CN102639720A - 用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用此装置的核酸适配子的高通量筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用其的核酸适配子的高通量筛选方法，特别是，将现有的对单一目标的适配子开发方式转换为改善的多元化平台的多元微流体装置及将其与高通量测序方法连接的核酸适配子的高通量筛选方法。本发明中的多元微流体装置不仅可以同时检测对多个目标的各个适配子，与现有的多元化技术相比，可以大幅缩减处理量及处理时间，特别是将本发明的装置与高通量测序方法连接而执行适配子筛选工序，从而可大幅减少目标结合/分离/放大工序过程，实现自动化工序，是非常有利的技术。

Description

用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用此装置的核酸适配子的高通量筛选方法
技术领域
本发明涉及一种用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用此装置的核酸适配子的高通量筛选方法，尤其是涉及，将现有的针对单一目标的适配子开发方式转换为改善的多元平台的多元微流体装置(SELEX lap-on-a-chip)及将其与高通量测序方法(high throughput sequencing)连接的核酸适配子高通量筛选方法(high throughput selection mehtod)。
背景技术
适配子为单链DNA或RNA分子，是以高亲和力可特殊识别目标物质的单链寡核酸。适配子可以作为检测分析系统中可识别分子的生物传感器的一个因素，目前被关注为抗体的代替物质。特别是，适配子与抗体不同，可以作为包括毒素的各种有机物及无机物的目标分子，一旦分离出可以与特定物质特殊结合的适配子，则可以通过自动化的寡核酸合成方法，以低成分实现持续再生产，非常经济。由此，1996年首次开发出利用荧光标记的适配子测量目标蛋白质的基于适配子的生物传感器以来，基于所述适配子的优点及结构特点，开发出各种适配子生物传感器(开发者：
Figure BPA00001563275100011
NICE，26(6)：690，2008)。
作为分离所述适配子的方法，一直以来使用SELEX(SystematicEvolution of Ligands by EXponential enrichment)工艺，但此方法一次只能实现对单一目标分子的适配子分离，一直到可以筛选到高亲和力的适配子或者仅剩少量的核算为止，要重复进行10次以上的放大/分离工序，并且另外还需要亲和度测试，因此，新适配子的开发所需时间较长，其工序复杂。由此，需要开发通过更简单的工序，在短时间内，同时分离出对两个以上的目标物质的适配子的新的适配子筛选工序。并且，也需要开发用于适配子筛选的自动化工序。
近来，为了更快的SELEX工序，引进了几种微流体技术，欲将分离适配子的时间从数个月/数周缩短为数日(Hybarget，et al.，Anal.Bioanal.Chem.，384：191，2006；Windbichler，et al.，Nat.Protoc.，1：637，2006；Eulberg，et al.，Nucleic Acids Research，33：e45，2005)。但是，这些方法并不适合作为更小型化且多元化的适配子筛选工序。针对此问题，本发明的发明人在PCT/US2009/054097号中开发出引用多元技术的微流体装置，但此技术也无法实现多个适配子的分离，只能是对结合于目标分子的适配子进行依序分离，并且，其用于适配子分离的装置也受限制。因此，需要开发出可以更加缩短工序执行时间，适合于对整个工序进行自动化处理的新型装置及工序。
本发明的发明人致力于开发提高效率及实现自动化的新型多元微流体装置及利用其的适配子高通量筛选方法，经努力确认，首先制造利用主要的微细结合通道以外的其他洗脱通道或管体的微流体装置模块，之后，连接各个模块，在数十个或数百个反应腔室内对数十-数百个目标物质同时多发地进行适配子分离，并可以与高通量测序装置或高通量亲和力测试装置连接而实现自动化，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种多元微流体装置，以改善的新方式，同时筛选多个适配子。
本发明的另一目的在于，提供一种适配子筛选方法，通过可实现自动化的新方法，与现有技术相比，更快地筛选多个适配子。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置，其特点在于，包括：
(a)结合通道，用于连接入口及出口；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；
(c)多个洗脱通道，其分别连接于所述多个目标分子结合区域；及，
(d)阀门开关装置。
本发明还提供一种用于适配子的筛选的多元微流体装置，其特点在于，包括：
(a)结合通道，其用于连接入口及出口之间；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；及，
(c)连接区域，用于连接所述多个目标分子结合区域。
本发明还提供一种用于适配子的筛选的多元化芯片，其特点在于，以所述多元微流体装置为一个单位体，包括两个以上所述单位体，所述单位体通过连接区域互相连接。
本发明还提供一种核酸适配子的高通量(high Throughput)筛选方法，其特点在于，包括：
(a)将由具有随机化排列区域的单链核酸构成的核酸群导入至权利要求1至37中任一项所述的多元微流体装置的结合通道，使其与结合通道内的目标分子结合区域的目标分子进行反应的步骤；
(b)从所述多元微流体装置去除未与所述目标分子结合的核酸的步骤；
(c)将与所述目标分子结合的核酸洗脱至所述多元微流体装置的各个洗脱通道或各个连接区域的一侧的步骤；
