CN109701672B - 超高通量微阵列单分子芯片及其制作方法和成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种超高通量微阵列单分子芯片及其制作方法和成像系统，其中，超高通量微阵列单分子芯片包括：衬底，具有用于加载样品的加样面和与所述加样面相对设置的用于观测样品的观测面；所述衬底具有多个通孔阵列单元，所述通孔阵列单元内排布有N×M个通孔，所述通孔连通于所述加样面和所述观测面，其开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。提高样品筛选效率，在对样品进行观测时可以清楚的对样品进行定位，可以实现快速定位筛选单细胞。

Description

超高通量微阵列单分子芯片及其制作方法和成像系统

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种超高通量微阵列单分子芯片及其制作方法和成像系统。

背景技术

高通量药物筛选是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，1年内仅能筛选75000个样品；1997年高通量筛选技术发展初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品；1999年高通量筛选技术进一步完善后，每天的筛选量就高达10万种化合物。因此药物筛选领域急需要高通量的筛选技术和筛选设备，目前高通量药物筛选最新设备均为基于384或1536微孔版结合自动化的机械设备，每天最多可以筛选上万级化合物，而新药物一般需要从数百万级的化合物里面筛选出一种有效化合物，现有的分子水平和细胞水平的筛选效率低下，导致新药开发周期很长，成本巨大。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于现有的分子水平和细胞水平的筛选效率低下。

为此，本发明提供了一种超高通量微阵列单分子芯片，包括：衬底，具有用于加载样品的加样面和与所述加样面相对设置的用于观测样品的观测面；所述衬底具有多个通孔阵列单元，所述通孔阵列单元内排布有N×M个通孔，所述通孔连通于所述加样面和所述观测面，其开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。

可选地，所述通孔的开口形状为矩形，所述第一结构为直角，所述第二结构为缺角。

可选地，所述通孔的开口尺寸为5μm～60μm，所述通孔的中心距为10μm～100μm，所述通孔的深度为20μm～300μm。

可选地，所述通孔的开口形状为正方形，所述正方形的边长为15-30μm。

可选地，所述加样面的表面为疏水结构面；所述通孔内部表面为亲水结构面。

可选地，所述通孔在所述加样面的开口尺寸大于所述通孔在所述探测面的开口尺寸。

可选地，所述加样面和/或所述观测面的表面具有亲生物分子结构。

根据第二方面，本发明实施例提供了一种超高通量微阵列单分子芯片制作方法，包括：提供衬底，并在所示衬底的一面形成保护层；在所述保护层背离所示衬底的一面上涂布光刻胶，并图形化所述光刻胶，形成多个凹槽阵列单元，所述凹槽贯通至所述保护层；以所述光刻胶为掩膜刻蚀所述衬底形成多个通孔阵列单元；剥离所述光刻胶和所述保护层；其中，所述通孔的开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。

可选地，在剥离所述光刻胶和所述保护层之后还包括：对所述衬底的一面的表面进行疏水性处理，形成疏水结构；对所述通孔内表面进行亲水性处理，形成亲水结构。

根据第三方面，本发明实施例提供了一种高通量微阵列单分子芯片成像系统，包括：载物台，承载有细胞培养腔，所述细胞培养腔用于放置上述的超高通量微阵列单分子芯片；照明光学系统，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片输出照明光；荧光成像光学系统，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片的观测面输出成像荧光；成像装置，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光，形成观测图像。

可选地，所述成像装置包括：物镜，具有自动对焦装置，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光；聚焦透镜组，用于对所述观测面反射的所述成像荧光聚焦；光学探测器，用于将所述聚焦后的成像荧光转换为所述观测图像。

本发明具有如下有益效果：

1.采用通孔阵列单元，相比于盲孔，一方面可以提高孔的毛细力，一方面可以利用流体的向下渗透能力，提高进样效率；此外，通孔结构增加了孔内细胞的束缚能力，在进样以后的表面清洗过程，可以避免被筛选物例如细胞被带出，不需要额外固定细胞；通孔阵列单元具有三个反应面，相对设置的加样面和观测面以及通孔内面，可以在加样面加样，观测面进行观测，通孔内进行免疫反应，有利于进行实时监测。

2.通孔开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置。在对样品进行观测时可以清楚的对样品进行定位，便于后续通过显微成像系统观察特定位置的细胞。可以实现快速定位筛选单细胞。

