KR101423032B1 - 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법 - Google Patents

핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기존 단일 타겟에 대한 압타머 개발방식을 개선된 멀티플렉스 플랫폼으로 전환시킨 멀티플렉스 마이크로 유체 장치 (SELEX lap-on-a-chip) 및 이를 고속 시퀀싱법(high throughput sequencing)과 연계한 것을 특징으로 하는 핵산 압타머의 고속 선별방법(high throughput selection mehtod)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 멀티플렉스 유체 장치는 다수개의 타겟에 대한 각 압타머를 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 멀티플렉스 기법에 비하여 처리량 및 처리시간을 크게 감축하는 장점이 있으며, 특히 본 발명에 따른 장치를 고속 시퀀싱법과 연계하여 압타머 선별공정을 수행함으로써 타겟결합/분리/증폭 공정 라운드를 대폭 감소시키고 자동화 공정의 수행을 가능하게 하는바, 매우 유용하다.

Description

핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법{Multiplex Microfluidic Device for Screening Nucleic Acid Aptamer and High Throughput Method of Screening Nucleic Acid Aptamer Using the Same}
본 발명은 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 기존 단일 타겟에 대한 압타머 개발방식을 개선된 멀티플렉스 플랫폼으로 전환시킨 멀티플렉스 마이크로 유체 장치 (SELEX lap-on-a-chip) 및 이를 고속 시퀀싱 방법(high throughput sequencing)과 연계한 것을 특징으로 하는 핵산 압타머의 고속 선별방법(high throughput selection mehtod)에 관한 것이다.
압타머는 단일 사슬 DNA 또는 RNA분자로서, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. 압타머는 검출분석 시스템에서 분자를 인식할 수 있는 바이오센서의 일 요소로 이용될 수 있어 항체의 대체물질로 인식되어 오고 있다. 특히, 압타머는 항체와 달리 독소를 비롯한 다양한 유기물 및 무기물의 표적 분자로 이용될 수 있고, 일단 특정 물질에 특이적으로 결합하는 압타머를 분리해내면 자동화된 올리고머 합성 방법으로 낮은 비용과 일관성으로 재생산이 가능한 바 경제적이었다. 이에 1996년 처음으로 형광표지된 압타머를 이용하여 표적 단백질을 측정한 압타머 기반의 바이오센서가 개발된 이후로 이와 같은 압타머의 장점과 구조적 특성을 기반으로 하여 다양한 압타머 바이오센서들이 개발되고 있다 (김연석&구만복, NICE, 26(6): 690, 2008).
이러한 압타머를 분리하기 위한 방법으로는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 공정을 사용하여 왔으나, 이는 한번에 단일 목적 분자에 대한 압타머의 분리만 가능하고, 높은 친화도를 갖는 압타머가 선별되거나 소수의 핵산이 남을 때까지 증폭/분리의 반복공정을 10회 이상 반복하여야 하며, 추가적으로 친화도 테스트를 요하므로 새로운 압타머의 개발에 많은 시간의 소요를 요하며 공정이 복잡한 단점이 있었다. 이에 좀더 간이한 공정으로 빠르게, 그리고 한번에 둘 이상의 타겟 물질에 대한 압타머를 동시에 분리해낼 수 있는 새로운 압타머 선별공정의 요청되어져왔다. 또한, 압타머 선별을 위한 자동화 공정의 도입도 요청되었다.
이에 최근 몇몇 미세 유체 기법이 보다 빠른 SELEX 공정을 위하여 도입되어, 압타머를 분리하는 데 걸리는 시간을 수개월/수주에서 며칠로 단축시키기 위한 노력이 있어왔다 (Hybarget, et al ., Anal . Bioanal . Chem ., 384:191, 2006; Windbichler, et al ., Nat . Protoc ., 1:637, 2006; Eulberg, et al ., Nucleic Acids Research, 33:e45, 2005). 그러나 이러한 방법들은 더 소형화되고 멀티플렉스된 압타머 선별공정으로는 적합하지 않았다. 이에 이와 관련하여 본 발명자는 PCT/US2009/054097호에서 멀티플렉스 기법을 도입한 미세 유체 장치를 개발하였으나, 이에 대해서도 동시에 여러 압타머의 분리가 가능하지 않고 타겟분자에 결합된 압타머의 순차적인 분리가 가능할 뿐이고, 압타머의 분리를 위한 수단이 한정되는 단점이 있었다. 이에 좀 더 공정 수행시간을 단축시키고 전체 공정을 자동화하는데 적합한 새로운 방식의 장치 및 공정의 개발이 요구되었다.
이에 본 발명자들은 효율이 개선되고 자동화가 가능한 새로운 방식의 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 압타머의 고속선별방법을 제공하고자 예의 노력한 결과, 주된 미세 결합 채널 이외에 별도의 용출 채널 또는 튜브를 채용한 미세 유체 장치 모듈을 제작한 다음, 각각의 모듈을 연결하여 수십 또는 수백개의 반응챔버에서 수십~수백개의 타겟 물질에 대한 동시다발적인 압타머 분리가 가능하고 압타머의 고속시퀀싱 또는 고속 친화성 테스트 기기와 연결되어 자동화될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다수개의 압타머를 동시에 선별할 수 있는 개선된 새로운 방식의 멀티플렉스 미세 유체 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다수개의 압타머를 기존보다 더 빠르게 선별해낼 수 있으며, 자동화가 가능한 새로운 방식의 압타머 선별방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치를 제공한다:
(a) 입구 및 출구 사이를 연결하는 결합 채널을 포함하는 기판;
(b) 상기 결합 채널 내에 형성되는 다수개의 타겟분자결합영역;
(c) 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 각각 연결되는 다수개의 용출채널; 및
(d) 밸브개폐시스템.
본 발명은 또한, 다음을 포함하는 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치를 제공한다:
(a) 입구 및 출구 사이를 연결하는 결합 채널을 포함하는 기판;
(b) 상기 결합 채널 내에 형성되는 다수개의 타겟분자결합영역; 및
(c) 상기 다수개의 타겟분자결합영역을 연결하는 연결영역.
본 발명은 또한, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 일 단위체로 하여 둘 이상 포함하되, 상기 단위체는 서로 연결영역을 통하여 연결된 것임을 특징으로 하는, 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 핵산 압타머의 고속(high Throughput) 선별방법을 제공한다:
(a) 랜덤화 배열 영역을 가지는 단일가닥 핵산들로 구성되는 핵산 집단을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입하여 결합 채널 내의 타겟분자결합영역의 타겟분자와 반응시키는 단계;
(b) 상기 타겟분자와 결합하지 않은 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치로부터 제거하는 단계;
(c) 상기 타겟분자와 결합된 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 용출채널 또는 각 연결영역의 일측으로 용출하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 용출된 핵산들을 수집하여 증폭시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 핵산들을 다시 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입시켜 상기 (a) 내지 (d) 단계를 반복하는 단계,
이때, 최종 반복라운드에서는 용출된 핵산의 증폭과정을 수행하지 않는 것을 특징으로 함; 및
(f) 최종 반복라운드에서 용출된 핵산을 압타머로서 선별하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 함유하는 압타머의 고속 선별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 멀티플렉스 미세 유세 장치를 통해 나온 핵산을 고속시퀀싱 방법을 통해 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치 및 이를 이용한 핵산 압타머의 고속 선별방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 멀티플렉스 유체 장치는 다수개의 타겟에 대한 각 압타머를 동시에 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 멀티플렉스 기법에 비하여 처리량 및 처리시간을 크게 감축하는 장점이 있으며, 특히 본 발명에 따른 장치를 고속 시퀀싱법과 연계하여 압타머 선별공정을 수행함으로써 타겟결합/분리/증폭 공정 라운드를 대폭 감소시키고 자동화 공정의 수행을 가능하게 하는바, 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 압타머 선별방법의 개략도이다.