(d)收集在所述(c)步骤中洗脱的核酸进行放大的步骤；
(e)将在所述(d)步骤中放大的核酸引入至所述多元微流体装置的结合通道，并重复所述(a)至(d)步骤的步骤，
此时，在最后一个重复过程中洗脱的核酸不进行放大步骤；及
(f)将在最终重复过程中洗脱的核酸筛选为适配子的步骤。
本发明还提供包括所述的多元微流体装置的适配子的高通量筛选用套件。
本发明还提供通过高通量测序方法分析通过所述多元微流体装置输出的核酸进行分析的方法。
本发明的其他特征及实施例将通过以下详细说明及权利要求书更加明确。
附图说明
图1为本发明中适配子筛选方法的概略示意图；
图2为包括气压阀门开关装置的5-PLEX微流体装置的概略示意图；
图3为5-PLEX微流体装置的概略示意图，该装置具有阀门开关装置，所述阀门开关装置用于，在洗脱与目标反应的核酸物质时，通过用于分离多个目标分子结合区域之间的结合信道的阀门和其他阀门，调节运行结合通道和洗脱通道之间的转换，“气压阀(Pneumatic valve)1”是用于在与目标反应的核酸物质洗脱时，分离多个目标分子结合区域之间的结合通道，“气压阀(Pneumatic valve)2”用于转换结合通道和洗脱通道之间的运行。
图4为根据图2制造的装置的流程图，(a)为5-PLEX微流体装置，(b)为向主结合通道注入蓝色墨水(包括欲与目标分子结合的适配子的结合溶液)的图片，(c)为利用洗涤溶液进行洗涤工序的图片，(d)为向洗脱通道注入红色墨水(洗脱溶液)的图片，(e)为在阀门运行(valve-on)状态下随着流体通道注入的图片，(f)为运行阀门(valve-on)而使得流体流图各个洗脱通道的图片；
图5为将从多个目标分子结合区域洗脱核酸结合物所需的各个洗脱通道的长度设置成相同长度，并确认洗脱溶液的体积及洗脱速度一致的结果示意图；
图6为根据电信号传输控制图4的情况的示意图；
图7为圆形24多元化SELEX芯片(Multiplex SELEX chip)的一实施例示意图；
图8为24多元化SELEX芯片的另一实施例示意图；
图9为24多元化SELEX芯片的再一实施例示意图；
图10为圆形96多元化SELEX芯片的一实施例；
图11为连接区域，即利用管体连接目标结合区域(反应腔室)的微流体装置的概略示意图；
图12为连接区域，即利用管体连接目标结合区域时，使用管体和通道层间金属销的概略示意图；
图13为连接区域，即利用管体连接目标结合区域时，使用衔接件的示意图；
图14中A为利用管体实现模块连接的多元化芯片的概略示意图，B为模块连接的实际实施例示意图；
图15为本发明中方法的自动化工序执行实施例概略示意图；
图16为利用图2的装置分别分离对BSA(阴性对照)、TBP、IIB、EGFP、HSF的5种目标的适配子后，通过Q-PCR技术确认各个适配子结合到相应的目标物质的曲线图。
具体实施方式
除非以其他形式被定义，本发明说明书中使用的所有技术用语及科技用语与本技术领域的普通技术人员所理解的用语具有相同的含义。通常，本发明说明书所使用的命名法是本技术领域所公知的，是惯用的方法。
在本发明的详细说明中使用的主要用语的定义如下。
本申请中所述的“核酸”为单链或双链DNA、RNA及其化学形式，所述形式并不干涉被筛选核酸的放大，但并不限于此，包括脊柱(backbone)形式、甲基化、异常盐基状组合、5-溴尿嘧啶(5-Bromouracil)的取代等。
在本申请中，“适配子”是指具有高亲和力，可以特殊地识别目标物质的较小的单链寡核酸。
在本申请中，“目标分子”是指选自有蛋白质、多肽、碳水化合物(carbohydrate)、脂质(lipid)、制药代理(pharmaceutical agent)、低分子物质、有机非药物代理(organic non-pharmaceutical agent)及细胞等巨分子复体(macromolecular complex)组成的群，但并不限于此。此时，低分子物质包括指双酚A等非极性低分子化学物质等。
在本申请中，“目标分子结合区域”是指通过溶胶凝胶组合物、珠(bead)等结合有目标分子，从而可以实现适配子结合的反应腔室。
在本申请中，“微流体装置”是指控制或操作μl、nL、pL、fL等微量(micro)标准的极微量溶液的流动的装置。
一方面，如图1所示，本发明提供一种用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置，所述装置可适用于改善的SELEX(X(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment)工序。
本发明中的用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置包括如下结构。
(a)基板，其包括连接入口及出口之间的结合通道；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；
(c)洗脱通道(elution channel)，其分别连接于所述多个目标分子结合区域；及，
(d)阀门开关装置。
在本发明中，在连接入口及出口之间的流体通道内形成有多个目标分子结合区域，因此，连接所述入口及出口之间的流体通道定义为结合通道，分别与所述多个目标分子结合区域连接，从目标分子结合区域洗脱与目标物质结合的核酸分子的流体通道定义为洗脱通道。
本发明的特点是，在一个结合通道内形成有多个目标分子结合区域。此时，包括于各个目标分子结合区域的目标分子为相同的目标分子，或两个以上互不相同的目标分子。优选地，各个目标分子是各不相同的目标分子，此时，目标分子结合区域，即发生目标分子与导入的核酸群的结合的腔室通过结合通道与其他腔室连接，从一端，即从结合通道的入口投入具有随机化排列区域的核酸群，则核酸群进入各个腔室内，与多个目标分子同时结合。由此，可以诱导适配子对各个目标分子的竞争(competition)，可以满足筛选亲和力(affinity)较高的适配子的条件。
