CN102586229A - 一种捕获探针的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物样品的制备与处理，提供了一种捕获探针的制备方法及其应用。所述捕获探针的制备方法包括以下步骤：A.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；B.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。本发明所述方法利用DNA克隆载体带入与待捕获核酸片段互补或部分互补的片段制备捕获探针，实现数量和位置确定的生物素标记，降低生产成本，适用范围广，使得制备的捕获探针能够应用于任意目标区域而不仅仅是外显子区域核酸片段的捕获。

Description

一种捕获探针的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物样品的制备与处理，更具体地说，涉及一种捕获探针的制备方法及其应用。

背景技术

后基因组时代，对特定片段的序列和功能的了解的需求日益迫切。现有技术中，对于核酸片段的获取，主要通过微阵列技术捕获核酸片段，其基本原理如下：在微阵列芯片上合成用于捕获核酸片段的DNA捕获探针，或是将DNA转变成RNA制备成捕获探针，然后将捕获探针与片段化之后得到的源核酸片段孵育结合，捕获目标核酸片段。该技术中，捕获探针的生物素标记是由带生物素标记的碱基带入，生物素标记的数量和位置是未知不确定的；而且该微阵列技术所用的DNA捕获探针直接在芯片上合成，生产成本高；此外，由于捕获探针的设计只针对不连续的外显子区域，因此只能捕获外显子区域核酸片段，适用的范围窄，对于外显子区域以外的核酸片段无法捕获。

因此，迫切需要一种新的捕获探针的制备方法，能够对捕获探针所带的生物素标记的数量和位置进行控制，能够降低生产成本，同时适用范围广，制得的捕获探针可以针对任意目标区域而不仅仅是外显子区域的核酸片段进行捕获。

发明内容

本发明的目的在于提供一种捕获探针的制备方法，同时提供该捕获探针在捕获核酸片段以及测序中的应用方法，旨在解决现有技术中捕获探针的生物素标记数量和位置不确定，生产成本高以及适用范围窄的问题。

为了实现发明目的，所述捕获探针的制备方法包括以下步骤：

A.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；

B.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。

其中，所述步骤A中DNA克隆载体，当其数量大于等于2时，则DNA克隆载体所包含的各插入片段之间叠加后能形成完整的待捕获核酸片段。

优选的，所述步骤B利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物制备捕获探针，包括以下步骤：

B1.片段化处理DNA克隆载体，得到DNA克隆载体片段；

B2.在DNA克隆载体片段两端接上接头，得到带接头的DNA克隆载体片段；

B3.利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物对带接头的DNA克隆载体片段进行扩增，得到扩增产物；

B4.分离提纯扩增产物，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

优选的，所述步骤B利用生物素化标记数量和位置确定的接头元件制备捕获探针，包括以下步骤：

B1’.通过DNA克隆载体培养增殖，得到足量的DNA克隆载体群；

B2’.片段化处理DNA克隆载体群，得到DNA克隆载体片段；

B3’.在DNA克隆载体片段两端接上生物素标记数量和位置确定的接头元件，得到带生物素标记接头的DNA克隆载体片段；

B4’.分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

其中，上述两种优选实现方式中，所述DNA克隆载体片段的大小优选在100-1000bp之间。

优选的，所述分离提纯扩增产物或分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，通过表面带有链霉亲和素或亲和素修饰的微珠实现。

更优选的，所述微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。

其中，若上述步骤A中的DNA克隆载体数量大于等于2时，则插入片段相互之间叠加能形成完整的待捕获核酸片段。

为了更好的实现发明目的，所述一种基于上述方法制备的捕获探针进行核酸片段捕获的方法包括以下步骤：

M1.片段化处理源核酸得到源核酸片段库；

M2.利用基于上述方法制备的捕获探针与源核酸片段库混合杂交，捕获目标核酸片段。

其中，所述步骤M1中源核酸片段大小在100-1000bp之间。

优选的，所述步骤M1还包括对得到的源核酸片段库进行扩增的步骤。

优选的，所述步骤M2之后还包括步骤：

M3.变性解离捕获的目标核酸片段，形成片段文库。

为了进一步阐述本发明的意义，本发明还提供一种利用上述方法所捕获的核酸片段进行基因测序的方法，所述方法包括以下步骤：

P1.利用上述方法所捕获的核酸片段形成的片段文库中加入引物进行扩增，得到捕获片段扩增产物；

P2.分离提纯捕获片段扩增产物，形成测序文库；

P3.利用测序文库进行测序，得到所捕获核酸片段的基因序列。

其中，所述步骤P1中的引物是带生物素标记的扩增引物。

优选的，所述步骤P2中，采用链霉亲和素或亲和素修饰的微珠进行分离提纯。

由上述可知，本发明所述捕获探针的制备及其应用方法，在制备过程中利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件进行捕获探针上生物素标记的控制，提高生物素标记的效率，降低生产成本；利用DNA克隆载体带入与待捕获核酸片段互补或部分互补的片段进行捕获探针的制备，进一步降低生产成本；此外，通过连续且相邻之间有重叠部分的插入片段设计，适用范围广，使得制备的捕获探针能实现对任意目标区域而不仅仅是外显子区域的核酸片段的捕获。

