ES2887105T3 - Plataforma integrada para el análisis de células individuales - Google Patents

Abstract

Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, que comprende - proporcionar i. una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de la suspensión celular pasen a través del poro, ii. una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en la que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, en la que los reactivos se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca, iii. medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos, iv. una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos, y - filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa, - ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, - sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta, - analizar al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

Description

DESCRIPCIÓN

Plataforma integrada para el análisis de células individuales

Introducción

La invención se refiere a un procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, que comprende a) proporcionar (i) una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando se aplica la célula a la membrana en un medio líquido, y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de una suspensión celular pasen a través del poro, (ii) una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en la que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, en la que los reactivos se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca, (iii) medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa del pocillo en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos, (iv) una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos; y b) filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa; c) ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo; d) sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta, y e) analizar al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una de las principales causas de muerte y morbilidad a nivel mundial (1). Solo en Europa, hubo 3,45 millones de nuevos casos de cáncer estimados y 1,75 millones de muertes por cáncer en 2012 (2). Incluyendo los tipos más comunes de cáncer tales como el cáncer de mama, el cáncer colorrectal, el cáncer de próstata y el cáncer de pulmón, los carcinomas representan, con diferencia, la clase de tumores más abundante. Los carcinomas son tumores sólidos derivados del tejido epitelial y la mayor parte de las muertes debidas a esta clase de tumores vienen provocadas por la diseminación hematógena de células cancerosas desde el tumor primario a órganos distantes y su posterior crecimiento para dar lugar a metástasis (3, 4). Se descubrió que durante este proceso complejo las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel clave, y su detección y caracterización fiables podría permitir estrategias nuevas y eficaces para el diagnóstico, el seguimiento y el tratamiento del cáncer (4-7). Sin embargo, el análisis de CTC todavía representa un gran desafío analítico debido a su abundancia ultrabaja de unas pocas células por ml de sangre cubiertas por miles de millones de células sanguíneas y a su compleja heterogeneidad intercelular (7-9). Esta heterogeneidad surge de la inestabilidad genética de las células tumorales, y se sospecha que impulsa la enfermedad metastásica, la resistencia a los medicamentos y la progresión de la enfermedad mediante un proceso evolutivo conocido como evolución clonal (10-12). Resolver esta heterogeneidad tanto en el genoma como en el transcriptoma de las CTC ofrece grandes expectativas para el tratamiento dirigido del cáncer y ha desplazado el interés del análisis masivo de las CTC hacia procedimientos de células individuales (5, 11, 13-15).

El desarrollo de herramientas eficaces para el aislamiento de CTC a partir de sangre completa ha sido un campo activo de investigación en los últimos años y los procedimientos desarrollados suelen aprovechar las propiedades biológicas o físicas de las CTC para el aislamiento. Los procedimientos basados en criterios de separación biológica utilizan en su mayor parte la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) generalmente expresada en la superficie de las CTC de origen epitelial como marcador (16).

No obstante, existe una duda considerable sobre si un procedimiento de aislamiento basado en EpCAM puro es capaz de capturar todos los tipos de CTC. Esto se debe a la mencionada heterogeneidad de las CTC, cada vez más reconocida. Se ha descubierto que especialmente un proceso conocido como transición epitelial-mesenquimal (EMT), que se sospecha que proporciona a las CTC una mayor capacidad de invasión, provoca una regulación a la baja de los marcadores epiteliales, incluida la EpCAM (17).

Debido a esto, se ha producido un mayor interés en los procedimientos de separación independientes de marcadores que se basan en criterios de separación física menos específicos (revisado en 18, 19). En este dominio se pueden encontrar los procedimientos más abundantes basados en tamaño/deformabilidad. Los dispositivos más sencillos que permiten el mayor rendimiento se basan en la microfiltración sin salida clásica. Estos procedimientos se basan en el tamaño más grande y la menor deformabilidad de las CTC en comparación con las células sanguíneas para llevar a cabo un aislamiento. Sin embargo, debido a las superposiciones de tamaño significativas entre las CTC y algunas WBC, estos procedimientos generalmente adolecen de una baja selectividad, lo que complica el análisis posterior de las células capturadas (20).

Otro problema con los procedimientos de aislamiento existentes para CTC es que no existe una plataforma verdaderamente integrada que permita el análisis directo de una célula individual después de la captura de CTC. Por lo tanto, los primeros estudios de células individuales, que se realizaron sobre CTC, utilizaron flujos de trabajo complejos para combinar el enriquecimiento y el análisis de células individuales de CTC (revisado en 10, 13, 21-29).

Como ejemplo, en el trabajo pionero de Lohr et al. (30), se aislaron en primer lugar CTC epiteliales utilizando perlas magnéticas marcadas con anti-EpCAM. En segundo lugar, las CTC aisladas se transfirieron a una matriz de micropocillos para la separación e identificación de células individuales por medio de ICC. A continuación, las CTC identificadas se transfirieron a pocillos individuales de una placa de PCR mediante un micromanipulador robótico. A continuación, se realizó la amplificación del genoma completo (WGA) mediante amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) seguida de secuenciación del genoma completo utilizando la plataforma Illumina MiSeq.

Otro sistema ofrecido por la empresa VyCap combina el enriquecimiento celular por filtración y el aislamiento de células individuales. Para ello, se utiliza una placa de microvaloración que tiene orificios (poros) en la parte inferior. Después del enriquecimiento, las células capturadas se disponen selectivamente mediante perforación desde la placa en pocillos individuales de una placa de pocillos estándar para el análisis de células individuales. Sin embargo, para ello el usuario requiere un sofisticado sistema perforador (micromanipulador). Alternativamente, los reactivos podrían, en principio, añadirse a las células en los pocillos de la placa de enriquecimiento. Sin embargo, esta adición tendría que ser realizada por el usuario y se considera técnicamente complicada en esta etapa. Por lo tanto, este procedimiento tampoco forma parte del producto ofrecido. Además, el uso de la placa de microvaloración porosa prefabricada se considera desventajoso debido a sus altos costes de producción, a la libertad combinatoria fuertemente limitada del usuario (no hay posibilidad de combinar la membrana y la placa de pocillos individualmente) y a que no se produce una separación limpia de células individuales (varias células por pocillo) para la suspensión celular concentrada (tal como sangre completa).

Además, la empresa Fluidigm ofrece un producto con una combinación eficaz de análisis y aislamiento de células individuales. Sin embargo, requiere una suspensión de células diana como alimentación y no contiene ningún medio para el enriquecimiento de CTC. Por lo tanto, para utilizar este sistema, el usuario necesita una tecnología de enriquecimiento de CTC adicional.

Los inconvenientes de dichos flujos de trabajo son las múltiples etapas de transferencia celular involucradas, que podrían introducir estrés celular y conllevar altos riesgos de pérdida celular y contaminación. Además, los rendimientos que se pueden obtener con dichos flujos de trabajo son muy limitados.

Nagai et al. (Moeto Nagai, Kiyotaka Oohara, Keita Kato, Takahiro Kawashima, Takayuki Shibata; Microdispositivos Biomed (2015) 17: 41; d Ot 10.1007/s10544-015-9943-z) han desarrollado una serie de sondas huecas utilizando tecnología de fabricación de sistemas microelectromecánicos y han demostrado la manipulación paralela de células individuales que pueden capturarse en la sonda aplicando presión negativa a las sondas. Las células atrapadas se pueden transportar a un chip de cultivo celular.

El documento US 2011/0233148 A1 divulga un sistema de placa de filtro que puede utilizarse para el cultivo in vitro de células o agregados celulares, y permite cambios relativamente fáciles y eficaces de los medios de cultivo. El sistema divulgado puede comprender una placa de depósito con al menos un pocillo, una placa de tamiz con al menos un pocillo de tamiz que comprende al menos una porción de pared de malla y una tapa. El sistema se utiliza para filtrar agregados celulares a partir de un medio líquido y separarlos de células individuales, desechos celulares y otros componentes del medio que pueden migrar a través de la porción de pared de malla, que preferentemente tiene un tamaño de poro de 20 a 100 micrómetros. Sin embargo, este sistema no es adecuado para aislar células individuales, ya que el pocillo de tamiz no las retiene bien. Además, un pocillo de tamiz comprende una porción de pocillo de malla con múltiples, preferentemente miles de poros, que están ubicados en un solo pocillo de la placa del depósito o en el lado opuesto al mismo. En consecuencia, el sistema no es adecuado para el aislamiento de células individuales, sino solo para la separación de células individuales no agregadas de agregados celulares. El aislamiento, el análisis y la comparación de una o más células individuales por microscopía o con respecto al análisis de componentes celulares no es posible con este sistema. Solo es posible observar microscópicamente los agregados celulares durante la fase de cultivo en el sistema de placa de filtro. Sin embargo, para el análisis de células individuales o componentes de células individuales, los agregados celulares deben retirarse o recogerse del sistema. A continuación, las células pueden disociarse en células individuales y, posteriormente, analizarse de diversas formas. Sin embargo, el documento US 2011/0233148 A1 no describe un dispositivo, un sistema o un kit que permita el aislamiento y potencialmente también la observación de las células individuales aisladas y el análisis subsiguiente de un componente celular de forma integrada. Por el contrario, se deben realizar muchos procesos posteriores independientes y no se describen dispositivos adecuados para realizar todas las etapas.

