CN110734854B - 超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，包括：微流控芯片、自动加样装置、温控热循环装置、荧光成像系统以及数据存储分析系统；所述自动加样装置具有X轴、Y轴和Z轴方向的自由度，用于将样品和试剂自动加入所述微流控芯片内；所述数据存储分析系统对采集的样品的荧光信号进行分析，识别阳性样本，并绘制出阳性样本的实时荧光定量分析曲线。本发明的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，集成微流控芯片、自动加样装置、温控热循环装置、荧光成像系统以及数据存储分析系统，可实现样品的自动化检测处理，能十万量级、百万量级的单细胞捕获核酸扩增以及实时荧光定量曲线分析。

Description

超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测 系统

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统。

背景技术

机体的生长、发育、分化、衰老和病理病变等均与基因的差异表达有关。肿瘤的发生发展及转移也与基因的突变和差异表达有关，肿瘤组织中心的细胞、周围的细胞、转移灶的细胞等，也因基因组和转录表达谱的差异，导致功能特性的不同，影响和决定肿瘤的治疗等结果。

传统的基因表达研究方法通常在mRNA水平来衡量某个基因的表达。对于mRNA水平的表达通常用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)来实现。当前的荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)，只能在细胞群体水平观察多细胞平均的结果。在细胞群体水平上进行的，最终得到的结果，其实是多个细胞的平均，往往丢失了细胞异质性的信息及单细胞功能多样性的关键信息。

随着单细胞分析技术发展，单细胞多基因检测系统应运而生。其通常是利用微流控通道制作独立的单元，将单细胞单独隔离在独立单元中，并进行cDNA扩增，每次最多捕获几百至几千个单细胞，然后再配合仪器进行核酸扩增检测，但现有的检测中，独立单元或是微孔数量为几百至几千，每次捕获的单细胞数量少，检测通量低。

因此当前单细胞分析通量较低，且还需结合再结合核酸荧光实时定量分析仪器。而现有核酸实时定量分析仪器是基于群体细胞核酸分子分析，丢失了细胞异质性的信息及单细胞功能多样性的关键信息。所以现在需要提供更可靠的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，包括：微流控芯片、自动加样装置、温控热循环装置、荧光成像系统以及数据存储分析系统；

所述自动加样装置具有X轴、Y轴和Z轴方向的自由度，用于将样品和试剂自动加入所述微流控芯片内；所述微流控芯片设置在所述温控热循环装置上；

所述温控热循环装置用于实现所述微流控芯片中的样品进行PCR扩增反应中的热循环温度控制；

所述荧光成像系统用于采集样品的荧光信号并传输至所述数据存储分析系统；

所述数据存储分析系统对采集的样品的荧光信号进行分析，识别阳性样本，并绘制出阳性样本的实时荧光定量分析曲线。

优选的是，所述微流控芯片上设置有不小于10⁶个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。

优选的是，所述微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm。

优选的是，所述温控热循环装置包括安装座、可滑动设置在所述安装座上的温控底座、设置在所述温控底座上的用于放置所述微流控芯片的载物台、设置在所述载物台和温控底座之间的加热组件、设置在所述安装座上的散热组件以及用于驱动所述温控底座在所述安装座上滑动的第一驱动机构。

优选的是，所述第一驱动机构包括设置在所述温控底座上的第一滑轨、设置在所述第一滑轨上的第一滑块、设置在所述安装座上第一主动带轮和第一从动带轮、设置在所述第一主动带轮和第一从动带轮之间的第一皮带以及与所述第一主动带轮驱动连接的第一电机；所述第一滑块与所述第一皮带连接，所述安装座连接在所述第一滑块上。

优选的是，所述自动加样装置包括固接在所述安装座上的加样底座以及设置在所述加样底座上的X轴驱动机构、Y轴驱动机构、Z轴驱动机构、加样机械臂；所述的X轴驱动机构、Y轴驱动机构、Z轴驱动机构用于实现所述加样机械臂沿X轴、Y轴和Z轴方向的运动。

优选的是，所述X轴驱动机构包括设置在所述加样底座上的X轴滑轨、X轴主动带轮和X轴从动带轮、设置在所述X轴主动带轮和X轴从动带轮之间的X轴皮带、设置在所述加样底座上且与所述X轴主动带轮驱动连接的X轴电机以及可滑动设置在所述X轴滑轨上且与所述X轴皮带连接的加样安装板；