附图说明

图1是本发明一个实施例中捕获探针的制备方法流程图；

图2是本发明一个具体实施例中以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物制备捕获探针的方法流程图；

图3是本发明另一个具体实施例中以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的接头元件制备捕获探针的方法流程图；

图4是本发明一个实施例中基于图1所示方法制备的捕获探针进行核酸片段捕获的方法流程图；

图5是本发明一个实施例中基于图4所示方法所捕获的核酸片段进行基因测序的方法流程图；

图6是本发明利用BAC DNA克隆载体制备捕获探针用以捕获核酸片段并制备成测序文库进行基因测序的方法示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明提供了一种捕获探针的制备方法，包括以下步骤：首先根据标准核酸序列库中待捕获核酸片段的核酸序列信息，将其分成连续且相邻之间有重叠部分的片段，长度为10～300kb，其长度可视选用的DNA克隆载体而定，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体。若DNA克隆载体多于一个，则其内的各插入片段相互叠加能形成完整的待捕获核酸片段。然后以得到的DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。该制备方法的优点在于：在捕获探针制备过程中利用生物素化数量和位置都确定的扩增引物或接头元件进行数量和位置确定的生物素标记，可以提高捕获探针生物素标记的效率，降低生产成本，便于后续的应用；通过DNA克隆载体引入与待捕获核酸片段互补或部分互补的片段进行捕获探针的制备，进一步降低生产成本；通过相互叠加能形成完整的待捕获核酸片段的插入片段设计，适用范围广，使得制备的捕获探针能实现对目标区域而不仅仅是外显子区域的核酸片段的捕获。

图1示出了本发明一个实施例中制备捕获探针的方法流程，该方法包括：

S101.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；

S102.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。

需要说明的是：

步骤S101中，根据待捕获核酸片段，从标准序列库中找到与之对应匹配的核酸序列信息，并根据找到的核酸序列信息，将其分成连续且相邻之间有重叠部分的片段，长度为10～300kb，其长度可视选用的DNA克隆载体而定，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体。

所述DNA克隆载体，是指能容纳外源DNA作为插入片段的克隆载体，较为常见的，包括但不限于细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)、酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome，YAC)、P1派生人工染色体(P1Derived Artificial Chromosome，PAC)和哺乳动物人工染色体(Mammal Artificial Chromosome，MAC)。作为插入片段的外源DNA，优选20kb～300kb的DNA片段。

本发明中，若待捕获核酸片段大小在单个DNA克隆载体能够克隆的范围之内，则只需1个DNA克隆载体即可；若待捕获核酸片段大小超出单个DNA克隆载体的克隆能力范围，则需要多个DNA克隆载体。DNA克隆载体的插入片段与待捕获核酸片段之间是互补结合关系，存在多个DNA克隆载体时，其内的插入片段是连续且相邻之间有重叠部分，叠加后能形成完整的待捕获核酸片段。

DNA克隆载体的获取，可以通过相应的载体构建公司购买，也可以自行构建。构建载体的技术，是现有技术中常见而且十分成熟的，主要利用如下步骤进行DNA克隆载体的构建：(1)将已知的与待捕获核酸片段相匹配的标准序列裂解成10～300kb的DNA片段，并将其插入到克隆空载体中，得到DNA克隆载体；(2)利用末端测序或Southern blot方法对DNA克隆载体进行筛选，得到含有目的片段的DNA克隆载体。

步骤S102开始之前，若DNA克隆载体量少，不足以支持后续的操作时，可对其进行增殖以获取足够的载体量。

步骤S102利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件，通过一系列操作将DNA克隆载体中的插入片段制备成特定位置带特定数量的生物素标记的捕获探针。其中，生物素标记数量和位置确定，主要是指在设计与合成扩增引物和接头元件的时候，根据不同的需要，在扩增引物和接头元件的不同位置标记上不同的生物素数量，然后这些扩增引物会在后续的扩增反应中完成对捕获探针生物素数量和位置的控制，而接头元件则可以通过与DNA克隆载体片段连接的过程中实现对捕获探针生物素数量和位置的控制。

