WO2021174327A1 - Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos - Google Patents

Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos Download PDF

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WO2021174327A1
WO2021174327A1 PCT/BR2021/050096 BR2021050096W WO2021174327A1 WO 2021174327 A1 WO2021174327 A1 WO 2021174327A1 BR 2021050096 W BR2021050096 W BR 2021050096W WO 2021174327 A1 WO2021174327 A1 WO 2021174327A1
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target
aptamers
cells
cultivation
microfluidic device
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PCT/BR2021/050096
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Erika DE SIMONE MOLINA
Emerson GALVES MORETTO
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Bioptamers Ltda
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the invention described herein relates to the specificity of aptamers and target therapy in the field of personalized medicine. More specifically, to one or more microfluidics devices, method, components and system for cell culture and development of aptamers with greater specificity for the target of interest through the SELEX technique. In particular, it refers to modeling aggressive types of cancer to develop aptamers tailored to a patient.
  • Cancer contemplates a group of diseases that, in common, have uncontrolled cell division with the potential to spread to other parts of the body. Especially for the most aggressive types of the disease, conventional chemotherapy treatment is the main cause of patient survival incompatibility.
  • a targeted therapy works by targeting the differences that support cancer cell survival and growth.
  • the identification of new anticancer compounds can be done through libraries of combinatorial molecules and ligand evolution processes.
  • a technique known as SELEX from Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, has stood out in the identification and selection of molecules called aptamers.
  • the aptamers consist of synthetic molecules, that is, non-naturally occurring, which present a specific interaction against a target molecule. Strategically, through this interaction, the affinity of a combinatorial nucleic acid library is enriched by SELEX from consecutive steps of exposure, capture and amplification of the species with the greatest capacity to bind the target of interest.
  • aptamers interact and have a desirable target reaction, in this case cancer cells, and can modify their functional activity or even locate, guide, position and deliver other compounds with therapeutic interest.
  • aptamers by SELEX it is possible to introduce negative selection steps against non-targets, that is, other cell types that are not of therapeutic interest.
  • the combinatorial library is incubated with the negative target and an attempt is made to discard the molecules bound to it, in order to amplify the species that can be called non-binding.
  • negative selection results in aptamers specific to the targets of interest, with no affinity for the negative targets.
  • the degree of specificity of the aptamers has proved to be insufficient to discriminate cell populations in practice, even after the negative selection steps during SELEX.
  • the present invention describes the precision in personalized targeted cancer therapy from the combination of bioengineering and molecular biology techniques. In particular, it materializes in microfluidic devices replicating individual systemic models of patients, thus improving the degree of specificity for the identification of personalized therapeutic molecules.
  • the present invention provides a method for treating cancer, comprising the ex vivo modeling of the patient through the cultivation of their cancerous and non-cancerous cells, taking into account the emergence of systemic properties for the development of personalized target therapies.
  • the invention stipulates a method for systemic modeling of the patient according to the location of cancer cells, considering the configuration of interactions and composition between different cell populations in the device, allowing a scan of molecules of interest.
  • the invention also offers a method for favoring the balance between binding affinity and dissociation constant of molecules of interest in a relevant environment, considering the competition between the positive and negative targets for the molecules of interest and according to the composition and connection of different cell populations.
  • FIG. 1 illustrates the general structure of the microfluidic device according to the present invention and shows details of the substrate forming a central chamber with a permeable bottom and framework function for isolating the target of interest;
  • FIG. 2 illustrates the layers of materials composing the substrate and shows details of the channels of the central chamber for connecting an inlet and an outlet.
  • FIG. 3 illustrates an example of combination of devices for systemic modeling of patients from connections between cell cultures and indicates the flow operation in the device controlled by a peristaltic pump.
  • FIG. 4 illustrates connections of devices combined in series and in parallel.
  • nucleic acids or “oligonucleotides” mean DNA, RNA or any “XNA” molecules, understood as any chemically modified oligonucleotide that does not prevent its copying by biochemical methods, such as PCR or sequential chemical synthesis. Illustrations of these modifications are, but are not limited to: replacement of nucleotide hydroxyl groups with halogens or methyl ether groups; use of chiral nucleotides; use of xeno nucleic acids and the like.
  • Target refers to any entity with a targeting interest.
  • a target could be: cell populations of interest, in this case the target or molecular complex could be located both on the cell surface and in internal structures; or directly an organic or inorganic molecule, but especially protein, polypeptide, lipid, lipoprotein or glycoprotein.
  • aptamer refers to non-naturally occurring nucleic acids that fold into three-dimensional structures upon which a specific interaction against the target molecule is obtained.
  • the specific interaction of the aptamer can confer an effect, among others, of binding to the target and reaction with modification of functional activity, which can induce activation, inhibition and facilitation of a reaction between the target and other molecules.
  • a "library of molecules” mentioned throughout this document refers to sets of compounds that contain varying amounts of different chemical species. This library can have varying degrees of diversity, like combinatorial oligonucleotide libraries. The library of molecules can also have the property of randomness, in the sense that, in general, almost all three-dimensional configuration possibilities given by the molecules' degrees of freedom are achieved by the library's binders. This library can be synthesized using various methods already known to those skilled in the art, or purchased commercially from third parties.
  • cancer refers to the group of diseases that in common have uncontrolled cell division with potential to form local solid tumors and metastases in other parts of the body. It also refers to neoplasms, cancer cells and cells that are malignantly transformed spontaneously or from environmental factors.
  • cells refers to cell populations and especially, but not exclusively, explants, punctures, biopsies, primary cultures, immortalized or primary cell lines, dissociated cell culture, histotypic or organotypic. It also refers especially, but not exclusively, to mammalian cells and which may or may not originate from a particular patient.
