KR20230011907A - 생물학/유전학의 검출, 분석, 정량화 및 시험을 위한 올리고뉴클레오티드 코딩된 화학적 라이브러리, 관련 시스템, 장치 및 방법 - Google Patents

생물학/유전학의 검출, 분석, 정량화 및 시험을 위한 올리고뉴클레오티드 코딩된 화학적 라이브러리, 관련 시스템, 장치 및 방법 Download PDF

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KR20230011907A
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dna
beads
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칸다스와미 비자얀
카필 마하칼카르
이 장
앤드류 보이드 맥코넬
조셉 프랭클린 로키키
마이클 반 응우옌
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플렉시움 인코포레이티드
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Abstract

본 출원은 공유 부착된 화학적 화합물 및 공유 부착된 DNA 바코드를 갖는 비드 및 이러한 비드를 사용하는 방법을 제공한다. 비드는 많은 실질적으로 동일한 카피의 화학적 화합물 및 많은 실질적으로 동일한 카피의 DNA 바코드를 갖는다. 화합물은 1개 이상의 화학적 단량체로 이루어지고, 여기서 DNA 바코드는 바코드 모듈의 형태를 취하고, 여기서 각각의 모듈은 화학적 단량체에 상응하고 상응하는 화학적 단량체의 확인을 가능하게 한다. 핵산 바코드는 연쇄된 구조 또는 직교 구조를 가질 수 있다. 비드-결합된 핵산 바코드를 서열분석하고, 비드로부터 화합물을 절단하고, 방출된 화합물의 생물학적 활성을 평가하는 방법이 제공된다.

Description

생물학/유전학의 검출, 분석, 정량화 및 시험을 위한 올리고뉴클레오티드 코딩된 화학적 라이브러리, 관련 시스템, 장치 및 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 1월 28일에 출원된 동시-계류 중인 미국 특허 출원 번호 16/774,871의 일부 계속 출원이고, 그의 이익을 주장하고, 그에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 또한 2020년 5월 8일에 출원된 동시-계류 중인 미국 특허 출원 번호 16/870,809의 일부 계속 출원이고, 그의 이익을 주장하고, 그에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 분야
본 개시내용은 화합물의 라이브러리를 사용하는 고처리량 스크리닝에 관한 것이며, 여기서 화합물은 비드에 결합되거나 또는 비드 내에 함유되고, 각각의 비드는 한 종류의 화합물의 다수 카피를 함유하고, 여기서 추가로, 비드는 또한 비드 내에 또는 비드 상에 함유되는 화합물의 정체 또는 합성 이력을 코딩하는 DNA 태그를 함유한다. 본 개시내용은 또한 화합물-적재 비드 및 검정 물질을 함유하는 피코웰에서 수행되는 고처리량 검정에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 비드-결합된 화합물을 방출시키고, 이들을 생물학적 활성에 대해 스크리닝하는 것에 관한 것이다. 광범위하게, 본 개시내용은 비드가 화합물을 위한 전달-비히클로서 사용되는 검정 및 이러한 화합물-적재 비드를 생성하는 방법을 고려한다.
본 개시내용은 각각의 화합물이 화학적 라이브러리에 속하는 1종 이상의 단량체로 제조된 것인 비드-결합된 화합물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 비드-결합된 DNA 바코드, 즉, 각각의 핵산의 서열이 하나의 특정한 화학적 라이브러리 단량체를 지칭하는 코드 (유전자 코드에 관한 것이 아님)인 핵산에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 비드-결합된 화합물을 방출시킨 다음, 방출된 화합물을 생물학적 활성에 대해 스크리닝하는 것에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 일반적으로 세포 또는 소수의 세포를 용량-제어된 화합물로 교란시키고, RNA 및/또는 단백질 분석에 의해 세포 상태의 변화를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법은 고처리량 스크리닝, 표적 발견 또는 진단 및 다른 유사한 적용 목적을 위해 단일-세포 수준에서 또는 복수의 세포에 적용될 수 있다.
추가로, 본 개시내용은 각각 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하기 위한, 컴퓨터-구현 방법, 컴퓨터-구현 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체에 관한 것이다.
예를 들어, 분할-및-풀 화학을 수반하는 조합 화학이 다량의 화합물을 합성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 제조된 화합물은 의약 화학 분야에서 사용되며, 여기서 화합물은 다양한 생화학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 이들 활성은 1종 이상의 단백질에 대한 결합을 포함하며, 여기서 단백질은 스크리닝 시험이 수행되는 시점에 공지되어 있다. 대안적으로, 시험되는 화합물에 의해 결합되는 단백질은 결합 사건이 검출된 후에만 확인된다. 화합물은 또한 공지된 단백질을 억제 또는 활성화시키는 그의 활성에 대해 스크리닝될 수 있다 (이는 "결합" 활성에 대해서만 스크리닝되는 것은 아님). 대안적으로, 화합물은 세포 기능을 억제 또는 활성화시키는 그의 활성에 대해 스크리닝될 수 있으며, 여기서 분자 표적은 스크리닝 시에 연구자에게 공지되어 있지 않다.
화합물, 예컨대 분할-및-풀 방법에 의해 제조된 화학물질의 거대 라이브러리에 속하는 화합물의 스크리닝은 수천개의 마이크로웰, 나노웰 또는 피코웰의 어레이로 스크리닝을 수행함으로써 용이해질 수 있다. 또한, 스크리닝은 비드에 의해 각각의 피코웰에 상이한 화합물을 제공함으로써 용이해질 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 수백 카피의 동일한 화합물을 함유하고, 여기서 동일한 비드는 또한 동일한 비드에 부착된 화합물을 확인하는 데 사용될 수 있는 수백 카피의 "DNA 바코드"를 함유한다. 또한, 화합물의 스크리닝은 절단가능한 링커를 사용함으로써 추가로 용이해지며, 여기서 절단가능한 링커는 비드로부터 화합물의 제어 방출을 허용하고, 이어서 방출된 화합물은 동일한 피코웰에서 생화학적 검정 또는 세포-기반 검정에 사용된다.
액적, 피코웰 또는 마이크로유체 환경과 같은 매우 작은 국한된 부피에서 화합물을 검정하는 것은, 예를 들어 필요한 검정 시약의 부피가 낮기 때문에 매우 유익하고, 따라서 조합으로 생성된 화합물에 제한될 필요가 없다. 화합물을 비드 상에 로딩할 수 있고 또한 화합물이 나중에 비드로부터 용리되도록 하는 임의의 방법을 사용하여 비드-결합된 화합물을 작은 국한된 부피로 검정에 전달할 수 있다. 비드에 대한 핵산 바코드의 첨가는 비드 내에 존재하는 화합물의 정체가 검정 부피와 함께 운반되도록 한다. 이러한 방식으로, 마이크로타이터 플레이트 내에서 화합물의 로봇공학 또는 공간 인덱싱을 필요로 하지 않으면서 매우 높은 처리량의 검정이 수행될 수 있다. 수백만 내지 수십억개의 화합물이 1개의 작은 바이알 내에 보유될 수 있으며, 화합물의 정체는 각각의 개별 화합물을 함유하는 동일한 비드 (DNA를 가짐) 상에 태그부착된다.
통상의 약물 발견 방법은 관심 표적을 골라내고, 표적 단백질 또는 효소와 화학적 화합물의 큰 라이브러리와의 상호작용을 모니터링하는 것을 수반한다. 많은 경우에, 다수의 초기 히트는 신체에 대해 독성이거나 또는 신체 내의 다른 단백질과 교차 반응성인 것으로 발견되어, 표적-기반 선택이 약물 스크리닝을 위한 비효율적인 방법이 되게 한다. 사전-선택된 표적에 대한 필요도 또한 고유의 한계인데, 이는 질환의 생물학적 토대가 널리 공지되고 이해될 것을 요구하기 때문이다. 전체 유기체에 대한 화합물 스크리닝은 어렵고, 고비용이며, 매우 낮은 처리량의 작업이다.
세포에 대한 통상적인 표현형 스크리닝은 이환-상태 세포의 모델을 생성하고, 세포를 다양한 약물 라이브러리와 접촉시키고, 질환 표현형이 측정가능한 검정에 의해 교정되는지 여부를 모니터링하는 것을 수반하였다. 이러한 스크리닝 방법은, 기저 생물학적 메카니즘이 초기에 반드시 이해되지는 않지만 치유 반응을 나타내는 측정가능한 표현형 변화가 관련 측정법으로 간주되기 때문에, 표현형 스크리닝으로 불린다. 다양한 기준선 및 이환 세포 상태를 반영하는 방대한 수의 세포주 및 질환 모델이 오늘날 이용가능하다. 또한, 보다 많은 수의 화합물 라이브러리 및 생물학적 약물 후보가 이용가능하다. 표현형 반응을 찾기 위해 상이한 세포 모델을 상이한 약물 후보와 조합하는 명백한 스크리닝 캠페인은, 검정이 마이크로타이터 플레이트 포맷 및 영상화 양식으로 제한되기 때문에 (둘 다 처리량이 심하게 제한됨) 기술적 한계 투성이다.
처리량 한계를 극복하기 위한 한 방법은 약물 발견을 위해 고처리량 단일-세포 스크리닝 접근법을 채택하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Heath et al., Nat Rev Drug Discov. 15:204-216, 2016] 참조). 이들 접근법에서, 단일 세포는 구획으로 분리 및 단리되며, 여기서 개별 검정이 각각의 세포에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어 액적 캡슐화를 사용하는, 단일 세포의 mRNA 서열분석을 통한 게놈 분석은, 앙상블 측정에 숨겨진 복잡한 세부사항을 밝혀내는 대중적인 방법이다 (예를 들어, 문헌 [Macosko et al., Cell 161:1202-1214, 2015 및 Ziegenhain et al., Mol Cell 65:631-643, 2017] 참조, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 현 최신 기술의 단일-세포 분석 플랫폼은 전사 상태에 기초하여 세포를 특징화하고 핑거프린팅하는 단일-세포 분석으로 mRNA 전사체의 정량화를 가능하게 하였다. 이러한 접근법은 대상체로부터 추출되거나 실험에서 제조된 조직 샘플들 사이의 비교, 및 단일-세포 전사 및 이에 따른 단백질 발현 상태의 조사를 가능하게 한다. 트랜스크립톰 서열분석 및 프로파일링에 의한 단일-세포 mRNA의 측정은 질환 진행 동안의 세포의 유전학적 표현형의 분자 메카니즘, 뿐만 아니라 약물 효능, 저항성 및 치료 표적의 발견을 조사하기 위한 중요한 접근법이다 (예를 들어, 문헌 [Chu et al., Cell Biol and Toxicol 33:83-97, 2017, Wang, Cell Biol Toxicol 32:359-361, 2016, 및 Wang et al., Cell Biol Toxicol 33:423-427, 2017] 참조). 단일-세포 RNA 서열분석의 적용은 약물 효능 및 특이성, 전사 추측통계, 트랜스크립톰 가소성 및 게놈 진화와 매우 관련된 트랜스크립톰 세포-대-세포 변이에 의해 입증되는 세포간 이질성을 정의하는 데 사용되었다. 피코웰에서의 캡슐화가 또한 입증되었다 (예를 들어, 문헌 [Gierahn et al., Nat Methods 14:395-398, 2017] 참조). 유사한 단리 방법을 사용하여 단일 세포 단백질 측정이 또한 가능하다 (Butnik et al., BioRxiv, Jan. 2017, Su et al., Proteomics 17:3-4, 2017).
자동화 플랫폼의 상업화된 버전, 예컨대 플루이다임 C1(Fluidigm C1), 10X게노믹스(10XGenomics) 또는 1셀바이오(1CellBiO) 시스템을 포함한 고처리량 단일-세포 RNA-서열분석 (RNA-seq) 방법의 급속한 증가에도 불구하고, 표적 효능작용 고처리량 약물 스크리닝 및 표적 발견을 위한 단일-세포 RNA 프로파일링의 적용은 상이한 약물을 상이한 세포에 효율적으로 분할할 수 있는 방법의 결여에 의해 제약된다. 세포 또는 조직을 웰 플레이트 내에서 상이한 교란 하에 인큐베이션하고, 이어서 단일-세포 분석 및 전사체 프로파일들 사이의 비교를 수행할 수 있지만, 조사될 수 있는 약물의 수는 플레이트 용량에 의해 제한된다. 추가로, 단리된 각각의 샘플로부터 바코딩된 mRNA를 제조한 다음, 모든 샘플에 대한 포괄적인 RNA 프로파일을 수행하려는 필요도 또한 주요 병목현상을 생성한다.
본원에 기재된 바와 같은 대규모 검정에서 진행중인 문제점들 중 하나는 많은 경우에서 단일 웰 내에 단일 비드가 있어야 한다는 것이다. 이는 전형적으로 96 웰 플레이트를 사용할 때에는 문제가 되지 않지만, 100,000개 초과의 웰을 갖는 검정 장치를 사용할 때에는 유의한 문제가 된다. 예를 들어, 반(Vann) 등의 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0021734 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)는 단일 웰에 단일 비드를 제공하도록 설계된 로봇 비드 분배 시스템을 개시하지만, 이 참고문헌은 사실상 단일 초과의 비드가 웰에 투입될 수 있다는 것 및 웰이 단일 비드만을 함유한다는 시각적 확인이 요구된다는 것을 언급한다 (반 등의 단락 [0131] 참조).
단일 비드가 대규모 검정에서 요구되는 성분일 때 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시키는 비드 분배 장치를 제공하는, 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하기 위한 시스템, 장치 및 방법의 개선이 본원에 기재된다.
간략하게 언급하면, 본 개시내용은 화학적 화합물을 스크리닝하기 위한 시스템을 제공하며, 이는 ( a ) 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 어레이 플레이트를 포함하고, 여기서 각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 여기서 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 여기서 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고; ( b ) 피코웰에 배치된 비드를 포함하고, 여기서 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드 및 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고; ( c ) 여기서 비드는 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드의 형태를 취하는 비드-결합된 DNA 바코드를 포함하고, 여기서 DNA 바코드가 연쇄된 DNA 바코드의 형태를 취하는 경우에, 연쇄된 DNA 바코드는 ( i ) 클릭 화학을 사용하거나 또는 ( ii ) 단계의 반복 주기를 사용하는 방법에 의해 제조되고, 여기서 단계의 반복 주기는 부분적으로 제조된 비드-결합된 DNA 바코드에 혼성화할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 혼성화는 스플린트 올리고 상의 어닐링 부위 및 부분적으로 제조된 비드-결합된 DNA 바코드 내의 상응하는 상보적 어닐링 부위에 의해 매개되고, 여기서 어닐링된 스플린트 올리고는 DNA 폴리머라제를 사용하여 부분적으로 제조된 DNA 바코드를 연장시키기 위한 주형으로서 사용되고, 여기서 스플린트 올리고는 부분적으로 제조된 DNA 바코드로 중합될 DNA 바코드 모듈에 대해 상보적인 염기를 함유하고, ( d ) 여기서 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물 중 각각의 하나는 1종 이상의 화학적 라이브러리 단량체를 포함하고, 여기서 각각의 비드-결합된 DNA 바코드 모듈은 상응하는 화학적 라이브러리 단량체를 확인하고, 여기서 용어 "화합물"은 1종 이상의 화학적 라이브러리 구성원을 포함하는 완성된 생성물을 지칭하는 것으로 사용되고, 여기서 완성된 DNA 바코드는 화합물을 확인한다.
마이크로웰, 나노웰 또는 피코웰의 바닥은 편평할 필요는 없다. 바닥은 유리 시험 튜브 또는 금속 원심분리 튜브의 하단 방식으로 만곡될 수 있다. 또한, 바닥은 원추형 원심분리 튜브에서와 같이 원추-형상일 수 있다. 바닥은 편평할 수 있지만, 노치, 예를 들어 피코웰에 놓여 있는 임의의 비드의 하단 근처에서 검정 용액 또는 세포 배양 용액의 움직임을 용이하게 하는 노치를 가질 수 있다. 편평-바닥 실시양태에서, 본 시스템 및 방법은 편평 바닥을 요구할 수 있다.
연쇄된 DNA 바코드는 유기 화학의 방법, 예를 들어 클릭 화학에 의해 전적으로 제조될 수 있다. 또한, 직교 DNA 바코드는, 예를 들어 클릭 화학을 포함하는 유기 화학의 방법에 의해 전적으로 제조될 수 있다.
또한, 복수의 캡을 추가로 포함하며, 각각의 캡이 상이한 피코웰의 개구부에 피팅될 수 있고, 각각의 캡이 피코웰 내부에 있는 유체의 증발을 최소화하거나 방지할 수 있고, 각각이 피코웰 내부에 있는 유체의 누출을 최소화하거나 방지할 수 있는 것인 상기 시스템이 제공된다.
또한, 연쇄된 DNA 바코드가 ( i ) 클릭 화학 및 스플린트 올리고를 사용하는 단계의 반복 주기 둘 다; ( ii ) 클릭 화학 및 클릭 화학 방법이 아닌 화학적 방법 둘 다; ( iii ) 클릭 화학만; 또는 ( iv ) 스플린트 올리고를 사용하는 단계의 반복 주기만을 사용하는 방법에 의해 제조되는 것인 상기 시스템이 포함된다. 이러한 특정한 실시양태의 경우 해당 "연쇄된 DNA 바코드"는 핵산을 비드에 직접 커플링시키는 데 사용되는 임의의 화학적 커플러를 포함하지 않는다.
구형 캡 실시양태에서, 복수의 구형 캡을 추가로 포함하며, 각각의 캡이 원형인 피코웰의 개구에 피팅될 수 있고, 각각의 캡이 피코웰의 내부에 있는 유체의 증발을 최소화하거나 방지할 수 있고, 각각의 캡이 피코웰의 내부에 있는 유체의 누출을 최소화하거나 방지할 수 있는 것인 상기 시스템이 제공된다.
반응 요소 실시양태에서, 적어도 1개의 피코웰에 배치된 적어도 1개의 비드가 상기 적어도 1개의 비드에 커플링된 적어도 1개의 반응 포획 요소를 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다. 또한, 적어도 1개의 피코웰에 배치된 적어도 1개의 비드가 상기 적어도 1개의 비드에 커플링된 적어도 1개의 반응 포획 요소를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 반응 포획 요소는 ( a ) 폴리(dT) 또는 ( b ) 엑손-표적화 RNA 프로브를 포함하는 것인 상기 시스템이 고려된다.
또한, DNA 바코드가 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드이고, DNA 바코드가 1개 이상의 DNA 바코드 모듈을 포함하고, 여기서 1개 이상의 DNA 바코드 모듈 각각은 화학적 라이브러리 단량체를 확인하는 정보를 코딩하고, 여기서 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드는 ( a ) 1개 이상의 기능적 핵산; 및 ( b ) 화학적 라이브러리 단량체의 정체 이외의 다른 유형의 정보를 코딩하는 1개 이상의 핵산 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 것인 상기 시스템이 고려된다.
하기는 DNA 바코드를 구성하는 비드-결합된 DNA 바코드 모듈의 수에 적용되기 때문에 "로만 이루어진" 실시양태 및 "포함하는" 실시양태를 개시한다. DNA 바코드가 단지 1개의 DNA 바코드 모듈 또는 단지 2개의 DNA 바코드 모듈로 이루어지거나, 또는 단지 3개의 DNA 바코드 모듈 또는 단지 4개의 DNA 바코드 모듈을 함유하는 등이거나, 또는 DNA 바코드가 적어도 1개의 DNA 바코드 모듈을 포함하거나 또는 적어도 2개의 DNA 바코드 모듈을 포함하거나 또는 적어도 3개의 DNA 바코드 모듈을 포함하거나 또는 적어도 4개의 DNA 바코드 모듈을 포함하는 등의 실시양태가 제공된다.
또한, 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드가 ( i ) 제1 DNA 바코드 모듈; 또는 ( i ) 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위 및 제2 DNA 바코드 모듈; 또는 ( ii ) 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위 및 제3 DNA 바코드 모듈; 또는 ( iii ) 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위 및 제4 DNA 바코드 모듈; 또는 ( iv ) 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위, 제4 DNA 바코드 모듈, 제4 어닐링 부위 및 제5 DNA 바코드 모듈; 또는 ( v ) 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위, 제4 DNA 바코드 모듈, 제4 어닐링 부위, 제5 DNA 바코드 모듈, 제5 어닐링 부위 및 제6 DNA 바코드 모듈을 포함하는 것인 시스템이 포함된다.
또한, DNA 서열분석 프라이머에 결합할 수 있는 프라이머 결합 부위를 추가로 포함하며, 여기서 상기 프라이머 결합 부위는 제1 DNA 바코드 모듈, 제2 DNA 바코드 모듈, 제3 DNA 바코드 모듈, 제4 DNA 바코드 모듈, 제5 DNA 바코드 모듈 또는 제6 DNA 바코드 모듈 중 1개 이상의 서열분석을 지시할 수 있고, 여기서 프라이머 결합 부위는 제1 DNA 바코드 모듈의 3-프라임, 제2 DNA 바코드 모듈의 3-프라임, 제3 DNA 바코드 모듈의 3-프라임, 제4 DNA 바코드 모듈의 3-프라임, 제5 DNA 바코드 모듈의 3-프라임 또는 제6 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 또는 여기서 프라이머 결합 부위는 제1 및 제2 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제2 및 제3 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제3 및 제4 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제4 및 제5 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제5 및 제6 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하는 것인 상기 시스템이 고려된다.
추가적으로, 프라이머 결합 부위가 제1 및 제2 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제2 및 제3 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제3 및 제4 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제4 및 제5 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하거나 또는 제5 및 제6 DNA 바코드 모듈 사이에 위치하는 것인 상기 시스템이 제공된다. 상류 DNA 바코드 모듈에 대한 및 하류 DNA 바코드 모듈에 대한 프라이머 결합 부위의 위치에 관한 실시양태에서, 프라이머 결합 부위가 연속 DNA 바코드 모듈의 각각의 및 모든 쌍 사이에 위치하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
추가로, 비드가 직교 DNA 바코드인 DNA 바코드를 포함하고, 비드가 외부 표면을 포함하고, 여기서 직교 DNA 바코드는 ( a ) 제1 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제1 핵산 (여기서 제1 핵산은 제1 위치에서 비드에 커플링됨), ( b ) 제2 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제2 핵산 (여기서 제2 핵산은 제2 위치에서 비드에 커플링됨) 및 ( c ) 제3 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제3 핵산 (여기서 제2 핵산은 제3 위치에서 비드에 커플링되고, 비드 상의 제1, 제2 및 제3 위치는 각각 비드의 외부 표면 상의 상이한 위치에 위치함)을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
코딩 실시양태에서, DNA 바코드가, 임의의 화학적 라이브러리 단량체를 확인하지 않지만, 대신 ( a ) 비드에 절단가능하게 부착된 화학적 화합물의 부류; ( b ) 유기 합성의 다단계 경로에서의 단계 번호; ( c ) 비드-결합된 화합물이 합성된 날짜; ( d ) 비드-결합된 화합물이 치료하고자 의도하는 질환; ( e ) 비드-결합된 화합물이 자극 또는 억제하고자 의도하는 세포 사건; 또는 ( f ) 주어진 화학적 라이브러리 단량체를 비드에 커플링시키는 데 사용된 반응 조건을 확인하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
링커 실시양태에서, 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물 각각이 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 상기 시스템이 제공된다. 또한, 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물 각각이 광-절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 상기 시스템이 제공된다. 또한, 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물 각각이 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 상기 시스템이 제공된다.
텐타겔(TentaGel)® 실시양태에서, 적어도 1개의 비드가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 그라프트된 저 가교 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그라프트된 공중합체를 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
방출-모니터 실시양태에서, 본 개시내용은 다음과 같은 상기 시스템을 제공한다: 적어도 1개의 피코웰이 방출-모니터 비드를 함유하고 임의의 다른 유형의 비드를 함유하지 않고,
여기서 방출-모니터 비드는 비드-결합된 켄처 및 비드-결합된 형광단을 포함하고, 여기서 비드-결합된 켄처는 비드-결합된 형광단의 바로 근처에 켄칭에 의해 위치하고, 비드-결합된 형광단의 형광의 적어도 50% (또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9%)를 켄칭할 수 있고, 비드-결합된 형광단은 제1 광-절단가능한 링커에 의해 결합되고, 방출-모니터 비드를 함유하는 피코웰은 제1 피코웰이고, 제1 피코웰은 제1 용액을 함유하고, 제1 피코웰을 절단 조건에 노출시키는 것은 광-절단가능한 링커를 절단하고 형광단을 제1 피코웰의 제1 용액 내로 방출할 수 있고, 노출은 형광단을 제1 피코웰에서 제1 용액 전체에 걸쳐 확산시키고, 확산된 형광단을 포함하는 제1 용액을 함유하는 제1 피코웰 상에 광을 비추어 획득한 형광 신호는 사용자가 형광 신호를 사용하여 방출-모니터 비드로부터 비드-결합된 형광단의 방출 퍼센트를 계산하여 계산된 방출 퍼센트에 대한 값을 생성하도록 하고, 제2 피코웰은 제1 광-절단가능한 링커와 동일한 유형의 광-절단가능한 링커와 커플링된 비드-결합된 화합물을 함유하고, 제2 피코웰은 제2 용액을 함유하고,
여기서 제1 피코웰 내의 방출-모니터 비드로부터의 계산된 퍼센트 방출에 대한 값은 제2 피코웰의 제2 용액 중 방출된 화합물의 농도의 계산을 가능하게 한다.
주어진 비드에 결합된 모든 화합물의 정체에 관한 또는 주어진 비드에 결합된 모든 DNA 바코드의 정체에 관한 실시양태에서, 적어도 1개의 비드가 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 포함하고, 여기서 복수는 1천만 내지 1억 카피의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드인 상기 시스템이 제공된다. 또한, 적어도 1개의 비드가 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 복수는 1천만 내지 1억 카피의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물인 상기 시스템이 제공된다.
세포 (예를 들어, 포유동물 세포, 암 세포, 박테리아 세포)에 관한 실시양태에서, 적어도 1개의 피코웰이 적어도 1개의 세포를 포함하고, 여기서 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 적어도 1개의 비드에 결합되고, 여기서 절단가능한 링커의 절단은 비드-결합된 화합물을 비드로부터 방출시켜 방출된 화합물을 생성하고, 여기서 방출된 화합물은 적어도 1개의 세포와 접촉할 수 있는 것인 상기 시스템이 제공된다. 다른 세포 실시양태에서, 적어도 1개의 피코웰이 적어도 1개의 세포를 포함하고, 여기서 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 적어도 1개의 비드에 결합되고, 여기서 절단가능한 링커의 절단은 비드-결합된 화합물을 비드로부터 방출시켜 방출된 화합물을 생성하고, 여기서 방출된 화합물은 적어도 1개의 세포와 접촉할 수 있고, 여기서 적어도 1개의 세포는 ( i ) 암 세포가 아닌 포유동물 세포, ( ii ) 포유동물 암 세포, ( iii ) 사멸 포유동물 세포, ( iv ) 아폽토시스 포유동물 세포, ( v ) 괴사 포유동물 세포, ( vi ) 박테리아 세포, ( vii ) 플라스모디움 세포, ( vii ) 대사 활성이지만 가교된 게놈을 갖고 세포 분열을 겪을 수 없는 세포, 또는 ( ix ) 바이러스로 감염된 포유동물 세포인 상기 시스템이 제공된다.
장치 실시양태에서, 각각의 피코웰이 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 여기서 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 여기서 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고, 여기서 개구는 둥글고, 여기서 바닥은 둥글고, 여기서 벽은 원추대 형태를 취하고, 여기서 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖고, 여기서 제1 직경은 제2 직경보다 더 큰 것인 상기 시스템이 제공된다.
다른 장치-관련 실시양태에서, 각각의 피코웰이 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 여기서 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 여기서 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고, 여기서 개구는 둥글고, 여기서 바닥은 둥글고, 여기서 벽은 원추대 형태를 취하고, 여기서 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖고, 여기서 제1 직경은 제2 직경보다 더 큰 것인 상기 시스템이며, 개구 내로 꼭 맞게 피팅되는 캡을 추가로 포함하고, 여기서 개구는 보다 큰 듀로미터를 갖는 (보다 경질인) 중합체에 의해 구성되고, 여기서 캡은 보다 작은 듀로미터를 갖는 (보다 연질인) 중합체로 제조되고, 여기서 캡 및 개구의 상대 듀로미터는 캡이 개구 내로 가역적으로 및 꼭 맞게 피팅되도록 하고, 여기서 캡은 ( i ) 단지 피코웰을 막고 누출을 방지하는 것으로 의도된 캡, ( ii ) 수동 캡이고, 세포 배지 중 세포가 피코웰에서 배양되는 상황에서 세포에 의해 방출되는 대사물을 흡수할 수 있는 캡, ( iii ) 활성 캡이고, 복수의 본질적으로 동일한 화합물을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 여기서 각각의 복수의 본질적으로 동일한 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 캡, ( iv ) 활성 캡이고, 복수의 동일한 시약을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 여기서 각각의 복수의 본질적으로 동일한 시약은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 캡인 상기 시스템이 제공된다. 또한, 캡이 구형이거나, 캡이 비-구형인 상기 시스템이 제공된다.
매트 실시양태에서, 상기 시스템은 상부의 일반적으로 평면인 표면을 포함하는 피코웰 어레이 플레이트, 복수의 피코웰 (여기서 각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 여기서 상단 개구는 바닥으로부터 벽에 의해 분리되고, 여기서 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재함) 및 임의로, 상기 복수의 피코웰 중 적어도 1개에 배치된 비드 (여기서 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드 및 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함함)를 포함하고, 여기서 피코웰 어레이 플레이트는 복수의 피코웰 중 적어도 1개 또는 모두의 상단에 있는 개구부를 단단히 덮을 수 있거나 또는 복수의 피코웰 중 적어도 1개 또는 모두의 상단에 있는 개구부를 실제로 단단히 덮고 있는 매트를 추가로 포함하고, 여기서 단단히 덮는 것은 가역적이고, 여기서 매트는 임의로 ( a ) 피코웰 어레이 플레이트의 상부의 일반적으로 평면인 표면과 접촉하여 위치할 때 복수의 피코웰 중 1개 이상에 포함될 수 있는 임의의 대사물, 생화학물질 또는 단백질을 흡수할 수 있는 흡수 표면, ( b ) 피코웰 어레이 플레이트의 상단의 일반적으로 평면인 표면에 대한 가역적인 접착을 유지할 수 있는 접착 표면 중 1개 또는 모두를 포함한다.
생화학적 검정 실시양태에서, 적어도 1개의 피코웰을 포함하며, 여기서 적어도 1개의 피코웰은 복수의 실질적으로 동일한 화합물 및 복수의 실질적으로 동일한 바코드를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 피코웰은 세레블론 E3 유비퀴틴 리가제, 세레블론 E3 유비퀴틴 리가제의 기질, 예컨대 이카로스 또는 아이올로스를 포함하는 검정 배지를 포함하는 것인 상기 시스템이며, 세레블론의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 활성화시켜 이카로스 또는 아이올로스의 세포내 농도를 감소시킬 수 있는 화합물에 대해 스크리닝할 수 있는 상기 시스템이 포함된다.
또 다른 생화학적 검정 실시양태에서, 적어도 1개의 피코웰을 포함하며, 여기서 적어도 1개의 피코웰은 복수의 실질적으로 동일한 화합물 및 복수의 실질적으로 동일한 바코드를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 피코웰은 MDM2 E3 유비퀴틴 리가제, MDM2 E3 유비퀴틴 리가제의 기질, 예컨대 p53을 포함하는 검정 배지를 포함하는 것인 상기 시스템이며, MDM2의 E3 유비퀴틴 리가제 활성을 활성화시켜 p53의 세포내 농도를 증가시킬 수 있는 화합물에 대해 스크리닝할 수 있는 상기 시스템이 고려된다.
보다 많은 바코딩 실시양태에서, DNA 바코드가, 임의의 화학적 단량체를 코딩하지 않지만, 대신 ( a ) 비드에 절단가능하게 부착된 화학적 화합물의 부류; ( b ) 유기 합성의 다단계 경로에서의 단계 (여기서 비드-결합된 핵산은 비드-결합된 화합물을 제조하는 데 사용되는 주어진 화학적 단량체에 상응하고, 여기서 주어진 화학적 단량체에 상응하는 비드-결합된 핵산은 화학적 단량체를 확인함); ( c ) 비드-결합된 화합물이 합성된 날짜; ( d ) 비드-결합된 화합물이 치료하고자 의도하는 질환; ( e ) 비드-결합된 화합물이 자극 또는 억제하고자 의도하는 세포 사건 중 1개 이상을 확인하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
임의의 헤드피스가 결여된 실시양태에서, 적어도 1개의 비드가 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고 또한 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 포함하며, 임의의 비드-결합된 화합물을 임의의 비드-결합된 DNA 바코드에 연결하는 임의의 헤드피스가 존재하지 않는 상기 시스템이 제공된다.
또한, 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%가 동일한 구조를 갖는 것인 상기 시스템이 고려된다. 추가적으로, 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%가 동일한 구조를 갖는 것인 상기 시스템이 고려된다.
추가로, 연쇄된 DNA 바코드가 DNA 바코드 모듈인 적어도 1개의 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템, 또는 연쇄된 DNA 바코드가 DNA 바코드 모듈인 단지 1개의 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
서열분석 프라이머 어닐링 부위 실시양태에서, 연쇄된 DNA 바코드가 DNA 바코드 모듈인 적어도 1개의 핵산, 및 ( a ) 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 사용될 수 있거나, ( b ) 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 여기서 헤어핀 구조는 서열분석 프라이머, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위 및 헤어핀 구조 내의 굴곡부를 포함하고, 여기서 굴곡부는 서열분석 프라이머의 5-프라임이고 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위의 3-프라임이거나, 또는 ( c ) 스페이서 핵산인 적어도 1개의 기능적 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
다른 서열분석 프라이머 실시양태에서, 직교 DNA 바코드가 복수의 DNA 바코드 모듈을 함유하며, 여기서 DNA 바코드 모듈 각각은 직접 또는 링커를 통해 비드 상의 상이한 부위에 커플링되고, 여기서 복수의 DNA 바코드 모듈 각각은 ( a ) 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 사용될 수 있거나, ( b ) 헤어핀 구조를 형성할 수 있고, 여기서 헤어핀 구조는 서열분석 프라이머, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위 및 헤어핀 구조 내의 굴곡부를 포함하고, 여기서 굴곡부는 서열분석 프라이머의 5-프라임이고 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위의 3-프라임이거나, 또는 ( c ) 스페이서 핵산인 적어도 1개의 기능적 핵산을 함유하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
스플린트 올리고에 관한 기능적 언어를 언급하는 실시양태에서, 연쇄된 DNA 바코드를 포함하며, 여기서 연쇄된 DNA 바코드는 ( a ) 제1 DNA 바코드 모듈 및 제1 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)에 대한 제1 어닐링 부위 (여기서 스플린트 올리고는 3개의 핵산을 포함하고, 여기서 3개의 핵산은 제1 어닐링 부위에 대한 혼성화 상보체인 핵산, 제2 DNA 바코드 모듈에 대한 혼성화 상보체인 핵산 및 제2 어닐링 부위인 핵산임) 및 ( b ) 제2 DNA 바코드 모듈 및 제2 스플린트 올리고에 대한 제2 어닐링 부위 (여기서 제2 스플린트 올리고는 3개의 핵산을 포함하고, 여기서 3개의 핵산은 제2 어닐링 부위에 대한 혼성화 상보체인 핵산, 제3 DNA 바코드 모듈인 핵산 및 제3 어닐링 부위인 핵산임)를 포함하는 것인 비드가 제공된다.
스플린트 올리고에 관한 기능적 언어를 함유하는 또 다른 실시양태에서, 제3 DNA 바코드 모듈 및 제3 스플린트 올리고에 대한 제3 어닐링 부위를 추가로 포함하며, 여기서 제3 스플린트 올리고는 3개의 핵산을 포함하고, 여기서 3개의 핵산은 제3 어닐링 부위에 대한 혼성화 상보체인 핵산, 제4 DNA 바코드 모듈인 핵산 및 제4 어닐링 부위인 핵산인 상기 비드가 제공된다.
또한, 스플린트 올리고에 관한 기능적 언어를 함유하는 또 다른 실시양태에서, ( i ) 제4 DNA 바코드 모듈 및 제4 스플린트 올리고에 대한 제4 어닐링 부위 (여기서 제4 스플린트 올리고는 3개의 핵산을 포함하고, 여기서 3개의 핵산은 제4 어닐링 부위에 대한 혼성화 상보체인 핵산, 제5 DNA 바코드 모듈인 핵산 및 제5 어닐링 부위인 핵산임), ( ii ) 반응 포획 요소, ( iii ) 방출 모니터 중 1개 이상을 추가로 포함하는 상기 비드가 제공된다.
링커 실시양태에서, 연쇄된 DNA 바코드가 비드에 커플링되지만, ( i ) 임의의 광절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되지 않거나, ( ii ) 임의의 효소적으로 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되지 않거나; 또는 ( iii ) 임의의 종류의 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되지 않은 것인 상기 비드가 포함된다.
별개의 커플링 위치에 관한 한 실시양태에서, 연쇄된 DNA 바코드가 비드 상의 제1 위치에 커플링되고, 여기서 비드는 또한 비드 상의 제2 위치에 커플링된 화합물을 포함하고, 여기서 제1 위치는 제2 위치와 동일하지 않은 것인 상기 비드가 제공된다.
표면 실시양태 (내부 및 외부 표면)에서, 외부 표면 및 내부 표면을 포함하고, 비드에 커플링된 적어도 10,000개의 실질적으로 동일한 연쇄된 DNA 바코드를 포함하며, 여기서 적어도 10,000개의 실질적으로 동일한 연쇄된 DNA 바코드의 적어도 90%는 외부 표면에 커플링된 것인 상기 비드가 제공된다.
본 개시내용을 다른 실시양태와 구별할 수 있는 배제적 실시양태에서, 임의의 폴리아크릴아미드를 포함하지 않고, 연쇄된 DNA 바코드가 ( i ) 프로모터인 임의의 핵산을 포함하지 않거나; ( ii ) 폴리A인 임의의 핵산을 포함하지 않거나; 또는 ( iii ) 프로모터인 임의의 핵산을 포함하지 않고 폴리A인 임의의 핵산을 포함하지 않는 것인 상기 비드가 제공된다.
방출-모니터 비드 실시양태에서, 본 개시내용은 수성 배지에서 기능할 수 있는 방출-모니터 비드를 제공하고, 여기서 방출-모니터 비드는 비드-결합된 켄처 및 비드-결합된 형광단을 포함하고, 비드-결합된 켄처는 비드-결합된 형광단의 바로 근처에 켄칭에 의해 위치하고, 비드-결합된 형광단의 형광의 적어도 50%를 켄칭할 수 있고, 비드-결합된 형광단은 제1 광-절단가능한 링커에 의해 결합되고, 방출-모니터 비드를 함유하는 피코웰은 제1 피코웰이고, 제1 피코웰은 제1 용액을 함유하고, 제1 피코웰을 절단 조건에 노출시키는 것은 광-절단가능한 링커를 절단하고 형광단을 제1 피코웰의 제1 용액으로 방출할 수 있고, 노출은 형광단을 제1 피코웰에서 제1 용액 전체에 걸쳐 확산시키고, 확산된 형광단을 포함하는 제1 용액을 함유하는 제1 피코웰 상에 빛을 비추어 획득한 형광 신호는 사용자가 방출-모니터 비드로부터 비드-결합된 형광단의 방출 퍼센트를 계산하기 위해 형광 신호를 사용할 수 있게 하여 계산된 방출 퍼센트에 대한 값을 생성하고, 제2 피코웰은 제1 광-절단가능한 링커와 동일한 유형의 광-절단가능한 링커와 커플링된 비드-결합된 화합물을 함유하고, 제2 피코웰은 제2 용액을 함유하고, 제1 피코웰에서 방출-모니터 비드로부터의 계산된 방출 퍼센트에 대한 값은 제2 피코웰의 제2 용액 중의 방출된 화합물의 농도의 계산을 가능하게 한다. 다른 방출-모니터 실시양태에서, 형광단이 TAMRA이고 켄처가 QSY7인 방출-모니터 비드, 및 도 9에 제시된 구조를 갖는 방출-모니터 비드, 및 도 10에 제시된 구조를 갖는 방출-모니터 비드, 및 적어도 90%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 99.9%가 켄칭 가능한 방출-모니터 비드가 제공된다.
제조 방법 실시양태에서, 방출-모니터 비드를 합성하는 방법이며, 여기서 방출-모니터 비드는 비드, 켄처, 형광단 및 형광단을 비드에 커플링시키는 광절단가능한 링커를 포함하고, ( i ) 수지를 제공하는 단계, ( ii ) 리신 링커를 수지에 커플링시키며, 여기서 리신 링커를 함유하는 시약은 L-Fmoc-Lys(4-메틸트리틸)-OH인 단계, ( iii ) Fmoc 보호기를 제거하는 단계, ( iv ) 켄처의 공급원으로서 켄처-N-히드록시숙신이미드 (켄처-NHS)인 시약을 사용하여 켄처를 커플링시키는 단계, ( v ) 트리플루오로아세트산을 포함하는 시약을 사용하여 4-메틸트리틸 보호기를 제거하는 단계, ( vi ) 광절단가능한 링커를 리신의 엡실론 아미노 기에 커플링시키며, 여기서 광절단가능한 링커는 Fmoc-광절단가능한 링커-OH인 시약에 의해 제공되는 것인 단계, ( vii ) 형광단을 커플링시키는 단계를 이 순서로 포함하는 방법이 포함된다. 또한, 단계의 순서와 관계없는 상기 실시양태가 제공된다. 다른 방법 실시양태에서, 형광단이 TAMRA이고 켄처가 QSY7인 상기 방법이 제공된다.
방출-모니터 비드의 유용성에 관한 방법에서, 피코웰에 존재하는 용액 중 화합물의 농도를 제어하는 방법이며, 여기서 방법은 피코웰 내의 비드-결합된 화합물에 적용되고, 여기서 피코웰은 용액을 함유하고, 여기서 비드-결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되고, ( a ) 비드-결합된 화합물을, 절단가능한 링커의 절단을 수행하고 비드로부터 비드-결합된 화합물을 방출시키는 조건에 노출시켜 방출된 화합물을 생성하고, 여기서 방출 후 용액 중 방출된 화합물의 확산 또는 분산이 이어져 용액 중 화합물의 실질적으로 균일한 농도를 생성하고, ( b ) 여기서 조건이 절단가능한 링커를 절단할 수 있는 광을 포함하고, ( c ) 여기서 조건이 실질적으로 균일한 농도의 결정된 농도를 생성하도록 조정되고, ( d ) 여기서 결정된 농도가 비드-결합된 방출-모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도와 관련하여 이루어진 것을 포함하는 방법이 제공된다. 또한, 조건이 광의 파장, 광의 강도 및 광 노출의 지속기간 중 1개 이상을 조정함으로써 조정되는 것인 상기 방법, 및 비드-결합된 방출-모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도가 비드로부터 비드-결합된 화합물의 방출을 수행하여 방출된 화합물을 생성하는 것과 동시에 결정되는 것인 상기 방법, 및 비드-결합된 방출-모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도가 실질적으로 비드로부터 비드-결합된 화합물의 방출을 수행하여 방출된 화합물을 생성하기 전 시간에 결정되는 것인 상기 방법이 제공된다.
용어 "결정된"은 비드를 광에 노출시키기 전에 농도가 목적하는 농도로서 미리 결정 및 결정된 것을 의미할 수 있다. 또한, 용어 "결정된"은 농도가 "실시간"으로 결정된 것, 즉, 비드를 광에 노출시키는 것과 동시에 농도가 결정된 것을 의미할 수 있다.
캡 실시양태에서, 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 플레이트와 조합된 캡이 포함되며, 여기서 캡은 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 플레이트와 함께 사용될 수 있고, 여기서 복수의 피코웰 각각은 개구, 바닥 및 벽에 의해 형성될 수 있고, 여기서 벽은 상단의 개구 및 하단의 바닥에 의해 형성되고, 여기서 개구는 둥글고, 여기서 바닥은 둥글고, 여기서 벽은 원추대의 표면 형태를 취하고, 여기서 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖고, 여기서 제1 직경은 제2 직경보다 더 크고,
여기서 캡은 개구 내로 꼭 맞게 피팅될 수 있는 구형 캡이고, 여기서 개구는 보다 큰 듀로미터를 갖는 (보다 경질인) 중합체에 의해 구성되고, 여기서 캡은 보다 작은 듀로미터를 갖는 (보다 연질인) 중합체로 제조되고, 여기서 캡 및 개구의 상대 듀로미터는 구형 캡이 개구 내로 가역적으로 및 꼭 맞게 피팅되도록 하고, 여기서 캡은 ( i ) 피코웰을 막고 누출을 방지할 수 있고, ( ii ) 세포 배지 중 세포가 피코웰에서 배양되는 상황에서 세포에 의해 방출되는 대사물을 흡수할 수 있는 수동 캡, ( iii ) 복수의 본질적으로 동일한 화합물을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 여기서 각각의 복수의 본질적으로 동일한 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되고, 여기서 절단가능한 링커의 절단은 비드로부터 복수의 화합물 중 적어도 일부를 방출시키는 것인 활성 캡, ( iv ) 복수의 동일한 시약을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 여기서 각각의 복수의 본질적으로 동일한 시약은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되고, 여기서 절단가능한 링커의 절단은 비드로부터 복수의 시약 중 적어도 일부를 방출시키는 것인 활성 캡이다.
다공성 캡 실시양태에서, 피코웰 플레이트 및 고체 중합체 코팅과 조합된 복수의 다공성 캡이 제공되고, 여기서 각각의 복수의 다공성 캡은 상부 표면 및 하부 표면을 포함하고, 피코웰 플레이트는 복수의 피코웰을 포함하고, 적어도 1개의 다공성 캡은 피코웰과 접촉하고, 피코웰 내에 가역적으로 및 꼭 맞게 끼워지고, 피코웰 플레이트 및 복수의 다공성 캡의 각각의 상부 표면은 고체 중합체 코팅으로 덮이고, 고체 중합체 코팅은 각각의 캡의 상부 표면의 적어도 일부와 접촉하고, 상부 표면의 상기 적어도 일부에 접착식으로 부착되고, ( i ) 각각의 복수의 피코웰은 수용액을 보유할 수 있고, 반응의 생성물은 용액에서 생성되고, 생성물의 적어도 일부는 복수의 다공성 캡 각각의 하부 표면에 의해 흡수되고, ( ii ) 중합이 가능한 중합가능한 시약의 용액은 피코웰 플레이트와 조합된 복수의 다공성 캡 위에 붓고, 중합가능한 시약은 중합되어 피코웰 플레이트의 실질적으로 모든 상단 표면을 코팅하는 실질적으로 평면인 표면을 형성함으로써, 중합된 시약을 각각의 복수의 다공성 캡에 고정시키고, ( iii ) 모든 복수의 다공성 캡은 복수의 피코웰로부터의 박리 작용에 의해 제거가능하고, 복수의 다공성 캡과 중합된 시약 사이에 접착이 유지되어, 부분적으로 각각의 캡의 상부 표면과 부착된 캡의 어레이가 중합된 시약에 포매되고, 각각의 캡의 하부 표면은 임의의 흡수된 반응 생성물의 분석을 위해 접근가능하다.
이는 DNA 바코드의 효소적 합성을 가이드하기 위해 스플린트 올리고를 사용하는 제조 방법 실시양태를 제공한다. 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드를 제조하는 방법이며, 여기서 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드는 복수의 DNA 바코드 모듈 및 임의로 1개 이상의 기능적 핵산 및 임의로 화학적 라이브러리 단량체의 정체 이외의 다른 것의 정체를 코딩하는 1개 이상의 정체-코딩 핵산을 포함하고, ( a ) 비드에 제1 DNA 바코드 모듈 및 제1 어닐링 부위를 포함하는 커플링된 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 제1 어닐링 부위는 제1 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)와 혼성화할 수 있고, 제1 스플린트 올리고는 커플링된 폴리뉴클레오티드에 대한 중합을 촉매하는 DNA 폴리머라제에 대한 주형으로서의 역할을 할 수 있고, 뉴클레오티드는 혼성화된 제1 스플린트 올리고의 것에 대해 상보적이고, 여기서 중합 후 혼성화된 제1 스플린트 올리고의 것에 대해 상보적인 중합된 뉴클레오티드는 비드-결합된 제2 DNA 바코드 모듈 및 제2 어닐링 부위를 포함하는 것인 단계; ( b ) 상기 비드에 상기 제1 스플린트 올리고를 갖는 커플링된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 제1 스플린트 올리고가 상기 커플링된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하도록 하는 것인 단계; ( c ) DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 ( dNTP )를 첨가하고, DNA 폴리머라제가 커플링된 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 dNTP의 중합을 촉매하도록 하는 단계이며, 여기서 커플링된 폴리뉴클레오티드는 유리 3'-말단을 갖고, 여기서 중합은 유리 3'-말단에 대한 것인 단계, ( d ) 제1 스플린트 올리고를 세척해내는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 또한, 제1 스플린트 올리고가 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈 및 제2 어닐링 부위를 포함하는 것인 상기 방법이 고려된다.
추가의 제조 방법 실시양태에서, 제1 스플린트 올리고가 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위 및 제1 서열분석 프라이머 어닐링 부위를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서 제1 서열분석 프라이머 어닐링 부위는 서열분석 프라이머에 혼성화하여 혼성화된 서열분석 프라이머를 생성할 수 있고, 여기서 혼성화된 서열분석 프라이머는 제2 DNA 바코드 모듈 및 제1 DNA 바코드 모듈의 서열분석을 지시할 수 있는 것인 상기 방법이 제공된다.
또한, 제1 스플린트 올리고, DNA 폴리머라제 및 dNTP가 모두 동시에 첨가되거나 또는 제1 스플린트 올리고, DNA 폴리머라제 및 dNTP가 각각 별개의 시간에 첨가되는 것인 상기 방법이 고려된다.
비드 상의 내부 대 외부 위치에 관하여, 비드가 외부 위치 및 내부 위치를 포함하고, 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드가 실질적으로 비드의 외부 상에 있는 위치에서 및 드물게 비드의 내부 위치에서 비드에 커플링되고, 비드가 또한 복수의 커플링된 화합물을 포함하고, 여기서 모든 복수의 커플링된 화합물은 서로 비교하였을 때 실질적으로 동일한 구조를 갖고, 비드가 실질적으로 소수성 중합체로 구성되는 것인 상기 방법이 제공된다.
추가의 방법 실시양태에서, ( a ) 비드에 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 및 제2 어닐링 부위를 포함하는 커플링된 제1의 보다 긴 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계이며, 여기서 제2 어닐링 부위는 제2 스플린트 올리고와 혼성화할 수 있고, 제2 스플린트 올리고는 커플링된 제1의 보다 긴 폴리뉴클레오티드에 대한 중합을 촉매하는 DNA 폴리머라제에 대한 주형으로서의 역할을 할 수 있고, 뉴클레오티드는 혼성화된 제2 스플린트 올리고의 것에 대해 상보적이고, 여기서 중합 후 혼성화된 제2 스플린트 올리고의 것에 대해 상보적인 중합된 뉴클레오티드는 비드-결합된 제3 DNA 바코드 모듈 및 제3 어닐링 부위를 포함하는 것인 단계; ( b ) 상기 비드에 상기 제2 스플린트 올리고를 갖는 커플링된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 상기 제2 스플린트 올리고가 상기 커플링된 제1의 보다 긴 폴리뉴클레오티드와 혼성화하도록 하는 것인 단계; ( c ) DNA 폴리머라제 및 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 ( dNTP )를 첨가하고, DNA 폴리머라제가 커플링된 보다 긴 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 dNTP의 중합을 촉매하도록 하는 단계이며, 여기서 커플링된 보다 긴 폴리뉴클레오티드는 유리 3'-말단을 갖고, 여기서 중합은 유리 3'-말단에 대한 것인 단계, ( d ) 제2 스플린트 올리고를 세척해내는 단계를 추가로 포함하는 상기 방법이 제공된다.
이는 전체 DNA 바코드의 제조를 위한 제1 DNA 바코드 모듈, 제2 DNA 바코드 모듈, 제3 DNA 바코드 모듈 등의 연속 넘버링에 관한 것이다. 이는 또한 전체 DNA 바코드의 제조에서 방법 단계의 주기를 몇번이고 반복하는 것에 관한 것이다. 언급된 단계를 반복하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 반복의 경우, DNA 바코드 모듈의 명칭은 기존 명칭에 1개의 번호를 부가함으로써 증가되고, 어닐링 부위의 명칭은 기존 명칭에 1개의 번호를 부가함으로써 증가되고, 스플린트 올리고의 명칭은 기존 원위 말단 DNA 바코드 모듈의 명칭에 1개의 번호를 부가함으로써 증가되고, "제1의 보다 긴 폴리뉴클레오티드"의 명칭은 기존 명칭에 1개의 번호를 부가함으로써 변화되고, 여기서 언급된 단계를 반복하는 단계를 포함하는 것은 1회 반복 또는 2회 반복 또는 3회 반복 또는 4회 반복 또는 5회 초과의 반복 또는 5회 초과의 반복 또는 10회 초과의 반복인, 각각의 상기 복수의 DNA 바코드 모듈이 번호에 의해 확인되거나 명명되는 것인 상기 방법이 제공된다.
또한, 각각의 스플린트 올리고가 서열분석 프라이머 어닐링 부위를 포함하고, 서열분석 프라이머 어닐링 부위가 서열분석 프라이머에 혼성화하여 혼성화된 서열분석 프라이머를 생성할 수 있고, 혼성화된 서열분석 프라이머가 적어도 1개의 비드-결합된 DNA 바코드 모듈 및 적어도 1개의 비드-결합된 DNA 바코드 모듈의 서열분석을 지시할 수 있는 것인, 복수의 스플린트 올리고를 포함하는 상기 방법이 고려된다.
이는 기능적 핵산 및 다양한 유형의 정보제공 핵산을 합성하기 위해 DNA 폴리머라제를 가이드하는 스플린트 올리고에 관한 실시양태에 관한 것이다. 적어도 1개의 스플린트 올리고가 기능적 핵산을 포함하거나, 또는 적어도 1개의 스플린트 올리고가 화학적 라이브러리 단량체에 대한 정보 이외의 다른 정보를 코딩하는 것인 상기 방법이 제공된다. 클릭 화학에 의해 적어도 1개의 DNA 바코드 모듈을 커플링시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 단계는 임의의 스플린트 올리고를 사용하지 않는 것인 상기 방법이 제공된다.
간략하게 언급하면, 본 개시내용은 화학적 화합물을 스크리닝하기 위한 시스템을 제공하며, 이는 ( a ) 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 어레이 플레이트를 포함하고, 여기서 각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 여기서 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 여기서 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고; ( b ) 적어도 1개의 피코웰에 배치된 적어도 1개의 비드를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드 및 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고; ( c ) 여기서 적어도 1개의 비드는 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드의 형태를 취하는 비드-결합된 DNA 바코드를 포함하고, 여기서 DNA 바코드가 연쇄된 DNA 바코드의 형태를 취하는 경우에, 연쇄된 DNA 바코드는 ( i ) 클릭 화학을 사용하거나 또는 ( ii ) 단계의 반복 주기를 사용하는 방법을 사용하여 제조되고, 여기서 반복 주기의 단계는 부분적으로 제조된 DNA 바코드에 어닐링하기 위한 스플린트 올리고를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 어닐링된 스플린트 올리고는 DNA 폴리머라제를 사용하여 부분적으로 제조된 DNA 바코드를 연장시키기 위한 주형으로서 사용되고, 여기서 스플린트 올리고는 부분적으로 제조된 DNA 바코드로 중합될 DNA 바코드 모듈에 대해 상보적인 염기를 함유한다.
또 다른 측면에서, DNA 바코드가 ( a ) 1개 이상의 DNA 바코드 모듈 (여기서 1개 이상의 DNA 바코드 모듈 각각은 화학적 라이브러리 단량체의 정체에 대한 정보를 코딩함) 및 ( b ) 임의로, 1개 이상의 기능적 핵산 및 ( c ) 임의로, 화학적 라이브러리 단량체의 정체에 대한 정보 이외의 다른 정보의 유형인 정보를 코딩하는 1개 이상의 핵산을 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
또한, 복수의 캡을 추가로 포함하며, 각각이 상이한 피코웰의 개구부에 피팅될 수 있고, 각각이 피코웰의 내부에 있는 유체의 증발을 최소화하거나 방지할 수 있고, 각각이 피코웰의 내부에 있는 유체의 누출을 최소화하거나 방지할 수 있는 것인 상기 시스템이 제공된다.
또한, 복수의 구형 캡을 추가로 포함하며, 각각이 원형인 피코웰의 개구에 피팅될 수 있고, 각각이 피코웰의 내부에 있는 유체의 증발을 최소화하거나 방지할 수 있고, 각각이 피코웰의 내부에 있는 유체의 누출을 최소화하거나 방지할 수 있는 것인 상기 시스템이 포함된다.
또한, 적어도 1개의 비드가 연쇄된 DNA 바코드의 형태를 취하는 DNA 바코드를 포함하는 경우에, 연쇄된 DNA 바코드가 ( i ) 서열분석 프라이머 결합 부위, ( ii ) 제1 DNA 바코드 모듈, ( iii ) 제1 올리고뉴클레오티드 스플린트와 혼성화할 수 있는 제1 어닐링 부위 (여기서 제1 올리고뉴클레오티드 스플린트는 제2 DNA 바코드 모듈의 효소적 합성을 가이드하는 데 사용될 수 있음), ( iv ) 제2 DNA 바코드 모듈, ( v ) 제2 올리고뉴클레오티드 스플린트와 혼성화할 수 있는 제2 어닐링 부위 (여기서 제2 올리고뉴클레오티드 스플린트는 제3 DNA 바코드의 합성을 가이드하는 데 사용될 수 있음), ( vi ) 제3 DNA 바코드 모듈, ( vii ) 제3 올리고뉴클레오티드 스플린트와 혼성화할 수 있는 제3 어닐링 부위 (여기서 제3 올리고뉴클레오티드 스플린트는 제4 DNA 바코드를 합성하는 데 사용될 수 있음)를 포함하는 것인 상기 시스템이 고려된다.
