CN108181478B

CN108181478B - 一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法

Info

Publication number: CN108181478B
Application number: CN201711369712.0A
Authority: CN
Inventors: 李桦楠; 帕维尔·诺伊茨尔; 徐颖; 张浩卿
Original assignee: Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Northwestern Polytechnical University
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN108181478A

Abstract

本发明公开了一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法，属于微全分析技术领域。该方法通过芯片边缘的十字标记，可以计算得到整体芯片的偏转角度，在后期处理每张图片时，可以根据该计算好的角度进行相应的旋转操作，避免了手动操作测量所带来的繁琐步骤以及时间上的消耗；根据间隔容易区分每块微反应腔部分，采取分块采集图像并分析的方法，避免了拼接以及其他因素带来的误差，保留了图片原有性质；解决了阵列式微流控芯片式生物反应的荧光信息检测问题，为快速数字微流体诊断系统铺路。

Description

一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法

技术领域

本发明属于微全分析技术领域，特别是一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法。

背景技术

现如今生物信息的荧光转化已成为生命科学研究领域的一项重要方法，并且微流控芯片在生物研究中的应用也越来越广泛，微全分析系统则是最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，例如各种芯片，在微流控芯片的分析系统中，将样品置于被集成化的数平方厘米的芯片上，实现高通量、低成本的化学分析。

专利号为CN1548944A的专利介绍了一种微流控芯片激光诱导荧光分析仪，该仪器针孔处置有可置换的CCD摄像机，与计算机通讯连接，获得图像信号，计算机控制步进电机，可以设定不同的速度移动三维平台以达到最佳检测位置；在电路方面，PMT数据采集板采集检测到的PMT信号，经单片机A/D转换后将数据上传给计算机，高压电源控制板接收来自计算机的数字信号指令并实施，输出控制板在接收来自计算机的数字信号D/A转换后控制高压模块的高电压输出，检测控制板采集高压模块输出的电压电流信号，步进电机控制板接收计算机数字信号，控制光学平台的移动，在数据采集时，接收单片机上传的数字信号显示图谱、显示各高压电源电极的电压、电流曲线图，采集完成后将采集到的谱图放大、移动显示分析比较。该仪器使用激光获取荧光信息，激光波长有一定的范围，必定会限制荧光材料的选取；对于一些生物反应过后需要最短时间内获取反应结果的实验，该仪器在时间上也会产生延迟，可能失去反应后的重要信息；并且对于一些高密度微流控芯片的微反应腔可能过小，仅使用CCD是无法获取其清晰图像的。

申请号为201710789184.8的专利提出了一种基于dPCR的新型全自动荧光信号采集分析方法，该专利对dPCR芯片进行分区域采集图片，自动识别拼接并统计荧光强度的方法，实现了全自动化，但是采集图片过程中每一步做到理论位置与实际位置重合，耗时长；自动识别拼接时采用先行后列的方式，将行与行之间的图片单独分隔开；在提取荧光强度时首先根据设计尺寸建立了一个同样的矩阵，其次根据一一对应关系提取照片上相应位置的数据。该方法在一定程度上解决了部分微流体芯片的荧光检测，但是对于某些微流体芯片的荧光检测存在无法准确清晰地采集图片的问题；并且当划分区域增加时，系统移动错位导致拼接时会有一定的误差产生。

发明内容

本发明针对现有研究中所存在的缺陷，提出一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法。

本发明实现上述目的的技术方案是，一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法，其创新点在于：该方法的步骤如下：

步骤1：阵列式微流控芯片的制作。阵列式微流控芯片为我们利用微纳米加工技术制作出的带有十字标记的微孔型芯片，参照图2，其整体尺寸为N*N㎜，区域A为微反应腔的部分，边缘尺寸为M*M㎜，区域A分为T块，分别用A1、A2、……、AT表示，T块Ai结构大小完全相同，Ai大小为m*n并且相邻两块之间的间隔为1～22μm之间，在芯片边缘和微反应腔A边缘构成的环形区域内有六个特殊的十字标记，参照图2中P1，P2，P3，P4，P5，P6，规定芯片上与P1最接近的顶点为坐标原点，P1、P2中心点连线并指向P2的方向为x正方向，P1、P5中心点连线并指向P5的方向为y正方向，若设P1的中心坐标为P1(a,b),0<a,b<(N-M)/2，则其他五点的中心坐标分别为P2(N-a,b)，P3(a，N/2)，P4(N-a，N/2)，P5(a，N-b)，P6(N-a，N-b)；该六个十字标记的中心所构成的矩形区域的大小为(N-2a)*(N-2a)。

步骤2：从芯片的四个顶点中任选一个作为初始顶点，与该初始顶点最相近的一个十字标记记为Mz,z的取值为1,2,5,6，将含有该完整十字标记Mz的部分作为第一张图片，该图片的位置即当前位置，当前位置坐标由初始顶点坐标来表示；