在本发明中，所述结合通道及目标分子结合区域是由蒸镀(deposition)于所述基板表面上的基板盖所形成，所述多个洗脱通道也可以由蒸镀于所述基板表面上的基板盖(lid)形成。此时，从所述目标分子结合区域洗脱与目标物质结合的核酸分子时，各个洗脱通道的长度设置成相同长度，使得洗脱溶液的体积和速度一致。
并且，在结合反应时，使得流体通过所述结合通道流入所述多个目标分子结合区域之间，并且在结合结束后，阀门开关装置运行，使得流体并不通过结合通道流动于所述多个目标分子结合区域之间，而是通过连接于各个目标分子结合区域的洗脱通道，洗脱结合于目标分子结合区域的目标分子的核酸。此时，阀门开关装置可以使得多元微流体芯片内的结合通道和洗脱通道之间的转换可以自动调节，包括两个以上装置，即两个以上的阀门，使得各个阀门可以不同运行。例如，阀门开关装置可以包括用于调节结合通道内流体的流动的阀门和将包括结合于所述目标分子的核酸的流体洗脱至洗脱通道的阀门。
上述阀门装置可以调节及优化流体的速度及流动，减少基板盖与基板(chip)之间粘接部分的压力，从而可以降低流体泄露可能性。
阀门开关装置可以是以热、气压、热力气动、液压、静电力、电子力、磁力、相位变化、压电等驱动方式驱动的阀门其中之一(压力阀、频率控制阀门(frequency control-valve)、微阀门(mirco-valve)及方向性阀(cock)等)，但只要是在具有随机化排列区域的核酸群(pool)进行目标分子结合反应时，通过结合通道使得包括所述核酸群的流体流动，之后，在洗脱结合于各个目标分子的核酸时，使得包括与所述目标分子结合的核酸的流体流动于所述洗脱通道的阀门开关装置就不受所述阀门的限制。
此时，所述压力阀利用水压、气压等压力变更流体的流向，微型阀是人为地插入微细大小的2-way或3-way阀门，根据人为选择，通过洗脱通道或者结合通道实现流体的流动。并且，使用方向性阀的装置是具有方向性的活动性开关装置，是在集成反应时，即执行核酸的目标分子结合反应时，以水平开关，使得流体通过结合通道流动，个别洗脱结合的核酸时，以垂直开关，使得流体通过洗脱通道洗脱的阀门开关装置。
如图2所示，本发明的实施例中制造出了包括气压阀门开关装置的5-plex微流体装置，所述装置一次可以对5个目标分子的适配子进行筛选。本发明中的5-PLEX微流体装置(5-plex SELEX-on-a-Chip)包括：底部，其包括作为加热装置的金属电极；腔体；通道；及，盖体部，其用于形成阀门开关装置(压力阀)(图2中的①)。底部起到洗脱与目标分子结合的核酸的加热装置(heater)的作用，所述底部用PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)涂布了芯片，所述芯片是5个焊条加热器(heater electrode)被铬/金(Cr/Au)所图案化(图2中的②)，基板盖在其上部形成了具有连接5个腔体和腔体之间的通道的第一个层(图2中的③)，并且在其上部形成了作为基板盖的、构成气压阀的第二个层(图2中的④)及起到支撑台作用而使得流体及气压顺利进入的第三个层(图2中的⑤)。此时，所述基板盖都由PDMS形成。
适配子-目标物质的反应腔室的直径为1.8mm，高为30μm，通道的宽度为0.28mm。用于施加气压的腔体的直径为0.5mm，高度为30μm，通道宽度为0.2mm。为了贴合PDMS和PDMS，在大气压条件下利用等离子进行表面处理，使其具有超亲水性并利用于粘合技术，用于表面处理的Ar/O2的暴露时间为2秒。
设置于所述目标分子结合区域之间，即连接腔体和腔体的通道上的气压阀，在通道中形成气压而阻拦流体从腔体流入至另一腔体，使得流体分别独立流入至各个洗脱通道。并且，如图3所示，利用另外的阀门可以自动调节结合通道与洗脱通道之间的转换。即，如图4所示，将核酸结合于目标分子时，打开气压阀，使得包括核酸群的流体从腔体流入至腔体，并结合于各个目标分子，洗脱时，利用气压阀阻拦流体的流动，并使得金属电极部分(腔体)发热，使得流体无交叉污染(cross-contamination)地分别从各个腔体流出。
并且，在本实施例中，将用于从多个目标分子结合区域洗脱核酸结合物的各个洗脱通道的长度设计为相同长度，结果，确认到洗脱通道的体积及洗脱速度一致(图5)。此时，为了在洗脱通道中将通道长度设计成相同长度，将流速统一，可以将“阻力”(通道的弯折)适用于洗脱通道。
从电信号流(Signal flow)角度图示利用气压阀的实验的情况如图6所示。利用被电信号控制的气压系统机械输入(Mechanical input)至腔体的气压(P)诱导V腔室组(Vchamber Array)的隔膜(diaphragm)的变形，这种变形(δ)起到阻拦流动的流体的阀门作用，所述电信号是利用鼠标或键盘输入。
并且，本发明中的用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置可以如图7至图10设计。
图7为24多元化SELEX芯片(Multiplex SELEX chip)，其设计成圆形使得芯片的形状更加简单。所述芯片如喷泉，可实现同时洗脱(elution)，可提高效率。特别是，在圆形内部可以设置多个腔体(Chamber)，可以实现更多的SELEX。此时，优选在芯片内部设置泵体，实现自动SELEX。
并且，图8也是24多元化SELEX芯片，可以在一个模具(mold)上制造6个左右，可一次性制造多个芯片，还可提高实验时的效率。此时，可以扩大芯片的大小，从而可以实现24个以上的SELEX芯片，并且各个腔体为独立形状，不会受到旁边的溶胶凝胶的影响。
并且，图9也是24多元化SELES芯片，该图中也可以将芯片大小扩大而实现24个以上的更多的SELEX芯片。