  • non-cancerous cells refers to cells in a physiological context and not malignantly transformed, and may originate from explants, punctures, biopsies, primary cultures, immortalized cell lines or not, dissociated cell culture, histotypic or organotypic. It also refers especially, but not exclusively, to mammalian cells that may or may not come from a particular patient.
  • explants refers to laboratory-grown mammalian tissues, which may or may not be obtained by surgical extraction from a particular patient, for whom the present invention may be useful in the generation of aptamers against the cancer. It also refers to any other animal tissue cultured in the laboratory or extracted by surgery.
  • liquid medium of circulation in the microfluidics system which can be composed of, but not limited to, buffer solutions, culture media, blood plasma derivatives of human or animal origin.
  • this invention refers to semi-permeable membranes for the accommodation and confinement of cell cultures without limiting communication to cell co-cultures through fluid circulation.
  • the present invention includes a central chamber containing at the bottom a semi-permeable insert for anchoring or scaffolding function for the culture of cells of interest and also immobilization for displaying libraries of molecules.
  • the chambers in this invention can have different sizes and shapes according to the designed support.
  • linker is used in the present invention as any chemical species with a specific three-dimensional structure capable of binding to other species chemical.
  • linkers in the context of this invention are, but are not limited to: oligonucleotides, peptides and proteins.
  • molecule expresses a set of atoms, which can be identical or different, arranged by covalent bonds. It is used as a reference to component species of substances, which can be transformed through chemical reactions, generating new chemical species.
  • Microfluidics and its grammatical derivatives, when used to describe the present invention, refer to the technique well known to those skilled in the art that uses devices and tools to accurately control, in an orchestrated and planned manner, flow paths of a fluid, the proportions of the composition of solutions and their combinations in association or not with any process or physical and/or chemical analysis, working in the pico, nano, micro or milliliter scales.
  • non-target or “negative target” refers to the opposite description of "target”, that is, what is not intended to establish interactions between species.
  • a negative target is used to remove binding species that have the undesirable function of interacting with species other than the targets.
  • the term "appropriate period” and its linguistic variations refer to any specific time interval necessary to achieve the objective of the process. These periods may already be known, such as described in this document, or may be determined as necessary to achieve a satisfactory result within what is expected in some specific application situation within the scope of this invention.
  • substrate refers to the material that constitutes the microfluidic device, which may be, but is not limited to: liquid crystal polymer, polydimethylsiloxane, polystyrene, low temperature co-fired ceramic, additive manufacturing of light curing and SD printing.
  • the invention presented here materializes in microfluidic devices, systems, components and methods used as a platform for the development of aptamers with improvement in the degree of molecular specificity to the target of interest.
  • one or more methods are provided as tools to improve the selection of aptamers with specificity for relevant application in biologically complex environments.
  • the method can be applied especially, but not limited to, iterative compound screening processes, such as, for example, the SELEX technique for aptamer development.
  • the stipulation encompasses: a) A substrate that forms channels connecting an inlet opening and an outlet opening; b) A substrate that forms a chamber with a permeable bottom and a scaffolding function for cell cultures; c) A combination of the substrates that form the unit of the microfluidics device; d) A modeling of the organism arranged through the modular combination of the device units in a closed system; e) An apparatus for guiding the circulatory flow of fluid according to the positive and negative targets of interest to be targeted; f) A platform for maintaining modular arrangements with physiologically compatible temperature, pressure and pH; g) A platform that allows the exposure of molecule libraries in a complex biological environment.
  • the substrate of the device is made up of layers of different materials, which remain connected by different physicochemical treatments, as shown in FIG. 1.
  • distinct materials such as glass, silicone-based organic polymer (PDMS), light curing resin, co-fired ceramic devices (LTCC) or polystyrene (PS) are used, they are combined by joining the layers of each material through exposure to plasma, followed immediately by suitable contact, pressing each layer against each other for a period of time.
  • light in the broad spectrum of ultraviolet (UV) is used for the polymerization of the device when constructed using light curing resin through the SD printing technique.
  • the device can still have its channels coated in hydrophobic solutions when produced by 3D printing using light-curing resin.
  • a treatment with isopropyl alcohol is performed for good surface leveling.
  • the channels are washed with varying concentrations of EDTA.
  • the size of the gasket is not limited to that described above, but can vary according to possibilities within the scope of the invention described herein, mainly depending on the technical specifications of the insert, which may vary.
  • the insert slot is made exclusively of 3D printed light-curing resin and comprises a niche that accommodates the sealing ring so that the device and the insert are connected.
  • the microfluidics device includes a central chamber containing at the bottom a semi-permeable insert with confinement function or framework for the culture of cells of interest. Furthermore, the insert is also used for target immobilization in the context of exposing molecule libraries for aptamer selection.
  • the chambers in this invention can have different sizes and shapes and according to the support of the designed insert, with diameters ranging from 4 to 120 mm and depths from 3 to 30 m or stipulated according to the standard size of wells for cell culture on laboratory plates.
  • accessory supports anchor the semi-permeable inserts to accommodate cell culture
  • the inserts may be made of polyethylene terephthalate, polycarbonate or other biologically inert material and the pores of the inserts may vary from 1 to 8 mM.
  • FIG. 2 illustrating the substrate composed of the layers of materials, and channels of the central chamber for connecting an inlet and an outlet.
  • the intersection between the channels and the central chamber is formed so as to direct the fluid from the device into the chamber through the semi-permeable insert accommodated at the bottom, ensuring that the fluid in the channel makes a continuous flow to fill the chambers.
  • Different channel diameters can be used for achieve a desirable flow rate and local pressure according to the particular needs of the cell culture of interest, the device being able to adequately accommodate these variations while maintaining the same flow by locally changing the caliber of the channel that precedes each chamber, whose internal circular sections can range from 0.4 to 1.5 mm 2 .
  • the platform includes devices connected by silicone tubes fixed through the protrusions on the surface of the devices in configuration where the outlet opening of a device connects with the inlet opening of at least one other device and a peristaltic pump.