步骤3：初始化当前位置为初始位置，初始位置坐标由当前位置坐标表示，该步骤由以下子步骤实现：

子步骤1：从初始位置开始，可编程微动控制平台向x正方向移动(N-2*a)距离，得到包含第二个十字标记的图片M2，返回初始位置；

子步骤2：可编程微动控制平台向y正方向移动(N-2*a)/2距离，得到包含第三个十字标记的图片M3，再向x正方向移动(N-2*a)距离，得到包含第四个十字标记的图片M4，再向x负方向移动(N-2*a)距离；

子步骤3：可编程微动控制平台向y正方向移动(N-2*a)/2距离，得到包含第五个十字标记的图片M5，再向x正方向移动(N-2*a)距离，得到包含第六个十字标记的图片M6。

步骤4：利用canny算子寻找十字标记的边缘，通过霍夫转换检测并画出相关直线，从而得到Mi中十字标记的四条边缘直线，记为li1，li2，li3，li4(参照图3)；最后根据解析几何的算法计算出四条直线的四个交叉点，记为vi1，vi2，vi3，vi4(参照图3)，从而得到六个标记的中心坐标，记为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)，计算Xc2＝Xc2+(N-2*a)，Yc3＝Yc3+(N-2*a)/2，Xc4＝Xc4+(N-2*a)，Yc4＝Yc4+(N-2*a)/2，Yc5＝Yc5+(N-2*a)，Xc6＝Xc6+(N-2*a)，Yc6＝Yc6+(N-2*a)，从而，六个十字标记在整张图片上的坐标为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)。

步骤5：参照图4，由tan^-1((Ycj-Yci)/(Xcj-Xci)),j＝2,4,6；i＝1,3,5,计算水平方向上c1和c2、c3和c4、c5和c6的相对偏转角度并记为α1、α2、α3，由tan^-1((Xcj-Xci)/(Ycj-Yci)),j＝3,4,5，6；i＝1,2，3，4，计算竖直方向上c1和c3、c1和c5、c3和c5、c2和c4、c2和c6、c4和c6的相对偏转角度并记为α4、α5、α6、α7、α8、α9，分别取其平均值，即α_x＝(α1+α2+α3)/3，α_y＝(α4+α5+α6+α7+α8+α9)/6，α_x和α_y即为图片在水平方向和竖直方向上的偏转角度，取α＝(α_x+α_y)/2，则α即为图片的偏转角度，根据Yc1-Yc2与零的关系确定图片的偏转方向。

步骤6：采集区域A的T个部分，得到T张图片，分别记为A11、A22、……、ATT。

步骤7：根据步骤5所得到的图片的偏转角度及偏转方向，将图片A_ii,i＝1,2,……,T,顺时针或逆时针方向旋转角度α，并重新记为A_ii。

步骤8：在图片A_ii上,i＝1,2,……,T，根据设计尺寸，第一个微反应腔的圆心坐标为基点坐标，记为(0,0)，然后以第i个微反应腔的圆心为中心坐标，i＝1,2，……，n-1，n，n为微反应腔的总数目,作直径为d的圆，记为圆CEi，圆CEi的位置即为图片A_ii上第i个微反应腔的位置，将包括边缘的圆CEi内所有点的值设置为i，其余值均设置为0，建立m*n的矩阵B，设矩阵B中数据i的位置为b1行b2列，则提取图片A_ii中b1行b2列的数据fiz，计算fiz的总和，并记为Fi。寻找Fi的最大值Fmax，计算fi＝Fi/Fmax，则fi即为芯片上第i个微反应腔的相对荧光强度，统计相同fi的个数并记为Numi，最后，将T个A_ii图片上统计的结果综合起来，得到最终的实验结果，实验结果由荧光强度fi及其个数Numi表示。

本发明的有益效果是：通过芯片边缘的十字标记，可以计算得到整体芯片的偏转角度，在后期处理每张图片时，可以根据该计算好的角度进行相应的旋转操作，避免了手动操作测量所带来的繁琐步骤以及时间上的消耗；根据间隔容易区分每块微反应腔部分，采取分块采集图像并分析的方法，避免了拼接以及其他因素带来的误差，保留了图片原有性质；解决了阵列式微流控芯片式生物反应的荧光信息检测问题，为快速数字微流体诊断系统铺路。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为阵列式微流控芯片的结构图。