방법 실시양태에서, ( a ) 복수의 비드를 제공하는 단계이며, 여기서 각각의 비드는 비드 표면에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 및 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물을 포함하고, 여기서 비드에 부착된 올리고뉴클레오티드의 서열은 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물의 합성 이력을 코딩하는 것인 단계; ( b ) 복수의 비드를 화합물 라이브러리 내의 화합물의 목적하는 특성에 대한 검정에 혼입시키는 단계; ( c ) 적어도 1개의 비드로부터 신호를 포획하는 단계이며, 여기서 신호는 검정에서 비드 상의 화합물의 성능을 반영하는 것인 단계; ( d ) 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 제거하지 않으면서, 검정 신호가 또한 포획된 적어도 1개의 비드에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드를 서열분석하는 단계; ( e ) 단계 ( d )의 서열분석 판독물로부터 적어도 1개의 화합물을 확인하고, 이를 단계 ( c )의 신호에서 포획된 그의 상응하는 검정 성능에 관련시키는 단계를 포함하는, 목적하는 특성을 갖는 화합물에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
추가로 상세하게, 검정이 결합 검정을 포함하거나, 또는 검정이 활성 검정을 포함하거나, 또는 검정이 경쟁적 결합 검정 또는 경쟁적 억제 검정을 포함하거나, 또는 검정이 비테더링된 화합물과 다른 검정 시약의 상호작용을 포함하며, 여기서 비테더링된 화합물은 비드 표면으로부터 방출된 화합물이거나 또는 화합물은 화합물을 비드에 연결하는 절단가능한 링커를 절단함으로써 방출되거나, 또는 검정이 복수의 국한된 부피에서 일어나며, 여기서 국한된 부피당 명목상 1개의 비드가 분산되는 것인 상기 방법이 포함된다.
또 다른 측면에서, 국한된 부피가 수성 액적을 포함하거나, 또는 수성 액적이 오일 배지 또는 소수성 액체 배지 중에 현탁되거나, 또는 국한된 부피가 피코웰을 포함하거나, 또는 피코웰이 규칙적 어레이로 조직화되거나, 또는 복수의 국한된 부피가 규칙적 어레이로 조직화되는 것인 상기 방법이 추가로 고려된다.
또한, 국한된 부피가 비드 주위에 부착성 수성 배지의 층을 포함하고, 비드가 소수성 배지 중에 현탁되는 것인 상기 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 서열분석하기 전에 검정 시약이 세척되는 것인 상기 방법, 및 서열분석 단계 ( d )가 검정 단계 ( b ) 전에 수행되는 것인 상기 방법이 추가로 포함된다. 또한, 비드 상의 올리고뉴클레오티드가 서열분석 단계 후에, 그러나 검정 단계 전에 제거되는 것인 상기 방법이 제공된다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 제거가 효소적 소화, 화학적 절단, 열 분해 또는 물리적 전단을 포함하는 것인 상기 방법, 및 결합 검정이 비드에 대한 RNA 분자의 결합을 포함하는 것인 상기 방법, 및 비드로부터의 신호가 결합된 RNA 분자의 서열분석을 포함하는 것인 상기 방법이 추가로 고려된다.
또 다른 측면에서, 결합 검정이 형광 표지된 결합 검정을 포함하고, 비드 상의 화합물에 결합하는 분자가 형광단을 포함하는 것인 상기 방법, 또는 결합 검정이 핵산 표지된 결합 검정을 포함하고, 비드 상의 화합물에 결합하는 분자가 핵산 태그를 포함하고, 추가로 검정으로부터의 신호가 비드 상의 화합물에 결합하는 분자에 부착된 핵산 태그의 서열분석을 포함하는 것인 상기 방법이 제공된다.
특성에 관한 방법 실시양태에서, 목적하는 특성이 ( i ) 효소의 촉매 활성을 억제 또는 자극하는 것, ( ii ) 세포-기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th1-유형 면역 반응을 자극하는 것, ( iii ) 세포-기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th2-유형 면역 반응을 자극하는 것, ( iv ) 세포-기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th1-유형 면역 반응을 억제하는 것, ( v ) 세포-기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th2-유형 면역 반응을 억제하는 것, ( vi ) 정제된 단백질, 세포-기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 단백질의 유비퀴틴-매개 분해를 자극 또는 억제하는 것 중 1개 이상을 포함하는 것인 상기 방법이 제공된다.
시스템 실시양태에서, ( a ) 복수의 화합물-부착된, 올리고뉴클레오티드-코딩된 비드를 수용하기 위한 샘플 구획; ( b ) 샘플 구획 내의 복수의 캡슐화 구획이며, 각각의 캡슐화 구획은 명목상 검정 배지 중에 분산된 단일 비드를 포함하고, 추가로 검정 배지는 비드 상의 화합물과의 상호작용이 검정되어 측정가능한 신호를 생성하는 시약을 포함하는 것인 복수의 캡슐화 구획; ( c ) 신호를 측정하기 위한 검출기; ( d ) 서열분석 플랫폼; 및 ( e ) 사용자로부터의 1개 이상의 명령을 수용하기 위한 사용자 인터페이스를 포함하는, 목적하는 활성을 갖는 화합물에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 시스템이 제공된다. 캡슐화 구획이 액체 액적을 포함하는 것인 상기 시스템이 또한 제공된다. 또 다른 측면에서, 캡슐화 구획이 피코웰을 포함하거나, 또는 추가로 캡슐화 구획이 검정 시약을 포함하거나, 또는 검출기가 광학 검출기를 포함하거나, 또는 서열분석기가 광학 검출기를 포함하는 것인 상기 시스템이 제공된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (a) 핵산 코딩된 교란을 제공하고, 세포를 핵산 코딩된 교란과 함께 국한시키는 단계; (b) 세포를 국한된 부피에서 핵산 코딩된 교란과 접촉시키며, 여기서 교란 개시 및 용량은 제어되는 것인 단계; (c) 세포를 명시된 기간 동안 핵산 코딩된 교란과 함께 인큐베이션하는 단계; 및 (d) 핵산 코딩된 교란을 코딩하는 핵산을 세포로 전달하는 단계에 의해 세포를 교란시키는 방법을 특색으로 한다.
이러한 측면의 일부 실시양태에서, 핵산 코딩된 교란은 핵산 코딩된 화합물 또는 약물 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 코딩된 교란은 DNA-코딩된 라이브러리이다.
일부 실시양태에서, 교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 부착되지 않고 용액 중에 유리된다. 일부 실시양태에서, 교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 서로 부착된다. 일부 실시양태에서, 교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 동일한 기질에 부착되지만 서로에는 부착되지 않는다. 일부 실시양태에서, 기질에의 교란의 부착 및 기질에의 핵산의 부착은 절단가능한 부착이다. 특정한 실시양태에서, 절단가능한 부착은 광절단가능한 부착, 온도 절단가능한 부착, pH 감수성 부착, 산 절단가능한 부착, 염기 절단가능한 부착, 소리 절단가능한 부착, 염 절단가능한 부착, 산화환원 감수성 부착 또는 물리적으로 절단가능한 부착으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용의 이러한 측면의 일부 실시양태에서, 세포 및 교란을 국한시키는 것은 액적 캡슐화, 에멀젼 캡슐화, 피코웰 캡슐화, 마크로웰 캡슐화, 물리적 부착, 버블 캡슐화 또는 미세유체 국한을 포함한다.
일부 실시양태에서, 교란에 대한 제어는 광 노출의 제어, 온도 노출의 제어, pH 노출의 제어, 시간 노출의 제어, 소리 노출의 제어, 염 노출의 제어, 화학적 또는 물리적 산화환원 전위의 제어 또는 기계적-교반 노출의 제어를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 인큐베이션은 기질로부터 교란을 절단한 후에 또는 기질로부터 핵산을 절단한 후에 세포를 교란에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 기질로부터 교란을 절단하지 않거나 또는 교란으로부터 핵산을 절단하지 않으면서 세포를 교란에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 코딩된 교란을 코딩하는 핵산을 세포로 전달하는 것은 핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산을 세포 막 내로 삽입하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산을 세포 표면 상의 생체분자에 부착시키는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 생체분자는 단백질 또는 탄수화물이다. 다른 실시양태에서, 핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산 상의 임의적인 태그를 통해 부착시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포를 교란에 의해 교란시키고 세포를 교란의 정체로 코딩하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 (a) 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리를 제공하는 단계; (b) 세포를 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리와 함께 국한시키는 단계이며, 여기서 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리는 조합으로 합성된 화합물의 1개 이상의 카피 및 코딩 핵산 태그의 1개 이상의 카피를 포함하고, 여기서 화합물 및 코딩 핵산은 비드에 부착되고, 여기서 코딩 핵산은 화합물의 정체를 코딩하고, 여기서 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리 및 세포는 국한 부피에서 국한되는 것인 단계; (c) 비드로부터 화합물을 방출시키고, 화합물을 국한 부피 내부에서 세포와 함께 인큐베이션하는 단계; (d) 임의로, 비드로부터 코딩 핵산 태그를 방출시키는 단계; 및 (e) 코딩 핵산 태그를 세포에 부착시켜, 세포에 부착된 코딩 핵산 태그를 통해 화합물의 정체를 보존하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포를 교란시키고, 세포를 교란의 정체로 코딩하고, 교란에 대한 세포의 반응을 측정하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 (a) 세포를 제1 국한된 부피에서 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리와 접촉시키고, 여기서 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리는 조합으로 합성된 화합물의 1개 이상의 카피 및 코딩 핵산 태그의 1개 이상의 카피를 포함하고, 여기서 화합물 및 코딩 핵산은 비드에 부착되고, 코딩 핵산은 화합물의 정체를 코딩하는 것인 단계; (b) 라이브러리 내의 화합물을 비드로부터 방출시키고, 라이브러리 내의 화합물을 제1 국한된 부피에서 세포와 함께 인큐베이션하는 단계; (c) 임의로, 코딩 핵산 태그를 제1 국한된 부피에서 비드로부터 방출시키는 단계; (d) 코딩 핵산 태그를 세포의 세포 표면에 포획시키고, 이에 의해 세포는 라이브러리 내의 화합물에 노출되고, 노출된 화합물의 정체는 세포 표면 상에 포획되는 것인 단계; (e) 세포를 제1 국한 부피로부터 방출시키고, 여기서 코딩 핵산 태그는 세포에 부착되고, 코딩 핵산 태그는 세포가 노출된 화합물의 정체를 코딩하는 것인 단계; (f) 이전에 교란되고 핵산 태그부착된 세포를 제2 국한된 부피에서 반응-검출 비드로 포획하고, 여기서 세포는 세포의 세포 내용물을 반응-포획 비드에 노출시키는 용해 조건에 노출되고, 반응 포획 비드는 세포 내용물을 포획하는 포획 프로브 및 이전에 교란되고 핵산 태그부착된 세포에서 교란을 코딩하는 핵산 태그를 포함하는 것인 단계, (g) 반응-포획 비드를 용해된 세포와 제2 국한 부피에서 인큐베이션하고, 이에 의해 세포 내용물 및 반응-포획 비드 상의 교란을 코딩하는 핵산 태그 둘 다를 포획하는 단계, (h) 임의로, 세포의 반응을 핵산 신호로의 교란으로 전환시키고, 여기서 교란에 대한 세포의 반응은 핵산 신호가 아닌 것인 단계 및 (i) 반응-포획 비드에 부착된 핵산 태그를 서열분석하고, 이에 의해 교란의 정체를 교란에 대한 세포의 반응과 상관시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 피코웰의 어레이 및 관능화된 교란 비드의 라이브러리를 제공하고, 여기서 피코웰은 단일 세포 및 단일 관능화된 교란 비드를 수용할 수 있고, 각각의 관능화된 교란 비드는 상이한 복수의 실질적으로 동일한 방출가능한 화합물 및 화합물을 코딩하는 복수의 뉴클레오티드 바코드를 포함하고, 뉴클레오티드 바코드는 세포의 세포 내용물을 포획할 수 있는 관능화된 바코드이고, 세포의 세포 내용물은 관능화된 교란 비드에 함유된 교란에 대한 세포 반응을 포함하는 것인 단계, (b) 단일 세포를 피코웰 어레이의 각각의 피코웰 내로 포획하는 단계, (c) 단일 관능화된 교란 비드를 단일 세포를 함유하는 피코웰로 포획하는 단계, (d) 관능화된 교란 비드로부터 화합물을 방출시키고, 세포를 방출된 화합물과 함께 인큐베이션하고, 여기서 피코웰 사이의 화합물은 최소의 확산을 갖는 것인 단계, (e) 세포를 용해시켜 세포 내용물을 방출시키는 단계, (f) 세포 내용물의 1개 이상의 성분을 관능화된 교란 비드 상의 관능화된 올리고뉴클레오티드 상에 포획하고, 여기서 포획은 혼성화 및 효소적 연장을 포함하여 뉴클레오티드 바코드를 세포 내용물의 핵산 요소와 조합함으로써, 뉴클레오티드 바코드 및 세포 내용물의 핵산 요소의 하이브리드를 형성하는 것인 단계 및 (g) 하이브리드를 방출시키고, 관능화된 교란 비드의 라이브러리로부터 하이브리드를 수집하고, 하이브리드를 서열분석하여, 교란을 세포 반응과 교란과 관련시키는 단계에 의한, 세포를 교란하고, 세포의 교란에 대한 반응을 포획하는 방법을 특징으로 한다.
화학적 화합물을 스크리닝하기 위한 시스템이 제공된다. 잠재적 실시양태는 하기를 포함한다:
시스템은 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 어레이 플레이트를 포함할 수 있고, 각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 상단 개구는 바닥으로부터 벽에 의해 분리된다. 벽은 상단 개구와 바닥 사이에 존재한다.
시스템은 피코웰에 배치된 단일 비드를 포함할 수 있고, 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 DNA 바코드 및 복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 화합물을 포함한다.
비드는 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드의 형태를 취하는 비드 결합된 DNA 바코드를 포함할 수 있고, DNA 바코드가 연쇄된 DNA 바코드의 형태를 취하는 경우에, 연쇄된 DNA 바코드는 클릭 화학을 사용하는 것 또는 단계의 반복 주기를 사용하는 것 중 하나 또는 둘 다를 사용하는 방법에 의해 제조된다.
단계의 반복 주기는 부분적으로 제조된 비드 결합된 DNA 바코드에 혼성화할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 혼성화는 스플린트 올리고 상의 어닐링 부위 및 부분적으로 제조된 비드 결합된 DNA 바코드 내의 상응하는 상보적 어닐링 부위에 의해 매개된다.
어닐링된 스플린트 올리고는 DNA 폴리머라제를 사용하여 부분적으로 제조된 DNA 바코드를 연장시키기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 스플린트 올리고는 부분적으로 제조된 비드 결합된 DNA 바코드로 중합될 DNA 바코드 모듈에 대해 상보적인 염기를 함유한다. 스플린트 올리고는 또한 부분적으로 제조된 비드 결합된 DNA 바코드로 중합될 어닐링 부위에 대해 상보적인 염기를 함유한다.
복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 화합물의 각각의 하나는 1개 이상의 화학적 라이브러리 단량체를 포함하고, 각각의 비드 결합된 DNA 바코드 모듈은 상응하는 화학적 라이브러리 단량체를 확인하고, 용어 "화합물"은 1개 이상의 화학적 라이브러리 구성원을 포함하는 완성된 생성물을 지칭하는 것으로 사용된다. 완성된 DNA 바코드는 화합물을 확인한다.
시스템은 비드 결합된 DNA 바코드에 포함되는 1개 이상의 DNA 바코드 모듈의 서열분석을 가이드할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열분석 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 임의로 시스템은 DNA 서열분석 기계를 포함하고, 여기서 DNA 서열분석 기계는 발광 기반 서열분석기가 아니고 pH 기반 DNA 서열분석 기계가 아니다.
시스템은 복수의 구형 캡을 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 캡은 원형인 피코웰의 개구에 피팅될 수 있고, 각각의 캡은 피코웰의 내부에 있는 유체의 증발을 최소화하거나 방지할 수 있고, 각각의 캡은 피코웰의 내부에 있는 유체의 누출을 최소화하거나 방지할 수 있다.
적어도 1개의 피코웰에 배치된 적어도 1개의 비드는 상기 적어도 1개의 비드에 커플링된 적어도 1개의 반응 포획 요소를 포함한다.
피코웰에 배치된 비드 중 적어도 1개는 상기 적어도 1개의 비드에 커플링된 적어도 1개의 반응 포획 요소를 포함한다. 적어도 1개의 반응 포획 요소는 폴리 (dT), 엑손 표적화 RNA 프로브, 항체 또는 압타머를 포함한다.
DNA 바코드는 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드이다. DNA 바코드는 1개 이상의 DNA 바코드 모듈을 포함한다. 1개 이상의 DNA 바코드 모듈 각각은 화학적 라이브러리 단량체를 확인하는 정보를 코딩한다. 연쇄된 DNA 바코드 또는 직교 DNA 바코드는 1개 이상의 기능적 핵산 및 화학적 라이브러리 단량체의 정체 이외의 다른 유형의 정보를 코딩하는 1개 이상의 핵산 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함한다.
비드 결합된 연쇄된 DNA 바코드는 제1 DNA 바코드 모듈, 또는 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위 및 제2 DNA 바코드 모듈, 또는 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위 및 제3 DNA 바코드 모듈, 또는 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위 및 제4 DNA 바코드 모듈, 또는 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위, 제4 DNA 바코드 모듈, 제4 어닐링 부위 및 제5 DNA 바코드 모듈, 또는 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위, 제4 DNA 바코드 모듈, 제4 어닐링 부위, 제5 DNA 바코드 모듈, 제5 어닐링 부위 및 제6 DNA 바코드 모듈을 포함한다.
비드는 직교 DNA 바코드인 DNA 바코드를 포함하고, 비드는 외부 표면을 포함한다. 직교 DNA 바코드는 제1 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제1 핵산 (제1 핵산은 제1 위치에서 비드에 커플링됨), 제2 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제2 핵산 (제2 핵산은 제2 위치에서 비드에 커플링됨) 및 제3 DNA 바코드 모듈 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함하는 제3 핵산 (제2 핵산은 제3 위치에서 비드에 커플링됨)을 포함하고, 비드 상의 제1, 제2 및 제3 위치는 각각 비드의 외부 표면 상의 상이한 위치에 위치한다.
연쇄된 DNA 바코드는 클릭 화학 및 스플린트 올리고를 사용하는 단계의 반복 주기 둘 다, 클릭 화학 및 클릭 화학 방법이 아닌 화학적 방법 둘 다, 클릭 화학만, 또는 스플린트 올리고를 사용하는 단계의 반복 주기만을 사용하는 방법에 의해 제조된다.
복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 화합물 각각은 절단가능한 링커에 의해, 또는 광 절단가능한 링커인 절단가능한 링커에 의해, 또는 비 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된다.
적어도 1개의 비드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 그라프트된 저 가교 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그라프트된 공중합체를 포함한다.
적어도 1개의 피코웰은 적어도 1개의 세포를 포함한다.
복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 적어도 1개의 비드에 결합되고, 절단가능한 링커의 절단은 비드로부터 비드 결합된 화합물을 방출시켜 방출된 화합물을 생성한다.
방출된 화합물은 적어도 1개의 세포와 접촉할 수 있다. 적어도 1개의 세포는 암 세포가 아닌 포유동물 세포, 포유동물 암 세포, 사멸 포유동물 세포, 아폽토시스성 포유동물 세포, 괴사성 포유동물 세포, 박테리아 세포, 플라스모디움 세포, 대사 활성이지만 가교된 게놈을 갖고 세포 분열을 겪을 수 없는 세포, 또는 바이러스로 감염된 포유동물 세포이다.
각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖고, 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고, 개구는 둥글다. 바닥은 둥글다. 벽은 원추대의 형태를 취한다. 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖는다. 제1 직경은 제2 직경보다 더 크다.
각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖는다. 상단 개구는 바닥으로부터 분리되고, 벽이 상단 개구와 바닥 사이에 존재하고, 개구는 둥글다. 바닥은 둥글다. 벽은 원추대의 형태를 취한다. 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖는다. 제1 직경은 제2 직경보다 더 크다.
캡은 개구에 꼭 맞게 피팅된다. 개구는 보다 큰 듀로미터를 갖는 (보다 경질인) 중합체에 의해 구성된다. 캡은 보다 작은 듀로미터를 갖는 (보다 연질인) 중합체로 제조된다. 캡 및 개구의 상대 듀로미터는 캡이 개구에 가역적으로 및 꼭 맞게 피팅되도록 한다.
캡은 단지 피코웰을 막고 누출을 방지하는 것으로 의도된 캡, 수동 캡이고, 세포 배지 중 세포가 피코웰에서 배양되는 상황에서 세포에 의해 방출되는 대사물을 흡수할 수 있는 캡, 활성 캡이고, 복수의 본질적으로 동일한 화합물을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 각각의 복수의 본질적으로 동일한 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 캡, 활성 캡이고, 복수의 동일한 시약을 포함하는 비드의 형태를 취하며, 각각의 복수의 본질적으로 동일한 시약은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된 것인 캡이다.
시스템은 적어도 1개의 구형 캡을 포함할 수 있다.
시스템은 적어도 1개의 비-구형 캡을 포함할 수 있다.
DNA 바코드는 임의의 화학적 단량체를 코딩하지 않지만, 대신 비드에 절단가능하게 부착된 화학적 화합물의 부류, 유기 합성의 다단계 경로에서의 단계 중 1개 이상을 확인하는 1개 이상의 핵산을 포함하고, 비드 결합된 핵산은 비드 결합된 화합물을 제조하는 데 사용되는 주어진 화학적 단량체에 상응한다. 주어진 화학적 단량체에 상응하는 비드 결합된 핵산은 화학적 단량체, 비드 결합된 화합물이 합성된 날짜, 비드 결합된 화합물이 치료하고자 의도하는 질환, 비드 결합된 화합물이 자극 또는 억제하고자 의도하는 세포 사건, 또는 주어진 화학적 라이브러리 단량체를 비드에 커플링시키는 데 사용된 반응 조건을 확인한다.
임의의 비드 결합된 화합물을 임의의 비드 결합된 DNA 바코드에 연결하는 임의의 헤드피스는 존재하지 않는다.
연쇄된 DNA 바코드는 DNA 바코드 모듈인 적어도 1개의 핵산, 및 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 사용될 수 있거나 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 1개의 기능적 핵산을 포함한다. 헤어핀 구조는 서열분석 프라이머, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위 및 헤어핀 구조 내의 굴곡부를 포함하며, 굴곡부는 서열분석 프라이머의 5 프라임이고, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위의 3 프라임이거나, 또는 스페이서 핵산이다.
직교 DNA 바코드는 복수의 DNA 바코드 모듈을 함유하며, DNA 바코드 모듈 각각은 직접 또는 링커를 통해 비드 상의 상이한 부위에 커플링되고, 복수의 DNA 바코드 모듈 각각은 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 사용될 수 있거나 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 1개의 기능적 핵산을 함유한다. 헤어핀 구조는 서열분석 프라이머, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위 및 헤어핀 구조 내의 굴곡부를 포함하며, 굴곡부는 서열분석 프라이머의 5 프라임이고, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위의 3 프라임이거나, 또는 스페이서 핵산이다.
피코웰에 존재하는 용액 중 화합물의 농도를 제어하는 방법. 방법은 피코웰 내의 비드 결합된 화합물에 적용된다. 피코웰은 용액을 함유한다. 비드 결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된다. 방법은 비드 결합된 화합물을 절단가능한 링커의 절단을 수행하는 조건에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 조건은 절단가능한 링커를 절단할 수 있는 광을 포함한다.
방법은 비드로부터 비드 결합된 화합물이 방출되도록 하여 방출된 화합물을 생성하고, 방출 후 용액 중 방출된 화합물의 확산 또는 분산이 이어져 용액 중 화합물의 실질적으로 균일한 농도를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 실질적으로 균일한 농도의 결정된 농도를 생성하도록 조건을 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 결정된 농도는 비드 결합된 방출 모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도와 관련하여 이루어진다.
조건은 광의 파장, 광의 강도 및 광 노출의 지속기간 중 1개 이상을 조정함으로써 조정되고, 임의로: 비드 결합된 방출 모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도는 비드로부터 비드 결합된 화합물의 방출을 수행하여 방출된 화합물을 생성하는 것과 동시에 결정되거나, 또는 비드 결합된 방출 모니터로부터 방출되는 방출된 형광단의 농도는 비드로부터 비드 결합된 화합물의 방출을 수행하여 방출된 화합물을 생성하기 상당히 전 시간에 결정된다.
캡은 복수의 피코웰을 포함하는 피코웰 플레이트와 조합된다. 캡은 상기 피코웰 플레이트와 함께 사용될 수 있다.
복수의 피코웰 각각은 개구, 바닥 및 벽에 의해 형성가능하다. 벽은 상단의 개구 및 하단의 바닥에 의해 형성된다. 개구는 원형이다. 바닥은 둥글다. 벽은 원추대의 표면의 형태를 취하고, 개구는 제1 직경을 갖고, 바닥은 제2 직경을 갖는다. 제1 직경은 제2 직경보다 더 크다. 캡은 개구에 꼭 맞게 피팅될 수 있는 구형 캡이다. 개구는 보다 큰 듀로미터를 갖는 (보다 경질인) 중합체에 의해 구성된다. 캡은 보다 작은 듀로미터를 갖는 (보다 연질인) 중합체로 제조된다. 캡 및 개구의 상대 듀로미터는 구형 캡이 개구에 가역적으로 및 꼭 맞게 피팅되도록 한다. 캡은 피코웰을 막고 누출을 방지할 수 있는 것, 세포 배지 중 세포가 피코웰에서 배양되는 상황에서 세포에 의해 방출되는 대사물을 흡수할 수 있는 수동 캡, 복수의 본질적으로 동일한 화합물을 포함하는 비드의 형태를 취하고, 각각의 복수의 본질적으로 동일한 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링되고, 복수의 피코웰 중 적어도 1개는 수성 배지를 함유하고, 절단가능한 링커의 절단은 복수의 본질적으로 동일한 화합물의 적어도 일부를 비드로부터 수성 배지 내로 방출시키는 것인 활성 캡이다.
시스템은 복수의 피코웰인 상부의 일반적으로 평면인 표면을 포함하는 피코웰 어레이 플레이트를 포함하고, 각각의 피코웰은 피코웰의 상단에 개구부를 형성하는 상단 개구, 바닥에 의해 형성되는 하단을 갖는다. 상단 개구는 바닥으로부터 벽에 의해 분리된다. 벽은 상단 개구와 바닥, 및 임의로 상기 복수의 피코웰 중 적어도 1개에 배치된 비드 사이에 존재한다. 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 DNA 바코드 및 복수의 실질적으로 동일한 비드 결합된 화합물을 포함하고, 피코웰 어레이 플레이트는 복수의 피코웰 중 적어도 1개 또는 모두의 상단에 있는 개구부를 단단히 덮을 수 있거나 또는 복수의 피코웰 중 적어도 1개 또는 모두의 상단에 있는 개구부를 실제로 단단히 덮고 있는 매트를 추가로 포함한다. 단단히 덮는 것은 가역적이다. 매트는 임의로 피코웰 어레이 플레이트의 상부의 일반적으로 평면인 표면과 접촉하여 위치할 때 복수의 피코웰 중 1개 이상에 포함될 수 있는 임의의 대사물, 생화학물질 또는 단백질을 흡수할 수 있는 흡수 표면, 피코웰 어레이 플레이트의 상단의 일반적으로 평면인 표면에 대한 가역적인 접착을 유지할 수 있는 접착 표면 중 1개 또는 모두를 포함한다.
복수의 비드를 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 비드는 실질적으로 서로 관련된 비드에 부착된 복수의 화합물 및 복수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인, 검정으로부터의 신호 및 비드 상의 서열분석 판독물을 결정하여 검정으로부터 1개 이상의 관심 화합물을 확인하는 방법. 각각의 비드에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드는 동일한 비드에 부착된 복수의 화합물을 확인하며, 비드에 부착된 복수의 화합물을 수반하는 검정을 수행하고, 단계 b의 검정에서 화합물의 성능을 반영하는 적어도 1개의 신호를 결정하고, 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 제거하지 않으면서 비드에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드를 서열분석하여, 각각의 비드에 대한 서열분석 판독물을 결정하고, 단계 d의 서열분석 판독물에 의해 비드에 부착된 화합물을 확인하고, 이를 단계 c의 결정된 신호에 함유된 검정 성능에 관련시키고, 비드는 검정으로부터의 신호를 갖고, 서열분석 판독물은 관심 화합물을 확인한다.
복수의 비드를 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 비드는 비드 표면에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 및 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물을 포함하는 것인, 목적하는 특성을 갖는 화합물에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 방법. 비드에 부착된 올리고뉴클레오티드의 서열은 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물의 정체를 코딩하며, 복수의 비드를 화합물 라이브러리 내의 화합물의 목적하는 특성에 대한 검정에 혼입시키고, 적어도 1개의 비드로부터 신호를 포획한다. 신호는 검정에서 비드에 대한 화합물의 성능을 반영하며, 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 제거하지 않으면서, 검정 신호가 또한 포획된 적어도 1개의 비드에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드를 서열분석하고, 단계 (d)의 서열분석 판독물로부터 적어도 1개의 화합물을 확인하고, 이를 단계 (c)의 신호에서 포획된 그의 상응하는 검정 성능에 관련시킨다.
각각의 비드는 상이한 복수의 올리고뉴클레오티드 및 상이한 복수의 실질적으로 관련된 화합물을 포함한다.
복수의 올리고뉴클레오티드는 복수의 DNA 올리고뉴클레오티드이다.
복수의 화합물은 다수의 화합물 빌딩 블록을 탠덤으로 연결함으로써 비드 표면에 부착되며, 모든 화합물 빌딩 블록은 함께 화합물을 구성한다.
각각의 DNA 모듈 및 각각의 화합물 빌딩 블록은 순차적으로 및 교대로 조립된다.
복수의 동일한 화합물 내의 각각의 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드 표면에 부착된다.
절단가능한 링커는 광절단가능한 링커, 프로테아제 절단가능한 링커 또는 산 절단가능한 링커이다.
화합물은 단계 ( a ) 후 및 단계 ( d ) 전에 비드 표면으로부터 절단된다.
화합물의 목적하는 특성을 반영하는 신호는 형광 신호이다.
각각의 비드의 크기는 1 μm 내지 100 μm이다.
각각의 비드의 크기는 1 μm 내지 10 μm이다.
각각의 비드의 크기는 약 3 μm이다.
방법은 복수의 잠재적 표적에서 표적 후보를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 목적하는 특성을 갖는 화합물은 표적 후보에 결합한다.
단계 (b)는 복수의 잠재적 표적에서 복수의 비드를 인큐베이션하는 것을 포함한다.
잠재적 표적은 단백질 또는 핵산이다.
서열분석은 단일-분자 실시간 서열분석, 이온 반도체 서열분석, 파이로시퀀싱, 합성에 의한 서열분석, 가교 증폭에 의한 서열분석, 라이게이션에 의한 서열분석, 나노포어 서열분석, 쇄 종결 서열분석, 대규모 병행 시그너쳐 서열분석, 폴로니 서열분석, 헬리스코프 단일 분자 서열분석, 샷건 서열분석, SOLiD 서열분석, 일루미나 서열분석, 터널링 전류 DNA 서열분석, 혼성화에 의한 서열분석, 질량 분광측정법을 사용한 서열분석, 마이크로유체 생어 서열분석 및 올리고뉴클레오티드 연장 서열분석에 의해 수행된다.
복수의 비드를 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 비드는 비드 표면에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드 및 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물을 포함하는 것인, 목적하는 특성을 갖는 화합물에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하는 방법. 비드에 부착된 올리고뉴클레오티드의 서열은 비드 표면에 부착된 복수의 실질적으로 관련된 화합물의 합성 이력을 코딩하며, 복수의 비드를 화합물 라이브러리 내의 화합물의 목적하는 특성에 대한 검정에 혼입시키고, 적어도 1개의 비드로부터 신호를 포획한다. 신호는 검정에서 비드에 대한 화합물의 성능을 반영하며, 비드로부터 올리고뉴클레오티드를 제거하지 않으면서, 검정 신호가 또한 포획된 적어도 1개의 비드에 부착된 복수의 올리고뉴클레오티드를 서열분석하고, 단계 (d)의 서열분석 판독물로부터 적어도 1개의 화합물을 확인하고, 이를 단계 (c)의 신호에서 포획된 그의 상응하는 검정 성능에 관련시킨다.
검정은 결합 검정을 포함한다.
검정은 활성 검정을 포함한다.
검정은 경쟁적 결합 검정 또는 경쟁적 억제 검정을 포함한다.
검정은 비테더링된 화합물과 다른 검정 시약의 상호작용을 포함한다. 비테더링된 화합물은 비드 표면으로부터 방출된 화합물이다.
화합물은 화합물을 비드에 연결하는 절단가능한 링커를 절단함으로써 방출된다.
검정은 복수의 국한된 부피에서 수행되며, 국한된 부피당 명목상 1개의 비드가 분산된다.
국한된 부피는 수성 액적을 포함한다.
수성 액적은 오일 배지 또는 소수성 액체 배지 중에 현탁된다.
국한된 부피는 피코웰을 포함한다.
피코웰은 규칙적 어레이로 조직화된다.
복수의 국한된 부피는 규칙적 어레이로 조직화된다.
국한된 부피는 비드 주위에 부착성 수성 배지의 층을 포함한다. 비드는 소수성 배지 중에 현탁된다.
검정 시약은 올리고뉴클레오티드를 서열분석하기 전에 세척된다.
서열분석 단계 (d)는 검정 단계 ( b ) 전에 수행된다.
비드 상의 올리고뉴클레오티드는 서열분석 단계 후에, 그러나 검정 단계 전에 제거된다.
올리고뉴클레오티드의 제거는 효소적 소화, 화학적 절단, 열 분해 또는 물리적 전단을 포함한다.
결합 검정은 비드에 대한 RNA 분자의 결합을 포함한다.
비드로부터의 신호는 결합된 RNA 분자의 서열분석을 포함한다.
결합 검정은 형광 표지된 결합 검정을 포함한다. 비드 상의 화합물에 결합하는 분자는 형광단을 포함한다.
결합 검정은 핵산 표지된 결합 검정을 포함한다. 비드 상의 화합물에 결합하는 분자는 핵산 태그를 포함하며, 추가로 검정으로부터의 신호는 비드 상의 화합물에 결합하는 분자에 부착된 핵산 태그의 서열분석을 포함한다.
목적하는 특성은 효소의 촉매 활성을 억제 또는 자극하는 것, 세포 기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th1 유형 면역 반응을 자극하는 것, 세포 기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th2 유형 면역 반응을 자극하는 것, 세포 기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th1 유형 면역 반응을 억제하는 것, 세포 기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 Th2 유형 면역 반응을 억제하는 것, 정제된 단백질, 세포 기반 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정가능한 바와 같은 단백질의 유비퀴틴 매개 분해를 자극 또는 억제하는 것 중 1개 이상을 포함한다.
복수의 화합물-부착된, 올리고뉴클레오티드-코딩된 비드를 수용하기 위한 샘플 구획, 샘플 구획 내의 복수의 캡슐화 구획이며, 각각의 캡슐화 구획은 명목상 검정 배지 중에 분산된 단일 비드를 포함하고, 추가로 검정 배지는 비드 상의 화합물과의 상호작용이 검정되어 측정가능한 신호를 생성하는 시약을 포함하는 것인 복수의 캡슐화 구획, 신호 측정을 위한 검출기, 서열분석 플랫폼, 및 사용자로부터의 1개 이상의 명령을 수용하기 위한 사용자 인터페이스를 포함하는, 목적하는 활성을 갖는 화합물에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 시스템.
캡슐화 구획은 액체 액적을 포함한다.
캡슐화 구획은 피코웰을 포함한다.
캡슐화 구획은 검정 시약을 포함한다.
검출기는 광학 검출기를 포함한다.
서열분석기는 광학 검출기를 포함한다.
핵산 코딩된 교란을 제공하고, 세포를 핵산 코딩된 교란과 함께 국한시키고, 세포를 국한된 부피에서 핵산 코딩된 교란과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 교란시키는 방법. 교란 개시 및 용량은 제어되며, 세포를 명시된 기간 동안 핵산 코딩된 교란과 함께 인큐베이션하고, 핵산 코딩된 교란을 코딩하는 핵산을 세포로 전달한다.
핵산 코딩된 교란은 핵산 코딩된 화합물 또는 약물 분자이다.
핵산 코딩된 교란은 DNA-코딩된 라이브러리이다.
교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 부착되지 않고 용액 중에 유리된다.
교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 서로 부착된다.
교란 및 교란을 코딩하는 핵산은 동일한 기질에 부착되지만 서로에는 부착되지 않는다.
기질에의 교란의 부착 및 기질에의 핵산의 부착은 절단가능한 부착이다.
절단가능한 부착은 광절단가능한 부착, 온도 절단가능한 부착, pH 감수성 부착, 산 절단가능한 부착, 염기 절단가능한 부착, 소리 절단가능한 부착, 염 절단가능한 부착, 산화환원 감수성 부착 또는 물리적으로 절단가능한 부착으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
세포 및 교란을 국한시키는 것은 액적 캡슐화, 에멀젼 캡슐화, 피코웰 캡슐화, 마크로웰 캡슐화, 물리적 부착, 버블 캡슐화 또는 미세유체 국한을 포함한다.
교란에 대한 제어는 광 노출의 제어, 온도 노출의 제어, pH 노출의 제어, 시간 노출의 제어, 소리 노출의 제어, 염 노출의 제어, 화학적 또는 물리적 산화환원 전위의 제어 또는 기계적-교반 노출의 제어를 포함한다.
인큐베이션은 기질로부터 교란을 절단한 후에 또는 기질로부터 핵산을 절단한 후에 세포를 교란에 노출시키는 것을 포함한다.
인큐베이션은 기질로부터 교란을 절단하지 않거나 또는 교란으로부터 핵산을 절단하지 않으면서 세포를 교란에 노출시키는 것을 포함한다.
핵산 코딩된 교란을 코딩하는 핵산을 세포로 전달하는 것은 핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것을 포함한다.
핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산을 세포 막 내로 삽입하는 것을 포함한다.
핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산을 세포 표면 상의 생체분자에 부착시키는 것을 포함한다.
생체분자는 단백질 또는 탄수화물이다.
핵산을 세포의 세포 표면에 부착시키는 것은 핵산 상의 임의적인 태그를 통해 부착시키는 것을 포함한다.
비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리를 제공하고, 세포를 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리와 함께 국한시키는 것을 포함하는, 세포를 교란으로 교란시키고 세포를 교란의 정체로 코딩하는 방법. 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리는 조합으로 합성된 화합물의 1개 이상의 카피 및 코딩 핵산 태그의 1개 이상의 카피를 포함한다. 화합물 및 코딩 핵산은 비드에 부착된다. 코딩 핵산은 화합물의 정체를 코딩한다. 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리 및 세포는 국한 부피에서 국한되며, 비드로부터 화합물을 방출시키고, 화합물을 국한 부피 내부에서 세포와 함께 인큐베이션하고, 임의로 비드로부터 코딩 핵산 태그를 방출시키고, 코딩 핵산 태그를 세포에 부착시켜, 세포에 부착된 코딩 핵산 태그를 통해 화합물의 정체를 보존한다.
세포를 제1 국한된 부피에서 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 교란시키고, 세포를 교란의 정체로 코딩하고, 교란에 대한 세포의 반응을 측정하는 방법. 비드-결합된 DNA 코딩된 라이브러리는 조합으로 합성된 화합물의 1개 이상의 카피 및 코딩 핵산 태그의 1개 이상의 카피를 포함한다. 화합물 및 코딩 핵산은 비드에 부착된다. 코딩 핵산은 화합물의 정체를 코딩하며, 라이브러리 내의 화합물을 비드로부터 방출시키고, 라이브러리 내의 화합물을 제1 국한된 부피 내부에서 세포와 함께 인큐베이션하고, 임의로 코딩 핵산 태그를 제1 국한된 부피 내부에서 비드로부터 방출시키고, 코딩 핵산 태그를 세포의 세포 표면에 포획시켜, 세포가 라이브러리 내의 화합물에 노출되고, 노출된 화합물의 정체가 세포 표면 상에 포획되고, 세포를 제1 국한 부피로부터 방출시킨다. 코딩 핵산 태그는 세포에 부착되고, 코딩 핵산 태그는 세포가 노출되는 화합물의 정체를 코딩하며, 이전에 교란된 핵산 태그부착된 세포를 제2 국한된 부피에서 반응-검출 비드로 포획한다. 세포는 세포의 세포 내용물을 반응-포획 비드에 노출시키는 용해 조건에 노출된다. 반응-포획 비드는 세포 내용물을 포획하는 포획 프로브 및 이전에 교란된 핵산 태그부착된 세포에서 교란을 코딩하는 핵산 태그를 포함하며, 반응-포획 비드를 제2 국한 부피에서 용해된 세포와 함께 인큐베이션하여, 세포 내용물 및 교란을 코딩하는 핵산 태그 둘 다를 반응-포획 비드 상에 포획하고, 임의로 교란에 대한 세포의 반응을 핵산 신호로 전환시킨다. 교란에 대한 세포의 반응은 핵산 신호가 아니며, 반응-포획 비드에 부착된 핵산 태그를 서열분석하여 교란의 정체를 교란에 대한 세포의 반응과 상관시킨다.
피코웰의 어레이 및 관능화된 교란 비드의 라이브러리를 제공하는 것을 포함하는, 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하는 방법. 피코웰은 단일 세포 및 단일 관능화된 교란 비드를 수용할 수 있으며, 각각의 관능화된 교란 비드는 상이한 복수의 실질적으로 동일한 방출가능한 화합물 및 화합물을 코딩하는 복수의 뉴클레오티드 바코드를 포함한다. 뉴클레오티드 바코드는 세포의 세포 내용물을 포획할 수 있는 관능화된 바코드이다. 세포의 세포 내용물은 관능화된 교란 비드에 함유된 교란에 대한 세포 반응을 포함하며, 단일 세포를 피코웰 어레이의 각각의 피코웰에 포획하고, 단일 관능화된 교란 비드를 단일 세포를 함유하는 피코웰에 포획하고, 관능화된 교란 비드로부터 화합물을 방출시키고, 세포를 방출된 화합물과 함께 인큐베이션한다. 피코웰 사이의 화합물은 최소 확산을 가지며, 세포를 용해시켜 세포 내용물을 방출시키고, 세포 내용물의 1종 이상의 성분을 관능화된 교란 비드 상의 관능화된 올리고뉴클레오티드 상에 포획한다. 포획은 혼성화 및 효소적 연장을 포함하여 뉴클레오티드 바코드를 세포 내용물의 핵산 요소와 합함으로써, 뉴클레오티드 바코드와 세포 내용물의 핵산 요소의 하이브리드를 형성하며, 하이브리드를 방출시키고, 관능화된 교란 비드의 라이브러리로부터 하이브리드를 수집하고, 하이브리드를 서열분석함으로써, 교란을 교란에 대한 세포 반응과 관련시킨다.
화학적 화합물을 세포 또는 세포의 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있는 다수의 웰을 포함하는 검정 장치를 포함할 수 있다. 시스템은 단일 비드가 각각의 웰에 배치된 복수의 비드를 포함할 수 있다. 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함할 수 있다. 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능할 수 있도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결될 수 있다.
또한, 화학적 화합물을 세포 또는 세포의 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법과 함께, 시스템이 제공될 수 있다. 시스템은 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있을 수 있는 다수의 웰을 포함하는 검정 장치를 포함할 수 있다. 시스템은 복수의 비드를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 각각의 웰에의 배치에 적합할 수 있고, 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함할 수 있고, 상기 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능할 수 있도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결될 수 있다.
비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함할 수 있으며, DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결될 수 있는 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교할 수 있고, DNA 바코드는 화합물을 확인한다.
시스템은 단일 비드만이 단일 웰에 포함되는 것을 허용하는 전달 분배기를 사용하여 비드를 웰 내로 전달하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이들 장치는 다수의 공동을 가지며, 각각의 공동은 단일 개구부 직경을 가질 수 있고, 복수의 비드 중 단일 비드만을 보유하도록 구성될 수 있다. 검정 장치 및 전달 분배기는, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 구성될 수 있고, 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합될 때 전달 분배기의 공동은 장치의 웰과 정렬될 수 있다.
각각의 웰은 각각의 상기 공동의 개구부 직경보다 더 클 수 있는 개구부 직경을 가질 수 있어서, 각각의 공동이 각각의 웰 위에 위치할 때, 상기 공동 및 상기 웰을 포함하는 봉쇄 공간이 형성될 수 있다.
단일 비드는 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 방출되어 상기 웰 내로 침착될 수 있다.
비드는 비-자기 비드일 수 있다.
상기 갭은 존재할 때 장치 내에서 전달되는 비드의 크기 (예를 들어, 직경)보다 더 작을 수 있는 크기 (예를 들어, 직경)를 가질 수 있다. 이는 갭을 통한 비드의 이동을 방지한다.
상기 방법과 함께, 장치가 제공될 수 있다. 장치는 적어도 1개의 프로세서, 및 적어도 1개의 프로세서에 의한 실행을 위한 적어도 1개의 프로그램을 저장하는 메모리를 가질 수 있으며, 적어도 1개의 프로그램은, 적어도 1개의 프로세서에 의해 실행될 때, 적어도 1개의 프로세서로 하여금 작동을 수행하게 하는 명령을 포함한다.
작동은 검정 장치 및 전달 분배기가, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
작동은 전달 분배기의 공동을 장치의 웰과 정렬하는 것을 포함할 수 있다.
작동은 봉쇄 공간을 형성하기 위해 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합되도록 하는 것을 포함할 수 있다.
작동은 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 단일 비드를 방출시키는 것을 포함할 수 있다.
추가로, 화학적 화합물을 세포 또는 세포의 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 적어도 1개의 프로그램을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체가 제공된다. 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체와 함께, 시스템이 제공될 수 있다. 시스템은 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있을 수 있는 다수의 웰을 포함하는 검정 장치를 포함할 수 있다. 시스템은 복수의 비드를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 각각의 웰에의 배치에 적합할 수 있고, 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함할 수 있고, 상기 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능할 수 있도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결될 수 있다.
상기 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함할 수 있으며, DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결될 수 있는 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교할 수 있고, DNA 바코드는 화합물을 확인한다.
비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체와 함께, 시스템은 다수의 공동을 갖는 전달 분배기를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 공동은 단일 개구부 직경을 가질 수 있고, 복수의 비드 중 단일 비드만을 보유하도록 구성될 수 있다. 검정 장치 및 전달 분배기는, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 구성될 수 있고, 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합될 때 전달 분배기의 공동은 장치의 웰과 정렬될 수 있다.
각각의 웰은 각각의 상기 공동의 개구부 직경보다 더 클 수 있는 개구부 직경을 가질 수 있어서, 각각의 공동이 각각의 웰 위에 위치할 때, 상기 공동 및 상기 웰을 포함하는 봉쇄 공간이 형성될 수 있다.
단일 비드는 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 방출되어 상기 웰 내로 침착될 수 있다.
비드는 비-자기 비드일 수 있다.
상기 갭은 존재할 때 장치 내에서 전달되는 비드의 크기 (예를 들어, 직경)보다 더 작을 수 있는 크기 (예를 들어, 직경)를 가질 수 있다.
적어도 1개의 프로그램은 적어도 1개의 프로세서에 의한 실행을 위한 것일 수 있고, 적어도 1개의 프로그램을 저장하는 메모리 상기 적어도 1개의 프로그램은 상기 적어도 1개의 프로세서에 의해 실행될 때 상기 적어도 1개의 프로세서로 하여금 동작을 수행하게 하는 명령을 포함한다. 작동은 검정 장치 및 전달 분배기가, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 작동은 장치의 웰과 전달 분배기의 공동을 정렬하는 것을 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 작동은 봉쇄 공간을 형성하기 위해 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합되도록 하는 것을 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 작동은 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 단일 비드를 방출시키는 것을 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 작동은 단일 비드를 상기 웰 내로 침착시키는 것을 이동시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함할 수 있다. DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결되면, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교할 수 있고, DNA 바코드는 화합물을 확인할 수 있다.
시스템은 다수의 공동을 갖는 전달 분배기를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 공동은 단일 개구부 직경을 갖고, 복수의 비드 중 단일 비드만을 보유하도록 구성된다. 검정 장치 및 전달 분배기는, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 구성될 수 있다. 전달 분배기의 공동은 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합될 때 장치의 웰과 정렬될 수 있다.
각각의 웰은 각각의 상기 공동의 개구부 직경보다 더 큰 개구부 직경을 가질 수 있다. 각각의 공동이 각각의 웰 위에 위치할 때, 상기 공동 및 상기 웰을 포함하는 봉쇄 공간이 형성될 수 있다.
단일 비드는 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 방출되어 상기 웰 내로 침착될 수 있다.
비드는 비-자기 비드일 수 있다.
갭은 존재할 때 장치 내에서 전달되는 비드의 크기 (예를 들어, 직경)보다 더 작을 수 있는 크기 (예를 들어, 직경)를 가질 수 있다.
각각의 상기 언급된 시스템, 방법 및 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 하기 열거된 각각의 특색 중 1개 이상을 임의의 적합한 조합으로 포함할 수 있다.
비드-결합된 화합물이 비드로부터 방출될 때, 비드-결합된 DNA 바코드는 비드로부터 방출되지 않을 수 있다.
각각의 국한된 부피는 단일 비드를 포함할 수 있다.
국한된 부피는 피코웰 또는 액적일 수 있다.
절단가능한 공유 링커는 광, 온도 변화, pH 변화, 소리, 염 또는 산화의 변화에 의해 절단될 수 있다.
절단가능한 링커는 광에 의해 절단될 수 있다.
광은 자외선일 수 있다.
세포의 성분은 지질, 단백질, 탄수화물 또는 핵산일 수 있다.
세포의 성분은 핵산일 수 있다.
핵산은 mRNA일 수 있다.
세포의 성분은 시토카인, 항원 또는 효소일 수 있다.
시험을 위한 측정가능한 용량 의존성 방식으로 비드로부터 방출된 화합물의 양은 비드에 결합되고 시험될 화합물과 별개인 신호 생성 화합물로부터 생성된 신호의 변화에 의해 측정될 수 있고, 신호 생성 화합물은 비드 상에 신호를 생성하지 않거나 감쇠된 신호를 생성하고, 일단 비드로부터 방출되면 증가된 신호를 생성할 수 있고, 신호의 증가는 비드로부터 방출된 시험될 화합물의 양과 상관관계가 있고, 비드로부터 방출된 화합물 및 비드로부터 방출된 신호 생성 화합물은 동일한 조건 하에 방출될 수 있다.
화합물 및 신호 생성 화합물은 동일한 비드에 결합될 수 있다.
신호 생성 화합물은 형광 화합물일 수 있고, 이의 형광은 둘 다 비드에 결합될 수 있는 경우에 켄처에 의해 켄칭될 수 있다.
적어도 하나의 국한된 부피는 또 다른 국한된 부피에서 비드 상의 비드-결합된 DNA 바코드 및 비드-결합된 화합물과 상이할 수 있는 비드-결합된 DNA 바코드 및 비드-결합된 화합물을 갖는 비드를 포함할 수 있다.
DNA 바코드는 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결될 수 있고, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 절단가능한 링커와 상이할 수 있다.
DNA 바코드는 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결될 수 있다.
DNA 바코드는 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결될 수 있고, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 절단가능한 링커와 상이한 메카니즘에 의해 절단될 수 있다.
전달 분배기는 전달 분배기 및 검정 장치가 적절한 정렬로 잠기도록 하는 잠금 메카니즘을 추가로 포함할 수 있다.
각각의 공동의 직경은 비드를 수용하도록 가역적으로 확장가능할 수 있다.
각각의 공동의 직경은 비드를 수용하기 위한 천연 또는 팽창 형태의 비드의 직경의 적어도 100.1%일 수 있다.
각각의 공동의 깊이는 비드의 크기 (예를 들어, 직경)의 적어도 50% 내지 비드의 크기 (예를 들어, 직경)의 약 125%일 수 있다.
전달 분배기는 검정 장치 아래의 전달 분배기의 다수의 공동으로의 비드의 전달을 위해 봉쇄 캡과 통합되도록 구성될 수 있다.
단일 비드는 크기 배제 비드일 수 있어, 상기 비드의 크기 (예를 들어, 직경)는 2개의 비드가 단일 공동에 피팅되도록 하는 크기 (예를 들어, 직경)를 갖는 비드는 배제한다.
비드는 약 0.5 내지 약 100 마이크로미터의 크기 (예를 들어, 직경)를 가질 수 있다.
전달 분배기는 그 위에 상기 검정 장치가 피팅될 수 있도록 구성될 수 있고, 상기 전달 분배기는, 상기 전달 분배기가 주어진 공동에 단지 단일 비드를 함유한다면, 전달 분배기 내의 각각의 공동이 검정 장치 내의 단일 웰에 정렬될 수 있도록 뒤집어진 위치로 검정 장치 아래에 위치하고 그에 정렬될 수 있다.
전달 분배기는 그 위에 상기 검정 장치가 피팅될 수 있도록 구성될 수 있고, 상기 검정 장치는 검정 장치 내의 각각의 웰이 상기 전달 분배기로부터 전달될 수 있는 단일 비드를 포함할 수 있도록 전달 분배기 아래에 위치하고 그에 정렬될 수 있고, 상기 전달은 검정 장치가 전달 분배기에 단일 피팅될 것을 요구한다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 공동의 개방 단부에 대향하는 하단 표면을 포함할 수 있고, 하단 표면은 하단 표면 내로 함요된 하위-공동을 포함할 수 있고, 하위-공동은 단일 비드를 보유하도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 개방 하단 표면 및 개방 상단 표면을 포함할 수 있고, 개방 하단 표면의 크기는 개방 상단 표면의 크기보다 더 작을 수 있고, 공동은 단일 비드가 개방 상단 표면과 개방 하단 표면 사이의 중간 지점에 놓이도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 복수의 공동 중 각각의 공동은 공동의 개방 단부에 대향하는 하단 표면을 포함할 수 있고, 하단 표면은 하단 표면 내에 또는 하단 표면 상에 자석을 포함할 수 있고, 자석은 단일 비드를 보유하도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 복수의 공동 중 각각의 공동은 내부 크기를 갖는 개구부를 포함할 수 있고, 개구부는 정지 구조로 차단될 수 있고, 정지 구조는 그 내에 하위-개구부를 갖는 고체 물질의 메쉬, 다공성 패브릭, 및 개구부의 내부 크기보다 더 작고 단일 비드의 최대 치수보다 더 큰 크기를 갖는 적어도 1개의 하위-개구부를 갖는 하위-구조로 이루어진 군 중 적어도 1개를 포함할 수 있다.
화학적 화합물을 세포 또는 세포의 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이 제공된다. 시스템은 다수의 웰을 포함하는 검정 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 웰은 다른 웰로부터 분리되고, 여기서 다수의 웰은 적어도 50,000개의 웰을 포함한다. 시스템은 복수의 비드를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 각각의 웰에의 배치에 적합하다. 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함할 수 있다. 상기 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능하도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결될 수 있다.
다른 실시양태에서, 시스템은 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있는 다수의 웰, 단일 비드가 단일 웰에의 배치에 적합한 것인 복수의 비드를 포함하는 검정 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 비드-결합된 화합물은 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결되어 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 비드로부터 방출가능하고, 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함하고, 여기서 DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결되는 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교하고, 여기서 DNA 바코드는 화합물을 확인하고; 여기서 각각의 비드는 적어도 약 10,000개의 실질적으로 동일한 DNA 바코드를 포함한다.
상기 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함할 수 있다. DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결되는 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교할 수 있다. DNA 바코드는 화합물을 확인할 수 있다.
시스템은 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 분배기를 추가로 포함할 수 있다.
전달 장치는 단일 비드를 전송할 수 있는 적어도 1개의 피펫을 추가로 포함할 수 있으며, 적어도 1개의 피펫은 가요성 팁을 포함한다. 피펫의 가요성 팁은 폴리이미드를 포함할 수 있다. 가요성 팁은 피펫의 총 길이의 20% 이하로 연장될 수 있다. 가요성 팁은 피펫의 총 길이의 10% 이하로 연장될 수 있다.
화학적 화합물을 세포 또는 세포의 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하는 방법이 제공된다. 방법은 상기 언급된 시스템으로 수행될 수 있다.
상기 방법은 검정 장치 및 전달 분배기가, 임의로 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하면서, 서로 피팅되거나 정합되도록 이동시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 전달 분배기의 공동을 장치의 웰과 정렬하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 봉쇄 공간을 형성하기 위해 검정 장치 및 전달 분배기가 서로 피팅되거나 정합되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 단일 비드를 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 단일 비드를 상기 웰 내로 침착시키는 것을 포함할 수 있다.
전달 장치는 로봇으로 또는 수동으로 또는 로봇 및 수동 공정의 조합으로 작동될 수 있다.
전달 장치는 자기 인력, 정전기 인력 또는 크기 및 중력에 기초한 공학 원리를 사용하여 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시킬 수 있다.
전달 분배기는 다수의 공동을 포함할 수 있다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 공동의 개방 단부에 대향하는 하단 표면을 포함할 수 있다. 하단 표면은 하단 표면 내로 함요된 하위-공동을 포함할 수 있다. 하위-공동은 단일 비드를 보유하도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 개방 하단 표면 및 개방 상단 표면을 포함할 수 있다. 개방 하단 표면의 크기는 개방 상단 표면의 크기보다 더 작을 수 있다. 공동은 단일 비드가 개방 상단 표면과 개방 하단 표면 사이의 중간 지점에 놓이도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 공동의 개방 단부에 대향하는 하단 표면을 포함할 수 있다. 하단 표면은 하단 표면 내에 또는 그 상에 자석을 포함할 수 있다. 자석은 단일 비드를 보유하도록 구성될 수 있다.
전달 분배기의 다수의 공동 중 각각의 공동은 내부 크기를 갖는 개구부를 포함할 수 있다. 개구부는 정지 구조로 차단될 수 있다. 정지 구조는 그 내에 하위-개구부를 갖는 고체 물질의 메쉬, 다공성 패브릭, 및 개구부의 내부 크기보다 더 작고 단일 비드의 최대 치수보다 더 큰 크기를 갖는 적어도 1개의 하위-개구부를 갖는 하위-구조로 이루어진 군 중 적어도 1개를 포함할 수 있다.