El documento US 2016/0045884 A1 divulga un chip de captura para capturar células individuales a partir de una suspensión que comprende un sustrato con una pluralidad de hoyuelos del tamaño de una célula para atrapar las células. Básicamente, este sustrato es una placa de múltiples pocillos, que se puede ensamblar con un chip de múltiples pocillos de orificios pasantes después de que se hayan capturado células individuales en los pocillos. Es importante destacar que los hoyuelos o pocillos del sustrato están cerrados en la parte inferior, por lo que las células no pueden pasar a través del sustrato, lo que diferencia críticamente dichos sustratos de una membrana porosa, tal como una membrana de filtro con un tamaño de poro definido, ya que pueden capturarse células de diferentes diámetros dando lugar a un aislamiento específico de tipo no celular de células individuales a partir de una suspensión. Las células individuales capturadas se pueden analizar posteriormente, por ejemplo, mediante PCR o expresión génica. Sin embargo, en los procedimientos y sistemas descritos en el documento US 2016/0045884 A1 no es posible controlar la especificidad de la captura de células, por lo que no es posible asegurar que el tipo de célula de interés correcto haya sido capturado y analizado por un determinado pocillo u hoyuelo. Además, dado que el chip de captura de sustrato está cerrado en la parte inferior, el sistema es propenso a un aislamiento celular no específico, lo que conduce al aislamiento y el análisis de otro tipo de células de la suspensión celular diferente de las células de interés. Estas células erróneamente aisladas no se pueden eliminar debido a la falta de un recubrimiento de superficie selectivo de células (por ejemplo, que contenga un anticuerpo inmovilizado dirigido contra un marcador de superficie específico de la célula diana), que solo retiene las células de interés durante una etapa de lavado subsiguiente. Además, las células erróneamente aisladas no pueden identificarse durante o después de realizar el procedimiento, ya que el sistema no comprende un análisis celular, por ejemplo, mediante el examen de las células aisladas microscópicamente.

Existe una necesidad en el sector de enriquecer, aislar y analizar células individuales para proporcionar medios para aislar células individuales específicas de interés (por ejemplo, CTC) con una alta especificidad a partir de una multitud de células de fondo (por ejemplo, células sanguíneas) en un flujo de trabajo simple que permita un análisis de alto rendimiento evitando simultáneamente la pérdida de células o la contaminación de muestras de células individuales.

Sumario de la invención

A la luz de las dificultades de la técnica anterior, el problema técnico subyacente de la presente invención es la provisión de medios para aislar células individuales específicas de interés con una alta especificidad en un flujo de trabajo simple que permita un análisis de alto rendimiento evitando simultáneamente la pérdida de células o la contaminación de muestras de células individuales.

Por lo tanto, la presente invención busca proporcionar un procedimiento, un dispositivo, un kit y un sistema para aislar y analizar células individuales de interés que aseguren una alta especificidad para la célula de interés en un sistema integrado que garantice un análisis de alto rendimiento de las células evitando las etapas de manipulación excesiva que podrían dar lugar a la pérdida o la contaminación de muestras de células individuales aisladas.

La solución al problema técnico de la invención se proporciona en las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes se proporcionan formas de realización preferidas de la invención.

La presente invención se refiere a un procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- proporcionar

i. una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de la suspensión celular pasen a través del poro,

ii. una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en la que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, en la que los reactivos se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca,

iii. medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos,

iv. una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos, y

- filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa,

- ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo,

- sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta,

- analizar al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

El procedimiento de la presente invención combina el enriquecimiento celular y el aislamiento celular por medio de filtración, preferentemente filtración por afinidad, con al menos una etapa de análisis de células individuales. El procedimiento de la presente invención permite el aislamiento y análisis de células individuales de interés en un procedimiento o sistema integrado, que minimiza las etapas de manipulación durante el aislamiento y el análisis de las células. El procedimiento de la presente invención reduce el riesgo de contaminación de muestras de células individuales y el análisis de células aisladas erróneamente, que no tienen la identidad deseada de las células de interés, y por lo tanto proporciona una forma fiable, rápida y eficaz (en términos de tiempo y costes) de obtener información sobre células de una población de células a nivel de células individuales.

Con el procedimiento de la presente invención es posible filtrar una suspensión celular, que comprende una mezcla compleja de diferentes células, a través de una membrana porosa que contiene uno o más poros, preferentemente cientos o miles de poros, en el que cada poro de la membrana puede retener un célula individual de interés de la suspensión de células, que queda atrapada mecánicamente o atascada en el poro o se adhiere al poro.

En el contexto de la presente invención, el atrapamiento de una célula en un poro de la membrana porosa se refiere a la adherencia de una célula al poro después de la aplicación de la suspensión celular líquida que contiene la célula de interés a la membrana porosa, por ejemplo en una etapa de filtración. El diámetro de poro se puede ajustar para evitar que una célula individual de interés pase a través del poro cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido. Dicho atrapamiento o adherencia de una célula se puede lograr mecánicamente, cuando el diámetro de poro se ajusta al tamaño y rigidez o flexibilidad del tipo de célula de interés, de modo que permite que la célula penetre en el poro pero no pase a través del poro, lo que produce como resultado que la célula quede atrapada o atascada dentro del poro.

Como alternativa, el poro puede ajustarse para mostrar propiedades de superficie que permitan la adherencia específica de la célula de interés, pero no de otros tipos de células. En este caso, el diámetro de poro también puede ser mayor que el diámetro de la célula de interés, porque la célula no tiene que quedar atrapada mecánicamente, pero puede adherirse al poro debido a adherencia de superficie por medio de la interacción con la superficie del poro. Sin embargo, en este caso puede ser ventajoso que el diámetro de poro sea aproximadamente el mismo o solo un poco más grande que el diámetro de una célula de interés para evitar que la célula pase a través del poro sin entrar en contacto con la superficie del poro, que puede interactuar con la superficie de la célula, o muy cerca de la misma.

Un experto es capaz de ajustar el poro para que sea adecuado para atrapar una célula específica de interés, ya sea ajustando el diámetro de poro para atrapar mecánicamente la célula de interés (dicho ajuste puede basarse en el diámetro medio conocido de una célula de interés, su rigidez y/o su flexibilidad), o ajustando o modificando las propiedades de superficie de la superficie del poro, por ejemplo recubriendo la superficie del poro con moléculas que interactúan específicamente con la célula de interés. En formas de realización, el poro puede ajustarse para atrapar una célula de interés mediante una combinación de ajuste del diámetro de poro al tipo de célula de interés y ajuste de las propiedades de superficie de las células para permitir la adherencia de una célula de interés, lo que da como resultado una combinación de atrapamiento mecánico y atrapamiento por medio de una interacción superficiesuperficie específica.

El poro se ajusta para evitar que una célula individual de interés pase a través del poro y para permitir que otros tipos de células de la suspensión celular pasen a través del poro, porque son más pequeñas o más flexibles y no se adhieren al poro, y/o para evitar que los tipos de células de la suspensión celular pasen a través del poro o se adhieran al mismo, porque son demasiado grandes o rígidas incluso para penetrar en el poro (lo que evita que se atasquen mecánicamente en el poro) y no presentan propiedades de superficie que permitan la adherencia a la superficie del poro por medio de una interacción específica.

En el caso de una filtración por afinidad, las células de interés también se unen a la superficie del poro, mientras que otras células no se unen a la superficie de la membrana/poro. En consecuencia, después de filtrar la suspensión celular a través de la membrana porosa, las células individuales de interés se adhieren a los poros de la membrana, mientras que las otras células de la suspensión celular han pasado a través de los poros sin atascarse o no pudieron pasar a través de la membrana y tampoco se adhieren a los poros.

Después de la filtración de la suspensión celular a través de la membrana porosa, la membrana porosa se puede ensamblar con una placa de pocillos. La membrana porosa y la placa de pocillos de la presente invención se han fabricado de una forma, por ejemplo, mediante microfabricación, en la que las posiciones de los poros en la membrana son conocidas y están preferentemente dispuestas en una estructura ordenada en la membrana, mientras que los pocillos de las placas de pocillos están ubicados en posiciones correspondientes a las posiciones de los poros de la membrana y preferentemente están dispuestos en la misma estructura ordenada que los poros de la membrana. En consecuencia, la posición de cada poro en la membrana corresponde a la posición de un pocillo en la placa de pocillos. Tras el ensamblaje de la placa de pocillos y la membrana porosa, los poros se colocan por encima de un pocillo de la placa de pocillos o en una posición opuesta al mismo.

La membrana y/o la placa de pocillos de la presente invención están equipadas con medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos. Estos medios de ensamblaje aseguran que al ensamblar la membrana y la placa cada poro esté ubicado en una posición opuesta o por encima de su pocillo correspondiente y no haya desplazamientos en el posicionamiento de los poros por encima de los pocillos. Los pocillos de la placa de pocillos tienen un diámetro que es mayor que el diámetro de los poros de la membrana, lo que garantiza que después del ensamblaje una célula individual de interés, que se encuentra en un poro de la membrana porosa y, por lo tanto, está ubicada en una posición opuesta a un pocillo correspondiente, se encuentre en el pocillo y no asoma ni sobresale del borde de la pared lateral del pocillo.

Como resultado del ensamblaje, una célula individual aislada que se encuentra en un poro de la membrana está en contacto solo con el contenido de un pocillo de la placa de pocillos y se asigna a un pocillo específico de la placa. No se requieren etapas de manipulación individuales con respecto a las células individuales para transferir las células individuales aisladas a un pocillo específico, porque al ensamblar la membrana, que comprende múltiples células individuales de interés aisladas y en las que se ha verificado su identidad, y la placa de pocillos, cada una de las, por ejemplo, cientos o miles de células individuales aisladas se pueden colocar en/sobre/en una posición opuesta a un pocillo individual. Esta etapa muy eficaz y que minimiza la contaminación asegura una alta calidad de las muestras celulares y minimiza el riesgo de contaminación cruzada entre pocillos.

En formas de realización de la invención, los medios de ensamblaje forman parte de la cubierta de sellado.

Ejemplos de medios de ensamblaje serían estructuras mecánicas ubicadas en la placa y/o la membrana y/o la cubierta que permiten el ensamblaje de la placa y la membrana solo en una orientación específica, lo que asegura el posicionamiento de los poros en una posición opuesta a sus correspondientes pocillos.