所述Y轴驱动机构包括设置在所述加样安装板上的Y轴滑轨、Y轴主动带轮和Y轴从动带轮、设置在所述Y轴主动带轮和Y轴从动带轮之间的Y轴皮带、设置在所述加样安装板上且与所述Y轴主动带轮驱动连接的Y轴电机以及可滑动设置在所述Y轴滑轨上且与所述Y轴皮带连接的Y轴滑块；

所述Z轴驱动机构包括固接在所述加样安装板上的Z轴电机、与所述Z轴电机驱动连接的Z轴带轮、与所述Z轴带轮驱动连接的转轴、固定套设在所述转轴上的驱动轴套、固接在所述Y轴滑块上的Z轴滑块、可滑动设置在所述Z轴滑块上且与所述加样机械臂固接的Z轴滑轨以及固接在所述加样机械臂上的用于与所述驱动轴套配合的驱动条，通过所述驱动轴套的转动带动所述驱动条沿Z轴方向运动。

优选的是，所述荧光成像系统包括宽光谱光源、可切换荧光分光装置以及成像探测器，所述宽光谱光源多个LED光源，所述可切换荧光分光装置包括多个可切换进入光路的荧光分光模块；

所述宽光谱光源发出的激发光经所述荧光分光模块反射后到达样品，样品被激发产生的荧光透射所述荧光分光模块后进入所述成像探测器，实现荧光成像。

优选的是，所述荧光成像系统还包括固接在所述安装座上的支撑架、固接在所述支撑架上的支撑板、设置在所述支撑板上的第二滑轨、可滑动设置在所述第二滑轨上的荧光切换滑板、第二主动带轮和第二从动带轮、设置在所述第二主动带轮和第二从动带轮之间的第二皮带以及设置在所述支撑板上且与所述第二主动带轮驱动连接的第二电机，所述荧光切换滑板与所述第二皮带连接。

优选的是，所述支撑板上开设有成像孔，所述安装座可滑动至所述支撑板下方，以将所述安装座上的微流控芯片输送至所述成像孔下方，从而通过荧光成像系统对所述微流控芯片内的样品进行荧光成像。

优选的是，所述支撑板上还设置有机架，所述成像探测器设置于所述机架上，且处于所述成像孔正上方；

所述多个荧光分光模块沿所述荧光切换滑板的滑动方向依次设置在所述荧光切换滑板上，通过所述荧光切换滑板一次将一个所述荧光分光模块运输至所述成像孔正上方，以切换进入光路；所述宽光谱光源设置在所述成像孔的侧部。

优选的是，所述数据存储分析系统包括图像预处理与存储模块、荧光图像分割与定位模块以及数据统计分析模块；

所述荧光成像系统采集的荧光信号包括PCR扩增反应中每次热循环平台期的过程荧光图像以及PCR扩增反应完成后的最终荧光图像；

所述数据存储分析系统的处理方法包括以下步骤：

S1：所述图像预处理与存储模块对采集到的过程荧光图像和最终荧光图像进行预处理，并存储；

S2：所述荧光图像分割与定位模块根据所述微孔阵列芯片上的微孔位置建立图像网格模板，将所述步骤S1处理后的过程荧光图像、最终荧光图像分别与图像网格模板配准，实现过程荧光图像和最终荧光图像上微孔位置的定位；

S3：针对最终荧光图像，提取阳性信号样本所在的微孔位置信息，作为目标微孔位置；

S4：针对过程荧光图像，提取与所述目标微孔位置对应的阳性样本所在的微孔的荧光强度信息，并绘制阳性样本的实时荧光定量PCR曲线。

本发明的有益效果是：

本发明的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，集成微流控芯片、自动加样装置、温控热循环装置、荧光成像系统以及数据存储分析系统，可实现样品的自动化检测处理，能十万量级、百万量级的单细胞捕获核酸扩增以及实时荧光定量曲线分析；

本发明可以实现十万量级、百万量级的单细胞捕获，通过多种荧光标记并配以具有多种荧光检测功能的荧光成像系统，可实现多个基因位点的实时定量PCR分析检测，相比于现有产品，极大的提升了检测通量，并且实现了单个细胞的分析而非群体细胞分析；