조합 라이브러리의 검정에 포함되는 화합물에 의해 유도된 세포 내의 트랜스크립톰 변화를 확인하는 방법. 방법은 상기 언급된 시스템으로 수행될 수 있다.
방법은 검정 어레이를 생성하는 것을 포함할 수 있다. 검정 어레이는 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있고 각각의 웰이 적어도 1개의 관심 세포를 포함하는 복수의 웰을 포함할 수 있고, 검정 어레이는 50,000개 초과의 웰을 포함한다. 검정 어레이는 복수의 비드를 포함할 수 있으며, 여기서 단일 비드로서 각각의 비드는 각각의 비드가 상기 조합 라이브러리로부터의 고유한 화합물을 포함하고 상기 라이브러리 내의 각각의 화합물이 잠재적 약물 후보로서 선택되도록 복수의 동일한 비드-결합된 화합물을 포함한다. 검정 어레이는 복수의 관능화된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 관능화된 올리고뉴클레오티드는 고유한 화합물의 구조 또는 상기 고유한 화합물을 제조하는 데 사용된 합성 단계를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 부분 및 RNA 포획 요소를 포함할 수 있다. 단일 비드는 단일 웰에 배치될 수 있다.
방법은 세포를 각각의 국한된 부피에서 비드로부터 그 국한된 부피 내로 방출되는 화합물과 접촉시키고, 상기 접촉에 반응하여 세포에 의해 발현되는 RNA에서의 트랜스크립톰 변화를 생성하기에 충분한 기간 동안 상기 접촉을 유지하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 세포를 용해시키고 RNA를 상기 비드 상의 RNA 포획 요소와 접촉시킴으로써 각각의 웰에서 세포로부터 RNA를 포획하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 복수의 비드의 적어도 한 부분으로부터 포획된 RNA를 확인하고, 상기 포획된 RNA에서의 임의의 트랜스크립톰 변화를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 상기 트랜스크립톰 변화를 생성한 화합물의 구조를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
비드는 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 장치를 사용하여 상기 검정 어레이의 웰에 첨가될 수 있다.
개시된 대상의 이들 및 다른 능력은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위의 검토 후에 보다 완전히 이해될 것이다.
이들 및 다른 특색은 첨부 도면과 함께 하기 상세한 설명으로부터 보다 용이하게 이해될 것이다.
도 1. 연쇄형 비드. 연쇄형 비드에서, DNA 바코드는 스페이서로서 프라이머 어닐링 부위와 같은 기능 또는 제조일에 대한 정보를 갖는 임의의 다른 핵산과 함께, 단일 쇄로 서로 연결된 모든 DNA 바코드 모듈의 형태를 취한다. 이 도면 상의 숫자는 구조 번호가 아니다. 숫자는 DNA 바코드 내의 "DNA 바코드 모듈"의 순서를 지칭한다.
도 2. 직교형 비드. 직교형 비드에서, DNA 바코드는 모든 DNA 바코드 모듈의 형태를 취하며, 여기서 DNA 바코드 모듈은 단일 쇄로 함께 발생하는 것이 아니라, 대신 비드 상의 상이한 위치에 별개로 연결된다. 이 도면 상의 숫자는 구조 번호가 아니다. 숫자는 DNA 바코드 내의 "DNA 바코드 모듈"의 순서를 지칭한다.
도 3. 절단가능한 링커, 절단 조건 (UV 광 또는 화학적 조건) 및 절단 생성물. 문헌 [Yinliang Yang (2014) Design of Cleavable Linkers and Applications in Chemical Proteomics. Technische Universitat Munchen Lehrstuhl fur Chemie der Biopolymere]으로부터의 정보. 각각의 링커의 좌측의 알파벳 문자는 이 참고문헌으로부터의 것이다.
도 4. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 위한 예시적인 아미노산 유도체.
도 5. 사진은 첨가되는 레날리도미드의 농도를 증가시킨 경우 HeLa 세포 내부에서의 융합 단백질의 분해의 증가를 개시한다. 상단: IKZF1/GFP 융합 단백질의 발현. 하단: mScarlett® 대조군의 발현. 레날리도미드를 0, 0.1, 1.0 또는 10 마이크로몰로 첨가하였다.
도 6. 사진은 첨가되는 레날리도미드의 농도를 증가시킨 경우 HeLa 세포 내부에서의 융합 단백질의 분해의 증가를 개시한다. 상단: IKZF3/GFP 융합 단백질의 발현. 하단: mScarlett 대조군의 발현. 레날리도미드를 0, 0.1, 1.0 또는 10 마이크로몰로 첨가하였다.
도 7. 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한 방법 및 시약. "DNA 바코드"의 가장 정확한 설명은 모든 DNA 바코드 모듈의 합에 함유된 모든 정보의 합이다. 그러나, 편의상, 용어 "DNA 바코드"는 모든 DNA 바코드 모듈의 모든 정보의 합 플러스 단계 번호 또는 비드-결합된 화합물을 구성하는 화학적 단량체의 일반적 유형과 같은 정보를 제공하는 임의의 추가의 핵산, 및 플러스 기능을 제공하는 임의의 추가의 핵산, 예컨대 링커, 서열분석 프라이머 결합 부위, 서열분석 프라이머 결합 부위를 갖는 헤어핀 또는 스페이서를 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. DNA 바코드가 적어도 부분적으로 클릭 화학에 의해 제조되는 경우에, DNA 바코드는 클릭 화학 반응으로부터의 잔류 화학적 기를 포함할 수 있다.
도 8. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 488의 구조. 이 도면의 목적은 상표명의 사용에 의지할 필요 없이 화합물을 확인하는 것이다.
도 9. 비드-결합된 방출-모니터의 간소화 다이어그램. 방출-모니터는 비드로부터 화합물의 UV-유도된 방출 후에, 사용자에게 가용성 화합물의 농도의 척도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 한 유형의 비드는 방출-모니터 전용이며, 즉, 이 비드는 또한 비드-결합된 화합물을 함유하지 않고, 또한 비드-결합된 DNA 라이브러리를 함유하지 않는다. "PCL"은 광절단가능한 링커이다.
도 10. 비드 방출-모니터의 상세한 다이어그램.
도 11. 비드 방출-모니터의 화학적 합성.
도 12. 링커가 리신 잔기를 포함하는 것인 이관능성 링커를 갖는 아민-관능화된 비드.
도 13. 제1 유형의 카르복실 기로 변형된 레날리도미드의 화학적 합성 단계.
도 14. 제2 유형의 카르복실 기로 변형된 레날리도미드의 화학적 합성 단계.
도 15. 제3 유형의 카르복실 기로 변형된 레날리도미드의 화학적 합성 단계.
도 16a, 도 16b, 도 16c. 레날리도미드 유사체.
도 17. DNA 바코드의 클릭-화학 합성에 적합한 데옥시시티딘 유사체의 화학적 합성 단계.
도 18a, b, c. 피코웰의 상단에 배치되고 피코웰을 밀봉하기 위한 캡. 도 18a는 화합물이 절단가능한 링커에 의해 방출가능한 것인 활성 캡을 보여준다. 도 18b는 시약, 예컨대 항체가 결합된 것인 또 다른 유형의 활성 캡을 보여준다. 결합된 시약은 영구적으로 연결될 수 있거나, 절단가능한 링커에 의해 연결될 수 있거나, 또는 수소 결합에 의해 결합될 수 있고, 단지 피코웰 내의 용액에 노출된 후 활성 캡으로부터 이 용액 내로 확산됨으로써 방출가능할 수 있다. 도 18c는 피코웰 내의 용액으로부터 대사물을 흡수, 흡착, 수집 또는 포획하는 데 사용될 수 있는 수동 캡을 보여준다. 후속적으로, 흡수된 대사물을 분석할 수 있다.
도 19a, b, c. 도 19a. 피코웰 위에 캡이 없는 피코웰 플레이트. 도 19b. 각각의 피코웰 위에 캡이 있는 피코웰 플레이트. 도 19c. 폴리아크릴아미드 용액을 각각의 피코웰 위에 1개의 캡이 단단히 고정되어 있는 피코웰 플레이트 상에 붓는다. 이어서, 폴리아크릴아미드는 다공성 캡 내로 스며들고, 응고되고, 각각의 캡에 대한 안정한 접착을 형성한다. 도 19d. 이어서, 응고된 폴리아크릴아미드 "루프"를 피코웰 플레이트로부터 벗겨내어, 이와 함께 각각의 캡을 가져온다. 이어서, 피코웰 용액으로부터 전달되고 각각의 캡 내로 흡수된 대사물을 분석할 수 있다. 바람직하게는, 피코웰 플레이트 위에 및 비드 위에 부어지는 용액은 히드로겔이 되고, 바람직하게는 비드는 히드로겔로부터 제조된다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 적어도 1개의 웰을 캡핑하고, 액체 중합체 용액을 플레이트 위에 및 캡핑된 웰 위에 붓는, 시스템, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로웰, 나노웰 또는 피코웰을 갖는 마이크로타이터 플레이트 및 관련 방법을 배제할 수 있다. 또한, 액체 중합체가 중합되어 각각의 캡에 부착되는 고체 중합체를 형성하는 상기의 것이 배제될 수 있다. 또한, 고체 중합체가 인열되어 이와 함께 부착된 캡을 제거하는 방법 및 생성된 조성물이 배제될 수 있다.
도 20. IKZF1 유전자를 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 사용된 원형 플라스미드의 맵. 플라스미드는 IKZF1 mNEON-p2a-mScarlet-w3-2FB (9081개 염기 쌍)이다. IKZF1은 이카루스 단백질을 코딩한다.
도 21. IKZF3 유전자를 세포의 게놈 내로 통합시키는 데 사용된 원형 플라스미드의 맵. 플라스미드는 IKZF3 mNeon-p2a-mScarlet-w3-2FB (9051 bp)이다. IKZF3은 아이올로스 단백질을 코딩한다.
도 22. 화학적 단량체 (화합물 1-6) 및 그의 DNA 바코드.
도 23. 화학적 단량체 (화합물 7-10) 및 그의 DNA 바코드.
도 24. 화학적 단량체 (화합물 11-16) 및 그의 DNA 바코드.
도 25. 화학적 단량체 (화합물 17-21) 및 그의 DNA 바코드.
도 26. 화학적 단량체 (화합물 22-16) 및 그의 DNA 바코드.
도 27. 화학적 단량체 (화합물 27-30) 및 그의 DNA 바코드.
도 28. 비드-결합된 DNA 바코드의 서열분석. 도면은 5개의 연속 염기 각각에 대한 형광 신호의 강도를 개시하며, 여기서 5개의 연속 염기는 비드-결합된 DNA 바코드의 일부이다.
도 29. 계단형 피코웰.
도 30. 비드로부터의 형광단의 방출의 시간 경과. 이는 t = 0초, t = 1초, t = 11초 및 t = 71초에서의 형광 데이터의 획득인, 비드-결합된 방출 모니터의 작동을 보여준다.
도 31. 켄처-형광단 기질에 대한 아스파르틸 프로테아제의 촉매 작용 후 생성된 방출 데이터.
도 32. 다양한 단계를 예시하는, 피코웰의 단면의 도면.
도 33. UV 선량의 증가가 비드로부터 형광단의 보다 큰 절단을 어떻게 유발하는지를 보여주는 적정 데이터. 레이퍼슨의 관점에서, 이는 축의 보다 강력한 스윙이 비드로부터 형광단을 절단하는 것에 어떻게 영향을 미치는지를 보여준다 (UV 선량의 전력은 제곱 센티미터당 줄로 측정됨). 표기법 "노출"은 사진을 찍을 때의 파라미터만을 지칭한다. 이는 단지 사진을 찍을 때의 노출 시간이다 (이는 절단을 수행하는 광 또는 여기를 수행하는 광의 노출 시간을 지칭하지 않음).
도 34. TAMRA 농도 대 광속. 365 nm에서의 UV 광에 대한 노출 후에 방출 후 유리 TAMRA의 농도가 제시된다.
도 35는 켄처-형광단 기질, 및 이 기질의 효소에 의한 절단, 그 결과 효소의 억제의 수기-도면을 제공한다. 비드-결합된 펩스타틴-A, 및 비드-결합된 Fmoc-발린 (음성 대조군)의 분자 구조가 또한 제시된다.
도 36. 용해된 세포로부터의 mRNA의 최종 포획, 후속하여 cDNA 라이브러리의 제조에 사용하기 위한 비드를 제조하는 단계. 이 도면은 또한 본 출원의 우선권이 주장된 가출원 (단일 세포 상의 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법) 중 하나에서 발생한다.
도 37. 세포를 DNA 바코드로 태그부착시키며, 여기서 태그부착은 세포 막에 포매된 지질에 의한다. 이 도면은 또한 본 출원의 우선권이 주장된 가출원 (단일 세포 상의 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법) 중 하나에서 발생한다.
도 38은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 프로세서 및 적어도 1개의 프로세서에 의한 실행을 위한 적어도 1개의 프로그램을 저장하는 메모리를 포함하는, 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하기 위한 컴퓨터 장치 또는 시스템의 개략적 다이어그램이다.
도 39는 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동 및 공동 내의 하위-구조를 갖는 분배기의 측면 횡단면도이다.
도 40은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동, 테이퍼형 측벽, 개방 상단 단부 및 개방 하단 단부를 갖는 분배기의 측면 횡단면도이다.
도 41은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동 및 각각의 공동의 하단에 배치된 자석을 갖는 분배기의 측면 횡단면도이다.
도 42는 예시적 실시양태에 따른 임의적인 메쉬 삽입물을 갖는 피펫의 측면 횡단면도이다.
도면은 반드시 축척에 맞는 것은 아님이 주목된다. 도면은 본원에 개시된 대상의 전형적 측면만을 도시하는 것으로 의도되며, 따라서 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 구체적으로 기재되고 첨부 도면에 예시된 구조, 시스템, 장치 및 방법이 비제한적 예시적 실시양태라는 것 및 본 발명의 범주가 단지 청구범위에 의해서만 정의된다는 것을 이해할 것이다.
첨부된 청구범위를 포함하여 본원에 사용된 단수 형태의 단어는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 그의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 특허 및 공개 특허 출원, 뿐만 아니라 도, 도면, 서열 목록, 콤팩트 디스크 등이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어진 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
약어
표 1은 약어 및 비제한적 정의를 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
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시약, 키트, 효소, 완충제, 살아있는 세포, 기기 등이 획득될 수 있다. 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스), 오크우드 케미칼(Oakwood Chemical) (사우스 캐롤라이나주 에스틸), 에피센터(Epicentre) (위스콘신주 매디슨), 인비트로젠(Invitrogen) (캘리포니아주 칼스배드), 프로메가(ProMega) (위스콘신주 매디슨), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) (캘리포니아주 칼스배드), 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코), 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs) (매사추세츠주 입스위치), 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC) (버지니아주 마나사스), 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) (뉴저지주 프랭클린 레이크스), 일루미나(Illumina) (캘리포니아주 샌디에고), 10X 게노믹스(10X Genomics) (캘리포니아주 플레전턴)를 참조한다.
바코딩된 겔 비드, 비-바코딩된 겔 비드 및 마이크로유체 칩은 매사추세츠주 캠브리지 소재의 1셀바이오(1CellBio)로부터 이용가능하다. 유동 세포측정법에 대한 지침 및 기기가 이용가능하다 (예를 들어, FACSCalibur®, BD 바이오사이언시스(BD Biosciences) (캘리포니아주 산호세), BD FACSAria II® 사용자 가이드, 파트 번호 643245, Rev.A, 2007년 12월, 344면 참조).
"표지된" 조성물은 분광학적, 광화학적, 형광측정, 생화학적, 면역화학적, 동위원소 또는 화학적 방법, 뿐만 아니라 플라즈몬 나노입자를 수반하는 방법에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 33P, 35S, 14C, 3H, 125I, 안정한 동위원소, 에피토프 태그, 형광 염료, 라만 태그, 전자-고밀도 시약, 기질, 또는 예를 들어 효소-연결 면역검정에 사용된 바와 같은 효소, 또는 플루오레트 (Rozinov and Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728)를 포함한다.
상세한 설명에 대한 내용 목차
( I ) 비드
( II ) 1 비드 1 화합물 (OBOC)
( III ) 비드에 대한 핵산 커플링
( IV ) DNA 바코드
( V ) 비드에 대한 화학적 화합물 커플링
( VI ) 화학적 단량체 서로의 커플링에 의한 화합물 제조
( VII ) 분할 및 풀 합성 및 병행 합성
( VIII ) 피코웰 제작
( IX ) 피코웰 내로의 비드 침착
( X ) 피코웰 내의 비드-결합된 핵산의 서열분석
( XI ) 비드로부터의 비드-결합된 화합물의 방출
( XII ) 화합물에 대한 생화학적 검정
( XIII ) 화합물에 대한 세포-기반 검정
( XIV ) 세포에 대한 교란-반응 분석
( I ) 비드
본 개시내용의 방법 및 조성물은 비드, 예컨대 단일크기의 텐타겔® M NH2 비드 (10, 20, 30 마이크로미터 등의 직경), 표준 텐타겔® 아미노 수지 (90, 130 마이크로미터 등의 직경), 텐타겔 마크로비즈(TentaGel Macrobeads)® (280-320 마이크로미터 직경) (상기 모두 독일 72072 튀빙겐 소재의 랩 폴리머(Rapp Polymere)로부터의 것)를 사용한다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜로 유도체화된 폴리스티렌 코어를 갖는다 (Paulick et al. (2006) J. Comb. Chem. 8:417-426). 텐타겔® 수지는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 그라프트된 저 가교 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그라프트된 공중합체이다. 따라서, 본 개시내용은 DNA 바코드 및 화합물 중 하나 또는 둘 다를 포함하도록 변형된 비드 또는 수지를 제공하며, 여기서 비변형된 비드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 그라프트된 저 가교 폴리스티렌 매트릭스로 이루어진 그라프트된 공중합체의 형태를 취한다.
텐타겔®은 하기를 특징으로 한다: "20 킬로 달톤 이하의 분자 질량의 PEG 쇄가 관능화된 가교 폴리스티렌 상에 고정화되었다. 약 2000-3000 달톤의 PEG 쇄를 갖는 그라프트 공중합체가 동역학적 속도, 이동성, 팽윤 및 수지 용량과 관련하여 최적인 것으로 입증되었다." (랩 폴리머, 독일). 따라서, 본 개시내용은 약 2000-3000 달톤의 PEG 쇄를 갖는 그라프트 공중합체의 형태를 취하는 비드 또는 수지를 제공한다. 팽윤에 관하여, 코멜라스(Comellas) 등은, 예를 들어 효소 검정에 사용되는 DCM, DMF, 메틸 알콜, 물 또는 완충제 중에 침지될 때 비드의 팽윤 능력을 측정하기 위한 지침을 제공한다 (Comellas et al. (2009) PLoS ONE. 4:e6222 (12 pages)). 팽윤의 단위는 비드 그램당 밀리리터이다.
대안적 비드 실시양태에서, 본 개시내용은 알킬 연결을 통해 폴리스티렌 백본에 부착된 PEG 스페이서를 갖는 수지를 사용하며, 여기서 수지는 마이크로구형이고 단일크기이다 (텐타겔® M 수지).
또 다른 대안적 비드 실시양태에서, 본 개시내용은 알킬 연결을 통해 폴리스티렌 백본에 부착된 PEG 스페이서를 갖는 수지를 사용하며, 여기서 수지 유형은 2종의 이관능성 종으로 존재한다: 첫째, 표면 변형된 수지: 비드의 외부 표면 상의 반응성 부위는 비드의 내부 부피 내의 반응성 부위에 대해 직교로 보호됨, 및 둘째, 하이브리드 수지: 절단가능한 및 비절단가능한 리간드는 이 지지체에 존재함 - 순차적 절단을 위해 개발됨 (텐타겔® B 수지).
또한, 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 PEG 스페이서가 알킬 연결을 통해 폴리스티렌 백본에 부착된 것인 수지를 사용하며, 여기서 마크로비드 수지는 매우 큰 입자 직경 및 높은 용량을 나타낸다 (텐타겔® MB 수지). 또한, 본 개시내용은 PEG 스페이서가 벤질 에테르 연결을 통해 폴리스티렌 백본에 부착된 것인 수지를 사용한다. 이 수지는 면역화 절차 또는 PEG 변형된 유도체 (PEG 부착된 PEG-변형된 화합물)의 합성에 사용될 수 있다 (텐타겔® PAP 수지).
또한, 비드는 하이포겔(HypoGel)® 200 수지일 수 있다. 이들 수지는 저 가교 폴리스티렌 매트릭스 (플루카 케미 게엠베하(Fluka Chemie GmbH), 스위스 CH-9471 부흐스) 상에 그라프트된 올리고에틸렌 글리콜 (MW 200)의 복합체이다.
일부 실시양태에서, PEG 링커가 없는 아미노 관능화된 폴리스티렌 비드, 예를 들어 단일크기의 폴리스티렌 M NH2 마이크로비드 (5, 10, 20 마이크로미터 등의 직경, 또한 독일 72072 튀빙겐 소재의 랩 폴리머로부터의 것)가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물은 비드에 대한 공유 부착 없이 비드 내의 세공 또는 챔버 또는 터널 내에 캡슐화될 수 있다. 화합물은 다양한 수단에 의해 비드의 이러한 세공 내로 확산되거나 강제로 들어갈 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물은 확산에 의해 비드 내에 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고온을 사용하여 비드를 팽윤시키고 화합물을 비드 내에 로딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고압을 사용하여 화합물이 비드 내로 강제로 들어가게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드를 팽윤시키는 용매를 사용하여 화합물을 비드 내에 로딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진공 또는 저압을 사용하여 화합물을 비드 내로 분할할 수 있다. 일부 실시양태에서, 온화한 또는 격렬한 물리적 교반을 사용하여 화합물을 비드 내로 로딩할 수 있다.
화합물이 공유 부착 없이 비드 상에 로딩되는 이러한 실시양태에서, 화합물은 확산에 의해 비드로부터 언로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비제한적 방식으로, 온도, 압력, 용매, pH, 염, 완충제 또는 세제 또는 이러한 조건의 조합을 사용하여 이러한 비드로부터 화합물을 언로딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드의 물리적 완전성은, 예를 들어 중합된 비드의 가교해제를 사용하여 이러한 비드 내에 함유된 화합물을 방출시킬 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 비드 중 하나를 수반하는, 임의의 비드 및 비드-화합물 복합체 또는 임의의 방법을 배제할 수 있다.
본 개시내용의 비드는 또한 하기를 포함한다. 메리필드 수지 (클로로메틸폴리스티렌), PAM 수지 (4-히드록시메틸페닐 아세트아미도 메틸 폴리스티렌), MBHA 수지 (4-메틸벤즈히드릴아민), 브로민화 왕 수지 (알파-브로모프리오피오페논), 4-니트로벤조페논 옥심 (카이저) 수지, 왕 수지 (4-히드록시메틸 페녹시메틸 폴리스티렌), PHB 수지 (p-히드록시벤질 알콜), HMPA 수지 (4-히드록시메틸 페녹시아세트산), HMPB 수지 (4-히드록시메틸-3-메톡시 페녹실 부탄산), 2-클로로트리틸 수지, 4-카르복시트리틸 수지, 링크 산 수지 (4-[(2,4-디메톡시페닐) 히드록시메틸) 페녹시메틸), 링크 아미드 (RAM) 수지 "노르" 수지 (4-((2,4-디메틸페닐) (Fmox-아미노)메틸) 페녹시알킬), PAL 수지 (5-[4-(Fmoc-아미노) 메틸-3,5-디메톡시페녹시] 발레르아미도메틸 폴리스티렌), 시버 아미드 수지 (9-Fmox-아미노-크산탄-3-일-옥시메틸), HMBA 수지 (히드록시메틸 벤조산), 4-술파모일벤조일 수지, "케너의 안전성 포착" 수지 (N-(4-술파모일벤조일) 아미노메틸-폴리스티렌), FMP-수지 (4-(4-포르밀-3-메톡시페녹시)-에틸) (문헌 [ChemFiles Resins for Solid-Phase Peptide Synthesis Vol. 3 (32 pages)] (플루카 케미 게엠베하, 스위스 CH-9471 부흐스) 참조).
본 개시내용의 비드는 화합물의 수동 캡슐화제로서 사용되는 상기 비드 (화합물에 대한 공유 연결 없이 화합물을 수동적으로 보유함)를 추가로 포함하고, 비관능화된 폴리스티렌 비드, 실리카 비드, 알루미나 비드, 다공성 유리 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 산화티타늄 비드, 알기네이트 비드, 세라믹 비드, PMMA (폴리메틸메타크릴레이트) 비드, 멜라민 비드, 제올라이트 층, 폴리락티드 비드, 디블록-공중합체 미셀, 덱스트란 비드 등을 추가로 포함한다. 이 단락에 열거된 많은 비드는 판매업체, 예컨대 미국 10516 뉴욕주 콜드 스프링 소재의 마이크로스피어스-나노스피어스(Microspheres-Nanospheres)로부터 구입할 수 있다.
비드에 추가로, 소포 또는 액적이 또한 본 개시내용의 일부 실시양태에 대한 화합물을 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 지질, 디블록-공중합체, 트리-블록 공중합체 또는 다른 막 형성 물질을 사용하여 화합물이 로딩될 수 있는 내부 부피를 형성할 수 있다. 화합물은 세제, 기계적 교반, 온도, 염, pH 또는 다른 수단의 첨가에 의해 이들 캡슐화된 부피로부터 방출될 수 있다. 유중수 액적 에멀젼 또는 수중유 액적 에멀젼은 검정 부피로 전달될 수 있는 화합물을 수동적으로 캡슐화하는 또 다른 수단이다.
수동 캡슐화를 사용하여 화합물을 전달하는 모든 실시양태에서, DNA 태그가 또한 수동적으로 로딩될 수 있거나, 또는 대안적으로 DNA 태그는 비드, 소포 또는 액적에 공유 부착될 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 화학물질 중 어느 하나로 제조되거나 또는 상기 화학물질 중 어느 하나의 유도체로 제조된 임의의 비드 또는 수지를 배제할 수 있다.
실시양태에서, 비드는 구상체일 수 있고, 약 0.1-1 마이크로미터, 약 1-5 마이크로미터, 약 1-10, 약 5-10, 약 5-20, 약 5-30, 약 10-20, 약 10-30, 약 10-40, 약 10-50, 약 20-30, 약 20-40, 약 20-50, 약 20-60, 약 50-100, 약 50-200, 약 50-300, 약 50-400, 약 100-200, 약 100-400, 약 100-600, 약 100-800, 약 200-400, 약 200-600, 약 200-800 마이크로미터 등의 직경을 가질 수 있다.
상기 값 및 범위의 관점에서 정의가능한 비-구상체 비드가 또한 제공된다. 예를 들어, 축 중 하나 또는 1차 치수 중 하나 (예를 들어, 측면) 또는 2차 치수 중 하나 (예를 들어, 대각선)는 상기 범위의 값을 포함할 수 있다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 값 또는 범위 중 1개 이상에 속하는 구상체 비드 (또는 비-구상체 비드)를 포괄하는 임의의 시약, 조성물, 시스템 또는 방법을 배제할 수 있다.
비드의 쇄. 한 실시양태에서, 복수의 비드 이량체가 제공되며, 여기서 비드-이량체는 서로 부착된 2개의 비드의 형태를 취하고, 여기서 하나의 비드는 복수의 부착된 핵산 바코드 (직교 핵산 모듈 또는 연쇄된 핵산 모듈)를 함유하고, 다른 비드는 복수의 부착된 화합물을 함유하고, 여기서 모든 화합물은 서로 실질적으로 관련되어 있다 (또는 모든 화합물은 서로 화학 구조가 실질적으로 동일함). 비드 이량체는 부착된 화합물을 갖는 제1 비드를 제조하고, 부착된 핵산 바코드를 갖는 제2 비드를 별개로 제조한 다음, 2개의 비드를 함께 연결함으로써 합성될 수 있다. 한 측면에서, 비드는 가역적 링커에 의해 서로 부착되고, 또 다른 측면에서, 비드는 비-가역적 링커에 의해 서로 부착된다.
비드 투과성. 실시양태에서, 본 개시내용은 다양한 범위 또는 정도의 투과성을 갖는 비드를 제공한다. 투과성은 용매에 의해 접근가능한 비드의 부피의 백분율로서 측정될 수 있으며, 여기서 측정 단위는 세공의 형태를 취하는 비드의 표면의 백분율이거나, 또는 측정 단위는 비드의 표면 (및 외부 배지)과 유체 소통하는 채널, 네트워크 또는 챔버의 형태를 취하는 비드의 내부의 백분율이다. 본 개시내용은 다공성 비드를 포괄할 수 있거나, 또는 대안적으로 다공성 비드를 배제할 수 있다.
로트버그(Rothberg)의 미국 특허 번호 9,062,304는 외부 및 내부 영역을 갖는 비드를 개시한다. 하기가 제시된다: "내부 표면 (세공 표면)" 및 "적합한 세공은 . . . 보다 큰 분자는 제외할 것이다" 및 "내부 및 외부 표면의 차별적 관능화를 활용하는" 옵션, 및 다양한 세공 직경, 및 중합체, 예컨대 폴리(스티렌 술폰산) 및 폴리스티렌. 로트버그의 도 1은 비드의 표면 및 비드의 세공의 사진을 제공한다. 베드레(Bedre)의 미국 특허 번호 9,745,438은 다공성 비드의 투과 전자 현미경 영상을 제공한다. 스미스(Smith)의 미국 특허 번호 5,888,930은 다공성 비드의 단면의 주사 전자 현미경사진을 제공한다. 표면 상에 작은 세공을 갖고 내부에 큰 세공을 갖는 구형 비드가 제시되며, 여기서 비드는, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카르보네이트, 셀룰로스 또는 폴리우레탄으로부터 제조된다. 쿠크(Cooke)의 미국 특허 번호 5,047,437은 무피 표면을 갖는 구형 폴리(아크릴로니트릴) 공중합체 세공 형태 (도 1) 및 표면 상에 외피를 갖는 비드 (도 5)를 개시한다. 차오(Tsao)의 미국 특허 번호 4,090,022는 셀룰로스 비드의 다공성 개구부 및 내부 공극 공간을 개시한다.
모든 도면을 포함한 각각의 상기-확인된 특허는, 각각 그 전문이 개별적으로 참조로 포함되는 것처럼, 그 전문이 본원에 포함된다.
어떠한 제한도 암시하지 않으면서, 비드 또는 마이크로입자의 외부 표면은 전체 비드 또는 마이크로입자를 탄성 필름으로 단단히 랩핑함으로써 결정될 수 있다. 비드 또는 마이크로입자는 사고-실험에 의해 랩핑될 수 있거나, 또는 랩핑된 비드는 도면 또는 사진에 의해 도시될 수 있거나, 또는 비드는 실제로 랩핑될 수 있다. 어떠한 제한도 암시하지 않으면서, 비드의 외부 표면은 랩핑과 물리적으로 접촉하는 비드의 그 부분이다.
예를 들어, 본 개시내용은 표면적의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%를 차지하는 세공을 갖는 비드를 제공한다. 또한, 본 개시내용은 내부 채널 또는 네트워크의 부피가 비드의 총 부피의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%를 차지하고, 내부 채널 또는 네트워크가 비드의 외부 표면 (및 외부 배지)과 유체 소통하는 것인 비드를 제공한다.
또한, 본 개시내용은 표면적의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만을 차지하는 세공을 갖는 비드를 제공한다. 또한, 본 개시내용은 내부 채널 또는 네트워크의 부피가 비드의 총 부피의 1% 미만, 2% 미만, 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만을 차지하고, 내부 채널 또는 네트워크가 비드의 외부 표면 (및 외부 배지)과 유체 소통하는 비드를 제공한다.
철-코어 비드. 본 개시내용은 철-코어 비드 또는 자기 비드를 포괄한다. 이들 비드는 자석으로 조작되어 이들을 하나의 반응 용기로부터 또 다른 반응 용기로, 또는 하나의 용기로부터 또 다른 용기로 이동시킬 수 있다. 로봇공학에 의한 조작은 이들 비드를 사용함으로써 증진될 수 있다. 자기 비드의 제조 및 사용 방법은 이용가능하다 (Szymonifka and Chapman (1994) Tetrahedron Letters. 36:1597-1600, Liu, Qian, Xiao (2011) ACS Comb. Sci. 13:537-546, Alam, Maeda, Sasaki (2000) Bioorg. Med. Chem. 8:465-473).
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 비드 또는 임의의 비드 집단을 배제할 수 있으며, 여기서 비드 또는 집단은 상기 값 또는 범위 중 하나를 충족시킨다.
비드 내로의 화합물 로딩
많은 실험에서, 사전-합성된 화합물을 비드 내로 로딩하는 것이 유리하며, 여기서 비드는 화합물을 검정에 전달하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 생물학적 시편으로의 약물 전달에 사용되는 많은 표준 기술은 화합물을 검정에 전달하도록 적합화될 수 있다 (문헌 [Wilczewska et al. (2012) Nanoparticles as drug delivery systems. Pharmacological Reports. 64:1020-1037, Kohane DS (2007) Microparticles and nanoparticles for drug delivery. Biotechnol. Bioeng. 96: 203-209, Singh et al. (2010) Microencapsulation: A promising technique for controlled drug delivery. Res Pharm Sci. 5: 65-77] 참조).
사전-합성된 화합물이 비드 내로 로딩되는 이러한 실시양태에서, 화합물은 전통적인 96, 385 또는 1536 웰 마이크로타이터 플레이트에 보유될 수 있다. 이들 플레이트에, 확산 또는 다른 활성 로딩 방법에 의해 화합물이 로딩된 비드가 첨가될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 함침을 위해 선택된 비드는 모액으로부터 제거될 때 화합물의 즉각적인 비움을 방지하는 세공 크기 또는 삼출 기하구조를 갖는다. 비드로부터의 확산은 필요한 경우에 열, 압력, 첨가제 또는 다른 자극제에 의해 증진될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화합물-적재 비드는 외부 임펄스에 의해 촉발될 때까지 내부 내용물의 누출을 방지하는 방식으로 캡핑될 수 있다. 다공성 비드의 외부를 캡핑하는 한 방법은 비드-화합물 용액에 지질 또는 친양쪽성 분자를 첨가하여, 비드의 표면에 노출된 공동이 친양쪽성 분자에 의해 형성된 이중층에 의해 밀봉되도록 하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 사전형성된 소포는 약물 적재 비드와 혼합됨으로써, 교반 시 소포가 파열되고 막이 약물-적재 비드의 표면 위에 재형성됨으로써, 그를 밀봉할 수 있다. 이러한 비드 밀봉을 수행하는 방법은 기재되어 있다 (문헌 [Tanuj Sapra et al. (2012) Nature Scientific Reports volume 2, Article No.: 848] 참조). 실리카 비드를 밀봉하기 위한 추가의 실험 프로토콜은 문헌 [Ryan Davis et al., Nanoporous Microbead Supported Bilayers: Stability, Physical Characterization, and Incorporation of Functional Transmembrane Proteins, SAND2007-1560]의 산디아 래보러토리즈(Sandia Laboratories)에 의한 보고서 발표, 및 문헌 [Hui Zheng et al. (bSUM: A bead-supported unilamellar membrane system facilitating unidirectional insertion of membrane proteins into giant vesicles) in J. Gen. Physiol. (2016) 147: 77-93]에 기재된 방법 bSUM에서 이용가능하다.
사전-합성된 화합물을 이용하는 일부 실시양태에서, 비드는 화합물로부터 적절한 시약의 첨가에 의해, 예를 들어 지질 또는 디-블록 공중합체의 첨가에 이어서 교반에 의해 생성되며, 이에 의해 내부에 또는 이중층 막 내에 화합물을 함유하는 소포가 형성된다. 일부 실시양태에서, 화합물을 마이크로유체 T 접합부를 통해 밀어내어 오일 상 중에 수성 상 액적을 생성할 수 있으며, 여기서 화합물은 수성 상 내에 또는 수성 상과 오일 상 사이의 계면에 함유된다. 일부 실시양태에서, 형성된 액적은 추가로 중합되어, 비중합된 수성 상 액적보다 더 견고하고 취급하기 안정한 히드로겔을 생성할 수 있다. 액적-기반 캡슐화 및 검정은 문헌 [Oliver et al. (2013) Droplet Based Microfluidics, SLAS Discovery Volume: 19 issue: 4, page(s): 483-496]에 개시되어 있다. 졸-겔 캡슐화 공정을 또한 사용하여 화합물을 비드 내에 캡슐화할 수 있다. 졸-겔 비드의 형성은 문헌 [Sol-gel Encapsulation of Biomolecules and Cells for Medicinal Applications, Xiaolin Wang et al. (2015) Current Topics in Medicinal Chemistry. 15: 223]에 기재되어 있다.
1 비드 1 화합물 (OBOC)
조합 라이브러리를 제조하는 데 사용된 방법은 3개의 단계, 즉, ( 1 ) 라이브러리를 제조하는 단계, ( 2 ) 라이브러리 내의 화합물을 스크리닝하는 단계, 및 ( 3 ) 화합물, 예를 들어 모든 화합물 또는 단지 스크리닝으로 흥미로운 결과를 제공한 화합물만의 구조를 결정하는 단계를 수반한다 (문헌 [Lam et al. (1997) The One-Bead-One-Compound Combinatorial Library Method. Chem. Rev. 97:411-448] 참조). 비드-결합된 합성에 의해 화합물을 합성하는 것의 이점은 화합물이 "분할-및-풀" 방법에 의해 신속하게 제조될 수 있다는 것이다.
코딩 전략과 조합된 OBOC. OBOC의 또 다른 특색은 각각의 비드가 화합물뿐만 아니라 코딩 전략을 포함할 수 있다는 것이다. 비드-결합된 핵산이 동일한 비드에 결합된 화합물을 코딩하는 데 사용되는 경우에, 용어 "코딩하는"은 유전자 코드를 지칭하지 않는다. 대신, 용어 "코딩하는"은 사용자가 수천개의 짧은 핵산 서열 각각을 단일 비드-결합된 화합물과 상관시키는 범례, 기호설명 또는 코드를 보유한다는 것을 의미한다.
비드-결합된 화합물 및 비드-결합된 핵산을 보유하는 비드 (여기서 핵산은 회합된 화합물을 코딩함) 사용의 극적인 변형은 하기와 같다. 극적인 변형은 접합체의 라이브러리를 제조하는 것이며, 여기서 라이브러리의 각각의 구성원은 소분자 플러스 DNA 모이어티의 접합체의 형태를 취하고, 여기서 DNA 모이어티는 소분자를 코딩한다. 이 접합체는 가용성이고, 비드-결합되지 않는다. 세포 또는 정제된 단백질로 스크리닝한 후에, 접합체는 세포 또는 정제된 단백질에 결합된 채로 남아있어, 접합체의 단리를 가능하게 하고, 최종적으로 접합된 핵산을 서열분석함으로써 화합물을 확인할 수 있다 (문헌 [Satz et al. (2015) Bioconjugate Chemistry. 26:1623-1632] 참조).
여기서, 대부분의 이 특허 문헌에서와 같이, 용어 "코딩하다"는 유전자 코드를 지칭하는 것이 아니라, 대신 연구자가 특정 핵산 서열을 사용하여 그에 부착된 화합물의 특정 공지된 구조를 나타낸다는 사실을 지칭한다.
코딩 전략의 사용, 예컨대 DNA 바코드의 사용에 대한 대안으로서, 스크리닝에서 양성인 비드 (이에 의해 스크리닝에서 양성인 화합물을 나타냄)를 에드만 분해 또는 질량 분광측정법에 적용하여 비드-결합된 화합물을 확인할 수 있다 (문헌 [Shih et al. (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223] 참조). 비드-결합된 화합물이 펩티드인 경우에, MALDI 질량 분광측정법이 스크리닝-양성 펩티드 화합물의 서열의 직접 결정에 사용될 수 있다. 레이저 조사 하에 절단 및 이온화가 동시에 발생하기 때문에, 직접 서열분석이 가능하다 (Song, Lam (2003) J. Am. Chem. Soc. 125:6180-6188).
조합 라이브러리의 분할-및-풀 합성을 수행하는 데 있어서 한가지 좋은 점은 모든 화합물이 공통 모티프를 공유하도록 화합물을 제조할 수 있다는 것이다. 이 전략은 "화합물의 라이브러리보다는 모티프의 라이브러리의 생성"으로서 기재되었다 (문헌 [Sepetov et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.92:5426-5430], 상기 문헌 [Lam et al., 418] 참조).
큰 비드의 전형적 예를 제공하면, 비드는 직경이 0.1 mm일 수 있고, 동일한 화합물의 약 1013 카피를 보유할 수 있다 (상기 문헌 [Lam et al.]). 비드-결합된 화합물의 라이브러리의 제조 후에, 각각의 비드를 개별 검정에 사용할 수 있으며, 여기서 검정은 생화학적 활성 또는 대안적으로 결합 활성을 측정한다. 검정은 "비드-상" 검정일 수 있거나, 또는 대안적으로 화합물이 비드로부터 절단되어 용액-상 검정에 사용될 수 있다 (상기 문헌 [Lam et al.]).
임의의 유형의 비드의 파라미터는 주어진 검정 배지에서 팽윤하는 그의 경향, 비드의 중합체가 소수성인지 또는 친수성인지의 여부, 각각의 화합물을 부착시키기 위한 비드 상의 부착 부위의 정체, 스페이서, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 비드의 표면으로부터 각각의 화합물의 일부 분리를 제공하기 위해 사용되는지의 여부의 문제, 및 비드의 내부 부피를 포함한다.
화합물을 비드에 부착시키되, 비드의 소수성 표면으로부터 멀리 떨어진 거리에서 부착시킬 필요성에 관하여, 상기 문헌 [Lam et al.]에서 폴리옥시에틸렌-그라프트된 스티렌 (텐타겔®)은 관능화가능한 기가 폴리옥시에틸렌 쇄의 말단에 있어 소수성 폴리스티렌으로부터 멀리 떨어져 있다는 이점을 갖는 것으로 개시한다. 수용성 링커를 갖는 비드는 텐타겔 및 폴리디메틸아크릴아미드 비드 (펩신(PepSyn)® 겔, 캠브리지 리서치 바이오케미칼스(Cambridge Research Biochemicals), 영국 노스위치)를 포함한다.
내부 부피의 파라미터는 비드-결합된 DNA 바코드와 비드-결합된 화합물의 표적 사이의 상호작용을 방지할 필요가 있다는 이점을 제공할 수 있다. 이러한 이점을 활용하기 위해, 비드는 DNA 바코드가 비드의 내부에 위치하도록 제조될 수 있는 반면, 대조적으로 스크리닝될 화합물은 비드의 표면에 부착된다 (상기 문헌 [Lam et al., pages 438-439]). 내부 부피의 이러한 이점은 비드-결합된 화합물이 절단가능한 링커에 의해 부착되고 절단 및 방출되는 화합물에 대해서만 화합물의 검정이 수행되는 경우에는 무관할 수 있다.
아펠(Appell) 등은 화학적 라이브러리를 합성한 후 스크리닝하여 활성 화합물을 검출하는 분할-및-풀 방법의 비제한적 예를 제공한다 (Appell et al. (1996) J. Biomolecular Screening. 1:27-31). 라이브러리 비드를 제1 마이크로웰 플레이트, 나노웰 플레이트 또는 피코웰 플레이트 상의 웰의 어레이에 각각의 웰 내에 하나씩 배치한다. 비드를 광에 노출시켜 비드-결합된 화합물의 약 50%를 절단함으로써 이들을 웰 내의 용액으로 방출시킨다. 이어서, 방출된 화합물을 제2 마이크로웰 플레이트로 옮기고, 활성 화합물을 함유하는 웰을 검출하기 위한 검정에 적용하여, 제1 플레이트 내의 비드가 활성인 비드-결합된 화합물을 함유하는지를 확인한다. 이어서, "활성 화합물이 단일 비드로부터 확인되면, 비드를 회수하고 디코딩하여, 합성 이력 및 . . . 활성 화합물의 구조을 산출한다" (상기 문헌 [Appell et al.]).
비드-결합된 화합물을 스크리닝하는 세포-기반 스크리닝 검정을 위해, 쉬(Shih) 등은 신규 유형의 비드를 제공한다 (Shih et al. (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223). 이러한 신규 유형의 비드는 "난소암에 대한 합성 사멸 리간드"의 라이브러리의 구성원인 비드-결합된 화합물을 함유한다. 비드는 또한 비오틴으로 장식되며, 여기서 샌드위치를 생성하는 2종 이상의 화학물질이 첨가되고, 여기서 샌드위치는 비드에 대한 세포의 부착을 유지한다. 샌드위치는 스트렙타비딘 플러스 비오틴-LXY30 복합체를 포함한다. 이러한 샌드위치는 비드를 LXY30의 수용체에 연결하며, 이는 세포 표면 상의 널리 공지된 단백질, 즉, 인테그린에서 일어난다. 상기 문헌 [Shih et al.]의 방법은 암 세포를 사멸시킬 수 있는 새로운 분자 ("LLS2")의 발견을 가져왔다. 상기 방법은 비드-결합된 화합물을 사용하며, 여기서 화합물은 (화합물이 여전히 비드-결합되어 있더라도) 세포에 결합한다. 초(Cho) 등은 유사한 1-비드-1-화합물 라이브러리를 생성하였으며, 여기서 스크리닝될 화합물은 (상기 기재된 샌드위치에 대한 임의의 필요 없이) 세포에 결합하기에 충분하였다 (Cho et al. (2013) ACS Combinatorial Science. 15:393-400). 초 등의 보고서의 목적은 암 세포에 의해 발현되는 인테그린에 결합하는 RGD-함유 펩티드를 발견하는 것이었다. 상기 개시된 시약 및 방법은 본 개시내용에 유용하다.
비드에 대한 핵산 커플링 (직교형, 연쇄형)
연쇄된 바코드 및 직교 바코드의 주제에 맞는 한 방식은 하나가 다른 것에 비해 갖는 이점을 주목하는 것이다. 연쇄된 바코딩에 비해 직교 바코딩의 이점은 하기와 같다. 성장하는 화학적 화합물의 각각의 단량체의 부착과 함께, DNA 바코드 모듈이 병행하여 부착된다. 연쇄된 바코딩에서, 임의의 주어진 모듈의 부착이 불완전하면 (모든 부착 부위가 필요한 모듈과 성공적으로 커플링되지는 않았음을 의미함), 완성된 바코드의 서열은 정확하지 않을 것이다. "정확하지 않다"라는 언급은 불완전한 커플링으로 인해 덩어리가 뭉치로부터 누락될 수 있음을 의미하며, 이것이 완성된 정확한 DNA 바코드인 것으로 가정되었음을 의미한다. 여기서, 완성된 바코드 서열은 모든 모듈의 부착 실패로 인해 오류를 함유할 것이다. 대조적으로, 직교 바코딩에서, 각각의 개별 모듈은 비드 상의 그 자신의 고유한 부착 부위에 공유 결합된다. 그리고 모듈이 비드 상의 주어진 부위에 부착되면, 이미 부착된 모듈에 추가의 모듈이 연결되지 않을 것이다.
본 개시내용은 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고, 부분적으로 합성된 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 각각의 DNA 바코드 모듈은, 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드에 부착되기 전에, 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 이 dsDNA는 DNA 가교-링커, 예컨대 미토마이신-C로 처리된다. dsDNA 형태의 DNA 바코드의 합성이 완료된 후, 이 dsDNA는 ssDNA로 전환된다. dsDNA의 ssDNA로의 전환은, DNA 가닥 중 1개가 우라실 (U) 잔기를 갖고, 우라실 잔기의 위치에서의 DNA의 절단이 우라실-N-글리코시다제에 의해 촉매되는 경우에 수행될 수 있다 (2017년 9월 25일에 출원된 미국 일련 번호 62/562,905의 도 5 참조. 미국 일련 번호 62/562,905는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 상기는 비드-결합된 화학적 화합물을 제조하는 데 사용된 시약이 성장하는 DNA 바코드에 가하는 손상을 지칭한다.
비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고 부분적으로 합성된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 이중 가닥 DNA 형태의 DNA 바코드를 합성하는 것이며, 여기서 서로 부착되는 각각의 DNA 바코드 모듈은 dsDNA의 형태를 취하고, 각각의 2개의 가닥은 DNA 헤드피스에 의해 안정화된다. 완성된 DNA 바코드의 최종 서열분석을 위해, 가닥 중 하나를 DNA 헤드피스로부터 절단하고 제거한다. 상기는 비드-결합된 화학적 화합물 (여기서 이 화학적 화합물은 화학적 라이브러리의 구성원임)을 제조하는 데 사용된 시약이 성장하는 DNA 바코드에 가하는 손상을 지칭한다.
비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 자기-조립하여 헤어핀을 형성하는 방식으로 DNA 바코드를 합성하는 것이며, 여기서 이 DNA 바코드는 자기-조립하여 헤어핀의 제1 갈래가 헤어핀의 제2 갈래에 어닐링한다.
합성될 DNA 바코드가 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 형태를 취하는 경우에, 용매, 예컨대 DCM, DMF 및 DMA는 DNA 바코드를 변성시킬 수 있다. 상기 방법 및 시약은 변성을 방지할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 용어 "DNA 바코드"는 화학적 화합물 그 전체를 확인하는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있는 반면, 대조적으로, "DNA 바코드 모듈"은 화학적 화합물을 구성하는 단량체 중 단 하나만을 지칭할 수 있다.
비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고 부분적으로 합성된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 사용하고, 7-aza-dATP 및 dGTP에 의해 이 dsDNA의 말단을 밀봉하는 것이다.
대안적 실시양태에서, 방법은 "연쇄된 DNA 바코딩"과 "직교 DNA 바코딩" 사이의 중간을 사용할 수 있으며, 여기서 이 중간은 DNA 바코드의 블록을 수반하고, 즉, 여기서 각각의 블록은 2개의 DNA 모듈을 함유하거나 또는 3개의 DNA 모듈을 함유하거나 또는 4개의 DNA 모듈을 함유하거나 또는 5개의 DNA 모듈을 함유하는 것 등이다 (그러나 전장 화합물을 확인하는 모든 DNA 모듈을 함유하지는 않음).
도 1은 연쇄된 구조화된 비드의 예시적이고 비제한적인 다이어그램을 개시한다. 비드는 복수의 DNA 바코드 (각각 DNA 바코드 모듈로 제조됨) 및 복수의 화합물 (각각 화학적 라이브러리 단량체로 제조됨)을 함유한다. 쉽게 말하자면, 용어 "DNA 바코드"는 "DNA 바코드 모듈"인 모든 핵산, 뿐만 아니라 일부 기능을 제공하는 모든 핵산을 포함하는 중합체를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 기능은 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위일 수 있거나, 또는 기능은 비드-결합된 화합물의 화학적 합성에서의 단계를 확인하는 데 사용될 수 있다. 도 1은 또한 비드-결합된 화합물을 보여주며, 여기서 각각의 화합물은 여러 화학적 라이브러리 구성원으로 제조되고, 여기서 각각의 화학적 라이브러리 구성원은 정사각형, 원형 또는 삼각형에 의해 나타내어진다. 도 1은 각각의 DNA 바코드 모듈이 연속적으로 1 내지 8로 넘버링된다는 것을 보여주며, 여기서 이들 숫자는 각각의 8개의 형상 (정사각형, 원형, 삼각형)에 상응한다. 명확성을 위해, 기능을 제공하는 (및 임의의 특정한 화학적 단위를 나타내지 않는 또는 "코딩"하지 않는) 핵산은 도면에 제시되지 않는다.
도 2는 직교 구조화된 비드의 예시적이고 비제한적인 실시양태를 개시한다. 비드는 복수의 DNA 바코드 (각각 DNA 바코드 모듈로 제조됨)를 함유하지만, 각각의 DNA 바코드 모듈은 비드 상의 별개의 연결 부위에 부착된다. 전체 DNA 바코드는 8개의 DNA 바코드 모듈로 이루어지며, 이는 도면에서 1-8로 넘버링된다. 특정한 DNA 바코드로부터의 정보를 판독한 다음, 이를 사용하여 동일한 비드에 결합된 화학적 화합물을 확인할 때, 각각의 별개로 부착된 DNA 바코드 모듈에 대해 DNA 서열분석을 수행하여야 한다. 도 2에서, 비드는 또한 8개의 형상 (원형, 정사각형, 삼각형)으로 나타낸 바와 같이 각각 8개의 단위를 갖는 복수의 부착된 화학적 화합물을 함유한다.
도 2에서, 명확성을 위해, 각각의 DNA 바코드 모듈에 부착된 기능적 핵산은 제시되지 않는다. 물론, 각각의 DNA 바코드 모듈은 완성된 전장 화합물에서 화학적 라이브러리 단량체의 위치를 확인하는 핵산을 가질 필요가 있다. 도 2에 나타낸 예에서, 위치는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 또는 제8일 필요가 있다.
한 실시양태에서, 화학적 단량체가 먼저 부착된 다음, 그 후에, 상응하는 DNA 바코드 모듈이 부착된다. 대안적 실시양태에서, DNA 바코드 모듈이 먼저 부착된 다음, 상응하는 화학적 단량체가 부착된다. 또한, 때때로 "한 실시양태"를 사용하고 때때로 "대안적 실시양태"를 사용하는 유기 합성 절차를 따를 수 있다. 또 다른 대안적 실시양태에서, 본 방법은 여러 DNA 바코드 모듈의 블록의 부착과 병행하여, 비드에 부착된 여러 화학적 단량체의 블록의 블록식 첨가를 제공한다.
배제적 실시양태에서, 비드에 대한 화학적 단량체, DNA 바코드 모듈 또는 화학적 단량체 및 DNA 바코드 모듈 둘 다의 블록식 첨가를 사용하는 시약, 조성물 및 방법이 배제될 수 있다.
이는 비드-결합된 화합물의 단량체를 "코딩"하거나 확인하는 역할을 하는 핵산을 포함한, 비드-결합된 폴리뉴클레오티드에 존재할 수 있는 핵산에 관한 것이다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 "단계-특이적 DNA 서열분석 프라이머 부위"를 코딩하는 핵산을 배제할 수 있다. 이러한 상황에서, 화합물에 존재하는 각각의 화학적 단량체에 대해, 상응하는 DNA 바코드 모듈이 존재하며, 여기서 각각의 DNA 바코드 모듈에 적어도 1개의 상응하는 프라이머-결합 부위, 즉, "단계-특이적 DNA 서열분석 프라이머 부위"가 플랭킹되어 있다. 또한, 화합물의 화학적 합성에서의 특정한 단계, 예컨대 단계 1, 단계 2, 단계 3, 또는 단계 4를 코딩하거나 지정하는 핵산이 배제될 수 있다.
또한, 본 개시내용은 스페이서로서 기능하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 폴리뉴클레오티드 쇄를 따라 서열분석 프라이머 어닐링 부위인 제1 부위와 화학적 단량체를 확인하는 제2 부위 사이의 거리를 생성할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 또 다른 핵산에 의해 제공된 정보를 반복하거나 확인하는 핵산을 사용할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 PCR 프라이머 결합 부위를 코딩하는 핵산을 사용할 수 있다. PCR 프라이머 결합 부위는 서열분석 프라이머와 구별될 수 있는데, 이는 PCR 프라이머 결합 부위를 갖는 폴리뉴클레오티드가 2개의 PCR 프라이머 결합 부위를 갖기 때문이고, 이들 부위 둘 다가 동일한 융점 (PCR 프라이머가 PCR 프라이머 결합 부위에 어닐링되는 경우의 융점)을 갖도록 설계되기 때문이다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 스페이서로서 기능하거나 또는 단지 스페이서로서만 기능하는 핵산을 배제할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 또 다른 핵산에 의해 제공된 정보를 반복하거나 확인하는 핵산을 배제할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 PCR 프라이머 결합 부위로서의 역할을 하는 핵산을 배제할 수 있고, PCR 프라이머가 아닌 프라이머에 대한 결합 부위로서의 역할을 하는 핵산을 배제할 수 있다.
추가적으로, 본 개시내용은 화학적 라이브러리가 제조된 날짜를 확인하거나, 또는 특정한 화합물의 화학적 합성에서의 단계를 확인하거나, 또는 프라이머 어닐링 서열로서의 역할을 하는 핵산을 배제할 수 있다.
특정한 DNA 바코드 모듈에 대한 서열분석 프라이머의 전용. 본 개시내용은 DNA 바코드 모듈 및 1개 이상의 서열분석 프라이머 어닐링 부위를 함유하는 DNA 바코드를 제공한다. 각각의 DNA 바코드 모듈은 그 자신의 전용 서열분석 프라이머 결합 부위를 가질 수 있다. 대안적으로, 비드-결합된 DNA 바코드 상에 존재할 수 있는 바와 같이, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 연속 DNA 바코드 모듈을 서열분석하기 위해 1개의 특정한 서열분석 프라이머 결합 부위가 사용될 수 있다.
하기는 각각의 DNA 바코드 모듈이 그 자신의 전용 서열분석 프라이머 결합 부위를 갖는 상황을 기재한다. 본 개시내용은 DNA 서열분석 프라이머에 결합할 수 있는 프라이머 결합 부위를 포함하는 비드-결합된 연쇄된 바코드를 제공하며, 여기서 상기 프라이머 결합 부위는 제1 DNA 바코드 모듈, 제2 DNA 바코드 모듈, 제3 DNA 바코드 모듈, 제4 DNA 바코드 모듈, 제5 DNA 바코드 모듈, 및 제6 DNA 바코드 모듈 중 1개 이상의 서열분석을 지시할 수 있고, 여기서 프라이머 결합 부위는 제1 DNA 바코드 모듈과 프라이머 결합 부위 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제1 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제2 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제3 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제4 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제5 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치하거나, 또는 사이에 다른 DNA 바코드 모듈이 없이 제6 DNA 바코드 모듈의 3-프라임에 위치한다.
코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 상보적인 서열. 본 개시내용은 상기 또는 본원의 다른 곳에 개시된 코딩 서열 중 어느 하나, 그의 임의의 조합 또는 모두를 포괄할 수 있다. 배제적 실시양태에서, 상기 또는 본원의 다른 곳에 개시된 코딩 서열 중 어느 하나, 그의 임의의 조합 또는 모두가 배제될 수 있다. 또한, 상기 또는 본원의 다른 곳에 기재된 코딩 서열 중 어느 하나, 그의 임의의 조합 또는 모두를 코딩하는 이중 가닥 핵산이 포함될 수 있거나 또는 배제될 수 있다.