En formas de realización de la invención, el procedimiento para analizar una o más células individuales de interés comprende adicionalmente un análisis microscópico del, al menos un, poro para células individuales retenidas.

Este análisis microscópico se realiza preferentemente después de la filtración de la suspensión celular. El análisis microscópico puede tener lugar antes o después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos. En formas de realización de la invención, el análisis microscópico se puede realizar antes o después de sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo.

Las formas de realización de la invención pueden combinar el enriquecimiento celular y el aislamiento celular a través de medios de filtración, preferentemente filtración por afinidad, con al menos dos etapas de análisis de células individuales, en la que estas etapas de análisis comprenden un análisis microscópico de la célula de interés aislada, lo que permite identificar la célula de interés aislada y confirmar su identidad, y un análisis de al menos un componente celular de una célula individual de interés aislada. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invención permite el aislamiento y el análisis de células individuales de interés con identidad confirmada en un procedimiento o sistema integrado, lo que minimiza las etapas de manipulación durante el aislamiento y el análisis de las células. Esta forma de realización del procedimiento de la presente invención reduce el riesgo de contaminación de muestras de células individuales y el análisis de células aisladas erróneamente, que no tienen la identidad deseada de las células de interés. Por tanto, este procedimiento proporciona una forma fiable, rápida y eficaz (en términos de tiempo y costes) de obtener información sobre las células de una población de células a nivel de células individuales.

Después de la etapa de filtrado, la membrana porosa con las células individuales de interés adheridas a los poros se puede analizar microscópicamente para verificar que las células adheridas a los poros de la membrana sean de hecho células de interés y no otras células de la suspensión celular compleja. Para esta etapa de análisis, se puede utilizar cualquier tipo de análisis microscópico que permita la identificación de células de interés. Un ejemplo preferido sería el análisis inmunocitoquímico (ICC) utilizando anticuerpos específicos de células.

Preferentemente, se analiza la membrana completa que contiene las células aisladas de forma que no se requiera un manejo, una tinción o una manipulación individual de células individuales. En consecuencia, la membrana completa con todas las células aisladas se puede analizar en un solo procedimiento de análisis, que podría implicar la tinción de las células con reactivos específicos, tales como anticuerpos específicos.

El análisis microscópico de la membrana se puede realizar antes o después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos. En general, las etapas del procedimiento de la presente invención no se enumeran en un orden cronológico específico, lo que representa un conjunto de eventos secuenciales que tienen que producirse en el orden enumerado. En cambio, el orden de las etapas del procedimiento puede variar y puede ser diferente del orden indicado. Por consiguiente, el orden de las diferentes etapas del procedimiento no es limitante con respecto a las formas de realización preferidas de la presente invención.

En formas de realización de la invención, las etapas del procedimiento se realizan en el orden siguiente

1. Filtrar la suspensión celular a través de la membrana porosa,

2. Ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo,

3. Sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta,

4. Analizar al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

Preferentemente, el análisis microscópico tiene lugar después de filtrar la suspensión celular y antes del análisis del, al menos un, componente celular de una célula retenida.

En formas de realización preferidas de la invención, cada pocillo de la placa de pocillos con el poro correspondiente y potencialmente una célula individual de interés retenida se sella antes de que se analice el, al menos un, componente celular de la célula individual de interés retenida. Antes de sellar, el pocillo se posiciona en una posición opuesta al poro de modo que la célula individual se ubique por encima del pocillo o dentro del mismo sin asomar por encima de las paredes laterales del pocillo.

El sellado de cada pocillo con el poro correspondiente y la célula individual ubicada por encima o dentro del pocillo se puede lograr colocando o presionando una cubierta sobre el lado de la membrana, que no se encuentra frente a la placa de pocillos después del ensamblaje de la placa de pocillos y la membrana. El sellado de los pocillos se puede lograr, por ejemplo, por medios mecánicos y/o térmicos, por ejemplo presionando la cubierta sobre la membrana, que a su vez se presiona sobre la placa de pocillos, mientras que la cubierta y/o la placa pueden templarse o calentarse.

El sellado de los pocillos individuales con los poros correspondientes y las células individuales garantiza que cada pocillo sellado comprenda solo un poro, que está ubicado por encima del pocillo después del ensamblaje de la placa y la membrana. En consecuencia, cada pocillo también contiene solo una célula individual de interés aislada, que se encuentra en el poro correspondiente. Sellando un pocillo que comprende su poro correspondiente con una célula individual aislada, se evita la contaminación de otros pocillos, por ejemplo los adyacentes. Esto es necesario, porque el análisis de uno o más componentes celulares de células individuales requiere espacios de reacción cerrados, a los que no puedan acceder los contaminantes.

El análisis de al menos un componente celular de una célula individual de interés aislada que se encuentra en un pocillo sellado después de ensamblar la membrana y la placa y sellar con la cubierta, se refiere al análisis de cualquier tipo de biomolécula que comprenda la célula individual de interés aislada. Por ejemplo, el análisis puede referirse a un análisis de secuenciación del genoma completo o un análisis de los ARNm específicos, por ejemplo mediante RT-PCR cuantitativa, o el transcriptoma completo de una célula. Los reactivos necesarios para dicho análisis están ya presentes en los pocillos de la placa, preferentemente ya en forma líquida. Alternativamente, los pocillos pueden contener los reactivos en forma seca, lo que requiere una etapa de rehidratación, que podría realizarse antes del ensamblaje de la placa y la membrana, o después del ensamblaje, por ejemplo mediante un sistema microfluídico que permite el suministro de líquidos a los pocillos sellados individuales.

En formas de realización de la invención, la placa de cubierta puede contener reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés. Dichos reactivos contenidos en la placa de cubierta pueden estar presentes en lugar de los reactivos o además de los reactivos contenidos en al menos un pocillo de la placa de pocillos.

Es una ventaja particular de la presente invención que los componentes celulares de células individuales aisladas pueden analizarse sin tener que transferir las células individuales por medios complicados, tales como un micromanipulador, a un sistema de análisis diferente. En cambio, las células individuales de interés individualizadas que se encuentran en los poros de la membrana después de la filtración pueden transferirse todas en una sola etapa a pocillos individuales de la placa, en los que se puede realizar el análisis posterior de los componentes celulares.

La etapa de sellado del procedimiento de la presente invención permite el análisis de componentes celulares de múltiples células individuales en un sistema integrado que no requiere el manejo o la manipulación de células individuales. Al filtrar la suspensión celular a través de la membrana porosa, las células individuales de interés se separan entre sí al asentarse como células individuales en los poros individuales de la membrana. Las células individuales aisladas/separadas que se encuentran en los poros de la membrana pueden analizarse microscópicamente para asegurar que la célula presente en un poro específico de la membrana sea una célula de interés prevista. Al ensamblar la placa de pocillos y la membrana porosa con la célula individual de interés aislada utilizando los medios de ensamblaje, que aseguran la orientación correcta de los pocillos y poros correspondientes, las células individuales se colocan en pocillos individuales sin necesidad de manipular células individuales. El sellado con una cubierta asegura que no haya contaminación cruzada de componentes de células individuales entre los diferentes pocillos. Por consiguiente, la presente invención permite el análisis de células individuales sin necesidad de clasificar o manipular o mover individualmente las células individuales. Esto permite el análisis paralelo de un gran número de células individuales de una forma muy eficaz, que es rápida y fiable.

Una "célula" o una "célula de interés" en el contexto de la presente invención se refiere, sin limitación, a una célula biológica, que podría derivarse de cualquier tipo de organismo, que comprende tanto organismos unicelulares como organismos multicelulares, tales como, por ejemplo, cualquier tipo de planta o animal, incluidos mamíferos, peces, anfibios, reptiles, aves, moluscos, artrópodos, anélidos, nematodos, platelmintos, cnidarios, ctenóforos y esponjas. Las células de la presente invención comprenden además células procariotas, bacterias, células eucariotas, células sanguíneas, células madre, células inmunitarias (tales como células B, células dendríticas, granulocitos, células linfoides innatas (ILC), megacariocitos, monocitos, macrófagos, células supresoras derivadas de mieloides (MDSC), células asesinas naturales (NK), plaquetas, glóbulos rojos (RBC), linfocitos T o timocitos), células cancerosas, células tumorales y células tumorales circulantes.

El término "célula", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, también se aplica al término "partícula biológica" y formas de realización específicas de partículas descritas en el presente documento. En consecuencia, todas las formas de realización preferidas de la presente invención descritas en el presente documento se aplican tanto a un procedimiento para el análisis de células individuales de interés como a un procedimiento para analizar una o más partículas biológicas individuales de interés. Además, las formas de realización preferidas de los procedimientos de la presente invención divulgadas en el presente documento también se aplican al dispositivo, al sistema y al kit para analizar células individuales de interés de la presente invención y también se divulgan en el contexto de estas formas de realización de la invención.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para analizar una o más partículas biológicas individuales de interés, que comprende

- proporcionar

i. una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una partícula biológica de interés cuando la partícula de interés se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de la suspensión celular pasen a través del poro,

ii. una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en el que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, en la que los reactivos se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca,

iii. medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos,

iv. una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos, y

- filtrar una suspensión celular líquida que comprende partículas biológicas de interés a través de la membrana porosa,

- opcionalmente, analizar microscópicamente el, al menos un, poro para detectar una partícula biológica individual retenida,

- ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo,

- sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta, - analizar al menos un componente biológico de una partícula biológica individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

El término "partícula biológica" en el contexto de la presente invención comprende, sin limitación, células de la presente invención, organismos unicelulares, microorganismos multicelulares, parásitos, virus, partículas víricas, cápsides víricas, bacteriófagos, fagos, cápsides de fagos y cápsides víricas artificiales. Las partículas comprenden además cualquier tipo de perlas o microperlas, que están acopladas a biomoléculas, tales como perlas magnéticas, perlas recubiertas de estreptavidina, perlas recubiertas de biotina, perlas recubiertas de anticuerpos y perlas que están acopladas a moléculas de ácido nucleico.