本发明通过在微孔内修饰DNA探针捕获细胞内的目标核酸分子，可实现十万量级、百万量级的单细胞捕获、原位裂解、核酸扩增；

本发明先通过最终荧光图像来确定所有阳性样本的所在的微孔位置，然后通过过程荧光图像仅仅提取所有阳性样本每次热循环平台期的荧光图像，能减少非特异数据的计算，减小计算量，从而实现了超高通量实时荧光定量PCR曲线快速绘制。

附图说明

图1为本发明的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统的结构示意图；

图2为本发明的自动加样装置的结构示意图；

图3为本发明的自动加样装置的另一个视角的结构示意图；

图4为本发明的Z轴驱动机构的局部结构示意图；

图5为本发明的温控热循环装置的结构示意图；

图6为本发明的温控热循环装置分解结构示意图；

图7为本发明的荧光成像系统的结构示意图；

图8为本发明的荧光成像系统的另一个视角的结构示意图；

图9为本发明的荧光分光模块的结构示意图；

图10为本发明的荧光成像系统的光路示意图。

附图标记说明：

1—自动加样装置；

10—加样底座；11—X轴驱动机构；12—Y轴驱动机构；13—Z轴驱动机构；14—加样机械臂；

110—X轴滑轨；111—X轴主动带轮；112—X轴从动带轮；113—X轴皮带；114—X轴电机；115—加样安装板；

120—Y轴滑轨；121—Y轴主动带轮；122—Y轴从动带轮；123—Y轴皮带；124—Y轴电机；125—Y轴滑块；

130—Z轴电机；131—Z轴带轮；132—转轴；133—驱动轴套；134—Z轴滑块；135—Z轴滑轨；136—驱动条；137—转轴座；

140—加样针头；

2—温控热循环装置；20—安装座；21—温控底座；22—载物台；23—加热组件；24—导热器；25—散热组件；26—第一驱动机构；27—铜板；260—第一滑轨；261—第一滑块；262—第一主动带轮；263—第一从动带轮；264—第一皮带；265—第一电机；

3—荧光成像系统；30—宽光谱光源；31—可切换荧光分光装置；32—成像探测器；33—支撑架；34—第二滑轨；35—荧光切换滑板；36—第二电机；37—第二主动带轮；38—第二从动带轮；39—第二皮带；300—第一LED光源；301—第二LED光源；302—第三LED光源；303—第一二向色镜；304—第二二向色镜；305—准直透镜；310—荧光分光模块；311—镜片安装块；312—激发滤光片；320—聚光镜；330—支撑板；331—成像孔；332—机架；

4—微流控芯片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

如图1所示，本实施例的一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，包括：微流控芯片4、自动加样装置1、温控热循环装置2、荧光成像系统3以及数据存储分析系统；

自动加样装置1具有X轴、Y轴和Z轴方向的自由度，用于将样品和试剂自动加入微流控芯片4内；微流控芯片4设置在温控热循环装置2上；

温控热循环装置2用于实现微流控芯片4中的样品进行PCR扩增反应中的热循环温度控制；

荧光成像系统3用于采集样品的荧光信号并传输至数据存储分析系统；

数据存储分析系统对采集的样品的荧光信号进行分析，识别阳性样本，并绘制出阳性样本的实时荧光定量分析曲线。数据存储分析系统可内嵌于上位机(如计算机)中，上位机与荧光成像系统3通信连接，可接受荧光成像系统3采集的数据。

其中，微流控芯片4上设置有不小于10⁶个微孔，微孔阵列设置，微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。

在一种优选的实施例中，微流控芯片4上设置有10个一字排列的微孔阵列区，每个微孔阵列区上设置有不小于10⁶个微孔，整个微流控芯片4上设置有不少于10⁷个微孔，从而使微孔阵列芯片能达到总量为百万量级的超高通量单细胞捕获。更为优选的实施例中，微孔内壁上修饰有至少一个DNA探针，DNA探针用于捕获目标核酸分子，通过修饰多个DNA探针即可实现多个基因位点的检测。更进一步的，微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm。