对于图1所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S101的一个实施例中，步骤S101具体实施如下：

在本步骤的一个实施方式中，利用BAC DNA克隆载体，以人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)作为待捕获核酸片段。从标准序列库中找到HLA基因的核酸序列并进行片段划分，根据其序列选择并得到BAC DNA克隆载体。HLA是人类的主要组织相容性复合体，位于人类第6号染色体短臂上6p21.3，全长为4000Kb。以每个BAC DNA克隆载体容纳150Kb的插入片段进行计算，因此可选择采用数量≥27的BAC DNA克隆载体，本实施例中采用28个BAC DNA克隆载体用于制备捕获探针，进行HLA核酸片段的捕获。对于确定的BAC DNA克隆载体，通过载体构建公司订购获取。

在本步骤的另一个实施方式中，利用YAC DNA克隆载体，以DMD基因(X连锁隐性遗传病基因)作为待捕获核酸片段。从标准序列库中找到DMD基因的核酸序列并进行片段划分，根据其序列选择并确定BAC DNA克隆载体。DMD基因位于人类X染色体短臂Xp21上，全长为2500kb。以每个YAC DNA克隆载体容纳250Kb的插入片段进行计算，采用11个YAC DNA克隆载体用于制备捕获探针，进行DMD基因的捕获。对于确定之后的YAC DNA克隆载体，为了节省时间，可直接由载体构建公司订购获得。

在本步骤的另一个实施方式中，利用PAC DNA克隆载体，对乳腺癌易感基因中的BRCA1基因进行捕获。首先从标准核酸序列库中找到BRCA1基因的核酸序列信息，然后根据其序列信息确定PAC DNA克隆载体。BRCA1基因位于人类17号染色体长臂17q21上，基因全长约为100Kb。根据PAC DNA克隆载体的容纳能力，直接采用1个PAC DNA克隆载体制备成捕获探针即可对BRCA1基因进行捕获。

以上实施方式的有益效果是：通过不同种类以及不同数量的DNA克隆载体对待捕获核酸片段进行直接覆盖，制备成捕获探针，从而可以获取待捕获核酸的全长片段；通过DNA克隆载体的形式引入插入片段作为后续待捕获核酸片段的捕获探针的制备原料，而不是直接合成，降低生产成本。

应当说明的是，以上实施例仅是步骤S101的其中一些实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

步骤S102中以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针，实现对捕获探针数量和位置确定的生物素标记，可以采用多种方法实现，既利于实际应用中的操作，又通过对数量和位置的控制实现成本的降低和标记效率的提高。以下将结合附图以及具体实施例进行详细说明。

图2给出了步骤S102以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备成捕获探针的一种方法流程，该方法包括：

S1021.片段化处理DNA克隆载体，得到DNA克隆载体片段；

S1022.在DNA克隆载体片段两端接上接头，得到带接头的DNA克隆载体片段；

S1023.利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物对带接头的DNA克隆载体片段进行扩增，得到扩增产物；

S1024.分离提纯扩增产物，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

本方法的优点在于：利用特定位置带有特定数量生物素标记的扩增引物实现对捕获探针进行标记数量及位置的可控生物素标记，实现对生产过程的控制，提高生物素标记效率，降低生产成本；同时还可以对接上接头之后的DNA克隆载体片段进行扩增，实现捕获探针数量增加的目的。

需要说明的是：

步骤S1021开始之前，对DNA克隆载体进行培养增殖，以便达到后续扩增反应所需的模板链需求。

步骤S1021中，对于DNA克隆载体进行片段化处理的方法包括但不限于雾化、超声破碎、机械剪切破碎、酶切片段化、化学以及热诱导片段化。

在DNA克隆载体片段化之后，根据捕获的需要进行片段的分离纯化，本发明所需的DNA克隆载体片段大小优选为100-1000bp。此外为了便于接头的连接，需要对分离纯化得到的片段进行磷酸化以及末端补平修饰。

步骤S1023中，带生物素标记的扩增引物是指在设计合成的时候，根据不同的需要对带生物素标记的碱基位置和数量进行控制，且扩增引物的序列与步S1022中的接头序列互补或部分互补。通过对扩增引物上的生物素标记的数量和位置进行控制，从而在后续的扩增反应中将这种控制传递到捕获探针上，实现对捕获探针的生物素标记数量和位置的控制。

步骤S1024中，利用带生物素标记扩增引物进行扩增能够得到带生物素标记的扩增产物这一特性，采用表面带有链霉亲和素或亲和素修饰的微珠分离提纯产物。

进一步的，所述微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。

进一步的，分离纯化步骤之后需要进行变性解离形成单链的操作。

对于图2所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S1021的一个实施例中，步骤S1021具体实施如下：