도 2는 공기압 밸브개폐시스템을 포함하는 5-플렉스 미세 유체 장치의 개략도이다.
도 3은 타겟과 반응한 핵산물질의 용출 시 다수개의 타겟분자결합영역 사이의 결합채널을 분리에 사용되는 밸브와 별도의 밸브로 결합채널과 용출채널 사이의 전환이 작동되도록 조절하는 밸브개폐시스템을 갖는 5-플렉스 미세 유체 장치의 개략도로서, "Pneumatic valve 1"은 타겟과 반응한 핵산물질의 용출 시 다수개의 타겟분자결합영역 사이의 결합채널을 분리할 때 사용되며, "Pneumatic valve 2" 는 결합채널과 용출채널 사이의 작동의 전환 시 사용된다.
도 4는 도 2에 따라 제조된 장치의 흐름도를 제시하는 사진으로, (a)는 5-플렉스 미세유체 장치이고, (b)는 메인 결합 채널로 파란색 잉크 (타겟분자와 결합할 압타머를 포함하는 결합용액)를 주입하는 사진이고, (c)는 세척용액을 도입하여 세척공정을 수행하는 사진이고, (d)는 용출 채널로 적색 잉크 (용출 용액)를 주입하는 사진이고, (e)는 밸브가 작동된 (valve-on) 상태에서 유체를 채널을 따라 주입시키는 사진이고, (f)는 밸브를 작동하여 (valve-on) 유체의 흐름을 각 용출채널로 흐르게 하는 사진이다.
도 5는 다수개의 타겟분자결합영역으로 부터 핵산 결합물의 용출을 위한 각각의 용출 채널의 길이를 동일하게 하여, 용출용액의 부피 및 용출 속도가 일정하다는 것을 확인한 결과이다.
도 6는 전기적 신호흐름에 따라 도 4의 상황을 컨트롤하는 것을 나타낸 사진이다.
도 7은 둥근 모양의 24 Multiplex SELEX chip의 일 실시예이다.
도 8은 24 Multiplex SELEX chip의 일 실시예이다.
도 9는 24 Multiplex SELEX chip의 일 실시예이다.
도 10은 둥근 모양의 96 Multiplex SELEX chip의 일 실시예이다.
도 11은 연결영역, 즉 튜브를 이용하여 타겟결합영역(반응챔버)를 연결한 미세 유체 장치의 개략도이다.
도 12는 연결영역, 즉 튜브를 이용하여 타겟결합영역을 연결 시 튜브와 채널 층간 금속핀이 사용됨을 보이는 개략도이다.
도 13은 연결영역, 즉 튜브를 이용하여 타겟결합영역을 연결 시 어뎁터 구조물이 사용됨을 보이는 구조물이다.
도 14의 A는 튜브를 이용한 모듈 연결을 통한 멀티플렉스 칩의 개략도이고, B는 모듈 연결의 실제 예시를 나타내는 사진이다.
도 15는 본 발명에 따른 방법의 자동화공정 수행 예시를 나타내는 개략도이다.
도 16은 도 2의 장치를 이용하여 BSA (음성대조군), TBP, IIB, EGFP, HSF 의 5종류의 타겟에 대한 압타머를 각각 분리한 후, 각각의 압타머가 해당 타겟 물질에 결합하는지를 Q-PCR 기법으로 확인한 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "핵산"이란, 단일가닥이나 2중가닥의 DNA, RNA와 그 화학적 수식체를 의미하는데, 이러한 수식은 선별된 핵산의 증폭을 간섭하지 않는 것으로, 이로서 제한되는 것은 아니나, 백본(backbone) 수식, 메틸화, 이상 염기상 조합, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함한다.
본원에서 "압타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.
본원에서 "타겟분자"란, 단백질 또는 폴리펩타이드, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 약학제제(pharmaceutical agent), 저분자물질, 유기성 비약학제제(organic non-pharmaceutical agent) 및 세포 등 거대분자복합체 (macromolecular complex) 등으로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 저분자물질이란 비스페놀 A 등과 같은 무극성의 저분자 화학물질 등을 포함한다.
본원에서, "타겟분자결합영역"이란, 솔겔 조성물, 비드 등에 의하여 타겟분자가 결합되어 있어 압타머의 결합이 이루어질 수 있는 반응챔버를 말한다.
본원에서, "미세 유체 장치"란 ㎕, nL , pL, fL 등과 같은 마이크로 수준의 극미량 용액의 흐름을 제어 또는 조작할 수 있는 장치를 말한다.
본 발명은 일 관점에서, 도 1과 같은 개선된 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 공정에 적용될 수 있는 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치는 다음을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 입구 및 출구 사이를 연결하는 결합 채널을 포함하는 기판;
(b) 상기 결합 채널 내에 형성되는 다수개의 타겟분자결합영역;
(c) 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 각각 연결되는 다수개의 용출채널; 및
(d) 밸브개폐시스템.
본 발명에서, 입구 및 출구 사이를 연결하는 유체 채널 내에 다수개의 타겟분자결합영역이 형성되므로 상기 입구 및 출구 사이를 연결하는 유체 채널은 결합채널이며, 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 각각 연결되어 타겟분자결합영역으로부터 타겟물질과 결합한 핵산 분자를 용출시키는 유체 채널은 용출채널로 정의된다.
본 발명에서는 하나의 결합 채널 내에 다수개의 타겟분자결합영역이 형성되는 것을 특징으로 한다. 이때, 각 타겟분자결합영역에 포함되는 타겟분자들은 서로 동일한 타겟분자이거나 둘 이상의 서로 상이한 타겟분자임을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 각 타겟분자는 서로 다른 타겟분자임을 특징으로 하는데, 이 경우 타겟분자결합영역, 즉 타겟분자와 도입된 핵산집단의 결합이 일어나는 챔버는 결합 채널을 통하여 다른 챔버와 서로 연결되어 있어 한쪽 끝, 즉 결합 채널의 입구에서 랜덤화 배열영역을 갖는 핵산 집단을 넣으면 각각의 챔버로 핵산 집단이 들어가 여러 개의 타겟분자와 한꺼번에 결합할 수 있게 된다. 따라서, 각각의 타겟분자에 대해 압타머의 경쟁(competition)을 유도할 수 있어 친화도(affinity)가 높은 압타머를 선별할 수 있는 조건이 충족되게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 채널 및 타겟분자결합영역은 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개에 의하여 형성될 수 있는데, 상기 다수개의 용출채널 역시 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개(lid)에 의하여 형성될 수 있다. 이때, 상기 타겟분자결합영역으로부터 타겟물질과 결합한 핵산 분자의 용출 시 각각의 단일 용출 채널은 그 길이를 동일하게 하여, 용출용액의 부피와 속도를 일정하게 할 수 있다.