직교형 DNA 바코드 (각각의 DNA 바코드 모듈은 비드 상의 별개의 위치에 부착됨)
직교형 비드의 합성. 직교 합성에서, 각각의 DNA 모듈은 비드 상의 별개의 부위에 공유 부착되고, 그 결과 전체 DNA 바코드가 복수의 DNA 모듈에 의해 기여된다. DNA 바코드가 직교 구조를 갖는 경우에, DNA 바코드 모듈 중 어느 것도 서로 부착되지 않는다 -- 대신 각각의 및 모든 DNA 바코드 분자는 특정한 DNA 바코드 모듈에 전용되는 그 자신의 비드-부착 부위를 갖는다.
각각의 DNA 바코드 모듈에 대한 합성 단계 번호를 확인하는 핵산. 실시양태에서, 직교 DNA 바코드는 화합물 합성의 제1 단계를 확인하는 짧은 핵산을 포함한다. 이러한 실시양태의 경우, 제1 화학적 단량체 및 제1 DNA 바코드 모듈의 병행 부착으로, 제1 DNA 바코드 모듈은 실제로 [제1 DNA 바코드 모듈]에 연결된 2개의 핵산 ["단계 1"을 의미하는 짧은 핵산]의 이러한 복합체 형태를 취한다. 이러한 복합체의 모든 뉴클레오티드는 서로 인-프레임이고, 서열분석 검정에서 판독될 수 있지만, 제1 짧은 핵산은 임의로 스페이서 핵산에 의해 제1 DNA 바코드 모듈에 부착될 수 있다.
하기는 직교 DNA 바코드의 상기 설명을 계속한다. 직교 DNA 바코드는 화합물 합성의 제2 단계를 확인하는 짧은 핵산을 포함한다. 이러한 실시양태의 경우, 제2 화학적 단량체 및 제2 DNA 바코드 모듈의 병행 부착으로, 제2 DNA 바코드 모듈은 실제로 [제2 DNA 바코드 모듈]에 연결된 2개의 핵산 ["단계 2"를 의미하는 짧은 핵산]의 이러한 복합체 형태를 취한다. 이러한 복합체의 모든 뉴클레오티드는 서로 인-프레임이고, 서열분석 검정에서 판독될 수 있지만, 제2 짧은 핵산은 임의로 스페이서 핵산에 의해 제2 DNA 바코드 모듈에 부착될 수 있다.
상기 기재된 방법은 임의의 주어진 비드에 대해 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 및 마지막까지의 DNA 바코드 모듈 및 마지막까지의 화학적 단량체에 대해 반복된다. 상기 방법은 비드-결합된 DNA 바코드 및 화학적 화합물을 생성하기 위해 분할-및-풀 합성을 사용할 때 따를 수 있다.
직교 구조는 연쇄된 구조에 비해 하기 이점을 제공한다. 연쇄된 합성 (모든 DNA 바코드 모듈이 하나의 연속 중합체로 서로 부착됨)에서, 임의의 중간 커플링 단계의 합성 달성의 실패가 최종적으로 완성될 연쇄된 DNA 바코드의 의미를 훼손할 수 있다는 것은 사실이다. 대조적으로, 직교 합성 (각각의 및 모든 DNA 바코드 모듈이 비드 상의 전용 부위에 부착됨)에서, 임의의 DNA 바코드 모듈의 부착 실패는 단지 비드 상의 비어있는 부착 부위만을 생성할 것이고, 임의의 다른 부착된 DNA 바코드 모듈의 의미를 훼손하지는 않을 것이다. 바람직한 실시양태에서, 각각의 부착된 DNA 바코드 모듈은 부착된 제2 핵산을 포함하며, 여기서 이 제2 핵산은 단계 (DNA 바코드 및 화학적 화합물의 병행 합성 동안의 단계)를 확인한다.
직교 합성을 위해, 비드 상의 모든 부착 부위 (성장하는 화학적 라이브러리 구성원을 부착시키기 위한 부위)가 소진되는 것이 허용된다. 그러나, 직교 합성을 위해, 화학 반응은 비드 상의 부착 부위의 전체 집단이 많은 DNA 바코드 모듈 중 제1 모듈의 부착과 함께 단지 부분적으로 소진되도록 설계될 필요가 있다. 하기는 직교 바코드의 화학적 합성 동안 부위 소진에 대한 임의적인 제한을 제공한다. 비-변형된 비드에 대해, DNA 바코드 모듈을 부착시키기 위해 이용가능한 부위의 총수는 100%이다.
직교-구성된 비드의 합성에서, 주어진 비드 상의 부착 부위의 소진 정도 (제1 DNA 바코드에 관하여). 하기는 제1 DNA 바코드 모듈을 부착시키는 것에 관한 것이다. 실시양태에서, 제1 DNA 바코드 모듈이 부착되면, 비드 상의 DNA 바코드 부착 부위의 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%가 소진된다. 다른 실시양태에서, 비드 상의 DNA 바코드 부착 부위의 약 2% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 20% 미만, 약 30% 미만, 약 40% 미만 또는 약 50% 미만이 소진된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 DNA 바코드 모듈이 부착되면, DNA 바코드 부착 부위의 2-4%, 2-6%, 2-8%, 2-10%, 2-12%, 2-14%, 2-16%, 2-18%, 2-20%, 10-20%, 10-25%, 10-30%, 10-35%, 10-40%가 소진된다.
제한에 관하여, 특정한 DNA 바코드를 구성하는 마지막 DNA 바코드 모듈을 부착시키면, 부위의 20% 미만이 소진되고, 부위의 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만, 95% 미만 또는 98% 미만이 소진된다.
배제적 실시양태는 임의의 상기 값 또는 범위에 매치되는 비드 또는 방법을 배제할 수 있다. 또한, 배제적 실시양태는 임의의 상기 값 또는 범위에 매치되지 못하는 비드 또는 방법을 배제할 수 있다.
하기는 각각 DNA 바코드인 1개 이상의 핵산을 포함하는 중합체, 뿐만 아니라 2개 이상의 핵산을 포함하는 중합체에 관한 것이며, 여기서 핵산의 일부는 프라이머-어닐링 부위로서 또는 스페이서로서의 역할을 하는 것과 같이 생화학적 기능을 갖고, 다른 핵산은 정보 기능을 갖고 DNA 바코드이다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 DNA 가교제, 예컨대 프소랄렌을 포함하는 DNA 바코드를 배제할 수 있다. 또한, DNA 바코드 모듈보다 더 높은 용융 온도 (또는 더 낮은 용융 온도)를 갖는 프라이머 결합 영역을 갖는 DNA 바코드가 배제될 수 있다. 이 온도는 단지 "더 높은" 또는 "더 낮은" 온도일 수 있거나, 또는 적어도 2℃ 더 높거나, 적어도 4℃ 더 높거나, 적어도 6℃ 더 높거나, 적어도 8℃ 더 높거나, 또는 적어도 2℃ 더 낮거나, 적어도 4℃ 더 낮거나, 적어도 6℃ 더 낮거나, 적어도 8℃ 더 낮을 수 있다.
또한, DNA 리가제를 사용하는 DNA 바코드의 제조 방법이 배제될 수 있다. 또한, 헤어핀 (ssDNA가 루프로 구부러져, ssDNA의 한 부분이 동일한 ssDNA의 또 다른 부분과 혼성화되도록 함)을 포함하는 DNA 바코드 및 그의 제조 방법이 배제될 수 있다. 추가적으로, 핵산 헤어핀이, 예를 들어 화학적 링커로 공유 폐쇄된 것인, 핵산 헤어핀을 갖는 조성물이 배제될 수 있다. 또한, "헤드피스"에 직접적으로 또는 "헤드피스"에 간접적으로 (DNA 바코드와 헤드피스 사이에 존재하는 1개 이상의 화학물질에 대한 공유 결합에 의해 간접적으로) 공유 연결된 DNA 바코드가 배제될 수 있다.
다른 배제적 실시양태에서, 완성된 DNA 바코드가 임의의 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하는 것이 아니라 단지 단일 가닥 DNA (ssDNA)만을 포함하는 것인 비드-결합된 DNA 바코드가 배제될 수 있다.
직교-구성된 비드의 합성에서, 주어진 비드 상의 부착 부위의 소진 정도 (제2 DNA 바코드에 관하여). 하기는 제2 DNA 바코드 모듈을 부착시키는 것에 관한 것이다. 실시양태에서, 제2 DNA 바코드 모듈이 부착되면 (직교 구성된 비드의 생성을 위해), 비드 상의 남아있는 유리 DNA 바코드 부착 부위의 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%가 소진된다. 다른 실시양태에서, 비드 상의 남아있는 유리 DNA 바코드 부착 부위의 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 20% 미만, 약 30% 미만, 약 40% 미만 또는 약 50% 미만이 소진된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 DNA 바코드 모듈이 부착되면, 남아있는 유리 DNA 바코드 부착 부위의 2-4%, 2-6%, 2-8%, 2-10%, 2-12%, 2-14%, 2-16%, 2-18%, 2-20%, 10-20%, 10-25%, 10-30%, 10-35%, 10-40%가 소진된다.
배제적 실시양태는 임의의 상기 값 또는 범위에 매치되는 비드 또는 방법을 배제할 수 있다. 또한, 배제적 실시양태는 임의의 상기 값 또는 범위에 매치되지 못하는 비드 또는 방법을 배제할 수 있다.
상기 실시양태, 뿐만 아니라 상기 배제적 실시양태는 또한, 제3 DNA 모듈 바코드를 부착시키거나 또는 제4 DNA 모듈 바코드를 부착시키거나 또는 제5 DNA 바코드 모듈을 부착시키는 방법 등에 적용될 수 있다.
연쇄형 DNA 바코드 (모든 DNA 바코드 모듈은 하나의 쇄 또는 중합체에 존재하며, 여기서 전체 쇄 또는 중합체는 비드 상의 하나의 위치에 부착됨).
비드-결합된 연쇄형 DNA 바코드의 합성. 본 개시내용은 비드-결합된 연쇄형 DNA 바코드를 제공하며, 여기서 비드는 복수의 연쇄형 DNA 바코드를 함유하고, 여기서 대부분의 또는 거의 모든 복수의 연쇄형 DNA 바코드는 본질적으로 동일한 구조를 갖는다. 연쇄형 DNA 바코드는 1개 이상의 DNA 바코드 모듈을 함유할 수 있으며, 여기서 전체 DNA 바코드를 따라 이들 DNA 바코드 모듈의 순서 (비드-부착 말단에서 원위 말단으로)는 비드-결합된 연쇄형 DNA 바코드가 합성되는 시간과 동일한 순서를 취한다. 또한, 전체 DNA 바코드를 따라 이들 DNA 바코드 모듈의 순서는 상응하는 화학적 라이브러리 단량체가 성장하는 비드-결합된 화합물에 커플링되는 시간과 동일한 순서를 취한다.
연쇄형 DNA 바코드는 전체 연쇄형 DNA 바코드를 비드에 커플링시키기 위해 사용되는 링커를 이 순서로 포함할 수 있다. 또한, 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈 및 제3 어닐링 부위를 이 순서로 포함할 수 있다.
비드-결합된 DNA 바코드에서 프라이머 혼성화 부위를 서열분석하는 한 순서. 서열분석 프라이머 혼성화 부위 실시양태에서, 연쇄형 DNA 바코드는 링커, 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 어닐링 부위, 제1 서열분석 프라이머 결합 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 어닐링 부위, 제2 서열분석 프라이머 결합 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 어닐링 부위 및 제3 서열분석 프라이머 결합 부위 등을 이 순서로 포함할 수 있다.
비드-결합된 DNA 바코드에서 발생하는 바와 같은 서열분석 프라이머 혼성화 부위의 또 다른 순서. 또 다른 서열분석 프라이머 혼성화 부위 실시양태에서, 연쇄형 DNA 바코드는 링커, 제1 DNA 바코드 모듈, 제1 서열분석 프라이머 결합 부위, 제1 어닐링 부위, 제2 DNA 바코드 모듈, 제2 서열분석 프라이머 결합 부위, 제2 어닐링 부위, 제3 DNA 바코드 모듈, 제3 서열분석 프라이머 결합 부위 및 제3 어닐링 부위 등을 이 순서로 포함할 수 있다.
용어 "어닐링 부위". 용어 "어닐링 부위"는 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)의 일부인 어닐링 부위를 지칭하는 것으로, 및 또한 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드 상에 존재하는 상응하는 비드-결합된 어닐링 부위를 지칭하는 것으로 사용된다. 통상의 기술자는 스플린트 올리고 상의 "어닐링 부위"가 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드 상의 상응하는 "어닐링 부위"와 동일한 DNA 서열을 보유하지 않는다는 것을 이해한다. 다시 말해서, 통상의 기술자는 하나의 서열이 다른 서열에 대해 상보적이라는 것을 이해한다. 따라서, 본원에서의 설명의 경우, 어닐링 부위 둘 다가 동일한 명칭을 갖는 것은 대수롭지 않다. 다시 말해서, 스플린트 올리고 상의 제2 어닐링 부위가 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드 상의 제2 어닐링 부위에 혼성화하는 것으로서 개시되는 것은 대수롭지 않다.
블록 합성. 대안적 실시양태에서, 성장하는 화합물 및 성장하는 DNA 바코드 모듈 서열은 블록으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 2-화학적 라이브러리 단위로 이루어진 블록은 상응하는 2-DNA 바코드 모듈로 이루어진 블록의 부착과 병행하여 비드에 부착될 수 있다. 유사하게, 3-화학적 라이브러리 단위로 이루어진 블록은 상응하는 3-DNA 바코드로 이루어진 블록의 부착과 병행하여 비드에 부착될 수 있다. 4개의 블록, 5개의 블록, 6개의 블록, 7개의 블록, 8개의 블록, 9개의 블록, 10개의 블록 등을 수반하는 블록 합성이 또한 제공된다. 이들 블록 전달 실시양태 각각은 또한 본 개시내용에서 배제될 수 있다. DNA 바코드 단량체의 블록식 전달은 DNA 바코드 단량체의 각각의 연속 블록을 수용하기 위한 고유한 부착 지점을 사용하여 직교로 수행될 수 있다. 대안적으로, DNA 바코드 단량체의 블록식 전달을 수행하여 콘카테머 구조를 생성할 수 있다 (모든 DNA 바코드 모듈은 단지 1개의 연속 선형 중합체로서 발생함).
또한, 비드-결합된 DNA 바코드 및 비드-결합된 화합물의 병행 분할-및-풀 합성 동안, 합성은 블록으로 이루어질 수 있다. 블록은 2개 이상의 화학적 라이브러리 단량체의 형태를 취할 수 있고, 블록은 2개 이상의 DNA 바코드 모듈의 형태를 취할 수 있다.
분할-및-풀 합성의 위치. 분할-및-풀 합성은 비드-결합된 화합물 및 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드의 병행 합성에 사용될 수 있다. 또한, 분할-및-풀 합성은 비드-결합된 화합물 및 비드-결합된 직교 DNA 바코드의 병행 합성에 사용될 수 있다. 연쇄된 DNA 바코드는 "스플린트 올리고" 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 연쇄된 DNA 바코드는 클릭 화학에 의해 제조될 수 있다. 또한, "스플린트 올리고" 방법 및 클릭 화학의 조합이 사용될 수 있다. 분할-및-풀 합성은 96 웰 플레이트에서 이루어질 수 있으며, 여기서 각각의 웰은 0.25 마이크로미터 필터로 제조된 바닥을 갖는다. 정상 중력 조건 하에, 수용액은 이 필터를 통해 유동하지 않는다. 그러나, 모든 96 웰로부터 임의의 수용액을 제거하기 위해, 예를 들어 제1 수용액을 제2 수용액으로 대체할 필요가 있는 경우, 흡인을 적용할 수 있다. 이 흡인 방법은 비드가 제1 세트의 시약에 노출될 때 또는 제1 세트의 시약이 헹구어질 필요가 있을 때 또는 제1 세트의 시약이 제2 세트의 시약으로 대체될 필요가 있을 때 사용된다. 매니폴드를 사용하여 96 웰 플레이트를 유지하고 (레스프렙 VM-96 매니폴드), 펌프를 사용하여 모든 필터의 바닥으로부터 유체를 인출할 수 있다 (BUCHI Vac V-500 펌프). 필터 바닥을 갖는 96 웰 플레이트는 아크로프렙 어드밴스 96 웰, 350 uL, 0.45 um, REF 8048 (폴 코포레이션(Pall Corp.), 멀티-웰 플레이트, 미시간주 앤 아버)이었다.
프라이머 어닐링 부위로부터 DNA 바코드 모듈까지의 거리. 비드-결합된 DNA 바코드의 서열분석 목적을 위해, 즉, DNA 바코드를 형성하는 모든 DNA 바코드 모듈, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위인 제1 핵산 및 DNA 바코드 모듈인 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열분석 목적를 위해, 제1 핵산은 제2 핵산의 바로 상류에 있을 수 있다. 대안적으로, 제1 핵산은 제2 핵산의 상류에 있을 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 핵산은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 뉴클레오티드만큼 또는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15개의 뉴클레오티드만큼 서로 분리된다. 분리는 단지 스페이서로서의 역할을 하는 핵산에 의한 분리일 수 있거나, 또는 대안적으로, 분리는 정보, 예컨대 유기 합성의 다단계 경로에서의 단계 번호 또는 화학적 화합물의 부류의 명칭 또는 비드-결합된 화합물에 의해 치료가능할 수 있는 질환 또는 날짜 또는 로트 번호 등을 코딩하는 제3 핵산에 의한 분리일 수 있다.
클릭 화학을 사용하는 비드-결합된 연쇄된 DNA 바코드의 합성
클릭 화학은 DNA 바코드의 단계별 합성에 사용될 수 있다. 여기서, 비드에 직접 제1 DNA 바코드 모듈이 커플링될 수 있거나, 또는 비드-결합된 링커에 제1 DNA 바코드 모듈이 커플링될 수 있다.
또한, 제1 서열분석 프라이머 결합 부위인 제2 핵산에 부착된 제1 DNA 바코드 모듈인 제1 핵산의 형태를 취하는 폴리뉴클레오티드가 커플링될 수 있다. 이 서열분석 프라이머 결합 부위는 작업자가 제1 DNA 바코드 모듈의 서열을 결정할 수 있도록 한다.
또 다른 예를 제공하면, 비드-결합된 제1 DNA 바코드 모듈에 직접 제2 DNA 바코드 모듈이 커플링될 수 있다. 대안적으로, 제2 서열분석 프라이머 결합 부위인 제2 핵산에 부착된 제2 DNA 바코드 모듈인 제1 핵산의 형태를 취하는 폴리뉴클레오티드가 커플링될 수 있다. 이 서열분석 프라이머 결합 부위는 작업자가 제2 DNA 바코드 모듈의 서열을 결정할 수 있도록 한다. 제1 DNA 바코드 모듈에 대한 번역-초과가 존재한다면, 이들 DNA 바코드 모듈 둘 다의 서열이 결정될 수 있다.
또 다른 예를 제공하면, 제1 DNA 바코드 모듈인 제1 핵산 및 DNA 바코드 및 화합물의 다단계 병행 합성에서의 단계를 확인하는 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 커플링될 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 제2 핵산은 분할-및-풀 합성에 의해 제조되는 화합물의 일반적 부류를 확인할 수 있다. 또한, 또는 대안적으로, 제2 핵산은 스크리닝될 화합물에 의해 치료될 질환을 확인할 수 있다. 또한, 제2 핵산은 화학자의 날짜 또는 명칭 등을 확인할 수 있다.
DNA 바코드를 합성하기 위한 바람직한 방법이 하기 제시되며, 여기서 각각의 DNA 바코드 모듈의 점진적 부착에 동일한 반응 주기가 사용된다.
단계 1. TCO 기가 부착된 비드를 제공한다. 실제 실시에서, 비드는 수백개 또는 수천개의 동일하게 부착된 TCO 기를 가질 것이며, 여기서 각각의 TCO 기는 비드 상의 상이한 부위에 부착된다. 또한, 실제 실시에서, 다수의 비드는 분할-및-풀 방법의 사용과 함께 클릭 화학에 의해 동시에 변형될 것이다.
단계 2. [테트라진]-[제1 DNA 바코드 모듈]-[아지드]를 비드에 첨가하고, TCO 기가 테트라진 기와 축합되게 한다. 결과는 하기 구축물이다: BEAD-TCO-테트라진-제1 DNA 바코드 모듈-아지드. 실제 실시에서, 이 구축물은 임의의 TCO 또는 테트라진을 포함하지 않지만, 대신 TCO가 테트라진과 축합될 때 생성되는 축합 생성물을 갖는다.
단계 3. 임의적인 세척.
단계 4. DBCO-TCO를 첨가하여 아지드를 캡핑하고 TCO 말단을 생성한다. 결과는 하기 구조이다:
BEAD-TCO-테트라진-제1 DNA 바코드 모듈-아지드-DBCO-TCO
단계 5. 임의적인 세척.
단계 6. 제2 DNA 바코드 모듈을 부착시키는 하기 시약을 첨가한다. 부착은 성장하는 DNA 바코드의 원위 말단에 대한 것이다. 시약은
비드에 대한 [테트라진]-[제2 DNA 바코드 모듈]-[아지드]이고, 이는 TCO 기가 테트라진 기와 축합되게 한다. 결과는 하기 구축물이다:
BEAD-TCO-테트라진-제1 DNA 바코드 모듈-아지드-DBCO-TCO-[테트라진]-[제2 DNA 바코드 모듈]-[아지드]
상기 스킴은 점점 더 많은 DNA 바코드 모듈의 단계적 첨가를 위한 단계의 주기를 포함하며, 여기서 이들 첨가는 점점 더 많은 화학적 단량체의 첨가와 병행된다. 다른 곳에 언급된 바와 같이, 이러한 "병행" 합성은 화학적 단량체를 부착시킨 후 그 단량체를 확인하는 DNA 바코드 모듈을 부착시키거나, 또는 대안적으로, DNA 바코드 모듈을 부착시킨 후 화학적 단량체를 부착시켜 그 특정한 화학적 단량체에 의해 확인되도록 하는 것을 수반할 수 있다.
DNA 바코드의 클릭-화학 합성을 위한 화합물
도 17은 DNA 바코드 모듈 및 궁극적으로 전체 DNA 바코드의 합성 동안 데옥시시티딘 잔기 (dC)를 연결하는 데 적합한 화합물의 화학적 합성을 개시한다. 출발 물질은 N4-아세틸-2'-데옥시-5'-O-DMT 시티딘이다. 약어 "DMT"는 4,4-디메톡시트리틸을 나타낸다. 유기 합성의 이러한 다단계 경로의 최종 생성물은 시토신 모이어티, 트리포스페이트 기, 및 리보스 기의 3'-위치에 부착된 프로파르길 기를 보유한다. 프로파르길 기는 클릭 화학에 사용되며, 여기서 이는 아지드 기와 축합되어 공유 결합을 생성한다. 축합 후, 결과는 잔류 화학물질 (핵산에 자연적으로 존재하지 않음)이 수행된 클릭 화학으로부터 "반흔"으로서 발생한다는 것이다. 클릭 화학에 의해 제조된 DNA 바코드의 합성에 의한 서열분석에 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제가 이용가능하며, 여기서 DNA 폴리머라제는 반흔에 걸쳐 이동할 수 있고, 여기서 반흔은 서열분석 오류를 유발하지 않는다. TBAI는 테트라부틸 암모늄 아이오다이드이다.
연쇄된 형상의 DNA 바코드의 합성
하기 설명에서, DNA 바코드 모듈은 DNA 바코드를 생성하기 위해 일렬로 조립된다. 그러나, 하기 제시된 본문 내 다이어그램에서, 본문 내 다이어그램을 페이지 상에 맞게 만들기 위해 용어 "DNA 바코드"가 "DNA 바코드 모듈" 대신 사용된다. 도 7은 본원에 제시된 것과 동일한 단계를 예시하지만, 비드의 다이어그램과 같은 추가의 세부사항을 갖는다. 각각의 추가의 DNA 바코드 모듈을 첨가하기 위해 반복된 반응 서열이 사용될 수 있다.
DNA 헤어핀을 코딩하는 말단 핵산을 포함하는 DNA 바코드를 생성하는 옵션. 이는 3-프라임 말단에서, 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위, 염기 쌍을 형성하지 않은 약 4종의 염기 형태를 취하는 굴곡부, 및 서열분석 프라이머 어닐링 부위 주위에서 구부러져 그와 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열분석 프라이머를 보유하는 핵산을 포함하는 DNA 바코드에 관한 것이다. 반복하면, 서열분석 프라이머는 서열분석 프라이머 어닐링 부위에 어닐링되며, 여기서 실제 서열분석 반응은 어닐링된 서열분석 프라이머의 3'-말단에서 시작된다.
DNA 바코드의 합성에서 최종 단계를 수행할 때 및 최종 DNA 바코드 모듈이 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드에 커플링될 때, "스플린트 올리고"는 DNA 헤어핀을 포괄하는 서열을 포함할 수 있다 (DNA 헤어핀은 서열분석 프라이머에 대한 어닐링 부위, 서로 또는 염기의 임의의 근처 서열과 염기 쌍을 형성하지 않는 여러 뉴클레오티드 및 서열분석 프라이머를 이 순서로 포함함). "스플린트 올리고"를 어닐링한 후, 이어서 DNA 폴리머라제 및 dNTP를 첨가하며, 여기서 중합은 성장하는 DNA 바코드의 3'-말단에서 일어나고, 여기서 주형으로서 스플린트 올리고를 사용하여 하기 순서대로 중합된다: (1) 서열분석 프라이머를 위한 어닐링 부위, (2) 서로 염기 쌍을 형성하지 않는 4 또는 5개의 데옥시리보뉴클레오티드 형태를 취하는 헤어핀 내의 굴곡부 및 (3) 서열분석 프라이머.
헤어핀 서열분석 프라이머의 3'-말단의 가역적 종결인자 기. 본 개시내용은 뉴클레오티드/가역적 종결인자 기의 사전-형성된 복합체를 어닐링된 서열분석 프라이머의 3'-말단에 부착시키기 위한 시약, 조성물, 및 방법을 제공한다. 가역적 종결인자 기는 헤어핀 서열분석 프라이머의 임의적인 성분이며, 이는 비드-결합된 DNA 바코드의 일부일 것이다.
단계 1. 시작 시에, 본 발명자들은 피코웰 내에 위치하는 비드를 가지며, 여기서 비드는 커플링된 폴리뉴클레오티드를 보유하고, 여기서 폴리뉴클레오티드의 5'-말단은 임의로 링커에 의해 비드에 커플링된다. 도 7은 비드-결합된 폴리뉴클레오티드가 제1 DNA 바코드 및 제1 어닐링 부위를 포함한다는 것을 보여준다. 링커는 핵산으로 제조될 수 있거나 또는 일부 다른 화학적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 소수성이고, 바람직하게는 링커는 비드-결합된 DNA 바코드를 소수성 폴리스티렌 비드, 예를 들어 텐타겔® 비드로부터 분리한다.
기록의 편의를 위해, 비드-결합된 DNA 바코드의 일부인 제1 어닐링 부위 및 가용성 "스플린트 올리고"의 일부인 제1 어닐링 부위는 이들이 동일한 염기 서열을 갖지 않더라도 둘 다 "제1 어닐링 부위"로 불린다 (대신, 염기 서열은 서로 상보적이며, 그 결과 스플린트 올리고가 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드 상의 제1 어닐링 부위에 혼성화할 수 있고, 이에 의해 주형으로서의 역할을 하여 DNA 폴리머라제가 스플린트 올리고 상에 있는 것을 카피함으로써 비드-결합된 DNA 바코드를 연장시킴).
또한, 기록의 편의를 위해, 비드-결합된 DNA 바코드의 일부인 제2 어닐링 부위 및 가용성 "스플린트 올리고"의 일부인 제2 어닐링 부위는 이들이 동일한 서열을 갖지 않더라도 (그러나 대신 상보적 염기를 가짐) 둘 다 "제2 어닐링 부위"로 불린다.
비드-결합된 성장하는 DNA 바코드는 5'-말단에서 3'-말단으로 하기 순서로 핵산을 함유할 수 있다:
비드- / 제1 DNA 바코드 / 제1 어닐링 부위 /
대안적으로, 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드는 5'-말단에서 3'-말단으로 단계 번호를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드는 하기 순서로 핵산을 갖는다:
비드- / 제1 DNA 바코드 / 단계 번호를 코딩하는 핵산 / 제1 어닐링 부위 /
대안적으로, 비드-결합된 성장 DNA 바코드는 하기 제시된 바와 같은 기능적 핵산 (서열분석 프라이머 어닐링 부위)인 핵산을 포함할 수 있다:
비드- / 제1 DNA 바코드 / 서열분석 프라이머 어닐링 부위 / 제1 어닐링 부위 /
비드에 대한 DNA 바코드의 커플링을 매개하는 임의적인 링커는 이들 본문 내 다이어그램에 제시되지 않는다. 링커는 핵산의 형태를 취할 수 있거나 또는 일부 다른 유기 화학물질로 제조될 수 있다.
단계 2. 가용성 스플린트 올리고뉴클레오티드 (스플린트 올리고)를 첨가하며, 여기서 이러한 스플린트 올리고는 제1 어닐링 부위 및 제2 DNA 바코드 모듈 및 제2 어닐링 부위를 포함한다.
도 7은 또한 혼성화된 스플린트 올리고가 주형으로서 사용되는 단계를 예시하며, 여기서 DNA 폴리머라제는 제2 DNA 바코드 모듈 및 제2 어닐링 부위의 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드에 대한 부착을 촉매한다. 도 7은 DNA 폴리머라제가 스플린트 올리고를 주형으로서 사용하여 비드-결합된 DNA 바코드를 약간 더 길게 성장시키도록 하는 (제2 DNA 바코드 및 제2 어닐링 부위의 공유 부착에 의해 성장함) 효소 생성물을 보여준다. 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드에 혼성화된 스플린트 올리고의 복합체가 본문 바로 아래에 제시된다:
비드- / 제1 DNA 바코드 / 제1 어닐링 부위 /
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
도 7에 제시된 일부 정보를 반복하기 위해, 스플린트 올리고가 바로 아래에 제시된다:
"제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위"
단계 3. DNA 폴리머라제 및 dNTP를 첨가하여 비드-결합된 DNA 바코드를 연장시킨다. 스플린트 올리고가 여전히 혼성화된 비드-결합된 성장하는 DNA 바코드가 하기 제시되며, 여기서 비드-결합된 성장하는 바코드는 이전보다 더 긴데, 이는 "제2 DNA 바코드 모듈"인 핵산 및 "제2 어닐링 부위"인 핵산이 그에 부착되기 때문이다. 도 7은 또한 이 단계를 예시한다. 스플린트 올리고는 비드-결합된 성장 바코드 아래에 제시된다:
비드- / 제1 DNA 바코드 / 제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
단계 4. 스플린트 올리고를 세척해낸다. 스플린트 올리고는 가열에 의해, 즉, 전체 피코웰 플레이트를, 예를 들어 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃로 약 10분 동안 가열함으로써, 또는 대안적으로, 피코웰 어레이에 묽은 NaOH를 첨가한 다음 중화시킴으로써 비드-결합된 성장하는 바코드로부터 해리되도록 촉진될 수 있다.
단계 5. 제2 스플린트 올리고를 첨가하며, 이는 비드-결합된 성장하는 스플린트 올리고에 혼성화한 후, 제3 DNA 바코드 및 제3 어닐링 부위의 DNA 폴리머라제-촉매된 부착을 매개하기 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 가용성 시약인 이러한 제2 스플린트 올리고가 하기 제시된다 (그러나, 이는 도 7에 제시되지 않음):
제2 어닐링 부위 / 제3 DNA 바코드 / 제3 어닐링 부위 /
단계 6. 이러한 올리고뉴클레오티드가 상응하는 비드-결합된 "제2 어닐링 부위"에 어닐링하도록 하고, DNA 폴리머라제가 비드-결합된 올리고뉴클레오티드를 연장시켜, "제3 DNA 바코드 / 제3 어닐링 부위 /에 대한 상보체를 함유하도록 한다.
단계 7. 제2 스플린트 올리고를 세척해낸다.
단계 4. 하기 스플린트 올리고를 첨가한다 (이러한 특정한 첨가는 도 7에 제시되지 않음):
제3 어닐링 부위 / 제4 DNA 바코드 / 제4 어닐링 부위 /
이 가용성 올리고뉴클레오티드는 비드-결합된 올리고뉴클레오티드의 "제3 어닐링 부위"에 어닐링할 수 있는 핵산을 갖는다. 어닐링되면, 4종의 dNTP와 함께 DNA 폴리머라제를 사용하고, 비드-결합된 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 또 다른 DNA 바코드 모듈 (제4 DNA 바코드)을 코딩하기 위해 사용한다. 상기 단계의 주기는 화학적 화합물의 라이브러리 및 회합된 DNA 바코드를 병행하여 생성하는 전체 분할-및-풀 절차 동안 반복되며, 여기서 각각의 DNA 바코드는 주어진 화합물과 회합된다 (여기서 각각의 DNA 바코드는 회합된 화합물의 화학적 합성의 이력에 대한 정보를 본 발명자들에게 제공함). 상기 단계의 주기는 화합물의 라이브러리의 화학적 합성이 완료되었을 때 정지된다. 완성된 비드-결합된 DNA 바코딩된 화학적 라이브러리를 사용하여, 이어서 비드를 피코웰 어레이의 피코웰 내로 분배할 수 있다.
각각의 비드에 대한 DNA 바코드는 또한 각각의 피코웰과 회합된 DNA 바코드를 구성한다. DNA 바코드는 비드-결합된 화합물의 확인을 가능하게 한다. 본 개시내용의 서열분석 방법은 비드가 여전히 피코웰 내부에 있는 동안 피코웰 내부에서 이루어진다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 서열분석 방법을 배제할 수 있고, 서열분석에 사용되는 임의의 시약을 배제할 수 있으며, 여기서 서열분석은 비드-결합된 DNA 주형에 대해 수행되지 않거나 또는 서열분석은 피코웰 내부에 위치하는 비드-결합된 DNA 주형에 대해 수행되지 않는다.
서열분석 프라이머를 위한 어닐링 부위. 한 실시양태에서, 완성된 DNA 바코드 내의 각각의 DNA 바코드 모듈은 그 자신의 서열분석 프라이머 어닐링 부위와 인 프레임으로 작동가능하게 연결되며, 따라서 작업자가 각각의 DNA 바코드 모듈에 대해 별개의 서열분석 절차를 수행할 수 있는 능력을 제공한다 (이러한 실시양태에서, 각각의 DNA 바코드 모듈은 또한 전체 DNA 바코드의 합성에서 단계를 확인하는 (코딩하는) 그 자신의 핵산과 작동가능하게 연결되는 것이 바람직함).
또 다른 실시양태에서, 각각의 DNA 바코드는 단지 1개의 서열분석 프라이머 어닐링 부위를 가지며, 여기서 이것은 비드-결합된 DNA 바코드의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치할 수 있고, 여기서 서열분석 프라이머 자체는 가용성이고, 피코웰에 첨가된 후, 서열분석 프라이머 어닐링 부위에 혼성화될 수 있다. 대안적으로, 서열분석 프라이머가 DNA 헤어핀의 일부인 경우에, 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하는 데 최종 단계에서 "스플린트 올리고"에 의해 이러한 DNA 헤어핀을 첨가한다. 도 7은 임의의 서열분석 프라이머에 대한 임의의 어닐링 부위를 보여주지 않는다.
핵산의 3'-말단을 통해 비드에 커플링된 핵산
본 발명에 개시된 다양한 실시양태는 DNA를 DNA의 5'-말단에 의해 비드에 커플링시키는 것에 관한 것이지만, 다른 실시양태에서, DNA, 예컨대 DNA 바코드 또는 DNA 태그는 그의 3'-말단에 의해 비드에 커플링될 수 있다. DNA의 3'-히드록실 기는 특정 화학적 합성 조건 (예를 들어, 미츠노부 변환) 하에 반응성일 수 있어, 3'-말단이 손상되고 연장, 라이게이션 또는 다른 단계에 참여할 수 없게 한다. 따라서, DNA 태그는 원치않는 화학 반응을 방지하고 DNA 바코드에 대한 손상을 방지하기 위해 그의 3'-말단을 통해 비드에 부착될 수 있다.
본 개시내용의 비드-결합된 DNA 바코드에 관한 배제적 실시양태. 연쇄된 DNA 바코드가 광절단가능한 링커에 의해 또는 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 것인 임의의 비드, 마이크로입자, 마이크로구체, 수지 또는 물질의 중합체 조성물이 배제될 수 있다.
하기: ( 1 ) 비드 상의 제1 위치에 커플링된 연쇄된 DNA 바코드, ( 2 ) 비드 상의 제2 위치에 커플링된 화합물 (여기서 제1 위치는 제2 위치와 동일하지 않음) 둘 다를 포함하지 않는 임의의 비드, 마이크로입자, 마이크로구체, 수지 또는 물질의 중합체 조성물이 배제될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 "화합물"은 복수의 화학적 라이브러리 단량체로 제조된다.
외부 표면 (또는 외부 표면들) 및 또한 내부 표면 (또는 내부 표면들 또는 내부 영역)을 갖지 않고, 비드가 비드에 커플링된 적어도 10,000개의 실질적으로 동일한 연쇄된 DNA 바코드를 포함하지 않고, 적어도 10,000개의 실질적으로 동일한 연쇄된 DNA 바코드의 적어도 90%가 외부 표면에 커플링된 것인 임의의 비드, 마이크로입자, 마이크로구체, 수지 또는 물질의 중합체 조성물이 배제될 수 있다. 다시 말해서, 커플링된 연쇄된 DNA 바코드의 적어도 90%가 외부 표면에 커플링되지 않은 것인 임의의 비드가 배제될 수 있다.
실질적으로 폴리아크릴아미드로 제조되거나 또는 임의의 폴리아크릴아미드를 함유하는 임의의 비드, 마이크로입자, 마이크로구체, 수지 또는 물질의 중합체 조성물이 배제될 수 있다.
프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하거나 또는 폴리A 영역을 함유하거나 또는 프로모터 및 또한 폴리A 영역을 함유하는 임의의 비드, 마이크로입자, 마이크로구체, 히드로겔, 수지 또는 물질의 중합체 조성물이 배제될 수 있다.
2개의 DNA 바코드 모듈을 갖는 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한 단지 1회 주기의 어닐링/중합만을 사용한 방법. 본 개시내용은 비드-결합된 DNA 바코드가 단지 1개의 어닐링/중합 단계를 포함하는 시스템, 시약 및 방법을 포괄한다. 이러한 실시양태는 하기 다이어그램에 의해 나타내어지며, 여기서 제1 다이어그램은 스플린트 올리고의 어닐링을 보여주고, 제2 다이어그램은 DNA 폴리머라제를 사용한 채움을 보여준다. 최종 결과는 2개의 DNA 바코드 모듈을 함유하는 비드-결합된 DNA 바코드이다. 이러한 특정한 절차에서, 비드-결합된 출발 물질은 임의로 링커 (그러나 바람직하게는 임의의 절단가능한 링커는 아님), 임의로 화학적 화합물의 확인 이외의 다른 정보를 코딩하는 핵산 및 임의로 기능적 핵산, 예컨대 서열분석 프라이머 또는 DNA 헤어핀을 포함할 수 있다. 2개의 다이어그램이 본문에 제시된다 (바로 하기 참조):
비드- / 제1 DNA 바코드 / 제1 어닐링 부위 /
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
비드- / 제1 DNA 바코드 / 제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 제1 어닐링 부위 / 제2 DNA 바코드 / 제2 어닐링 부위
3개의 DNA 바코드 모듈을 갖는 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한 2회 주기의 어닐링/중합을 사용한 방법. 본 개시내용은 2개의 상이한 스플린트 올리고 (제1 스플린트 올리고, 제2 스플린트 올리고)가 사용되는 비드-결합된 조성물, 시스템 및 방법을 포괄한다. 이 상황에서, 제1 스플린트 올리고는 구조: 제1 어닐링 부위/제2 DNA 바코드/제2 어닐링 부위를 포함하고, 제2 스플린트 올리고는 구조: 제2 어닐링 부위/제3 DNA 바코드/제3 어닐링 부위를 포함한다.
4개의 DNA 바코드 모듈을 갖는 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한, 3회 주기의 어닐링/중합을 사용한 방법. 본 개시내용은 3개의 상이한 스플린트 올리고 (제1 스플린트 올리고, 제2 스플린트 올리고, 제3 스플린트 올리고)가 사용되는 비드-결합된 조성물, 시스템 및 방법을 포괄한다. 이 상황에서, 제1 스플린트 올리고는 구조: 제1 어닐링 부위/제2 DNA 바코드/제2 어닐링 부위를 포함하고, 제2 스플린트 올리고는 구조: 제2 어닐링 부위/제3 DNA 바코드/제3 어닐링 부위를 포함하고, 제3 스플린트 올리고는 구조: 제3 어닐링 부위/제4 DNA 바코드/제4 어닐링 부위를 포함한다.
5개의 DNA 바코드 모듈을 갖는 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한 4회 주기의 어닐링/중합을 사용한 방법. 본 개시내용은 4개의 상이한 스플린트 올리고 (제1 스플린트 올리고, 제2 스플린트 올리고, 제3 스플린트 올리고, 제4 스플린트 올리고)가 사용되는 비드-결합된 조성물, 시스템 및 방법을 포괄한다. 이러한 상황에서, 제1 스플린트 올리고는 구조: 제1 어닐링 부위/제2 DNA 바코드/제2 어닐링 부위를 포함하고, 제2 스플린트 올리고는 구조: 제2 어닐링 부위/제3 DNA 바코드/제3 어닐링 부위를 포함하고, 제3 스플린트 올리고는 구조: 제3 어닐링 부위/제4 DNA 바코드/제4 어닐링 부위를 포함하고, 제4 스플린트 올리고는 구조: 제4 어닐링 부위/제5 DNA 바코드/제5 어닐링 부위를 포함한다.
복수의 DNA 바코드 모듈을 갖는 비드-결합된 DNA 바코드를 생성하기 위한 복수의 어닐링/중합 단계를 사용한 실시양태. 본 개시내용은 단지 1개의 스플린트 올리고 (2-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는, 단지 2개의 스플린트 올리고 (3-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는, 단지 3개의 스플린트 올리고 (4-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는, 단지 4개의 스플린트 올리고 (5-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는, 단지 5개의 스플린트 올리고 (6-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는, 단지 6개의 스플린트 올리고 (7-모듈 DNA 바코드를 제조함)를 사용하는 등의 연쇄된 바코드와 관련된 비드-결합된 조성물, 시스템 및 방법을 포괄한다.
적어도 1개의 스플린트 올리고, 적어도 2개의 스플린트 올리고, 적어도 3개의 스플린트 올리고, 적어도 4개의 스플린트 올리고, 적어도 5개의 스플린트 올리고, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 20개의 스플린트 올리고 또는 20개 미만, 15개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만의 스플린트 올리고를 사용하는 비드-결합된 조성물, 시스템 및 방법이 포괄된다. 이들 수는 스플린트 올리고 자체, 뿐만 아니라 스플린트 올리고를 첨가하는 단계의 수 및 또한 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드에 첨가되는 DNA 모듈의 넘버링을 지칭한다.
DNA 바코드에 대한 손상 감소
직교 DNA 바코드 (연쇄된 DNA 바코드 대신) 사용에 의한 손상 감소. 연쇄된 DNA 바코드 및 직교 DNA 바코드의 주제에 맞는 한 방식은 하나가 다른 것에 비해 갖는 이점을 주목하는 것이다. 연쇄된 바코딩에 비해 직교 바코딩의 이점은 하기와 같다. 성장하는 화학적 화합물의 각각의 단량체의 부착에서, 화학적 라이브러리를 생성하는 화학적 라이브러리 단량체 및 완성된 전장 DNA 바코드를 생성하는 DNA 바코드 모듈이 병행하여 부착된다.
연쇄된 바코딩에서, 임의의 주어진 모듈의 부착이 불완전하면 (모든 부착 부위가 필요한 모듈과 성공적으로 커플링되지는 않았음을 의미함), 완성된 바코드의 서열은 정확하지 않을 것이다. "정확하지 않다"이라는 언급은 사용자가 완성된 생성물이 완전하고 정확한 DNA 바코드였다고 가정한 경우, 불완전한 커플링으로 인해 덩어리가 누락되었음을 의미한다. 여기서 완성된 DNA 바코드 서열은 모든 DNA 모듈의 부착 실패로 인해 오류를 함유할 것이다. 대조적으로, 직교 바코딩에서, 각각의 개별 DNA 모듈은 비드 상의 그 자신의 고유한 부착 부위에 공유 결합된다. 그리고 DNA 모듈이 비드 상의 주어진 부위에 부착되면, 비드에 이미 커플링된 DNA 모듈에 추가의 DNA 모듈이 커플링될 필요가 없다.
가교-링커 사용에 의한 손상 감소. 본 개시내용은 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고, 부분적으로 합성된 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 각각의 DNA 바코드 모듈은, 성장하는 비드-결합된 DNA 바코드에 부착되기 전에, 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 이 dsDNA는 DNA 가교-링커, 예컨대 미토마이신-C로 처리된다. dsDNA 형태의 DNA 바코드의 합성이 완료된 후, 이 dsDNA는 ssDNA로 전환된다. dsDNA의 ssDNA로의 전환은, DNA 가닥 중 1개가 우라실 (U) 잔기를 갖고, 우라실 잔기의 위치에서의 DNA의 절단이 우라실-N-글리코시다제에 의해 촉매되는 경우에 수행될 수 있다 (2017년 9월 25일에 출원된 미국 일련 번호 62/562,905의 도 5 참조. 미국 일련 번호 62/562,905는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 상기는 비드-결합된 화학적 화합물을 제조하는 데 사용된 시약이 성장하는 DNA 바코드에 가하는 손상을 지칭한다.
DNA 바코드를 제조하기 위한 이중 가닥 DNA (dsDNA) 사용에 의한 손상 감소. 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고 부분적으로 합성된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 이중 가닥 DNA 형태의 DNA 바코드를 합성하는 것이며, 여기서 서로 부착되는 각각의 DNA 바코드 모듈은 dsDNA의 형태를 취하고, 각각의 2개의 가닥은 DNA 헤드피스에 의해 안정화된다. 완성된 DNA 바코드의 최종 서열분석을 위해, 가닥 중 하나를 DNA 헤드피스로부터 절단하고 제거한다. 상기는 비드-결합된 화학적 화합물 (여기서 이 화학적 화합물은 화학적 라이브러리의 구성원임)을 제조하는 데 사용된 시약이 성장하는 DNA 바코드에 가하는 손상을 지칭한다.
헤어핀 포함에 의한 손상 감소. 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 자기-조립하여 헤어핀을 형성하는 방식으로 DNA 바코드를 합성하는 것이며, 여기서 이 DNA 바코드는 자기-조립하여 헤어핀의 제1 갈래가 헤어핀의 제2 갈래에 어닐링한다.
합성될 DNA 바코드가 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 형태를 취하는 경우에, 용매, 예컨대 DCM, DMF 및 DMA는 DNA 바코드를 변성시킬 수 있다. 상기 방법 및 시약은 변성을 방지할 수 있다.
dsDNA의 밀봉된 말단 사용에 의한 손상 감소. 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키고 부분적으로 합성된 DNA 바코드에 대한 손상을 감소시키는 또 다른 방법은 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 사용하고, 7-aza-dATP 및 dGTP에 의해 이 dsDNA의 말단을 밀봉하는 것이다.
단백질성 용매 회피, 강산 및 강염기 회피, 강 환원제 및 산화제 회피에 의한 손상 감소. 데옥시리보핵산 (DNA)의 존재 (비드-결합된 DNA이든 또는 비드-결합되지 않은 DNA이든)에 상용성인 화학의 유형은 단백질성 용매의 부재, 강산성 조건의 회피, 강염기, 예컨대 t-부틸 리튬의 회피, 강한 환원제, 예컨대 수소화알루미늄리튬의 회피, DNA 염기와 반응하는 시약, 예컨대 일부 알킬 할라이드의 회피 및 일부 산화제의 회피를 요구할 수 있다 (문헌 [Luk and Sats (2014) DNA-Compatible Chemistry (Chapter 4) in A Handbook for DNA-Encoded Chemistry, 1st ed. John Wiley and Sons, Inc.] 참조).
다른 곳에 언급된 바와 같이, 용어 "DNA 바코드"는 화학적 화합물 그 전체를 확인하는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있는 반면, 대조적으로, "DNA 바코드 모듈"은 화학적 화합물을 구성하는 단량체 중 단 하나만을 지칭할 수 있다.
DNA-상용성 화학 사용에 의한 핵산에 대한 손상 감소. 사츠(Satz) 등은 비드-결합된 핵산에 상용성인 다양한 화학을 개시한다 (Satz et al. (2015) Bioconjugate Chemistry. 26:1623-1632, correction in Satz et al. (2016) Bioconjugate Chem. 27:2580-2580). 상기 문헌 [Satz et al.]에서의 설명이 DNA/화학적 라이브러리 구성원 접합체에 대해 수행되는 화학 반응에 관한 것이지만, 기재된 DNA-상용성 화학의 유형이 또한 관련되며, 여기서 유기 화학은 비드-결합된 화합물 및 비드-결합된 DNA를 함유하는 비드에 대해 수행될 것이다.
벤즈이미다졸 화합물, 이미다졸리디논 화합물, 퀴나졸리논 화합물, 이소인돌리논 화합물, 티아졸 화합물 및 이미다조피리딘 화합물의 형성을 위한 DNA-상용성 반응이 개시되어 있다 (문헌 [Satz et al., Table 1, entries 1-6] 참조).
또한, alloc 탈보호, BOC 탈보호, t-부틸 에스테르 가수분해, 메틸/에틸 에스테르 가수분해, 및 히드라진 및 라니 니켈을 사용한 니트로 환원을 포함하여 DNA-상용성 보호기가 개시되어 있다 (문헌 [Satz et al., Table 1, entries 7-11] 참조).
추가로, 시약을 DNA에 커플링시키는 방법이 개시되며, 여기서 커플링은 DNA에 이미 부착된 관능기에서 일어난다. 방법은 스즈키 커플링, 알킨과 아릴할라이드 사이의 소노가시라 커플링을 위한 최적화된 절차, 디메틸-1-디아조-2-옥소프로필포스포네이트를 사용하는 알데히드의 알킨으로의 전환, 정제된 알킨으로부터 직접 트리아졸 고리화첨가를 위한 신규 방법, 이소시아네이트 빌딩 블록과 아민 관능화된 DNA와의 반응을 위한 개선된 방법 (여기서 개선된 반응은 pH 9.4 완충제에서 이소시아네이트 시약으로 일어남)을 포함한다 (문헌 [Satz, et al., Table 1, entries 12-15] 참조).
시약을 DNA에 커플링시키는 추가의 방법이 개시되며, 여기서 커플링은 DNA에 이미 부착된 관능기에 대해 일어난다. 이들은 1급 아민이 DNA에 접합되는 방법, DNA-접합된 티오우레아를 형성하기 위한 최적화된 절차, 2급 아민을 알킬화하고 지방족 1급 아민을 비스-알킬화하는 방법, 아민-관능화된 DNA-접합체와 반응할 수 있는 빌딩 블록으로서 헤타릴할라이드를 사용하는 1급 아민 DNA-접합체의 모노알킬화 및 비티히 반응을 위한 방법을 포함한다 (문헌 [Satz et al., Table 1, entries 16-20] 참조).
DNA 복구 효소에 의한 손상된 DNA의 감소. 효소, DNA-손상 결합 단백질 및 헬리카제를 포함한 다양한 단백질이 DNA 손상을 복구하는 데 이용가능하다. 산화성 손상, 방사선-유도된 손상, UV 광-유도된 손상, 포름알데히드 부가물로부터의 손상 및 알킬 기 부가물의 형태를 취하는 손상을 복구할 수 있는 DNA 복구 단백질이 상업적으로 이용가능하다. 손상된 염기를 제거하는 (그러나 ssDNA 또는 dsDNA를 절단하지는 않는) 글리코시드 효소는 5-포르밀우라실, 데옥시우리딘 및 5-히드록시메틸우라실을 복구하는 데 이용가능하다. T4PDG는 피리미딘 이량체를 복구하는 데 이용가능하다. hNEIL1 뿐만 아니라 Fpg는 산화된 피리미딘, 산화된 퓨린, 아퓨린산 부위 및 아피리미딘산 부위를 복구하는 데 이용가능하다. EndoVIII는 산화된 피리미딘 및 아피리미딘산 부위를 복구하는 데 이용가능하다. EndoV는 미스매치를 복구하는 데 이용가능하다. HaaG는 알킬화된 퓨린을 복구하는 데 이용가능한 글리코실라제이다. DNA 복구 효소가 갭을 남기는 경우 (여기서 이중 가닥 DNA는 가닥 중 하나에서 1개 이상의 연속 데옥시리보뉴클레오티드가 누락된 갭을 가짐), 다양한 DNA 폴리머라제가 갭을 채우는 데 이용가능하다 (문헌 [Catalog (2018) New England BioLabs, Ipswich, MA] 참조).
다양한 DNA 복구 효소 및 DNA 복구 시스템이 포유동물, 효모 및 박테리아로부터 단리되었다. 이들은 뉴클레오티드 절제 복구 (NER), 직접 복구, 염기 절제 복구, 전사-커플링된 DNA 복구 및 재조합 복구를 매개하는 것을 포함한다. 가닥간 DNA 가교는 NER 및 상동 재조합의 조합 사용에 의해 복구될 수 있다. 직접 복구는 포토리아제 효소에 의한 시클로부탄 피리미딘 이량체 및 6-4 생성물의 복구를 포함한다. 직접 복구는 또한 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의한 O6-메틸구아닌으로부터의 O6-메틸의 제거를 포함한다. 문헌 [Sancar et al. (2004) Ann. Rev. Biochem. 73:39-85, Hu, Sancar (2017) J. Biol. Chem. 292:15588-15597]을 참조한다.
본 개시내용은 DNA 복구 효소 또는 DNA 복구 단백질의 복합체 등으로 처리함으로써 비드-결합된 DNA 바코드에 대한 손상을 복구하기 위한 시스템, 시약 및 방법을 제공한다.
DNA를 그의 3'-말단을 통해 비드에 커플링시키는 것에 의한 손상 감소. 특정 화학적 변환은 핵산의 노출된 3'-히드록실 기를 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 미츠노부 반응은 1급 및 2급 알콜의 에스테르, 페닐 에테르, 티오에테르 및 다양한 다른 화합물로의 전환을 가능하게 하며, 이는 노출된 3'-말단을 후속 처리 단계에 대해 비반응성이 되게 하거나 또는 이제 변형된 3'-말단이 추가의 화학 반응에 참여하하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 태그는 그의 3'-말단을 통해 비드에 부착될 수 있고, 따라서 5'-말단만이 용액에 노출된다.
본 개시내용의 시약, 시스템 및 방법은 비드-결합된 핵산, 예컨대 비드-결합된 DNA 또는 비드-결합된 DNA 태그를 포괄하며, 여기서 비드에 대한 커플링은 DNA의 3'-말단 (또는 3'-단부)을 수반한다. DNA 바코드를 포함하는 ssDNA가 ssDNA의 3'-말단에 의해 커플링되는 경우, 서열분석은 단지 1개의 서열분석 프라이머를 혼성화함으로써 개시될 수 있으며, 여기서 이 서열분석 프라이머는 전체 DNA 바코드의 상류에 혼성화하고, 여기서 이 혼성화는 커플링된 ssDNA의 비드-결합된 말단에 또는 그 근처에 존재한다. 단지 1개의 서열분석 프라이머를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 복수의 서열분석 프라이머가 사용될 수 있으며, 여기서 각각의 서열분석 프라이머는 특정한 DNA 바코드 모듈의 상류에서 혼성화한다. 예를 들어, 주어진 DNA 바코드가 5개의 DNA 바코드 모듈을 함유하고, 여기서 DNA가 그의 3'-말단에 의해 비드에 커플링되는 경우에, DNA 바코드는 5개의 상이한 프라이머 어닐링 부위를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 프라이머 어닐링 부위는 주어진 DNA 바코드 모듈의 막 상류 또는 바로 상류에 위치한다.
이중 가닥 DNA (dsDNA) 커플링 실시양태. 다른 실시양태에서, dsDNA가 비드에 커플링되며, 여기서 dsDNA 내의 가닥 중 단지 1개의 3'-말단이 비드에 커플링된다. dsDNA를 수반하는 5'-커플링 실시양태에서, dsDNA가 커플링될 수 있으며, 여기서 dsDNA의 가닥 중 단지 1개의 5'-말단이 비드에 커플링된다.
( V ) 비드에 대한 화학적 화합물 커플링
본 개시내용은 (1) 화학적 라이브러리 구성원을 기질, 예컨대 비드에 부착시키기 위한 링커, (2) 핵산 바코드를 기질, 예컨대 비드에 부착시키기 위한 링커, (3) 예를 들어 UV 광에 의해 절단가능하거나, 효소, 예컨대 프로테아제에 의해 절단가능한, 절단가능한 링커, (4) 비-절단가능한 링커, (5) 이관능성 링커, (6) 다관능성 링커 및 (7) 연결에 사용되는 복수의 비드를 제공한다. 예를 들어, 4-히드록시메틸 벤조산 (HMBA) 링커, 4-히드록시메틸페닐아세트산 링커가 이용가능하다 (문헌 [Camperi, Marani, Cascone (2005) Tetrahedron Letters. 46:1561-1564] 참조).
"비-절단가능한 링커"는 주어진 유기 화학 절차의 단계 동안 사용되는 임의의 시약, 조건 또는 환경에 의해 검출가능하게 절단될 수 없는 링커로서 특징화될 수 있다. 대안적으로, "비-절단가능한 링커"는 주어진 유기 화학 절차의 다른 반응물, 생성물 또는 시약에 대해 허용불가능하게 파괴적인 시약, 조건 또는 환경을 제외하고는 절단될 수 없는 링커로서 특징화될 수 있다.
이관능성 링커 또는 다른 다관능성 링커는 포크 (음식을 소비하기 위해 인간에 의해 사용되는 포크)의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 포크의 핸들은 비드에 부착되고, 여기서 포크의 각각의 가지는 다양한 화학물질 중 하나에 연결된다. 예를 들어, 하나의 가지는 화학적 라이브러리 구성원에 연결될 수 있다. 또 다른 가지는 DNA 바코드에 연결될 수 있다. 포크의 또 다른 가지는 금속 이온에 연결될 수 있다.