培养28个BAC DNA克隆载体进行增殖，使得载体中所含的插入片段达到能够进行一般扩增反应所需模板的数量。

采用超声破碎的方法对BAC DNA克隆载体进行片段化处理，操作条件为430-440W功率，超声破碎5～10s，重复40次。破碎后得到的片段混合物利用1％琼脂糖凝胶进行分离纯化，切胶回收100-1000bp大小的片段，为保证回收产物的纯度，利用纯化柱对回收产物再次纯化回收得到BAC DNA片段。

为了便于后续的接头连接，对BAC DNA片段进行磷酸化和末端补平修饰，本实施例中具体操作如下：BAC DNA片段溶液，20μL；10mM dNTP，1.5μL；T4DNA聚合酶(5U/μL)，1μL；Klenow DNA聚合酶(10U/μL)，0.1μL；T4多核苷酸激酶(10U/μL)，0.5μL；10mM ATP，1.5μL；T4DNA连接缓冲液，10μL；加ddH₂O至100μL，25℃孵育45min，反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。

应当说明的是，本实施例仅是步骤S1021中的其中一种实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1022的一个实施例中，步骤S1022具体实施如下：

经补平修饰后的BAC DNA片段进行接头连接反应，连接体系为：补平后的BAC DNA片段溶液，50μL；接头溶液，5μL；T4DNA连接酶(5U/μL)，10μL；10×T4DNA连接酶buffer，20μL；4×PEG6000(m/V，30％)，50μL；10mM ATP，25μL；加ddH₂O至200μL，16℃连接过夜，连接产物以回收试剂盒纯化回收，得到带接头的BAC DNA片段。

应当说明的是，本实施例仅是步骤S1022中的其中一种实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1023的一个实施例中，步骤S1023具体实施如下：

在本步骤的一个实施方式中，为了便于标记和分离提纯，设计并合成5’末端带双生物素标记的扩增引物，利用该扩增引物对带接头的BAC DNA片段进行扩增，该扩增引物与接头序列完全互补。该实施方式的优点在于直接在5’末端进行双生物素标记，标记数量和位置容易控制，简单易得，也便于后续应用中分离提纯时减少空间位阻效应。

在本步骤的另一个实施方式中，为了实现结合的牢固稳定，设计并合成序列中间位置碱基带双生物素标记的扩增引物，利用该扩增引物对带接头的BAC DNA片段进行扩增，该扩增引物与接头序列完全互补。该实施方式的优点在于生物素化标记位置在扩增引物序列中间，能够使得后续分离提纯操作时结合更加稳定牢固。

在本步骤的一个实施方式中，为了兼顾成本和结合的稳定程度，设计并合成距5’末端差3的位置处碱基带单生物素标记的扩增引物，利用该扩增引物对带接头的BAC DNA片段进行扩增，该扩增引物与接头序列部分互补。该实施方式的优点在于可以减少扩增引物的碱基个数，又不影响与接头的结合稳定程度。

扩增引物结合到接头上之后，可以应用现有技术中一般的液相扩增如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)或固液两相扩增方法对其进行扩增。为保证扩增产物的单一性和纯度，优选使用可以实现单分子扩增的固液两相扩增方法，如微乳液PCR(emulsion PCR，ePCR)以及桥式PCR等。在本步骤的一个实施方式中，采用典型的ePCR扩增方法，先将一端的扩增引物固定于磁珠上，另一端引物位于水相溶液中，然后水相与油相混合制备成乳浊液体系，实现扩增反应在相互隔离的封闭小液滴中进行单分子扩增。上述ePCR具体步骤可参考文献：BEAMing：single-molecule PCR onmicroparticles in water-in-oil emulsions，Frank Diehl，Meng Li，Yiping He，naturemethods，Vol.3，No.7，July 2006。

在本步骤的另一个实施方式中，采用一般的PCR扩增反应，准备过程简单，扩增体系为：4μL带接头的BAC DNA片段；上、下游两端所述扩增引物各1μL；10mM dNTPs，2μL；Taq酶(5U/μL)，1μL；10×buffer，10μL；加ddH₂O至100μL。扩增反应按照如下程序进行：

95℃5min；

95℃30s，55℃30s，72℃30s，15cycles；

72℃5min。

扩增产物利用试剂盒纯化回收，TE重悬。

应当说明的是，以上所述仅是步骤S1023中的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1024的一个实施例中，步骤S1024具体实施如下：