3.加样面的表面为疏水结构面，可以减小样品的残留，通孔内为亲水结构面可以增强通孔的毛细作用力，提高进样效率，并且能够提高对样品的束缚力，在进样以后的表面清洗过程，可以避免细胞被带出，不需要额外固定细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中提供的超高通量微阵列单分子芯片的结构示意图；

图2为本发明实施例中提供的超高通量微阵列单分子芯片的局部放大示意图；

图3为本发明实施例中提供的超高通量微阵列单分子芯片的通孔阵列单元的示意图；

图4为本发明实施例中提供的超高通量微阵列单分子芯片剖面图；

图5为本发明实施例中提供的超高通量微阵列单分子芯片成像系统的示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

本实施例提供了一种超高通量微阵列单分子芯片，如图1所示，包括：衬底100，具有用于加载样品的加样面和与所述加样面相对设置的用于观测样品的观测面；所述衬底100具有多个通孔阵列单元110，所述通孔阵列单元110内排布有N×M个通孔111，所述通孔111连通于所述加样面和所述观测面，其开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔111的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元110的位置，其中，N≥1，M≥1。在本实施例中，衬底100材料可以为材料可以是硅、玻璃、陶瓷，在本实施例中，衬底100可以采用硅基衬底，例如可以采用6到8寸片衬底，通过6到8寸硅基衬底上设计微通孔阵列结构，可以实现百万、千万甚至上亿微通孔的批量均一化制作。

在本实施例中，采用通孔阵列单元110，相比于盲孔，一方面可以提高孔的毛细力，一方面可以利用流体的向下渗透能力，提高进样效率；此外，通孔111结构增加了孔内细胞的束缚能力，在进样以后的表面清洗过程，可以避免被筛选物例如细胞被带出，不需要额外固定细胞；通孔阵列单元110具有三个反应面，相对设置的加样面和观测面以及通孔111内面，可以在加样面加样，观测面进行观测，通孔111内进行免疫反应，有利于进行实时监测。

所称通孔阵列单元110内排布有N×M个通孔111，其中，N和M可以为大于或等于1的任意整数，在本实施例中，可以以N＝3，M＝3为例进行说明，机每个通孔111阵列排布有3×3个通孔111，多个通孔阵列单元110组成芯片上阵列。在本实施例中，通孔阵列单元110内部包含9个通孔111，所述通孔111的开口形状为矩形，所述第一结构为直角，所述第二结构为缺角，在本实施例中，可以以通孔111的开口形状为正方形为例进行说明，通过缺角的方式进行编码实现在大面积阵列中定位通孔阵列单元110，所称第一结构所表示的为第一子编码可以为二进制中的“0”，第二结构所表示的第二子编码为二进制中的“1”具体的，缺角可以代表“1”，直角可以代表“0”，例如，如图3所示，左上角第一孔A，从左上角开始顺时针四个角分别对应“0”、“0”、“0”、“1”，由此第一排三个孔可以作为12位的二进制编码作为通孔阵列单元110的行号，由左至右开始第一个孔代表最高的4位，第二个孔代表中间的4位，第三个孔代表最低的4位，因此图例中第一排三个孔的二进制编码为“0001 10010111”，转换为十进制数值为407，作为通孔阵列单元110得行号，这种方式从“0000 0000 0000”到“11111111 1111”总计2¹²个编码，从0开始到4095，图2所示的局部放大图I中的通孔阵列单元110在第407行；第二行的三个孔代表方向，唯一的缺角位于左上方的方孔，因此当芯片旋转倒置时，可通过第二行的三个孔避免错误判断微孔阵列位置；第三行的三个孔的二进制编码代表微阵列单元的列号，图2所示的编码为“0001 0001 0000”，转换为十进制为272，在第273列，因此图例所示微孔阵列单元位于407行，273列。因此，在对样品进行观测时可以清楚的对样品进行定位，便于后续通过显微成像系统观察特定位置的细胞。可以实现快速定位筛选单细胞。

