5)将40ul Endprep mix加入(4)中60ul上清的PCR管中，吹打混匀，短暂离心，进行末端修复，反应条件为30℃、30min。
(4)、将PCR管从磁力架中取出，加入20ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中，再在PCR管中加入12.5ul dA-Tailing(解冻后放4℃，离心后再使用)，吹打混匀。进行末端加尾，反应条件为37℃30min,70℃5min,4℃5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix和adapter各2.5ul，吹打混匀，短暂离心，放入PCR仪中，反应条件为30℃10min，20℃20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水，再加入50ul磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，放入磁力架上，静置5min，澄清后去上清，保持PCR管在磁力架上，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出，加入25ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀，在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplification mix 2，吹打混匀，短暂离心，进行PCR扩增，反应条件为
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取50ul加入PCR扩增产物中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng，根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1DNA，2.5ul的SS DNA，2ul的P5(500um)，2ul的P7-x(500um)，短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30min，直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水，轻弹混匀，水化10min，短暂离心，取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件为
第一步95℃ 5min
第二步65℃ 5min
第三步65℃ 无限
在95℃结束后，将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合(每个样品所取量)，在65℃2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中，在65℃5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液，加入时吹打混匀，2.5min后加入10ul(每个样品所取量)杂交液，加入后吹打混匀，65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠，取Dnabeads磁珠震荡混匀，根据样品数取磁珠(每个样品取30ul磁珠)，用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中，每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中，震荡45min(每隔5min上下颠倒混匀)，45min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液1于上步磁珠中，洗15min，每5min颠倒混匀一次，15min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液2提前放入70℃PCR仪预热，加165ul的洗液2于上步磁珠中，颠倒混匀，在70℃洗10min，10min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清，洗液2洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22ul的超纯灭菌水，3ul的primer和25ul的Amplification mix2，颠倒混匀，进行PCR扩增，扩增程序为
第二----四步扩增15cycle。
(7)、将上步八连排放在磁力架上，待溶液澄清后，吸上清进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中，吸取50ul磁珠加入PCR单管中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序，得到测序的数据。
4.SNP分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核苷酸多态性(SNP)的信息；
(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核苷酸；
(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测；
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸；
5.InDel分析流程
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k-H 50-w 10-E 0.6-a 8-M 10-m 10-d 100-A50)；
(3)利用CCDS、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸括入/氨基酸缺失/移码突变)；
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels；
6.大片段扩增缺失分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用ONCOCNV6.4统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图。
7.基因融合分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到基因融合结果。
上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围。
Claims (2)
1.一种用于白血病基因突变和基因融合的高通量测序检测方法，包括白血病高频突变基因和融合基因高通量测序检测方法；
白血病高频突变基因和融合基因高通量测序的方法包括如下步骤：
(1)根据人类基因组HG19，调取白血病高频突变基因和融合基因的外显子和内含子序列；
常见白血病基因列表如下：
调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子和内含子区域;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作白血病驱动基因捕获试剂盒;
所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:
从病人血液中提取1-3ug DNA ，然后利用白血病常见驱动基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，进而分析，找出与白血病相关驱动基因的所有突变信息，从而得到患者白血病的变异情况，以达到准确基因诊断的目的。
2.根据权利要求1所述的一种白血病驱动基因的检测方法，其特征在于：采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程、大片段扩增确实分析流程和基因融合分析流程;
所述单核苷酸多态性分析过程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸;
(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测;
(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸，同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的
单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸;
所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的InDel作为候选的InDels，在候选的InDels中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的InDel，最后筛选出疾病相关的候选InDels;
所述大片段扩增确实分析流程包括如下步骤:
(1)测序仪获取原始短序列;
(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;
(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;
(4)统计目标区域覆盖大小，然后根据每个目标区域位点的位置信息为横坐标，每个位置相应的覆盖度为纵坐标作图，得出扩增和缺失的分析图，所述括入缺失标记分析过程包括如下步骤：
(1)把去除接头序列和低质量的测序数据比对到人类基因组上;
(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;
(3)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对InDel进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能;
(4)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的基因融合作为候选的融合基因，在候选的融合基因中去除掉在dbSNP、其他外显子测序项目中出现的融合基因，最后筛选出疾病相关的候选融合基因；
所述基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 550)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测多个基因基因的全部或一部分的编码区首尾相连，包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到基因融合结果。
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