한편, 결합반응 시 상기 결합 채널을 통하여 상기 다수개의 타겟분자결합영역 사이로 유체가 흐르게 하고, 결합이 종료된 후에는 결합 채널을 통하여 상기 다수개의 타겟분자결합영역간 유체가 흐르지 않고 각 타겟분자결합영역에 연결된 용출채널로 타겟분자결합영역의 타겟분자에 결합되었던 핵산이 용출될 수 있도록 밸브개폐시스템이 작용할 수 있다. 이때, 밸브개폐시스템은 멀티플렉스 미세 유체 칩 내의 결합채널과 용출 채널 사이의 전환을 자동으로 조절되도록 할 수 있으며, 둘 이상의 장치, 즉 둘 이상의 밸브를 포함하여 각각의 밸브가 서로 다른 작동을 하도록 할 수 있다. 예로, 밸브개폐시스템은 결합 채널 내의 유체 흐름을 조절하는 밸브와 상기 타겟분자에 결합된 핵산을 포함하는 유체를 용출채널로 용출시키는 밸브를 포함하도록 할 수 있다.
이러한 밸브시스템은 유체의 속력 및 흐름을 조절 및 최적화하여 기판 덮개와 기판(chip)의 접착된 부분에 압력을 감소시켜 유체가 새는 것을 최소화할 수 있게 한다.
밸브개폐시스템은 예시적으로 열, 공기압, 열공압, 유압, 정전기력, 전자력, 자력, 상변화, 압전 등을 구동방식으로 하는 밸브 중 어느 하나(압력밸브, 주파수 컨트롤 밸브(frequency control-valve), 마이크로 밸브(mirco-valve) 및 방향성 코크 등)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 랜덤화 배열영역을 가지는 핵산 집단(pool)이 타겟분자결합반응 시에는 결합 채널을 통하여 상기 핵산 집단을 포함하는 유체가 흐르게 하고 추후 각 타겟분자에 결합된 핵산을 용출시킬 때에는 상기 용출채널로 상기 타겟분자에 결합된 핵산을 포함하는 유체가 흐를 수 있도록 하는 밸브개폐시스템이면 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 압력밸브는 수압, 공기압 등의 압력을 이용하여 유체의 흐름을 변경시키는 것을 특징으로 하며, 마이크로 밸브의 경우 미세크기의 2-way 또는 3-way 밸브를 인위적으로 삽입하여 인위적 선택에 따라 용출채널로 또는 결합채널을 통하여 유체의 흐름이 이루어지게 할 수 있다. 또한, 방향성 코크를 사용하는 시스템은 방향성 있는 활동성 개폐시스템으로 통합 반응 시, 즉 핵산의 타겟분자결합반응을 수행할 때에는 수평으로 개폐하여 결합 채널을 통하여 유체가 흐르게 하고 결합된 핵산을 개별적으로 용출할 때에는 수직으로 용출채널를 통하여 용출할 수 있게 하는 밸브개폐시스템을 말한다.
본 발명의 실시예에서는 도 2에 나타난 바와 같이, 공기압 밸브개폐시스템을 포함하는, 5개 타겟분자에 대한 압타머를 한꺼번에 선별할 수 있는 5-플렉스 미세 유체 장치를 제조하였다. 본 발명에 따른 5-플렉스 미세 유체 장치(5-plex SELEX-on-a-Chip)은 가열수단으로 금속전극을 포함하는 바닥부분과, 챔버, 채널 및 밸브개폐시스템(압력밸브)를 형성시키는 덮개 부분으로 이루어진다 (도 2의 ①). 타겟분자에 결합된 핵산을 용출할 수 있는 가열수단(heater) 역할을 하는 바닥 부분은 5개의 heater electrode 가 Cr/Au 로 패턴화 되어 있는 칩을 PDMS (Polydimethylsiloxane)로 코팅하였고 (도 2의 ②), 기판덮개는 5개의 챔버와 챔버 간을 연결하는 채널이 있는 1번째 층 (도 2의 ③)을 그 위에 형성하였으며, 또한, 그 위에 기판 덮개로서 공기압 밸브를 이루는 2번째 층 (도 2의 ④) 및 유체 및 공기압이 잘 들어갈 수 있도록 지지대 역할을 하는 3번째 층 (도 2의 ⑤)으로 구성하였다. 이때, 상기 기판덮개는 모두 PDMS로 구성하였다.
압타머-타겟 물질의 반응 챔버의 직경은 1.8mm이고 높이는 30㎛, 채널의 폭은 0.28mm로 하였다. 공기압 인가를 위한 챔버의 직경은 0.5mm, 높이는 30㎛이며, 채널의 폭은 0.2mm로 하였다. PDMS와 PDMS 사이의 접합을 위해서 대기압 하에서 플라즈마로 표면처리를 하여 초 친수성으로 만들어 접합 기술에 이용되었으며, 표면 처리를 위한 Ar/O2의 노출시간은 2초로 하였다.
상기 타겟분자결합영역의 사이, 즉 챔버와 챔버를 연결하는 채널에는 설치한 공기압 밸브는, 채널에 공기압을 만들어 챔버에서 챔버로 유체가 흐르는 것을 막고 독립적으로 각 용출채널로 흐를 수 있도록 하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 결합 채널과 용출채널 사이의 전환을 별도의 밸브에 의해 그 작동이 자동으로 조절되도록 하였다. 즉, 도4에 나타난 바와 같이, 핵산을 타겟분자에 결합시킬 때는 공기압 밸브를 열어 핵산 집단이 포함된 유체가 챔버에서 챔버로 흐르면서 각각의 타겟분자에 결합될 수 있도록 하고, 용출시킬 때는 공기압 밸브로 유체의 흐름을 막은 후 금속 전극 부분(챔버)에 열을 발생시켜 상호오염(cross-contamination) 없이 챔버 별로 따로 유체가 흘러나오도록 하였다.
아울러, 본 실시예에서는 다수개의 타겟분자결합영역으로부터 핵산 결합물의 용출을 위한 각각의 용출채널의 길이를 동일하게 한 결과, 용출채널의 부피 및 용출속도가 일정하다는 것을 확인하였다 (도 5). 이때, 용출 채널에서 채널 길이를 같게 하고 유속을 동일하게 하기 위해 '저항'(채널의 꼬임)을 용출 채널에 도입할 수 있다.