Las ventajas y formas de realización divulgadas para el procedimiento para analizar una o más células individuales de interés también se divulgan para las formas de realización de la invención que se refieren a un procedimiento para analizar una o más partículas biológicas individuales de interés.

La membrana porosa de la presente invención se utiliza para filtrar la suspensión celular que comprende las células de interés. La membrana puede ser plana o laminar y puede tener un espesor definido. La forma de la membrana se puede ajustar a la aplicación específica, por ejemplo para que sea compatible con los medios utilizados para filtrar la suspensión celular a través de la membrana porosa. La forma de la membrana no limita el alcance de la presente invención.

Formas de realización preferidas de la membrana porosa de la invención

La membrana porosa puede ser una membrana microfabricada que comprende al menos un poro, preferentemente múltiples poros, preferentemente 1000 - 1.000.000 poros.

Además, los poros tienen preferentemente todos un diámetro de poro idéntico o casi idéntico, que está ajustado específicamente al tamaño y la forma de la célula de interés. Preferentemente, el diámetro de poro es tal que el diámetro de una célula individual de interés es ligeramente mayor que el diámetro de poro, de modo que la célula de interés no pueda pasar a través del poro durante la filtración de la suspensión celular a través de la membrana porosa, al menos no sin entrar en contacto con los límites del poro. En el contexto de la invención, el poro puede tener diferentes formas geométricas con diferentes formas de la sección transversal del poro. Preferentemente, el poro presenta una sección transversal redonda o elíptica y es de forma cónica o cilíndrica. Sin embargo, cualquier tipo de geometría de poros adecuada para retener una célula individual de interés está comprendida en las formas de realización de la presente invención.

La membrana porosa de la presente invención comprende preferentemente un polímero, tal como un polímero termoplástico. Se prefieren membranas porosas que sean filtros de policarbonato, microtamices de nitruro de sílice, rejillas de TEM (microscopía electrónica de transmisión) de cobre o níquel, membranas que comprenden policarbonato, SU-8, parileno, ORMOCER® o silicio.

ORMOCER® es una clase de polímeros híbridos inorgánicos-orgánicos. ORMOCER® tiene propiedades tales como transparencia, dureza o estabilidad térmica/química, que están determinadas por la red inorgánica. Al reticularlo con una red orgánica es posible adaptar propiedades tales como la tenacidad, para mejorar la procesabilidad o la funcionalidad. Añadiendo grupos funcionales, se pueden adaptar específicamente otras propiedades, incluida la elasticidad, la energía superficial o la permeabilidad a los gases. Su adaptabilidad exclusiva es la principal ventaja de los materiales ORMOCER® y los hace atractivos para la aplicación en el contexto de la presente invención, especialmente para producir la membrana porosa.

En formas de realización preferidas de la presente invención, la membrana se recubre con un hidrogel y/o comprende anticuerpos inmovilizados.

Dichas modificaciones de superficie de la membrana porosa mediante el recubrimiento con un hidrogel y/o anticuerpos inmovilizados son ventajosas debido a que la membrana porosa puede modificarse por dichos medios para convertirse en una membrana de afinidad. Los hidrogeles y/o los anticuerpos pueden poseer determinadas propiedades de afinidad que pueden mejorar la unión específica de las células de interés en el poro de la membrana y reducir la unión no específica de células o componentes no deseados de la suspensión celular líquida. Esto permite la retención específica de células de interés en los poros de la membrana, incluso aunque las células pudieran pasar a través de los poros de una membrana no modificada. Por ejemplo, si una célula de interés pudiera pasar a través de un poro de un diámetro igual o inferior al diámetro de la célula, porque la célula es flexible y puede ajustar su forma para pasar a través del poro, podría quedar retenida en el poro si la superficie de la membrana o el poro se han modificado de una forma que da lugar a una unión específica de la célula de interés.

Los hidrogeles de la presente invención son redes poliméricas hinchables en agua, que pueden proteger las superficies de forma eficaz de la adhesión no específica de proteínas y células. Cuando se funcionalizan con grupos específicos, los recubrimientos de hidrogel permiten desencadenar la adhesión específica de las células.

Los hidrogeles preferidos para su uso en el recubrimiento de las membranas de la presente invención comprenden, sin limitación, hidrogeles de alginato, hidrogeles plurónicos, hidrogeles de gelatina o hidrogeles de quitina. Los ingredientes comunes de los hidrogeles incluyen, sin limitación, poli(alcohol vinílico), poli(acrilato de sodio), polímeros y copolímeros de acrilato con abundancia de grupos hidrófilos. Los materiales de hidrogel naturales comprenden agarosa, metilcelulosa, hialuronano y otros polímeros de origen natural.

En una forma de realización específicamente preferida de la presente invención, el sustrato se puede recubrir con un hidrogel de polidimetilacrilamida-co-metacriloilbenzofenona (PDMAA-MABP), que puede contener un reticulante fotoactivo, benzofenona (BP). El recubrimiento se puede lograr mediante recubrimiento por inmersión y posteriormente iluminando con luz UV (preexposición) para iniciar tanto la reticulación como la unión a la superficie mediante reacciones de inserción de C-H.

La superficie de la membrana porosa, que ya puede estar recubierta con un hidrogel, puede modificarse inmovilizando o uniendo biomoléculas con una afinidad específica por otras biomoléculas o células de la membrana. Las modificaciones preferidas de las superficies de las membranas comprenden la inmovilización de estreptavidina, anticuerpos, aptámeros y receptores o ligandos de receptores, tales como, por ejemplo, receptores Fc.

La inmovilización de dichas biomoléculas, preferentemente proteínas, con una afinidad específica en la superficie de una membrana recubierta con PDMAA-MABP se puede realizar después del recubrimiento por inmersión y la posterior iluminación con luz UV (preexposición) para iniciar tanto la reticulación como la unión a la superficie mediante reacciones de inserción de CH saturando la superficie, que todavía puede contener unidades de BP activas, con la proteína, por ejemplo estreptavidina, operación seguida de otro tratamiento con UV y una etapa de lavado para eliminar la proteína no unida.

Si la superficie recubierta con hidrogel se ha modificado mediante inmovilización de estreptavidina, el proceso de modificación puede completarse uniendo moléculas de captura biotiniladas específicas de la célula diana, tales como un anticuerpo o un aptámero, a la membrana mediante una sencilla incubación. Este proceso de modificación de superficie es particularmente ventajoso, porque produce una distribución homogénea de proteínas inmovilizadas de forma estable y permite controlar el grado de funcionalización variando la dosis de energía de la preexposición.

Los anticuerpos preferidos u otras moléculas utilizadas para la modificación de superficie de la membrana para el aislamiento de células de interés específicas pueden unirse a receptores específicos o biomoléculas en la superficie de las células de interés.

Los anticuerpos inmovilizados preferidos de la presente invención comprenden, sin limitación, anticuerpos con afinidad por EpCAM, EGFR, HER2 y MUC-1.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el diámetro de poro se encuentra en el intervalo de aproximadamente 10 nm a 1000 pm, preferentemente de 100 nm a 100 pm, de forma más preferida de 1 pm a 50 pm, de la forma más preferida de 5 a 20 pm.

Una gran ventaja de la presente invención es que es posible aislar células individuales o partículas biológicas de tamaños muy diferentes a partir de una suspensión celular líquida compleja, que comprende una diversidad de partículas biológicas y/o células. El diámetro de poro de la membrana se puede ajustar al diámetro de la célula o partícula de interés. Por ejemplo, las partículas víricas, las cápsides víricas y las cápsides víricas artificiales suelen encontrarse en el intervalo de 20 a 300 nm, dependiendo del tipo de virus o cápside. La mayor parte de los procariotas miden entre 1 pm y 10 pm, pero su tamaño puede variar de 0,2 pm (Mycoplasma genitalium) a 750 pm (Thiomargarita namibiensis), según el tipo. Las células eucariotas también varían en tamaño, aunque generalmente tienen un diámetro de 2 a 20 pm, pero también pueden ser más pequeñas o más grandes. Por ejemplo, los megacariocitos tienen un diámetro de aproximadamente 160 pm y, por lo tanto, requerirían tamaños de poro más grandes para el aislamiento en el contexto de la presente invención en comparación con, por ejemplo, los eritrocitos, que tienen un diámetro de aproximadamente 6 pm y son muy flexibles.

Un experto es capaz de seleccionar el diámetro adecuado para la respectiva aplicación y célula o partícula de interés, por ejemplo, basándose en el tamaño y la rigidez/flexibilidad de la respectiva partícula o célula de interés. Además, el experto sabe cómo ajustar el tamaño/diámetro de poro respectivo dependiendo de las modificaciones de superficie de la membrana.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, el diámetro de poro varía de 5 pm a 12 pm. Otras formas de realización preferidas comprenden tamaños de poro de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 pm. Estos tamaños de poros son particularmente preferidos para aislar células de mamíferos o seres humanos que se encuentran en circulación en el torrente sanguíneo. Por ejemplo, mediante el uso de membranas con diámetros de poro de este tipo, es posible las células tumorales circulantes (CTC) de una muestra de sangre de un paciente con cáncer, porque los glóbulos blancos y rojos incluidos en una muestra de sangre pueden atravesar poros de este tamaño sin quedarse atascados en los poros, debido a su tamaño relativamente pequeño y su flexibilidad comparativamente alta.

Según otra forma de realización preferida de la presente invención, los poros están dispuestos en una estructura ordenada sobre la membrana, en la que la posición de los poros es complementaria a la posición de los pocillos en la placa de pocillos.