  • the devices are modularly arranged in a closed system for guiding the circulatory flow with the aid of the pump, so that the fluid is continuously pushed for circulation between the devices as shown in FIG. 3.
  • the target cells confined in the device's central chamber are co-cultured with other non-target cells, that is, the devices are kept connected in a closed system to exchange signaling molecules through a circulating fluid, ie, in addition to components of the fluid, cultures are exposed to signaling molecules secreted by themselves or by other cells in the system conditioning the fluid medium.
  • the fluid used in the microfluidic device can be, but not restricted to, buffer solutions such as phosphate saline solution, Hanks balanced salt solution, HEPES; cell culture media such as MEM, DMEM, F-12, RPMI with adjustment to pH 7.
  • the fluid can be composed of defined medium supplemented with growth factors or be supplemented with fetal bovine serum or patient serum concentrates.
  • the microfluidic system of the present invention includes a pump with peristaltic movement to control the flow through the devices, this flow being able to vary between 0.5 mL/min and 3 mL/min continuously or for programmed periods from 5 to 180 min.
  • the devices with culture of the cells of interest are arranged in combination with the negative targets through serial and/or parallel connections, as shown in FIG. . 4.
  • Different combinations can be used seeking to recapitulate the arrangement of the cells of interest in reference to the blood circulation flows in the individual.
  • the inventive method provides the modeling patients as an external closed system, in which devices are arranged in different combinations for each specific individual without the need to manufacture a specific new device.
  • the device flow for the development of targeted therapy against pancreatic tumor, the device flow must travel through device 1 with lung cell culture, then divide into two devices connected in parallel, one device 3 containing cultures of pancreatic cancer cells and another device 4 containing cultures of peritumoral cells or non-malignantly transformed pancreas cells.
  • the streams are joined and proceed to a device 5 containing cultures of liver cells and then directed to a device 6 containing cultures of bone marrow. Finally, the flow is directed to a peristaltic pump and again directed to device 1.
  • the cell cultures of interest must be confined to mobilization of fluid components, including molecules derived from the combinatorial library for aptamer selection and recovery of binding species.
  • the fluid is at a temperature of 37°C, humid atmosphere and with 5% C02 during circulation through the arrangement of devices.
  • the combinatorial nucleic acid library for selection of aptamers using the reference technique is introduced.
  • SELEX The library of molecules can be exemplified by an application of this invention for aptamer selection via SELEX.
  • the nucleic acid library can be produced by sequential chemical synthesis and/or by enzymatic reactions, being composed of about 109 to 1015 random oligonucleotides.
  • Such oligonucleotides contain 70 to 100 nucleotides and have a random central region flanked by conserved regions for primer hybridization and polymerase chain reaction amplification.
  • the target cell culture is collected for extraction of the binding molecules.
  • the adhered binders they can be highlighted by procedures that change the three-dimensional structure of the binder such as, for example, temperature (70-95 ⁇ C), high concentrations of salts (such as KCI, NaCI, MgCl2, etc.), changes in pH by treatment with acid solution or basic, denaturing agents such as urea, ethidium bromide, phenol-chloroform method, or by chemical bond competition (with high concentrations of imidazole, glutathione, or known target monoclonal antibodies).
  • temperature 70-95 ⁇ C
  • salts such as KCI, NaCI, MgCl2, etc.
  • denaturing agents such as urea, ethidium bromide, phenol-chloroform method
  • chemical bond competition with high concentrations of imidazole, glutathione, or known target monoclonal antibodies.
  • the recovered molecules are amplified by polymerase chain reactions and reconstituted in their single strand form, which can then be submitted to a subsequent round of selection or followed to identify the aptamers. As some cycles are carried out, a greater number of copies of the ligands showing greater affinity tends to be enriched by binding competition, being necessary in the proposed invention from 3 to 8 cycles to obtain aptamers.
  • the method materialized on the platform implies a new technical effect to the SELEX technique, providing specificity for the application of aptamers in biologically complex and relevant environments such as, for example, but not limited to personalized targeted cancer therapy.
  • the application of the SELEX technique against respective positive and negative targets disconnected from a homeostatic balance does not result in a satisfactory level of specificity for therapeutic applications.
  • the specificity of the developed aptamer simulates the degree obtained through the SELEX technique in vivo in animal guinea pigs, with the advantage of providing in parallel targets and environment derived from the patient for therapeutic purposes .
  • the invention described herein stipulates a method for the selection of aptamers with high specificity by target cells: a) In the device substrate, fix a support in the central chamber containing the insert of appropriate porosity for the confinement of the cell types of interest ; b) Arrange the devices modularly in a closed system through combination connections in series and/or in parallel by coupling the protrusions of the substrate to the connectors and to the silicone tubes; c) Fill the system of channels and chambers of the devices with fluid at B7 ⁇ C; d) Accommodate the cell cultures of interest in the respective central chambers of the devices; e) Circulate the fluid in the system for an adequate period, ranging from 10 to 72 hours; f) Inject a combinatorial library of molecules into the system for a period of time between 10 to 90 min; g) Discard and replace the fluid circulating in the system at B7 ⁇ C; h) Collect the culture of target cells confined in the central chamber of the device; i) Extract molecules originating
  • the method can meet the sufficiently necessary particularities for the development of customized aptamers for that patient.
  • Aptamers developed against cancer cells from a given patient through the present invention may be used in targeted anticancer therapies for this patient, acting, for example, as carriers of radiotherapy, chemotherapies, immunotherapies and gene therapies.