其中，微孔阵列芯片的基底可采用聚合物、Si等材料，通过刻蚀，可形成直径在1μm-100μm的微孔结构。微流控芯片4上设置有常规的进样口、出样口、缓冲液入口和缓冲液出口。待测样品和qPCR反应试剂通过进样口进入，缓冲液入口和缓冲液出口供细胞裂解液和缓冲液等试剂的出入。

微流控芯片4中的样品在温控热循环装置2上实现PCR扩增，并通过荧光成像系统3进行荧光信号采集。主要的工作过程为：将微流控芯片4放入温控热循环装置2，然后通过自动加样装置1向微流控芯片4中加入相关试剂，主要包括：先通入细胞裂解液，实现细胞原位裂解，通过微孔内修饰的DNA探针捕获目标核酸分子，然后通入缓冲液清洗；最后通入qPCR反应试剂，然后封闭微孔，进行PCR扩增，并通过荧光成像系统3采集荧光信号，最后通过数据存储分析系统进行荧光分析，以实现单细胞基因表达水平分析。其中，微孔的封闭可采用油封，以实现各通道隔离；然后进行PCR扩增和荧光检测。

自动加样装置1的加样方案、温控热循环装置2温控方案、荧光成像系统3的成像方案以及数据存储分析系统的分析处理方案可通过以下具体实施例实现。

其中，荧光成像模块系统的荧光信号包括PCR扩增反应中每次热循环平台期的过程荧光图像以及PCR扩增反应完成后的最终荧光图像。即对于微流控芯片4的每一个区域，PCR扩增反应中，启动热循环后，在每一次热循环的低温退火的平台期均采集荧光图像，即为过程荧光图像。然后在整个PCR扩增反应完成后，再采集荧光图像即为最终荧光图像。通过最终荧光图像来确定所有阳性样本的所在的微孔位置，然后通过过程荧光图像提取所有阳性样本每次热循环平台期的荧光图像，以实现实时荧光定量PCR曲线绘制。

在一种实施例中，数据存储分析系统的分析处理可通过以下方案实现：数据存储分析系统包括图像预处理与存储模块、荧光图像分割与定位模块以及数据统计分析模块；荧光成像系统3采集的荧光信号包括PCR扩增反应中每次热循环平台期的过程荧光图像以及PCR扩增反应完成后的最终荧光图像。

数据存储分析系统的处理方法包括以下步骤：

S1：图像预处理与存储模块对采集到的过程荧光图像和最终荧光图像进行预处理，并存储；

S2：荧光图像分割与定位模块根据微孔阵列芯片上的微孔位置建立图像网格模板，将步骤S1处理后的过程荧光图像、最终荧光图像分别与图像网格模板配准，实现过程荧光图像和最终荧光图像上微孔位置的定位；

S3：针对最终荧光图像，提取阳性信号样本所在的微孔位置信息，作为目标微孔位置；

S4：针对过程荧光图像，提取与目标微孔位置对应的阳性样本所在的微孔的荧光强度信息，并绘制阳性样本的实时荧光定量PCR曲线。

其中，先通过最终荧光图像来确定所有阳性样本的所在的微孔位置，然后通过过程荧光图像仅仅提取所有阳性样本每次热循环平台期的荧光图像，能减少非特异数据的计算，减小计算量，从而实现超高通量实时荧光定量PCR曲线的快速绘制。

实施例1

在上述实施例的基础上，参照图5和6，本实施例中，温控热循环装置2包括安装座20、可滑动设置在安装座20上的温控底座21、设置在温控底座21上的用于放置微流控芯片4的载物台22、设置在载物台22和温控底座21之间的加热组件23、设置在安装座20上的散热组件25以及用于驱动温控底座21在安装座20上滑动的第一驱动机构26。微流控芯片4放置在载物台22上，并通过透明盖板覆盖密封。

其中，更为优选的，温控底座21上设置有导热器24，导热器24具有多个导热鳍片，便于快速散热。导热器24上设置铜板27，加热装置为帕尔贴或热电偶，且设置在铜板27上，载物台22设置在加热装置上，通过加热装置对载物台22上的微流控芯片4中的样品进行加热。散热组件25为设置在安装座20上的多个散热风扇，通过散热风扇加速散热。