并且，图10为96多元化SELEX芯片，其涉及为圆形(Disc-type)，芯片形状简单，可以缩小芯片大小而设计。所述芯片如喷泉，可实现同时洗脱(elution)，可提高实验效率。特别是，在圆形内部可以设置多个腔体(Chamber)，可以实现更多的SELEX。此时，优选地，在芯片内部设置泵体，实现自动SELEX。
本发明中用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置，还包括以下结构。
(a)基板，其包括连接入口及出口之间的结合通道；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；及，
(c)连接区域，用于连接所述多个目标分子结合区域。
在本发明中，所述连接区域的一端可以从其一侧或两侧的目标分子结合区域分离，如图11所示，其可以为管体(tube)。并且，在本发明中，所述结合通道及目标分子结合区域可以通过蒸镀于所述基板表面上的基板盖(lid)形成，所述管体连接至各个目标分子结合区域的孔(hole)，所述孔也是通过蒸镀于所述基板表面上的基板盖(lid)所形成，此时，连接方法有“管体与所述目标分子结合区域的孔间的直接连接，汉密尔顿注射器的针与所述目标分子结合区域的孔之间的直接连接”等方法，但这种连接会出现反应物的泄露、无法再利用等问题点。为此，本发明如图12所示，在目标分子结合区域，即用于产生结合反应的腔体件连接的管体的切割部位上，用金属销进行连接，使得腔体的注入口与管体的连接及分离更加自由，并且可连续使用。
并且，在本发明的实施例中，为了防止基板与形成所述目标分子结合区域的孔的基板盖之间的翘起现象，如图13所示，另行蒸镀了衔接件(adapter)结构。此时，衔接件优选由PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)形成的板型结构物。通过设置衔接件，可提高管体与通道层之间的连接度，从而实现基板表面与基板盖之间的强力贴合。
在本发明的装置中，目标分子结合区域，即反应腔室的目标分子可通过各种方法固定。例如，利用溶胶凝胶阶段曝气法可以固定各种物质，例如化学物质、肽等低分子物质、蛋白质、抗体、细胞等，可以无结构变化地以活性状态固定于反应腔体内。并且，可以在反应腔室内捕获螯合亲和层析柱(Ni-NTA-agarose)珠(bead)、磁性珠、谷胱甘肽表面处理珠、与环氧树脂等反应的物质和bead的复合体，根据各种目标分子的应用，可以固定各种bead。并且，随着在各个反应腔室内固定不同种类的细胞，可以开发针对表达于细胞表面的物质的适配子。
此时，为了防止目标分子结合区域，即反应腔室之间的异物污染或目标分子-bead复合体之间的混淆，优选地，可以使用薄膜(membrane)过滤器。即，在制造PDMS盖(lid)时，将两种试剂(reagent)混合后，在硬化之前，提前将薄膜帖于用于管体连接的孔部分而硬化，完全硬化后，打孔而与管体连接，此方式可以防止腔体之间的异物污染。由此，本发明可以在目标分子结合区域之间附加设置过滤器。
结合于上述目标分子结合区域的目标分子的核酸，通过阀门开关装置从洗脱通道洗脱，或通过目标分子结合区域的连接区域的一端而洗脱，根据固定于目标分子结合区域，即反应腔室的物质，结合于目标分子的核酸分子的分离可以直接适用于以各种方法开发的芯片上。例如，可以通过高浓度氯化(NaCl，KCl，MgCl2，Tris等)、pH变化(HCl，NaOH处理)方法变化核酸的三位结构，从而可以诱导出亲密度缺陷，通过尿素(Urea)处理来诱导目标蛋白质的结构变化，从而分离核酸。除此之外，还有根据浓度变化的竞争分离法，可以通过高浓度咪唑(Imidazole)、谷胱甘肽(Glutathione)处理来诱导竞争分离结合，如果是对化学品的核酸分离，则通过高浓度化学品处理来激发核酸分子结合竞争来进行分离。
但是，在本发明的实施例中，是利用热来分离结合于目标分子的核酸分子。适配子是在形成结构时具有对目标物质的结合力，这种结构是根据盐基之间的氢结合而形成。可以激发DNA或RNA的热改性的温度称为溶解温度，在比溶解温度略高的温度条件下，盐基之间的氢结合会断开，使得适配子的结构拆解，失去对目标物质的结合力，从而可以从目标分离(elution，洗脱)。通常，洗脱适配子的温度为65～95℃。
在本发明的一实施例中制造的SELEX芯片(SELEX-on-a-chip)中，在芯片上蒸镀金属电极，形成增加电阻值的结构而产生较高的热量，从而实现适配子的分离洗脱。通过对适用热条件的最佳化(寻找仅影响适配子的结构变化的温度条件)，诱导高纯度适配子洗脱。此时，优选地，可以使现有的分离方法与芯片上产生的热一起融合适用。
此时，本发明的装置将作为加热装置的电极中的一个电极靠近所述多个目标分子结合区域而设置，或者，多个电极分别靠近各个目标分子结合区域而分别设置。在本发明人的专利PCT/US2009/054097号中，为了防止结合于形成在一个流体通道内的目标分子结合区域的目标分子的核酸被混合，依次洗脱，在各个目标分子结合区域的下端部分别形成独立地电极，与此不同地，在本发明中，利用一个电极对整个目标分子结合区域进行加热，实现核酸分子同时分离。在此，金属电极的材质只要是可以发热的材料即可(例如，Al、Cr/Au等)。如图8至图10所示，所述优点特别是可以几何级数减少了同时对多个目标分子进行SELEX时的时间。在以往的专利中，因低效率的洗脱时间，无法实现24plex以上的高速筛选，但是通过阀门装置的开关装置，提高了高速筛选效率，实现了24-flex、96-flex等多重分析。