图3为图片Mi中检测到的十字标记的四条直线和四条直线相交的四个交点。

图4为所计算的图片偏转角度示意图。

图5为微反应腔为10μm的阵列式微流控芯片的结构图。

图6为实验检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步详细阐述。

一种阵列式微流控芯片(该芯片微反应腔的密度达到了570000个/cm²以上)的荧光采集分析方法的步骤依次为：

步骤1：阵列式微流控芯片的制作。阵列式微流控芯片为我们利用微纳米加工技术制作出的带有特殊标记的微孔型芯片，参照图5，其整体尺寸为9.1*9.1㎜，区域A为微反应腔的部分，边缘尺寸为8380*8380μm，区域A分为六块，分别用A1、A2、A3、A4、A5、A6表示，六块Ai结构大小(大小为2766*4194)完全相同，并且相邻两块之间的间隔为21μm，在芯片边缘和微反应腔A边缘构成的环形区域内有六个特殊的十字标记，参照图2中P1，P2，P3，P4，P5，P6，规定芯片上与P1最接近的顶点为坐标原点，P1、P2中心点连线并指向P2的方向为x正方向，P1、P5中心点连线并指向P5的方向为y正方向，若设P1的中心坐标为P1(200,200)(单位为μm)，则其他五点的中心坐标分别为P2(8900,200)，P3(200，4550)，P4(8900，4550)，P5(200，8900)，P6(8900，8900)(单位为μm)；参照图5，每一个微反应腔的尺寸为10μm，相邻两个微反应腔之间的距离(EF)为13μm，相邻两行中相邻三个微反应腔的圆心(A、B、C三点)构成等边三角形，以等六块的形式分布于芯片上，每一块中每一行有322个微反应腔，有123*2行，则该芯片上共有475272个微反应腔。

步骤2：从芯片的四个顶点中任选一个作为初始顶点，与该初始顶点最相近的一个十字标记记为Mz(z的取值为1,2,5,6)，将含有该完整十字标记Mz的部分作为第一张图片，该图片的位置即当前位置，当前位置坐标由初始顶点坐标来表示；

子步骤1：从初始位置开始，x正方向移动8700μm的距离，得到包含第二个十字标记的图片M2，返回初始位置；

子步骤2：y正方向移动4350μm的距离，得到包含第三个十字标记的图片M3，再向x正方向移动8700μm的距离，得到包含第四个十字标记的图片M4，再向x负方向移动8700μm的距离；

子步骤3：y正方向移动4350μm的距离，得到包含第五个十字标记的图片M5，再向x正方向移动8700μm的距离，得到包含第六个十字标记的图片M6。

步骤5：参照图4，由tan^-1((Ycj-Yci)/(Xcj-Xci))(j＝2,4,6；i＝1,3,5)计算水平方向上c1和c2、c3和c4、c5和c6的相对偏转角度并记为α1、α2、α3，由tan^-1((Xcj-Xci)/(Ycj-Yci))(j＝3,4,5，6；i＝1,2，3，4)计算竖直方向上c1和c3、c1和c5、c3和c5、c2和c4、c2和c6、c4和c6的相对偏转角度并记为α4、α5、α6、α7、α8、α9，分别取其平均值，即α_x＝(α1+α2+α3)/3，α_y＝(α4+α5+α6+α7+α8+α9)/6，α_x和α_y即为图片在水平方向和竖直方向上的偏转角度，取α＝(α_x+α_y)/2，则α即为图片的偏转角度，根据Yc1-Yc2与零的关系确定图片的偏转方向。

步骤6：采集区域A的六个部分，得到六张图片，分别记为A11、A22、A33、A44、A55、A66。

步骤7：根据步骤5得到图片的偏转角度及偏转方向，将图片A_ii(i＝1,2,3,4,5,6)分别顺时针(或逆时针)方向旋转角度α，再将旋转后的图片缩放至原始大小，即2766*4194，并重新记为A_ii。

步骤8：在图片A_ii上，i＝1,2,3,4,5,6,根据设计尺寸，第一个微反应腔的圆心坐标为基点坐标，记为(0,0)，然后以第i个微反应腔的圆心为中心坐标，i＝1,2，……，n-1，n，n为微反应腔的总数目，作直径为d的圆，记为圆CEi，圆CEi的位置即为图片A_ii上第i个微反应腔的位置，将包括边缘的圆CEi内所有点的值设置为i，其余值均设置为0，建立2766*4194的矩阵B，设矩阵B中数据i的位置为b1行b2列，则提取图片A_ii中b1行b2列的数据fiz，计算fiz的总和，并记为Fi。寻找Fi的最大值Fmax，计算fi＝Fi/Fmax，则fi即为芯片上第i个微反应腔的相对荧光强度，统计相同fi的个数并记为Numi，最后，将六个A_ii图片上统计的结果综合起来，得到最终的实验结果，实验结果由荧光强度fi及其个数Numi表示，参照图6。