공기압 밸브를 이용한 실험의 상황을 전기 기계적 신호 흐름 (Signal flow)의 측면에서 나타낸 그림은 도 6과 같다. 마우스 혹은 키보드 입력에 의한 전기적 신호로 제어되는 자동 공기압 시스템을 이용하여 챔버에 공급된 기계적인 입력(Mechanical input)된 공기압(P)은 Vchamber Array의 diaphragm의 변형을 유도하고, 이러한 변형(δ)은 흐르는 유체를 막아주는 밸브 역할을 하게 된다.
아울러, 본 발명에 따른 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치는 도 7 내지 도 10과 같은 형태로 설계될 수 있다.
도 7은 24 Multiplex SELEX chip으로서, 둥근 모양으로 설계를 하여 칩의 모양을 단순화하였다. 이는 분수처럼 동시 elution이 가능한 형태로 효율성을 높일 수 있다. 특히, 둥근 모양 내부에 여러 개의 챔버(Chamber)를 넣을 수 있어 더 많은 SELEX를 가능하게 한다. 이때, 바람직하게는 칩 내부에 펌프를 넣어 자동으로 SELEX를 하도록 할 수 있다.
또한, 도 8 역시 24 Multiplex SELEX chip으로서, 한 몰드(mold) 위에 6개 정도 제작할 수 있어 한번에 여러 칩을 제작가능하며 실험 시 효율성을 높일 수 있다. 이때, 칩의 크기를 크게 함으로써 24개 보다 더 많은 SELEX 칩을 구연 가능하며, 챔버가 각각 독립적인 모양이어서 옆의 졸-겔에 전혀 영향이 없는 장점이 있다.
아울러, 도 9 역시, 24 Multiplex SELES chip으로서, 이 역시 칩의 크기를 크게 한다면 24개보다 더 많은 SELEX 칩을 구연가능하다.
한편, 도 10은 96 Multiplex SELEX Chip으로서, 둥근 모양 (Disc-type)으로 설계하여 칩의 모양이 간단하고, 칩의 크기를 작게 할 수 있게 설계 가능하다. 이는 분수처럼 동시 elution이 가능하여 실험을 할 때 효율성을 높일 수 있다. 특히, 둥근 모양 내부에 여러 개의 챔버(Chamber)를 넣을 수 있어 더 많은 SELEX를 가능하게 한다. 이때, 바람직하게는 칩 내부에 펌프를 넣어 자동으로 SELEX를 하도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치는 또한, 다음을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 입구 및 출구 사이를 연결하는 결합 채널을 포함하는 기판;
(b) 상기 결합 채널 내에 형성되는 다수개의 타겟분자결합영역; 및
(c) 상기 다수개의 타겟분자결합영역을 연결하는 연결영역.
본 발명에 있어서, 상기 연결영역은 일측 또는 양측의 타겟분자결합영역으로부터 일 말단이 분리될 수 있는 것을 특징으로 하는 것으로서, 이는 도 11에 나타난 것과 같이 튜브인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서 또한, 상기 결합 채널 및 타겟분자결합영역은 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개(lid)에 의하여 형성되는 것을 있는데, 상기 튜브 또한, 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개(lid)에 의하여 형성되는 각 타겟분자결합영역의 홀(hole)로 연결되는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때 “튜브와 상기 타겟분자결합영역의 홀 간 직접 연결, 해밀턴주사기의 바늘과 상기 타겟분자결합영역의 홀 간 직접 연결" 등과 같은 방법이 있으나, 이 경우 반응물의 누출, 재사용 불가와 같은 문제점이 발생하였다. 이에 본 발명에서는 타겟분자결합영역, 즉 결합반응이 일어나는 챔버 간 연결을 위한 튜브의 절단부위에 도 12에 나타난 바와 같이, 금속핀으로 연결하여 챔버의 주입구와 튜브의 연결 및 분리가 자유롭고 연속 사용이 가능하도록 개선하였다.
아울러, 본 발명의 실시예에서는 기판과 상기 타겟분자결합영역의 홀을 형성하는 기판덮개 간 들뜸 현상을 방지하기 위하여, 도 13에 나타난 바와 같이, 어뎁터(adapter) 구조물을 추가로 증착한 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 어뎁터 구조물은 바람직하게는 PDMS (Polydimethylsiloxane)으로 만들어진 판형 구조물임을 특징으로 할 수 있다. 어뎁터 구조물을 설치함으로써, 튜브와 채널 층과의 연결을 향상시킴으로써 기판 표면과 기판 덮개 간 강력한 접착이 유도된다.
본 발명에 따른 장치에 있어서, 타겟분자결합영역, 즉 반응챔버에 타겟분자는 다양한 방법에 의하여 고정될 수 있는 장점이 있다. 예시적으로, 솔젤 분주법을 이용한 다양한 물질 고정 가능한데, 예로 화학물질, 펩타이드 등 저분자 물질, 단백질, 항체, 세포 등이 구조변화 없이 활성상태로 반응 챔버 내 고정될 수 있다. 뿐만 아니라, Ni-NTA-agarose 비드, 자성비드, Glutathione 표면처리 비드, 에폭시 레진 등에 반응하는 물질과 비드 복합체의 반응 챔버 내 포집이 가능하며, 여러 종류 타겟분자 응용에 따른 다른 종류의 비드 고정이 가능하다. 또한, 각각의 반응 챔버에 다른 종류의 세포를 고정할 수 있음에 따라 세포 표면에 발현되는 물질에 대한 압타머 개발이 가능하다.
이때, 바람직하게는 타겟분자결합영역, 즉 반응 챔버 간 이물질 오염이나 타겟분자-비드 복합체가 서로 섞이는 것을 막기 위하여 멤브레인 필터를 이용할 수 있다. 즉, PDMS 덮개(lid) 제작 시 두 종류의 시약(reagent)를 섞고 경화되기 전 튜브 연결을 위한 홀 부분에 미리 멤브레인을 붙여 굳히고, 완전히 굳은 후 구멍을 뚫어 튜브와 연결하는 방식으로 챔버 간 이물질 오염을 방지할 수 있다. 이에 본 발명은, 상기 타겟분자결합영역 사이에 추가로 필터가 설치되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이러한 타겟분자결합영역의 타겟분자에 결합된 핵산은 밸브개폐시스템을 통하여 용출 채널로 용출되거나, 타겟분자결합영역의 연결영역의 일말단을 통하여 용출될 수 있는데, 타겟분자에 결합된 핵산분자의 분리는 타겟분자결합영역, 즉 반응 챔버에 고정된 물질에 따라 다양한 방법으로 개발된 칩에 직접 적용될 수 있다. 예시적으로, 고농도 염처리 (NaCl, KCl, MgCl2, Tris 등), pH 변화 (HCl, NaOH 처리)의 방법으로 핵산의 3차원 구조 변화하여 친밀도 결함을 유도할 수 있으며, 우레아 (Urea) 처리로 타겟 단백질의 구조변화를 유도하여 핵산을 분리할 수 있다. 이외에도 농도 변화에 의한 경쟁 분리법으로서, 고농도 Imidazole, Glutathione 처리로 경쟁 분리 결합을 유도할 수 있는데, 케미컬에 대한 핵산 분리의 경우 고농도 케미컬 처리로 핵산분자 결합 경쟁을 유발하여 분리하게 된다.