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Abstract

A presente invenção refere-se a um método para desenvolvimento de terapias alvo anticâncer personalizadas a base de aptâmeros e através da modelagem sistêmica de um indivíduo em dispositivos de microfluídica. Em uma modalidade, a invenção proporciona métodos para desenvolvimento de terapias alvo, em que se inclui a manutenção de células alvo cancerígenas em co-cultivo com células não-alvo e não-cancerígenas através de dispositivos microfluídicos modularmente arranjados em sistemas fechados para desenvolvimento de aptâmeros. Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para desenvolvimento de terapias alvo, em que se inclui a manutenção de células alvo em co-cultivo com células não-alvo através de dispositivos microfluídicos modularmente arranjados em sistemas fechados. A este respeito, a invenção proporciona o desenvolvimento de aptâmeros para o alvo de interesse em equilíbrio homeostático com os componentes do fluido condicionado pelo co-cultivo com as células não-alvo.

Description

MÉTODO PARA SELEÇÃO DE APTÂMEROS COM ALTA ESPECIFICIDADE PELO ALVO EM PLATAFORMA DE DISPOSITIVOS MICROFLUÍDICOS PARA CO-CULTIVO DE TECIDOS
MÚLTIPLOS
Campo da Invenção
[001] A invenção aqui descrita refere-se à especificidade de aptâmeros e terapia alvo no campo da medicina personalizada. Mais especificamente, a um ou mais dispositivos de microfluídica, método, componentes e sistema para cultivo de células e desenvolvimento de aptâmeros com maior especificidade pelo alvo de interesse através da técnica SELEX. Em particular, refere-se à modelagem de tipos agressivos de câncer para o desenvolvimento de aptâmeros personalizados para um paciente.
Estado da técnica
[002] O câncer contempla um grupo de doenças que, em comum, apresentam divisão celular descontrolada com potencial de se espalhar para outras partes do corpo. Especialmente para os tipos mais agressivos da doença, o tratamento quimioterápico convencional é a principal causa da incompatibilidade de sobrevivência do paciente.
[003] Existem tipos diferentes de terapias alvo contra o câncer, agrupadas de acordo com sua natureza e com o efeito que exercem. De forma geral, uma terapia alvo funciona alvejando as diferenças que sustentam a sobrevivência e o crescimento das células cancerosas. A identificação de novos compostos anticâncer pode ser feita através de bibliotecas de moléculas combinatórias e processos de evolução de ligantes. A este respeito, uma técnica conhecida como SELEX, de Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, tem se destacado na identificação e seleção de moléculas chamadas aptâmeros.
[004] Do latim Aptus (ligação) combinado ao do grego Meros (partes), os aptâmeros consistem em moléculas sintéticas, isto é, de ocorrência não natural, que apresentam uma interação específica contra uma molécula alvo. Estrategicamente, através desta interação, a afinidade de uma biblioteca combinatória de ácidos nucleicos é enriquecida por SELEX a partir de etapas consecutivas de exposição, captura e amplificação das espécies com maior capacidade de ligação ao alvo de interesse. Neste quesito, os aptâmeros interagem e possuem uma reação desejável no alvo, neste caso as células cancerosas, podendo modificar sua atividade funcional ou ainda localizar, guiar, posicionar e entregar outros compostos com interesse terapêutico.
[005] Durante o desenvolvimento clássico de aptâmeros por SELEX, é possível introduzir etapas de seleção negativa contra não-alvos, isto é, outros tipos de células que não sejam as de interesse terapêutico. Neste caso, a biblioteca combinatória é incubada com o alvo negativo e busca-se descartar as moléculas a ele ligadas para, assim, amplificar as espécies que podem ser chamadas de não-ligantes. Idealmente, a seleção negativa resulta em aptâmeros específicos aos alvos de interesse, sem afinidade aos alvos negativos. O grau de especificidade dos aptâmeros, no entanto, tem se revelado insuficiente para discriminar populações celulares na prática, mesmo depois das etapas de seleção negativa durante o SELEX.
[006] Já para a variante in vivo do SELEX, apesar do ganho em especificidade ao introduzir a seleção de aptâmeros em cobaias, resultam em aptâmeros selecionados com base na afinidade por alvos e não-alvos distorcidos pelo xeno-modelo animal.
[007] No extremo oposto, a personalização do tratamento oncológico tem despontado como um caminho terapêutico de maior sucesso. Devido à singularidade dos indivíduos e da particular evolução da patologia em cada organismo, pacientes diagnosticados com um mesmo tipo de câncer apresentam respostas diferentes a tratamentos semelhantes. Atendendo ao ganho em especificidade para discriminação entre populações celulares, como cancerosas e não cacerosas, a precisão da presente inovação contempla o desenvolvimento de aptâmeros específicos e personalizados para cada paciente. Para isso, a presente invenção propõe uma nova técnica de seleção, com base em dispositivos de microfluídica. Breve descrição da invenção
[008] A presente invenção descreve a precisão na terapia alvo personalizada contra o câncer a partir da combinação entre bioengenharia e técnicas de biologia molecular. Em particular, materializa-se em dispositivos de microfluídica replicantes de modelos sistémicos individuais de pacientes, aperfeiçoando, assim, o grau de especificidade para a identificação e de moléculas terapêuticas personalizadas.
[009] A presente invenção fornece um método para tratamento de câncer, compreendendo a modelagem ex vivo do paciente através do cultivos de suas células cancerosas e não-cancerosas, levando em consideração a emergência de propriedades sistémicas para o desenvolvimento de terapias alvo personalizadas.
[010] Por um lado, a invenção estipula um método para modelagem sistémica do paciente de acordo com a localização das células cancerosas, considerando a configuração das interações e a composição entre as diferentes populações celulares no dispositivo, permitindo uma varredura de moléculas de interesse.
[011] Além disso, fornece um método para seleção de aptâmeros com maior especificidade e demonstra a utilidade da técnica para alvejar células cancerosas com maior precisão e a nível personalizado.