在本步骤的一个实施方式中，根据之前扩增反应中带有生物素标记的扩增引物，得到带生物素标记的扩增产物，因此利用表面带有链霉亲和素修饰的磁珠对扩增产物进行分离纯化。以磁铁吸附磁珠，然后用TE缓冲液轻微冲洗数遍，得到纯化的扩增产物。扩增产物分离纯化后，利用0.1M的NaOH清洗3次，使其解旋形成单链，洗脱缓冲液清洗3次，然后TE重悬保存。

在本步骤的另一实施方式中，扩增产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，然后切割所需范围内的目的条带纯化回收，再利用纯化柱对回收产物再次纯化回收得到BAC DNA片段，也可实现扩增产物的分离纯化。

应当说明的是，以上实施方式仅是步骤S1024中的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

图3示出了图1步骤S102以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针的另一种方法流程，该方法包括：

S1021’.通过DNA克隆载体培养增殖，得到足量的DNA克隆载体群；

S1022’.片段化处理DNA克隆载体群，得到DNA克隆载体片段；

S1023’.在DNA克隆载体片段两端接上生物素标记数量和位置确定的接头元件，得到带生物素标记接头的DNA克隆载体片段；

S1024’.分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

本方法的优点在于：利用特定位置带有特定数量生物素标记的接头元件，直接得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针，提高生物素化标记效率，简化标记步骤，降低生产成本；直接通过培养DNA克隆载体增殖得到足量的插入片段，制备足量的捕获探针，不需要再经过扩增步骤，更不需要通过在芯片上合成的方式制备捕获探针，进一步降低生产成本。

对此方法需要说明的是：

步骤S1021’中，直接利用DNA克隆载体进行培养增殖，是指利用人工染色体的特性，直接进行克隆载体的培养筛选，得到足量的克隆载体群，从而可以不用进行扩增就可以得到足量的捕获探针制备材料。

步骤S1022’中，对于DNA克隆载体群的片段化处理方法包括但不限于雾化、超声破碎、机械剪切破碎、酶切片段化、化学以及热诱导片段化。

在DNA克隆载体片段化之后，根据捕获的需要进行片段的分离纯化，本发明所需的DNA克隆载体片段大小优选为100-1000bp。此外为了便于接头的连接，需要对分离纯化得到的片段进行磷酸化以及末端补平修饰。

步骤S1023’中，根据不同的目的，在设计合成接头元件时对生物素化标记的位置以及数量进行控制，然后通过在DNA克隆片段两端接上接头元件时将这种控制传递到捕获探针，从而在制备过程中实现对捕获探针的可控生物素标记。

所述接头元件包括但不限于常见的平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头、分叉接头。

其中，所述平末端接头是双链完全互补的核酸分子。

其中，所述突出末端接头是双链核酸分子，双链核酸分子的一个末端为平末端，另一末端为突出末端。突出末端的碱基数无具体限制，优选为1到10个碱基之间。

所述带茎环结构的接头是单链核酸分子，包括茎环区域和互补配对区域。

所述分叉接头是双链核酸分子，包括互补区和分叉区。

步骤S1024’中，针对带有生物素标记的接头元件，通过表面带有链霉亲和素或亲和素修饰的微珠直接对接头连接产物进行分离纯化。

进一步的，所述的微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。

更进一步的，纯化的产物进行变性解离形成单链捕获探针。

对于图3所示本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S1021’的一个实施例中，步骤S1021’具体实施如下：

利用LB液体培养基对订购回来的BAC DNA克隆载体进行分别培养，得到足量的BAC DNA克隆载体群，回收提纯BAC DNA。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S1021’中的一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1022’的一个实施例中，步骤S1022’具体实施如下：

采用超声破碎的方法对BAC DNA进行片段化处理，操作条件为430-440W功率，超声破碎5～10s，重复50次。破碎后得到的片段混合物利用1％琼脂糖凝胶进行分离纯化，切胶回收100-1000bp大小的片段，为保证回收产物的纯度，利用纯化柱对回收产物再次纯化回收得到BAC DNA片段。

为了便于后续的接头连接，对BAC DNA片段进行磷酸化和末端补平修饰，本实施例中具体操作如下：BAC DNA片段溶液，20μL；10mM dNTP，1.5μL；T4DNA聚合酶(5U/μL)，1μL；Klenow DNA聚合酶(10U/μL)，0.1μL；T4多核苷酸激酶(10U/μL)0.5μL；10mM ATP，1.5μL；T4 DNA连接缓冲液，10μL；加ddH₂O至100μL，25℃孵育1h，反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S1022’中的一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1023’的一个实施例中，步骤S1023’具体实施如下：