其中，第一驱动机构26包括设置在温控底座21上的第一滑轨260、设置在第一滑轨260上的第一滑块261、设置在安装座20上第一主动带轮262和第一从动带轮263、设置在第一主动带轮262和第一从动带轮263之间的第一皮带264以及与第一主动带轮262驱动连接的第一电机265；第一滑块261与第一皮带264连接，安装座20连接在第一滑块261上。通过第一电机265带动温控底座21沿X轴方向滑动，使温控底座21运输至散热风扇上方或是运离散热风扇上方。在开始加样和加试剂时，温控底座21处于初始位置，位于荧光成像系统3左侧。

进行PCR扩增反应和检测时，通过第一驱动机构26将温控底座21运输至反应位置，即荧光成像系统3下方，且处于散热风上方。需加热时，加热装置对样品加热；当需要降温时，下方的散热风扇启动，以快速降温。

实施例2

在上述实施例的基础上，参照图1-4，本实施例中，自动加样装置1包括固接在安装座20上的加样底座10以及设置在加样底座10上的X轴驱动机构11、Y轴驱动机构12、Z轴驱动机构13、加样机械臂14；的X轴驱动机构11、Y轴驱动机构12、Z轴驱动机构13用于实现加样机械臂14沿X轴、Y轴和Z轴方向的运动。加样机械臂14上设置有加样针头140，可吸取样品、试剂等加入到微流控芯片4中。

更进一步的，X轴驱动机构11包括设置在加样底座10上的X轴滑轨110、X轴主动带轮111和X轴从动带轮112、设置在X轴主动带轮111和X轴从动带轮112之间的X轴皮带113、设置在加样底座10上且与X轴主动带轮111驱动连接的X轴电机114以及可滑动设置在X轴滑轨110上且与X轴皮带113连接的加样安装板115。X轴电机114电机通过X轴主动带轮111、X轴从动带轮112、X轴皮带113带动加样安装板115沿X轴方向运动，从而带动Y轴驱动机构12、Z轴驱动机构13、加样机械臂14整体沿X轴方向运动。

更进一步的，Y轴驱动机构12包括设置在加样安装板115上的Y轴滑轨120、Y轴主动带轮121和Y轴从动带轮122、设置在Y轴主动带轮121和Y轴从动带轮122之间的Y轴皮带123、设置在加样安装板115上且与Y轴主动带轮121驱动连接的Y轴电机124以及可滑动设置在Y轴滑轨120上且与Y轴皮带123连接的Y轴滑块125。Y轴电机124通过Y轴主动带轮121、Y轴从动带轮122、Y轴皮带123带动Y轴滑块125沿Y轴方向运动，从而带动加样机械臂14沿Y轴方向运动。

更进一步的，Z轴驱动机构13包括固接在加样安装板115上的Z轴电机130、与Z轴电机130驱动连接的Z轴带轮131、与Z轴带轮131驱动连接的转轴132、固定套设在转轴132上的驱动轴套133、固接在Y轴滑块125上的Z轴滑块134、可滑动设置在Z轴滑块134上且与加样机械臂14固接的Z轴滑轨135以及固接在加样机械臂14上的用于与驱动轴套133配合的驱动条136，通过驱动轴套133的转动带动驱动条136沿Z轴方向运动，Y轴滑块125上开设有供转轴132穿过的轴孔。Z轴带轮131包括与Z轴电机130驱动连接的主动轮、与主带轮通过皮带连接的从动轮，加样安装板115上设置有用于安装转轴132的转轴座137。Z轴电机130通过Z轴带轮131带动转轴132转动，转轴132上的驱动轴套133转动后带动驱动条136沿Z轴方向运动，从而实现加样机械臂14沿Z轴方向的运动。其中，驱动轴套133与驱动条136之间可采用摩擦驱动配合(如驱动轴套133为摩擦套或摩擦轮，驱动条136为摩擦板或或齿条板或摩擦面等，通过摩擦力，由驱动轴套133的转动带动驱动条136的Z向运动)，也可采用齿轮啮合(如驱动轴套133为齿轮套，外周设置齿部，驱动条136为齿条，通过齿轮套上的齿部与齿条啮合，将驱动轴套133的转动转换为驱动条136的Z向运动)。本实施例中，驱动轴套133为摩擦套，驱动条136为齿条板，通过摩擦套与齿条板之间的摩擦力，将摩擦套的转动转换为齿条板的Z向运动。