[012] A invenção oferece, também, um método para favorecimento de equilíbrio entre afinidade de ligação e constante de dissociação de moléculas de interesse em um ambiente relevante, considerando a competição entre os alvos positivo e negativo pelas moléculas de interesse e de acordo com a composição e conexão das diferentes populações celulares.
[013] Por fim, resulta em um método para substituir, reduzir e refinar o uso de modelos de desenvolvimento pré-clínico baseados em experimentação animal, permitindo antecipar resultados preliminares de eficácia, distribuição e toxicidade.
[014] Outros aspectos e modalidades exemplificativas da invenção estão descritas nas seções a seguir e nos anexos. Breve descrição dos desenhos
[015] A FIG. 1 ilustra a estrutura geral do dispositivo microfluídico de acordo com a presente invenção e mostra detalhes do substrato formando uma câmara central com fundo permeável e função de arcabouço para isolamento do alvo de interesse;
[016] A FIG. 2 ilustra as camadas de materiais compondo o substrato e mostra detalhes dos canais da câmara central para conexão de uma entrada e outra de saída.
[017] A FIG. 3 ilustra um exemplo de combinação dos dispositivos para modelagem sistémica de pacientes a partir de conexões entre os cultivos celulares e indica a operação de fluxo no dispositivo controlada por uma bomba peristáltica.
[018] A FIG. 4 ilustra conexões dos dispositivos combinados em série e em paralelo.
Descrição detalhada da invenção Glossário
Ácido nucleico e oligonucleotídeos
[019] Sempre que usados neste documento, os termos "ácidos nucleicos" ou "oligonucleotídeos" significam moléculas de DNA, RNA ou qualquer "XNA", entendido como qualquer oligonucleotídeo com modificação química que não impede sua cópia por métodos bioquímicos, como PCR ou síntese química sequencial. As ilustrações dessas modificações são, mas não se limitam a: substituição de grupos hidroxila de nucleotídeos por halogênios ou grupos metil-éter; uso de nucleotídeos quirais; uso de ácidos xeno nucleicos e similares.
Alvo [020] Como usado aqui, o termo "alvo" refere-se a qualquer entidade com interesse de alvejamento. Para ilustrar, mas sem limitar o escopo das possibilidades, um alvo pode ser: populações celulares de interesse, neste caso o alvo ou complexo molecular pode estar localizado tanto na superfície celular como nas estruturas internas; ou diretamente uma molécula orgânica ou inorgânica, mas especialmente proteína, polipeptideo, lipídio, lipoproteína ou glicoproteína.
Aptâmero
[021] termo "aptâmero" refere-se a ácidos nucleicos de ocorrência não natural que se enovelam em estruturas tridimensionais sobre as quais uma interação específica contra a molécula alvo é obtida. A interação específica do aptâmero pode conferir um efeito, entre outros, de ligação ao alvo e reação com modificação de atividade funcional, podendo induzir ativação, inibição e facilitação de reação entre o alvo e outras moléculas.
Biblioteca de moléculas
[022] Uma "biblioteca de moléculas" mencionada por todo este documento refere-se a conjuntos de compostos que contenham quantidades diversas de diferentes espécies químicas. Esta biblioteca pode apresentar graus variados de diversidade, como as bibliotecas combinatórias de oligonucleotídeos. A biblioteca de moléculas pode também ter a propriedade da aleatoriedade, no sentido de que, em geral, quase todas as possibilidades de configurações tridimensionais dadas pelos graus de liberdade das moléculas são alcançadas pelos ligantes da biblioteca. Esta biblioteca pode ser sintetizada a partir de vários métodos já conhecidos pelos especialistas na área, ou adquirida comercialmente de terceiros.
Câncer [023] Por "câncer", a presente invenção, especialmente em seu escopo de aplicação, refere-se ao grupo de doenças que em comum apresentam divisão celular descontrolada com potencial de formação de tumores sólidos locais e de metástases em outras partes do corpo. Também se refere a neoplasias, a células cancerosas e a células transformadas malignamente de maneira espontânea ou a partir de fatores ambientais.
Células
[024] Conforme usado neste documento, "células" refere-se a populações celulares e especialmente, mas não exclusivamente, a explantes, punções, biópsias, culturas primárias, linhagens celulares imortalizadas ou primárias, cultura de células dissociadas, histotípicas ou ainda organotípicas. Também se refere especialmente, mas não exclusivamente, a células de mamíferos e que podem ou não originar de um paciente em particular.
Células não cancerosas
[025] Conforme usado neste documento, "células não cancerosas", especialmente em seu escopo de aplicação, refere-se à células em contexto fisiológico e não transformadas malignamente, podendo ser originárias de explantes, punções, biópsias, culturas primárias, linhagens celulares imortalizadas ou não, cultura de células dissociadas, histotípicas ou ainda organotípicas. Também se refere especialmente, mas não exclusivamente, a células de mamíferos que podem ou não provir de um paciente em particular
Espécies
[026] Conforme usado neste documento, o termo "espécies" refere-se às diferentes moléculas de ácidos nucleicos que compõem as bibliotecas combinatórias utilizadas para o desenvolvimento de aptâmeros. Explantes
[027] No contexto deste documento, "explantes" refere-se a tecidos de mamíferos cultivados em laboratório, que podem ou não ser obtido pela extração cirúrgica de um paciente em particular, para quem a presente invenção possa ser útil na geração de aptâmeros contra o câncer. Também se refere a qualquer outro tecido animal cultivado em laboratório ou extraído por cirurgia.
Fluido
[028] Entende-se por "fluido" o meio líquido de circulação no sistema de microfluídica, que pode ser composto por, mas não limitado a, soluções tampão, meios de cultivo, derivados de plasma sanguíneo de origem humana ou animal.