在本发明中，为了防止在阀门驱动及管体连接时的反应物的泄露，改善了以下几点。即，在本发明的实施例中，调节及优化流体速度及流动，减少基板盖和基板(chip)帖合部分的压力，从而减少流体的泄露。并且，在玻璃基板表面涂布PDMS(Polydimethylsiloxane)，形成腔体和通道的基板盖也用PDMS形成而构成“全部PDMS芯片(All PDMS Chip)”，结果，提高了芯片和基板盖部分的粘着力，从而减少了流体的泄露。即，在本发明中，基板是由如PDMS、PMMA(polymethylmethacrylate，聚甲基丙烯酸甲酯)及聚苯乙烯(polystyrene)等塑料、玻璃、硅胶及金(Gold)等金属其中之一形成，优选地，所述基板是由PDMS(Polydimethylsiloxane)涂层。此时，所述基板盖由PDMS(Polydimethylsiloxane)形成，从而构成All PDMS Chip结构。并且，优选地，利用使得基板和目标分子的固定更加容易的化合物，即PVAc、聚醋酸乙烯酯等进行涂层。
在本实施例中，由PDMS形成基板盖，此时，通过调整基板盖厚度来降低无流体流动时通道内产生的反压(back pressure)。并且，较薄地设计PDMS基板盖，从而可以提高阀门驱动效率。即，优选地，所述PDMS基板盖的厚度＜200μm，更优选100～200μm。
并且，上述基板盖由聚苯乙烯(polystyrene)形成，基板由塑料、玻璃或硅胶形成，如塑料-聚苯乙烯、玻璃-聚苯乙烯、硅胶-聚苯乙烯等来构成装置。
本发明中的多元微流体装置可以该装置为基本单位(模块)，连接两个以上而使用，从另外一个角度，本发明是涉及用于适配子筛选的多元化芯片，其以所述多元微流体装置为一个单位体，包括两个以上，所述单位体通过连接区域互相连接。此时，利用管体或通道串联或并联基本单位体，从而构成多元化芯片。并且，优选地，连接所述基本单位体的连接区域上设置过滤器，可以防止基板单位体之间的异物污染。
从另一个观点上，本发明涉及核酸适配子高通量(high Throughput)筛选方法，所述方法利用上述多元微流体装置。此时，本发明的筛选方法包括如下步骤。
(a)将由具有随机化排列区域的单链核酸构成的核酸群导入至上述多元微流体装置的结合通道，使其与结合通道内的目标分子结合区域的目标分子进行反应的步骤；
(b)从所述多元微流体装置去除未与所述目标分子结合的核酸的步骤；
(c)将与所述目标分子结合的核酸洗脱至所述多元微流体装置的各个洗脱通道或各个连接区域的一侧的步骤；
(d)收集在所述(c)步骤中洗脱的核酸进行放大的步骤；
(e)将在所述(d)步骤中放大的核酸引入至所述多元微流体装置的结合通道，并重复所述(a)至(d)步骤的步骤，
此时，在最后一个重复过程中洗脱的核酸不进行放大步骤；及
(f)将在最终重复过程中洗脱的核酸筛选为适配子的步骤。
本发明的上述方法可以对具有不同的随机化排列区域的1×109～15个核酸群进行。随机化(randomized)此用语用于叙述在规定长度内具有任意可能的排列的核酸的段(segment)。随机化排列可以根据需要具有8-100核苷酸以上范围的各种长度。因为可能存在的无法预知的偏向性或核苷酸选择性，形成随机化排列段的化学或酶反应有可能无法生成计算出的随机化排列。随机化一用语是为了反应上述偏向可能性，代替随机而使用。在已公知的依次化学合成等技术中，并没有发生很大的偏差。在较短的段中，可能存在的极小的偏向性是可以无视的。
特别是本方法需要对向核酸测试混合物的初期制造。个别的测试核酸可以具有保存于混合物内的所有核酸的排列和构成侧面的随机化区域。保存区域是为了使得核酸的放大及筛选更加容易而设置。在本领域中这样的排列较多，因此，在排列的选择上，本领域的普通技术人员可以与指定的放大方法一同进行选择。随机化区域可以具有完全或部分随机化排列。选择性地，核酸的该部分可以具有混合物的所有核酸类中的固定的副部分的同时，一同具有随机化副部分。例如，被公知为与标记蛋白质结合的，或为了结合而被筛选的排列区域与随机化区域成为一体，从而可以改善结合性或结合的特异性。测试混合物的排列多样性，可以通过在筛选/放大工序中对测试混合物的核酸产生变异而引入或放大。原则上，被测试混合物采用的核酸可以根据其可以放大的情况具有任意长度。本发明方法是在多个排列变异体中进行筛选的方法中最实用的方法。并且，优选地，本发明的方法被采用于约4盐基到任意可到达的大小的核酸排列的结合的评价。
在本发明中，包括于所述多元微流体装置的各个目标分子结合区域的目标分子是相同的目标分子或两个以上互不相同的目标分子。优选地，各个目标分子为互不相同的目标分子，此时，目标分子结合区域，即发生目标分子和导入的核酸群之间的结合的腔体，通过结合通道与另一腔体连接，因此，从一端，即从结合通道的入口注入具有随机化排列区域的核酸群，则核酸群进入各个腔体，与多个目标分子同时进行结合。由此，对各个目标分子可以诱导适配子竞争(competition)，从而可以满足筛选亲和力(affinity)高的适配子的条件。
上述目标分子，例如，蛋白质、多肽、碳水化合物(carbohydrate)、脂质(lipid)、制药代理(pharmaceutical agent)、低分子物质、有机非药物代理(organic non-pharmaceutical agent)及细胞等巨分子复体(macromolecular complex)等，只要是可以成为适配子的目标的分子，则不受限制。
导入至上述装置的核酸群，在优选与目标分子的结合的条件下，与所述目标分子接触，在所述核酸群中可与目标分子特异结合的核酸与所述目标分子结合形成核酸-目标分子对。由此，可以去除随之产生的未结合核酸。
并且，在本发明的步骤中，“放大”意味着分子的复制或增加分子种类的量或数的工序或工序组合。此时，所述“放大”过程可以是PCR过程，其包括：被筛选RNA的cDNA复制制造步骤；利用聚合酶连锁反应增加各个cDNA的复制数的步骤；及，转录(Transcription)cDNA复制而获得与被筛选的RNA具有相同排列的RNA分子的步骤。即，如本技术领域的普通技术人员所公知，包括直接DNA复制、直接RNA放大等方法，本领域公知的反应或反应的组合都可适当利用。从结果上来说，放大方法必须在放大混合物的比例上体现出初始混合物内的不同的排列比例。