El término "estructura ordenada" se refiere a una disposición de los poros y pocillos en una formación bidimensional repetitiva y uniforme en la membrana y en la placa, respectivamente. Por ejemplo, los pocillos o poros de una membrana o placa pueden disponerse de manera que cada poro/pocillo tenga la misma distancia a sus poros/pocillos adyacentes, lo que proporciona una disposición repetitiva de los poros/pocillos en la membrana/placa.

Además, los poros/pocillos pueden disponerse en una cuadrícula rectangular, en la que los poros están dispuestos en líneas horizontales y verticales en la membrana y los poros/pocillos de cada línea pueden tener todos la misma distancia a sus dos pocillos/poros adyacentes, siendo las líneas horizontales y verticales rectangulares entre sí. Alternativamente, los poros/pocillos pueden disponerse en líneas horizontales que están desplazadas entre sí, de modo que las líneas horizontales no sean rectangulares con respecto a las líneas verticales de poros/pocillos, sino que formen líneas diagonales entre sí.

Es importante destacar que los pocillos y poros de la placa y la membrana de la presente invención pueden disponerse en estructuras ordenadas correspondientes que sean complementarias entre sí. Esto asegura que tras el ensamblaje de la membrana y la placa, cada poro de la membrana se coloque en una posición opuesta al pocillo correspondiente de la placa.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, la membrana tiene un espesor de 2 a 100 pm, preferentemente de 5 a 20 pm.

Es particularmente preferible que la membrana tenga un espesor de 2-100 pm debido a que dichas membranas poseen la estabilidad requerida para resistir la presión aplicada durante la filtración de la suspensión celular, a la vez que es posible sellar los poros de la membrana dispuestos por encima del correspondiente pocilio de la placa de pocilios con la cubierta, por ejemplo utilizando medios mecánicos y/o térmicos. Un mayor espesor permite aplicar una mayor presión durante la filtración o aplicar mayores fuerzas mecánicas sin romper ni desgarrar la membrana. En consecuencia, se prefieren membranas más gruesas para la filtración de líquidos a alta presión. Por otra parte, las membranas finas, que preferentemente están fabricadas de materiales termoplásticos que permiten la deformación y la fusión con otros plásticos al calentarse, se prefieren para asegurar un proceso de sellado eficaz con la cubierta, debido a que la aplicación de pequeñas fuerzas mecánicas y/o calor puede dar lugar ya a una deformación de la membrana que permite un sellado eficaz del pocillo con el poro y las células ubicadas por encima del pocillo o en el mismo.

Un espesor de 5-20 gm es particularmente preferido debido a que representa un espesor de membrana que asegura la estabilidad de la membrana cuando se aplica una presión de filtración necesaria para filtrar una suspensión celular que comprende células sanguíneas de mamífero y/o células tumorales circulantes. Por otra parte, una membrana que tiene un espesor de 5-20 gm se sella y se fusiona de manera muy eficaz con la placa de pocillos y la cubierta cuando la cubierta se aplica a la placa y la membrana ensambladas. Además, una membrana con un espesor de 5-20 gm y los poros comprendidos solo añaden un volumen muerto muy pequeño al volumen de los pocillos después del ensamblaje, lo que es ventajoso para un análisis eficaz de los componentes celulares.

En una forma de realización particularmente preferida del procedimiento de la presente invención, las células de interés son células tumorales circulantes y los anticuerpos inmovilizados comprenden anticuerpos con afinidad por EpCAM.

El término "lado" en el contexto de la membrana de la presente invención se refiere a las dos superficies llanas o planas de la membrana. Los dos lados se pueden designar como lado frontal o de suministro y como lado posterior o de descarga. El lado frontal (o lado de suministro) de la membrana es el lado que está expuesto a la suspensión celular durante el paso de filtración. El lado posterior (o lado de descarga) es el lado de la membrana, en el que el líquido que ha pasado a través de los poros de la membrana se libera de los poros.

En determinadas formas de realización de la presente invención, la membrana tiene dos lados iguales que son intercambiables con respecto a su función como lado frontal o posterior durante el proceso de filtración. En formas de realización preferidas adicionales, la membrana se puede ensamblar con la placa de pocillos en ambas direcciones, ya sea con el lado frontal o el lado posterior orientado hacia la placa de pocillos.

Según otra forma de realización preferida de la presente invención, la membrana porosa posee un lado frontal plano, que está expuesto a la suspensión celular líquida durante el proceso de filtración, y el lado posterior comprende medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos. En esta forma de realización preferida de la presente invención, el lado posterior se coloca sobre la placa de pocillos de modo que los medios de ensamblaje o la membrana porosa puedan acoplarse con los medios de ensamblaje de la placa de pocillos, lo que asegura que los poros de la membrana estén ubicados en una posición opuesta al pocillo correspondiente en la membrana.

Formas de realización preferidas relativas a la filtración y el lavado de la membrana

Las formas de realización preferidas del procedimiento de la presente invención también comprenden la provisión de medios para filtrar la suspensión celular líquida a través de la membrana porosa.

Los medios para filtrar la suspensión celular líquida se pueden conectar a la membrana de filtro porosa de forma que se aplique una suspensión celular líquida al lado frontal de la membrana y el flujo a través del proceso de filtración se pueda recolectar después de la liberación desde el lado posterior de la membrana. Los medios para filtrar la suspensión celular líquida comprenden, sin limitación, sistemas de filtración clásicos que utilizan membranas de filtro, tales como adaptadores que se pueden conectar a una membrana y a una jeringa, que se pueden utilizar para aplicar la suspensión celular líquida a la membrana.

Preferentemente, los medios para filtrar la suspensión celular líquida se refieren a sistemas de filtración que permiten la aplicación de una suspensión celular líquida a la membrana porosa con una presión de filtración controlable (presión transmembrana). Se prefiere particularmente que la presión de filtración sea controlable, porque la presión de filtración puede influir en la selectividad y la especificidad de la membrana porosa con respecto al tipo de célula que se retiene en los poros.

Además, los sistemas de filtración de la presente invención pueden comprender sistemas hidrostáticos con depósitos de líquido. Dichos depósitos de líquido pueden ser ventajosos, por ejemplo, para aplicar soluciones tampón a la membrana después de la filtración para lavar la membrana porosa y reducir la unión no específica de células o partículas no deseadas.

El procedimiento de la presente invención comprende preferentemente lavar la membrana antes del ensamblaje con la placa de pocillos para eliminar las células unidas de forma no específica.

El lavado de la membrana después de la filtración puede producirse de varias formas automáticas o manuales. Por ejemplo, se puede aplicar un tampón de filtración o un tampón de lavado a la membrana desde el lado frontal o el lado posterior por medio de un sistema de filtración con una presión de filtración específica controlada para eliminar las células que se han unido débilmente a los poros de la membrana y pueden pasar a través de la membrana tras la aplicación de un volumen de líquido adicional o una mayor presión de filtración. Por ejemplo, si la membrana porosa se ha modificado para que contenga anticuerpos inmovilizados que son específicos de las células de interés que hay que aislar, es posible eliminar las células que se quedaron atascadas en los poros de la membrana porque tienen un tamaño similar al de las células de interés incrementando el aumento de la presión de filtración, mientras que las células de interés permanecerán unidas a los poros, porque se han unido además a los anticuerpos, lo que da lugar a una unión más estrecha de las células de interés. El lavado del lado posterior demostró ser particularmente eficaz para eliminar las células contaminantes u otro material unido de forma no específica.

En otra forma de realización de la invención, la membrana se puede lavar oscilando la membrana en un recipiente que contenga un tampón de lavado adecuado, que no solo eliminará células o partículas que se han unido de manera no específica a los poros o la membrana, sino también células o partículas que se han unido a las superficies planas de la membrana, específicamente al lado frontal, que se ha expuesto a la suspensión celular líquida durante la filtración.

Formas de realización preferidas del análisis microscópico y el análisis de componentes celulares

Preferentemente, el procedimiento de la presente invención comprende un análisis microscópico de al menos un poro para detectar células individuales retenidas.

La etapa de análisis microscópico es particularmente ventajosa en el contexto de la presente invención, porque permite la verificación de la identidad, el fenotipo o el tipo celular de la célula individual retenida que se encuentra en un poro después de la filtración de una suspensión celular líquida a través de la membrana de filtro. En consecuencia, es posible excluir del análisis de datos un poro o un pocillo que contiene un tipo de célula no deseado después de realizar el procedimiento de la presente invención y se puede estar seguro de la identidad de cada una de las células individuales aisladas y analizadas, ya sea una célula de interés o un tipo de célula diferente. Por lo tanto, es posible generar datos recopilados a partir del análisis de múltiples células individuales de interés que no se contaminarán con los resultados que se han generado debido al análisis de un tipo de célula no deseado.

El análisis microscópico puede comprender cualquier tipo de análisis que sea adecuado para verificar que una célula que se encuentra en un poro de la membrana es una célula de interés, tal como por ejemplo, microscopía de campo claro o análisis inmunocitoquímico (ICC).

La inmunocitoquímica (ICC) es una técnica de laboratorio habitual que se utiliza para visualizar la localización de una proteína específica o un antígeno específico en o sobre una célula de interés mediante el uso de un anticuerpo primario específico que se une al mismo, por ejemplo. El anticuerpo primario permite la visualización de la proteína utilizando un microscopio de fluorescencia, particularmente cuando se ha unido con un anticuerpo secundario que tiene un fluoróforo conjugado.

En el contexto del procedimiento de la presente invención, la ICC se puede realizar utilizando uno o más marcadores de la célula de interés, preferentemente marcadores de superficie celular. En el caso de las CTC como células de interés, los marcadores adecuados comprenden, sin limitación, CK8, CK18, CK19, EpCAM y CD45. Adicionalmente, se pueden usar colorantes de ADN o marcadores nucleares, tales como DAPI y/o Hoechst. Es posible combinar varios marcadores en ICC utilizando fluoróforos distinguibles para visualizar el marcador respectivo, por ejemplo, por medio de anticuerpos marcados con fluoróforo.