Inserto
[029] Por "inserto", esta invenção refere-se a membranas semi-permeáveis para a acomodação e confinamento de culturas de células sem limitar a comunicação para co- cultivos celulares através da circulação do fluido. A presente invenção inclui uma câmara central contendo ao fundo um inserto semi-permeável para função de ancoragem ou arcabouço para a cultura de células de interesse e também imobilização para a exposição de bibliotecas de moléculas. As câmaras nesta invenção podem ter tamanhos e formatos diferentes de acordo com o suporte projetado.
Ligante
[030] termo "ligante" é usado na presente invenção como qualquer espécie química com uma estrutura tridimensional específica capaz de se ligar a outras espécies químicas. Exemplos de ligantes no contexto desta invenção são, mas não estão limitados a: oligonucleotídeos, peptídeos e proteínas.
Molécula
[031] Neste documento, o termo "molécula" expressa um conjunto de átomos, que podem ser idênticos ou diferentes, arranjados por ligações covalentes. É usado como referência a espécies componentes de substâncias, e que podem ser transformadas através de reações químicas gerando novas espécies químicas.
Microfluídica
[032] "Microfluídica" e seus derivados gramaticais, quando usados para descrever a presente invenção, referem-se à técnica bem conhecida dos especialistas na área que utiliza dispositivos e ferramentas para controlar com precisão, de maneira orquestrada e planejada, os caminhos de fluxo de um fluido, as proporções da composição de soluções e suas combinações em associação ou não com qualquer processo ou análise física e/ou química, trabalhando nas escalas pico, nano, micro ou de mililitro.
Não-alvo ou alvo negativo
[033] Como aqui também utilizado, o termo "não-alvo" ou ainda "alvo negativo" refere-se à descrição contrária de "alvo", ou seja, aquilo a que não se objetiva estabelecer interações entre as espécies. Um alvo negativo é usado para remover as espécies ligantes que tenham a função não desejável de interagir com outras espécies além dos alvos.
Período adequado
[034] Conforme usado neste documento, a expressão "período adequado" e suas variações linguísticas referem-se a qualquer intervalo de tempo específico necessário para atingir o objetivo do processo. Esses períodos podem já ser conhecidos, como descrito neste documento, ou podem ser determinados conforme a necessidade de alcançar um resultado satisfatório dentro do que se espera em alguma situação específica de aplicação dentro do escopo desta invenção.
SELEX
[035] Derivado do acrónimo em inglês para Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, o termo SELEX é usado em referência à técnica envolvendo experimentos de evolução in vitro a partir bibliotecas combinatórias.
Substrato
[0S6] Por "substrato", este documento refere-se ao material que constitui o dispositivo microfluídico, que pode ser, mas não está limitado a: polímero de cristal líquido, polidimetilsiloxano, poliestireno, cerâmica co-queimada a baixa temperatura, fabricação aditiva de fotopolimerização e impressão SD.
Métodos
[0S7] A invenção aqui apresentada materializa-se em dispositivos microfluídicos, sistemas, componentes e métodos utilizados como plataforma para o desenvolvimento de aptâmeros com aprimoramento do grau de especificidade molecular ao alvo de interesse. Por um lado, um ou mais métodos são fornecidos como ferramentas para aprimorar a seleção de aptâmeros com especificidade para aplicação relevante em ambientes biologicamente complexos. Por outro lado, o método pode ser aplicado especialmente, mas não limitado a, processos iterativos de triagem de compostos, como, por exemplo, a técnica SELEX para desenvolvimento de aptâmeros.
De acordo com a invenção aqui apresentada, a estipulação engloba: a) Um substrato que forma canais conectando uma abertura de entrada e uma abertura de saída; b) Um substrato que forma uma câmara com fundo permeável e função de arcabouço para as culturas de células; c) Uma combinação dos substratos que formam a unidade do dispositivo de microfluídica; d) Uma modelagem do organismo arranjada através da combinação modular das unidades do dispositivo em sistema fechado; e) Um aparato para orientação de fluxo circulatório de fluido de acordo com os alvos positivos e negativos de interesse para serem alvejados; f) Uma plataforma para manutenção dos arranjos modulares com temperatura, pressão e pH compatíveis com os fisiológicos; g) Uma plataforma que permite a exposição de bibliotecas de moléculas em ambiente biológico complexo.
[038] Na presente invenção, o substrato do dispositivo é constituído de camadas de materiais diferentes, que se mantêm conectadas por tratamentos físico-químicos diversos, como representado na FIG. 1. Quando materiais distintos como vidro, polímero orgânico à base de silicone (PDMS), resina fotopolimerizável, dispositivos cerâmicos co-queimados (LTCC) ou poliestireno (PS) são usados, eles são combinados pela junção das camadas de cada material através da exposição a plasma, seguida imediatamente de contato adequado, pressionando cada camada uma contra a outra por um determinado período. Em outro aspecto técnico, a luz no amplo espectro de ultravioleta (UV) é usada para a polimerização do dispositivo quando construído usando resina fotopolimerizável através da técnica de impressão SD. O dispositivo pode ainda ter seus canais revestidos em soluções hidrofóbicas quando produzido por impressão 3D usando resina fotopolimerizável. Com relação aos canais microfluídicos, quando impresso com resina fotopolimerizável, faz-se um tratamento com álcool isopropílico para um bom nivelamento da superfície. Quando construídos usando camadas LTCC, os canais são lavados com concentrações variáveis de EDTA.
[039] Um outro aprimoramento para o funcionamento adequado do dispositivo de forma a minimizar o vazamento de fluidos durante sua operação, especialmente nas conexões entre o inserto e o dispositivo, consiste na utilização de um anel de vedação ou de polímero de silicone de diâmetro lOmm e espessura l,7mm inserido apropriadamente na fenda de suporte. O tamanho do anel de vedação não se limita ao descrito anteriormente, mas pode variar de acordo com as possibilidades dentro do escopo da invenção aqui descrita, principalmente dependendo das especificações técnicas do inserto, que podem variar. A fenda do inserto é feita exclusivamente de resina fotopolimerizável impressa em 3D e compreende um nicho que acomoda o anel de vedação de maneira que o dispositivo e o inserto estejam conectados.