다만, 본 발명의 실시예에서는, 타겟분자에 결합되어 있는 핵산분자를 열을 이용하여 분리하였다. 압타머는 구조를 형성함으로써 타겟 물질에 대한 결합력을 가지게 되는데 이 구조는 염기 간의 수소 결합에 의해 형성됨. DNA 또는 RNA의 열변성을 일으킬 수 있는 온도를 용해온도라 하는데 용해온도보다 약간 높은 온도에서는 염기들 간의 수소결합이 끊어져 압타머의 구조가 풀리게 되고 타겟 물질에 대한 결합력을 잃기 때문에 타겟에서 분리 (elution) 될 수 있다. 일반적으로 압타머를 elution 하는 온도는 65~95℃를 사용한다.
이에 본 발명의 일 실시예에서 제작한 SELEX-on-a-chip 에서는 칩에 금속전극을 증착, 저항값을 증가하는 구조물을 만들어 높은 열을 발생시켜 압타머 분리 용출이 가능하도록 하였다. 적용된 열 조건의 최적화 (압타머 구조변화만 영향을 미치는 온도 조건 탐색)로 순도 높은 압타머 용출을 유도하였다. 이때, 바람직하게는 기존 분리방법이 칩에서 발생 유도되는 열과 함께 융합 적용 가능하도록 할 수 있다.
이때, 본 발명에 따른 장치는 가열수단으로서의 전극을 하나의 전극이 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 근접하여 설치되도록 하거나, 다수개의 전극이 각 타겟분자결합영역에 근접하여 각각 개별적으로 설치되도록 할 수 있다. 이는 기존 본 발명자의 특허인 PCT/US2009/054097호의 경우, 하나의 유체 채널 내 형성된 타겟분자결합영역의 타겟분자에 결합된 핵산들을 서로 섞이지 않고 순차적으로 용출하기 위하여 각 타겟분자결합영역의 하단부에 각각 개별적인 전극의 형성이 요구된 것과 달리, 본 발명에 따른 장치의 경우 하나의 전극으로서 전체 타겟분자결합영역에 열을 가하여 동시에 핵산분자가 분리될 수 있도록 하는 장점이 있다. 여기서 금속 전극의 재질은 열 발생을 위한 것이면 제한이 없다 (예: Al, Cr/Au 등). 특히 이 장점은 도면 8 내지 10과 같이 동시에 많은 타겟분자를 실렉스할 때 시간을 기하급수적으로 줄였다. 기존 특허에서는 비효율적인 용출 시간 때문에 24-플렉스이상의 고속스크리닝을 실현 할 수 없었지만 밸빙 시스템의 개폐시스템에 의해 고속스크리닝의 효율을 향상시켜 24-Felx, 96-Flex 등 다중분석이 실질적으로 가능하게 하였다.
본 발명에서는 또한, 밸브구동 및 튜브 연결 시 반응물 누출을 방지하기 위하여 다음의 점을 개선하였다. 즉, 본 발명의 실시예에서는 유체의 속력 및 흐름을 조절 및 최적화하여 기판 덮개와 기판(chip)의 접착된 부분에 압력을 감소시켜 유체가 새는 것을 최소화할 수 있게 하였다. 또한, 유리 기판 표면에 PDMS (Polydimethylsiloxane)을 코팅하고, 챔버와 채널을 만들어 주는 기판 덮개도 PDMS 로 만들어 “All PDMS Chip”을 구성한 결과 플라즈마 클리닝(plasma cleaning) 후 칩과 기판덮개 부분의 접착력을 증가시켜 유체가 새는 것을 최소화하였다. 즉, 본 발명에 있어서, 기판은 PDMS, PMMA (polymethylmethacrylate) 및 폴리스티렌(polystyrene)과 같은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금(Gold) 등 금속 중 어느 하나로 형성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 기판은 PDMS (Polydimethylsiloxane)으로 코팅한 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 기판 덮개는 PDMS(Polydimethylsiloxane)로 형성되도록 하여 All PDMS Chip.의 구성이 가능하여 진다. 아울러, 기판과 타겟분자의 고정을 용이하게 할 수 있는 화합물, 즉 PVAc, 폴리비닐 아세테이트 등으로 코팅하는 것이 바람직하다.
본 실시예에서는, 기판덮개를 PDMS로 구성하고 이때 기판덮개의 두께를 조절함으로써 유체의 흐름이 없을 때 채널 내부에 발생되는 back pressure를 감소시켰다. 또한, PDMS 기판덮개의 두께를 얇게 함으로써 밸브 구동의 효율성을 증대시킬 수 있다. 즉, 바람직하게는 상기 PDMS 기판덮개의 두께를 <200㎛로, 더욱 바람직하게는 100~200㎛로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 상기 기판덮개는 폴리스티렌(polystyrene)으로 형성하고, 기판은 플라스틱, 유리 또는 실리콘으로 형성하여 plastic-polystyrene, glass-polystyrene, silicon-polystyrene 등과 같이 장치를 제조할 수도 있다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 미세 유체 장치는 이를 기본 단위체 (모듈)로 하여 둘 이상 연결하여 사용할 수 있으며, 이에 본 발명은 다른 관점에서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 일 단위체로 하여 둘 이상 포함하되, 상기 단위체는 서로 연결영역을 통하여 연결된 것임을 특징으로 하는, 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 칩에 관한 것이다. 이때, 튜브 또는 채널을 이용하여 기본 단위체를 직렬 또는 병렬로 연결하여 멀티플렉스 칩을 만들 수 있다. 아울러, 이때 바람직하게는 상기 기본단위체를 연결하는 연결영역에는 추가로 필터를 설치하여 기본 단위체 간 이물질 오염을 방지할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산 압타머의 고속(high Throughput) 선별방법에 관한 것이다. 이때, 본 발명에 따른 선별방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(a) 랜덤화 배열 영역을 가지는 단일가닥 핵산들로 구성되는 핵산 집단을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입하여 결합 채널 내의 타겟분자결합영역의 타겟분자와 반응시키는 단계;
(b) 상기 타겟분자와 결합하지 않은 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치로부터 제거하는 단계;
(c) 상기 타겟분자와 결합된 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 용출채널 또는 각 연결영역의 일측으로 용출하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 용출된 핵산들을 수집하여 증폭시키는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 핵산들을 다시 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입시켜 상기 (a) 내지 (d) 단계를 반복하는 단계,
이때, 최종 반복라운드에서는 용출된 핵산의 증폭과정을 수행하지 않는 것을 특징으로 함; 및
(f) 최종 반복라운드에서 용출된 핵산을 압타머로서 선별하는 단계.