다수의 비드의 사용에 관하여, 본 개시내용은 다수-비드 실시양태, 예컨대 하기를 제공한다: (1) 제2 비드에 연결된 부착된 핵산 바코드를 함유하는 제1 비드, 여기서 제2 비드는 부착된 화학적 라이브러리 구성원을 함유함, (2) 제2 비드에 연결된 부착된 핵산 바코드를 함유하는 제1 비드, 여기서 제2 비드는 부착된 화학적 라이브러리 구성원을 함유하고, 여기서 제3 비드는 (제1 비드 및 제2 비드 중 하나 또는 둘 다에) 부착되고, 여기서 제3 비드는 공유 부착된 시약을 함유함. 부착된 시약은 효소일 수 있으며, 여기서 효소는 부착된 화학적 라이브러리 구성원의 활성을 검정하는 데 사용된다.
( VI ) 단량체를 함께 커플링시키는 것에 의한 화합물 제조
예시적인 화학적 단량체. 본 개시내용의 조성물 및 방법을 위한 화학적 단량체로서 사용하기에 적합한 아미노산 유도체가 도 4에 제시된다. 도면은 화학물질의 공급처, 예를 들어 아나스펙 EGT 그룹(AnaSpec EGT Group) (캘리포니아주 프리몬트), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스), 아크로스 오가닉스(Acros Organics) (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)의 일부) 또는 콤비-블록스(Combi-Blocks) (캘리포니아주 샌디에고)를 나타낸다.
추가의 화학적 단량체가 도 22-27에 제시된다. 도 22-27 각각은 구조, 화학 명칭 및 회합된 DNA 모듈 바코드를 제공한다. 도면에 개시된 바와 같이, 화합물 1-6에 대해 (도 22), 각각의 바코드는 ACGT, ACTC, AGAC, AGCG, AGTA 및 ATAT이다. 화합물 7-10에 대해 (도 23), 각각의 바코드는 ATGA, CACG, CAGC 및 CATA이다. 화합물 11-16에 대해 (도 24), 각각의 바코드는 CGAG, CGCT, CGTC, CTAC, CTGT 및 GACT이다. 화합물 17-21에 대해 (도 25), 각각의 바코드는 GAGA, GCAC, GCTG, GTAG 및 GTCA이다. 화합물 22-26에 대해 (도 26), 각각의 바코드는 GTGC, TAGT, TATC, TCAG 및 TCGC이다. 화합물 27-30에 대해 (도 27), 각각의 바코드는 TCTA, TGAT, TGCA 및 TGTG이다. 이들 바코드는 단지 예시적이다. 화합물의 임의의 주어진 라이브러리에 대해, DNA 바코드의 상이한 집합물을 사용하여 그 라이브러리에서 화합물을 구축하는 데 사용되는 각각의 화학적 단량체를 확인할 수 있다.
커플링 반응. 하기는 화학적 단량체를 비드에 및 서로 커플링시키는 것을 기재하며, 즉, 제1 단계는 제1 화학적 단량체를 절단가능한 링커에 의해 비드에 직접 커플링시키는 것이고, 이어서 후속 화학적 단량체를 하나씩 서로 연결시킨다. 하기 개시된 조건은 DNA 상용성이다.
이는 텐타겔® 비드 상에서 3개의 아미노산 화합물을 제조하는 방법을 기재한다. Fmoc-포토-링커 4-{4-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐아미노) 에틸]-2-메톡시-5-니트로페녹시} 부탄산) 또는 Fmoc 보호를 갖는 또 다른 적절한 링커로 변형된 Fmoc 보호된 수지 (1 mg, 랩 폴리머 게엠베하, 10 um, 텐타겔 M-NH2, 0.23 mmol/g)를 반응기 플레이트 (머크 밀리포어 리미티드(Merck Millipore Ltd), 0.45 um 소수성 PTFE)의 각각의 웰 내부 DMA (150 uL) 중에 현탁시켰다. 레스프렙 VM-96 진공 매니폴드를 사용하여 플레이트의 바닥에 진공을 적용함으로써 용매를 제거하였다. 수지를 DMF 중 5% 피페라진, 2% DBU의 혼합물 150 uL 중에 현탁시킴으로써 Fmoc 보호기를 제거하였다. 플레이트를 엑셀 사이언티픽 알루미나 실로 밀봉하고, 40℃에서 15분 동안 진탕시켰다. 용매를 적용된 진공에 의해 제거하고, 탈보호 절차를 5분 동안 반복하였다. 여과 후, 각각의 웰을 2XDMA, 3XDCM, 1XDMA 각각 150 uL로 세척하고, 각각의 세척 사이에 진공을 적용하여 용매를 제거하였다. 이어서, 수지의 각각의 웰을 60 mM Fmoc-아미노산, 80 mM 옥시마, 200mM DIC 및 80 mM 2,4,6-트리메틸피리딘의 사전-활성화된 혼합물 150 uL를 첨가함으로써 적절한 아미노산에 의해 아실화하고, 이를 실온에서 2분 동안 정치하였다. 플레이트를 다시 밀봉하고, 40℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 여과 후, 각각의 웰을 2XDMA 및 3XDCM 각각 150 uL로 세척하였다. 각각의 웰 내의 비드를 150 ul의 DCM 중에 재현탁시키고, 각각의 웰의 내용물을 피펫팅을 통해 단일 리셉터클 내로 합하였다. 합한 비드를 철저히 혼합하고, 적절한 웰에 동일한 양을 피펫팅하여 (1 mg/웰) 플레이트 내로 재분배하였다. 용매를 적용된 진공에 의해 제거하고, 각각의 웰을 다음 적절한 단계를 위해 준비하였다. 각각의 추가의 아미노산 커플링에 대해, 먼저 Fmoc 탈보호 단계를 반복한 후 목적하는 아미노산과의 커플링 단계가 이어진다. 분할 및 풀이 요구되는 경우에, 조합 및 재분배 방법을 반복한다.
이는 비드 상에서 분할-풀 방법에 의해 3-량체 아미노산을 생성하는 방법을 기재한다. Fmoc-포토-링커 4-{4-[1-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐아미노) 에틸]-2-메톡시-5-니트로페녹시} 부탄산) 또는 임의의 다른 적절한 링커로 변형된 Fmoc 보호된 수지 (1 mg, 랩 폴리머 게엠베하, 10 um, 텐타겔 M-NH2, 0.23 mmol/g)를 반응기 플레이트 (머크 밀리포어 리미티드, 0.45 um 소수성 PTFE)의 각각의 웰 내부 DMA (150 uL) 중에 현탁시켰다. 레스프렙® VM-96 진공 매니폴드를 사용하여 플레이트의 바닥에 진공을 적용함으로써 용매를 제거하였다. 수지를 DMF 중 5% 피페라진, 2% DBU의 혼합물 150 uL 중에 현탁시킴으로써 Fmoc 보호기를 제거하였다. 플레이트를 엑셀 사이언티픽 알루미나 실로 밀봉하고, 40℃에서 15분 동안 진탕시켰다. 용매를 적용된 진공에 의해 제거하고, 탈보호 절차를 5분 동안 반복하였다. 여과 후, 각각의 웰을 2XDMA, 3XDCM, 1XDMA 각각 150 uL로 세척하고, 각각의 세척 사이에 진공을 적용하여 용매를 제거하였다. 이어서, 수지의 각각의 웰을 60 mM Fmoc-아미노산, 80 mM 옥시마, 200mM DIC 및 80 mM 2,4,6-트리메틸피리딘의 사전-활성화된 혼합물 150 uL를 첨가함으로써 적절한 AA에 의해 아실화하고, 이를 실온에서 2분 동안 정치하였다. 플레이트를 다시 밀봉하고, 40℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 여과 후, 각각의 웰을 2XDMA, 3XDCM, 1XDMA 각각 150 uL로 세척하였다. 각각의 추가의 AA 커플링에 대해, 먼저 Fmoc 탈보호 단계를 반복한 후 목적하는 AA과의 커플링 단계가 이어진다. 각각의 연속 커플링을 분석하기 위해, 비드 1 mg 부분을 100uL DMSO 중에 현탁시키고, 365 nm LED의 전체 전력에 2시간 동안 노출시켰다. 수지를 여과해내고, 여과물을 애질런트 포로쉘 SB-C-18, 3.0X50mm, 2.7 um 칼럼이 장착된 애질런트 1100 시리즈 LCMS 상에 주입하였다. 1.2 mL/분의 유량으로 4분에 걸쳐 물 중 0.1%TFA 중 5% CH3CN에서 0.1%TFA 중 100 CH3CN으로의 구배 및 220 nm에서의 모니터링을 실행하였다.
레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®)가 부착된 비-아미노산 펜던트를 제조하기 위한 실험. 이는 탈보호 후에 마지막 아미노산에 부착될 것이다. 이를 또한 스핀으로 수행하였다. 수지의 각각의 웰을 DMA 중 40 mM 클로로 아세트산, 40 mM 옥시마, 80 mM DIC 및 40 mM TMP의 5분 사전숙성된 혼합물 150 uL로 아실화하였다 (Fmoc 탈보호 후). 플레이트를 밀봉하고, 40℃에서 1시간 동안 진탕시켰다. 각각의 웰을 3XDMA, 3XDCM 및 2XDMA 각각 150 uL로 세척하였다. 이어서, 수지를 DMA 중 100 mM K2CO3 및 100 mM Rev의 현탁액 중에 재현탁시켰다. 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 3시간 동안 진탕시켰다. 수지를 2X50/50 DMA/물, 3XDMA, 3XDCM 및 2XDMA 각각 150 uL로 세척하였다.
주어진 비드에 부착된 화학적 화합물의 합성의 충실도 정의. 이는 화학적 화합물이 화학적 라이브러리의 구성원인 완성된 화학적 화합물에 관한 것이다. 각각의 화학적 화합물은 부분적으로 또는 전체적으로 화학적 단량체로부터 제조될 수 있다. 하기는 주어진 비드에 부착된 화학적 화합물을 특징화한다. 이 주어진 비드는 화학적 화합물의 라이브러리의 분할-및-풀 기반 합성의 생성물일 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 고유한 화학적 화합물을 보유한다.
화학적 라이브러리의 구성원은 고체 상 합성에 의해 고체 지지체 상에서, 예컨대 비드 상에서 합성될 수 있다. 펩티드 결합을 갖는 화학물질의 고체 상 합성은 하기 2개의 화학적 기 중 하나의 사용을 특징으로 한다. 제1 화학적 기는 N-알파-9-플루오레닐-메틸옥시카르보닐 (Fmoc, 염기 불안정성)이다. 제2 화학적 기는 tert-부틸옥시카르보닐 (tBoc, 산 불안정성)이다 (문헌 [Vagner, Barany, Lam (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8194-8199] 참조). Fmoc 및 tBoc는 펩티드 기질을 보호하는 데 사용될 수 있는 보호기이며, 여기서 Fmoc 기 또는 tBoc 기는 알파-아미노 기에 부착된다 (Sigler, Fuller, Verlander (1983) Biopolymers. 22:2157-2162).
바람직하게는, 합성 완료 후, 주어진 비드에 결합된 화학적 라이브러리의 구성원의 적어도 99.5%, 적어도 99.0%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85% 또는 적어도 80%가 정확히 동일한 화학 구조를 갖는다. 화학적 라이브러리 구성원의 다단계 합성의 1개 이상의 단계에서 불완전한 커플링이 발생할 수 있는 것이 가능하다. 이러한 이유로, 본 개시내용의 조성물은 하기 한계 또는 범위 중 하나에 의해 특징화되고 제한될 수 있다.
또한, 주어진 비드에 결합된 화학적 라이브러리의 구성원의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99%가, 합성 완료 후, 정확히 동일한 화학 구조를 갖는 것인 방법 및 시약이 본 개시내용에 의해 제공된다 (이들 수는 고체 상 합성 동안 발생할 수 있는 오류, 예를 들어 하나의 성장하는 화합물이 화학적 단량체 중 하나를 수용하지 못하는 것을 고려하고 이를 반영함. 또한, 이들 수는 고체 상 합성 동안 발생할 수 있는 임의의 단량체에 대한 화학적 손상을 고려하고 이를 반영함).
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 "정확히 동일한 구조"에 대한 상기 컷-오프 값 중 하나를 충족시키지 않는 임의의 방법 또는 시약을 배제할 수 있다.
대안적 실시양태에서, 비드 집단 중 2개의 비드, 3개의 비드, 4개의 비드, 5개의 비드, 약 5-10개의 비드, 약 10-20개의 비드, 약 20-40개의 비드, 약 40-80개의 비드는 같은 동일한 화학적 화합물을 함유한다 (고체 상 합성 동안 화학적 단량체의 혼입에서의 임의의 오류를 고려하지 않고, 유기 합성 동안 화학적 단량체에 발생하는 임의의 화학적 손상을 고려하지 않음).
클릭 화학 도입. 문헌 [Jewett et al.]에 따르면, "클릭 반응은 . . . 선택적이고, 고수율이며, 우수한 반응 동역학을 갖는 것으로 . . . 정의된다. 성분이 주위 생물학적 환경에 대해 불활성인 클릭 반응의 하위부류는 배직교로 명명된다" (Jewett and Bertozzi (2010) Chem. Soc. Rev. 39:1272-1279). "클릭 화학"은 작은 단위를 헤테로원자 연결, 예컨대 탄소-X-탄소와 함께 연결하는 데 사용될 수 있다. 클릭 화학은 약물 또는 약물 후보의 합성을 위해 단독으로 또는 다른 유형의 화학 반응과 함께 사용될 수 있다. 클릭 화학은 조합 화학에 사용되는 절차로 잘 작동한다. 클릭 화학에서의 반응은 고수율, 비가역적, 산소 또는 물에 대한 비감수성을 특징으로 한다. "클릭 화학"에 사용되는 화학 반응의 부류는 (1) 특히 1,3-쌍극자 패밀리로부터의 및 헤테로-딜스 알더 반응으로부터의 고리화첨가 반응, (2) 변형된 헤테로시클릭 분자, 예컨대 에폭시드, 아지리딘 및 시클릭 술페이트와 같은 친핵성 개환 반응, (4) 비-알돌 유형의 카르보닐 화학 및 (5) 산화 반응 및 일부 마이클 첨가 반응과 같은 탄소-탄소 다중 결합으로의 첨가를 포함한다. 클릭 화학 반응은 그의 높은 열역학적 구동력, 종종 20 kcal/mol 초과에 의해 구별되는 반면, 대조적으로, 비-클릭 화학 반응은 단지 보통의 열역학적 구동력으로 결합을 형성하는 것을 수반한다 (Kolb and Sharpless (2003) Drug Discovery Today. 8:1128-1137, Kolb, Finn, Sharpless (2001) Angew. Chem. Int. Ed. 40:2004-2021).
테트라진 및 트랜스-시클로옥텐 (TCO). 테트라진, 예컨대 1,2,4,5-테트라진은 딜스-알더 고리화첨가에 의해 트랜스-시클로옥텐 (TCO)과 반응할 수 있다 (Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016).
하르트비히-부흐발트 아미노화. 하르트비히-부흐발트 아미노화 반응은 제약의 고체-상 합성에 사용될 수 있다. 이 아미노화 반응은 탄소-질소 결합을 합성하는 데 사용되며, 여기서 반응은 팔라듐에 의해 촉매되는 아릴-할라이드 플러스 아민 (R1-NH-R2)을 수반하여 아릴 생성물을 생성하고, 여기서 아민은 할라이드를 대체하고, 여기서 아미노 기의 질소는 방향족 고리에 직접 부착된다. 최종 결과는 (아릴 기의) 탄소 대 (아미노 기의) 질소 결합을 수반하는 생성물이다. 달리 말하면, 반응은 아릴할라이드를 상응하는 아닐린으로 전환시킨다. 하르트비히-부흐발트 아미노화는 다양한 아민에 상용성이고, 조합 화학에 매우 적합하다 (Zimmermann and Brase (2007) J. Comb. Chem. 9:1114-1137).
휘스겐 고리화첨가. 휘스겐 1,3-쌍극자 고리화첨가 반응은 알킨 및 유기 아지드를 수반한다. 알킨은 R-C≡CH의 구조를 갖는다. 아지드는 R-N+=N=N-의 구조를 갖는다. 구리 촉매는 휘스겐 고리화첨가 반응의 속도를 가속화시킨다. 휘스겐 반응은 "클릭 화학" 또는 "클릭 반응"에 의해 작동한다. 휘스겐 반응은, 구리에 의해 촉매될 때, 소분자 약물을 제조하는 데 적합한 1,2,3-트리아졸 핵을 생성할 수 있다. 휘스겐 반응은 아미노산 측쇄가 적어도 보호된 형태일 때 그의 존재에 상용성이다. 1,2,3-트리아졸로 제조된 분자는 폴리펩티드의 아미드 결합과 유사한 결합을 보유할 수 있고, 따라서 이들 분자는 펩티드 결합에 대한 대용물일 수 있다 (Angell and Burgess (2007) Chem. Soc. Rev. 36:1674-1689).
펩티드 핵산 (PNA). 본 개시내용은 펩티드 핵산을 합성하기 위한 분할 및 풀 화학, 조합 화학 또는 고체 상 화학의 방법을 제공한다. 펩티드 핵산은 올리고뉴클레오티드의 유사체이다. 이들은 뉴클레아제에 의한 가수분해에 저항한다. 이들은 그의 표적 RNA 서열에 강하게 결합할 수 있다. 세포 내로의 펩티드 핵산의 흡수는 "세포 관통 펩티드"에 의해 증진될 수 있다 (Turner, Ivanova, Gait (2005) Nucleic Acids Res. 33:6837-6849, Koppelhus (2008) Bioconjug. Chem. 19:1526-1534). 펩티드 핵산은 고체 상 합성 및 조합 합성에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Quijano, Bahal, Glazer (2017) Yale J. Biology Medicine. 90:583-598, Domling (2006) Nucleosides Nucleotides. 17:1667-1670] 참조).
본 개시내용은 비드-결합된 화합물을 포괄하며, 여기서 화합물은 단지 1개의 단량체의 형태를 취한다. 예를 들어, 이러한 비드-결합된 화합물은 레날리도미드의 형태를 취할 수 있거나, 또는 이는 카르복실산 기가 부착된 레날리도미드의 형태 또는 아미노 기가 카르복실산 기를 보유하는 작은 화학적 모이어티로 변형된 레날리도미드의 형태 또는 화합물이 레날리도미드의 입체이성질체 또는 거울상이성질체인 레날리도미드 유사체인 형태를 취할 수 있다.
( VII ) 분할 및 풀 합성 및 병행 합성
이는 화학적 화합물의 라이브러리를 합성하기 위한 "분할 및 풀" 방법의 사용 및 "분할 및 "풀" 방법이 비드-결합된 화학적 화합물 및 비드-결합된 DNA 바코드의 동시 합성에 사용되는 방법에 관한 것이다. 이는 또한 화합물의 혼합 세트를 제조하기 위한 분할 및 풀링을 기재한다. 이후 시점에, 비-아미노산의 커플링, 뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의해 변형된 비드의 제조가 하기 개시된다.
본 개시내용은 화학적 라이브러리를 생성하기 위한 분할 및 풀 합성을 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 (a) 비드를 상이한 용기로 분할하는 단계, (b) 상이한 빌딩 블록을 각각의 용기에 첨가하는 단계이며, 예를 들어, 3개의 용기가 사용되는 경우, 종 A를 제1 용기에, 종 B를 제2 용기에 및 종 C를 제3 용기에 첨가하여 반응시키고, 여기서 종은 용기 내의 모든 비드 상의 부착 부위에 공유 결합되는 것인 단계, (c) 모든 비드를 1개의 용기에서 함께 풀링하는 단계, (d) 비드를 3개의 용기로 분할하는 단계, (e) 상이한 빌딩 블록을 각각의 용기에 첨가하는 단계이며, 여기서 종 A를 제1 용기에 첨가하고, 종 B를 제2 용기에 첨가하고, 종 C를 제3 용기에 첨가하고, 여기서 종은 이전에 부착된 제1 종에 공유 결합되는 것인 단계를 수반한다 (문헌 [Stockwell (2000) Trends Biotechnol. 18:449-455] 참조).
본 개시내용의 분할-및-풀 합성은 각각의 화학적 커플링 단계 (화학적 라이브러리 구성원을 제조함) 전 또는 후에, DNA-바코드 커플링 단계를 포함하며, 여기서 이 DNA 바코드는 그 단계에서 커플링될 화학물질을 확인한다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 주어진 병행 합성 단계에 대해, 화학물질을 부착시키기 전에 바코드가 부착되는 것인 방법 및 시약을 배제할 수 있다. 반대로, 본 개시내용은 주어진 병행 합성 단계에 대해, 바코드를 부착시키기 전에 화학물질이 부착되는 것인 방법 및 시약을 배제할 수 있다.
분할 및 풀 방법에 의해 제조된 비드-결합된 화학적 라이브러리의 한 특징은 각각의 비드가 그에 부착된 단지 한 유형의 화합물을 가질 것이라는 것이다. 불완전한 커플링이 존재하는 경우에, 예를 들어 주어진 분할 및 풀 단계에 대해, 5,000개의 부착 부위 중 단지 4,000개만이 목적하는 화학 종과 성공적으로 커플링된 경우에, 일부 불균질성이 발생할 것이다.
병행 합성. 본 개시내용의 바람직한 실시양태에서, 병행 합성이 화학적 화합물 및 회합된 DNA 바코드의 유기 합성에 사용될 수 있다. 실제 실시에서, 1개 이상의 화학적 단량체에 의한 비드의 변형 및 1개 이상의 DNA 바코드 모듈에 의한 동일한 비드의 변형은 엄격하게 병행이 아니다. 실제 실시에서, 비드는 1개 이상의 화학적 단위 (화학적 단량체)를 수용한 후, 특정한 화학적 단위를 코딩하는 DNA 바코드 모듈을 수용한다. 용어 "병행"은 화학적 라이브러리 단량체의 중합체가 성장함에 따라 DNA 바코드 모듈의 중합체 또한 성장한다는 사실을 지칭한다. 모든 DNA 바코드 모듈이 비드에 부착되어 연쇄된 구조 또는 직교 구조를 형성하였을 때, 전장 DNA 바코드는 "DNA 바코드" (단지 DNA 바코드 모듈이 아님)로 불린다.
외부에 부착된 DNA 바코드의 수 대 부착된 화학적 라이브러리 구성원의 총수의 비.
이는 비드의 외부 표면 및 내부 표면에 관한 것이다. 외부에 부착된 DNA 바코드 (내부에 부착된 DNA 바코드의 수와 관계 없음) 및 부착된 화학적 라이브러리 구성원 (외부 표면 뿐만 아니라 내부 표면 둘 다에 부착됨)을 갖는 주어진 비드에 대해, 외부에 부착된 DNA 바코드 수 대 총 부착된 화학적 라이브러리 구성원 수의 비는, 예를 들어 약 0.1:100, 약 0.2:100, 약 0.5:100, 약 1.0:100, 약 2:100, 약 5:100, 약 10:100, 약 20:100, 약 30:100, 약 40:100, 약 50:100, 약 60:100, 약 70:100, 약 80:100, 약 90:100, 약 1:1, 약 100:150, 약 100:200, 약 100:400, 약 100:600 등일 수 있다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 값 중 하나에 맞는 임의의 비드 또는 임의의 비드 집단을 배제할 수 있다.
전형적인 비드에 대한 DNA 바코드의 균질성, 전형적인 비드에 대한 화학적 라이브러리 구성원의 균질성
본 개시내용은 임의의 주어진 비드에 대해 (또는 임의의 비드 집단에 대해) 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99.5% 등인 "화학적 라이브러리 균질성"을 제공한다.
덜 엄격한 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 주어진 비드에 대해 또는 대안적으로 임의의 주어진 비드 집단에 대해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%인 "화학적 라이브러리 균질성"을 제공한다.
유사하게, 본 개시내용은 바코드, 예컨대 DNA 바코드의 균질성을 평가하기 위한 상기 컷-오프 값을 제공한다.
DNA 바코드에 대한 균질성 및 화학적 라이브러리 구성원에 대한 균질성은 실험실 매뉴얼 또는 노트북의 방법 섹션에서 계획되고 요구되는 바와 같은 정확한 서열에 부합하는 총 집단의 퍼센트의 측면에서 정의될 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 컷-오프 값 중 1개 이상에 부합하지 않는 임의의 시약, 조성물 또는 방법을 배제할 수 있다.
비드 집단의 균질성을 평가하는 경우에, 전체 비드 집단 전반에 걸쳐 균질성이 요구되는 상황에 대해, 비드 #1, 비드 #2, 비드 #3, 비드 #4, 비드 #5, 비드 #6, 비드 #7 등의 합에 대한 균질성을 고려할 필요가 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 DNA 바코드의 균질성이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99.5% 등이 아닌 임의의 비드 또는 임의의 비드 집단을 배제할 수 있다. 또한, 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 화학적 라이브러리 구성원의 균질성이 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99.5% 등이 아닌 임의의 비드 또는 임의의 비드 집단을 배제할 수 있다.
내부에 부착된 DNA 바코드 대 외부에 부착된 DNA 바코드의 비
본 개시내용의 일부 실시양태에서, DNA 바코드가 주로 외부 표면 상에 부착된 것인 비드를 제조하고 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 내부 DNA 바코드를 갖는 비드를 제조하고 사용하지 않는 한 가지 이유는 내부 공간에 대한 DNA 올리고머의 낮은 투과 및 내부 공간에 대한 DNA 리가제 (완성된 DNA 바코드를 생성하기 위해 DNA 모듈을 서로 연결하기 위한 리가제)의 낮은 투과이다. 그리고 서열분석 목적을 위해, 내부 DNA 바코드를 제조하고 사용하지 않는 이유는 바코드의 최종 서열분석에 필요한 DNA를 증폭시키는 데 필요한 효소의 낮은 투과이다. 내부 DNA 바코드를 갖는 비드를 제조하고 사용하지 않는 또 다른 이유는 화학적 라이브러리의 구성원을 부착시키기 위한 내부 공간을 남겨두는 것이다.
본 개시내용은 DNA 바코드를 보유하는 비드를 제공하며, 여기서 내부에 부착된 DNA 바코드 대 외부에 부착된 DNA 바코드의 비는 약 0.1:100, 약 0.2:100, 약 0.4:100, 약 0.8:100, 약 1:100, 약 2:100, 약 4:100, 약 8:100, 약 10:100, 약 20:100, 약 40:100, 약 50:100, 약 60:100, 약 70:100, 약 80:100, 약 90:100, 약 1:1 등이다.
또한, 본 개시내용은 DNA 바코드를 보유하는 비드를 제공하며, 여기서 내부에 부착된 DNA 바코드 대 외부에 부착된 DNA 바코드의 비는 0.1:100 미만, 0.2:100 미만, 0.4:100 미만, 0.8:100 미만, 1:100 미만, 2:100 미만, 4:100 미만, 8:100 미만, 10:100 미만, 20:100 미만, 40:100 미만, 50:100 미만, 60:100 미만, 70:100 미만, 80:100 미만, 90:100 미만, 1:1 미만 등이다.
수성 현탁액 중 비드 집단은 기질, 예컨대 피코웰 어레이에 접촉되어, 비드가 피코웰에 들어가고 이를 점유할 수 있다. 현탁액 중 비드의 수 대 기질 중 피코웰의 수의 비는 목적하는 점유율에 도달하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 현탁액이 단지 1개의 비드를 함유하면, 비드를 함유하는 모든 피코웰은 단지 1개의 비드를 함유할 것이고, 남아있는 피코웰은 임의의 비드를 함유하지 않을 것이다. 현탁액이 20,000개의 비드를 함유하고 기질이 200,000개의 피코웰을 함유하면, 적어도 180,000개의 피코웰은 전부 비드가 없을 것이고, 비드를 함유하는 대부분의 피코웰은 단지 1개의 비드를 함유할 것이다. 점유된 피코웰의 작은 백분율은 2개의 비드를 함유할 것이다.
값 실시양태에서, 현탁액 중 비드 수 대 피코웰 수의 비는 약 0.2:100, 약 0.4:100, 약 0.6:100, 약 0.8:100, 약 1:100, 약 2:100, 약 4:100, 약 6:100, 약 8:100, 약 10:100, 약 20:100, 약 30:100, 약 40:100, 약 50:100, 약 60:100, 80:100, 약 100:100 (1:1과 동일), 약 2:1, 약 4:1, 약 6:1, 약 8:1, 약 10:1 등일 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 값 또는 범위 중 하나에 속하는 임의의 방법 또는 시스템을 배제할 수 있다.
범위 실시양태에서, 현탁액 중 비드 수 대 피코웰 수의 비는 약 0.2:100 내지 약 0.4:100, 약 0.4:100 내지 약 0.6:100, 약 0.6:100 내지 약 0.8:100, 약 0.6:100 내지 약 1:100, 약 1:100 내지 약 2:100, 약 2:100 내지 약 4:100, 약 4:100 내지 약 6:100, 약 0.6:100 내지 약 8:100, 약 8:100 내지 약 10:100, 약 10:100 내지 약 20:100, 약 20:100 내지 약 30:100, 약 30:100 내지 약 40:100, 약 40:100 내지 약 50:100, 약 50:100 내지 약 60:100, 약 60:100 내지 80:100, 약 80:100 내지 약 100:100 (1:1과 동일), 약 100:100 (1:1과 동일) 내지 약 2:1, 약 2:1 내지 약 4:1, 약 4:1 내지 약 6:1, 약 6:1 내지 약 8:1, 약 8:1 내지 약 10:1 등일 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 값 또는 범위 중 하나에 속하는 임의의 방법 또는 시스템을 배제할 수 있다.
( VIII ) 피코웰 제작
피코웰 어레이 플레이트를 제조하기 위한 UV 광, 포토마스크 및 포토레지스트의 조합. 많은 마이크로웰 또는 피코웰을 포함하는 플레이트가 본 개시내용에서 사용하기 위해 하기와 같이 제작될 수 있다. 간략하게, 3개 층의 샌드위치를 조립한다. 상단 층은 포토레지스트이다. 중간 층은 유리 웨이퍼이다. 하단 층은 포토마스크이다. 피코웰은 UV 광에 의해 포토레지스트로부터 조각될 것이다. 피코웰이 포토레지스트의 편평 시트로부터 조각된 후에, 포토레지스트는 머핀 베이킹용 컵을 함유하는 전형적인 금속 팬과 유사하고, 머핀 반죽을 보유하기 위해 사용되는 팬 내의 컵은 각진 측면을 갖는다. UV 광은 포토레지스트의 중합체를 분해하기 때문에 "비-가교 링커"로서 작용한다. UV 처리 후, 용매를 첨가하여 UV 처리된 포토레지스트를 세척해내어, 깨끗하게 보이는 피코웰을 남긴다.
각진 벽을 생성하는 각도로 회전시킨다. 각진 벽을 갖는 피코웰을 하기와 같이 생성한다. 포토마스크는 많은 개구를 가지며, 여기서 각각의 개구는 피코웰의 목적하는 하단 치수에 상응한다. 하단 치수는 원주, 직경 및 형상, 즉, 원형 형상을 포함할 수 있다. 광원의 회전 또는 샌드위치를 보유하는 스테이지 (포토마스크/유리 웨이퍼/포토레지스트 샌드위치)의 회전 동안 각진 UV 광을 포토마스크 내의 개구 쪽으로 향하게 함으로써 웰의 상단 치수를 생성한다. 회전으로, 광원은 포토마스크/웨이퍼/포토레지스트 샌드위치에 대해 90도 각도에 있지 않고, 대신 각각의 피코웰에서 각진 벽을 조각해내기 위해 90도 지점으로부터 약간 각져 있다. 많은 피코웰을 함유하는 생성된 피코웰 어레이 플레이트는 그대로 사용될 수 있다. 대안적으로, 이러한 피코웰 어레이 플레이트는 많은 피코웰 어레이 플레이트의 저비용 생성을 위한 몰드로서 사용될 수 있다.
한(Han) 등은 마이크로웰이 각진 벽을 갖는 것인 마이크로웰 플레이트를 제조하기 위한 장비 및 시약을 기재한다 (문헌 [Han et al. (2002) J. Semiconductor Technology and Science. 2:268-272] 참조). UV 공급원, 접촉 스테이지, 틸팅 스테이지 및 SU-8 포토레지스트가 기재된다. 제작은 단면 연마된 실리콘 웨이퍼로 시작한다. SU-8 포토레지스트를 약 0.10 내지 0.15 mm 두께로 웨이퍼 상에 코팅한다. 이어서, 포토레지스트를 65℃ 핫 플레이트 상에서 10분 동안, 이어서 95℃ 핫 플레이트 상에서 30분 동안 소프트 베이킹한다. 생성된 포토레지스트/웨이퍼 샌드위치를 접촉 스테이지를 사용하여 UV 마스크와 접촉시킨다. 용어 "경사 및 회전 UV 리소그래피"는 각각의 웰이 각진 벽을 갖는 것인 마이크로웰 어레이 플레이트 또는 피코웰 어레이 플레이트를 제조하는 방법을 지칭한다. 여기서 웰의 바닥은 보다 작은 직경을 갖고, 웰의 상단 (여기서 웰의 상단 에지는 플레이트의 편평 표면과 만남)은 보다 넓은 직경을 갖는다. UV 광 노출을 위해, 턴테이블이 사용되고, 여기서 UV 광이 경사진다 (상기 문헌 [Han et al.]). 마스크는 포토레지스트와 접촉되며, 여기서 마스크 내의 각각의 개구는 원형이다. 상기 문헌 [Han et al.]의 도 8은 UV 광, UV 마스크, 포토레지스트 구조, 웨이퍼 기질 및 턴테이블의 방향의 사진을 제공한다. 한 등은 원추대를 제조하는 방법을 기재한다. 연질 물질, 예컨대 PDMS (폴리디메틸실록산)를 원추형 어레이 상에 붓고 경화시킬 수 있으며, 그때 PDMS 층을 박리하면, 원추형 웰이 형성된다.
피코웰 어레이 플레이트의 대량 생산에 사용하기 위한 몰드의 생성. 피코웰 어레이 플레이트가 제조된 경우에, 에폭시를 플레이트 상에 부어 모든 피코웰을 충전시키고 모든 충전된 피코웰을 에폭시 플랫폼과 연결시킬 수 있다. 에폭시가 응고되면, 피코돌기의 어레이가 부착된 고체 플랫폼을 제거한다 (피코돌기는 목적하는 피코웰의 뒷면임). 피코돌기를 갖는 고체 플랫폼은 많은 피코웰 어레이 플레이트의 제조에 사용될 수 있는 재사용가능한 몰딩이다.
에폭시 몰드 (또는 임의의 경질 물질로 제조된 원추형 어레이 몰드)로부터 복제물을 제조하는 절차는 "고온 엠보싱"으로 불린다. 간략하게, 기판 물질을 그의 유리 전이 온도 또는 연화 온도로 가열하고, 이 지점에서 피코돌기를 갖는 몰드를 열-연화된 물질에 대해 균일하게 가압한다. 몰드는 피코돌기가 피코-함입부로서 기판 물질 내로 옮겨진 후에 기판으로부터 분리될 수 있다. 본 개시내용은 바람직하게는 각각 몰드 및 기판의 패턴으로서 피코-콘 및 피코웰을 개시한다.
고온 엠보싱, 에폭시 마스터 및 포토레지스트, 예컨대 SU-8 포토레지스트가 기재되어 있다 (문헌 [Bohl et al. (2005) J. Micromechanics and Microengineering. 15:1125-1130, Jeon et al. (2011) Biomed Microdevices. 13:325-333, Liu, Song, Zong (2014) J. Micromechanics and Microengineering. 24:article ID:035009, del Campo and Greiner (2007) J. Micromechanics and Microengineering. 17:R81-R95] 참조).
다른 마이크로웰 플레이트 실시양태. 플라스틱 마이크로웰 어레이는 규소 몰드를 사용한 열 성형에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 규소 몰드는 마이크로웰의 어레이, 예를 들어 800,000개의 마이크로웰의 어레이를 보유한다. 비-펄스 건식 에칭 공정을 사용하여 테이퍼형 기하구조 및 매끄러운 측벽 및 서브마이크로미터 허용오차를 생성하는 고도의 제어가 창출될 수 있다. 대조적으로, 펄스 건식 에칭 공정, 예컨대 보쉬 공정을 사용하는 방법은 거친 측벽 및 에칭 동안 측면 치수에 대한 제어의 결여를 초래할 수 있다.
비-펄스 건식 에칭 공정을 사용하여, 크롬 마스크를 사용하여 비-펄스 등방성 건식 에칭 공정에 의해 생성된 규소 마스터 상에 플라스틱을 열적으로 형성함으로써 플라스틱 어레이가 제작된다. 이 공정은 3종의 기체, 즉, Ar, SF6 및 C4F8를 사용한다. 공정은 1200 내지 2000 와트의 RF 전력 및 150 와트의 바이어스에서 수행된다. 매끄러운 측벽의 생성과 함께 규소 몰드의 테이퍼의 미세-조정은 3종의 기체 사이의 기체 유동을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. SF6 대 C4F8의 비는 달라지며, 여기서 비의 변화의 결과는, 예를 들어 18도 (매우 비스듬한 벽), 9도 (약간 비스듬한 벽) 또는 2도 (기판에 거의 수직인 벽)의 각도로 존재하는 몰드의 테이퍼형 벽 (규소 기둥)이다 (문헌 [Perry, Henley, and Ramsey (Oct. 26-30, 2014) Development of Plastic Microwell Arrays for Improved Replication Fidelity. 18th Int. Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. San Antonio, TX (pages 1700-1703)] 참조).
실시양태에서, 본 개시내용은 마이크로웰의 어레이를 포함하는 기판, 어레이, 그리드, 마이크로유체 장치 등을 제공한다. 한 실시양태에서, 모든 마이크로웰은 본질적으로 동일한 부피를 갖는다. 이 부피는 약 1 펨토리터, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 20, 약 40, 약 60, 약 80, 약 100, 약 200, 약 400, 약 600 약 800 또는 약 1,000 펨토리터일 수 있다.
또한, 부피는 임의의 상기 2개의 인접한 값 사이의 범위, 예컨대 약 40 펨토리터 내지 약 60 펨토리터의 범위의 형태를 취할 수 있다. 또한, 부피는 상기 목록에서 서로 바로 인접하지 않은 임의의 상기 2개의 값 사이의 범위의 형태를 취할 수 있다.
추가로, 부피는 약 1 피코리터, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 20, 약 40, 약 60, 약 80, 약 100, 약 200, 약 400, 약 600 약 800 또는 약 1,000, 약 2,000, 약 5,000, 약 10,000, 약 20,000, 약 50,000, 약 100,000, 약 200,000, 약 500,000 또는 약 1,000,000 피코리터일 수 있다. 또한, 부피는 상기 목록에서 서로 바로 인접하지 않은 임의의 상기 2개의 값 사이의 범위의 형태를 취할 수 있다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 마이크로웰을 포함하는 임의의 기판 또는 마이크로웰을 포함하는 임의의 어레이를 배제할 수 있으며, 여기서 각각의 마이크로웰의 부피는 상기 값 중 하나에 의해 정의가능하거나 또는 서로 인접한 상기 2개의 값 중 임의의 값의 범위에 의해 정의가능하거나 또는 목록에서 서로 인접하지 않은 상기 2개의 값 중 임의의 값의 범위에 의해 정의가능할 수 있다.
피코웰 상의 구형 플러그 (캡핑 비드로도 공지됨). 본 개시내용은 피코웰 어레이의 각각의 및 모든 웰 또는 실질적으로 모든 웰에 대한 구형 플러그 또는 대안적으로 다공성 구형 플러그를 제공한다. 플러그의 목적은 웰의 내부에 약물, 약물 후보, 세포 내용물 및 대사물을 유지하는 것이다. 플러그는 또한 피코웰의 내용물을 서로 단리하는 것을 돕는다. 구형 플러그는 피코웰의 상단 (또는 개구부 또는 입구)을 덮는 목적이 충족될 수 있는 한, 완벽하게 구형일 필요는 없을 수 있다. 웰은 상단 직경 및 하단 직경을 가질 수 있다. 웰을 캡핑하기 전 구형 플러그의 직경은 약 10 마이크로미터, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 70, 약 90, 약 120 또는 약 200 마이크로미터이다. 플러그는 이들을 피코웰 어레이 위에 간단히 유동시킴으로써 피코웰을 덮도록 첨가될 수 있다. 원심분리, 압력, 교반 또는 다른 방법을 사용하여 비드를 피코웰의 상단 (또는 입구 또는 개구부)에 밀어 넣어 단단한 밀봉을 보장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용매를 사용하여 캡핑 비드의 팽윤 및/또는 크기를 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 비드가 수축되게 하는 용매 중에 로딩될 수 있고, 검정 완충제 또는 상이한 용매로 대체되면, 캡핑 비드는 그의 원래 크기로 회복되거나 또는 팽윤되어, 피코웰을 단단히 밀봉한다. 일부 실시양태에서, 온도를 사용하여 캡핑 비드를 팽윤 또는 수축시켜 피코웰의 입구에서 보다 우수한 밀봉을 얻을 수 있다. 필요한 경우, 캡핑 비드는 제자리에 유지될 수 있고, 계단형 피코웰 어레이 내의 계단들 중 하나에 의해 피코웰 내로 추가로 떨어지는 것이 방지될 수 있다.
캡핑 비드는 본 개시내용의 화합물을 보유하는 동일한 유형의 비드일 수 있거나 또는 상이한 유형의 비드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 실제로 화합물을 보유하는 비드 자체일 수 있다. 캡핑 비드는 피코웰로부터 분자의 확산을 방지하거나 늦추는 수동 캡으로서의 역할을 할 수 있거나 또는 비드는 활성 비드일 수 있고, 여기서 캡핑 비드에 부착된 관능성 모이어티가 피코웰로부터 시약을 포획하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다공성 캡핑 비드는 피코웰 내부에서 수행되는 세포-기반 검정으로부터 방출된 대사물을 수동적으로 포획할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 세포 물질, 예컨대 지질, 단백질, 탄수화물 및 핵산을 비-특이적으로 포획할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 건강한, 이환된, 용해된 또는 고정된 세포로부터 방출된 단백질을 특이적으로 포획하기 위해 항체로 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 세포 핵산을 특이적으로 포획하는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드로 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA 또는 RNA 관능화된 캡핑 비드는 캡핑된 피코웰 내의 세포로부터 방출된 마이크로RNA를 포획하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 2개의 비드, 즉, 피코웰 내부에 있는 화합물 함유 비드 및 피코웰의 입구를 덮는 캡핑 비드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 또한 화합물-보유 비드이다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 화합물 비드로부터 방출된 물질을 포획한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 화합물-비드로부터 방출된 샘플링 화합물을 포획한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 화합물-비드로부터 방출된 DNA 바코드를 포획한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 이들이 캡핑하는 피코웰 내로부터 방출된 상이한 유형의 분석물을 포획한다.
캡 및 피코웰의 상대 경도. 바람직한 장비는 마이크로타이터 플레이트이며, 여기서 각각의 마이크로타이터는 그의 하단 표면에 수천개의 피코웰을 포함한다. 캡이 적절하게 안착되는 능력 또는 캡이 각각의 피코웰을 밀봉하는 능력은 캡의 경도 대비 피코웰의 개구 및 피코웰의 내벽을 구성하는 플라스틱의 경도의 함수일 수 있다.
플라스틱의 경도는 "듀로미터" 값의 관점에서 정의될 수 있다. 경도는 압입에 대한 물질의 저항성으로 정의되고 시험된다. 구형 플러그의 경도 및 피코웰의 벽의 경도는 그의 "듀로미터"의 관점에서 정의될 수 있다. 경도는, 예를 들어 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 또는 약 100일 수 있다. 이들 듀로미터 값 중 임의의 값을 플라스틱 물질 또는 다른 물질에 귀속시키는 데 있어서, 어느 스케일이 사용되는지를 또한 언급해야 한다. 예를 들어, 스케일은 연질 물질에 사용되는 ASTM D2240 유형 A 스케일, 또는 경질 물질에 사용되는 ASTM D2240 유형 D 스케일일 수 있다 (문헌 [Silicon Design Manual, 6th ed., Albright Technologies, Inc., Leominster, MA] 참조).
피코웰의 형상. 일부 실시양태에서, 피코웰은 원통의 직경이 피코웰의 상단 및 하단에서 대략 유사한 원통형 피코웰일 수 있다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 약간의 테이퍼를 가질 수 있고, 피코웰의 상단은 피코웰의 하단보다 약간 더 크다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 원추형 피코웰일 수 있고, 각도가 1도 내지 30도로 임의의 위치에서 정상으로부터 벗어난다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 계단형 피코웰이고, 여기서 피코웰은 (직경이 상단에서 하단으로 매끄럽게 변하는 원추형 피코웰과 대조적으로) 상단 직경에서 하단 직경으로 불연속 계단을 갖는다. 일부 실시양태에서, 계단형 피코웰은 피코웰의 개구부 근처에 넓은 원통 및 피코웰의 하단 근처에 더 좁은 원통을 갖는다. 일부 실시양태에서, 계단형 피코웰은 상단에서 하단으로 다수의 불연속 계단을 가질 수 있다. 다수-계단형 피코웰의 일부 실시양태에서, 모든 가로대에서의 직경은 그 아래 가로대의 직경보다 더 클 수 있다. 일부 실시양태에서, 작은 비드는 계단형 피코웰의 하단에 침착될 수 있고, 캡핑 비드는 계단형-피코웰의 최상단 개구부에 침착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 2개 초과의 비드를 함유할 수 있다.
계단형 피코웰의 제조 방법. 도 29는 계단형 피코웰을 개시한다. 제시된 실시양태는 3개의 구획 및 2개의 계단을 갖는다. 상단 구획이 가장 넓고, 캡을 수용하도록 구성되며, 피코웰이 캡핑되는 상황에서 상단 구획의 대부분이 캡에 의해 점유된다. 중간 구획은 주로 또는 단독으로 시약에 의해 점유되도록 구성된다. 시약은 완충제, 효소 기질, 1종 이상의 염 및 보존제 또는 안정화제, 예컨대 디티오트레이톨, RNAse 억제제, 글리세롤 또는 DMSO를 포함할 수 있다. 가장 낮은 구획은 비드, 즉, DNA 라이브러리 및 방출가능한 화합물 둘 다가 커플링된 비드에 의해 점유되도록 구성된다. DNA 바코드 및 방출가능한 화합물을 보유하는 것에 추가로, 동일한 비드는 또한 "반응 포획 요소"를 보유할 수 있다. 캡핑 비드는 제자리에 유지될 수 있고, 계단형 피코웰 어레이 내의 계단들 중 하나에 의해 피코웰 내로 추가로 떨어지는 것이 방지될 수 있다. 도 29에서, 구조 1은 캡이고, 구조 2는 비드이고, 구조 3은 제1 계단 바로 위에 위치하는 상단 영역이다. 구조 4는 검정 시약을 배치하는 데 사용될 수 있는 중간 영역이다. 중간 영역은 제2 계단 바로 위에 있다. 중간 영역 내의 검정 시약은 가장 낮은 영역으로 확산될 수 있다. 구조 (5)는 비드를 배치하고 1개 이상의 세포를 배치하기 위해 사용될 수 있는 가장 낮은 영역이다.
비드에 의해 점유되는 가장 낮은 구획의 공간에 관하여 (단지 1개의 비드가 피코웰에 존재한다고 가정함), 비드의 직경은 가장 낮은 구획의 직경의 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 98%일 수 있다 (피코웰이 원형 웰이라고 가정함). 피코웰이 원형 웰이 아닌 경우에, 상기 값은 웰의 가장 넓은 치수를 지칭할 수 있다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 파라미터 중 임의의 것을 충족시키지 않는 임의의 시스템 또는 비드를 배제할 수 있다.
추가로 비드에 의해 점유된 공간에 관하여 (단지 1개의 비드가 피코웰에 존재한다고 가정함), 비드의 약 50%는 가장 낮은 구획에 있고, 동일한 비드의 약 50%는 중간 구획에 있으며, 여기서 이들 파라미터는 또한, 약 55%는 가장 낮은 구획에 및 약 65%는 중간 구획에, 약 60%는 가장 낮은 구획에 및 약 40%는 중간 구획에, 약 65%는 가장 낮은 구획에 및 약 45%는 중간 구획에, 약 70%는 가장 낮은 구획에 및 약 30%는 중간 구획에, 약 75%는 가장 낮은 구획에 및 약 25%는 중간 구획에, 약 80%는 가장 낮은 구획에 및 약 20%는 중간 구획에, 약 85%는 가장 낮은 구획에 및 약 15%는 중간 구획에, 약 90%는 가장 낮은 구획에 및 약 10%는 중간 구획에, 약 95%는 가장 낮은 구획에 및 약 5%는 중간 구획에, 및 약 100%는 가장 낮은 구획에 있을 수 있다. 이들 계산을 하기 위해, 비드에 의해 점유된 공간은 (가설적으로) 비드가 다공성이 아닌 것으로 가정한다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 파라미터 중 임의의 것을 충족시키지 않는 임의의 시스템 또는 비드를 배제할 수 있다.
원추형 및 원통형 피코웰에서와 같이, 몰딩 시스템을 사용하는 것이 계단형 피코웰을 생성하는 하나의 바람직한 실시양태이다. 이러한 목적을 위해, 다층 기둥의 어레이를 함유하는 몰드가 요구되고, 그 결과 열가소성 또는 다른 경화성 중합체 기판으로의 스탬핑 시, 계단형 피코웰의 모양이 형성될 수 있다. 각각의 계단이 상이한 직경인 (올라갈수록 더 작음) 다수의 계단을 갖는 층상 기둥 어레이가 다층 리소그래피 공정에 의해 형성될 수 있다. 간략하게, 포토레지스트의 제1 층을 제1 마스크를 통해 노출시켜 마이크로기둥 어레이의 제1 층을 가교시킨다. 포토레지스트의 제2 층은 (이전에 노출된) 제1 층 상에 직접 침착될 수 있고, 제2 포토마스크는 이후에 제2 포토레지스트에서의 제2 패턴을 가교시키는 데 사용될 수 있는 등이다. 다층 패턴화의 종료 시에, 레지스트의 스택을 현상하여 비가교된 영역을 세척해내어, 다층 기둥의 어레이를 남길 수 있다. 다층 기둥 어레이를 생성하기 위한 상세한 프로토콜은 문헌 [Francisco Perdigones et al., (January 8th, 2011). Microsystem Technologies for Biomedical Applications, Biomedical Engineering, Trends in Electronics Anthony N. Laskovski, IntechOpen]에서 찾아볼 수 있다. 다층 기둥 어레이의 어레이가 생성되면, 표준 공정을 사용하여, 몰드를 사용하여 계단형 피코웰 어레이를 임프린팅할 수 있다.
캡핑 비드 제거. 많은 실시양태에서, 피코웰 내의 화학적 교란에 대한 반응, 분석물 또는 세포 반응을 연구하기 위해 캡핑 비드를 샘플링하는 것이 유리하다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 피코웰 어레이를 뒤집고 기계적 교반을 사용함으로써 피코웰의 입구로부터 제거될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용매를 사용하여 피코웰을 수축시켜, 이들을 피코웰의 입구로부터 더 용이하게 제거되도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡핑 비드보다 더 높은 밀도의 액체가 피코웰 어레이의 상단에 첨가되어, 캡핑 비드가 부력에 의해 상승하고 고밀도 배지의 상단에 부유하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 캡핑 비드는 서로 가교되어, 캡핑 비드를 피코웰 어레이의 상단으로부터 박리될 수 있는 캡핑 시트로 전환시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 가교 겔을 캡핑된 피코웰 상에 부을 수 있으며, 여기서 가교 겔은 캡핑 비드에 가교되고, 그 자체에 가교되어, 캡핑 비드를 박리될 수 있는 가교 시트 내로 포매포매되게 한다.
박리된 층 형태로 피코웰의 상대적 위치 보존. 캡핑 비드가 박리될 수 있는 겔 층으로 맞물릴 때와 같은 실시양태에서, 서로에 대한 및 피코웰에 대한 캡핑 비드의 상대적 위치는 박리된 층에서 보존된다는 것이 인지될 것이다. 이는 피코웰 사이의 직접 연결, 피코웰에서의 검정, 피코웰에서의 비드 및 캡핑 비드에 포획된 임의의 물질을 허용한다.
일부 실시양태에서, 피코웰 어레이의 상대적 특징부를 박리된 층 내의 캡핑 비드로 배향시키기 위해 기준 마커가 사용될 수 있다.
피코웰의 등록 및 정렬을 가능하게 하는 기준 마커. 불규칙 어레이로 피코웰을 배열하는 것은 피코웰 어레이의 영상화 동안 이동 및 드리프트의 용이한 확인을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 영상화 동안 광학적 및 기계적 드리프트의 검출을 용이하게 하기 위해 불규칙한 순서로 배열된다. 일부 실시양태에서, 피코웰 어레이는 영상화 동안 이동 및 드리프트를 확인하는 것을 돕는 기준 마커를 함유한다. 일부 실시양태에서, 기준 마커는 피코웰 어레이의 피코웰 사이에 삽입되어 있는 용이하게 확인가능한 형상, 패턴 또는 특징부이다. 일부 실시양태에서, 적은 수의 피코웰 자체는 영상화 동안 광학적 또는 기계적 드리프트의 경우 용이한 등록을 허용하기 위해 용이하게 확인가능한 패턴으로 배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외부 마커, 예컨대 형광 비드는 기준 패턴을 제공하기 위해 피코웰 어레이 상에 드리즐링될 수 있다.
캡-부재 매트 실시양태. 적어도 일부 형태 또는 예에서, 캡-부재 매트 실시양태는 "캡이 없는 필름"의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 피코웰에 존재할 수 있는 임의의 세포 배양 배지 또는 효소 검정 배지의 증발을 방지하기 위해, 피코웰의 상단에서 개구부를 밀봉하는 대신, 매트에 의해 밀봉을 달성할 수 있다. 바람직하게는, 매트는 주어진 피코웰 어레이에서 모든 피코웰을 덮도록 크기조정된다. 대안적으로, 매트는 어레이 내의 피코웰의 미리 결정된 분획을 덮도록 크기조정될 수 있다. 매트는 피코웰 플레이트의 상단에 고정되어, 피코웰을 덮고, 또한 피코웰 사이에 있는 피코웰 플레이트의 일반적으로 평면인 상단 표면을 덮을 수 있다. 단단한 접촉은 다음 중 1개 이상에 의해 달성될 수 있다: ( i ) 예를 들어, 매트의 상단에 놓이고 매트의 상단에서 중량으로서의 역할을 하는 경질 고무 압반에 의해 일정한 압력을 유지하는 것, ( ii ) 경질 고무 압반과 같은 중량에 연결된 매트를 사용하는 것, ( iii ) 전체 매트에 적용될 수 있는 가역적 화학 접착제 (매트가 흡수성 매트가 아닌 상황에서). 매트가 흡수성 매트인 경우에, 매트는 가역적 화학 접착제에 의해 둘러싸인 원형 흡수성 패드를 함유한다. 여기서, 매트는 피코웰 어레이와 접촉되고, 원형 흡수성 패드가 각각의 피코웰의 개구부만을 덮고 개구부 위로 "흘러나오지" 않아 피코웰 플레이트의 평면 표면과 접촉하도록 정렬된다.
피코웰 플레이트의 실질적으로 평면인 표면과 접촉하기 위한 매트로서 사용하기 위한 및 피코웰의 캡이 없는 밀봉에 사용하기 위한 막이 이용가능하다. 편평 시트 막, 예컨대 다우 필름 텍스(Dow Film Tex), 지이 오스모닉스(GE Osmonics), 마이크로딘 나디르(Microdyn Nadir), 토레이(Toray), 트리셉(TriSep), 신더(Synder), 노바멤(Novamem), 에보닉(Evonik) 및 아쿠아포린(Aquaporin) 편평 시트 막은 워싱턴주 켄트 소재의 스테를리테크 코포레이션(Sterlitech Corp)으로부터 이용가능하다. 이들은 폴리아미드-TFC, 셀룰로스 아세테이트, 폴리아미드-우레아-TFC, 셀룰로스 아세테이트 블렌드, 폴리피페라진-아미드-TFC, PES, 복합 폴리아미드-TFC, PES, PAN, PVDF, PSUH, RC, PESH, 폴리에테르 에테르 케톤, 폴리이미드 등으로 제조된 막을 포함한다. 분자량 컷오프의 관점에서 세공 크기는 150 Da, 200 Da, 300 Da, 500 Da, 900 Da, 600 Da, 1,000 Da, 2,000 Da, 3,000 Da, 5,000 Da, 10,000 Da, 50,000 Da, 20,000 Da, 30,000 Da 70,000 Da, 100,000 Da, 200,000 Da, 300,000 Da, 400,000 Da, 500,000 Da, 800,000 Da, 3500 Da, 0.005 마이크로미터, 0.030 마이크로미터, 0.05 마이크로미터, 0.10 마이크로미터, 0.20 마이크로미터 등을 포함한다. 본 개시내용의 시스템, 조성물, 시약 및 방법과 관련하여, 이들 컷오프 값은 다른 부류의 화합물을 제외하고 특정 부류의 화합물의 선택적 수집을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 상기 막 중 일부는 단백질 및 다른 거대분자를 배제하면서, 소분자 대사물이 통과하여 흡수성 매트에 의해 흡수되도록 할 수 있다. 물, 금속 이온, 염, 대사물, 단백질 및 핵산을 포함한 모든 분자에 대해 불투과성인 편평 시트 막이 또한 본 개시내용의 시스템, 조성물 및 방법에 사용하기 위해 이용가능하다.
가역적 접착은 "분자 벨크로", 예를 들어 피리딘-함유 중합체를 갖는 메탈로포르피린 함유 중합체에 의해 매개될 수 있다 (Sievers, Namyslo, Lederle, Huber (2018) eXPRESS Polymer Letters. 12:556-568). 다른 분자 벨크로 접착제는 L-3,4-디히드록시페닐 알라닌, ssDNA의 상보적 가닥 (피코웰 플레이트의 편평 상부 표면에 공유 부착된 한 유형의 ssDNA 및 매트에 공유 부착된 다른 유형의 ssDNA), 카테콜 측쇄를 함유하는 공중합체 등을 수반한다 (상기 문헌 [Sievers, et al.] 참조). 또한, 가역적 접착은 갈륨 접착제에 의해 매개될 수 있으며, 여기서 접착 정도는 약간의 온도 변화에 의해 제어될 수 있다 (Metin Sitti (May 18, 2016) Switch and Stick. The chemical element gallium could be used as a new reversible adhesive that allows its adhesive effect to be switched on and off with ease. Max-planck-Gesellschaft). 또 다른 가역적 접착제는 DSM-니아가 테크놀로지(DSM-Niaga Technology) (네덜란드 즈볼)로부터 이용가능하다.