在本步骤的一个实施方式中，为了简便易行，减少空间位阻效应，设计并合成了5’末端带双生物素标记的平末端接头，然后利用该平末端接头与经过补平修饰的BAC DNA片段进行连接，从而实现制备过程中控制捕获探针的生物素标记。本实施方式的优点在于直接在平末端接头5’末端带上双生物素标记，简便易行，还能减少后续操作中的空间位阻效应。

在本步骤的另一个实施方式中，为了使生物素标记与相应物质的结合稳定，且避免接头自连现象的发生，设计并合成了互补区中间位置碱基带双生物素标记的分叉接头，利用该接头与经过补平修饰的BAC DNA片段两端连接，实现制备过程中捕获探针生物素标记的控制。该实施方式的优点在于接头元件中间位置进行双生物素化标记，可以使后续的分离纯化中与微珠的结合更加稳定；同时分叉接头还能防止在连接反应中出现接头自连的现象。

上述接头元件与BAC DNA片段两端的连接体系为：补平后的BAC DNA片段溶液，50μL；所述生物素标记数量和位置确定的接头溶液，5μL；T4 DNA连接酶(5U/μL)，10μL；10×T4 DNA连接酶buffer，20μL；4×PEG6000(m/V，30％)，50μL；10mM ATP，25μL；加ddH₂O至200μL，16℃连接24h，连接产物以回收试剂盒纯化回收，得到带生物素标记接头的BAC DNA片段。

应当说明的是，上述实施方案仅是步骤S1023’中的其中一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S1024’的一个实施例中，步骤S1024’具体实现如下：

利用表面带有链霉亲和修饰的磁珠对带有生物素标记接头的BAC DNA克隆片段进行分离纯化，利用磁铁吸附磁珠，然后TE缓冲液进行轻微冲洗数遍，最后TE重悬。

分离纯化的产物再利用0.1M的NaOH过洗数次，使得连在磁珠上的双链BAC DNA片段变性解离成单链，洗脱缓冲液清洗2次，TE重悬，形成最终的特定位置带有特定数量生物素标记的捕获探针。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S1024’中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

图4示出了本发明一个实施例中基于图1所示方法制备的捕获探针进行核酸片段捕获的方法流程，该方法包括：

S201.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；

S202.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。

S203.片段化处理源核酸得到源核酸片段库；

S204.将已制备好的捕获探针与源核酸片段库混合杂交，捕获待捕获核酸片段。

本发明的优点在于：利用基于图1所示方法制备的捕获探针进行核酸片段的捕获，既在捕获探针的制备过程中进行特定位置带特定数量的生物素标记控制，提高生物素标记的效率，又可以通过DNA克隆载体引入捕获探针的制备降低生产成本，还可以实现对任意目标区域而不仅仅是外显子区域的核酸片段的捕获。

需要说明的是：

步骤S201与步骤S202按照之前图示所述步骤进行，在此不再赘述。

步骤S203中，所述源核酸可以是任意来源的核酸，包括但不限于基因组DNA、RNA、核酸大片段、线粒体DNA或质粒DNA。片段化的方法根据所需要的片段大小选取常用方法中的任意一种，包括但不限于雾化、超声破碎、机械剪切破碎、酶切片段化、化学以及热诱导片段化。

在所述源核酸片段化处理之后，还包括对源核酸片段进行分离纯化。根据测序的片段长度需要，对于片段化得到的DNA片段，需要进行目的DNA片段的分离纯化，本发明所需要的片段大小优选在100-1000bp之间。片段分离方法可采用凝胶方法、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等常用方法。

分离提纯源核酸片段之后，为了得到更多拷贝数量的源核酸片段，可以对分离提纯产物进一步进行扩增。

步骤S204中，利用已制备的捕获探针捕获目标核酸片段后，为了便于后续的进一步应用，还可以对捕获的待捕获核酸片段进行变性解离，形成单链核酸片段文库。

对于图4所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

以HLA作为待捕获核酸片段为例，利用BAC DNA克隆载体制备数量和位置确定的生物素化标记捕获探针。步骤S201和步骤S202可以通过多种方式实现，其中一些具体实施方式和操作已在前面图示中进行过详细描述，在此不再进行赘述。

在步骤S203的一个实施例中，步骤S201具体实施如下：

源核酸选用包含有HLA整体的大片段DNA，通过Sau3AI/HinfI又双酶切的方法进行片段化处理，酶切体系为：

大片段DNA         5μg；

Sau3AI/HinfI    各100U；

10×enzyme buffer  20μL；

加ddH₂O至200μL，37℃酶切2h。

得到的酶切片段混合物利用1％琼脂糖凝胶进行分离纯化，选择100-1000bp大小的片段切胶回收，得到所需要的源核酸片段。

本实施例使用双酶切体系，能够保证随即酶切得到的片段长度更加均匀。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S203中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S204中的一个实施例中，步骤S204具体操作如下：