본 발명에 따른 방법은, 서로 다른 랜덤화 배열 영역을 가지는 1×109~15 개의 핵산집단에 대하여 수행될 수 있다. 랜덤화(randomized)라는 용어는 소정의 길이에 걸쳐서 원칙적으로 임의의 가능한 배열을 갖고 있는 핵산의 세그먼트를 기술할 때 사용된다. 랜덤화 배열은, 필요에 따라 약 8로부터 100 뉴클레오티드 이상의 범위를 갖는 다양한 길이를 갖는다. 랜덤 배열 세그먼트가 만들어지게 되는 화학 또는 효소반응은, 존재할 수도 있는 알 수 없는 편향성 또는 뉴클레오티드 선호성 때문에, 계산상의 랜덤배열을 생성하지 못할 수도 있다. 랜덤화라는 용어는, 비이상성으로부터의 이와 같은 편향 가능성을 반영하기 위하여 랜덤 대신에 사용된다. 순차적 화학합성과 같은 현재 공지된 기술에 있어서, 큰 편차가 일어나는 것으로는 알려져 있지 않다. 짧은 세그먼트에 있어서, 존재할 수도 있는 극소 편향성은 무시할 수 있는 정도이다.
특히 본 방법은 대상핵산 시험 혼합물의 초기 제조가 요구된다. 개별적인 시험핵산은 혼합물내의 모든 핵산에 보존된 배열과 측면을 이루는 랜덤화 영역을 함유할 수 있다. 보존 영역은 핵산의 증폭 및 선별을 용이하게 하기 위하여 마련된다. 당 분야에는 이와 같이 알려진 배열이 많기 때문에, 배열의 선택은 당 분야의 통상적인 숙련자가, 소정의 증폭방법과 함께, 할 수 있는 것 중의 하나이다. 랜덤화 영역은 완전히 또는 부분적인 랜덤화 배열을 가질 수 있다. 선택적으로 핵산의 이 부분은, 혼합물의 모든 핵산류에 있어서 일정하게 고정되어 있는 부부분(副部分)과 함께, 랜덤화된 부부분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 표적단백질과 결합하는 것으로 알려진, 또는 결합되기 위하여 선별된 배열 영역은 랜덤화 영역과 일체가 되어 결합성이 개선되거나 결합의 특이성이 개선될 수 있다. 시험 혼합물의 배열 다양성은, 선별/증폭 공정 중 시험 혼합물의 핵산에 변이를 발생시킴으로써 도입 또는 증대 될 수 있다. 원칙적으로, 시험 혼합물에 채택된 핵산은 그가 증폭될 수 있는 대로 임의의 길이가 될 수 있다. 본 발명의 방법은, 다수의 배열 변이체로부터 선별하는데 있어서 가장 실용적으로 채택된다. 따라서 본 방법은, 약 4염기로부터 임의의 도달할 수 있는 크기의 핵산 배열의 결합을 평가하는데 바람직하게 채택될 것으로 기대된다.
본 발명에서는 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 타겟분자결합영역에 포함되는 타겟분자들은 서로 동일한 타겟분자이거나 둘 이상의 서로 상이한 타겟분자임을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 각 타겟분자는 서로 다른 타겟분자임을 특징으로 하는데, 이 경우 타겟분자결합영역, 즉 타겟분자와 도입된 핵산집단의 결합이 일어나는 챔버는 결합 채널을 통하여 다른 챔버와 서로 연결되어 있어 한쪽 끝, 즉 결합 채널의 입구에서 랜덤화 배열영역을 갖는 핵산 집단을 넣으면 각각의 챔버로 핵산 집단이 들어가 여러 개의 타겟분자와 한꺼번에 결합할 수 있게 된다. 따라서, 각각의 타겟분자에 대해 압타머의 경쟁(competition)을 유도할 수 있어 친화도(affinity)가 높은 압타머를 선별할 수 있는 조건이 충족되게 된다.
이러한 타겟분자로는 단백질 또는 폴리펩타이드, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 약학제제(pharmaceutical agent), 저분자물질, 유기성 비약학제제(organic non-pharmaceutical agent) 및 세포 등 거대분자복합체 (macromolecular complex) 등을 예시할 수 있는데, 압타머의 타겟이 되는 분자이면 이에 제한되지 않음은 자명하다고 할 것이다.
상기 장치에 도입된 핵산집단은 타겟분자와 결합이 선호되는 조건하에서 상기 타겟분자와 접촉되게 되고, 상기 핵산집단 중 타겟분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산은 상기 타겟분자에 결합되어 핵산-타겟분자 쌍을 이루게 된다. 따라서, 뒤따르는 비결합 핵산에 대한 제거가 가능하게 된다.
한편, 본 발명의 단계에서 "증폭"은 분자의 카피 또는 분자종류의 량 또는 수를 증가시키는 공정 또는 공정의 조합을 의미한다. 이때, 상기 "증폭"과정은 PCR 과정임을 특징으로 할 수 있으며, 이에 선별된 RNA들의 cDNA 카피제조, 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 각 cDNA의 카피수를 증가 및 cDNA 카피를 전사하여 선별된 RNA들과 동일한 배열을 갖는 RNA 분자를 얻는 공정을 포함할 수 있다. 즉, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 공지된 바와 같이, 직접 DNA 복제, 직접 RNA 증폭 등과 같은 방법을 포함하여, 당 분야에 공지된 반응 또는 반응들의 조합이 적절히 이용될 수 있다. 증폭방법은 결과적으로, 증폭된 혼합물의 비율면에 있어서, 초기 혼합물내의 상이한 배열의 비율을 필수적으로 나타내도록 되어야 한다.
아울러, 본 발명에 따른 방법에서는 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 기본단위 (모듈)로 하여 둘 이상 연결하여 사용할 수 있다. 즉, 튜브 또는 미세 결합 채널을 이용하여 기본 단위를 직렬 및 병렬로 연결하여 multiplex 칩을 만들 수 있다. 예시적으로 4-plex chip을 24개 연결하여 96-well plate 타입 칩으로 개선할 수 있다. 이렇게 모듈화함에 따라 실험목적에 따라 수십 내지 수백개의 well plate 타입 칩으로 진행하고 이를 바로 서열분석(예) Solexa), 물질 간 결합력 분석 (예) Octet)에 손쉽게 적용시킬 수 있어 자동화가 가능하게 된다.
아울러, 본 발명에 있어서, 상기 (e)의 반복단계는 소정의 선별성이 달성될 때까지 반복되게 되는데, 예를 들면, 최초 실험혼합물, 즉 랜덤화 배열영역을 갖는 핵산집단 중 특정 핵산이 소정의 결합정도를 달성하거나 또는 혼합물 중 최소의 핵산이 얻어질 때까지 반복이 계속될 수 있다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 미세유세장치를 이용함으로써 6회까지 반복라운드를 수행하지 않아도 압타머의 선별이 가능해진다. 즉, 상기 반복단계는 6회 이내 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3회 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 방법의 각 반복라운드에서 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치로부터 용출된 핵산들에 대하여 고속 시퀀싱법(high throughput sequencing)을 이용하여 서열분석을 수행한 다음, 각 반복라운드에서 고속 시퀀싱법에 의하여 분석된 서열을 비교하여 반복횟수의 증가에 따라 상대적인 비율이 증가하는 핵산서열을 압타머로서 선별할 수 있다. 이때, 고속시퀸싱법을 이용함으로써 클로닝을 수행할 필요가 없어지므로 더 빠르고 간편하게 압타머를 선별할 수 있다. 즉, 바이오인포메틱스 분석툴을 이용하여 SELEX 단계를 줄일 수 있다.