흡수성 물질 (비-특이적 흡수제, 특이적 흡수제). 흡수성 특징을 제공하기 위해 매트에 혼입될 수 있는 흡수성 물질은 "분자체" 비드, 예컨대 세파로스(Sepharose)®, 세파덱스(Sephadex)®, 아가로스(Agarose)®, 뿐만 아니라 DEAE 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 포스포셀룰로스 또는 상기의 임의의 조합으로 제조된 이온 교환 비드를 포함하며, 이들은 모두 하나의 흡수성 매트로 조합된다. 흡수성 리간드는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 사용되는 것을 포함한다 (캘리포니아주 허큘레스 소재의 바이오라드(BioRad) 카탈로그 참조). 특이적 흡수제는 반응-포획 요소, 예컨대 폴리(dT)를 포함하며, 이는 폴리A 테일과의 혼성화에 의해 mRNA를 포획할 수 있다. 또한, 반응 포획 요소는 엑손-표적화 RNA 프로브, 항체 및 압타머를 포함한다. 이들 각각 또는 그의 임의의 조합은 매트에 공유 부착되어 흡수 매트를 생성할 수 있으며, 여기서 흡수 매트를 피코웰의 상단 표면에 접촉시키는 것은 피코웰 내부에 있을 수 있는 수성 검정 배지 또는 수성 세포 배양 배지의 포획을 가능하게 한다.
( IX ) 피코웰 내로의 비드 침착
피코웰을 갖는 플레이트는 96-웰 플레이트의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 이들 96 웰 각각은 수천개의 피코웰을 함유한다. 또한, 피코웰을 갖는 플레이트는 24-웰 플레이트의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 이들 24개의 웰 각각은 수천개의 피코웰을 함유한다. 96-웰 플레이트의 경우, 각각의 웰을 물 또는 수용액 중 비드의 현탁액 0.1-0.2 mL를 사용하여 충전될 수 있다. 24-웰 플레이트의 경우, 각각의 웰을 물 또는 수용액 중 비드의 현탁액 약 0.5 mL를 사용하여 충전할 수 있다. 현탁액은 일회용 팁을 갖는 통상의 피펫을 사용하여 첨가될 수 있다. 현탁액 중에 존재하는 비드의 수는 단지 1개의 비드를 함유하는 피코웰의 약 1/3, 2개의 비드를 함유하는 피코웰의 약 1/3 및 비드를 함유하지 않거나 2개 초과의 비드를 함유하는 비드의 약 1/3을 생성하는 것일 수 있다. 또한, 현탁액 중 비드의 수는 1개 이상의 비드를 함유하는 웰 중에서, 이들 웰의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98%가 단지 1개의 비드를 함유하는 상황을 생성하는 것일 수 있다.
비드가 침강된 후, 임의의 과량의 액체는 피펫 팁을 96 웰 플레이트의 각각의 웰의 벽에 접촉시키거나 또는 피펫 팁을 24 웰 플레이트의 각각의 웰의 벽에 접촉시키고, 과량의 액체를 빼냄으로써 제거될 수 있다.
피코웰이 반응을 수행하는 데 사용될 검정 시약, 예를 들어 DNA 서열분석, 생화학적 검정 또는 배양된 세포의 검정 시약에 관하여, 검정 시약은 이미 침강된 비드를 함유하는 피코웰에 첨가될 수 있다. 비드 현탁액의 초기 첨가에 대해 상기 기재된 바와 같이, 검정 시약을 피펫으로 첨가한다. 검정 시약이 이미 각각의 피코웰 내에 있는 용액과 평형화한 후, 96-웰 플레이트의 각각의 96 웰 내에 있는 임의의 과량의 용액 또는 24-웰 플레이트의 각각의 24 웰 내에 있는 임의의 과량의 용액을 96-웰 플레이트의 각각의 96 웰의 벽에 접촉하거나 24-웰 플레이트의 각각의 24 웰의 벽에 접촉하는 피펫 팁으로 빼낼 수 있다.
피코웰 어레이의 플로우-셀 실시양태. 피코웰 어레이는 유입구 및 유출구를 갖는 유체 챔버가 피코웰 어레이의 상단에 탑재된 플로우-셀의 일부일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 개시내용의 비드, 세포 및 다른 검정 물질은 유입구로부터 유입되고 유출구를 통해 유출될 수 있다. 중력 또는 원심력을 사용하여 비드가 플로우셀을 통해 유동할 때 비드를 피코웰에 넣을 수 있다.
( X ) 피코웰 내의 비드-결합된 핵산의 서열분석
비드-결합된 핵산은 비드에 여전히 부착되어 있는 동안 서열분석될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비드-결합된 핵산은 비드로부터 DNA 바코드의 절단 후에 서열분석될 수 있다.
서열분석 전 비드로부터의 DNA 바코드 절단. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 비드-결합된 DNA 바코드가 비드로부터 절단되어, 증폭 전에 또는 서열분석 전에 또는 임의의 유형의 서열 확인 기술, 예컨대 핵산 프로브와의 혼성화 전에, DNA 바코드를 가용성 형태로 방출시키는 방법을 포괄할 수 있다.
배제적 실시양태. 실시양태에서, 본 개시내용은 비드-결합된 DNA 바코드가 증폭 전에 또는 서열분석 전에 또는 임의의 유형의 서열 확인 기술, 예컨대 핵산 프로브와의 혼성화 전에 절단되는 것인 임의의 방법, 연관된 시약, 시스템, 조성물 또는 비드를 배제할 수 있다. 또한, 본 개시내용은 DNA 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 절단되는 것인, 또는 DNA 바코드의 일부만을 포함하는 핵산이 증폭 전에, 서열분석 전에 또는 임의의 유형의 서열 확인 기술, 예컨대 핵산 프로브와의 혼성화 전에 절단되는 것인 임의의 방법을 배제할 수 있다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR). PCR 방법, 뿐만 아니라 qPCR 방법은 (1) 고온에서 DNA 주형을 변성시키고, 감소된 온도에서 프라이머를 어닐링하고, 최종적으로 DNA 폴리머라제에 의해 촉매되는 바와 같이 DNA 합성에 의해 프라이머를 연장시키는 것을 수반하는 3-단계 방법에 의존한다 (Gadkar and Filion (2014) Curr. Issues Mol. Biol. 16:1-6). qPCR은 또한 "실시간 PCR"로 불린다 (Kralik and Ricchi (2017) Frontiers Microbiology. 8 (9 pages)).
PCR 방법 및 qPCR 방법에서의 최근의 변형 또는 개선은 헬리카제-의존성 (HDA) 증폭의 사용, 내부 증폭 제어의 사용, 잠금 핵산 (LNA)의 사용 및 억제제에 결합하는 첨가제의 사용을 포함한다 (Gadkar and Filion (2014) Curr. Issues Mol. Biol. 16:1-6). 잠금 핵산은 그의 표적을 인식하고 극도의 정확도로 결합하는 이점을 제공한다.
qPCR은 표적화된 DNA 분자의 동시 증폭 및 정량화를 가능하게 한다. qPCR 방법은 반응 곡선이 특정한 형광 한계값에 도달하는 데 요구되는 증폭 주기의 수를 비교한다 (Pabinger, Rodiger, Kriegner (2014) Biomolecular Detection Quantification. 1:23-33). 레프슬란드(Refsland) 등은 qPCR을 수행하기 위한 명백하게 전형적인 조건의 간결한 설명을 제공한다 (Refsland, Stenglein, Harris (2010) Nucleic Acids Res. 38:4274-4284).
PCR 프라이머의 설계 및 검증, 및 변수, 예컨대 어닐링 온도 (Ta), 용융 온도 (Tm), 신장 단계의 온도, 완충제의 유형에 대한 지침이 이용가능하다 (Bustin and Huggett (2017) Biomolecular Detection Quantification. 14:19-28).
롤링 서클 증폭 (RCA). DNA는 비드에 부착되는 동안 증폭될 수 있다. 증폭된 형태의 DNA는 비-증폭된 DNA보다 서열분석하기가 더 용이하다. 롤링 서클 증폭 방법에서, DNA 태그 (DNA 바코드)는 단일 가닥으로 제조된다. 단일 가닥이 되면, 스플린트 올리고를 첨가하여 태그 DNA의 말단을 가교시키고, 이어서 스플린트 올리고를 연장 및 라이게이션시킨다. DNA 폴리머라제 (마이너스 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성) 사용은 DNA가 스플린트 올리고의 연장을 촉매한 후에 라이게이션가능한 접합부를 보장한다. 이어서, 원형화된 DNA는 가닥-치환 DNA 폴리머라제, 예컨대 phi29 DNA 폴리머라제를 첨가함으로써 롤링 서클 증폭에 적용될 수 있다. DNA 바코드 태그 상에서 롤링 서클 증폭 (RCA)을 수행하는 능력은, 임의의 생존 DNA 분자가 용이하게 서열분석되기에 충분한 양으로 열적으로 증폭될 수 있기 때문에, DNA를 손상시킬 수 있는 합성 화학의 사용을 허용한다. DNA는 엑소뉴클레아제 소화, 닉킹 및 고온에서의 용융에 의해 또는 수산화나트륨으로의 처리에 의해 단일-가닥으로 제조될 수 있다.
롤링 서클 증폭 (RCA)의 추가의 세부사항은 RCA를 수행하는 데 사용될 수 있는 하기 단계에 의해 밝혀졌다.
단계 1: 비드-결합된 ssDNA로 시작한다. 비드-결합된 DNA가 초기에 이중 가닥 형태 (dsDNA)인 경우에, RCA에 사용되지 않을 가닥은 티민 (T) 잔기가 비드-부착 말단에서 또는 그에 매우 근접하게 우라실 (U) 잔기로 대체되도록 제조될 수 있다. dsDNA가 이러한 방식으로 제조되는 경우, 우라실-N 글리코시다제를 사용하여 우라실 잔기를 절단함으로써, 불안정한 당 포스페이트를 (DNA 백본의 일부로서) 남길 수 있으며, 여기서 이러한 불안정한 위치는 뉴클레아제-처리에 의해 절단될 수 있다 (Ostrander et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3419-3423).
단계 2: "스플린트 올리고"를 비드-결합된 ssDNA에 첨가한다. 스플린트 올리고는 비드에 공유 커플링된 ssDNA의 말단 (5'-말단)에서 약 10-20개 염기 쌍에 혼성화하고, 또한 비드-결합된 ssDNA의 유리 말단 (3'-말단)에서 약 10-20개 염기 쌍에 혼성화하도록 설계된다. 스플린트 올리고는 ssDNA의 비드-결합된 말단을 비드-결합된 ssDNA의 유리 말단에 매우 근접하게 가져올 필요는 없다. 거대 루프를 형성하기 위해 비드-결합된 ssDNA 서열의 먼 말단이 함께 테더링되는 것이 필요한 모든 것이다.
단계 3: 술폴로부스 DNA 폴리머라제 IV를 첨가하여, 이 폴리머라제가 스플린트 올리고에 한쪽 말단에서 공유 부착된 상보적 거대 루프를 생성하기 위해 주형으로서 ssDNA의 거대 루프를 사용하게 한다.
단계 4: DNA 리가제를 사용하여 상보적 거대 루프를 공유 폐쇄하며, 그 결과는 원형 ssDNA이다. RCA 동안 "롤링"을 수행하는 것이 이러한 폐쇄 원형 ssDNA이다.
단계 5: 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제를 첨가하고, dNTP를 첨가한다. 첨가된 DNA 폴리머라제는 dNTP를 비드-결합된 ssDNA에 공유 부착시키고, 비드-결합된 ssDNA의 원위 말단을 연장시켜 "롤링 서클" 상에 있는 것의 상보적 카피를 생성하고, 이어서 추가로 연장시켜 "롤링 서클" 상에 있는 것의 또 다른 상보적 카피를 생성하고, 훨씬 더 연장시켜 "롤링 서클" 상에 있는 것의 또 다른 상보적 카피를 생성한다. 이러한 잠재적으로 무한한 증폭 공정 동안, DNA 폴리머라제의 지속적인 활성은 DNA 폴리머라제의 가닥 치환 활성에 의해 가능해진다.
임의로, 본 개시내용의 방법은 형광 분자 비콘에 의한 롤링 서클 증폭 (RCA)의 실시간 모니터링을 포함한다 (Nilsson, Gullberg, Raap (2002) Nucleic Acids Res. 30:e66 (7 pages)). RCA를 위한 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스), 시그니스 트루프라임 테크놀로지(Sygnis TruePrime Technology) (트루프라임(TruePrime)® RCA 키트) (독일 하이델베르크) 및 지이 헬스케어(GE Healthcare) (템플리피(TempliPhi) 500® 증폭 키트)로부터 이용가능하다. 형광단 및 켄처는 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific) (캘리포니아주 칼스배드), 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) (오레곤주 유진), 케이만 케미칼(Cayman Chemical) (미시간주 앤 아버) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 이용가능하다.
단계 6. RCA에 의해 증폭된 ssDNA를 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하며, 여기서 프라이머가 첨가되고, 열안정성 DNA 폴리머라제가 첨가되고, 후속적으로 PCR 생성물이 차세대 서열분석에 의해 서열분석된다.
본 개시내용의 한 측면에서, RCA-증폭된 ssDNA는 PCR 생성물을 제조하는 PCR 증폭 전에 비드로부터 절단된다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, PCR 생성물을 생성하는 PCR 증폭은 비드로부터 RCA-증폭된 ssDNA를 절단하지 않으면서 이루어질 수 있다.
문헌 [Baner et al., "Through the RCA reaction, a strand can be generated that represents many tandem copies of the complement to the circularized molecule" (Baner, Nilsson, Landegren (1998) Nucleic Acids Res. 26:5073-5078)]에 기재된 바와 같이, 바실루스 서브틸리스 상 phi29 DNA 폴리머라제는 그의 가닥 치환 활성 및 높은 진행성 때문에 적합한 효소이다. RCA는 유사하게 문헌 [Li et al. as, "In RCA, a circular template is amplified isothermally by a DNA polymerase phi29 with . . . strand displacement properties. The long single-stranded DNA products contain thousands of sequence repeats: (Li and Zhong (2007) Anal. Chem. 79:9030-9038)]에서 특징화된다.
본 개시내용의 DNA 바코드의 서열분석은, 어떠한 제한도 암시하지 않으면서, 미국 특허 번호 8,632,975 (Vander Horn) (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 DNA 바코드는, 예를 들어 합성에 의한 서열분석을 사용하는 방법, 예컨대 생어 서열분석 방법에 의해, 또는 "차세대 서열분석"을 사용하는 방법에 의해 서열분석될 수 있다.
DNA 서열분석을 위한 일루미나 방법. DNA 서열분석을 위한 일루미나 방법은 하기와 같다. DNA는 초음파처리에 의해 100-400개 염기 쌍 (bp)의 크기 범위로 단편화될 수 있다 (Hughes, Magrini, Demeter (2014) PLoS Genet. 10:e1004462). 일루미나 방법에서, 세포 또는 세포들로부터의 DNA의 단편이 DNA 어댑터 (단편의 말단에 부착됨)에 의해 변형된 것인 DNA 라이브러리가 제조된다. 반응 생성물은 샌드위치의 형태를 취하며, 여기서 서열분석될 DNA는 샌드위치의 중심에 있다. 반응 생성물은 (제1 어댑터)-(서열분석될 DNA)-(제2 어댑터)의 형태를 취한다. 이어서, 어댑터-DNA-어댑터 복합체는 또 다른 어댑터와 회합되며, 여기서 이러한 다른 어댑터는 고체 표면에 공유 부착된다. 고체 표면은 편평 플레이트일 수 있다. 고체 표면은 편평 표면으로부터 튀어나온 많은 어댑터의 론을 갖는다. 어댑터는 샌드위치에 있는 어댑터 중 하나에 대해 상보적인 DNA 서열을 갖는다. 실제로, 론은 2가지 유형의 어댑터를 함유하며, 여기서 하나의 어댑터는 복합체 내의 어댑터 중 하나에 결합하고 (혼성화하고), 복합체를 플레이트에 비-공유 테더링한다. 이들은 "제1 론-결합된 어댑터" 및 "제2 론-결합된 어댑터"로 불릴 수 있다. DNA 폴리머라제의 제1 과제는 주형으로서 테더링된 (그러나 비-공유 결합된) DNA를 사용하여 딸 가닥을 생성하는 것이고, DNA 중합이 일어날 때 딸 가닥은 "제1 론-결합된 어댑터"에 공유 부착된 형태이다. 이러한 공유 연결은 DNA 폴리머라제의 촉매 작용에 의해 생성되었다. 딸 가닥이 완전히 합성된 후, 원위 말단 (배지 내로 튀어나온 말단)은 상기-명명된 샌드위치에서 제2 어댑터에 대해 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이러한 상보적인 DNA 서열은 새로 합성된 딸 DNA의 원위 말단이 구부러지고 "제2 론-결합된 어댑터"에 혼성화하도록 한다. 샌드위치의 어댑터 둘 다가 어떻게 사용되는지 및 "제1 론-결합된 어댑터" 및 "제2 론-결합된 어댑터" 둘 다가 어떻게 사용되는지는 상기 기재되었다.
이어서, 반응 주기를 수회 수행하며, 그 결과는 원래의 dsDNA의 증폭된 버전의 클러스터이다. 실제로, 클러스터는 공유 부착된 (테더링된) ssDNA 분자의 형태를 취하며, 여기서 이들 ssDNA 분자 모두는 원래의 dsDNA (살아있는 세포 또는 조직으로부터 단리된 dsDNA)의 가닥 중 단지 하나에 상응한다. 이러한 테더링된 ssDNA 분자의 클러스터는 "폴로니"로 불린다. 폴로니의 생성은 "가교 증폭"으로 불리는 기술에 의해 이루어진다. 최종적으로, 가교 증폭 및 폴로니의 생성 후에, 고체 표면에 공유 부착된 역방향 가닥을 그의 테더링으로부터 절단하고, 세척해내고, 폐기하여, 정방향 가닥만을 남긴다.
일루미나® 방법에 대한 정보는 문헌 [Goodwin, McPherson, McCombie (2016) Nature Rev. Genetics. 17:333-351, Gierahn, Wadsworth, Hughes (2017) Nature Methods. 14:395-398, Shendure and Hanlee (2008) Nature Biotechnology. 26:1135-1145, Reuter, Spacek, Snyder (2015) Molecular Cell. 58:586-597], [Illumina Sequencing by Synthesis (유튜브 상의 5분 비디오)]로부터 이용가능하다.
올리고뉴클레오티드 라이게이션 및 검출에 의한 서열분석 (SOLiD 서열분석). SOLiD는 염료-표지된 분자로부터의 형광 강도를 측정하여 DNA 단편의 서열을 결정한다. DNA 단편의 라이브러리를 서열분석될 샘플로부터 제조하고, 클론 비드 집단 (각각의 자기 비드의 표면 상에 단지 1종의 단편만을 가짐)을 제조하는 데 사용한다. 비드에 부착된 단편에는 범용 P1 어댑터 서열이 부착되도록 주어져 모든 단편의 출발 서열이 둘 다 공지되고 동일하다. PCR을 수행하고, 이어서 비드에 부착된 생성된 PCR 생성물을 슬라이드에 공유 결합시킨다.
이어서, 프라이머는 라이브러리 주형 내의 P1 어댑터 서열에 혼성화한다. 4개의 형광 표지된 이-염기 프로브의 세트는 서열분석 프라이머에의 라이게이션에 대해 경쟁한다. 이-염기 프로브의 특이성은 각각의 라이게이션 반응에서 모든 제1 및 제2 염기를 조사함으로써 달성된다. 라이게이션, 검출 및 절단의 다수 주기는 최종 판독물 길이를 결정하는 주기의 수로 수행된다. 일련의 라이게이션 주기 후에, 연장 생성물을 제거하고, 주형을 라이게이션 주기의 제2 라운드를 위해 n-1 위치에 대해 상보적인 프라이머로 리셋한다 (문헌 [Wu et al. (2010) Nature Methods. 7:336-337] 참조).
pH-기반 DNA 서열분석. pH-기반 DNA 서열분석은 폴리머라제-촉매된 연장 반응의 부산물로서 생성된 수소 이온을 측정함으로써 염기 혼입을 결정하는 시스템 및 방법이다. 각각 프라이머 및 폴리머라제가 작동가능하게 결합된 DNA 주형을 반응 챔버 또는 마이크로웰 내로 로딩한 후, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 첨가 및 세척의 반복 주기를 수행한다. DNA 주형은 클론 집단으로서 고체 지지체에 부착되는 주형이다. 각각의 이러한 혼입으로 수소 이온이 방출되고, 집합적으로 수소 이온을 방출하는 주형의 집단이 반응 챔버의 국부 pH에 대한 검출가능한 변화를 유발한다 (문헌 [Pourmand (2006) Proc. Nat'l. Acad. Sci.103:6466-6470] 참조). 본 개시내용은 pH-기반 DNA 서열분석을 배제할 수 있다.
연쇄된 DNA 바코드에 관하여, 전체 연쇄된 DNA 바코드는 1회 실행으로 서열분석될 수 있다 (전체 연쇄된 DNA 바코드의 서열분석은 단지 1개의 서열분석 프라이머만을 요구함). 대안적으로, 연쇄된 DNA 바코드를 구성하는 DNA 바코드 모듈의 일부 또는 모두를 개별 서열분석에 적용할 수 있다 (여기서 각각의 개별 서열분석된 DNA 바코드 모듈은 그 자신의 서열분석 프라이머를 얻음). 직교 DNA 바코드에 관하여, 직교 DNA 바코드를 구성하는 각각의 DNA 바코드 모듈은 각각의 DNA 바코드 모듈이 비드 상의 그 자신의 부위에 부착된다는 사실 때문에 그 자신의 전용 서열분석 프라이머를 필요로 한다.
배제적 실시양태. 실시양태에서, 본 개시내용은 마이크로유체, 오일 배지에 존재하는 수성 액적, 및 수성 시약을 함유하는 제1 채널이 오일을 함유하는 제2 채널과 연결되어 연결 영역에서 시작하는 제3 채널을 통해 오일 배지를 통해 이동하는 수성 액적을 생성하는 경우에 생성되는 수성 액적을 수반하는 것인 임의의 시스템, 장치, 장치의 조합 및 방법을 배제할 수 있다. 마이크로유체 장치 및 시약은 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brouzes, Medkova, Savenelli (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:14195-14200, Guo, Rotem, Hayman (2012) Lab Chip. 12:2146-2155, Debs, Utharala, Balyasnikova (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:11570-11575, Sciambi and Abate (2015) Lab Chip. 15:47-51] 참조).
다른 배제적 실시양태에서, "DNA 헤드피스"를 포함하는 임의의 시약, 조성물, 핵산 또는 비드, 또는 "DNA 헤드피스"에 공유 부착된 시약, 조성물, 핵산 또는 비드가 배제될 수 있다. 문헌 [MacConnell, Price, Paegel (2017) ACS Combinatorial Science. 19:181-192]은 비드가 아지도 DNA 헤드피스 모이어티로 관능화된 것인 DNA 헤드피스의 예를 제공한다.
서열분석 방법 및 서열분석 시약에 관한 추가의 배제적 실시양태. 실시양태에서, 본 개시내용은 DNA 서열분석에서 "가역적 종결인자"의 사용을 수반하지 않는 시약, 시스템 또는 방법을 배제할 수 있다. 또한, 메톡시 차단 기를 포함하지 않는 임의의 시약, 시스템 또는 방법이 배제될 수 있다. 또한, DNA 서열분석을 수반하지만, 폴리뉴클레오티드의 순서에 대한 정보가 검출 및 수집되는 시점에 서열분석될 DNA가 비드에 공유 결합되어 있지 않은 것인 임의의 시약, 시스템 또는 방법이 배제될 수 있다. 추가로, 서열분석 반응, 예를 들어 PCR 기술 또는 롤링 서클 기술에 의한 증폭을 수행하기 전에 DNA 주형을 증폭시키는 임의의 시약, 시스템 또는 방법이 배제될 수 있다. 실시양태에서, 임의의 바코딩 방법, 예를 들어 연쇄된 핵산 바코딩 (하나의 단일 핵산 상에 존재하는 화학적 라이브러리의 구성원의 합성에 대한 모든 정보)이 배제될 수 있다. 또 다른 측면에서, 임의의 바코딩 방법, 예를 들어 직교인 핵산 바코딩 (비드 상의 복수의 부착 위치 상에 분산되어 있는 화학적 라이브러리의 주어진 단량체의 합성에 대한 정보)이 배제될 수 있다. DNA 리가제에 관한 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 핵산 바코드의 모듈을 연결하기 위해 DNA 리가제를 사용하는 임의의 시약, 시스템 또는 방법을 배제할 수 있다.
형광단, 켄처 및 FRET-기반 검정. 본 개시내용은 화학적 라이브러리의 구성원을 스크리닝하거나 또는 화학적 라이브러리의 단리된 구성원을 특징화하기 위한 형광단 및 켄처를 제공한다. FRET는 포스터 공명 에너지 전달이다.
검정은 비드-결합된 화학적 라이브러리에 대해 수행될 수 있다. 또한, 검정은 비드로부터의 절단 직후에 유리 화학적 라이브러리 구성원에 대해 수행될 수 있으며, 즉, 비드와 동일한 마이크로웰에서 수행되거나 또는 비드와 동일한 히드로겔 매트릭스의 근처에서 수행될 수 있다. 또한, 검정은 어떠한 비드에도 부착되지 않았거나 또는 비드로부터 절단된 다음 정제된 가용성 화학적 라이브러리 구성원에 대해 수행될 수 있다.
본 개시내용의 시약으로서 적합한 형광단은 알렉사 350, 알렉사 568, 알렉사 594, 알렉사 633, A647, 알렉사 680, 플루오레세인, 퍼시픽 블루, 쿠마린, 알렉사 430, 알렉사 488, 알렉사 532, 알렉사 546, 알렉사 660, ATTO655, ATTO647n, 세타우-665 (세타 바이오케미칼스(SETA Biochemicals), 일리노이주 어바나), Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 테트라메틸로다민 (TMR), 텍사스 레드, 테트라클로로플루오레세인 (TET), 헥사클로로플루오레세인 (HEX) 및 조 염료 (4'-5'-디클로로-2',7'-디메톡시-6-카르복시플루오레세인), SYBR 그린 I (흡수 497 nm, 방출 520 nm), 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM) (흡수 492 nm, 방출 518 nm), 5-카르복시플루오레세인 (5-FAM) (흡수 492 nm, 방출 518 nm), FITC 및 로다민을 포함한다. 켄처는 TAMRA 켄처, 블랙 홀 켄처-1 (BHQ1) 및 블랙 홀 켄처-2 (BHQ2) 및 DABCYL 켄처를 포함한다. 본 특허 문헌의 다른 곳에 개시된 바와 같이, TAMRA는 형광단일 수 있고, 이는 또한 켄처일 수 있음을 주목한다.
FRET 시약이 형광단 및 켄처를 포함하는 것인 FRET-기반 검정을 위한 시약에 대한 지침이 이용가능하다 (문헌 [Johansson (2006) Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching. Methods Mol. Biol. 335:17-29] 참조). FRET-기반 검정의 예는 신호 펩티다제 (SpsB)의 활성을 기질인 "SceD 펩티드"를 사용하여 측정하는 것을 포함한다. 펩티드에 부착된 FRET-쌍은 4-(4-디메틸아미노페닐아조) 5-((2-아미노에틸) 아미노)-1-나프탈렌술폰산이었다 (문헌 [Rao et al. (2009) FEBS J. 276:3222-3234] 참조). 또 다른 예는 펩티드 기질인 KVSLNFPIL을 사용한 HIV-1 프로테아제의 검정으로부터 유래한다. 공여자/수용자 FRET 쌍은 EDANS (공여자) 및 DABCYL (수용자)이었다. EDANS 형광은 비형광 DABCYL로의 공명 에너지 전달에 의해 DABCYL에 의해 켄칭될 수 있다 (문헌 [Meng et al. (2015) J. Biomolecular Screening. 20:606-615] 참조). 또 다른 예는 보툴리눔 독소의 검정으로부터 유래한다. SNAP-25의 활성은 기질인 BoNT-A를 사용함으로써 측정될 수 있다. FRET-기반 검정을 위해, 기질은 N-말단 연결된 플루오레세인-이소티오시아네이트 (FITC)를 가졌고, C-말단 연결된 켄처는 4-(4-디메틸아미노페닐) 디아제닐벤조산 (DABSYL)이었다. 펩티드 기질은 SNAP-25의 아미노산 190-201에 상응하였다 (문헌 [Rasooly and Do (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74:4309-4313] 참조).
본 개시내용은 효소 억제제, 효소 활성화제를 발견 및 확인하기 위해 및 주어진 단백질의 생체내 분해 속도를 증진시킬 수 있는 화합물을 발견하기 위해 화합물의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 시약, 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 시약, 조성물 및 방법은 FRET-기반 검정을 사용할 수 있고, 대안적으로 이들은 FRET-기반 검정 이외의 다른 검정을 사용할 수 있다.
분자 비콘이 기재되어 있다 (문헌 [Baruch, Jefferey, Bogyo (2004) Trends Cell Biology. 14:29-35] 참조). 분자 비콘은 형광단이 링커에 의해 켄처에 결합된 것인 시약이다. 링커는 뉴클레아제에 의해 절단가능할 수 있고, 따라서 뉴클레아제 활성을 측정할 수 있다. 본 개시내용은 뉴클레아제 억제제를 확인하기 위해 및 대안적으로 뉴클레아제 활성화제를 확인하기 위해 화학적 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 펭(Feng) 등은 다양한 뉴클레아제의 활성을 측정하기 위한 분자 비콘의 사용 및 FRET-기반 검정의 사용을 기재하였다 (Feng, Duan, Liu (2009) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48:5316-5321). 펭 등은 다양한 제한 효소의 활성을 측정하기 위한 FRET-기반 검정의 사용을 보여주었다.
( XI ) 비드-결합된 화합물의 방출
절단가능한 링커. 절단가능하지 않은 링커가 제공된다. 또한, 절단가능한 링커가 제공된다 (문헌 [Gordon et al. (1999) J. Chem. Technology Biotechnology. 74:835-851]에 인용된 바와 같은, 문헌 [Holmes and Jones ((1995) J. Org. Chem. 60:2318-2319, Whitehouse et al. (1997) Tetrahedron Lett. 38:7851-7852, 및 Yoo and Greenberg ((1995) J. Org. Chem. 60:3358-3364] 참조). 절단가능한 링커는 또한 알칼리 가수분해에 존재하는 아실 술폰아미드 링커, 뿐만 아니라 온화한 조건 하에 절단되는 활성화된 N-알킬 유도체, 및 또한 아릴-규소 결합을 기재로 하는 무흔적 링커 및 실릴 에테르 연결을 기재로 하는 무흔적 링커를 포함한다 (문헌 [Gordon et al. (1999) J. Chemical Technology Biotechnology. 74:835-851]의 페이지 839 및 842에 기재됨). 또한, 절단 시 (여기서 절단은 퍼아이오데이트 산화에 의함) C-말단 알데히드를 생성하는 타르타르산을 기재로 하는 링커가 제공된다 (문헌 [Paulick et al. (2006) J. Comb. Chem. 8:417-426] 참조).
도 3은 본 개시내용의 조성물 및 방법에 적합한 다양한 절단가능한 링커를 개시한다. 도 3은 문헌 [Yinliang Yang (2014) Design of Cleavable Linkers and Applications in Chemical Proteomics. Technische Universitat Munchen Lehrstuhl fur Chemie der Biopolymere]의 표 1로부터 재현된다. 도 3으로부터, 본 개시내용에 바람직한 절단가능한 링커는 링커 a, c, d, p, q, r 및 t이다. 링커 p는 본원에 개시된 실험 결과에 사용되었다. 이들에 대한 절단 조건은 DTT (링커 a), Na2SO4 (링커 c), Na2SO4 (링커 d), UV 광 (링커 p), UV 광 (링커 q), UV 광 (링커 r) 및 TEV 프로테아제 (링커 t)이다. 이들 특정한 절단 조건은 온화하고, 비드를 손상시키거나, 비드-결합된 화합물을 손상시키거나 또는 비드-결합된 화합물의 임의의 화학적 라이브러리 구성원 (단위)을 손상시키지 않을 것으로 예상된다.
클릭-화학에 상용성인 화학적으로 절단가능한 링커. 문헌 [Qian et al. (2013)]은 클릭-화학에 상용성인 다수의 절단가능한 링커를 기재한다 (Qian, Martell, Pace (2013) ChemBioChem. 14:1410-1414). 이들은 아조 결합이 디티오나이트로 절단가능한 것인 아조 결합을 갖는 링커를 포함한다. 이 링커는 하기 구조를 갖는다: R1-벤젠1-N=N-벤젠2-R2. 제1 벤젠 고리는 R1에 대해 파라인 히드록시 기를 갖고, 제2 벤젠 고리는 R2에 연결된 카르보닐 기를 가지며, 여기서 이 카르보닐 기는 아조 모이어티에 대해 파라이다.
광불안정성 절단가능한 링커. 본 개시내용은 o-니트로벤질 기를 갖는 광절단가능한 링커를 포괄한다. 이 기는 330-370 nm에서의 조사에 의해 절단될 수 있다 (문헌 [Saran and Burke (2007) Bioconjugate Chem. 18:275-279, Mikkelsen, Grier, Mortensen (2018) ACS Combinatorial Science. DOI:10.1021] 참조). o-니트로벤질 링커보다 더 짧은 광분해 시간을 갖는 링커는 2-(2-니트로페닐)-프로필옥시카르보닐 (NPPOC) 링커이다. o-니트로벤질 링커의 변형은 o-니트로벤질아미노 링커이다. 펩티드 쇄에 부착될 때 및 후속적으로 절단될 때, 이 링커는 아미드를 방출한다. o-니트로베라트릴 기를 갖는 링커가 이용가능하며, 이들은 비치환된 o-니트로벤질 링커보다 더 짧은 광분해 시간 및 더 큰 방출 수율을 갖는다. 또한, 페나실 링커, 벤조인 링커 및 피발로일 링커가 이용가능하다 (문헌 [Mikkelsen et al. (2018) ACS Combinatorial Science. DOI:10.1021] 참조).
광절단가능한 에테르 결합을 갖는 링커가 이용가능하다. 이 광절단가능한 링커는 링커가 비드에 부착되고 절단가능한 기가 "R 기"인 경우에 사용될 수 있고, 절단 후에, 방출된 기는 ROH의 형태를 취한다 (문헌 [Glatthar and Giese (2000) Organic Letters. 2:2315-2317] 참조). 또한, 광절단가능한 에스테르 결합을 갖는 링커가 이용가능하다 (상기 문헌 [Glatthar and Giese]에 인용된 바와 같은, 문헌 [Rich et al. (1975) 97:1575, Renil and Pillai (1994) Tetrahedron Lett. 35:3809-3812, Holmes (1997) J. Org. Chem. 62:2370-2380] 참조). 링커 내의 에테르 결합은 산, 염기, 산화, 환원 및 플루오라이드 감수성 실릴-산소 결합 절단 및 광분해에 의해 절단될 수 있다 (상기 문헌 [Glatthar and Giese]).
펩티드 (R1) 및 핵산 (R2)을 연결하는 데 사용된 또 다른 광절단가능한 링커는 하기와 같다. R1은 벤질 기의 메틸렌 모이어티에 직접 연결된다. 고리-부착된 니트로 기는 메틸렌 기에 대해 파라이다. 고리-부착된 에틸 기는 메틸렌 모이어티에 대해 메타이다. 에틸 기의 1-탄소는 포스페이트를 보유한다. 이 포스페이트의 산소 원자에 R2 기가 부착된다 (Olejnik et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27:4626-4631).
아커블롬(Akerblom) 등은 아미노, 히드록실, 브로모 및 메틸아미노 기 및 또한 4-니트로페녹시카르보닐 활성화된 히드록실 및 아미노 기를 함유하는 알파-메틸 2-니트로벤질 유형의 광불안정성 링커를 개시한다 (문헌 [Akerblom and Nyren (1997) Molecular Diversity. 3:137-148] 참조). 카텝신 B는 표적 서열 "발린-시트룰린"을 갖는 링커를 절단할 수 있다 (Dal Corso, Cazzamalli, Neri (2017) Bioconjugate Chemistry. 28:1826-1833).
효소-절단가능한 링커. 효소, 예컨대 프로테아제에 의해 절단가능한 링커가 이용가능하다 (문헌 [Leriche, Chisholm, Wagner (2012) Bioorganic Medicinal Chem. 20:571-582] 참조). 히드록시메틸페녹시 링커는 키모트립신으로 절단될 수 있다 (Maltman, Bejugam, Flitsch (2005) Organic Biomolecular Chem. 3:2505-2507). 담배 식각 바이러스 프로테아제로 절단가능한 링커가 이용가능하다 (문헌 [Weerapana, Speers, Cravatt (2007) Nature Protocols. 2:1414-1425, Dieterich, Link, Graumann (2006) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 103:9482-9487] 참조). 링커 서열 LVPRG 및 LVPRGS는 트롬빈에 의해 절단될 수 있다 (Jenny, Mann, Lundblad (2003) Protein Expression Purification. 31:1-11). 플라스민-절단가능한 링커가 이용가능하다 (Devy, Blacher, Noel (2004) FASEB J. 18:565-567).
비드-결합된 방출-모니터. 본 개시내용은 비드-결합된 화합물의 방출을 평가할 수 있는 신규하고 고유한 방출-모니터를 제공한다. 방출-모니터는 비드-결합된 형광단 및 켄처의 복합체의 형태를 취하며, 여기서 형광단은 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된다. 바람직하게는, 절단가능한 링커는 광절단가능한 링커이다. 바람직하게는, 비드-결합된 방출-모니터는 전용 피코웰에 위치하며, 여기서 그 피코웰은 임의의 다른 유형의 비드는 함유하지 않는다. 광절단가능한 링커의 절단에 의해, 형광단은 비드로부터 방출되고, 피코웰 내의 배지 내로 확산되고, 비드-결합된 켄처로부터 일부 거리를 달성하며, 그 결과는 방출량에 비례하는 형광의 증가이다. 형광의 증가는 피코웰 내에 있는 유리 형광단의 농도의 계산을 가능하게 하고, 보다 중요하게는 다른 웰에 위치하는 다른 비드로부터 방출되는 화학적 화합물의 양의 계산을 가능하게 한다.
요약하면, 비드-결합된 방출-모니터는 그 자신의 전용 웰에 위치하며, 여기서 다른 웰은 약물 후보인 비드-결합된 화합물을 함유하였다.
도 8은 비드-결합된 방출-모니터의 바람직한 비제한적 예의 간소화 버전을 개시한다. 방출-모니터는 형광단 근처에 보유되는 켄처의 형태를 취하여, 형광단의 켄칭을 유발한다. 실시양태에서, 켄칭은 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.8%, 적어도 99.9%, 적어도 99.95% 등이다. 피코웰에서, 하나의 비드는 방출-모니터 전용인 반면, 또 다른 비드 또는 비드들은 화합물을 부착시키는 데 및 DNA 라이브러리를 부착시키는 데 사용된다. 피코웰 내의 모든 비드의 UV 광에의 노출은 형광단 및 화합물의 동시 절단을 유발한다. QSY7이 바람직한 켄처이다. QSY7에 대한 구조 및 CAS 번호는 하기와 같다 (하기 참조):
CAS 명칭/번호: 크산틸륨, 9-[2-[[4-[[(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)옥시]카르보닐]-1-피페리디닐]술포닐]페닐]-3,6-비스(메틸페닐아미노)-, 클로라이드 304014-12-8
켄처로부터 형광단의 분리로 인한 형광의 증가는 동시에 방출된 화합물의 피코웰에서의 농도를 추정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 켄처로부터 형광단의 분리로 인한 형광의 증가는 피코웰에 유리 형태로 존재하는 분자 (이전에 비드-결합된 화합물인 화합물의 형태를 취하는 분자)의 수를 추정하는 데 사용될 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 방출-모니터는 켄처 및 형광단을 포함하며, 여기서 절단은 형광단의 방출을 유발한다 (켄처의 방출은 아님). 이러한 실시양태는 하기 덜 바람직한 실시양태보다 더 낮은 배경 잡음을 제공한다. 덜 바람직한 실시양태에서, 절단은 켄처의 방출을 유발하며, 여기서 판독물은 비드-결합된 형광단으로부터의 형광의 증가의 형태를 취한다.
방출-모니터는 비드로부터 화합물의 UV-유도된 방출 후에, 사용자에게 가용성 화합물의 농도의 척도를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 한 유형의 비드는 방출-모니터 전용이다. "전용"이란, 이 비드가 비드-결합된 화합물을 함유하지도 않고, 비드-결합된 DNA 라이브러리를 함유하지도 않는다는 것을 의미한다.
일반적 제안으로서, 단지 화합물이 감광성 링커의 절단에 의해 비드로부터 방출되었기 때문에, 화합물이 가용성 화합물이 되는 것으로 추정되어서는 안된다. 무엇보다도, 단지 화합물이 "소수성"인 것으로 간주되거나 또는 "수불용성"인 것으로 간주되기 때문에, 어떠한 분자도 용매 중에서 자유롭게 이동하지 않는다는 것을 의미하지는 않는다는 것에 주목한다. 예를 들어, 심지어 콜레스테롤도 물에서 측정가능한 용해도를 갖는다 (문헌 [Saad and Higuchi (1965) Water Solubility of Cholesterol. J. Pharmaceutical Sciences. 54:1205-1206] 참조). 또한, 비드-결합된 수불용성 화합물의 생화학적 효능은 계면활성제, 세제, 첨가제, 예컨대 DMSO, 또는 담체, 예컨대 인간 혈청 알부민에 의해 증가될 수 있다. 따라서, 방출-모니터는, 피코웰이 상기 작용제 중 하나를 함유하거나 또는 대안적으로 수불용성 화합물이 피코웰의 내부에서 배양되는 살아있는 세포의 형질 막 근처에서 방출되는 조건 하에, 제한된 수용해도를 갖거나 수용성이 아닌 화합물의 전체 농도를 평가하는 데 사용될 수 있다.
도 9는 비드-결합된 방출-모니터의 바람직한 실시양태의 간소화 버전을 개시하는 한편, 도 10은 비드-결합된 방출-모니터의 이러한 바람직한 실시양태의 완전하고 상세한 구조를 개시한다.
도 30은 비드가 피코웰에 있는 경우에 비드-방출 모니터의 사용을 입증하는 데이터를 제공한다. 광-절단가능한 링커를 사용하여 결합된 비드-결합된 형광단은 TAMRA (여기 파장 530 nm, 방출 파장 570 nm)였다. 도면은 비드로부터의 형광단의 방출의 시간-경과를 보여준다. 이는 비드-결합된 방출 모니터의 작동, t = 0초, t = 1초, t = 11초 및 t = 71초에서의 형광 데이터의 획득을 보여준다. 도 30은 또한 4개의 보다 작은 도면 중 2개에 대한 보다 작은 도면의 확대를 보여주는 삽입도를 포함한다. 도 30은 "펩티드 Q-플루오르 기질" 및 비드와 함께 아스파르틸 프로테아제인 카텝신-D의 인큐베이션으로부터 얻었다. 시약을 4℃의 웰에 넣었다. 365 nm의 자외선을 사용하여 비드로부터 형광단을 절단함으로써, 형광단을 방출시키고 이를 켄처로부터 분리하였다. 본 검정의 목적은 별개의 웰에서 일어나는 방출의 시간 경과를 평가하는 것이었으며, 여기서 별개의 웰은 상이한 유형의 비드를 함유하였다. 상이한 유형의 비드는 동일한 광-절단가능한 링커를 가졌지만, 이러한 광-절단가능한 링커는 펩스타틴-A에 부착되었다. 펩스타틴-A의 방출은 동일한 검정 배지에 있는 아스파르틸 프로테아제에 결합하여 이를 억제할 수 있다. 비드-결합된 펩스타틴-A 및 아스파르틸 프로테아제를 사용한 이러한 설정은 양성 대조군으로서의 역할을 할 수 있다.
UV를 20x 대물렌즈를 통해 노출시켰다. 영상을 획득=5로 얻었고, 노출은 400 ms였다. TAMRA에서 530 nm에서 여기시킨다. TAMRA는 570 nm에서 방출된다.
도 35는 비드-결합된 펩스타틴-A가 방출되고 방출된 펩스타틴-A가 효소 억제를 일으키는 효소적 검정에 대한 추가의 세부사항을 개시한다. 광절단가능한 펩스타틴-A (양성 대조군) 및 공유 Cy5 표지를 디스플레이하는 10 μm 텐타겔 비드를 PBST 완충제 중 광절단가능한 Fmoc-발린 (음성 대조군)을 디스플레이하는 10 μm 텐타겔 비드와 혼합하였다. 이 비드 집단을 피코웰 내로 도입한 다음, 카텝신-D 프로테아제 및 펩티드 Q-플루오르 기질 (λex = 480 nm, λem = 525 nm)을 포함하는 프로테아제 억제 검정으로 완충제 교환하였다. 웰을 공기에 의해 캡슐화하고, 전체 슬라이드를 UV (365 nm, 77 J/cm2)에 노출시켜, 광불안정성 링커를 절단함으로써, 화합물을 대략 13 μM에 도달하도록 방출시켰다. 플로우셀을 인큐베이션하였다 (30분, 37℃). 양성 대조군 비드를 함유하는 웰은 카텝신-D에 의한 펩티드 단백질분해를 억제하여 낮은 형광 신호를 생성할 것이다. 음성 대조군 비드를 함유하는 웰은 어떠한 카텝신-D 억제도 나타내지 않을 것이고, 형광 강도가 비어있는 웰과 유사할 것이다.
주어진 화학물질에 대한 켄처 및 형광단의 용어는 바로 근처에서 어떤 다른 화학물질이 발생하는지에 따라 변할 수 있다. TAMRA는 비드-결합된 방출 모니터의 실험실 데이터에 사용되는 형광단이지만, 다른 문맥에서 TAMRA는 켄처일 수 있다. TAMRA는 FAM 및 TAMRA를 함유하는 택맨(TaqMan)® 프로브에서 켄처로서 작용한다.
실험 설정 및 실험실 데이터의 추가의 설명. 본 개시내용은 공기에 의해 구획화된, 충전된 피코-웰 내의 포스페이트 완충제 (10 mM 포스페이트, 154 mM 나트륨, pH 8.0) 중 제어된 5(6)-카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA) 농도에 대한 데이터를 제공한다. 형광 영상을 캡쳐하고 (10 ms, 2 ms 노출), 웰-면적을 평균 픽셀 강도 (n ≥ 100)에 의해 정량화하여 농도 대 형광 강도 보정 곡선을 생성하였다. 상기 데이터는 유리 TAMRA의 다양한 미리 결정된 농도 (2, 10, 30, 60, 100 mM TAMRA)에서의 형광을 보여주는 표준 곡선의 형태를 취한다. 이 표준 곡선은 2가지 상이한 조건, 즉, 2 밀리초 노출 또는 10 밀리초 노출로 사진 영상을 찍은 조건 하에 생성되었다. 표준 곡선을 생성하기 위해 사용된 실험을 피코웰에서 수행하였지만, 이 실험에서는 어떠한 비드도 사용하지 않았다 (단지 공지된 양의 TAMRA). 데이터는 단지 표준 곡선 (이는 또한 보정 곡선으로 불릴 수 있음)의 형태를 취하기 때문에, 사진 영상은 이 특허 문헌에 제시되지 않는다.
실험 설정은 하기를 포함하였다. 스킴 X)의 경우, 텐타겔-Lys(PCL1-Tamra)-QSY7 비드 구조. QSY7 (회색)은 광절단가능한 링커 (자주색)를 통해 비드에 공유 부착된 Tamra 형광단 (오렌지색)을 켄칭한다. UV (365 nm)로부터의 조사는 계내 화합물의 정량적 방출을 제공한다.
도 31은 켄처-형광단 기질에 대한 아스파르틸 프로테아제의 촉매 작용 후에 생성된 방출 데이터를 개시한다. 보다 큰 형광은 효소가 보다 촉매 활성인 것을 의미한다. 보다 적은 형광은 효소가 보다 덜 촉매 활성인 것, 즉, 효소가 유리 억제제에 의해 보다 억제되는 것을 의미하며, 여기서 억제제는 비드로부터 유리되고, 유리는 광-절단가능한 링커의 절단에 의해 수득된다. UV 방출 및 카텝신-D 검정 인큐베이션 (λex = 480 nm, λem = 525 nm) 후에 영상을 캡쳐하였다. 양성 대조군 비드를 함유하는 웰을 Cy5 형광단에 의해 스펙트럼으로 확인할 수 있었다 (λex = 645 nm, λem = 665 nm, 오렌지색 가색). 섹션을 개방 웰 부피에 걸쳐 라인-플롯으로 분석하였으며, 음성 대조군 비드를 함유하는 웰은 카텝신-D 억제를 도출하지 않았다. 양성 대조군 비드를 함유하는 웰 내의 검정 부피는 암색이었으며, 이는 강한 억제를 나타낸다. 비어있는 웰 내의 검정 부피는 음성 대조군 비드를 함유하는 웰과 대등하다.
도 32는 하기 절차를 예시한다. 추가로 스킴 X)에 관하여, 피코웰 기질 (웰당 46 pL)을 플로우셀, 진공 하에 습윤시킨 웰에 봉입하고, 텐타겔-Lys(PCL1-TAMRA)-QSY7 비드의 현탁액을 도입하고, 플로우-셀에 걸쳐 공기를 뽑아내어, 각각의 웰을 구획화하였다 (상단). 플로우셀을 제어된 광속의 UV LED (λ평균 365 nm)에 의해 조사하고, 평형화되도록 한 후 (20분), 형광 현미경검사 영상을 취하여 방출된 화합물 (TAMRA) 농도를 정량화하였다 (하단) (도 32). 상세하게, 도 32는 피코웰이 플로우셀에서 습윤되는 단계, 현탁액 중 비드가 피코웰 위에 도입되어 피코웰당 1개의 비드를 생성하는 단계, 과량의 분산 용액을 감소시키기 위해 플로우셀에 걸쳐 공기를 뽑아내고, 피코웰 플레이트의 평면 상단 표면의 표면 아래로 메니스커스 하락을 생성하는 단계, 제어된 UV 노출 (365 nm)로 일부 TAMRA의 방출을 생성하는 단계, 및 형광 현미경검사 (여기 531/40 nm) (594/40 nm 방출)로 형광 신호를 검출하면서 TAMRA로부터의 광 방출을 유발하는 단계를 예시하는, 피코웰의 단면의 도면을 보여준다. 표기법 "슬래시 40"은 대역폭을 지칭하며, 즉, 컷-오프 필터가 광을 531 nm 플러스 20 nm 및 마이너스 20 nm의 범위로 및 594 nm 플러스 20 nm 및 마이너스 20 nm의 범위로 국한시키는 것을 의미한다 (이 슬래시 표기법은 여기 파장 및 또한 방출 파장에 대해 사용될 수 있음).
본 발명자들은 하기 데이터를 보여주는 사진을 얻었다 (도 33 참조). 피코-웰 플로우 셀에서 UV LED (365nm) 노출 후 10-μm 텐타겔-Lys(PCL1-TAMRA)-QSY7 비드로부터 방출된 형광단 (TAMRA)의 형광 방출 (λex 531/40 nm, λem 593/40). A) QSY7의 FRET 켄칭 효과로 인해, UV 노출 (0 J/cm2) 전에 배경을 초과하는 유의한 방출이 없음. TAMRA 방출을 (B) 25 J/cm2, (C) 257 J/cm2, (D) 489 J/cm2, (E) 721 J/cm2, (F) 953 J/cm2의 UV 노출 후에 평형 (20분)에 도달하도록 한 다음, 적절한 노출 시간을 사용하여 영상화하였다. TAMRA 농도를 측정하기 위해 각각의 비드 주위의 부피 내에서 형광 방출을 측정하였다 (도 33). 표기법 "슬래시 40"은 대역폭을 지칭하며, 즉, 컷-오프 필터가 광을 531 nm 플러스 20 nm 및 마이너스 20 nm의 범위로 국한시키는 것을 의미한다 (이 슬래시 표기법은 여기 파장 및 또한 방출 파장에 대해 사용될 수 있음).
하기는 본 발명자들에 의한, 비드-결합된 방출 모니터의 시험 및 사용으로부터의 일부 형광 데이터의 해석이다 (도 34 참조): UV 노출 (365 nm) 후 피코-웰 (45 pL) 내부의 비드-방출된 TAMRA의 농도. 영상 분석은 비드-충전된 웰 (n ≥ 14) 주위의 용액의 평균 픽셀 강도를 사용하고, 영상 노출 시간에 대해 정규화한 다음, 피코 웰 내의 공지의 TAMRA 농도의 표준 곡선에 상관시켰다. 오차 막대는 RSD%로부터 계산된 1σ를 나타낸다. UV 방출된 화합물 농도는 1.1 μM (RSD% 8.9), 54.3 μM (RSD% 5.2), 142 μM (RSD% 4.2), 174 μM (RSD% 7.7), 197.3 μM (RSD% 10.1)이었다 (도 34).
( XII ) 화합물에 대한 생화학적 검정 (세포-기반이 아닌 검정)
피코웰 내의 비드를 사용하여 다양한 생화학적 검정이 가능하다. 비제한적 예는 결합 검정, 효소적 검정, 촉매 검정, 형광 기반 검정, 발광 기반 검정, 산란 기반 검정 등을 포함한다. 실시예는 하기 상술된다.
프로테아제 및 펩티다제의 억제제에 감수성인 생화학적 검정. 목적이 프로테아제를 억제하는 약물을 검출한 다음 개발하는 것인 경우에, 스크리닝 검정은 특정한 프로테아제 또는 펩티다제, 적합한 절단가능한 기질 및 후보 약물 화합물에 의한 억제 정도에 감수성인 색상-기반 검정 또는 형광-기반 검정의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 시약은 비드-결합된 화합물일 수 있으며, 여기서 화합물은 아직 활성에 대해 시험되지 않았다. 또 다른 시약은 비드-결합된 펩스타틴 (HIV-1 프로테아제의 확립된 억제제)의 형태를 취할 수 있다 (Hilton and Wolkowicz (2010) PLoS ONE. 5:e10940 (7 pages)). 또 다른 시약은 HIV-1 프로테아제의 절단가능한 기질일 수 있으며, 여기서 HIV-1 프로테아제에 의한 절단은 색상의 변화 또는 형광의 변화를 유발한다. 스크리닝-양성 약물 후보는 특정한 검정 (주어진 마이크로웰에서)이 색상의 차이 (또는 형광의 차이)를 유발하는 경우에 확인된다. 절단가능한 기질은 켄처 및 형광물질에 공유 결합되고 그가 플랭킹된 감수성 펩티드의 형태를 취한다. 절단 전에, 형광단은 근처 켄처 때문에 형광을 발하지 않지만, 절단 후에, 형광을 나타낸다 (문헌 [Lood et al. (2017) PLoS ONE. 12:e0173919 (11 pages), Ekici et al. (2009) Biochemistry. 48:5753-5759, Carmona et al. (2006) Nature Protocols. 1:1971-1976] 참조). 본 개시내용의 시약 및 방법은 상기 개시된 기술을 포괄한다.
시약이 MDM2 (효소) 및 p53 (기질)을 포함하는 것인, 유비퀴틴 리가제를 억제하는 화합물에 대한 효소-기반 스크리닝 검정. 출원인은 하기 기술에 기초하여 작동 시험을 수행하였다. MDM2는 세포에서 p53의 양을 조절한다. MDM2는 일부 암에서 과다발현된다. MDM2는 하기와 같은 언급에 의해 제시된 바와 같은 효소이다: "시험관내 연구는 정제된 MDM2가 . . . p53을 . . . 유비퀴틴화하기에 충분하다" (Leslie et al. (2015) J. Biol. Chem. 290:12941-12950)]. 출원인의 목적은 MDM2의 억제제를 발견하는 것이며, 여기서 이들 억제제는 p53의 유비퀴틴화를 감소시켜 p53의 후속 분해를 감소시킬 것으로 예상된다. 세포에서의 p53의 예상된 증가의 관점에서, 상기 특성을 갖는 억제제는 암을 치료하는 데 유용할 것으로 예상된다.
본 출원인은 MDM2/HDM2에 의해 매개된 바와 같은 p53의 유비퀴틴화에 대한 레날리도미드의 영향을 평가하기 위해 하기 효소-기반 검정을 사용하였다. 출원인은 하기 키트로부터의 시약을 사용하였다: MDM2/HDM2 유비퀴틴 리가제 키트 - p53 기질 (보스턴 바이오켐(Boston Biochem), 매사추세츠주 캠브리지). 검정에 사용된 시약 중 하나는 공유 결합된 항체를 갖는 비드였다. 비드는 텐타겔® M NH2 (카탈로그 번호 M30102, 랩 폴리머 게엠베하, 독일)이었고, 항체는 마우스에서 생합성된 항-인간 p53 모노클로날 항체였다. MDM2는 기질로서 p53을 사용할 수 있는 E3 리가제이며, 여기서 MDM2는 p53의 유비퀴틴화를 촉매한다.
암을 감소시키기 위한 p53 활성화의 목적. MDM2, "p53"으로 불리는 전사 인자 및 항암 요법 사이의 관계는 하기 설명에 의해 시사된다. 설명은 "MDM2는 p53을 유비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제이며, 이를 프로테아솜 분해에 대해 표적화한다" (Ortiz, Lozano (2018) Oncogene. 37:332-340). p53은 종양-억제 활성을 갖는다. p53 활성은 MDM2에 의해 억제될 수 있다. 문헌 [Wu et al.]에 따르면, MDM2는 "p53-결합 단백질"이다 (문헌 [Wu, Buckley, Chernov (2015) Cell Death Disease. 6:e 2035] 참조). 화합물이, 예를 들어 MDM2와 p53 사이의 상호작용을 차단함으로써 p53의 유비퀴틴화를 방지하는 경우에, 화합물은 항암 약물로서 기능할 것으로 예상될 수 있다.