Los fluoróforos (o fluorocromos) que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención son compuestos químicos fluorescentes que pueden reemitir luz tras una fotoexcitación. Los fluoróforos para su uso como marcadores en la construcción de biomoléculas marcadas de la invención comprenden, sin pretender ser exhaustivos, rodamina y derivados, tales como Texas Red, fluoresceína y derivados, tales como 5-bromometilfluoresceína, Lucifer Yellow, IAEDANS, 4-acetato de 7-Me2N-cumarina, 3-acetato de 7-OH-4-CH3-cumarina, 3-acetato de 7-NH2-4CH3-cumarina (AMCA), monobromobimano, trisulfonatos de pireno, tales como Cascade Blue, y monobromotrimetil-amoniobimano, FAM , TET, CAL Fluor Gold 540, HEX, JOE, VIC, CAL Fluor Orange 560, Cy3, NED, Quasar 570, Oyster 556, TMR, CAL Fluor Red 590, ROX, LC red 610, CAL Fluor Red 610, Texas red, lC red 610, CAL Fluor Red 610, LC red 640, CAL Fluor Red 635, Cy5, LC red 670, Quasar 670, Oyster 645, LC red 705, Cy5.5, BODIPY FL, Oregon Green 488, Rhodamine Green, Oregon Green 514, Cal Gold, BODIPY R6Gj, Yakima Yellow, JOE, HEX, Cal Orange, BODIPY TMR-X, Quasar-570 /Cy3, TAMRA, Rhodamine Red-X, rodamina B, rodamina 6G, Redmond Red, BODIPY 581/591, Cy3.5, Cal Red/Texas Red, BODIPY TR-X, BODIPY 630/665-X, Pulsar-650, Quasar-670/Cy5.

El análisis microscópico se puede realizar mediante cualquier configuración de microscopía adecuada y se puede realizar de forma manual o automatizada. Es particularmente preferido realizar un análisis microscópico automatizado de cada poro de la membrana porosa, ya que con el mismo se economiza tiempo y se reduce la carga de trabajo para el personal que realiza el análisis. Los datos generados por el análisis microscópico se pueden asignar a la ubicación o la posición de cada una de las células individuales aisladas en la membrana de modo que sea posible vincular los datos microscópicos a la posición de una célula individual en la membrana y/o la placa de pocilios y a los datos del análisis de un componente celular. Esto significa que el procedimiento de la presente invención permite vincular el análisis de la identidad celular al análisis de los componentes celulares para cada una de las células analizadas en el procedimiento.

El procedimiento de la presente invención comprende un análisis de al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

El término "componente celular" se refiere a cualquier tipo de biomolécula que esté comprendida por la célula individual retenida. Las biomoléculas en el contexto de la presente invención comprenden, pero sin limitación, ácidos nucleicos, proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos, moléculas de azúcar, lípidos y combinaciones de los mismos, tales como, por ejemplo, proteínas glicosiladas u otras biomoléculas glicosiladas.

Los ácidos nucleicos en el contexto de la presente invención comprenden, sin limitación, ADN, ARN, APN, ADNmc, ADNbc, ARN, ARNm, ARNt, ARNncl, ARNnc, microRNA, ARNip, ARNr, ARNgs (sgRNA), ARNpi (piRNA), ARNm ^{reportero (rmRNA), ARNnp, ARNnop (snoRNA), ARN pequeño de cuerpos de Cajal (scaRNA), ARNg,} ArN ^vírico, ARN modificado, tal como por ejemplo ANB (LNA). Los oligonucleótidos en el contexto de la presente invención son moléculas de ácido nucleico relativamente cortas de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.

Las moléculas de azúcar en el contexto de la presente invención comprenden carbohidratos o sacáridos, incluidos monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. El término glicosilación describe reacciones enzimáticas y químicas que conducen a la unión de una molécula de azúcar a una proteína, un lípido u otras moléculas, en el que las moléculas del producto glicosilado se denominan glicósidos, que incluyen glicoproteínas, peptidoglicanos y glicolípidos.

En el contexto de la presente invención, los lípidos son moléculas hidrófobas que son parcialmente o completamente insolubles en agua y, debido a su baja polaridad, se disuelven en disolventes lipófilos o hidrófobos. Los lípidos son componentes estructurales importantes de las membranas celulares, se utilizan como fuente de energía en los organismos vivos y tienen funciones en la transducción de señales. Los lípidos comprenden, sin limitación, ácidos grasos, grasas, ceras, esteroles, vitaminas liposolubles (tales como las vitaminas A, D, E y K), monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, lipopolisacáridos e isoprenoides (terpenoides).

El análisis del, al menos un, componente celular puede referirse, por ejemplo, al análisis de la presencia, la abundancia, la secuencia y/o la función de una o más biomoléculas de la célula de interés. El análisis de la presente invención comprende preferentemente la ejecución de un programa de temperatura definido. Los análisis preferidos de los componentes celulares de la presente invención comprenden, sin limitación, análisis por PCR de una o más secuencias de ácido nucleico, RT-PCR cuantitativa de uno o más genes, amplificación del genoma completo, secuenciación de uno o más genes, secuenciación del genoma completo, análisis de transcriptomas, traducción in vitro, ensayos enzimáticos y análisis electroforético.

Una forma de realización preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, en el que el análisis de al menos un componente celular de una célula retenida comprende una amplificación de ácido nucleico.

En una forma de realización preferida de la presente invención, la célula de interés es una CTC y el análisis de los componentes celulares está dirigido al análisis de la expresión de genes supresores de tumores y/o oncogenes y/o al análisis de mutaciones de oncogenes y/o genes supresores de tumores. Otros análisis preferidos de las CTC se refieren a la expresión de marcadores específicos, que pueden analizarse mediante análisis de ICC o de ácidos nucleicos, por ejemplo, en los que dichos marcadores proporcionan pistas sobre las propiedades de célula madre de la CTC o son relevantes para elegir una estrategia terapéutica adecuada, especialmente en el contexto de la medicina personalizada.

Formas de realización preferidas de la placa de pocilios y análisis de componentes celulares

Según formas de realización preferidas de la presente invención, los pocillos de la placa contienen reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, pudiendo proporcionarse los reactivos en forma líquida o en forma seca.

En formas de realización preferidas de la presente invención, los reactivos se proporcionan a los pocillos en forma líquida. Dichas formas de realización son particularmente ventajosas, porque los reactivos no necesitan rehidratarse y los reactivos líquidos se proporcionan a la placa en un formato listo para su uso.

La provisión de los reactivos en forma seca es particularmente ventajosa si las placas se almacenan durante períodos prolongados antes de su uso, porque los reactivos secos pueden ser más estables que los reactivos líquidos reconstituidos.

En una forma de realización preferida del procedimiento de la presente invención, los pocilios no contienen reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés. En consecuencia, los reactivos deben añadirse a los pocillos después del ensamblaje de la placa y la membrana. Esto es posible, por ejemplo, por medio de un sistema microfluídico, que está conectado a los pocillos individuales de la placa de pocillos, pudiendo transportar los sistemas microfluídicos reactivos líquidos a los pocillos individuales, por ejemplo, después de que se haya sellado el pocillo.

Algunas formas de realización preferidas de la presente invención comprenden medios para aplicar un líquido a uno o más pocillos de la placa de pocillos. El líquido puede ser, por ejemplo, un tampón de rehidratación o agua, que se puede utilizar para disolver o rehidratar los reactivos secos que están contenidos en los pocillos. En formas de realización adicionales de la invención, el líquido puede comprender los reactivos para analizar al menos un componente de la célula de interés, que se aplican al, al menos un, pocillo de la placa de pocillos. Los medios para aplicar un líquido a uno o más pocillos de la placa de pocillos comprenden, por ejemplo, una pipeta, una pipeta multicanal o un sistema microfluídico que está conectado a los pocillos.

Otras formas de realización de la presente invención se refieren a un procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, en el que diferentes pocillos pueden contener reactivos iguales o diferentes para analizar al menos un componente de la célula de interés.

En una forma de realización preferida de la presente invención, diferentes pocillos de la placa de pocillos contienen los mismos reactivos para analizar al menos un componente de la célula de interés. Esta forma de realización es particularmente ventajosa, porque permite analizar todas las células individuales aisladas de la misma manera y comparar la célula individual con respecto al componente o parámetro analizado. El llenado de los pocillos de la placa es sencillo, porque todos los pocillos contienen reactivos idénticos y no hay riesgo de contaminar los pocillos adyacentes.

Según otra forma de realización preferida de la presente invención, diferentes pocillos de la placa de pocillos contienen diferentes reactivos para analizar al menos un componente de la célula de interés. Por ejemplo, en el caso de un análisis de PCR, diferentes pocillos podrían contener cebadores con diferentes secuencias que se utilizan para amplificar diferentes secuencias de ácidos nucleicos. En otra forma de realización de la presente invención, diferentes pocillos pueden contener diferentes códigos de barras de secuenciación, de modo que incluso después de agrupar el contenido de diferentes pocillos después de la amplificación, los ácidos nucleicos amplificados se pueden asignar a una célula específica que se encontraba en un poro específico de la membrana después de la filtración.

Una forma de realización preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, en el que la progresión del análisis se detecta en tiempo real. Por ejemplo, la progresión de una reacción de amplificación de ácido nucleico se puede controlar en tiempo real mediante el uso de colorantes fluorescentes intercalados, sondas de ácido nucleico marcadas fluorescentemente que cambian sus propiedades de emisión durante la amplificación de la molécula diana.