이러한 상기 고속 시퀀싱법을 수행하는 장치는 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 용출채널 또는 각 연결영역의 일측과 연결되어 바로 수행될 수 있다. 기존에는 타겟 물질에 대한 압타머를 선별한 후 T-벡터에 클로닝 하여 개별 압타머를 따로 염기서열 분석을 하였다. 그러나 클로닝이 번거롭고, 압타머를 하나하나 서열 분석할 수밖에 없다는 단점이 있으며, multiplex SELEX 에서는 많은 압타머를 따로 서열 분석해야하는 문제점이 있어, 본 발명의 실시예에서는 Solexa 방식의 고속 시퀀싱법 (High-throughput sequencing)을 연계하여 클로닝을 따로 할 필요 없이 압타머 풀을 한꺼번에 서열 분석할 수 있으며, 개별 바코드를 가지는 어뎁터를 이용하여 여러가지 타겟의 압타머 혹은 SELEX 라운드 별 압타머 풀을 한꺼번에 서열을 동정하여 따로 분석할 수 있었다. 현재 96가지의 바코드를 달아 96가지 타겟 또는 라운드 별 압타머를 서열 분석할 수 있는 기술이 나와 있다. 고속 시퀀싱법으로는 예시적으로 Solexa, Solid 기법 등을 사용할 수 있으나, 동시에 다량의 서열을 고속으로 분석할 수 있는 기법이면 이에 제한되는 것은 아니다.
아울러, 상기 (f) 단계는 최종적으로 용출된 핵산에 대하여 추가로 타겟분자 친화성 테스트를 수행하여 친화도가 확인된 핵산을 압타머로서 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 타겟분자 친화성 테스트는 고속 친화성 테스트 방법인 것을 특징으로 할 수 있는데, 예시적으로 고속 친화성 테스트로서 Octet system을 사용할 수 있는데, Octet 시스템은 BLI (Bio-Layer Interferometry) 기술을 이용하여 생체 물질 간 결합 분석을 위한 무표지 (Label-free) kinetic analysis 와 quantitation을 수행할 수 있는 장비이다. BLI (Bio-Layer Interferometry) 는 센서 표면의 Optical-layer 상에서 물질간의 결합이 일어나면 센서 표면의 두께 변화가 일어나고 이러한 두께 변화는 센서 표면을 관통하여 반사되는 백색광의 파동 패턴 변화로 표시되어 물질 간의 결합을 측정하는 기술이다. 이는 96개 시료를 두 시간 이내에 kinetic screening 또는 affinity test를 할 수 있어 multiplex가 가능하며 단백질 뿐만 아니라 펩타이드나 저분자 물질 간의 상호작용 역시 측정할 수 있다. 또한 표지가 필요 없는 센서이기 때문에 쉽고 간편할 뿐만 아니라 다른 무표지 기술과 달리 시료의 표면을 직접적으로 검출해 내기 때문에 유체 시스템에서 나타나는 여러 문제점들이 없다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 미세 유체 장치를 기본단위로 하여 96well plate type으로 제공한 후, 이를 상기 Octet 시스템으로 연결시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 도 15에 나타난 바와 같이, 각 단계의 수행을 자동화할 수 있는 것을 특징으로 한다. 종래의 SELEX 공정은 바이오 관련 실험의 집약체로 단계단계 마다 실험자의 능력 및 노하우에 의해 실험 성공 여부가 달리 판가름되었다. 따라서 규격화 및 자동화의 필요성이 높이 요구되었다.
그러나 본 발명에 따른 장치는 SELEX-on-chip으로서, 범용화 되어 있는 96/384-well plate 규격에 맞추어 디자인함으로써 기존 장비와 연계로 SELEX 전체 과정의 자동화를 가능하게 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 장치, 즉 SELEX-on-a-Chip 은 단일 단위체 (모듈) 형식으로 구성되어 있어 튜브를 이용하여 기본 단위를 직렬 및 병렬로 연결하여 multiplex 칩 (예, 96-well type, 384-well type 등) 을 만들 수 있고, 규격화된 SELEX 칩과 튜브를 이용한 물리적 연결 혹은, 밸브시스템에 의한 챔버 개폐 구동으로 96-well plate로의 압타머의 분리, 회수가 자동 조절 되도록 할 수 있다. 따라서, 기존의 96/384-well plate 기반 분석기기 (PCR, High Throughput sequencer, affinity 측정 장치) 로의 적용이 용이한 장점이 있다.
본 발명의 실시예에서는, 도 2의 5-plex 미세유체 장치를 이용하여 BSA (음성대조군), TBP, IIB, EGFP, HSF의 5 종류의 타겟에 대한 압타머로 101apt (TBP를 타겟으로 한 압타머), b4apt (IIB를 타겟으로 한 압타머), GFPapt(EGFPfmf 타겟으로 한 압타머) 및 HSFapt(HSF를 타겟으로 한 압타머)를 각각 분리하였다. 그 다음, 본 발명의 장치 및 방법에 따라 분리한 압타머가 해당 타겟물질에 결합하는지 확인하기 위하여 StepOne-Plus RT PCR (Applied Biosystems)를 이용하여 Q-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, TBP, IIB, EGFP, HSF를 각각 타겟으로 하여 분리한 각 압타머들은 본래의 각 타겟에 대하여 친화력이 높음을 확인하였다. 도 16의 그래프에서 Y축의 Quantity 수치가 높을 수록 높은 친화력을 가지고 결합하는 것을 의미한다.
한편, 본 발명에 따른 방법은 휴대성을 높이기 위하여, 키트의 형태로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치를 함유하는 압타머의 고속 선별용 키트에 관한 것이다. 이때, 상기 키트는 용출된 핵산의 증폭 및 서열분석을 위한 시약을 추가적으로 별도의 용기에 담아 제공하거나 또는 별도의 반응부에 담아 제공할 수도 있다.
상기 압타머의 고속 선별용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음

Claims (54)

  1. 다음을 포함하는 핵산 압타머 선별을 위한 멀티플렉스 미세 유체 장치:
    (a) 입구 및 출구 사이를 연결하는 결합 채널을 포함하는 기판;
    (b) 상기 결합 채널 내에 형성되는 다수개의 타겟분자결합영역;
    (c) 상기 타겟분자의 결합반응 시 상기 결합 채널을 통하여 상기 다수개의 타겟분자결합영역 사이로 유체가 흐르게 하고, 결합이 종료된 후에는 결합 채널을 통하여 상기 다수개의 타겟분자결합영역 간 유체가 흐르지 않고 각 타겟분자결합영역에 연결된 용출채널로 타겟분자에 결합된 핵산을 포함하는 유체가 용출될 수 있도록 하여, 타겟분자결합영역을 분리시키는 밸브개폐시스템;
    (d) 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 각각 연결되는 다수개의 용출채널;
    (e) 상기 각 타겟분자결합영역의 타겟분자와 결합된 핵산을 각 타겟분자결합영역에 연결된 각 용출채널로 용출되도록 하는 단일 용출수단; 및
    (f) 상기 다수개의 타겟분자결합영역을 연결하는 연결영역.