从而通过X轴驱动机构11、Y轴驱动机构12、Z轴驱动机构13能实现加样机械臂14沿X轴、Y轴和Z轴方向的运动，以实现对微流控芯片4的样品、各种试剂的自动添加。

实施例3

在上述实施例的基础上，参照图7-10，本实施例中，荧光成像系统3包括宽光谱光源30、可切换荧光分光装置31以及成像探测器32，宽光谱光源30多个LED光源，可切换荧光分光装置31包括多个可切换进入光路的荧光分光模块310；

宽光谱光源30发出的激发光经荧光分光模块310反射后到达样品，样品被激发产生的荧光透射荧光分光模块310后进入成像探测器32，实现荧光成像。当然宽光谱光源30还包括有分光光路，以将多个LED光源传输至荧光分光模块310。

作为优选的实施例，荧光成像系统3还包括固接在安装座20上的支撑架33、固接在支撑架33上的支撑板330、设置在支撑板330上的第二滑轨34、可滑动设置在第二滑轨34上的荧光切换滑板35、第二主动带轮37和第二从动带轮38、设置在第二主动带轮37和第二从动带轮38之间的第二皮带39以及设置在支撑板330上且与第二主动带轮37驱动连接的第二电机36，荧光切换滑板35与第二皮带39连接。

其中，支撑板330上开设有成像孔331，安装座20可滑动至支撑板330下方，以将安装座20上的微流控芯片4输送至成像孔331下方，从而通过荧光成像系统3对微流控芯片4内的样品进行荧光成像。

其中，支撑板330上还设置有机架332，成像探测器32设置于机架332上，且处于成像孔331正上方；

多个荧光分光模块310沿荧光切换滑板35的滑动方向依次设置在荧光切换滑板35上，通过荧光切换滑板35一次将一个荧光分光模块310运输至成像孔331正上方，以切换进入光路；宽光谱光源30设置在成像孔331的侧部。

在进一步的实施例中，宽光谱光源303个不同波长的LED光源，实现全波段可见光(波长为400nm-700nm)覆盖。分光光路包括设置在3个LED光源出射端的3个准直透镜305以及若干用于将LED光源发出的光反射或透射到荧光分光模块310上的二向色镜。例如，本实施例中，3个LED光源分别为第一LED光源300、第二LED光源301和第三LED光源302，二向色镜包括2个：第一二向色镜303和第二二向色镜304。第一LED光源300发出的光经过准直透镜305准直后依次透射第一二向色镜303和第二二向色镜304，进入荧光分光模块310；第二LED光源301发出的光经过准直透镜305准直后被第一二向色镜303反射，然后再透射第二二向色镜304，进入荧光分光模块310；第三LED光源302发出的光经过准直透镜305准直后被第二二向色镜304反射至荧光分光模块310。

其中，荧光分光模块310包括4个，每个荧光分光模块310均包括镜片安装块311以及设置在其中的激发滤光片312，每个激发滤光片312允许通过的波长各不相同，实现不同荧光的过滤。镜片安装块311四周均开孔。荧光分光模块310切换进光路时，荧光分光模块310处于成像孔331上方，且处于成像探测器32正下方，LED光源处于

成像探测器32选用高灵敏度CMOS相机或CCD相机，且相机前还设置有聚光镜320。宽光谱光源30发出的光经过分光光路后被荧光分光模块310反射至样品上，样品被激发产生的荧光再经过激发滤光片312后，经过聚光镜320到达CMOS相机，进行荧光成像。DNA探针用于捕获目标核酸分子，微孔中可通过修饰多种荧光标记的多个DNA探针即可实现多个基因位点的检测；与之对应的，荧光成像系统3需扩展为具有对多种荧光进行成像的功能，然后利用数据存储分析系统对多种荧光信号进行分析，即可实现多个基因位点的检测。所以本实施例中，通过设置三种不同波长的光源实现全波段可见光(波长为400nm-700nm)覆盖，并利用可切换的4个荧光分光模块310对不同的荧光进行过滤，最终对不同的荧光成像。

在一种实施例中，超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统的工作流程包括:

1)载物台22初始化，载物台22处于初始加样位置，将微流控芯片4装入载物台22，通过自动加样装置1向微流控芯片4中加入样品，通过微流控芯片4上的微孔结构产生的毛细力捕获单细胞；