Los colorantes fluorescentes intercalados que se pueden utilizar para la detección en tiempo real de ácidos nucleicos amplificados en el contexto de la presente invención comprenden, sin limitación, bromuro de etidio, yoduro de propidio, Hoechst 33258, Hoechst 33342, naranja de acridina, homodímeros de bromuro de etidio, EvaGreen y todos los colorantes de las familias SYBR y SYTO. Dichos colorantes también incluyen POPO, BOBO, YOYO y TOTO de Molecular Probes (Eugene, Oreg.).

Se prefiere que el procedimiento de la presente invención comprenda proporcionar un adaptador para disponer la placa de pocillos, la membrana y la cubierta ensambladas en un analizador.

Dichos adaptadores de la presente invención pueden ser muy útiles para disponer la placa, la membrana y la cubierta ensambladas de la presente invención en diferentes máquinas de análisis que están configuradas para analizar muestras que se proporcionan en formatos estándar. Dado que la placa, la membrana y la cubierta microfabricadas de la presente invención pueden no ser compatibles con los analizadores disponibles comercialmente, se puede utilizar un adaptador adecuado. Dichos adaptadores están diseñados de forma que puedan disponerse en el analizador respectivo, mientras que pueden acomodar también la placa de pocillos, la membrana y la cubierta ensambladas. Preferentemente, los adaptadores son térmicamente conductores de modo que puedan transmitir cambios de temperatura del analizador a la placa de pocillos del dispositivo de la presente invención.

Mediante el uso de una diversidad de adaptadores diferentes, es posible disponer la placa de pocillos, la membrana y la cubierta ensambladas en muchas máquinas de análisis diferentes para diferentes tipos de reacciones analíticas. Los analizadores de la presente invención comprenden, sin limitación, termocicladores disponibles comercialmente, termocicladores para la detección en tiempo real de reacciones de amplificación, lectores de fluorescencia, lectores de placas para determinar la dispersión de luz, nefelometría, fluorescencia, luminiscencia o absorbancia, microscopios automatizados, sistemas de micromanipuladores, secuenciadores o dispositivos electroforéticos.

Según formas de realización preferidas de la presente invención, el, al menos un, pocillo está conectado a un sistema microfluídico que permite el transporte de líquidos desde y hacia los pocillos.

Los sistemas microfluídicos que están conectados a los pocilios de la presente invención permiten el transporte específico de líquidos desde y hacia los pocillos de la placa. Esto permite el llenado de los pocillos, por ejemplo, con reactivos para el análisis de componentes celulares, y el transporte del contenido del pocillo, en particular después de que se haya producido la reacción de análisis (por ejemplo, una amplificación de ácido nucleico), a los sistemas conectados que se utilizan para aplicaciones posteriores.

En formas de realización preferidas de la presente invención, el, al menos un, componente de la célula individual retenida se usa para el procesamiento posterior después del análisis. Las aplicaciones posteriores o el análisis de los componentes analizados de las células individuales de interés pueden ser, por ejemplo, secuenciación de análisis de secuencias de ácido nucleico amplificadas, secuenciación del genoma completo después de la amplificación del genoma completo o análisis electroforético de secuencias de ácido nucleico amplificadas.

El transporte de los componentes celulares analizados desde los pocillos a los dispositivos o sistemas para aplicaciones posteriores puede tener lugar a través de sistemas microfluídicos y/o sistemas adaptadores complejos. Dichos sistemas adaptadores complejos pueden comprender sistemas microfluídicos que están conectados al sistema microfluídico de la placa de pocillos y/o de los sistemas para el análisis posterior de los componentes celulares analizados.

En formas de realización alternativas de la presente invención, los componentes celulares analizados, tales como moléculas de ácido nucleico amplificadas, podrían eliminarse de los pocillos por medio de un micromanipulador, que podría penetrar a través de la cubierta y/o la membrana dispuesta por encima del pocillo, en el que la cubierta y/o la membrana pueden tener un punto de rotura predeterminado, pudiendo penetrar el micromanipulador a través de la cubierta y/o la membrana. En formas de realización preferidas de la invención, esta etapa de eliminar los componentes celulares analizados de los pocillos se puede realizar mediante un micromanipulador que comprende múltiples agujas paralelas que pueden penetrar en múltiples pocillos en paralelo para eliminar el líquido que comprende los productos de reacción.

La forma del, al menos un, pocillo de la placa de pocillos se puede elegir libremente. Los pocillos de la presente invención pueden tener cualquier forma que sea compatible con las características de la presente invención, incluidos, sin limitación, pocillos cilíndricos, cónicos, de fondo plano o de fondo redondo. Pueden ser preferidos los pocillos cónicos o cilíndricos, ya que permiten una reducción del volumen de los pocillos sin dejar de tener un diámetro amplio en la abertura o la parte superior del pocillo, que rodea el poro que comprende la célula de interés después del ensamblaje de la placa, la membrana y la cubierta.

Otras formas de realización preferidas de la presente invención

La membrana y/o la placa de la presente invención comprenden medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar al menos un poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo. Dichos medios de ensamblaje son particularmente importantes para asegurar que cada poro de la membrana esté posicionado en una posición opuesta al correspondiente pocillo de la placa después del ensamblaje. Los medios adecuados en el contexto de la presente invención comprenden estructuras mecánicas que aseguran que la membrana y la placa solo se puedan ensamblar de una manera específica que asegure la orientación correcta de los pocillos y los poros. Además, se pueden utilizar marcas o etiquetas ópticas que indiquen cómo deben orientarse la membrana y la placa entre sí para garantizar la posición óptima de los poros y los pocillos. Dichas marcas también pueden ser orificios en la membrana, que pueden servir como marcas ópticas o pueden encajarse con las estructuras correspondientes de la placa de pocillos o la cubierta.

Una forma de realización preferida adicional se refiere al procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, en el que los medios de ensamblaje son estructuras mecánicas complementarias de la membrana y la placa de pocillos, en el que las estructuras mecánicas de la membrana y las estructuras mecánicas de la placa de pocillos se acoplan entre sí cuando la membrana y la placa de pocillos se ensamblan en una orientación para posicionar al menos un poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo y evitar el ensamblaje de la membrana y la placa de pocillos en una orientación diferente.

La presente invención comprende una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa del pocillo. La cubierta se puede combinar con la membrana antes o después de ensamblar la membrana y la placa de pocillos. La cubierta debe diseñarse de forma que pueda sellar herméticamente los pocillos, mientras que la membrana con los poros y la célula retenida de interés están encerradas entre la cubierta y los bordes del pocillo respectivo.

Esto se puede lograr, por ejemplo, mecánicamente y/o térmicamente presionando la cubierta sobre la membrana y la placa ensambladas, preferentemente mientras se aplica calor, que es un proceso similar al laminado clásico. Además, el proceso de sellado puede implicar procesos químicos adicionales, tales como procesos de laminación reactiva, que se basan en recubrimientos poliméricos que pueden ser térmicamente reticulables y/o fotorreticulables. Preferentemente, el sellado se produce mediante una reacción mecánico-térmica o una reacción química.

En formas de realización preferidas de la presente invención, la placa de cubierta y/o la placa de pocilios y/o la membrana de la presente invención se recubren con un polímero de laminación reactiva, que permite la reticulación del polímero, por ejemplo mediante estimulación térmica o fotoestimulación. Dichos procedimientos son conocidos por el experto en la técnica y se han descrito en la literatura, como por ejemplo por Kelb et al. (Kelb, C.; Rother, R.; Schuler, A.-K.; Hinkelmann, M.; Rahlves, M. et al.: Manufacturing of embedded multimode waveguides by reactive lamination of cyclic olefin polymer and polymethylmethacrylate. Optical Engineering 55 (2016), Nr. 3, 37103. DOI: https://doi.org/10.1117/1.OE.55.3.037103).

Según formas de realización preferidas adicionales, el proceso de sellado puede basarse en, o implicar adicionalmente, la inserción en aceite.

La presente invención también se refiere a un dispositivo para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de una suspensión celular pasen a través del poro

- una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en el que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, pudiendo proporcionarse los reactivos en forma líquida o en forma seca,

- medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos,

- una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa del pocillo.

Preferentemente, todos los componentes de un dispositivo de la presente invención son transparentes y permiten la transmisión de luz.

En formas de realización del dispositivo de la invención, en la configuración ensamblada, un pocillo de la placa de pocillos solo puede estar en contacto con un poro de la membrana porosa. En consecuencia, después de realizar el procedimiento de la invención utilizando el dispositivo de la invención, un único pocillo normalmente está en contacto únicamente con una única célula que ha sido retenida en un poro de la membrana porosa. Esta es una gran ventaja del dispositivo de la invención en comparación con los sistemas de placa de filtro del estado de la técnica que comprenden pocillos de tamiz con múltiples poros en una malla, en los que el pocillo de tamiz está ubicado en una posición opuesta a un pocillo de la placa de depósito, de modo que en un solo pocillo están ubicados múltiples poros que pueden haber retenido múltiples células. Por consiguiente, el análisis de una célula individual retenida en el pocillo del depósito no es posible, a diferencia del sistema de la invención. La invención se refiere además a un sistema para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- un dispositivo para analizar una o más células individuales de interés según la presente invención, y

- medios para filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa, y/o

- una configuración de microscopía para analizar el, al menos un, poro de la membrana para detectar células individuales retenidas, y/o

- un analizador para el análisis de al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

Además, la presente invención se refiere a un kit para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- un dispositivo para analizar una o más células individuales de interés según la presente invención, y

- reactivos para visualizar células retenidas en la membrana porosa para el análisis microscópico, y/o

- reactivos para el análisis de al menos un componente celular de una célula individual retenida en al menos un pocillo sellado.