  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 채널 및 타겟분자결합영역은 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다수개의 용출채널은 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개(lid)에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 밸브개폐시스템은 결합채널 내의 유체 흐름을 조절하는 밸브와 상기 타겟분자에 결합된 핵산을 포함하는 유체를 용출채널로 용출시키는 밸브를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 밸브개폐시스템은 열, 공기압, 열공압, 유압, 정전기력, 전자력, 자력, 상변화 및 압전 중 어느 하나를 밸브개폐를 위한 구동요소로 하는 시스템인 것을 특징으로 하는 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 용출채널로 용출되는 용출용액의 부피 및 용출 속도가 일정하도록 상기 다수개의 용출채널의 길이를 서로 동일하게 하는 것을 특징으로 하는 장치.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 용출수단은 상기 결합 채널의 다수개의 타겟분자결합영역에 근접하여 설치되는 가열수단인 것을 특징으로 하는 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 가열수단은 전극인 것을 특징으로 하는 장치.
  11. 제10항에 있어서, 하나의 전극이 상기 다수개의 타겟분자결합영역에 근접하여 설치되는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 삭제
  13. 제2항에 있어서, 상기 기판 덮개는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 또는 PS(polystyrene)로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 PDMS 기판덮개의 두께를 100~200㎛로 하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제1항에 있어서, 기판은 플라스틱, 유리, 실리콘 및 금속 중 어느 하나로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 플라스틱은 PDMS, PMMA (Polymethylmethacrylate) 및 폴리스티렌(polystyrene) 중 어느 하나로 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제15항에 있어서, 상기 기판은 PDMS (Polydimethylsiloxane), PS(polystyrene), PMMA(Polymethylmethacrylate), PVA(Polyvinyl alcohol) 및 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate) 중 어느 하나로 코팅한 것임을 특징으로 하는 장치.
  18. 삭제
  19. 제1항에 있어서, 상기 타겟분자결합영역 사이에 추가로 필터가 설치되는 것을 특징으로 하는 장치.
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 상기 연결영역은 일측 또는 양측의 타겟분자결합영역으로부터 일 말단이 분리될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  22. 제1항에 있어서, 상기 연결영역은 튜브인 것을 특징으로 하는 장치.
  23. 삭제
  24. 제1항에 있어서, 상기 연결영역은 상기 기판의 표면에 증착되는 기판 덮개(lid)에 형성되어 있는 각 타겟분자결합영역의 홀(hole)로 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
  25. 제1항에 있어서, 상기 연결영역은 금속핀을 통하여 상기 타겟분자결합영역의 홀로 연결되는 것을 특징으로 하는 장치.
  26. 제1항에 있어서, 상기 연결영역과 타겟분자결합영역의 홀 사이에 어뎁터 구조물이 추가로 증착된 것을 특징으로 하는 장치.
  27. 제1항에 있어서, 상기 용출수단은 각 타겟분자결합영역의 타겟분자와 결합된 핵산을 각 타겟분자결합영역에 연결된 각 연결영역의 일측으로 용출되도록 하는 용출수단인 것을 특징으로 하는 장치.
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  38. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제17항, 제19항, 제21항, 제22항 및 제24 내지 제27항 중 어느 한 항의 멀티플렉스 미세 유체 장치를 일 단위체로 하여 둘 이상 포함하되, 상기 단위체는 서로 연결영역을 통하여 연결된 것임을 특징으로 하는, 압타머 선별을 위한 다중 멀티플렉스 칩.
  39. 제38항에 있어서, 상기 단위체 간 연결영역은 튜브 또는 채널인 것을 특징으로 하는 다중 멀티플렉스 칩.
  40. 제38항에 있어서, 상기 단위체 간 연결영역에 추가로 필터가 설치되는 것을 특징으로 하는 다중 멀티플렉스 칩.
  41. 다음 단계를 포함하는 핵산 압타머의 고속(high Throughput) 선별방법:
    (a) 랜덤화 배열 영역을 가지는 단일가닥 핵산들로 구성되는 핵산 집단을 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제17항, 제19항, 제21항, 제22항 및 제24 내지 제27항 중 어느 한 항의 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입하여 결합 채널 내의 타겟분자결합영역의 타겟분자와 반응시키는 단계;
    (b) 상기 타겟분자와 결합하지 않은 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치로부터 제거하는 단계;
    (c) 상기 타겟분자와 결합된 핵산들을 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 용출채널 또는 각 연결영역의 일측으로 용출하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 용출된 핵산들을 수집하여 증폭시키는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 핵산들을 다시 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 결합 채널로 도입시켜 상기 (a) 내지 (d) 단계를 반복하는 단계,
    이때, 최종 반복라운드에서는 용출된 핵산의 증폭과정을 수행하지 않는 것을 특징으로 함; 및
    (f) 최종 반복라운드에서 용출된 핵산을 압타머로서 선별하는 단계.
  42. 제41항에 있어서, 상기 핵산 집단은 서로 다른 랜덤화 배열 영역을 가지는 1×109~15 개의 핵산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치는 서로 상이한 타겟분자를 포함하는 타겟분자결합영역들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치는 서로 동일한 타겟분자를 포함하는 타겟분자결합영역들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 타겟분자는 단백질 또는 폴리펩타이드, 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid), 약학제제(pharmaceutical agent), 저분자물질, 유기성 비약학제제(organic non-pharmaceutical agent) 및 거대분자복합체 (macromolecular complex)로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제41항에 있어서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치가 둘 이상 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치는 튜브 또는 채널에 의하여 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제41항에 있어서, 각 반복라운드에서 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치로부터 용출된 핵산들에 대하여 고속 시퀀싱법(high throughput sequencing)을 이용하여 서열분석을 수행한 다음, 각 반복라운드에서 고속 시퀀싱법에 의하여 분석된 서열을 비교하여 반복횟수의 증가에 따라 상대적인 비율이 증가하는 핵산서열을 압타머로서 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제41항에 있어서, 상기 (e)단계의 반복은 1 내지 6회 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 고속 시퀀싱법을 수행하는 장치는 상기 멀티플렉스 미세 유체 장치의 각 용출채널 또는 각 연결영역의 일측과 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제41항에 있어서, 상기 (f) 단계는 최종적으로 용출된 핵산에 대하여 추가로 타겟분자 친화성 테스트를 수행하여 친화도가 확인된 핵산을 압타머로서 선별하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 타겟분자 친화성 테스트는 고속 친화성 테스트 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제41항에 있어서, 각 단계의 수행은 자동화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제11항, 제13항 내지 제17항, 제19항, 제21항, 제22항 및 제24 내지 제27항 중 어느 한 항의 멀티플렉스 미세 유체 장치를 함유하는 압타머의 고속 선별용 키트.
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