2)利用自动加样装置1，通过缓冲液入口，加入细胞裂解液，实现细胞原位裂解，通过孔内修饰特异性DNA探针捕获目标核酸分子，然后通入缓冲液清洗；

3)通过自动加样装置1向微流控芯片4中加入qPCR反应试剂，通过油封实现各通道隔离，在微流控芯片4上覆盖透明盖板密封；

4)通过第一驱动机构26将载物台22整体移动至反应区(也即检测区)，微流控芯片4移动至成像孔331下方，启动PCR热循环，加热装置将样品加热至设定温度，并且在每个热循环平台期采集荧光图像，如使用了多种荧光标记则切换荧光分光模块310，逐一采集；然后通过载物台22移动，将微流控芯片4的下一个区域移动至成像孔331正下方，进行下一个区域的荧光成像；将采集到图像进行图像拼接形成一张包括微流控芯片4整个样品区域的荧光图像，即为该次热循环平台期的过程荧光图像。PCR扩增反应完成后，再采集微流控芯片4整个样品区域的荧光图像，即最终荧光图像；

5)数据存储分析系统调用采集的荧光信号，并进行分析，获得实时荧光定量PCR曲线，数据存储分析系统包括图像预处理与存储模块、荧光图像分割与定位模块以及数据统计分析模块，其具体分析方法包括：

5-1)：图像预处理与存储模块对采集到的过程荧光图像和最终荧光图像进行预处理(可包括图像拼接、降噪滤波、图像增强等)，并存储；

5-2)：荧光图像分割与定位模块根据微孔阵列芯片上的微孔位置建立图像网格模板，将步骤S1处理后的过程荧光图像、最终荧光图像分别与图像网格模板配准，实现过程荧光图像和最终荧光图像上微孔位置的定位；

5-3)：针对最终荧光图像，提取阳性信号样本所在的微孔位置信息，作为目标微孔位置；

5-4)：针对过程荧光图像，提取与目标微孔位置对应的阳性样本所在的微孔的荧光强度信息(即微孔位置的灰度均值)，并绘制阳性样本的实时荧光定量PCR曲线。其中，可应用多线程并行处理运算，同时提取多个微孔通道内的荧光强度，以提高处理速度。

上述过程为针对一种荧光的荧光信号处理，包括多种荧光信号时，按上述步骤分别处理即可。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，包括：微流控芯片、自动加样装置、温控热循环装置、荧光成像系统以及数据存储分析系统；

所述自动加样装置具有X轴、Ｙ轴和Ｚ轴方向的自由度，用于将样品和试剂自动加入所述微流控芯片内；所述微流控芯片设置在所述温控热循环装置上；

所述温控热循环装置用于实现所述微流控芯片中的样品进行PCR扩增反应中的热循环温度控制；

所述荧光成像系统用于采集样品的荧光信号并传输至所述数据存储分析系统；

所述数据存储分析系统对采集的样品的荧光信号进行分析，识别阳性样本，并绘制出阳性样本的实时荧光定量分析曲线；

所述数据存储分析系统包括图像预处理与存储模块、荧光图像分割与定位模块以及数据统计分析模块；

所述微流控芯片上设置有不小于10⁶个微孔，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状；

所述微孔形状为正六边形，其外接圆的直径为1-100μm；

所述荧光成像系统采集的荧光信号包括PCR扩增反应中每次热循环平台期的过程荧光图像以及PCR扩增反应完成后的最终荧光图像；

所述数据存储分析系统的处理方法包括以下步骤：

S1：所述图像预处理与存储模块对采集到的过程荧光图像和最终荧光图像进行预处理，并存储；

S2：所述荧光图像分割与定位模块根据所述微孔阵列芯片上的微孔位置建立图像网格模板，将所述步骤S1处理后的过程荧光图像、最终荧光图像分别与图像网格模板配准，实现过程荧光图像和最终荧光图像上微孔位置的定位；

S3：针对最终荧光图像，提取阳性信号样本所在的微孔位置信息，作为目标微孔位置；

S4：针对过程荧光图像，提取与所述目标微孔位置对应的阳性样本所在的微孔的荧光强度信息，并绘制阳性样本的实时荧光定量PCR曲线。

2.根据权利要求1所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述温控热循环装置包括安装座、可滑动设置在所述安装座上的温控底座、设置在所述温控底座上的用于放置所述微流控芯片的载物台、设置在所述载物台和温控底座之间的加热组件、设置在所述安装座上的散热组件以及用于驱动所述温控底座在所述安装座上滑动的第一驱动机构。