并且，在本发明的方法中，可以将上述多元微流体装置作为基本单位(模块)，连接两个以上而使用。即，利用管体或微细结合通道，串联及并联所述基本单位而构成多元化(multiplex)芯片。例如，可以连接24个4plex芯片(4-plex chip)改善为96孔板(96-well plate)类型的芯片。这样模块化后，根据实验目的，使用数十或数百个孔板类型的芯片，这种方法容易适用于序列分析(例如，Solexa，测序技术)、物质间结合力分析(如Octet)来实现自动化。
并且，在本发明中，上述(e)的重复步骤是一直重复到达到规定的筛选度为止，例如，可以最初实验混合物，即，具有随机化排列区域的核酸群中的特定核酸达到指定的结合程度，或者获得混合物中最小核酸为止重复。
利用本发明的多元微流体装置，即使进行不到6次的重复过程也可以筛选出适配子。即，上述重复次数可以小于6次，优选地为1-3次。
再者，在本发明方法的各个重复过程中，利用高通量测序方法(highthroughput sequencing)对从上述多元微流体装置洗脱的核酸进行序列分析，之后，比较在各个重复过程中利用高通量测序方法分析的序列，将根据重复次数的增加，其相对比例也增加的核酸序列筛选为适配子。此时，因利用高通量测序方法而无需执行复制(cloning)，因此可更快更简单地筛选适配子。即，利用生物信息学(Bioinformatics)分析工具可以缩减SELEX步骤。
执行上述高通量测序方法的装置与上述多元微流体装置的各个洗脱通道或各个连接区域的一侧连接，可直接执行步骤。现有技术中是再筛选对目标物质的适配子之后，复制于T-载体，对个别的适配子进行盐基序列分析。但是，其缺点是复制麻烦，只能是对适配子挨个进行序列分析，并且在多元化SELEX中，对很多适配子需另行进行序列分析。本发明的实施例连接代测序技术(Solexa)方式的高通量测序方法(High-throughput sequencing)，无需进行复制，对适配子池可以进行一次性的序列分析，利用具有个别条形码的衔接件，对各种目标的适配子或各个SELEX过程的适配子池进行一次性的序列识别而另行进行分析。目前已经出台了标记96中条形码而对96中目标或各个过程中的适配子进行序列分析的技术。作为高通量测序方法，例如，Solexa、Solid技术等，但并不限于此，只要是可以同时对大量序列进行高通量分析即可。
并且，上述(f)步骤对最终洗脱的核酸进行进一步的目标分子亲和力测试，将亲和力被确认的核酸筛选为适配子。所述目标分子亲和力测试为高通量亲和力测试方法，例如，作为高通量亲和力测试可以利用八隅体系统(Octetsystem)，八隅体系统利用BLI(Bio-Layer Interferometry，干涉技术)技术，可以进行用于活体物质之间结合分析的无标记(Label-free)动力分析(kinetic analysis)及定量(quantitation)的装置。BLI(Bio-LayerInterferometry)是在传感器表面的光层(Optical-layer)上发生物质之间的结合时，传感器表面的厚度发生变化，此厚度变化表示为贯通传感器表面而被反射的白色光的波动图案变化，从而测量物质之间的结合的技术。此技术可以在两个小时内对96个试剂进行动能筛查(kinetic screening)或亲和性标记试验(affinity test)，从而可以进行多元化，并且不仅对蛋白质，对肽或低分子物质之间的相互作用也可以进行测量。并且，所述传感器无需标记，因此不但简单容易，并且与其他无标记技术不同地，可以直接检测试料表面，因此不具有流体系统中存在的各种问题点。由此，以本发明的微流体装置为基本单位，以96孔板式(96well plate type)提供，并将此连接至八隅体(Octet)系统。
由此，如图15所示，本发明方法的各个步骤可以自动化实现。以往的SELEX工序是生物相关试验的集合体，在每个步骤中根据试验者的能力及经验，试验的成功与否也不同。因此，需要较高的规格化及自动化。
但是，本发明的装置为SELEX-芯片(SELEX-on-chip)，根据通用的96/384-孔板规格设计，通过与现有装置连接而实现SELEX整个过程的自动化。并且，本发明中的装置，即SELEX-芯片(SELEX-on-a-Chip)以单一的单位体(模块)形式构成，利用管体将基本单位串联及并联连接，从而构成多元化芯片(如，96孔型、384孔型等)，通过利用规格化的SELEX芯片和管体的物理连接，或利用阀门装置的腔体开关的驱动，自动调节向96孔板(96-well plate)的适配子分离及回收。由此，易于适用在现有的基于96/384孔板的分析仪器(PCR，High Throughput sequencer，affinity测量装置)。
在本发明的实施例中，利用图2的5-plex微流体装置，作为对BSA(阴性对照组)、TBP、IIB、EGFP、HSF 5种目标的适配子，分别分离出1O1apt(以TBP为目标的适配子)、b4apt(以IIB为目标的适配子)、GFPapt(以EGFPfmf为目标的适配子)及HSFapt(以HSF为目标的适配子)。之后，为了确认根据本发明的装置及方法分离的适配子是否与该目标物质结合，利用StepOne-PlusRT PCR(Applied Biosystems，美国应用生物系统公司)进行了Q-PCR。
结果，如图16所示，确认到分别以TBP、IIB、EGFP、HSF为目标分离的各个适配子对原来的各个目标的亲和力较高。在图16的曲线图中，Y轴的量(Quantity)数值越高，结合时的亲和力也越高。
再者，为了提高便携性，本发明的方法可以套件(kits)形式提供。即，从另一个角度来说，本发明涉及包括上述多元微流体装置的适配子高通量筛选用套件。此时，所述套件可以将用于洗脱核酸的放大及序列分析的试剂装于另外的容器或另外的反应部而提供。