40μL源核酸片段库溶液95℃加热1min，然后置于冰中迅速冷却，加入到50μL捕获探针溶液中，再加入2μL Salmon sperm DNA，加ddH₂O至100μL，65℃杂交36～72h；反应结束后，先用含有0.1％SDS的1×柠檬酸钠缓冲液(salt-sodiumcitrate，SSC)在15～25℃条件下清洗杂交产物15min；然后继续用含有0.1％SDS的1×SSC在65℃条件下，清洗杂交产物15min，重复3次。

捕获目标核酸片段后，还包括对其进行解离释放的步骤，具体为：向杂交产物中加入20μL 0.1M的NaOH，15～25℃作用10min，然后去除连接有捕获探针的微珠，再向液体中加入1.2μL 20％的乙酸保存所捕获的源核酸片段库。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S204中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

图5示出了本发明一种基于图4所示方法捕获的核酸片段进行基因测序的方法流程，该方法包括：

S301.在捕获核酸片段形成的片段文库中加入引物进行扩增，得到捕获片段扩增产物；

S302.分离提纯捕获片段扩增产物，形成测序文库；

S303.利用测序文库进行测序，得到所捕获核酸片段的基因序列。

本发明所述技术方案的优点在于：利用DNA克隆载体制备成的带生物素化标记的捕获探针捕获得到的目标核酸片段扩增形成测序文库，可以实现对特定核酸片段的序列进行分析，实现对其功能的解析。

对上述技术方案需要说明的是：

步骤S301中加入的引物，可以是普通的扩增引物，优选为带生物素标记的扩增引物。

进一步的，所述扩增可以是液相扩增，如普通的PCR；也可以是固液两相扩增，如ePCR。

步骤S302中，所述分离提纯，根据加入的扩增引物为带生物素标记的扩增引物，优选利用表面带有链霉亲和素修饰的微珠进行分离纯化。

步骤S303中，所述测序是指利用碱基互补原则，对待测序文库进行序列检测，从而得到所捕获片段的基因序列。所用测序方法包括但不限于常见的Sanger测序法、454焦磷酸测序法、ABI的Solid测序法、Illumina的Solexa测序法或Pstar系列的连接测序法和配对末端测序法。

对于图5所示的本发明的技术方案，下面将给出具体实施例加以详细阐述。

在步骤S301的一个实施例中，步骤S301具体实现如下：

在捕获核酸片段形成的BAC DNA片段文库中加入带生物素标记的引物，扩增的PCR反应体系为：片段文库溶液40μL、10×buffer 30μL、10mM dNTP3μL、上下游两端引物各3μL、Taq酶3μL(5U/μL)，ddH₂O加至300μL。扩增反应程序为：

94℃2min；

94℃10s，57℃10s，72℃20s，15cycles；

72℃5min。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S301中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S302的一个实施例中，步骤S302具体实施如下：

利用表面带有链霉亲和修饰的磁珠对带生物素标记扩增产物进行分离纯化，利用磁铁吸附磁珠，然后TE缓冲液进行轻微冲洗数遍，最后TE重悬。

分离纯化的带生物素标记扩增产物再经过0.1M的NaOH数次过洗，使得连在磁珠上的双链带生物素标记扩增产物变性解离成单链，洗脱缓冲液清洗2次，TE重悬形成测序文库。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S302中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

在步骤S303的一个实施例中，步骤S303具体实施如下：

利用Pstar测序系统，对测序文库进行测序，具体操作包括：

点样：将测序文库中的待测样品与测序buffer混合，在制备好并放置于容器内的固相载体上进行点样。

固定样品：利用锡箔纸将放有已经点好样的固相载体的容器包住避光，室温下固定16h。

上样测序：固定结束之后的固相载体，用TE溶液洗涤，并用ddH₂O进行过洗。将洗涤过的固相载体装入测序小室中，进行基因测序，收集荧光信号。

应当说明的是，本实施方案仅是步骤S303中的其中一个具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

图6示出了本发明利用BAC DNA克隆载体制备捕获探针用以捕获核酸片段并制备成测序文库进行基因测序的方法示意图。该图直观的展示了利用BAC DNA克隆载体制备捕获探针用以捕获核酸片段并制备成测序文库进行基因测序的过程：

步骤1.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的BAC DNA克隆载体。根据待捕获的目标核酸HLA片段，采用28个BAC DNA克隆载体，该28个BAC DNA克隆载体的插入片段彼此之间有重叠区域，叠加之后能形成完整的待捕获核酸HLA片段。通过载体构建公司直接获取该28个BAC DNA克隆载体。