스크리닝 검정의 목적. 스크리닝 검정의 목적은 p53의 유비퀴틴화에 영향을 미치는 화합물, 예를 들어 p53 유비퀴틴화를 자극하는 화합물 및 p53 유비퀴틴화를 억제하는 화합물을 발견하는 것이다. 상세하게, 목적은 억제 또는 활성화 화합물을 발견하는 것이며, 여기서 그의 효과는 MDM-2 및 E1 리가제, E2 리가제 또는 E3 리가제를 통한 것이다. MDM2는 "뮤린 이중 미세염색체"를 의미한다. MDM2는 "E3 유비퀴틴 리가제"로 불린다. MDM2가 세포에서 발생하는 경우에, 증거는 p53의 유비퀴틴화를 촉매하는 데 있어서의 그의 활성이 다수의 다른 단백질, 예컨대 CUL4A, DDB1 및 RoC1을 요구한다는 것을 시사한다 (문헌 [Banks, Gavrilova (2006) Cell Cycle. 5:1719-1729, Nag et al. (2004) Cancer Res. 64:8152-8155] 참조). 뱅크스(Banks) 등은 "L2DTL, PCNA 및 DDB1/CUL4A 복합체는 p53 종양 억제인자 및 그의 조절인자 MDM2/HDM2와 물리적으로 상호작용하는 것으로 밝혀졌다"라고, p53 및 MDM2를 수반하는 물리적 상호작용을 기재하였다 (Banks, Gavrilova (2006) Cell Cycle. 5:1719-1729). 나그(Nag) 등은 또한 "Cul4A는 E3 리가제로서 기능하고, 유비퀴틴-프로테아솜 경로를 통해 여러 조절 단백질의 단백질분해에 참여한다. 여기서, 본 발명자들은 Cul4A가 MDM2 및 p53-와 회합한다는 것을 제시한다"라고, p53 및 MDM2를 수반하는 물리적 상호작용을 기재하였다 (Nag et al. (2004) Cancer Res. 64:8152-8155).
p53 유비퀴틴화의 조정제에 대한 비드-기반 검정으로부터의 목적하는 판독물. 스크리닝 화합물이 스크리닝-양성 히트를 생성하는 경우에, 즉, 보다 많은 AF488 형광이 존재하는 경우에, 이는 활성화제가 발견되었다는 것을 의미한다. 그리고 스크리닝 화합물이 스크리닝-양성 히트를 생성하는 경우에, 즉, 형광의 감소가 존재하는 경우에, 이는 억제제가 발견되었다는 것을 의미한다. p53의 유비퀴틴화를 억제하는 화합물은 화합물이 암을 치료하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 또한, p53의 유비퀴틴화를 특이적으로 억제하는 화합물, 즉, 화합물이 다른 단백질의 유비퀴틴화를 억제하지 않는 경우 또는 화합물이 p53에 대한 것보다 덜 심한 억제로 다른 단백질의 유비퀴틴화를 억제하는 경우는 또한 화합물이 암을 치료하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
물질. 물질은 보스턴 바이오켐으로부터의 E3 리가제 키트 K-200B를 포함하였다. 보스턴 바이오켐 카탈로그는 이 키트를 Mdm2/HDM2 유비퀴틴 리가제 키트 - p53 기질로서 기재한다. 하기는 이 키트의 일부인 Mdm2에 관한 것이다. 이 키트는 세레블론을 포함하지 않는다. 레날리도미드 및 유사한 화합물은 세레블론 또는 Mdm2에 결합할 수 있으며, 여기서 최종 결과는 유비퀴틴 리가제의 활성화이다. 물질은 또한 다이아몬드 화이트 글래스 현미경 슬라이드, 25 mm x 75 mm (글로브 사이언티픽(Globe Scientific), 뉴저지주 파라무스)를 포함하였다. 코닝 교반기/핫 플레이트 (0 내지 10 설정) 698 와트, 모델 PC-420. N-히드록시-숙신이미드 (NHS). 메틸테트라진 (mTET). 알렉사플루오르488 (AF488) (써모피셔 사이언티픽). 텐타겔 비드 M NH2 (카탈로그 번호 M30102) (랩 폴리머 게엠베하). 파라필름 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스). 도 8은 알렉사 플루오르® 488의 구조를 보여준다. 알렉사 플루오르 488 (AF488)의 구조는 알렉사플루오르488-나노골드-스트렙타비딘에 대한 제품 정보 (나노프로브스, 인크.(Nanoprobes, Inc.), 뉴욕주 야팡)에 제시된다.
( XIII ) 화학적 화합물에 대한 세포-기반 검정
피코웰에서 수행되는 세포-기반 검정은 인간 세포, 비-인간 세포, 인간 암 세포, 비-인간 암 세포, 박테리아 세포, 기생충 세포, 예컨대 플라스모디움 세포를 사용할 수 있다. 또한, 세포-기반 검정은 "사멸되었지만 대사적으로 활성인", 즉, 그의 게놈이 가교되어 대사는 허용하지만 세포 분열을 방지하는 인간 세포 또는 비-인간 세포를 사용하여 수행될 수 있다 (미국 특허 공개 번호 2007/0207170 (Dubensky) (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 또한, 세포-기반 검정은 아폽토시스 세포, 괴사 세포 또는 사멸 세포에 대해 수행될 수 있다. 박테리아 세포를 사용한 세포-기반 검정은 항생제를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 바이러스로 감염된 인간 세포는 항바이러스제를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 세포의 조합이 세포-기반 검정을 위해 제공된다. 예를 들어, 항원 제시를 자극하거나 또는 대안적으로 항원 제시를 손상시키는 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위해 수지상 세포와 T 세포의 조합이 제공된다.
세포-기반 검정은, 예를 들어 정상 조직의 생검, 고형 종양 또는 혈액암 또는 순환 고형 종양 세포로부터의 생검으로부터 수득된 바와 같은 세포의 1차 배양물에 기반할 수 있다. 또한, 세포-기반 검정은 1회 이상 계대배양된 세포에 기반할 수 있다.
피코웰에서 수행되는 세포-기반 검정은 단지 1개의 세포를 함유하거나 또는 2개의 세포, 3개의 세포, 4개의 세포, 5개의 세포 또는 약 2개의 세포, 약 3개의 세포, 약 4개의 세포, 약 5개의 세포 또는 복수의 세포 또는 3개 미만의 세포, 4개 미만의 세포, 5개 미만의 세포 등을 함유하는 배양물을 사용할 수 있다.
출원인은 하기 기술에 기초하여 작동 시험을 수행하였다. 이는 레날리도미드 (시험 화합물)가 전사 인자의 유비퀴틴-매개 단백질분해를 억제하는 예시적 실시양태에 대해 화합물을 스크리닝하기 위한 세포-기반 검정을 기재한다. 전사 인자는 이카로스 및 아이올로스를 포함한다.
본 개시내용은 비드-결합된 화합물 상의 화합물을 스크리닝하는 세포-기반 검정을 제공하며, 여기서 스크리닝은 많은 피코웰을 보유하는 플레이트로 수행된다. 세포-기반 검정의 성분은 비드-결합된 화학적 라이브러리를 보유하기 위한 피코웰을 포함하며, 여기서 각각의 비드에는 실질적으로 단지 1종의 균일한 유형의 화합물이 부착되어 있다. 화합물은 절단가능한 링커에 의해 방출된다. 포유동물 세포가 피코웰에서 배양된다. 피코웰은 또한 배양 배지를 포함한다. 레날리도미드를 사용한 본원에 개시된 비제한적 예는 주어진 표적 단백질의 유비퀴틴화를 조정하는 다른 화합물을 발견하기 위해 화학적 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 원리 증명 예이다.
세포-기반 검정의 보다 짧은 설명. 재조합 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 단백질분해를 유도하는 화합물을 검출하고 스크리닝하기 위한 시약으로서 사용되며, 여기서 스크리닝 양성인 화합물을 확인하는 판독은 녹색 세포가 무색 세포 또는 감소된 녹색을 갖는 세포가 되는 상황이다. 이러한 세포-기반 검정의 메카니즘에 관하여, 녹색 세포가 무색 세포 또는 감소된 녹색을 갖는 세포로 되는데 있어서 레날리도미드의 작용 메카니즘은 레날리도미드가 "세레블론"으로 불리는 단백질에 결합하는 것이다. 세포에서, 세레블론은 "E3 유비퀴틴 리가제"로 불리는 단백질의 복합체의 일부이다. 세레블론은 항암 약물인 레날리도미드, 탈리도미드 및 포말리도미드의 직접 표적이다. E3 유비퀴틴 리가제의 정상 및 구성적 활성 및 그의 세레블론에 대한 관련성은 하기와 같이 기재되었다: "세레블론은 . . . E3 유비퀴틴 리가제에 . . . 결속하는 [표적 단백질의] 프로테오솜 분해를 촉진한다" (문헌 [Akuffo et al. (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200] 참조). E3 유비퀴틴 리가제의 정상 활성과 달리, 약물, 예컨대 레날리도미드, 탈리도미드 또는 포말리도미드가 첨가되는 경우에, 결과는 "레날리도미드, 탈리도미드 및 포말리도미드가 . . . E3 유비퀴틴 리가제에 의한 기질의 . . . 유비퀴틴화 및 분해를 촉진한다 . . . 각각의 이들 약물은 전사 인자인 IKZF1 및 IKZF3의 분해를 유도한다" (Kronke et al. (2015) Nature. 523:183-188).
용어와 관련하여, 세레블론은 "E3 리가제"로 불리고 또한 "E3 유비퀴틴 리가제"로 불리는 단백질의 복합체의 일부인 것으로 기재되었다. 일반적으로, 세레블론 자체는 "E3 리가제"로 불리지 않는다. 하기 발췌문은 단어 "세레블론"이 어떻게 사용되는지를 밝히고 있다. 문헌 [Akuffo et al. (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200]에 따르면, "탈리도미드에 결합 시 . . . E3 리가제 기질 수용체 세레블론은 . . . DDB1-CUL4A-Roc1-RBX1 E3 유비퀴틴 리가제를 결속시킴으로써 [기질의] 프로테오솜 파괴를 촉진한다." 일관되게, 문헌 [Yang et al. (2018) J. Biol. Chem. 293:10141-10157]은 다음과 같이 개시한다: "세레블론은 . . . 단백질 [기질] 유비퀴틴화를 매개하는 쿨린-4 RING E3 리가제의 기질 수용체로서 기능한다." 문헌 [Zhu et al. (2014) Blood. 124:536-545]은 다음과 같이 언급한다: "탈리도미드가 CRBN [세레블론]에 결합하여 CRBN, DDB1 및 CUL4로 구성된 . . . E3 유비퀴틴 리가제 복합체의 기능을 변경시킨다." 문헌 [Lopez-Girona et al. (2012) Leukemia. 26:2326-2335]은 다음과 같이 언급한다: "연구는 탈리도미드의 . . . 직접 분자 표적으로서 E3 리가제 단백질 세레블론 (CRBN)을 확인하였다 . . . CRBN 및 . . . DDB1은 Cul4A 및 Roc1과 기능적 E3 리가제 복합체를 형성한다."
본 출원인에 의해 고안되고 사용된 세포-기반 검정의 큰 그림을 보면, 제1 단계는 레날리도미드가 세포에 첨가되는 것이다. 마지막 단계는 IKZF1 및 IKZF3이 분해되는 것이다. IKZF1이 GFP와의 융합 단백질로서 발생하는 경우에, 마지막 단계는 전체 융합 단백질이 프로테아솜에 의해 분해된다는 것이다. 유사하게, IKZF3이 GFP와의 융합 단백질로서 발생하는 경우에, 최종 단계는 이러한 전체 융합 단백질이 프로테아솜에 의해 분해된다는 것이다. GFP 분해의 결과는 일단 녹색-형광 세포인 세포가 비-형광 세포로 전환된다는 것이다.
세포-기반 검정의 보다 긴 설명. 이는 E3 유비퀴틴 리가제의 단백질 (단백질의 복합체)의 명칭, 이 복합체에 결합하는 단백질의 명칭 및 이 복합체의 표적인 단백질의 명칭에 관한 것이다. 이들 명칭에 대해, 공개된 문헌은 일치하지 않는다. 때때로 이는 단백질의 명칭에 의해 단백질을 지칭하고, 때때로 이는 단백질을 코딩하는 유전자의 명칭을 사용하여 단백질을 지칭한다. 이러한 이유로, 하기 설명은 단백질 명칭을 유전자 명칭과 함께, 예컨대 "세레블론" (단백질의 명칭) 및 "CRBN" (유전자의 명칭)을 사용한다. 또한, "이카로스"는 단백질의 명칭이고, 유전자의 명칭은 IKZF1이다. 또한, "아이올로스"는 단백질의 명칭이고, IKZF3은 유전자의 명칭이다. "쿨린-링 핑거 리가제-4"는 단백질의 명칭이고, 유전자의 명칭은 CRL4이다. "쿨린-1의 조절인자"는 단백질의 명칭이고, 유전자의 명칭은 ROC1이다. ROC1은 또한 RBX1로 공지되어 있다 (Jia and Sun (2009) Cell Division. 4:16. DOI:10.1186). "쿨린-4A"는 단백질의 명칭이고, 유전자의 명칭은 CUL4A이다. 문헌 [Schafer, Ye, Chopra (2018) Ann. Rheum. Dis. DOI:10.1136, Chen, Peng, Hu (2015) Scientific Reports. 5:10667, Matyskiela et al. (2016) Nature. 535:252-257, Akuffo et al. (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200)]을 참조한다.
E3 유비퀴틴 리가제는 유비퀴틴 잔기의 표적 단백질로의 전달을 촉매하며, 그 결과는 표적 단백질이 분해를 위해 프로테아솜으로 보내지는 것이다. E3 리가제는 표적 단백질의 1개 이상의 리신 잔기에 대한 유비퀴틴의 부착을 촉매한다. 인간은 약 617개의 상이한 E3 유비퀴틴 리가제 효소를 발현한다 (문헌 [Shearer et al. (2015) Molecular Cancer Res. 13:1523-1532] 참조). E3 유비퀴틴 리가제는 이들 단백질의 복합체이다: DNA 손상 결합 단백질-1 (DDB1), 쿨린-4 (CUL4A 또는 CUL4B), 쿨린-1의 조절인자 (RoC1) 및 RING 박스-도메인 단백질 (RBX1). 상기 언급된 바와 같이, RoC1은 RBX1과 동일한 단백질이다 (문헌 [Jia and Sun (2009) Cell Division. 4:16. DOI:10.1186] 참조). 세레블론 (CRBN)이 E3 유비퀴틴 리가제 복합체에 연결되는 경우에, 생성된 보다 큰 복합체는 CRL4CRBN로 불린다 (Matyskiela et al. (2016) Nature. 535:252-257). 용어 "CRL4"는 "쿨린-4 RING 리가제"를 의미한다 (Gandhi et al. (2013) Brit. J. Haematol. 164:233-244, Chamberlain et al. (2014) Nature Struct. Mol. Biol. 21:803-809). 상기 명명법의 불일치는 세레블론에 대한 문헌을 읽을 때 고려될 필요가 있다.
하기는 상기 개시된 짧은 발췌문의 보다 긴 버전이다. 또 다른 형태의 명명법, 즉, 용어: "CRL4CRBN E3 유비퀴틴 리가제"가 하기에 제시된다. 보다 긴 설명은 다양한 명칭 및 세포 사건을 보다 완전히 통합시킨다. "세레블론 (CRBN)과 E3 유비퀴틴 리가제 복합체 사이의 관계는 다음과 같이 기재되었다: "세레블론 (CRBN)은 DDB1-CUL4A-Roc1-RBX1 E3 유비퀴틴 리가제를 결속시킴으로써 [표적 단백질의] 프로테오솜 분해를 촉진한다" (Akuffo et al. (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200). 항암 약물에 관하여, "레날리도미드, 탈리도미드 및 포말리도미드는 . . . E3 유비퀴틴 리가제에 의한 기질의 . . . 유비퀴틴화 및 분해를 촉진한다. 이들 화합물은 CRL4CRBN E3 유비퀴틴 리가제에 대한 기질 어댑터인 CRBN에 결합한다 . . . 각각의 이들 약물은 . . . 전사 인자인 IKZF1 및 IKZF3의 분해를 유도한다" (Kronke et al. (2015) Nature. 523:183-188).
이는 임의의 주어진 마이크로웰, 나노웰 또는 피코웰이 비드를 함유하고, 비드가 공유 연결된 화합물을 갖고, 화합물이 절단가능한 링커를 통해 부착되고, 웰이 1개 이상의 배양된 포유동물 세포를 함유하는 것인 세포-기반 검정에 관한 것이다. 본 개시내용의 화합물 및 약물 후보에 대한 반응은 1종 이상의 바이오마커에 의해 평가될 수 있다.
바이오마커는 진단 바이오마커, 주어진 환자가 주어진 약물에 반응할지 (더 나아질지)를 예측하는 바이오마커 및 주어진 환자가 주어진 약물에 대해 허용되지 않는 독성을 경험할지를 예측하는 바이오마커를 포함한다 (Brody, T. (2016) Clinical Trials: Study Design, Endpoints and Biomarkers, Drug Safety, and FDA and ICH Guidelines, 2nd ed., Elsevier, San Diego, CA). 본 개시내용은 또 다른 종류의 바이오마커, 즉, 약물 요법이 개시된 후에 주어진 약물에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 바이오마커를 사용한다. 예를 들자면, 하기는 바이오마커 "퍼옥시레독신6 (PRDX6) 및 폐암에 관한 것이다. 문헌 [Hughes et al.]에 따르면, "세포주로부터의 세포 배지 중 PRDX6 수준은 . . . 비히클에 비해 게피티닙 처리 후 . . . 증가하였다 . . . 시간 경과에 따른 PRDX6 축적은 게피티닙 감수성과 양의 상관관계가 있었다. 혈청 PRDX6 수준은 . . . 처음 24시간의 처리 동안 현저하게 증가하였고 . . . 게피티닙 처리 과정 동안 혈청 PRDX6의 변화는 . . . 항-EGFR 작용제에 대한 반응을 모니터링하기 위한 영상화-기반 전략에 비해 이점을 . . . 제공한다." 바이오마커가 반응 효능의 보다 직접적인 척도, 즉, 종양 크기 및 수의 감소를 검출하기 위한 "영상화"의 사용에 비해 이점을 갖는다는 것을 언급한 것을 주목한다 (Hughes et al. (2018) Cancer Biomarkers. 22:333-344). 항암 약물에 대한 반응을 모니터링하는 다른 바이오마커는 난소암에 대한 플라틴 요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 CA125, 및 난소암에 대한 화학요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 혈청 HSPB1을 포함한다 (문헌 [Rohr et al. (2016) Anticancer Res. 36:1015-1022, Stope et al. (2016) Anticancer Res. 36:3321-3327] 참조).
시토카인 발현. 반응은 발현된 시토카인, 예컨대 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-감마 및 TNF-알파를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 특정한 시토카인은 이들 시토카인 중 하나를 특이적으로 인식하는 항체를 보유하는 금 나노구조를 사용하여 동시에 측정될 수 있으며, 여기서 검출은 플라즈몬 공명을 수반한다 (Spackova, Wrobel, Homola (2016) Proceedings of the IEEE. 104:2380-2408, Oh et al. (2014) ACS Nano. 8:2667-2676). 단일 세포, 예컨대 단일 T 세포에 의해 발현된 시토카인은 마이크로웰을 포함하는 장치에서 형광 항체에 의해 측정될 수 있다 (Zhu, Stybayeva (2009) Anal. Chem. 81:8150-8156). 상기 방법은 본 개시내용을 위한 시약 및 방법으로서 유용하다.
일부 실시양태에서, 시토카인에 대한 항체는 피코웰의 벽에 부착될 수 있으며, 여기서 약물 노출의 함수로서 세포로부터 방출된 또는 차등 방출된 임의의 시토카인은 피코웰의 벽에 결합된 항체에 의해 포획될 수 있다. 포획된 시토카인은 표지된 항체의 제2 세트에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인에 대한 항체는 캡핑 비드에 부착될 수 있다. 이어서, 캡핑 비드를 가교 히드로겔 시트에 포매시킬 수 있고, 이를 박리하여, 예를 들어 ELISA, 질량 분광계 또는 다른 분석 기술을 통한 추가 분석에 적용할 수 있다.
아폽토시스. 아폽토시스에 대한 실시간 데이터, 및 단일 세포의 아폽토시스에서의 초기 사건은 표면-증강 라만 분광분석법 (SERS) 및 국부 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)으로 측정될 수 있다 (문헌 [Stojanovic, Schasfoort (2016) Sensing Bio-Sensing Res.7:48-54, Loo, Lau, Kong (2017) Micromachines. 8:338. DOI:10.3390] 참조). 상기 문헌 [Stajanovic]은 세포로부터 시토크롬 C, EpCam 및 CD49e의 방출을 검출한다. 상기 문헌 [Loo et al.]은 세포로부터 시토크롬 C의 방출을 측정하며, 여기서 검출은 DNA 압타머를 수반한다 (이 DNA 압타머는 항체와 같이 작용함). 조우(Zhou) 등은 SERS를 사용하여 단일 세포에서 초기 아폽토시스를 검출하며, 여기서 세포 막 상의 포스파티딜 세린이 측정된다 (문헌 [Zhou, Wang, Yuan (2016) Analyst. 141:4293-4298] 참조). 아폽토시스에 대한 데이터를 수집하는 것에 추가로, 유사분열 단계, 대사물의 방출, 형질 막에 결합된 생체분자의 발현에 대한 데이터를 수집함으로써 약물 활성을 평가하는 데 SERS가 사용될 수 있다 (문헌 [Cialla-May et al. (2017) Chem. Soc. Rev. 46:3945-3961] 참조). 플라즈몬 공명은 아폽토시스에서 발생하는 단백질 변성 및 DNA 단편화를 측정할 수 있다 (문헌 [Kang, Austin, El-Sayed (2014) ACS Nano. 8:4883-4892] 참조). 플라즈몬 공명 (SERS)은 알파 나선 형태 대 베타 시트 형태의 유사분열 단백질의 백분율을 측정함으로써 암 세포와 정상 세포를 구별할 수 있다 (Panikkanvalappil, Hira, El-Sayed (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:159-15968). 상기 방법은 본 개시내용을 위한 시약 및 방법으로서 적합하다.
아폽토시스는 또한 플라즈몬 공명을 사용하지 않고 대신 항-절단된 카스파제-3 항체를 사용하는 면역세포화학을 사용하는 방법으로, 배양된 세포에서 측정될 수 있다 (Shih et al. (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223).
세포-기반 검정에 대한 일반적 정보. 본 개시내용의 세포-기반 검정은 인간 암 세포, 고형 종양으로부터의 세포, 혈액암으로부터의 세포, 인간 줄기 세포, 인간 간세포, 병원성 박테리아, 감염성 박테리아, 박테리아로 감염된 인간 세포, 바이러스로 감염된 인간 세포 등으로부터의 반응을 시험하는 데 사용될 수 있다. 검정은 세포의 형태학적 반응, 예컨대 이동, 뿐만 아니라 유전적 반응 및 생화학적 반응을 검출할 수 있다.
본 개시내용의 검정은 피코웰 내부에 위치하는 세포의 반응을 검출하도록 또는 피코웰 외부에, 예컨대 피코웰의 어레이 위의 층으로서 위치한 영양 배지 내에 위치하는 세포의 반응을 검출하도록 설계될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 검정은 세포 및 비드가 배지 내에 위치하는 경우, 세포는 배지 내에 위치하고 비드는 배지 위 또는 아래에 위치하는 경우, 세포는 배지의 상단에 위치하고 비드는 배지 위 또는 내부 또는 아래에 위치하는 경우, 세포의 반응을 검출하도록 설계될 수 있다.
본 개시내용은 피코웰 어레이에 세포 집단을 제공한다. 실시양태에서, 세포 집단의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 100%가 피코웰 내부에 존재한다 (피코웰 위에 위치한 임의의 영역에는 존재하지 않음). 실시양태에서, 웰 내부에 존재하는 세포의 비율 (나머지는 웰의 어레이 위에 존재하는 영양 배지의 층에 위치함)은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 100% 또는 이들 숫자 중 2개에 의해 정의된 임의의 범위, 예컨대 "약 60% 내지 약 90%"의 범위일 수 있다.
세포용 매트릭스. 세포의 생물학적 활성의 검정을 위해, 및 세포가 비드로부터 방출된 화합물에 노출되는 경우에, 또는 세포가 비드-결합된 화합물에 노출되는 경우에, 적합한 매트릭스는 하기 중 1종 이상을 포함하는 것을 포함한다: 폴리-D-리신 (PDL), 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-L-오르니틴 (PLO), 비트로넥틴, 오스테오폰틴, 콜라겐, RGD 서열을 함유하는 펩티드, RGD 서열을 함유하는 폴리펩티드, 라미닌, 라미닌/피브로넥틴 복합체, 라미닌/엔탁틴 복합체 등. 적합한 매트릭스는 또한 코닝, 인크.(Corning, Inc.)로부터 이용가능한 제품, 예컨대 퓨라매트릭스(PuraMatrix)® 펩티드 히드로겔(Peptide Hydrogel)®, 셀-택(Cell-Tak)® 세포 및 조직 접착제, 매트리겔(Matrigel)® 등을 포함한다. 문헌 [Corning Life Sciences (2015) Corning Cell Culture Surfaces, Tewksbury, MA (20 pages), De Castro, Orive, Pedraz (2005) J. Microencapsul. 22:303-315]을 참조한다. 배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 매트릭스 중 하나 또는 상기 중합체 중 하나를 포함하는 임의의 조성물 또는 방법을 배제할 수 있다.
실시양태에서, 본 개시내용은 개별 피코웰이 비드, 1개 이상의 세포 및 용액 (임의의 매트릭스 없음) 또는 매트릭스 또는 조합된 용액과 매트릭스를 함유하는 어레이를 제공한다. 매트릭스는 히드로겔, 폴리리신, 비트로넥틴, 매트리겔® 등일 수 있다.
비드-결합된 화합물 또는 비드-방출된 화합물의 활성이 평가될 수 있다. 활성을 평가하기 위한 검정은 효소를 활성화 또는 억제하는 것, 세포-신호전달 캐스케이드 또는 개별 세포-신호전달 단백질을 활성화 또는 억제하는 것, 항체에 (또는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)에, 항체의 가변 영역에) 결합하는 것, 효소에 대한 (또는 항체에 대한 또는 항체의 가변 영역에 대한) 리간드 또는 기질의 결합을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
상기 검정의 경우, 판독물은, 예를 들어 켄처에 연결된 형광단 (F-Q)을 수반하는 형광 검정으로 결정될 수 있다. 링커는 엔도프로테아제, DNAse, RNAse 또는 포스포리파제에 의해 절단가능하도록 설계될 수 있다 (문헌 [Stefflova, Zheng (2007) Frontiers Bioscience. 12:4709-4721] 참조). 용어 "분자 비콘"은 이러한 유형의 F-Q 분자를 지칭하지만, "분자 프로브"는 또한 택맨® 검정에서와 같이 F 및 Q의 분리가 혼성화에 의해 유도되는 구축물을 지칭하는 것으로 사용되었다 (Tyagi and Kramer (1996) Nature Biotechnol. 14:303-308, Tsourkas, Behlke, Bao (2003) Nucleic Acids Res. 15:1319-1330).
약물 노출에 반응한 전사 프로파일링. 본 개시내용의 DNA 바코드는 반응-포획 요소를 함유하도록 변형될 수 있으며, 여기서 반응 포획 요소는 바코드의 코딩 부분에 의해 코딩되는 교란에 대한 세포의 반응을 포획한다. 일부 실시양태에서, DNA 바코드는 폴리-T 섹션 (티미딘 뉴클레오티드의 다수 반복부)에서 종결될 수 있으며, 여기서 폴리-T 서열은 용해된 세포로부터 방출된 폴리-A 종결 mRNA 분자를 포획하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응-포획 서열은 관심 유전자에 대해 상보적일 수 있고, 이에 의해 이러한 실시양태의 비드에 대한 혼성화를 통해 목적하는 유전자의 발현 프로파일을 포획할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피코웰은 전사 프로파일이 비드 상에 포획되는 단일 세포 피코웰을 함유할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 전사 프로파일이 포획되는 피코웰에 복수의 세포가 함유될 수 있다.
하나의 예시적인 작업흐름에서, 약물에 대한 세포의 전사 반응을 포획하기 위해 하기 절차를 따를 수 있다. (a) 웰당 단일 세포를 포획하도록 설계된 피코웰을 제공한다. (b) 화합물-적재된 DNA 바코딩된 비드를 피코웰당 1개의 비드가 존재하도록 피코웰 내로 도입한다. (c) 적절한 방법 (실시양태의 비드에 대해 적절하게, UV 절단가능한 링커를 통해 부착된 화합물의 경우 UV 처리, 화합물에 침지된 비드의 경우 확산, 산 절단가능, 염기 절단가능, 온도 절단가능 등)에 의해 화합물을 각각의 피코웰에서 비드로부터 방출시킨다. (d) 피코웰은 피코웰 내에 내용물을 보유하는 캡핑 비드를 통해 또는 다른 수단, 예컨대 피코웰의 상단 상의 공기 장벽 또는 오일 장벽에 의해 서로 단리될 수 있다. (e) 피코웰 내의 세포를 소정의 지속기간 동안 비드로부터 방출된 화합물의 존재 하에 인큐베이션되도록 한다. (f) 적합한 양의 시간, 즉, 1시간, 2시간, 5시간, 9시간, 12시간, 15시간, 18시간, 1일, 3일, 1주, 2주, 1개월 또는 검정에 기초한 또 다른 적절한 시간 후에, 세포를 용해 방법에 의해 용해시킨다. 용해 방법은 세제의 첨가, 동결 및 해동의 반복 주기, 가열, 막 파괴 펩티드의 첨가, 기계적 교반 또는 다른 적합한 수단을 수반할 수 있다. (g) 용해되면, 세포의 내용물은 피코웰 내의 비드에 노출되고, 이 때 피코웰의 비드 상의 반응-포획 요소는 이들이 설계된 반응을 포획할 수 있게 된다. 일부 실시양태에서, 반응 포획은 각각의 피코웰 내의 세포 (또는 세포들)의 완전한 mRNA 프로파일을 포획하는 폴리-T 서열이다. 일부 실시양태에서, 반응-포획 요소는 세포로부터 특이적 DNA 또는 RNA 서열을 포획하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 세포의 전사 반응은 화합물의 투여량 (또는 농도)의 함수로서 포획될 수 있다.
( XIV ) 세포에 대한 교란-반응 분석
본원에 기재된 방법은 교란의 라이브러리 및 세포의 라이브러리를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란 및 세포는 국한된 환경에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 동안 또는 후에, 교란을 확인하는 바코드 ("교란 바코드")는 그와 함께 인큐베이션되는 세포로 전달될 수 있다. 방법은 세포를 교란으로부터 방출 (즉, 분리 또는 제거)시키고, 세포를 교란 바코드와 함께 세포 내용물이 포획되는 제2 국한에 적용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 국한은 세포-특이적 바코드를 함유할 수 있고, 이는 세포 내용물 및 교란 바코드를 후속적으로 연구하여, 교란을 세포 반응에 관련시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 2가지 반응인 교란 바코드에 의해 코딩되는 교란 반응 및 측정 반응을 포함할 수 있다. 교란 반응에서, 세포는 교란에 적용될 수 있다. 측정 반응에서, 교란의 결과로서의 세포 반응이 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 측정 반응은 측정 바코드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 방법은 교란 바코드를 측정 반응으로 전달하는 단계 및 측정 반응에 함유된 교란 바코드 및 측정 바코드 둘 다를 포획하여, 교란을 세포 반응에 관련시키는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 교란 바코드에 의해 코딩되는 교란 반응을 포함할 수 있다. 교란 반응은 세포에 교란을 적용하고, 후속적으로 적용된 교란에 대한 세포의 세포 반응을 측정하는 것을 포함한다. 교란 바코드는 세포 반응을 측정하기 전 또는 후에 디코딩될 수 있고, 따라서 교란의 정체를 측정된 세포 반응에 관련시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 DNA-코딩된, 비드-결합된 화합물 라이브러리를 제공하는 단계 (여기서 화합물은 비드로부터 방출될 수 있음), DNA-코딩된, 비드-결합된 화합물 라이브러리를 세포의 라이브러리와 접촉시키는 단계 (여기서 접촉은 비드를 제1 국한된 부피에서 1개 이상의 세포와 함께 국한시킴으로써 수행될 수 있음), 화합물을 비드로부터 방출시키는 단계 및 화합물을 제1 국한된 부피에서 세포와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션과 동시에 또는 그 후에, 화합물을 확인하는 DNA 바코드는 비드로부터 방출되어 세포에 부착될 수 있다. 이어서, DNA 바코드가 부착된 세포는 제1 국한된 부피로부터 방출되고, 제2 국한된 부피에 다시 국한될 수 있으며, 여기서 제2 국한된 부피는 세포를 용해시키는 시약 및 세포에 의해 운반되는 세포 내용물 및 비드-특이적 바코드를 포획하는 메카니즘을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 내용물 및 바코드를 포획하는 데 사용되는 메카니즘은 단일 세포 또는 세포의 작은 클러스터를 고유하게 확인하는 기능을 할 수 있는 포획 바코드를 사용하는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포획 바코드 및 비드-특이적 바코드는 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개별적으로 바코딩된 물질을 함유하는 모든 국한된 부피는 병합되어 세포 및 비드에 특이적인 바코딩된 세포 내용물 및 바코드의 풀을 생성할 수 있다. 바코딩된 물질의 풀을 서열분석에 의해 분석하여 개별 세포 반응을 연구하고, 이들을 세포 반응을 유발하는 교란에 연관시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 액적 내의 개별 세포를 포획하는 것을 포함한다. 세포는 세포가 경험한 교란을 고유하게 확인하기 위해 그의 세포 막 상에 핵산 바코드를 함유할 수 있다. 세포는 액적 내에 용해될 수 있고, 세포의 mRNA 및 세포-막 결합된 핵산 바코드는 바코딩된 포획 올리고뉴클레오티드 ("포획 바코드")의 세트 상에 포획될 수 있다. 각각의 액적은 상이한 고유하게 바코딩된 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 1개의 액적 내의 바코드는 실질적으로 동일한 서열의 스트레치를 갖는다. mRNA 및 세포-막 결합된 바코드는 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 액적-바코딩된 올리고뉴클레오티드 상에 카피될 수 있다. 핵산 물질은 액적을 파열시킴으로써 액적으로부터 함께 풀링될 수 있다. 모든 핵산 물질을 서열분석하여 개별 세포의 전사 프로파일을 연구하고, 이를 전사 프로파일과 연관된 교란과 관련시킬 수 있다.
본원에 기재된 방법은 세포의 라이브러리를 2개의 바코딩된 국한인 교란 국한 및 용해 국한에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 세포는 개별적으로 또는 작은 클러스터로서 국한될 수 있다. 바코드는 세포를 교란시키면서 세포에 도입된 바코드 및 세포를 용해시키면서 도입된 바코드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란 바코드는 세포에 의해 용해 단계로 운반될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용해 바코드는 세포 내용물 및/또는 교란 바코드에 적용되어, 세포 내용물을 세포가 경험한 교란과 관련시키는 바코딩된 세포 내용물의 확립을 가져올 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란 비드는 또한 반응-포획 프로브를 함유할 수 있다. 이 경우에, 2개의 구획화 단계 대신, 단일 피코웰 구획화 단계로 충분할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 화합물 바코드는 세포 반응을 포획할 수 있도록 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란 바코드는 mRNA 분자의 폴리(A) 테일이 혼성화할 수 있는 폴리(T) 절편으로 끝난다.
일부 실시양태에서, 단일-세포 교란-반응 분석을 위한 작업흐름은 하기와 같다: (1) 관능화된 교란 비드를 제공하는 단계이며, 여기서 교란 바코드는 포획 서열로 끝나고, 여기서 포획 서열은 mRNA의 포획을 위한 폴리(T) 뉴클레오티드 또는 다른 세포 반응을 포획하기 위한 다른 적절한 포획 프로브의 세트를 포함할 수 있는 것인 단계, (2) 피코웰 어레이 내의 세포의 라이브러리를 포획하는 단계, (3) 관능화된 교란의 라이브러리를 동일한 피코웰 내로 포획하는 단계이며, 여기서 일부 실시양태에서, 단일 세포 및 단일 관능화된 비드는 웰마다 포획되고, 다른 실시양태에서, 세포의 클러스터가 피코웰 내에 포획될 수 있는 것인 단계, (4) 임의로, 웰 사이의 시약의 교차 오염을 방지하기 위해 피코웰을 오일 배지로 덮는 단계, (5) 교란 비드로부터 화합물을 방출시키고, 각각의 웰 내의 세포를 교란 비드로부터 방출된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계, (6) 용해 완충제 중에서 피코웰 위로 유동시킴으로써 피코웰 내의 세포를 용해시키는 단계, (7) mRNA 또는 다른 세포 반응을 교란 바코드의 팁 상에 직접 포획하는 단계, (8) 폴리머라제 또는 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 세포 반응을 교란 바코드 상에 카피하는 단계, (9) 초음파처리에 의해 피코웰로부터 비드를 방출시킨 다음, 방출된 비드로부터 연장된 교란 바코드를 절단하거나, 또는 비드가 여전히 피코웰 내에 있는 동안 간단히 비드로부터 교란 바코드를 절단하는 단계, 및 (10) 절단된 뉴클레오티드 (연장된 교란 바코드)를 적절한 라이브러리 제조 방법에 적용하고, 이렇게 제조된 뉴클레오티드를 서열분석하는 단계. 일부 실시양태에서, 서열분석된 뉴클레오티드는 2개의 절편을 함유한다: 세포가 적용된 교란/화합물을 확인하는 교란 바코드, 및 교란 바코드에 의해 확인된 교란/화합물에 적용된 세포의 mRNA 발현에 상응하는 반응 절편. 이 작업흐름은 공정의 QC를 위한 임의적인 영상화 단계와 함께 도 36에 나타나 있다. 리버스 트랜스크립타제 방법은 포획된 RNA를 비드-부착된 DNA 상으로 연장시켜, 세포 내용물 정보를 관능화된 비드 상으로 전달하는 역할을 할 수 있다. 이어서, 비드를 풀링하고, 추출하고, 서열분석기 상에서 분석할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 세포로부터의 DNA는 또한 관능화된 비드 상의 특이적 프라이머에 포획될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 폴리머라제가 리버스 트랜스크립타제를 대체할 수 있다.
일부 실시양태에서, 교란 및 세포-반응 포획은 도 37에 기재된 바와 같이 2개의 상이한 국한에서 일어날 수 있다. 교란 바코드는 세포-반응-포획 국한에 적용되기 전에 세포 표면 상으로 전달될 수 있다. 세포-반응-포획은 또한 세포-표면 상에 운반된 교란 바코드를 포획하여, 세포 반응을 세포가 노출된 교란과 직접 관련시키는 것을 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 반응의 포획은 Drop-seq 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 반응의 포획은 임의의 상업적 단일-세포 분석 기기, 예컨대 10X 게노믹스(10X Genomics) 단일-세포 기기, 레인던스(Raindance) 단일-세포 분석 프로토콜, 바이오라드(BioRad) 단일-세포 단리 기기, 미션 바이오(Mission Bio) 단일-세포 분석 프로토콜, 기가젠(GigaGen) 기기 및 프로토콜 및/또는 임의의 다른 상업적으로 이용가능한 단일-세포 분석 기기 또는 서비스에서 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 현탁액은 교란 비드와 함께 국한을 겪은 세포에 대한 출발점으로서 사용될 수 있다. 세포를 수성 배지 중에 현탁시키거나 또는 세포를 현탁액 중에 배양하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 세포를 현탁시키고 세포를 현탁액 중에 배양하는 방법이 또한 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 구상체 세포 배양물은 이들이 단리된 단일 세포보다 더 많은 세포-세포 상호작용 시그너쳐를 포획하기 때문에 교란을 위한 출발점으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Edmondson et al., Assay Drug Dev Technol. 12:207-218, 2014, Fennema et al., Trends Biotechnol. 31:108-115, 2013, Han et al., Sci Reports 5:11891, 2015, Zanoni et al., Sci Reports 6:19103, 2016] (이들의 개시내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 고처리량 교란을 겪기 위해 단일 세포 대신 오르가노이드가 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Foley, Nat Methods 14:559-562, 2017, Liu et al., Front Pharmacol. 7:334, 2016, Neugebauer et al., BioRxiv April 2017, Skardal et al., Drug Discov Today 21:1399-1411, 2016, Boehnke et al., J Biomol Screen 21:931-941, 2016] (이들의 개시내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
일부 실시양태에서, 세포는 질환-모델로부터 수득된다. 본원에 기재된 방법은 질환-모델 세포에 걸친 화합물의 대규모 고처리량 스크리닝을 가능하게 하여 치유 반응이 교란/화합물 라이브러리 내의 화합물 중 1종 이상에 대한 노출에 의해 수득되는지 여부를 확인한다. 다른 실시양태에서, 세포는 다양한 계통의 건강한 세포이다. 본원에 기재된 방법은 다양한 화합물에 대한 세포 반응의 대규모 고처리량 맵핑을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 세포에 대한 조합 화합물 라이브러리의 비편향 스크리닝에 의해 수집된 데이터는 약물-세포 상호작용의 공지된 맵에 기초한 신생 약물 예측을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 국한은 액적 국한을 포함한다. 일부 실시양태에서, 액적은 오일 매트릭스 중 수성 액적을 포함한다. 일부 실시양태에서, 액적은 수성 상 및 오일 상의 혼합을 포함하는 마이크로유체 접합부에서 생성된다. 일부 실시양태에서, 마이크로유체 접합부는 세포, 교란 비드 및 오일 상을 포함한다. 세포 및 비드를 갖는 액적을 생성하기 위한 마이크로유체 아키텍처의 한 실시양태는 "Drop-Seq" 방법에 의해 예시된다 (예를 들어, 문헌 [Macosko et al., Cell 161:1202-1214, 2015] 참조).
일부 실시양태에서, 방법은 히드로겔 국한을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 국한은 세포 및 비드가 히드로겔 매트릭스에 포매되어 그의 자유 확산을 방지하는 것인 히드로겔 국한을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서로 근접하게 되는 세포 및 비드의 공동국재화는 우연히 발생한다. 일부 실시양태에서, 비드는 세포에 부착되는 결합 모이어티를 함유하며, 여기서 세포-비드 듀플렉스는 이어서 히드로겔에 포매된다. 일부 실시양태에서, 세포에 대한 비드의 근접성은 그 비드로부터 방출된 화합물이 확산 유도된 교차 반응성 없이 그 세포만을 교란하도록 보장한다 (세포 간격은 히드로겔에서의 화합물의 확산 반경보다 더 멀다). 일부 실시양태에서, 교란 후, 세포는 용해 완충제를 히드로겔에 통과시킴으로써 용해되며, 여기서 방출된 세포 내용물은 세포에 근접한 비드 상에 포획된다. 일부 관련 간행물은 문헌 [Zhu and Yang, Acc. Chem. Res. 50:22, 2017, Sung and Shuler, Lab Chip 9:1385-1394, 2009, Gurski et al., Biomaterials 30:6076, 2009, Microfluidic Immunophenotyping Assay Platform for Immunomonitoring of Subpopulations of Immune Cells, pages 1761-1763, 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, MicroTAS, 2013] 및 미국 특허 공개 번호 US20030175824 A1 (이들의 개시내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 국한은 피코웰 국한을 포함하며, 여기서 개별 비드 및 세포는 마이크로제작된 피코웰 내에 포획되고, 검정은 피코웰의 어레이에서 수행될 수 있다. 세포 및 비드를 피코웰의 어레이 내로 로딩하기 위한 상세한 절차는, 예를 들어 문헌 [Yuan and Sims, Sci Rep. 6:33883, 2016]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 교란 비드는 또한 반응-포획 프로브를 함유하며, 여기서 2개의 구획화 단계 대신, 단일 피코웰 구획화 단계로 충분하다. 이러한 실시양태에서, 교란 바코드는 세포 반응을 포획할 수 있도록 관능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 교란 바코드는 mRNA 분자의 폴리(A) 테일이 혼성화할 수 있는 폴리(T) 절편으로 끝난다.
일부 실시양태에서, 단일-세포 교란-반응 분석을 위한 작업흐름은 하기와 같다 (예를 들어, 도 36 참조): (1) 관능화된 교란 비드를 제공하는 단계이며, 여기서 교란 바코드는 포획 서열로 끝나고, 여기서 포획 서열은 mRNA의 포획을 위한 폴리(T) 뉴클레오티드 또는 다른 세포 반응을 포획하기 위한 다른 적절한 포획 프로브의 세트를 포함할 수 있는 것인 단계, (2) 피코웰 어레이 내의 세포의 라이브러리를 포획하는 단계, (3) 관능화된 교란의 라이브러리를 동일한 피코웰 내로 포획하는 단계이며, 여기서 일부 실시양태에서, 단일 세포 및 단일 관능화된 비드는 웰마다 포획되고, 다른 실시양태에서, 세포의 클러스터가 피코웰 내에 포획될 수 있는 것인 단계, (4) 임의로, 웰 사이의 시약의 교차 오염을 방지하기 위해 피코웰을 오일 배지로 덮는 단계, (5) 교란 비드로부터 화합물을 방출시키고, 각각의 웰 내의 세포를 교란 비드로부터 방출된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계, (6) 용해 완충제 중에서 피코웰 위로 유동시킴으로써 피코웰 내의 세포를 용해시키는 단계, (7) mRNA 또는 다른 세포 반응을 교란 바코드의 팁 상에 직접 포획하는 단계, (8) 폴리머라제 또는 리버스 트랜스크립타제를 사용하여 세포 반응을 교란 바코드 상에 카피하는 단계, (9) 초음파처리에 의해 피코웰로부터 비드를 방출시킨 다음, 방출된 비드로부터 연장된 교란 바코드를 절단하거나, 또는 비드가 여전히 피코웰 내에 있는 동안 간단히 비드로부터 교란 바코드를 절단하는 단계, 및 (10) 절단된 뉴클레오티드 (연장된 교란 바코드)를 적절한 라이브러리 제조 방법에 적용하고, 이렇게 제조된 뉴클레오티드를 서열분석하는 단계. 일부 실시양태에서, 서열분석된 뉴클레오티드는 2개의 절편을 함유한다: 세포가 적용된 교란/화합물을 확인하는 교란 바코드, 및 교란 바코드에 의해 확인된 교란/화합물에 적용된 세포의 mRNA 발현에 상응하는 반응 절편.
일부 실시양태에서, 세포 반응은 형태학적 반응으로서 광학적으로 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 반응은 교란 후 측정된 신호의 차이를 연구하기 위해 특정 세포 특징부의 표지를 통해 측정된다. 일부 실시양태에서, 세포 반응은 세포 내로 조작된 반응이며, 여기서 유리한 자극은 세포가 조작된 반응을 발현하도록 한다. 일부 실시양태에서, 조작된 반응은 리포터 유전자이다. 일부 실시양태에서, 조작된 반응은 형광 단백질의 발현이다.
일부 실시양태에서, 세포 반응은 세포의 트랜스크립톰을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전사 반응은 세포의 mRNA 내용물을 포획하고 mRNA 전사체의 발현 수준을 분석함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Bacher et al., Genome Biol 17:63, 2016, Svensson et al., Nat Methods 14:381, 2017, Miao and Zhang, Quantitative Biol 4:243, 2016] (이들의 개시내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 세포 반응은 세포에서의 단백질 또는 효소의 발현 및/또는 번역후 활성화 상태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 반응을 포획하는 것은 폴리(T) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포로부터 폴리(A) mRNA를 포획하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 반응은 세포에서의 인핸서 RNA의 발현 수준을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Rahman et al., Nucleic Acid Res. 45:3017, 2017] (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 세포 반응은 세포에서의 신생 전사체의 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생 전사 반응은 글로벌 런-온 서열분석 (GRO-Seq)에 의해 포획된다 (예를 들어, 문헌 [Gardini, Meth Mol Biol 1468:111-120, 2017 및 Danko et al., Nat Methods 12:433, 2015] (이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 일부 실시양태에서, 세포 반응은 단백질 농도를 포함하며, 여기서 단백질은 DNA-태그부착된 항체에 의해 확인되고, 추가로 적절한 태그가 비드 상으로 전달된다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 세포 반응은 영상화, 게놈 분석, 또는 분자 생물학 및 서열분석에서의 임의의 다른 도구에 의해 포획될 수 있다.
실시예
실시예 1. 제1 작업흐름
본 개시내용은 "제1 작업흐름" 및 "제2 작업흐름"으로서 하기 약술된 것을 포함한 방법을 제공한다.
제1 작업흐름은 하기 단계를 포함한다: ( 1 ) DELB를 생성하는 단계, ( 2 ) 비드를 피코웰 내로 첨가하는 단계, ( 3 ) 검정 시약을 피코웰 내로 로딩하는 단계, ( 4 ) 비드-결합된 화합물을 방출시키는 단계, ( 5 ) 검정 판독물을 측정하는 단계, ( 6 ) 검정 판독물을 순위화하는 단계, 및 ( 7 ) 새로운 세트의 DELB를 생성하는 단계.
DELB를 생성한다. 먼저, 비드 상의 DNA 코딩된 라이브러리 (DELB)를 생성한다. 각각의 비드는 정확하고 동일한 화합물의 집단을 함유하지만, 제조된 화합물 중 일부가 불완전한 커플링을 갖거나 화학적 손상, 예컨대 부주의한 산화를 겪은 경우 이로부터 약간의 이탈이 발생할 수 있다.
비드를 피코웰 내로 첨가한다. 이어서, 비드를 피코웰에 침착시킨다. 바람직한 실시양태에서, 각각의 피코웰은 단지 1개의 비드를 얻는다. 각각의 피코웰은 둥근 상부 에지, 둥근 하부 에지, 단단한 원형 하단, 개방 상단 및 벽을 가질 수 있다. 벽의 하단은 둥근 상부 에지 및 둥근 하단 에지에 의해 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 벽은 각지며, 여기서 둥근 상부 에지의 직경은 둥근 하부 에지의 직경보다 더 크다. 이러한 방식으로, 벽 (그 자체로 보았을 때)은 역원추의 절편과 유사하다. 피코웰 어레이는 비드의 중복이 존재하도록 제조될 수 있다. 다시 말해서, 어레이는 피코웰 내로 배치되는 수천개의 비드 중 2개의 비드가 정확히 동일한 화합물을 함유하도록 제조될 수 있다. 중복은, 예를 들어 2개 비드, 3개 비드, 4개 비드, 5개 비드, 10개 비드, 20개 비드, 40개 비드, 60개 비드, 80개 비드, 100개 비드 등, 또는 약 2, 약 3, 약 4, 약 10, 약 20, 약 40, 약 60, 약 80, 약 100, 약 200, 약 500, 약 1,000개 비드 등, 또는 2개 초과, 5개 초과, 10개 초과, 20개 초과, 40개 초과, 60개 초과, 80개 초과, 100개 초과, 200개 초과, 500개 초과, 1,000개 초과의 비드 등일 수 있다.
검정 시약을 피코웰 내로 로딩한다. 각각의 비드-결합된 화합물의 생화학적 활성을 평가하는 데 사용될 수 있는 시약을 각각의 피코웰 내로 도입한다. 생화학적 활성은 결합 활성, 효소 억제 활성, 효소 활성화 활성, 살아있는 포유동물 세포의 활성 (분자 표적이 공지되어 있지 않은 경우), 살아있는 포유동물 세포의 활성 (분자 표적이 공지되어 있는 경우) 등의 형태를 취할 수 있다. 시약은 FRET 시약 플러스 효소의 형태를 취할 수 있다. FRET 시약은 프로테아제 기질에 의해 켄처에 연결된 형광단일 수 있다. 효소는 프로테아제에 의해 절단가능한 프로테아제의 기질일 수 있다. 비드-결합된 화합물은 프로테아제를 억제하는 능력에 대해 시험된다.
검정 물질을 로딩한 후, 각각의 피코웰은 필름에 의해 캡핑될 수 있거나, 또는 다수의 또는 모든 피코웰은 하나의 필름에 의해 캡핑될 수 있거나, 또는 다수의 또는 모든 피코웰은 각각의 핌플이 피코웰에 피팅되는 것인 핌플을 갖는 필름에 의해 캡핑될 수 있거나, 또는 각각의 피코웰은 다공성 구체로 피팅된다. 실시양태에서, 구체의 부피의 약 5%, 부피의 약 10%, 부피의 약 20%, 부피의 약 30% 또는 부피의 약 40%가 피코웰에 피팅된다 (여기서 나머지는 표면과 같은 높이이거나 또는 표면 위에 존재함). 실시양태에서, 핌플의 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100%가 피코웰에 피팅된다.
비드-결합된 화합물을 방출시킨다. 비드-결합된 화합물의 방출을 유발하는 단계를 수행한다. 실시양태에서, 단계는 주어진 비드에 부착된 화합물의 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 40%, 약 60%, 약 80%, 약 99% 또는 약 100%의 방출을 유발할 수 있다. 방출은 광에 의해, 화학 시약에 의해, 효소에 의해, 온도의 이동에 의해, 그의 임의의 조합 등에 의해 수행될 수 있다.
방출은 ( i ) 단일 방출, ( ii ) 다중 방출, ( iii ) 연속 방출의 형태를 취할 수 있다. 다중 방출은, 예를 들어 자외선 광의 여러 방출 형태를 취할 수 있으며, 여기서 각각의 방출은 그 광 방출의 시작 시에 비드에 부착되는 비드-결합된 화합물의 약 10%를 절단하기에 충분하다. 연속 방출은, 예를 들어 1시간의 과정에 걸쳐 광의 연속 방출의 형태를 취하여, 유리 화합물의 농도를 꾸준히 증가시킬 수 있다. 이러한 상황에서, 유리 화합물 (절단된 화합물)의 꾸준히 증가하는 농도는 그 화합물의 표적을 적정하기 위한 것일 수 있다. 이러한 종류의 적정 실험을 사용하여 주어진 화합물의 효력을 평가할 수 있다. 비제한적 예를 제공하자면, 단일 방출 방법에서, 광 노출의 기간 후 판독이 이루어지는 후속 기간이 이어지고, 연속 방출 방법에서, 광 노출은 판독이 이루어지는 기간 중 일부, 대부분 또는 모든 기간 동안 계속된다.
배제적 실시양태에서, 본 개시내용은 단일 방출을 사용하거나, 다중 방출을 사용하거나 또는 연속 방출을 사용하는 임의의 방법, 시약, 조성물 또는 시스템을 배제할 수 있다.
검정 판독물을 측정한다. 상기 개시된 생화학적 활성 및 그 활성에 대한 방출된 화합물의 영향을 검출한다. 이러한 생화학적 활성은 효소적 활성, 리포터 유전자의 활성, 유전적 활성 (예를 들어, 전사 또는 번역 속도), 결합 활성 (예를 들어, 항원에 대한 항체), 세포 활성 (예를 들어, 이동의 변화, 세포-신호전달 경로의 변화, 형태의 변화)의 형태를 취할 수 있다. 활성은 형광, 발색 활성, 발광, 광 현미경검사, 택맨® 검정, 분자 비콘, 질량 분광측정법, 라만 분광분석법, 국부 표면 플라즈몬 공명 (LSPR), 표면 플라즈몬-커플링 방출 (SPCE), 표면-증강 라만 산란 (SERS) 등에 의해 검출될 수 있다. 검출은 전부 원격인 방법, 예컨대 형광 검출 또는 광 현미경검사에 의해, 또는 대안적으로, 피코웰로부터 샘플을 취하는 것을 수반하는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 반응물과 생성물의 혼합물을 함유하는 샘플은 피코웰 중 하나에 부분적으로 삽입된 구형 다공성 스폰지에 의해 분석을 위해 회수될 수 있다.
검정 판독물을 순위화한다. 이 단계에서, 복수의 상이한 화합물 (하나의 특정한 비드와 회합된 각각의 유형의 화합물)로부터의 검정 판독물은 생화학적 활성을 활성화시키거나, 억제하거나 또는 일부 방식으로 조정하는 그의 능력의 관점에서 순위화된다.
새로운 세트의 DELB를 생성한다. 상기 기재된 단계는 생화학적 활성을 나타내는 다양한 화합물에 대한 정보를 사용자에게 제공한다. 정보는 최대 활성을 갖는 하나의 화합물의 형태를 취할 수 있으며, 나머지는 최대 활성의 약 절반 이하를 갖는다. 대안적으로, 정보는 유사한 최대 활성을 갖는 여러 화합물의 형태를 취할 수 있으며, 다른 화합물은 최대 활성의 약 절반 이하를 갖는다. 새로운 세트의 DELB는 하기와 같이 생성될 수 있다. 최고-순위 화합물 (선도 화합물) 중 1개 이상은 하기 비제한적 전략 중 1개 이상에 기초하여 새로운 세트의 DELB를 제조하기 위한 기초로서 사용될 수 있다: ( i ) 지방족 쇄를 상동체로 대체하는 것, 예컨대 프로판올 측쇄를 부탄올 측쇄로 대체하는 것, ( ii ) 지방족 쇄를 이성질체로 대체하는 것, 예컨대 프로판올 측쇄를 이소프로판올 측쇄로 대체하는 것, ( iii ) 펩티드 결합을 펩티드 결합의 유사체, 예컨대 펩티다제에 의해 가수분해될 수 없는 결합으로 대체하는 것, ( iv ) 한 유형의 하전된 기를 또 다른 유형의 하전된 기로 대체하는 것, 예컨대 포스페이트 기를 포스포네이트, 술페이트, 술포네이트 또는 카르복실 기로 대체하는 것.