Claims

1.一种阵列式微流控芯片的荧光采集分析方法，其特征在于：该方法的步骤如下：

步骤1：阵列式微流控芯片的制作；阵列式微流控芯片为利用微纳米加工技术制作出的带有十字标记的微孔型芯片，其整体尺寸为N*N㎜，区域A为微反应腔的部分，边缘尺寸为M*M㎜，区域A分为T块，分别用A1、A2、……、AT表示，T块Ai结构大小完全相同，Ai大小为m*n，并且相邻两块之间的间隔为1～22μm之间，在芯片边缘和微反应腔A边缘构成的环形区域内有六个特殊的十字标记P1，P2，P3，P4，P5，P6，规定芯片上与P1最接近的顶点为坐标原点，P1、P2中心点连线并指向P2的方向为x正方向，P1、P5中心点连线并指向P5的方向为y正方向，设P1的中心坐标为P1(a,b)，0<a,b<(N-M)/2，其他五点的中心坐标分别为P2(N-a,b)，P3(a，N/2)，P4(N-a，N/2)，P5(a，N-b)，P6(N-a，N-b)；该六个十字标记的中心所构成的矩形区域的大小为(N-2a)*(N-2a)；

步骤2：从芯片的四个顶点中任选一个作为初始顶点，与该初始顶点最相近的一个十字标记记为Mz，z的取值为1,2,5,6，将含有该完整十字标记Mz的部分作为第一张图片，该图片的位置即当前位置，当前位置坐标由初始顶点坐标来表示；

子步骤3：可编程微动控制平台向y正方向移动(N-2*a)/2距离，得到包含第五个十字标记的图片M5，再向x正方向移动(N-2*a)距离，得到包含第六个十字标记的图片M6；

步骤4：利用canny算子寻找十字标记的边缘，通过霍夫转换检测并画出相关直线，从而得到Mi中十字标记的四条边缘直线，记为li1，li2，li3，li4；最后根据解析几何的算法计算出四条直线的四个交叉点，记为vi1，vi2，vi3，vi4，从而得到六个标记的中心坐标，记为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)，计算Xc2＝Xc2+(N-2*a)，Yc3＝Yc3+(N-2*a)/2，Xc4＝Xc4+(N-2*a)，Yc4＝Yc4+(N-2*a)/2，Yc5＝Yc5+(N-2*a)，Xc6＝Xc6+(N-2*a)，Yc6＝Yc6+(N-2*a)，从而，六个十字标记在整张图片上的坐标为c1(Xc1，Yc1)，c2(Xc2，Yc2)，c3(Xc3，Yc3)，c4(Xc4，Yc4)，c5(Xc5，Yc5)，c6(Xc6，Yc6)；

步骤5：由tan^-1((Ycj-Yci)/(Xcj-Xci))(j＝2,4,6；i＝1,3,5)计算水平方向上c1和c2、c3和c4、c5和c6的相对偏转角度并记为α1、α2、α3，由tan^-1((Xcj-Xci)/(Ycj-Yci))，j＝3,4,5，6；i＝1,2，3，4，计算竖直方向上c1和c3、c1和c5、c3和c5、c2和c4、c2和c6、c4和c6的相对偏转角度并记为α4、α5、α6、α7、α8、α9，分别取其平均值，即α_x＝(α1+α2+α3)/3，α_y＝(α4+α5+α6+α7+α8+α9)/6，α_x和α_y即为图片在水平方向和竖直方向上的偏转角度，取α＝(α_x+α_y)/2，则α即为图片的偏转角度，根据Yc1-Yc2与零的关系确定图片的偏转方向；

步骤6：采集区域A的所述T个部分，得到T张图片，分别记为A11、A22、……、ATT；

步骤7：根据步骤5所得到的图片的偏转角度及偏转方向，将图片A_ii，i＝1,2,……,T，顺时针或逆时针方向旋转角度α，并重新记为A_ii；

步骤8：在图片A_ii上，i＝1,2,……,T，根据设计尺寸，第一个微反应腔的圆心坐标为基点坐标，记为(0,0)，然后以第i个微反应腔的圆心为中心坐标，i＝1,2，……，n-1，n，n为微反应腔的总数目，作直径为d的圆，记为圆CEi，圆CEi的位置即为图片A_ii上第i个微反应腔的位置，将包括边缘的圆CEi内所有点的值设置为i，其余值均设置为0，建立m*n的矩阵B，设矩阵B中数据i的位置为b1行b2列，则提取图片A_ii中b1行b2列的数据fiz，计算fiz的总和，并记为Fi；寻找Fi的最大值Fmax，计算fi＝Fi/Fmax，则fi即为芯片上第i个微反应腔的相对荧光强度，统计相同fi的个数并记为Numi，最后，将T个A_ii图片上统计的结果综合起来，得到最终的实验结果，实验结果由荧光强度fi及其个数Numi表示。