3.根据权利要求2所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述第一驱动机构包括设置在所述温控底座上的第一滑轨、设置在所述第一滑轨上的第一滑块、设置在所述安装座上第一主动带轮和第一从动带轮、设置在所述第一主动带轮和第一从动带轮之间的第一皮带以及与所述第一主动带轮驱动连接的第一电机；所述第一滑块与所述第一皮带连接，所述安装座连接在所述第一滑块上。

4.根据权利要求3所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述自动加样装置包括固接在所述安装座上的加样底座以及设置在所述加样底座上的X轴驱动机构、Y轴驱动机构、Z轴驱动机构、加样机械臂；所述的X轴驱动机构、Y轴驱动机构、Z轴驱动机构用于实现所述加样机械臂沿X轴、Ｙ轴和Ｚ轴方向的运动。

5.根据权利要求4所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述X轴驱动机构包括设置在所述加样底座上的Ｘ轴滑轨、Ｘ轴主动带轮和Ｘ轴从动带轮、设置在所述Ｘ轴主动带轮和Ｘ轴从动带轮之间的X轴皮带、设置在所述加样底座上且与所述Ｘ轴主动带轮驱动连接的X轴电机以及可滑动设置在所述Ｘ轴滑轨上且与所述X轴皮带连接的加样安装板；

所述Y轴驱动机构包括设置在所述加样安装板上的Y轴滑轨、Y轴主动带轮和Y轴从动带轮、设置在所述Y轴主动带轮和Y轴从动带轮之间的Y轴皮带、设置在所述加样安装板上且与所述Y轴主动带轮驱动连接的Y轴电机以及可滑动设置在所述Y轴滑轨上且与所述Y轴皮带连接的Y轴滑块；

所述Z轴驱动机构包括固接在所述加样安装板上的Z轴电机、与所述Z轴电机驱动连接的Z轴带轮、与所述Z轴带轮驱动连接的转轴、固定套设在所述转轴上的驱动轴套、固接在所述Y轴滑块上的Z轴滑块、可滑动设置在所述Z轴滑块上且与所述加样机械臂固接的Z轴滑轨以及固接在所述加样机械臂上的用于与所述驱动轴套配合的驱动条，通过所述驱动轴套的转动带动所述驱动条沿Z轴方向运动。

6.根据权利要求5所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述荧光成像系统包括宽光谱光源、可切换荧光分光装置以及成像探测器，所述宽光谱光源多个LED光源，所述可切换荧光分光装置包括多个可切换进入光路的荧光分光模块；

所述宽光谱光源发出的激发光经所述荧光分光模块反射后到达样品，样品被激发产生的荧光透射所述荧光分光模块后进入所述成像探测器，实现荧光成像。

7.根据权利要求6所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述荧光成像系统还包括固接在所述安装座上的支撑架、固接在所述支撑架上的支撑板、设置在所述支撑板上的第二滑轨、可滑动设置在所述第二滑轨上的荧光切换滑板、第二主动带轮和第二从动带轮、设置在所述第二主动带轮和第二从动带轮之间的第二皮带以及设置在所述支撑板上且与所述第二主动带轮驱动连接的第二电机，所述荧光切换滑板与所述第二皮带连接。

8.根据权利要求7所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述支撑板上开设有成像孔，所述安装座可滑动至所述支撑板下方，以将所述安装座上的微流控芯片输送至所述成像孔下方，从而通过荧光成像系统对所述微流控芯片内的样品进行荧光成像。

9.根据权利要求8所述的超高通量单细胞核酸分子实时荧光定量分析一体化快速检测系统，其特征在于，所述支撑板上还设置有机架，所述成像探测器设置于所述机架上，且处于所述成像孔正上方；

所述多个荧光分光模块沿所述荧光切换滑板的滑动方向依次设置在所述荧光切换滑板上，通过所述荧光切换滑板一次将一个所述荧光分光模块运输至所述成像孔正上方，以切换进入光路；所述宽光谱光源设置在所述成像孔的侧部。

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