[040] Na presente invenção, o dispositivo de microfluídica inclui uma câmara central contendo ao fundo um inserto semi-permeável com função de confinamento ou arcabouço para a cultura de células de interesse. Além disso, o inserto é também utilizado para a imobilização do alvo no contexto da exposição de bibliotecas de moléculas para seleção de aptâmeros. As câmaras nesta invenção podem ter tamanhos e formatos diferentes e de acordo com o suporte do inserto projetado, com diâmetros podendo variar de 4 a 120 mm e profundidades de 3 a 30 m ou estipuladas de acordo com o tamanho padrão de poços para cultura de células em placas de laboratório. Na presente invenção, suportes acessórios ancoram os insertos semi-permeáveis para acomodação do cultivo de células, podendo os insertos serem feitos de polietileno tereftalato, policarbonato ou outro material biologicamente inerte e podendo os poros dos insertos variar de 1 a 8 mM.
[041] Como representado na FIG. 2, ilustrando o substrato composto pelas camadas de materiais, e canais da câmara central para conexão de uma entrada e outra de saída. A interseção entre os canais e a câmara central é formada de maneira a direcionar o fluido do dispositivo para o interior da câmara através do inserto semi-permeável acomodado na parte inferior, assegurando que o fluido do canal faça fluxo contínuo para preenchimento das câmaras. Diferentes diâmetros de canal podem ser usados para atingir uma taxa de fluxo desejável e pressão local de acordo com as necessidades particulares da cultura de células de interesse, podendo o dispositivo acomodar adequadamente essas variações enquanto mantém o mesmo fluxo alterando localmente o calibre do canal que precede cada câmara, cujas cujas seções circulares internas podem variar de 0,4 a 1.5 mm2.
[042] A plataforma contempla os dispositivos conectados por tubos de silicone fixados através das protuberâncias na superfície dos dispositos em configuração onde a abertura de saída de um dispositivo se conecta com a abertura de entrada pelo menos um outro dispositivo e de uma bomba peristáltica. Os dispositivos são arranjados modularmente em sistema fechado para orientação do fluxo circulatório com o auxílio da bomba, de forma que o fluido é empurrado continuamente para circulação entre os dispositivos como representado na FIG. 3. As células alvo confinadas na câmara central do dispositivo são co-cultivadas com outras células não-alvo, ou seja, os dispositivos são mantidos conectados em sistema fechado para troca de moléculas de sinalização através de um fluido circulante, Ou seja, além dos componentes do fluido, as culturas são expostas às moléculas sinalizadoras secretadas por elas mesmas ou por outras células do sistema condicionando o meio do fluido. O fluido utilizado no dispositivo microfluídico pode ser, mas não restrito a, soluções tampões como solução salina fosfato, Hanks balanced salt solution, HEPES; meios de cultivo de células como MEM, DMEM, F-12, RPMI com ajuste para pH 7. O fluido pode ser composto por meio definido suplementado com fatores de crescimento ou ainda serem suplementados com soro fetal bovino ou concentrados de soro de pacientes. O sistema microfluídico da presente invenção inclui uma bomba com movimento peristáltico para controle do fluxo através dos dispositivos, podendo esse fluxo variar entre 0.5 mL/min e 3 mL/min continuamente ou por períodos programados de 5 a 180 min.
[043] De acordo com a localização in situ no organismo dos alvos positivos a serem alvejados, os dispositivos com cultivo das células de interesse são arranjados em combinação com os alvos negativos através de conexões em série e/ou em paralelo, como demonstrado na FIG. 4. Diferentes combinações podem ser utilizadas buscando recapitular a disposição das células de interesse em referência aos fluxos de circulação sanguínea no indivíduo. Em um sentido amplo, o método inventivo proporciona a modelagem de pacientes como um sistema fechado externo, em que os dispositivos são arranjados em combinações diferentes para cada indivíduo em específico sem a necessidade de fabricação de um novo dispositivo específico. Por exemplo, mas não limitado a este exemplo, para o desenvolvimento de terapia-alvo contra tumor pancreático, o fluxo do dispositivo deve percorrer um dispositivo 1 com cultivo de células pulmonares, a seguir dividir-se em dois dispositivos conectados em paralelo, sendo um dispositivo 3 contendo cultivos de células cancerosas de pâncreas e outro dispositivo 4 contendo cultivos de células peritumorais ou células de pâncreas não transformadas malignamente. Os fluxos são unidos e prosseguem para um dispositivo 5 contendo cultivos de células hepáticas e a seguir direcionado para um dispositivo 6 contendo cultivos de medula óssea. Por fim, o fluxo é direcionado para uma bomba peristáltica e novamente direcionado para o dispositivo 1.
[044] Por todas as maneiras pelas quais os dispositivos podem ser arranjados para organizar alvos positivos e negativos, os cultivos celulares de interesse devem ser confinados para mobilização dos componentes do fluido, incluindo as moléculas derivadas da biblioteca combinatória para seleção de aptâmero e recuperação das espécies ligantes. Para operação da plataforma, o fluido é em temperatura de 37^C, atmosfera úmida e com 5% de C02 durante a circulação pelo arranjo de dispositivos. Após um período adequado para igualamento das taxas de associação e dissociação dos componentes do fluido em circulação pelos alvos e estabelecimento de um equilíbrio homeostático entre os alvos positivos e negativos, é introduzida a biblioteca combinatória de ácidos nucleicos para seleção dos aptâmeros através da técnica de referência SELEX. A biblioteca de moléculas pode ser exemplificada por uma aplicação desta invenção para seleção de aptâmero através de SELEX. Este método de seleção consiste na A biblioteca de ácidos nucleicos pode ser produzida por síntese química sequencial e/ou por reações enzimáticas, sendo composta por cerca de 109 a 1015 oligonucleotídeos aleatórios. Tais oligonucleotídeos contém de 70 a 100 nucleotídeos e apresentam uma região central randômica flanqueada por regiões conservadas para hibridização de primers e amplificação por reação em cadeia da polimerase.