所述适配子的高通量筛选用套件可以使瓶、桶(tub)、小袋(sachet)、信封(envelope)、管体、小瓶(ampoule)等形状，这些套件的部分或整体可以由塑料、玻璃、纸、箔纸、蜡等形成。容器上可以设置盖体，该盖体可以是容器的一部分，或者通过机械、粘贴或其他手段而帖附于容器，该盖体与容器可部分或完全分离。容器上还可以设置有塞子，该容器通过该塞子，利用注射针来靠近内容物。所述套件可以包括外部包装，该外部包装可以包括有关构成部分的使用的使用手册。
工业利用性
如上所述，本发明涉及用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置及利用其的核酸适配子的高通量筛选方法。本发明中的多元微流体装置不仅可以同时检测对多个目标的各个适配子，与现有的多元化技术相比，可以大大缩减处理量及处理时间，特别是将本发明的装置与高通量测序方法连接而执行适配子筛选工序，从而可大幅减少目标结合/分离/放大工序过程，实现自动化工序，是非常有利的技术。
如上详细记载了本发明内容中的特定部分，本技术领域的普通技术人员可以知道上述记载仅为较佳实施例，本发明并不限于此。从而，本发明实际上的保护范围是由权利要求书及其等价部分所定义。

Claims (54)

1.一种用于核酸适配子的筛选的多元微流体装置，其特征在于，包括：
(a)结合通道，用于连接入口及出口；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；
(c)多个洗脱通道，其分别连接于所述多个目标分子结合区域；及，
(d)阀门开关装置。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述结合通道及目标分子结合区域是由蒸镀于所述基板表面上的基板盖所形成。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述多个洗脱通道由蒸镀于所述基板表面上的基板盖(lid)所形成。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述阀门开关装置是在结合反应时，使得流体通过所述结合通道流动于所述多个目标分子结合区域之间，在结合结束后，使得流体并不是通过所述结合通道流动于所述多个目标分子结合区域之间，而是使得包括结合于目标分子的核酸的流体洗脱至连接于各个目标分子结合区域的洗脱通道。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述阀门开关装置包括：用于调节所述结合通道内的所述流体的流动的阀门；及，将包括结合于所述目标分子的核酸的流体洗脱至所述洗脱通道的阀门。
6.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述阀门开关装置以热、大气压、热力气动、液压、静电力、电子力、磁力、位相变化及压电其中之一作为阀门开关的驱动因素。
7.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，将所述多个洗脱通道的长度设置为相同的长度，使得洗脱至所述洗脱通道的洗脱溶液的体积及洗脱速度一致。
8.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括洗脱装置，其用于使得与所述各个目标分子结合区域的目标分子结合的核酸洗脱至与所述各个目标分子结合区域连接的各个所述洗脱通道。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述洗脱装置为加热装置，所述加热装置靠近所述结合通道的多个目标分子结合区域而设置。
10.根据权利要求9所述的装置，其特征在于，所述加热装置为电极。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，一个所述电极靠近所述多个目标分子结合区域而设置。
12.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，多个所述电极靠近所述各个目标分子结合区域而分别设置。
13.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述基板盖由聚二甲基硅氧烷PDMS形成。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述PDMS基板盖的厚度为100～200μm。
15.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基板由塑料、玻璃、硅胶及金属其中之一形成。
16.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述塑料为PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA及聚苯乙烯其中之一。
17.根据权利要求15所述的装置，其特征在于，所述基板由PDMS、PVA及聚醋酸乙烯酯其中之一涂层。
18.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述基板盖由聚苯乙烯形成，所述基板由塑料、玻璃及硅胶其中之一形成。
19.根据权利要1所述的装置，其特征在于，在所述目标分子结合区域之间还设置有过滤器。
20.一种用于适配子的筛选的多元微流体装置，其特征在于，包括：
(a)结合通道，其用于连接入口及出口之间；
(b)多个目标分子结合区域，其形成于所述结合通道内；及，
(c)连接区域，用于连接所述多个目标分子结合区域。
21.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述连接区域的一端可与一侧或两侧的目标分子结合区域分离。
22.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述连接区域为管体。