在可选的实施例中，通孔111的开口尺寸为5μm～60μm，所述通孔111的中心距为10μm～100μm，所述通孔111的深度为20μm～300μm。作为优选，通孔111的开口形状为正方形，所述正方形的边长为15-30μm。具体的，细胞平均尺寸在15μm左右，如果细胞总数和通孔111数一样，平均根据随机分布的原理，每个通道的细胞分布个数服从泊松分布统计，如果通孔111尺寸在15到30μm，每个通道内平均装载的细胞数量是1，根据泊松分布，通孔111内还有1个细胞的概率是λ*exp(-λ)，此时概率为0.36(λ＝1)；如果通孔111尺寸在30μm到45μm，平均装载细胞数量为2，通孔111内含有单细胞的概率为0.27(λ＝2)；如果通孔111尺寸在45μm到60μm，平均装载细胞数量为3，通孔111内含有单细胞的概率为0.15(λ＝3)。因此，通孔111尺寸设置为15-30μm时，每个通孔111内含有一个单细胞的概率最大。除了细胞分析体系，其他生物单分子如核酸和蛋白，可以采用更小的尺寸，但受到成像分辨设备的限制，以及样品量的限制，不宜少于5μm。中心距主要影响总的样品量，多余的样品会有部分表面残留，如果中心距过大，则表面残留过多，会造成样品浪费。通孔111尺寸和中心距离具有相互关系，如60μm的通孔111尺寸，中心距不宜超过100μm，否则会造成芯片通道密度低，造成样品浪费，而如5μm的通孔111尺寸，受到成像分辨率的限制，最小中心距不宜小于10μm。因此，本实施例中，通孔111的开口尺寸为5μm～60μm，所述通孔111的中心距为10μm～100μm。为保证细胞正常生长，需要保证通孔111的容量，采用通孔111的深度为20μm～300μm可以较好地保证细胞的空间。

为提高进样效率，在可选的实施例中，加样面的表面为疏水结构面，通孔111内部表面为亲水结构面。在本实施例中，衬底100的两个面军具有疏水结构，加样面的表面为疏水结构面，可以减小样品的残留，通孔111内为亲水结构面可以增强通孔111的毛细作用力，提高进样效率，并且能够提高对样品的束缚力，在进样以后的表面清洗过程，可以避免细胞被带出，不需要额外固定细胞。

所述通孔111在所述加样面的开口尺寸大于所述通孔111在所述探测面的开口尺寸，形成锥形通孔111，锥形通孔111可以有利于卡住单细胞，对于细胞分析，可以提高单细胞的捕捉成功率。

为了提高样品的捕获的成功率，在本实施例中，加样面和/或所述观测面的表面具有亲生物分子结构，具体的，可以通过化学键合的方式，在表面修饰一些特定基团，可以便于捕捉蛋白、核酸或者细胞。

本发明实施例还提供了一种超高通量微阵列单分子芯片制作方法，包括如下步骤：

S10.提供衬底，并在所示衬底的一面形成保护层。在本实施例中，所称衬底可以为硅基衬底，所称保护层可以为铝，由于常规深硅刻蚀技术在表面不被腐蚀的情况下可以做到深宽比25:1。而本实施例中，深宽比可能达到60:1，采用常规深硅刻蚀可能会导致表面被腐蚀，因此，在衬底上可以电镀或沉积一层铝作为保护层，以提高深硅刻蚀的深宽比。

S20.在所述保护层背离所示衬底的一面上涂布光刻胶，并图形化所述光刻胶，形成多个凹槽阵列单元，所述凹槽贯通至所述保护层。

S30.以所述光刻胶为掩膜刻蚀所述衬底形成多个通孔阵列单元。

S40.剥离所示光刻胶和所述保护层。具体的可以通过化学腐蚀对保护层进行剥离。在剥离保护层后，对表面进行减薄研磨，形成平整表面。

其中，所述通孔的开口具有用于表征第一子编码的第一结构和/或用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和/或所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。

在步骤S40之后可以还包括：

S50.对所述衬底的一面的表面进行疏水性处理，形成疏水结构。

S60.对所述通孔内表面进行亲水性处理，形成亲水结构。

具体的，在表面再一次进行热氧化处理，利用亲水试剂对硅片进行整体改性，使孔内表面结合亲水基团，再用疏水试剂对硅片进行表面改性，表面形成疏水结构。

本发明实施例还提供了一种高通量微阵列单分子芯片成像系统，具体如图5所示，可以包括：载物台210，承载有细胞培养腔211，所述细胞培养腔211用于放置上述实施例中描述的超高通量微阵列单分子芯片；照明光学系统220，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片输出照明光；荧光成像光学系统230，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片的观测面输出成像荧光；成像装置240，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光，形成观测图像。