步骤2.以BAC DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。利用超声破碎的方式对BAC DNA克隆载体进行片段化处理，1％凝胶分离纯化大小在100-1000bp之间的BAC DNA片段，然后进行磷酸化和末端补平修饰。修饰后的BAC DNA片段两端接上接头一，并加入生物素标记数量和位置确定的扩增引物进行扩增，利用磁珠对扩增产物进行分离提纯。纯化产物以NaOH进行变性解离形成单链，得到带生物素标记的捕获探针。

步骤3.片段化处理包含有HLA在内的大片段DNA，得到的片段接上接头二进行扩增形成待捕获的DNA片段文库。利用Sau3AI和HinfI对大片段DNA进行双酶切处理，凝胶分离纯化大小在100-1000bp之间的DNA片段。提取的DNA片段经过磷酸化和末端补平修饰后，接上接头，并加入扩增引物进行扩增得到待捕获的DNA片段文库。

步骤4.将制备好的带生物素标记的捕获探针与待捕获的DNA片段文库混合杂交，捕获HLA片段。首先将待捕获的DNA片段文库95℃加热1min，然后迅速冷却，将其加入至捕获探针溶液中，加入其它杂交辅助试剂，65℃孵育杂交48h，捕获DNA片段文库中属于HLA的片段。利用磁铁对捕获产物进行分离，然后变性解离捕获得到的HLA片段。

步骤5.利用捕获得到的HLA片段制备测序文库。利用与原扩增引物序列互补的扩增引物对捕获得到的HLA片段进行再次扩增，对扩增产物进行提纯，然后接上接头三，形成测序文库。

步骤6.将测序文库中的样品进行点样固定，上样至测序仪，获取测序样品的基因序列。

应当说明的是，本发明对捕获探针制备的方法典型的应用但不限于捕获探针制备，任何其他类似的应用均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种捕获探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；

B.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。

2.根据权利要求1所述的捕获探针的制备方法，其特征在于，所述步骤B利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物制备捕获探针，包括以下步骤：

B1.片段化处理DNA克隆载体，得到DNA克隆载体片段；

B2.在DNA克隆载体片段两端接上接头，得到带接头的DNA克隆载体片段；

B3.利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物对带接头的DNA克隆载体片段进行扩增，得到扩增产物；

B4.分离提纯扩增产物，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

3.根据权利要求1所述的捕获探针的制备方法，其特征在于，所述步骤B利用生物素化标记数量和位置确定的接头元件制备捕获探针，包括以下步骤：

B1’.通过DNA克隆载体培养增殖，得到DNA克隆载体群；

B2’.片段化处理DNA克隆载体群，得到DNA克隆载体片段；

B3’.在DNA克隆载体片段两端接上生物素标记数量和位置确定的接头元件，得到带生物素标记接头的DNA克隆载体片段；

B4’.分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

4.根据权利要求2或3所述的捕获探针的制备方法，其特征在于，所述DNA克隆载体片段的大小在100-1000bp之间。

5.根据权利要求2或3所述的捕获探针的制备方法，其特征在于，所述分离提纯扩增产物或分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，是通过表面带有链霉亲和素或亲和素修饰的微珠实现的。

6.根据权利要求1所述的捕获探针的制备方法，其特征在于，若所述步骤A中的DNA克隆载体数量大于等于2时，则插入片段相互之间叠加能形成完整的待捕获核酸片段。

7.一种基于权利要求1所述方法制备的捕获探针进行核酸片段捕获的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

M1.片段化处理源核酸得到源核酸片段库；

M2.利用基于权利要求1所述方法制备的捕获探针与源核酸片段库混合杂交，捕获目标核酸片段。

8.根据权利要求7所述的核酸片段捕获的方法，其特征在于，所述步骤M1中源核酸片段大小在100-1000bp之间。

9.根据权利要求7所述的核酸片段捕获的方法，其特征在于，所述步骤M1还包括对得到的源核酸片段库进行扩增的步骤。

10.根据权利要求7所述的核酸片段捕获的方法，其特征在于，所述步骤M2之后还包括以下步骤：

M3.变性解离捕获的目标核酸片段的片段，形成片段文库。

11.一种基于权利要求7所述的方法捕获的核酸片段进行基因测序的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

P1.利用基于权利要求6所述方法所捕获的核酸片段形成的片段文库中加入引物进行扩增，得到捕获片段扩增产物；

P2.分离提纯捕获片段扩增产物，形成测序文库；

P3.利用测序文库进行测序，得到所捕获核酸片段的基因序列。

12.根据权利要求11所述的基因测序的方法，其特征在于，所述步骤P1中的引物是带生物素标记的引物。

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