23.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述结合通道及目标分子结合区域是由蒸镀于所述基板的表面上的基板盖所形成。
24.根据权利要求22所述的装置，其特征在于，所述管体连接至所述目标分子结合区域的孔，所述孔形成于蒸镀于所述基板的表面上的基板盖上。
25.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，所述管体通过金属销连接至所述目标分子结合区域的所述孔。
26.根据权利要求24所述的装置，其特征在于，在所述管体和所述目标分子结合区域之间还蒸镀有衔接件。
27.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，还包括洗脱装置，所述洗脱装置使得与所述各个目标分子结合区域的目标分子结合的核酸洗脱至与所述各个目标分子结合区域连接的各个所述洗脱通道的一侧。
28.根据权利要求27所述的装置，其特征在于，所述洗脱装置为加热装置，所述加热装置靠近所述结合通道的多个目标分子结合区域而设置。
29.根据权利要求28所述的装置，其特征在于，所述加热装置为电极。
30.根据权利要求29所述的装置，其特征在于，一个所述电极靠近所述多个目标分子结合区域而设置。
31.根据权利要求29所述的装置，其特征在于，多个所述电极靠近所述各个目标分子结合区域而分别设置。
32.根据权利要求23所述的装置，其特征在于，所述基板盖由聚二甲基硅氧烷PDMS形成。
33.根据权利要求32所述的装置，其特征在于，所述PDMS基板盖的厚度为100～200μm。
34.根据权利要求20所述的装置，其特征在于，所述基板由塑料、玻璃、硅胶及金属其中之一形成。
35.根据权利要求34所述的装置，其特征在于，所述基板由PDMS、PVA及聚醋酸乙烯酯其中之一涂层。
36.根据权利要求23所述的装置，其特征在于，所述基板盖由聚苯乙烯形成，所述基板由塑料、玻璃及硅胶其中之一形成。
37.根据权利要20所述的装置，其特征在于，在所述目标分子结合区域之间还设置有过滤器。
38.一种用于适配子的筛选的多元化芯片，其特征在于，以权利要求1至37中任一项所述的多元微流体装置为一个单位体，包括两个以上所述单位体，所述单位体通过连接区域互相连接。
39.根据权利要求38所述的多元化芯片，其特征在于，所述单位体之间的连接区域为管体或通道。
40.根据权利要求38所述的多元化芯片，其特征在于，在所述单位体之间的连接区域还设置有过滤器。
41.一种核酸适配子的高通量筛选方法，其特征在于，包括：
(a)将由具有随机化排列区域的单链核酸构成的核酸群导入至权利要求1至37中任一项所述的多元微流体装置的结合通道，使其与结合通道内的目标分子结合区域的目标分子进行反应的步骤；
(b)从所述多元微流体装置去除未与所述目标分子结合的核酸的步骤；
(c)将与所述目标分子结合的核酸洗脱至所述多元微流体装置的各个洗脱通道或各个连接区域的一侧的步骤；
(d)收集在所述(c)步骤中洗脱的核酸进行放大的步骤；
(e)将在所述(d)步骤中放大的核酸引入至所述多元微流体装置的结合通道，并重复所述(a)至(d)步骤的步骤，
此时，在最后一个重复过程中洗脱的核酸不进行放大步骤；及
(f)将在最终重复过程中洗脱的核酸筛选为适配子的步骤。
42.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述核酸群包括具有不同的随机排列区域的1×109～15个核酸。
43.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流体装置包括具有互相不同的目标分子的目标分子结合区域。
44.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流体装置包括具有相同目标分子的目标分子结合区域。
45.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述目标分子选自由蛋白质、多肽、碳水化合物、脂质、制药代理、低分子物质、有机非药物代理及巨分子复体构成的群中。
46.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流体装置设置有两个以上。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述多元微流体装置通过管体或通道连接。
48.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，在各个重复过程中，利用高通量测序方法，对从所述多元微流体装置洗脱的核酸进行序列分析，之后，比较在各个重复过程中通过高通量测序方法分析的序列，将根据重复次数的增加其相对比例也增加的核酸序列筛选为适配子。
49.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述(e)步骤的重复次数为1至6次。
50.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，执行所述高通量测序方法的装置与所述多元微流体装置的各个洗脱通道或各个连接区域的一侧连接。
51.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述(f)步骤对最终洗脱的核酸进行进一步的目标分子亲和力测试，将亲和力被确认的核酸筛选为适配子。
52.根据权利要求51所述的方法，其特征在于，所述目标分子亲和力测试为高通量亲和力测试。
53.根据权利要求41所述的方法，其特征在于，所述各个步骤以自动化方法执行。
54.一种包括权利要求1至权利要求37中任一项所述的多元微流体装置的适配子的高通量筛选用套件。
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