优选的，所述成像装置240包括：物镜241，具有自动对焦装置2411，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光；聚焦透镜组242，用于对所述观测面反射的所述成像荧光聚焦；光学探测器243，用于将所述聚焦后的成像荧光转换为所述观测图像。上位机244，用于对光学探测器生成的观测图像信号进行图像分析。在本实施例中，光学探测器可以采用光电倍增管，将成像荧光信号转换成电信号，经过A/D转换电路，将电信号信号传输到上位机软件，进行采集处理以及图像分析。光电倍增管分辨率高，成像范围小，用于逐点扫描成像，最小分辨率可达2μm。适用于需要高分辨率成像的细胞或分子筛选。

光学探测器也可以采用面阵CCD成像，通过图像采集模块将信号转换成数字信号，由上位机软件处理存储，分析图像数据。采用CCD成像，速度快，成像范围大，最小分辨率可达到20μm。适用于通量高，需要快速成像的细胞或分子筛选。

在本实施例中，高通量微阵列单分子芯片成像系统基于倒置荧光显微镜成像原理，分为照明光学系统以及荧光成像光学系统，将芯片固定于细胞培养腔内，腔体固定于二维载物台上，进行分区域扫描成像，利用自动对焦装置，获取不同区域清晰图像，结合通孔开口形状所表征的编码的顺序，拼接成完整图像；物镜可包含不同倍率的显微物镜，先在低倍物镜下进行整体快速扫描成像，发现目标区域后，切换高倍物镜，针对目标区域进行高倍率放大成像，可观测细胞生长变化，通孔开口形状所表征的编码可便于系统快速定位目标区域。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，包括

衬底，具有用于加载样品的加样面和与所述加样面相对设置的用于观测样品的观测面；

所述衬底具有多个通孔阵列单元，所述通孔阵列单元内排布有N×M个通孔，所述通孔连通于所述加样面和所述观测面，所述通孔的开口具有用于表征第一子编码的第一结构和用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。

2.如权利要求1所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，所述通孔的开口形状为矩形，所述第一结构为直角，所述第二结构为缺角。

3.如权利要求1所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，

所述通孔的开口尺寸为5μm～60μm，所述通孔的中心距为10μm～100μm，所述通孔的深度为20μm～300μm。

4.如权利要求3所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，

所述通孔的开口形状为正方形，所述正方形的边长为15-30μm。

5.如权利要求1所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，

所述加样面的表面为疏水结构面；

所述通孔内部表面为亲水结构面。

6.如权利要求1-5任意一项所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，

所述通孔在所述加样面的开口尺寸大于所述通孔在所述观测面的开口尺寸。

7.如权利要求1-5任意一项所述的超高通量微阵列单分子芯片，其特征在于，

所述加样面和/或所述观测面的表面具有亲生物分子结构。

8.一种超高通量微阵列单分子芯片制作方法，其特征在于，包括：

提供衬底，并在所示衬底的一面形成保护层；

在所述保护层背离所示衬底的一面上涂布光刻胶，并图形化所述光刻胶，形成多个凹槽阵列单元，所述凹槽贯通至所述保护层；

以所述光刻胶为掩膜刻蚀所述衬底形成多个通孔阵列单元；

剥离所述光刻胶和所述保护层；

其中，所述通孔的开口具有用于表征第一子编码的第一结构和用于表征第二子编码的第二结构，N×M个所述通孔的第一子编码和所述第二子编码的集合用于表征所述通孔阵列单元的位置，其中，N≥1，M≥1。

9.如权利要求8所述的超高通量微阵列单分子芯片制作方法，其特征在于，在剥离所述光刻胶和所述保护层之后还包括：

对所述衬底的一面的表面进行疏水性处理，形成疏水结构；

对所述通孔内表面进行亲水性处理，形成亲水结构。

10.一种高通量微阵列单分子芯片成像系统，其特征在于，包括：

载物台，承载有细胞培养腔，所述细胞培养腔用于放置所述权利要求1-7任意一项所述的超高通量微阵列单分子芯片；

照明光学系统，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片输出照明光；

荧光成像光学系统，用于向所述超高通量微阵列单分子芯片的观测面输出成像荧光；

成像装置，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光，形成观测图像；

所述成像装置包括：

物镜，具有自动对焦装置，用于接收所述观测面反射的所述成像荧光；

聚焦透镜组，用于对所述观测面反射的所述成像荧光聚焦；

光学探测器，用于将所述聚焦后的成像荧光转换为所述观测图像。

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