[045] Após um período de exposição da biblioteca de ácidos nucleicos, a cultura de células-alvo é coletada para extração das moléculas ligantes. Os ligantes aderidos podem ser destacados por procedimentos que alterem a estrutura tridimensional do ligante como, por exemplo, temperatura (70-95^C), elevadas concentrações de sais (como KCI, NaCI, MgCI2, etc.), alterações no pH pelo tratamento com solução ácida ou básica, agentes desnaturantes como uréia, brometo de etídio, método fenol- clorofórmio ou pela competição de ligação química (com altas concentrações de imidazol, glutationa, ou anticorpos monoclonais de alvo conhecido). As moléculas recuperadas são amplificadas por reações em cadeia da polimerase e reconstituídas na sua forma de simples fita, podendo então ser submetidas a um ciclo subsequente de seleção ou seguir para identificação dos aptâmeros. À medida que alguns ciclos são realizados, um maior número de cópias dos ligantes apresentando maior afinidade tende a ser enriquecido por competição de ligação, sendo necessário na invenção proposta de 3 a 8 ciclos para a obtenção de aptâmeros. Através da presente invenção, o método materializado na plataforma implica em um novo efeito técnico à técnica SELEX, fornecendo especificidade para aplicação dos aptâmeros em ambientes biologicamente complexos e relevantes como, por exemplo, mas não limitado a, terapia-alvo contra câncer personalizada. Em contraste, a aplicação da técnica de SELEX contra os respectivos alvos positivos e negativos desconectados de um equilíbrio homeostático, não resulta em um nível de especificidade satisfatório para aplicações terapêuticas.
[046] De acordo com a invenção apresentada, sugere-se que a especificidade do aptâmero desenvolvido simula ao grau obtido através da técnica SELEX in vivo em cobaias animais, com a vantagem de em paralelo fornecer alvos e ambiente derivados do próprio paciente para fins terapêuticos.
[047] A invenção aqui descrita estipula um método para a seleção de aptâmeros com alta especificidade pelas células-alvo: a) No substrato de dispositivos, fixar um suporte na câmara central contendo o inserto de porosidade apropriada para o confinamento dos tipos celulares de interesse; b) Arranjar os dispositivos modularmente em um sistema fechado através de conexões combinações em série e/ou em paralelo através do acoplamento das protuberâncias do substrato aos conectores e aos tubos de silicone; c) Preencher o sistema de canais e câmaras dos dispositivos com fluido a B7^C; d) Acomodar os cultivos celulares de interesse nas respectivas câmaras centrais dos dispositivos; e) Circular o fluido no sistema por um período adequado, podendo variar entre 10 a 72 horas; f) Injetar no sistema uma biblioteca combinatória de moléculas para circulação por um período de tempo entre 10 a 90 min; g) Descartar e substituir o fluido em circulação no sistema a B7^C; h) Coletar a cultura de células-alvo confinada na câmara central do dispositivo; i) Extrair as moléculas originárias da biblioteca combinatória que se ligaram às células-alvo; j) Amplificação e reconstituição do conjunto de moléculas extraídas das células- alvo; k) Identificação das moléculas candidatas à aptâmeros
Aplicabilidade Industrial
[048] Em uma aplicação clínica, quando amostras de explantes de pacientes oncológicos são co-cultivadas e arranjadas em alvo e não-alvo, o método pode reunir as particularidades suficientemente necessárias para o desenvolvimento de aptâmeros personalizados para esse paciente. Os aptâmeros desenvolvidos contra as células cancerosas de um dado paciente através da presente invenção poderão ser utilizados em terapias-alvo anticâncer para este paciente, atuando, por exemplo, como carreadores de radioterapias, quimioterapias, imunoterapias e terapias genéticas.
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos caracterizado pelo fato de que é a combinação da técnica SELEX a um arranjo de dispositivos microfluídicos para co-cultivos de células alvo cancerosas e células não-alvo não-canceros explantadas de pacientes.
2. Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método para co-cultivo de células consiste em um arranjo modular fechado com circulação de fluido orientada por combinações dos dispositivos microfluídicos conectados em paralelo e/ou em série.
3. Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o desenvolvimento de aptâmeros para células-alvo é feito em sistemas fechados e em equilíbrio homeostático entre os componentes do fluido, este em condicionamento pelo co-cultivo com células não-alvo.
4. Método para seleção de aptâmeros com alta especificidade pelo alvo em plataforma de dispositivos microfluídicos para co-cultivo de tecidos múltiplos, de acordo com a reivindicação 1, é um método para desenvolvimento de veículos carreadores para terapia-alvo a partir dos aptâmeros desenvolvidos para um paciente específico, com aplicação na entrega de quimioterapia, radioterapia, imunoterapia e terapia genética anticâncer.
5. Dispositivo microfluídico caracterizado pelo fato de que compreende culturas de explantes de um organismo em particular que compreende um alvo desejado e seus não alvos.
6. Dispositivo microfluídico caracterizado pelo fato de que abrange: I. um substrato que forma canais conectando uma abertura de entrada e outra de saída;
II. uma multiplicidade de câmaras de incubação formadas ao longo do dispositivo e conectadas através dos canais de conexão e onde o suporte plástico permeável para o cultivo de células ou explantes pode ser firmemente fixado; e
III. um padrão de conexão de câmaras de incubação para culturas de células ou explantes não alvo e alvo, de modo a simular o fluxo de circulação sistémica do sangue de um organismo humano em um tumor local.
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