El experto en la técnica sabe que las características, propiedades y ventajas enumeradas anteriormente para el procedimiento para analizar una o más células individuales de interés de la presente invención se aplican igualmente al dispositivo, el sistema y el kit para analizar una o más células individuales de interés de la presente invención. Es obvio que las características preferidas del procedimiento de la invención pueden integrarse en el dispositivo, el sistema o el kit, ya que el procedimiento se realiza con la ayuda del dispositivo, el sistema o el kit. Por consiguiente, todas las características y ventajas del procedimiento de la presente invención también se han descrito en el contexto del dispositivo, el sistema o el kit. A la inversa, las características que se han descrito en el contexto del dispositivo, el sistema o el kit también se aplican al procedimiento de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La invención se describe con más detalle por medio de las figuras siguientes. Estas no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan formas de realización preferidas de aspectos de la invención que se proporcionan para una mayor ilustración de la invención descrita en el presente documento.

Breve descripción de las figuras:

Figura 1: Esquema de la plataforma propuesta para el enriquecimiento y análisis de células individuales de CTC.

Figura 2: Esquema de un producto modular que permite estudios de células individuales en CTC capturadas utilizando un equipo de laboratorio estándar.

Figura 3: Representación esquemática de un flujo de trabajo propuesto para el acoplamiento eficaz del aislamiento y la secuenciación de células tumorales circulantes individuales.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente mediante los ejemplos siguientes. Estos no pretenden limitar el alcance de la invención, sino que representan formas de realización preferidas de aspectos de la invención proporcionadas para una mayor ilustración de la invención descrita en el presente documento.

Ejemplo 1:

Lo siguiente es una descripción de la plataforma de análisis integrada descrita mediante los dibujos de la figura 1.

En el centro de la plataforma se encuentra una membrana, que permite el enriquecimiento de células de interés, tales como células cancerosas o CTC, utilizando criterios de separación física. Opcionalmente, la membrana también puede utilizar procedimientos de afinidad para la retención y el aislamiento de células de interés, por ejemplo anticuerpos. Este enfoque combinado, que se ha introducido recientemente (31), puede mejorar el rendimiento de captura de la microfiltración clásica y permite un análisis celular de alta calidad (figura 1 A). Para permitir el análisis posterior de una célula individual, se utiliza una membrana con ubicaciones de poros definidas con precisión. Después del enriquecimiento celular, dicha membrana contiene las CTC capturadas bien separadas y en ubicaciones bien definidas (es decir, en/sobre los poros). Esto significa que las dos etapas iniciales, que son necesarias para el análisis de células individuales de CTC (es decir, el enriquecimiento y la separación de células individuales), se llevan a cabo a la vez. Las células capturadas se observan y se identifican después utilizando microscopía estándar y protocolos ICC (figura 1 B).

Para evitar más etapas de transferencia celular para permitir el análisis molecular de una célula individual, se utiliza un ensamblaje innovador que transforma cada poro en una cámara de reacción individual intercalando la membrana entre una lámina de cubierta y una placa de micropocillos hecha a medida que contiene los componentes necesarios (es decir, la mezcla maestra) (figura 1C). El ensamblaje de detección herméticamente sellado se inserta posteriormente en un termociclador estándar para realizar las reacciones de amplificación deseadas (es decir, PCR o RT-PCR para amplificación dirigida o WGA o WTA para amplificación de genoma completo o transcriptoma completo). En el caso de una amplificación dirigida, la formación de imágenes fluorescentes del ensamblaje de detección durante o después de (RT-) PCR produce inmediatamente información molecular de cada célula y permite una correlación directa con su morfología o datos ICC capturados anteriormente.

Debido a la alta densidad de poros de la membrana, se pueden realizar fácilmente diez mil análisis de células individuales en un área superficial tan pequeña como de 1 cm2, lo que permite altos rendimientos. En el caso de WGA o WTA, los pocillos que contienen material amplificado con éxito pueden identificarse mediante imágenes de fluorescencia y seleccionarse para la secuenciación posterior. El contenido de los pocillos seleccionados podría recuperarse utilizando un micromanipulador y utilizarse como material de partida para la preparación de la biblioteca estándar para NGS (figura 1D). Es importante destacar que la manipulación del material amplificado durante esta etapa se considera menos crítica en comparación con el de las células individuales o su ADN o ARN no amplificado durante etapas anteriores de los flujos de trabajo convencionales.

Ejemplo 2:

Para proporcionar una alta flexibilidad de aplicación y minimizar los costes para el usuario final (por ejemplo, hospitales, compañías farmacéuticas, laboratorios de servicio y universidades), se propone un diseño de producto modular que sea compatible con las configuraciones de microscopios y máquinas de PCR existentes (figura 2).

El producto modular comprende una placa de cubierta, que es un disco transparente recubierto con un polímero de laminación reactiva; una membrana microfabricada porosa, que está recubierta con hidrogel funcional; una placa de pocillos microfabricada, que está recubierta con un polímero de laminación reactiva y se llena con reactivos de PCR de células individuales; un adaptador de PCR, que es una placa termoconductora adecuada para máquinas de PCR estándar. La placa de pocillos y la membrana comprenden medios complementarios para el ensamblaje (estructuras de alineación).

Ejemplo 3:

El ejemplo de flujo de trabajo propuesto comprende el aislamiento de CTC de una muestra de sangre mediante el filtrado de la muestra a través de una membrana que consiste en una placa fina, que tiene poros cilíndricos de diámetro de poro exacto en posiciones definidas con precisión, y que puede estar provista de un recubrimiento de hidrogel funcional. Esta membrana permite el aislamiento de CTC de sangre completa mediante la selección del tamaño y/o la interacción molecular con el recubrimiento funcional (es decir, a través de proteínas de superficie expresadas por las células). Después de la filtración, las células aisladas se pueden analizar mediante procedimientos microscópicos convencionales en la membrana. Para permitir la secuenciación de células individuales de las células aisladas de la forma más eficaz, la membrana se superpone ahora con las células atrapadas con una placa de microvaloración. Como resultado, cada poro se suelda a exactamente un pocillo subyacente en la placa de microvaloración. Dado que los pocillos individuales han recibido previamente los reactivos necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y códigos de barras individuales, es posible generar ADNc a partir de moléculas de ARNm específicas de células en todos los pocillos, que contienen células individuales después del ensamblaje con la membrana. Los productos de todos los recipientes se pueden combinar y analizar con un secuenciador comercial. Debido a los códigos de barras incorporados, las secuencias de lectura se pueden asignar a las células correspondientes. Dicha plataforma permite que una amplia base de usuarios secuenciar de forma eficaz las CTC a partir de muestras de pacientes utilizando dispositivos existentes y secuenciarlas sin etapas de transferencia.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- proporcionar

i. una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de la suspensión celular pasen a través del poro,

ii. una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en la que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro y el, al menos un, pocillo contiene reactivos para analizar al menos un componente de las células de interés, en la que los reactivos se pueden proporcionar en forma líquida o en forma seca,

iii. medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos,

iv. una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos, y

- filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa, - ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo,

- sellar el, al menos un, pocillo y el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al pocillo con la cubierta, - analizar al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

2. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según la reivindicación 1, en el que la membrana está recubierta con un hidrogel y/o comprende anticuerpos inmovilizados.

3. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende adicionalmente un análisis microscópico del, al menos un, poro para células individuales retenidas.

4. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana tiene un espesor de 2-100 pm, preferentemente de 5-20 pm.

5. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los poros están dispuestos en una estructura ordenada en la membrana, en el que la posición de los poros es complementaria a la posición de los pocillos de la placa de pocillos.

6. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana porosa tiene un lado frontal plano, que está expuesto a la suspensión de células líquida durante el proceso de filtrado, y el lado posterior comprende los medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos.

7. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el diámetro de poro varía de 5 pm a 12 pm.

8. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que diferentes pocillos pueden contener los mismos o diferentes reactivos para analizar al menos un componente de la célula de interés.

9. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el, al menos un, pocillo está conectado a un sistema microfluídico que permite el transporte de líquidos desde y hacia los pocillos.

10. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de interés son células tumorales circulantes y los anticuerpos inmovilizados comprenden anticuerpos con afinidad por EpCAM.

11. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis de al menos un componente celular de una célula retenida comprende una amplificación de ácido nucleico, y/o en el que la progresión del análisis se detecta en tiempo real.

12. Procedimiento para analizar una o más células individuales de interés según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sellado se produce mediante una reacción mecánico-térmica o una reacción química, y/o en el que el, al menos un, componente de la célula individual retenida se utiliza para el procesamiento posterior después del análisis.

13. Dispositivo para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- una membrana porosa que comprende al menos un poro, en la que el poro se ajusta para atrapar una célula individual de interés cuando la célula se aplica a la membrana en un medio líquido y para permitir que células más pequeñas o más flexibles de la suspensión celular pasen a través del poro,

- una placa de pocillos que comprende al menos un pocillo, en la que el diámetro de pocillo es mayor que el diámetro de poro,

- medios de ensamblaje para ensamblar la membrana porosa y la placa de pocillos en una orientación para posicionar el, al menos un, poro en una posición opuesta al, al menos un, pocillo, en el que los medios de ensamblaje son parte de la membrana porosa y/o la placa de pocillos,

- una cubierta para sellar el, al menos un, pocillo con el, al menos un, poro ubicado en una posición opuesta al, al menos un, pocillo después de ensamblar la membrana porosa y la placa del pocillo.

14. Sistema para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- un dispositivo para analizar una o más células individuales de interés según la reivindicación 13, y

- medios para filtrar una suspensión celular líquida que comprende células de interés a través de la membrana porosa, y/o

- una configuración de microscopía para analizar el, al menos un, poro de la membrana para detectar células individuales retenidas, y/o

- un analizador para el análisis de al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.

15. Kit para analizar una o más células individuales de interés, que comprende

- un dispositivo para analizar una o más células individuales de interés según la reivindicación 13, y

- reactivos para visualizar células retenidas en la membrana porosa para análisis microscópico, y/o

- reactivos para el análisis de al menos un componente celular de una célula individual retenida en el, al menos un, pocillo sellado.