실시예 2. 제2 작업흐름
제2 작업흐름은 캡으로 밀봉된 피코웰을 수반한다. 캡은 피코웰의 직경보다 약간 더 큰 직경의 구체 형태를 취할 수 있으며, 여기서 이 직경은 피코웰의 상단 테두리에서 측정된다 (피코웰의 하단에서는 측정되지 않음). 캡은 전체 피코웰 플레이트를 가벼운-중력 원심분리에 적용함으로써 피코웰의 상단에 꼭 맞게 피팅될 수 있다. 제2 작업흐름에서, 캡은 링커를 함유하는 비드의 형태를 취하며, 여기서 각각의 링커는 화합물에 연결된다. 링커는 절단가능한 링커이며, 여기서 절단은 화합물을 방출시키고 이들이 세포로 확산되도록 한다. 이러한 유형의 캡은 "활성 캡"으로 불린다. 제2 작업흐름은 하기 단계를 포함한다: ( 1 ) DELB를 생성하는 단계, ( 2 ) 검정 시약을 피코웰 내로 로딩하는 단계, ( 3 ) 피코웰을 DELB로 캡핑하는 단계, ( 4 ) 캡으로서 작용하는 비드로부터 비드-결합된 화합물을 방출시키는 단계, ( 5 ) 검정 판독물을 측정하는 단계, ( 6 ) 비드 상에 있는 DNA 바코드의 서열을 결정하는 단계, ( 7 ) 검정 판독물을 순위화하는 단계, 및 ( 8 ) 새로운 세트의 DELB를 생성하는 단계.
실시예 3. 방출 제어
이는 비드-결합된 화합물의 방출을 제어하고 모니터링하는 것에 관한 것이다. 본 출원인은 비드-결합된 방출-모니터를 합성하기 위한 하기 절차를 고안하였다. 도 11 및 하기 본문을 참조한다.
도 11은 비드-결합된 방출-모니터의 상기 예시적 실시양태의 유기 합성에서의 단계를 기재한다.
단계 1. 수지를 제공한다.
텐타겔® 수지 (M30102, 10μm NH2, 0.23 mmol/g, 10 mg, MB160230, 160μm RAM, 0.46 mmol/g, 2 mg)를 칭량하여 튜브 (1.5 mL 에펜도르프)에 넣고 팽윤시켰다 (400μL, DMA).
수지를 소결 스핀-칼럼 (모비콜(MoBiCol)® 스핀 칼럼, 피셔 사이언티픽)으로 옮기고, 용매를 진공에 의해 필터를 통해 제거하고, 펜던트 Fmoc를 탈보호시켰다 (DMA 중 2% DBU를 함유하는 5% 피페라진, 400μL, 40℃에서 2x 10분). 모비콜 스핀 칼럼은 10 마이크로미터의 큰 프릿 및 루어-락 캡을 가졌다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
단계 2. 리신 링커를 수지에 커플링시킨다.
DMA (350 μL) 중에 혼합된 L-Fmoc-Lys(Mtt)-OH (21 μmol, 6.6 당량), DIEA (42 μmol, 13.3 당량), COMU (21 μmol, 6.6 당량)를 함유하는 용액을 제조하고, 인큐베이션하고 (1분, 실온), 이어서 소결 스핀-칼럼 내부의 건조 수지에 첨가하고, 볼텍싱하고, 인큐베이션하여 (15분, 40℃) 유리 아민을 아미드화하였다. 수지를 진공에 의해 여과하고, 이 반응을 1회 반복하였다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
단계 3. Fmoc 보호기를 제거한다.
펜던트 Fmoc를 탈보호시켰다 (DMA 중 2% DBU를 함유하는 5% 피페라진, 400 μL, 40℃에서 2x 10분).
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
단계 4. 켄처를 커플링시킨다.
DMA (350 μL) 중에 혼합된 QSY7-NHS (4.9 μmol, 1.55 당량), 옥시마 (9.5 당량, 3.3 당량), DIC (21 μmol, 6.6 당량), TMP (3.5 μmol, 1.1 당량)를 함유하는 용액을 제조하고, 인큐베이션하고 (1분, 실온), 이어서 소결 스핀-칼럼 내부의 건조 수지에 첨가하고, 볼텍싱하고, 인큐베이션하여 (14시간, 40℃) 유리 아민을 아미드화하였다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
아세트산 무수물 (80 μmol, 25.3 당량), TMP (80 μmol, 25.3 당량)를 함유하는 용액을 제조하고, DMA (400 μL) 중에서 혼합하고, 혼합한 다음, 소결 스핀-칼럼 내부의 건조 수지에 첨가하고, 볼텍싱하고, 인큐베이션하였다 (20분, 실온).
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하고 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM), DCM 중에서 인큐베이션하고 (1시간, 실온), 이어서 진공 하에 여과하고, 진공 챔버에서 건조시켰다 (30분, 2.5 PSI).
단계 5. Mtt 보호기를 제거한다.
TFA (96 μL), 메탄올 (16 μL)을 함유하는 Mtt 탈보호 칵테일을 제조하고, DCM (1488 μL) 중에서 혼합하여 6:1:93%의 TFA:메탄올:DCM 용액을 수득하였다.
Mtt 탈보호 칵테일을 완전히 건조된 수지 (400μL)에 첨가하고, 혼합하고, 진공 하에의 여과에 의해 용리시키고, 이어서 순차적 분취량의 Mtt 탈보호 칵테일 (4x 400μL)을 첨가하고, 혼합하고, 인큐베이션하고 (5분, RT), 실온에서 20분의 총 합한 인큐베이션 시간 동안 용리시켰다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL, 2% DIEA를 함유하는 1x DMA, 400μL, 3x DMA, 400μL).
단계 6. 광절단가능한 링커를 리신의 엡실론-아미노에 커플링시킨다.
DMA (400 μL) 중에 혼합된 Fmoc-PCL-OH (32 μmol, 10 당량), 옥시마 (32 μmol, 10 당량), DIC (50 μmol, 15.8 당량), TMP (32 μmol, 10 당량)를 함유하는 용액을 제조하고, 인큐베이션하고 (1분, 실온), 이어서 소결 스핀-칼럼 내부의 건조 수지에 첨가하고, 볼텍싱하고, 인큐베이션하여 (14시간, 40℃) 유리 ε-아민을 아미드화하였다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
단계 7. 이전에 커플링된 광절단가능한 링커로부터 Fmoc 보호기를 제거한다.
펜던트 Fmoc를 탈보호시켰다 (DMA 중 2% DBU를 함유하는 5% 피페라진, 400 μL, 40℃에서 2x 10분).
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하였다 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 1x DMA, 400 μL).
단계 8. 형광단을 커플링시킨다.
TAMRA (6 μmol, 1.9 당량), TMP (24 μmol, 7.6 당량), COMU (16 μmol, 5 당량)를 함유하는 용액을 제조하고, DMA (400 μL) 중에서 혼합하고, 인큐베이션하고 (1분, 실온), 이어서 소결 스핀-칼럼 내부의 건조 수지에 첨가하고, 볼텍싱하고, 혼합하면서 인큐베이션하여 (2시간, 40℃, 800 RPM) 유리 아민을 아미드화하였다.
수지를 진공 하에 여과하고, 세척하고 (2x DMA, 400 μL, 3x DCM, 400 μL, 2x DMA, 400 μL, 2x DMSO), 이어서 DMSO 중에 혼합하면서 인큐베이션하였다 (16시간, 40℃).
하기는 상기 개시된 실험실 절차의 보다 넓은 설명을 제공한다.
비드에 부착된 이관능성 링커. 이관능성 링커를 용액 중에서 합성하고, 아민-관능화된 비드에 부착시켰다. 도 11은 리신으로 출발하는 유기 합성 경로를 개시한다. 이어서, 리신-Boc를 TCO 링커에 의해 연결하였다. 링커의 주요 부분은 한 말단에 질소를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 형태를 취하였다. Boc는 이 연결 반응에서 이탈기였다. 사용된 TCA는 실제로 히드록시-TCO의 라세미체였다. 이 TCO 유도체의 히드록실 기는 이중 결합의 한 측면으로부터 4개의 탄소 원자만큼 떨어져 위치한 탄소 원자에 연결되었다 (이는 이중 결합의 다른 측면으로부터 3개의 탄소 원자만큼 떨어져 위치한 것과 동일함). 도 11에 제시된 바와 같이, 다단계 합성에서의 제1 생성물은 Boc-리신-링커-TCO의 형태를 취하였다. 히드록시-TCO의 한 부분인 히드록실 기는 여전히 TCO 기에 부착되어 있으며, 여기서 이는 아미노화-폴리에틸렌 글리콜 기와 TCO 기 사이에 위치한다 (도 11).
합성 경로의 제2 세트는 HCl로의 처리 및 광절단가능한 링커 (PCL)의 첨가를 수반하였다. 이 제2 단계의 생성물은 Boc 기가 광절단가능한 링커로 대체된 것을 제외하고는 제1 단계의 생성물과 동일하였다. 리신 모이어티는 제2 단계의 생성물에서 중앙 위치를 차지한다. 리신 모이어티에 관하여, 이 리신 모이어티는 유리 카르복실 기를 갖고, 절차의 제3 단계에서, 아미노화 비드가 이 유리 히드록실 기에 연결되어, 비드-결합된 시약의 합성을 유발하며, 여기서 시약은 2개의 분지의 형태를 취하고, 한 분지의 말단은 TCO 태그이고, 다른 분지의 말단은 절단가능한 결합을 보유하는 방향족 고리이다. 화학적 단량체를 광절단가능한 링커의 원위 말단에 부착시키기 위해, 먼저 Fmoc 기를 제거하고, 여기서 Fmoc 기를 수소 원자로 대체한다.
Fmoc를 제거한다. 문헌 [Isidro-Llobet et al.]에 따르면, "Fmoc는 . . . 염기, 주로 2급 아민에 의해 제거되며, 이는 이들이 제거 동안 생성된 디벤조풀벤을 포획하는 데 더 우수하기 때문이다" (Isidro-Llobet et al. (2009) Chem. Rev. 109:2455-2504). 대안적으로, Fmoc는 Pd/BaSO4를 사용한 촉매적 가수소분해에 의해 또는 액체 암모니아 및 모르폴린 또는 피페리딘에 의해 제거될 수 있다.
Fmoc 기의 제거 후 화학적 단량체의 부착이 이어진다. 이어서, 출원인은 카르복실산 기를 갖는 화학적 단량체를 축합시켰으며, 그 결과는 아미드 결합의 생성이었다.
실시예 4. 활성 화합물에 대한 세레블론-기반 검정
화합물의 세포-기반 검정 (세레블론-기반 검정)으로부터의 결과. 세포-기반 검정을 위한 시약 및 방법. 출원인은 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 버지니아주 마나사스)로부터 입수한 CCL-2 HeLa 세포를 사용하였다. 세포 배지는 HEPES로 완충된 깁코 DMEM 고 글루코스 배지였다. 세포 배양물 위의 분위기는 37℃에서 인큐베이터를 사용하여 5% 이산화탄소로 보충된 대기 공기였다. 세포 배지는 글루타맥스(GlutaMAX)® (깁코 써모피셔(Gibco Thermofisher))로 보충되고 또한 비필수 아미노산 및 페니실린 플러스 스트렙토마이신 (깁코 써모피셔, 매사추세츠주 월섬)으로 보충된 DMEM 플러스 10% 태아 소 혈청이었다. HeLa 세포를 LTR-CTCF-프로모터-IKZF1 (또는 IKZF3)-mNeon-P2A-mScar-LTR-CTCF의 형태를 취하는 구축물로 형질감염시켰다. mScarlet는 양성 대조군으로서 사용된 요소이다. mScarlet는 "mScarlet"로 불리는 적색 형광 단백질을 코딩한다 (문헌 [Bindels et al. (2017) Nature Methods. 14:53-56] 참조). 프로모터는 독시시클린 유도성 프로모터이며, 이는 기질의 신속한 개시 유도 및 적정을 가능하게 한다. P2A는 2개의 다른 폴리펩티드 사이에 위치한 요소이다. P2A는 번역 동안 2개의 별개의 폴리펩티드를 생산하도록 기능하여, mScar 폴리펩티드가 IKZF1/녹색 형광 단백질 (GFP)로 이루어진 융합 단백질의 유비퀴틴화 및 분해에 의해 영향을 받지 않으면서 적색 광을 생성하는 양성 대조군으로서 기능하도록 한다. mNeonGreen은 창고기 브란키오스토마 란세올라툼(Branchiostoma lanceolatum) 다량체성 황색 형광 단백질 (얼리이 바이오테크놀로지(Allele Biotechnology), 캘리포니아주 샌디에고)로부터 유래된다. P2A는 P2A 단백질 내의 한 지점에서 자기-절단을 가능하게 하는 영역이다. 보다 정확히는, P2A 펩티드는 리보솜이 2A 펩티드의 C-말단에서의 글리실-프롤릴 펩티드 결합의 합성을 건너뛰도록 하여, 2A 펩티드와 그의 바로 하류 펩티드 사이의 절단을 유도한다 (Kim, Lee, Li, Choi (2011) PLoS ONE. 6:e18556 (8 pages)).
시험 화합물에 대한 세포-기반 검정의 효능의 입증. 하기는 레날리도미드 및 레날리도미드의 유사체의 형태를 취하는 시험 화합물에 대한 세포-기반 검정의 사용을 입증한다. 도 5는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 HeLa 세포로부터의 결과를 개시하며, 여기서 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 적색 형광 단백질 (mScarlet)을 발현하였다. 첨가된 레날리도미드의 농도를 증가시키는 것은 점진적으로 더 적은 녹색 형광을 생성하였고, 최고 농도에서 녹색 형광을 제거하였다. 그러나 레날리도미드는 적색 형광은 실질적으로 감소시키지 않았다. 상단: IKZF1/GFP 융합 단백질의 발현. 하단: mScarlett 대조군의 발현. 레날리도미드를 0, 0.1, 1.0 또는 10 마이크로몰로 첨가하였다.
도 6은 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 HeLa 세포로부터의 결과를 개시하며, 여기서 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 적색 형광 단백질 (mScarlet)을 발현하였다. 첨가된 레날리도미드의 농도를 증가시키는 것은 점진적으로 더 적은 녹색 형광을 생성하였고, 최고 농도에서 녹색 형광을 제거하였다. 그러나 레날리도미드는 적색 형광은 실질적으로 감소시키지 않았다. 상단: IKZF3/GFP 융합 단백질의 발현. 하단: mScarlett 대조군의 발현. 레날리도미드를 0, 0.1, 1.0 또는 10 마이크로몰로 첨가하였다.
레날리도미드가 융합 단백질의 단백질분해를 유발하는 경로를 요약하기 위해, 제1 레날리도미드를 HeLa 세포에 첨가한다. 이어서, 레날리도미드는 이들 세포에서 자연적으로 발생하는 세레블론에 결합한다. 이 세레블론은 E3 유비퀴틴 리가제와의 복합체로 발생한다. E3 유비퀴틴 리가제는 재조합 IKZF1 융합 단백질 (또는 재조합 IKZF3 융합 단백질)을 유비퀴틴으로 태그부착함으로써 레날리도미드에 반응한다. 최종 결과는 유비퀴틴-태그부착된 융합 단백질이 세포의 프로테아솜에서 분해된다는 것이다.
피코웰 플레이트를 코팅한다. 이는 피코웰 플레이트의 상단 표면에 적용되지만 반드시 피코웰 내부로 들어가 그를 코팅하지는 않는 용액을 기재한다. 이는 또한 피코웰 플레이트의 상단 표면에 적용되고 피코웰에 들어가 피코웰의 하단 표면을 코팅하는 용액에 관한 것이다. 출원인은 플루로닉(Pluronic)® 127 (시그마 알드리치, 미주리주 세인트 루이스)의 용액을 건조 플라스틱에 첨가하였다. 그 결과 표면은 친수성이고 더 이상 소수성이 아니다. 이어서, 표면을 물로 세척하였다. 이어서, 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 첨가하였으며, 여기서 이 PBS는 피코웰 내부로 들어간다. 이동하는 공기는 진공에 의해 적용되며, 그 결과 공기가 피코웰 내의 작은 버블을 팽창하게 하고, 이어서 버블을 PBS로 대체하고, 최종 결과 많은 피코웰이 PBS로 충전된다. 이어서, PBS를 비트로넥틴 코팅 용액 (AF-VMB-220) (페프로테크(PeproTech), 뉴저지주 록키 힐)으로 대체하였다. 플루로닉스® 127은 H(OCH2CH2)x (OCH2CHCH3)y (OCH2CH2)ZOH이다. 비트로넥틴 코팅 용액을 적용한 후에, 본 출원인은 코팅 용액이 피코웰 내로 들어가도록 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플루로닉 127은 피코웰을 분리하는 융기부를 코팅하고, 비트로넥틴은 피코웰의 하단에 있다. HeLa 세포는 비트로넥틴에 부착되고, 이들이 비트로넥틴에 부착될 때, 이들은 피코웰의 하단에 부착된다.
HeLa 세포를 유동 세포측정법에 의해 성공적으로 형질감염된 세포에 대해 스크리닝하였다. 성공적인 형질감염을 결정하기 위해 2가지 기준을 동시에 사용하였다. 먼저, 레날리도미드를 유동 세포측정법에 의한 분류 2일 전에 세포 배지에 첨가하였다. 양성 세포는 적색-플러스 및 녹색-마이너스인 것이었으며, 여기서 적색-플러스는 세포가 mScar을 코딩하는 유전자로 형질감염되었다는 것을 의미하고, 녹색-마이너스는 레날리도미드가 사실상 융합 단백질 IKZF1/mNeon (또는 융합 단백질 IKZF3/mNeon)의 유비퀴틴화 및 분해를 촉진하였다는 것을 의미한다. 독시시클린에 관하여, 독시시클린을 3 마이크로몰로 사용하여 렌티바이러스 벡터 구축물의 발현을 유도하였다. 독시시클린을 사용한 농도/유도 곡선은 문헌 [Go and Ho (2002) J. Gene Medicine. 4:258-270]에 제시된다. 렌티바이러스 벡터로 형질감염시킨 후, 성장하는 세포에서 IKZF1이 최소로 발현되도록 하기 위해 하기 조건을 사용하였다. 조건은 배지로부터 독시시클린을 제거하고, 또한 구축물에서 "인슐레이팅 서열"을 사용하는 것이었다. 인슐레이팅 서열은 구축물 외부의 프로모터로부터의 번역-초과를 방지한다. 인슐레이팅 서열이 기재되었다 (문헌 [Anton et al. (2005) Cancer Gene Therapy. 12:640-646, Carr et al. (2017) PLoS ONE. 12:e0176013] 참조). 인슐레이팅 서열은 구축물 외부에 있는 프로모터가 구축물의 일부인 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 발현을 구동시키는 것을 방지한다. 세포를 피코웰 내로 넣기 위해, 세포를 [세포의 수]/[피코웰의 수]의 주어진 비로 피코웰 플레이트의 상단 표면으로 옮길 수 있다. 비는, 예를 들어 약 1개 세포/40개 웰, 약 1개 세포/20개 웰, 약 1개 세포/10개 웰, 약 2개 세포/10개 웰, 약 4개 세포/10개 웰, 약 8개 세포/10개 웰, 약 16개 세포/10개 웰, 약 32개 세포/10개 웰, 약 50개 세포/10개 웰, 약 100개 세포/10개 웰 등일 수 있다. 세포는 세포가 피코웰의 하단을 코팅하는 비트로넥틴에 부착되자마자 피코웰에서 검정에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 구축물 및 세포 배양의 세부사항. 이는 IKZF1/3에 대한 리포터 세포주를 구축하고, 이들을 피코웰에서 배양하고, 이들을 벌크 레날리도미드로 검정하는 것에 관한 것이다. 리포터 구축물을 보유하는 플라스미드를 깁슨 조립을 사용하여 부분으로부터 조립하였다 (첨부 맵 참조). 리포터 구축물, 뿐만 아니라 UbC 구동 rtTA-M2.2를 갖는 렌티바이러스를 렌티엑스 HEK293T 세포 (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 팔로 알토)에서 제3 세대 패키징 시스템 (키메라 CMV 프로모터 및 tat 단백질 없음)을 사용하여 제조하였다. 플라스미드를 칼슘 침전 방법을 통해 형질감염시켰다. 바이러스 상청액을 권장 렌티엑스 배지 플러스 1% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 수거하고, 0.45um 저 단백질 결합 필터 (밀리포어)를 통해 여과하였다. 숙주 HeLa 세포를 ATCC로부터 입수하고, 표준 조건에서 배양하였다. 바이러스 상청액을 전면생장 미만의 HeLa 배양물에 적용하고, 24시간 후에 독시시클린을 함유하는 렌티엑스 배지로 교체하였다. 클론 선택 2일 전에, 레날리도미드를 배양물에 첨가하였다. 클론을 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 선택하고, 알렉사플루오르 488 (음성) 및 Cy3 채널 (양성) 둘 다에 대해 게이팅하였다. 클론을 검정 전에 레날리도미드 없이 10일 동안 성장시켰다. 가장 안정한 발현 수준 클론을 스크리닝에 사용한다.
이는 세포를 비드로 밀봉하고 세포를 다공성 비드를 통해 용해시키는 실험을 기재한다. 피코웰 패턴화된 하단을 갖는 96 웰 플레이트 (뮤웰즈(MuWells))를 진공 적용 없이 플루로닉 F127 세제 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)로 처리하여 웰의 상부 부분을 부동태화한다. 30분 인큐베이션 후에, 과량의 세제를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 증류된 H2O로 세척해낸다. 웰을 에탄올로 플러싱하고, 공기 유동 하에 생물안전 캐비닛에서 건조시킨다. 웰을 강한 진공 하에 PBS로 완전히 습윤시키고, PBS를 비트로넥틴 코팅 시약 (프리프로테크)으로 대체한다. 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 비트로넥틴 코팅 시약을 제거하고, 리포터 세포를 바람직한 밀도로 시딩한다. 세포 시딩 순간부터, 배지는 검정 내내 디쉬에 머무른다. 광절단가능한 화합물을 보유하는 텐타겔® 비드는 비트로넥틴 코팅 전에 또는 세포 시딩 후에 시딩될 수 있다. PEG 중합체 비드를 웰 수에 비해 과량으로 배양물의 상단에 로딩한다.
플레이트를 400rcf에서 1분 동안 스핀시킨다. 적절한 양의 시간 동안 365nm LED 광원을 사용하여 화합물을 비드로부터 광-방출시킨다. 영상화 (형광 리포터의 판독)까지 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
구축물. 도 20 및 도 21은 관련 구축물을 개시한다. 각각의 이들 도면은 HeLa 세포 게놈 내로 통합될 서열을 개시하고, 각각의 도면은 캐리어 서열 (렌티바이러스에 속하는 서열)을 개시한다. 렌티바이러스에 속하는 서열은 약 1시부터 약 9시까지의 방향이며, 여기서 이 서열은 2개의 긴 말단 반복부 (LTR)에 의해 괄호로 묶여 있다. 약 9시부터 약 1시까지의 방향의 서열은 HeLa 세포 게놈 내로 통합된다. 상세하게, 먼저 플라스미드를 생산자 세포 (HEK93T) (클론테크, 캘리포니아주 팔로 알토) 내로 형질감염시킨다. 생산자 세포는 렌티바이러스를 생산한 다음 방출한다. 이어서, 방출된 렌티바이러스는 HeLa 세포를 감염시키고, 핵산을 HeLa 세포 게놈 내로 통합시킨다.
광학. 본 세포 배양 실험을 위해, 출원인은 루들 일렉트로닉 프로덕츠 스테이지 (루들 일렉트로닉 프로덕츠, 리미티드(Ludl Electronic Products, Ltd.), 뉴욕주 호손)가 구비된 악시오버트 200-M 칼 자이스 현미경에 연결된 HBO 100 (칼 자이스 마이크로스코피, 게엠베하(Carl Zeiss Microscopy, GmbH), 독일)에 연결된 EBQ100 단리된 수은 램프를 사용하였다. 본 출원인은 또한 수은 램프가 구비된 필터 큐브를 사용하였으며, 여기서 필터 큐브는 여기 파장을 제어하고 또한 방출 검출 파장을 제어하였다. 영상을 바슬러 ACA2440-35UM (바슬러 아게(Basler AG), 독일 22926 아렌스부르크)로 캡쳐하였다. 수은 램프에 대한 대안으로서 할로겐 램프를 사용하였다. 마이크로웰 플레이트, 피코웰 플레이트 등을 플레이트 홀더 및 제어기가 있는 "XY 스테이지"에 의해 제자리에 유지시켰다. 광학 사용을 위한 XY 스테이지 및 다른 정확한 위치설정 스테이지는 뉴마크 시스템즈, 인크.(Newmark Systems, Inc.) (캘리포니아주 란초 산타 마르가리타), 에어로테크, 인크.(Aerotech, Inc.) (펜실베니아주 피츠버그), 피직 인스트루멘테 게엠베하(Physik Instrumente GmbH) (독일 76228 카를스루에)로부터 이용가능하다.
실시예 5. 활성 화합물에 대한 MDM2-기반 검정
유리를 아미노 기를 함유하도록 변형시킨다. 실리카 기판은 다수의 "관능성 실란" 중 1개 이상에 의해 아미노 기를 함유하도록 변형될 수 있다. 이들 "관능성 실란"은 3-아미노프로필-트리에톡시실란 (APTES), 3-아미노프로필-트리메톡시실란 (APTMS), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란 (AEAPTES), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란 (AEAPTMS) 및 N-(6-아미노헥실)아미노메틸트리에톡시실란 (AHAMTES)이다. 이들 시약과 유리의 반응은 증기 상 또는 용액 상에서 수행될 수 있다 (문헌 [Zhu, Lerum, Chen (2012) Langmuir. 28:416-423] 참조).
화합물의 생화학적 검정 (MDM2-기반 검정)으로부터의 결과. 실험실 방법. 하기 시약을 유리 슬라이드에 적용하였다. 유리 슬라이드를 아미노 기를 갖도록 변형시켰다. 시약은 NHS-PEG-mTET였다. NHS는 N-히드록시-숙신이미드이다. NHS는 활성화된 에스테르의 유형이다. NHS는 생체접합 반응, 예컨대 마이크로비드 또는 마이크로어레이 슬라이드의 표면 활성화에 유용하다 (Klykov and Weller (2015) Analytical Methods. 7:6443-6448).
PEG는 폴리에틸렌 글리콜이다. mTET는 메틸테트라진이다. 이 시약을 DMSO와 혼합한 다음, 2 마이크로리터의 부피를 유리 슬라이드에 적용하였다. 50 mM NHS-PEG-mTET 10 마이크로리터를 DMSO 30 마이크로리터와 혼합하여 혼합물을 제조하였다. NHS 기는 유리 측면의 아미노 기와 반응하며, 그 결과 mTET 기가 유리 슬라이드에 부착된다. mTET의 목적은 슬라이드와 비드 사이에 공유 연결을 생성하는 것이었다.
TCO 및 테트라진은 "클릭 화학" 반응을 매개할 수 있다. 이들 클릭 화학 반응의 예는 TCO로 관능화된 DNA와 커플링시키기 위해 테트라진으로 관능화된 항체를 사용하는 것이다. 또는 테트라진-변형된 비드와 커플링시키기 위해 TCO로 변형된 항체를 사용한다 (문헌 [van Buggenum et al. (2016) Scientific Reports. 6:22675 (DOI:10.1038), Rahim et al. (2015) Bioconjug. Chem. 18:352-360, Haun et al. (2010) Nature Nanotechnol. 5:660-665] 참조).
상세하게는, 슬라이드의 상단에 파라필름의 시트를 적용함으로써 유리 슬라이드를 제조하였으며, 여기서 파라필름은 중간으로부터 절단된 개구를 가졌고, 상기 혼합물의 방울을 유리 슬라이드에 직접 개구에서 적용하였다. 혼합물을 적용하기 전에, 상단에 파라필름을 갖는 유리 슬라이드를 90초 동안 완전 가열로 가열하여, 파라필름과 슬라이드 사이에 단단한 밀봉을 생성하고, 파라필름의 개방 영역 (개구)에의 혼합물 적용 후 액체의 침출을 방지하였다. 파라필름 내로 절단된 개구에 2 마이크로리터 액적이 놓인 유리 슬라이드를 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 동안, 유리 슬라이드는 페트리 디쉬 내부에 있었으며, 여기서 디쉬는 페트리 디쉬의 상단 및 측면을 덮는 유리 커버로 덮었다. 밤새 인큐베이션하기 전에, 정사각형의 파라필름을 방울 위에 및 주위 파라필름 위에 놓아, 물이 방울로부터 증발하는 것을 방지하였다.
슬라이드/비드/항체의 복합체를 제조하기 위한 본 발명의 방법. 출원인의 방법은 TCO에 의해 관능화된 비드를 사용하였다. 비드의 TCO 기는 비드에 대한 메틸테트라진-관능화된 슬라이드의 공유 부착을 매개하였다. 또한, 비드의 TCO 기는 비드에 대한 메틸테트라진-관능화된 항-p53 항체의 공유 부착을 매개하였다.
놀랍게도, 본 출원인은 제1 단계가 슬라이드와 비드를 접촉시키는 것이면, 항체의 후속 첨가는 비드에 대한 항체의 공유 부착을 유발하지 않을 것임을 발견하였다. 또한, 본 출원인은 놀랍게도, 제1 단계가 비드와 항체를 접촉시키는 것이면, 이 혼합물의 슬라이드로의 후속 전달은 슬라이드에 대한 비드의 공유 부착을 유발하지 않을 것임을 발견하였다. 바람직한 방법에서, 3종의 이들 시약 모두 - 슬라이드, 비드 및 항체 - 는 동시에 서로 접촉된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 먼저 비드 및 항체를 함께 혼합하여 비드의 항체에 대한 공유 연결을 개시한 다음, 즉시 또는 몇 분 내에, 이 혼합물을 슬라이드에 적용하여, 그 결과 비드가 슬라이드에 공유 연결된다.
효소-기반 스크리닝 검정의 성질. 검정은 비드가 부착된 유리 슬라이드의 형태를 취한다. 비드는 전사 인자 p53에 대한 결합에 특이적인 부착된 항체를 함유한다. 이 항체는 인간 p53 및 또한 유비퀴틴화 인간 p53에 결합할 수 있다. 지금까지, 검정 방법은 하기 시약들 사이의 샌드위치를 수반한다는 것을 알 수 있다:
슬라이드 / 공유 결합된 비드 / 비드-결합된 항-p53 Ab / 유비퀴틴화 p53
이 검정으로부터의 판독물은 유비퀴틴화-p53이며, 여기서 유비퀴틴화-p53은 유비퀴틴에 특이적인 형광 항체에 의해 검출된다. 상세하게, 항체는 염소에서 제조된 폴리클로날 항체이며, 여기서 항체는 형광단 (AF488)으로 태그부착된다. 도 8은 AF488의 구조를 개시한다. 이 형광 항체는 유비퀴틴에 결합한다. 따라서, 유비퀴틴화-p53이 검출되는 경우에, 하기 샌드위치가 존재한다:
슬라이드 / 공유 결합된 비드 / 비드-결합된 항-p53 Ab / 유비퀴틴화 p53 / 형광 Ab
실시예 6. 피코웰에서의 DNA 서열분석.
비드-결합된 DNA 바코드의 서열분석을 수행하였으며, 여기서 비드는 피코웰당 1개의 비드로 피코웰에 위치하였다. 검정 방법은 형광 뉴클레오티드의 일시적 결합을 통해 비드-결합된 DNA 바코드 상의 각각의 위치를 한번에 하나씩 조사하는 것을 수반하였다. 각각의 비드는 약 100 아토몰의 커플링된 DNA 바코드를 함유하였으며, 여기서 커플링은 클릭-화학에 의한 것이었다. 이 수는 비드당 커플링된 약 6천만개의 올리고뉴클레오티드와 등가이다. DNA 바코드 상의 각각의 염기에 대해, 검정은 모든 4종의 형광 dNTP를 동시에 첨가하는 것을 수반한다. 어떠한 제한도 암시하지 않으면서, 4종의 형광 dNTP는 AF488-dGTP, CY3-dATP, 텍사스레드-dUTP 및 CY5-dCTP였다. 형광 신호를 포획한 다음, 이미지J 소프트웨어 (국립 보건원, NIH)에 의해 처리하여 상응하는 수치 값을 제공하였다. 데이터는 비드-결합된 DNA 바코드의 일부인 5개의 연속 뉴클레오티드 (모두 일렬)의 서열분석으로부터의 것이다. 비드-결합된 DNA 바코드는 DNA 헤어핀 영역을 포함하였다. DNA 헤어핀 영역 내의 염기는 그 자체에 어닐링되어 헤어핀을 형성하였으며, 여기서 이 DNA 헤어핀 내의 3'-말단 뉴클레오티드는 서열분석 프라이머로서의 역할을 하였다. 이 3'-말단에서 일시적 결합에 의한 서열분석을 개시하였다. 서열분석 검정을 삼중으로, 즉, 3개의 상이한 비드를 사용하여 수행하였으며, 여기서 1개의 DNA 바코드 서열을 3개의 비드 각각에 사용하였다. 다시 말해서, 3개의 비드 각각은 다른 2개의 비드에 의해 제공된 것과 동일한 서열분석 판독물을 제공할 것으로 예상되었다.
도 28은 서열분석 결과를 개시하며, 여기서 서열분석은 비드-결합된 DNA 바코드 상에서 수행하였다. 제1 염기, 제2 염기, 제3 염기, 제4 염기 및 제5 염기를 조사한 결과가 제시된다. 각각의 이들 염기에 대해, 각각 AF488-dGTP, CY3-dATP, 텍사스레드-dUTP 및 CY5-dCTP를 사용하여 조사함으로써 생성된 형광 방출이 별개의 히스토그램 막대로서 별개로 제시된다. 각각의 4개의 히스토그램 막대는 상이한 그래픽을 갖는다: AF488-dGTP (흑색 윤곽선, 회색 내부), CY3-dATP (흑색 윤곽선, 백색 내부), 텍사스레드-dUTP (채워진 흑색 히스토그램 막대) 및 CY5-dCTP (채워진 회색 히스토그램 막대). 비드 직경은 수용액에서의 팽윤 후 10-14 마이크로미터였다. 피코웰의 부피는 12 피코리터였다.
조사된 주형 서열은 5'-CTCACATCCCATTTTCGCTTTAGT-3'였다. 이러한 특정한 서열분석 검정을 위해, 5개의 연속 염기를 조사하였으며, 여기서 가장 큰 형광 신호를 제공한 형광 dNTP는 형광 dGTP, dATP, dGTP, dUTP 및 dGTP였으며, 이는 dC, dT, dC, dA 및 dC인 주형 상의 서열에 상응한다. 따라서, 서열분석 결과는 100% 정확하였다. 결과는 비드-결합된 DNA 바코드가 서열분석될 수 있고, 즉, DNA 바코드가 여전히 비드에 결합되어 있다는 것을 입증한다. 다시 말해서, 비드-결합된 DNA 바코드는 서열분석가능하다.
실시예 7. 세포 바코딩
바코딩 개념 소개. 여기서 바코딩의 개념을 소개한다. 통상의 바코딩 기술은 주어진 단일 세포의 트랜스크립톰을 바코딩한다. 도 36 및 도 37은 향후 서열분석을 위한 준비로, 트랜스크립톰을 포획 및 증폭시키는 절차에 대한 단계를 예시한다. 도 36은 mRNA를 방출시키기 위한 세포의 용해, 이어서 역전사를 보여준다. 도 37은 고정화된 폴리(dT)에 의한 mRNA의 포획, 이어서 역전사 및 최종적으로 서열분석을 보여준다. 서열분석은 차세대 서열분석 (NGS)으로 이루어질 수 있다.
주어진 세포로부터의 메신저 RNA (mRNA) 분자의 일부 또는 대부분은 공통 바코드로 태그부착될 수 있으며, 여기서 이 태그부착은 연구자가 임의의 주어진 mRNA 서열에 대해 주어진 세포의 관점에서 그 코딩 서열의 기원을 결정하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 100개의 상이한 단일 세포로부터의 각각의 별개의 트랜스크립톰을 나타내는 핵산이 함께 혼합되는 경우 및 100개의 상이한 단일 세포 각각으로부터의 핵산이 그 자신의 바코드를 갖는 경우에, 하기 이점이 나타날 것이다. 이점은 모든 트랜스크립톰으로부터의 핵산이 하나의 시험 튜브에서 함께 혼합될 수 있고, 이어서 차세대 서열분석에 적용될 수 있으며, 여기서 바코드는 사용자로 하여금 어느 정보가 동일한 세포로부터의 것인지를 확인할 수 있게 한다는 것이다.
상기 이점은 하기와 같이 상이한 방식으로 기재된다. mRNA 바코딩의 사용에서, 주어진 단일 세포는 그 세포로부터의 mRNA 분자의 일부 또는 대부분으로부터의 정보가 cDNA의 상응하는 분자로 전환되도록 프로세싱되며, 여기서 각각의 이들 cDNA 분자는 정확히 동일한 DNA 바코드를 보유한다. 이러한 바코딩 절차는 10개, 20개, 100개, 수백개 또는 1,000개 초과의 상이한 세포로 반복될 수 있으며, 여기서 이들 세포 각각으로부터의 cDNA 분자는 고유한 세포-특이적 바코드를 가짐으로써 구별된다. 이 방법은 연구자가 모든 세포로부터의 모든 바코딩된 cDNA 분자 (모든 바코딩된 cDNA 분자는 서열분석 전에 함께 혼합됨)의 풀로부터 DNA 서열분석을 모두 하나의 서열분석 실행으로 수행할 수 있게 한다 (문헌 [Avital, Hashimshony, Yanai (2014) Genome Biology. 15:110] 참조).
형질 막을 태그부착하는 바코드와 비교하여 핵산을 태그부착하는 바코드. 각각의 화학물질 또는 각각의 부류의 화학물질의 모든 구성원이 고유한 DNA 바코드와 회합된 것인 화학물질의 라이브러리를 제조하기 위한 지침이 이용가능하다 (문헌 [Brenner and Lerner (1992) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 89:5381-5383, Bose, Wan, Carr (2015) Genome Biology. 16:120. DOI 10.1186] 참조). 상기 바코딩 예를 염두에 두고, 하기는 특정한 단일 세포에 또한 적용될 수 있는 또 다른 유형의 바코딩을 제공한다. 본 개시내용은 세포의 형질 막에 안정하게 부착된 태그의 형태를 취하는 세포-회합 바코딩을 제공한다.
형질 막-결합에 부착되는 적어도 2종의 바코드의 옵션. 주어진 세포의 형질 막을 태그부착하기 위해 사용되는 바코드는 세포의 유형을 확인하는 제1 바코드 및 세포에 노출된 교란제를 확인하는 제2 바코드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 바코드는 세포를 건강한 인간 대상체, 임상 연구 번호 7로부터의 인간 대상체 번호 38, 인간 원발성 결장직장암 세포주, 5회 계대배양된 인간 원발성 결장직장암 세포주, 다발성 골수종을 갖는 다발성 골수종 인간 대상체, 다발성 골수종을 갖는 치료-나이브 인간 대상체 번호 23, 또는 다발성 골수종을 갖는 치료-경험이 있는 인간 대상체 번호 32로부터 기원하는 것으로서 확인할 수 있다.
또한, 바코드는 특정한 단일 세포에 주어진 (바코딩 전 또는 후에 주어진) "교란제"를 확인할 수 있다. "교란제"는 항암 약물, 항암 약물들의 조합물, 조합으로 생성된 화합물, 또는 항체 약물과 소분자 약물의 조합물일 수 있다. 바코딩은 주어진 단일 세포를 추적하는 데 사용될 수 있고, 그 세포를 후속 거동, 예컨대 1개 이상의 세포-신호전달 경로에 의한 활성화 또는 억제, 증가 또는 감소된 이동, 아폽토시스, 괴사, 1종 이상의 CD 단백질 (CD, 분화 클러스터)의 발현 변화, 1종 이상의 종양유전자의 발현 변화, 1종 이상의 마이크로RNA (miRNA)의 발현 변화와 상관시키는 데 사용될 수 있다. 발현은 전사 속도, 세포 내의 주어진 폴리펩티드의 수준, 시토졸로부터 막-결합으로의 주어진 단백질의 위치 변화 등의 관점에서 이루어질 수 있다.
막-결합된 당단백질의 세포-표면 올리고사카라이의 태그부착. 태그, 예컨대 DNA 바코드를 살아있는 세포의 형질 막에 연결하기 위한 방법 및 시약이 이용가능하다. 태그부착은 막-결합된 당단백질의 올리고사카라이드 쇄를 공격하고 이에 공유 결합하는 반응성 모이어티와 DNA 바코드의 공유 복합체로 이루어진 시약에 의해 달성될 수 있다. 문헌은 히드라지드 비오시틴이 막-결합 당단백질 상의 탄수화물에 비오틴을 연결하는 데 사용될 수 있다는 것을 확고히 하고 있다. 본 개시내용은 이 시약을 사용하되, 단 비오틴을 DNA 바코드로 대체한다. 탄수화물은 산화되어 알데히드를 형성할 필요가 있다. 히드라지드는 알데히드와 반응하여 히드라진 연결을 형성한다. 올리고사카라이드 상의 시알산 성분은 1 mM Na 메타-퍼아이오데이트 (NaIO4)로 용이하게 산화된다. 산화 단계 및 히드라지드-연결 단계의 수행에서, 1급 아민 기를 갖는 완충제는 피해야 한다. 예를 들어, 문헌 ["Instructions. EZ-LinkHydrazide Biocytin. Number 28020. ThermoScientific (2016) (4 pages), Bayer (1988) Analyt. Biochem. 170:271-281, Reisfeld (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:519-526, Wollscheid, Bibel, Watts (2009) Nature Biotechnol. 27:378-386]을 참조한다.
살아있는 세포 상의 당단백질의 올리고사카라이드 모이어티를 태그부착시키는 또 다른 방법은 퍼아이오데이트 산화 및 아닐린-촉매된 옥심 라이게이션을 사용하는 것이다. 이 방법은 시알산의 온화한 퍼아이오데이트 산화 및 이어서 아닐린의 존재 하에 아미녹시 태그와의 라이게이션을 사용한다. 이 방법의 변형법에서, 갈락토스 옥시다제를 사용하여 알데히드를 올리고사카라이드의 말단 갈락토스 잔기 및 말단 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 잔기에 도입할 수 있다. 갈락토스 옥시다제는 탄소-6에서의 산화를 촉매하여 알데히드를 생성한다. 알데히드 생성 후, 아닐린-촉매된 라이게이션을 사용하여 아미녹시비오틴과 커플링시킬 수 있다 (문헌 [Ramya, Cravatt, Paulson (2013) Glycobiology. 23:211-221] 참조). 본 개시내용은 비오틴을 DNA 바코드로 대체하고, 아미녹시-DNA 바코드의 아닐린-촉매된 라이게이션을 제공한다.
세포 표면에 결합된 항체에 의해 매개되는 태그부착. 본 개시내용은 바코드를 세포의 형질 막에 부착시키기 위한 방법 및 시약을 제공하며, 여기서 부착은 막-결합된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 매개된다. 항체는 트랜스-시클로옥텐 (TCO)으로 공유 변형될 수 있으며, 여기서 이러한 변형은 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 수행될 수 있다 (문헌 [Supporting Information (5 pages) for Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016] 참조). 이러한 항체의 공유 변형은 시약, 트랜스-시클로옥텐 숙신이미딜 카르보네이트를 사용하여 수행될 수 있다 (Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016). 이어서, 항체-테트라진 복합체를 세포와 접촉시켜 막-결합된 항체를 생성할 수 있다. 막-결합된 항체는 각각 테트라진 모이어티를 보유하며, 이는 클릭 화학을 통해, 예컨대 항체를 DNA 바코드-테트라진 복합체에 노출시킴으로써 항체의 태그부착을 가능하게 한다.
테트라진은 시약, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS)를 사용하여 항체의 유리 아미노 기에 도입될 수 있다 (문헌 [van Buggenum, Gerlach, Mulder (2016) Scientific Reports. 6:22675] 참조). 항체가 1개 이상의 테트라진 기를 함유하면, 항체는 TCO-DNA 바코드인 시약에 의해 DNA 바코드를 부착시킴으로써 추가로 변형될 수 있다. 이러한 변형된 항체를 사용하여, 항체는 이어서 살아있는 세포를 태그부착시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서 항체는 세포의 막-결합된 단백질에 결합한다.
테트라진-DNA 바코드의 복합체를 제조할 수 있다. 이어서, 이러한 복합체를 세포 배지 내로 도입할 수 있으며, 여기서 배지는 세포를 포함하고, 세포는 부착된 항체-TCO 복합체를 보유한다. 테트라진-DNA 바코드가 막-결합된 항체-TCO 복합체와 접촉하는 경우, 그 결과 클릭 화학 반응이 일어나 세포가 DNA 바코드로 태그부착된다. 이 클릭 화학 반응은 37℃에서 30분 동안 수행될 수 있다.
상기 절차에 사용하기 위한 바람직한 항체는 형질 막의 막-결합된 단백질에 단단히 및 특이적으로 결합하는 것이며, 여기서 막-결합된 단백질은 높은 존재비로, 예를 들어 세포 막당 50,000개 초과의 카피로 발생하고, 막-결합된 단백질은 세포 표면 상에서 안정하고, 세포의 내부로 많이 재순환되지는 않고, 막-결합된 막은 배양 배지 내로 많이 유출되지는 않는다.
막-결합된 단백질을 아지드로 태그부착하고, 이어서 옥틴 접합체로 클릭 화학을 수행한다. 아지드는 효소, 리포산 리가제에 의해 살아있는 세포의 막-결합된 단백질 상에 도입되고, 이어서 DNA 바코드에 접합된 플루오린화 옥틴 화합물이 부착될 수 있다. 플루오린화 옥틴 화합물의 형광단에 대한 접합이 기재되어 있다 (문헌 [Jewett and Bertozzi (2010) Chem. Soc. Rev. 39:1272-1279, Fernandez-Suarez, Bertozzi, Ting (2007) Nature Biotechnol. 25:1483-1487] 참조). 반복하면, "팅(Ting) 및 동료들은 리포산 리가제를 . . . 사용하여 포유동물 세포-표면 단백질 내로 아지드를 도입하였다 . . . 이어서, 단백질을 플루오린화 시클로옥틴-접합된 형광 염료-접합된 형광 염료로 표지할 수 있다" (상기 문헌 [Jewett et al.]).
실시예 7. 피코웰 위의 캡
피코웰 캡핑. 각각의 피코웰을, 각각의 피코웰에 1개의 구체로, 구체로 캡핑하였으며, 여기서 구체는 피코웰의 개구 (상단 개구부)에 피팅된다. 구체를 피코웰 플레이트에 적용하기 위해, 구체를 성장 배지에 넣고 현탁시킨 다음, 피코웰 플레이트의 상단 표면에 적용하고, 구체를 침강되도록 하였다. 이어서, 각각의 피코웰의 개구에서 구체의 견고한 안착을 얻기 위해, 전체 플레이트를 원심분리기에 배치하고 저-중력으로 스핀시킨다.
활성 캡 및 수동 캡. 도 18a는 피코웰의 상단에 삽입된 활성 캡을 보여주고, 도 18b는 피코웰의 상단에 삽입된 수동 캡을 보여준다. 바람직하게는, 캡은 피코웰 플레이트를 제조하는 데 사용된 물질보다 더 연질인 물질로 제조되고, 그 결과 캡이 피코웰의 개구 내로 눌려질 때 캡이 약간 변형되고, 그 결과 누출을 방지하도록 꼭 맞게 피팅된다. 실시양태에서, 본 개시내용은 활성 캡, 수동 캡 또는 활성 캡 및 수동 캡 둘 다 중 1개 이상을 제공한다. 각각의 캡은 독립형일 수 있고, 임의의 다른 캡에 연결되지 않을 수 있다. 대안적 실시양태에서, 예를 들어 플레이트의 상단 표면 상에 놓일 수 있는 중합체 시트에 의해, 보다 많은 캡이 함께 연결될 수 있으며, 여기서 복수의 캡이 중합체 시트의 하단으로부터 돌출되고, 돌출 캡은 각각의 피코웰에 피팅되도록 미리 결정된 간격으로 존재한다. 피코웰의 바닥에 놓일 수 있는 비드 대신 활성 캡을 사용할 수 있다. 활성 캡은 실질적으로 동일한 화합물의 많은 부착된 카피를 함유하며, 여기서 각각의 화합물은 활성 캡 (여기서 구형 비드의 샘플에 제시됨)에 부착되고, 절단은 피코웰에 존재하는 용액 내로의 화합물의 방출을 유발한다 (도 18a).
수동 캡과 관련하여, 수동 캡은 다공성이고, 스폰지처럼 작용한다. 이는 생화학적 반응으로부터 생성물을 흡수하고, 따라서 사용자의 목적이 피코웰 내의 배양물인 살아있는 생물학적 세포에 대한 주어진 화합물의 영향을 결정하는 것인 경우 생성물의 수집을 용이하게 한다. 다시 말해서, 화합물은 세포가 반응하도록 자극하며, 여기서 반응은 1종 이상의 대사물의 증가된 (또는 감소된) 발현의 형태를 취하고, 대사물 중 일부는 수동 캡을 향해 확산되고 수동 캡에 의해 흡수된다. 이어서, 사용자는 수동 캡을 수집하고, 수동 캡에 흡수된 대사물을 분석할 수 있다 (도 18b).
캡의 어레이에 부착되는 중합체 매트. 도 19는 다공성 캡의 어레이에서 각각의 캡에 부착될 수 있는 중합체 매트를 예시한다. 부착되면, 중합체 매트를 박리하고 제거하여, 이와 함께 어레이 내 각각의 다공성 캡을 가져올 수 있다. 그 결과, 다공성 캡을 갖는 중합체 매트는 다공성 캡과 회합된 대사물 또는 다른 화학물질을 측정하는 검정에 사용될 수 있다.
단계적 예를 제공하자면, 수천개의 피코웰의 어레이 내의 각각의 웰은 1개의 비드를 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 비드는 1가지 유형의 화합물을 함유하고, 여기서 화합물은 절단가능한 링커를 통해 부착된다. 피코웰은 또한 용액뿐만 아니라 배양된 세포를 함유한다. 피코웰은 다공성 캡으로 밀봉되며, 여기서 다공성 캡은 용액과 접촉하고, 배양된 세포로부터 방출되는 대사물을 포획 (샘플링, 흡수, 흡착)할 수 있다. 대사물은 화합물의 대사물일 수 있거나, 또는 대사물은 시토카인, 인터류킨, 중간 대사의 생성물, 마이크로RNA 분자, 엑소솜 등의 형태를 취할 수 있다. 최종적으로, 폴리아크릴아미드의 용액을 피코웰 플레이트 상에 붓고, 폴리아크릴아미드를 수천 개의 다공성 캡 내로 침지시키고, 이어서 각각의 및 모든 캡에 단단히 부착된 매트의 형태로 응고시킨다. 이어서, 응고된 매트를 제거하며, 여기서 각각의 캡을 흡수된 대사물에 대해 별개로 분석한다.
바람직한 실시양태에서, 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 캡핑 비드를 얽혀있는 층 또는 매트 내로 가교시킨다. 피코웰 어레이 위에 부어 캡핑 비드를 경화시키고 얽어 넣을 수 있는 폴리아크릴아미드 용액의 20% 용액을 생성하는 프로토콜은 하기와 같다. 40% 비스-아크릴아미드 용액 4 ml 및 1.5 M 트리스 pH 8.8 2 ml를 증류 탈이온수 1.8 ml에 첨가한다. 이 혼합물을 캡핑된 피코웰 어레이 위에 붓기 직전에, 80 마이크로리터의 자유 라디칼 개시제 과황산암모늄 (APS, 10% 원액) 및 8 마이크로리터의 자유 라디칼 안정화제 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌-디아민 (TEMED)을 첨가하여 겔의 가교를 시작한다. 겔 층을 부은 후, 완전히 가교시키고, 캡핑된 피코웰 어레이 위에서 완전히 가교되도록 한다. 완전히 가교되면 (취급하기에 충분히 강직성 또는 대략 60분의 세팅), 폴리아크릴아미드 층은 트위저를 사용하여 박리될 수 있다. 캡핑 비드는 피코웰의 상단으로부터 들어올려져 폴리아크릴아미드 층에 부착되는 것으로 발견된다. 이러한 거동은 폴리아크릴아미드 비드, 텐타겔 비드, 폴리스티렌 비드 및 실리카 비드를 포함한 다수의 비드 유형에 대해 관찰될 수 있다.
누출 방지에 있어서의 캡의 효능 측정. 실시양태에서, 캡의 효능은 광절단가능한 링커를 갖는 비드를 사용함으로써 결정될 수 있다. 피코웰 또는 하나의 특정한 피코웰 어레이 내의 몇몇 피코웰의 영상은 피코웰을 UV 광에 노출시키기 직전에 및 피코웰을 UV 광에 노출시킨 후 시간 프레임에서 캡쳐될 수 있다. 예를 들어, 영상은 t = 마이너스 10초 및 t = 10초, 20초, 40초, 60초, 2분, 4분, 8분, 15분, 60분, 90분, 2시간, 3시간 및 4시간에 캡쳐될 수 있다. 2시간에서의 주어진 웰의 형광이 t = 10초에서 발견된 형광의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 약 100%와 동일한 (t = 마이너스 10초에서 찍힌 배경 영상이 차감됨) 탁월한 효능이 나타날 수 있다. 영상은 또한, 예를 들어 캡 바로 근처에서 피코웰 외부의 피코웰 플레이트의 영역에서 찍을 수 있다. 플레이트의 표면 상의 (피코웰 외부) 및 캡 바로 근처의 영역의 형광이 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 0.01% 미만, 0.005% 미만 또는 0.001% 미만인 경우에 탁월한 효능이 나타날 수 있다. 이러한 비교는 웰 내의 유체의 부피와 관계없이 및 플레이트의 상단 및 캡의 외부에 위치한 임의의 유체의 부피와 관계없이 이루어질 수 있으며, 여기서 비교는 단순히 광 검출기에 의해 캡쳐되는 전체 시야를 고려할 수 있다. 대안적으로, 비교는 유체의 깊이 (피코웰의 깊이, 피코웰 플레이트의 상단 상의 유체의 깊이)의 교정으로 이루어질 수 있다. 또한 대안적으로, 비교는 피코웰 플레이트의 전체 표면에 걸친 임의의 누출 형광단의 확산을 고려할 수 있다.
바코딩이 본 개시내용의 시약 및 방법에 적용되는 방법. 하기는 본 개시내용의 시약 및 방법의 추가 실시양태를 제공한다.
시약 및 능력. 현미경 비드가 제공된다. 현미경 비드는 각각 고체-상 합성에 의해 단량체와 커플링될 수 있는 복수의 제1 링커에 의해 공유 변형될 수 있으며, 여기서 고체-상 합성의 완료는 화학적 라이브러리의 구성원을 생성한다. 이러한 화학적 라이브러리의 구성원은 비드-결합된다. 동일한 현미경 비드는 각각 복수의 DNA 바코드와 커플링될 수 있는 복수의 제2 링커에 의해 공유 변형될 수 있다. 이러한 DNA 바코드의 구성원은 비드-결합된다.
실시예 9. 본 개시내용의 DNA 바코드
이는 DNA 서열을 화학적 라이브러리 구성원과 상관시키는 "DNA 바코드"를 제공하는, 종이 상에 인쇄될 수 있거나 또는 컴퓨터 언어로 저장될 수 있는 정보의 세트에 관한 것이다. 이러한 DNA 바코드는 "범례" 또는 "기호설명"으로 불릴 수 있다. DNA 바코드는 또한 화학적 화합물의 특정 부류, 예컨대 특정 FDA-승인된 항암 약물의 유사체를 확인할 수 있거나 또는 사용자의 이름을 확인할 수 있거나 또는 비드-결합된 화학적 라이브러리로 시험될 특정 질환을 확인할 수 있는 핵산을 제공한다.
실시예 10. 레날리도미드 유사체
도 13, 14 및 15는 레날리도미드의 3종의 상이한 유도체 (각각의 유도체는 카르복실산 기를 보유함)로의 전환을 개시한다. 각각의 이들 카르복실산 기는 후속적으로 비드-링커 복합체와 축합시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 카르복실산 기가 비드-링커 복합체에 축합되는 경우, 이는 이전에 Fmoc에 의해 점유된 위치에 부착된다.
1급 아민으로 시작하여 이를 카르복실산으로 전환시킨다 (도 13). 출원인은 1급 아민을 갖는 화합물을 카르복실 기를 갖는 화합물로 전환시킴으로써 화합물의 라이브러리를 생성하는 접근법을 취한다. 도 13은 레날리도미드로 시작하는 것을 개시한다. 레날리도미드는 1급 아민을 갖는다. 여기에 4-디메틸아미노피리딘 (DMA) 및 아세토니트릴 (ACN) 중 숙신산 무수물을 첨가한다. 숙신산 무수물은 1급 아미노 기와 축합되어, 카르복실산 기를 보유하는 레날리도미드를 생성한다. 도면에서 용어 "cat."는 촉매를 의미한다.
후속적으로, 이 카르복실산 기는 비드에 연결될 수 있다. 따라서, 생성된 복합체는 BEAD-숙신산 모이어티-레날리도미드이다.
도 14는 리날리도미드로 시작하고 t-부틸-브로모아세테이트를 첨가하여 중간체를 제공하는 것을 개시한다. 이어서, 중간체를 FmocOSu (o-숙신이미드)로 처리하여 레날리도미드의 카르복실산 유도체인 최종 생성물을 생성한다. 이어서, 카르복실산 모이어티는 유리 아미노 기, 예를 들어 Fmoc 기가 한번 부착된 유리 아미노 기와 축합될 수 있다. 대안적으로, 카르복실산은 비드 상에 존재하는 화학적 단량체의 유리 아미노 기와 축합될 수 있으며, 축합 결과 2개의 화학적 단량체가 서로 부착된다.
도 15는 출발 물질로서 레날리도미드를 개시한다. 레날리도미드는 3-카르복시벤즈알데히드와 반응하며, 여기서 알데히드 기는 아미노 기와 축합되어 레날리도미드의 또 다른 유형의 카르복실산 유도체를 생성한다.
도 16a, 도 16b 및 도 16c는 신규하고 고유한 비드-결합된 화합물의 라이브러리를 생성하기 위한 본 출원인의 또 다른 접근법을 개시하며, 여기서 화합물은 비드로부터 방출된 다음, 세포-기반 검정 또는 무세포 검정에서 활성에 대해 시험될 수 있다. 각각의 3종의 화합물은 1급 아민이 벤젠 고리의 고유한 위치에 있는 레날리도미드 유사체이다.
실시예 11. 커플링된 반응-포획 요소를 갖는 비드와 함께 세포를 함유하는 피코웰.
본 개시내용은 화합물에 대한 세포의 반응을 평가하기 위한 시약, 시스템 및 방법을 제공하며, 여기서 측정되는 반응은 트랜스크립톰의 변화의 형태를 취한다. "트랜스크립톰의 변화"는, 어떠한 제한도 암시하지 않으면서, 세포 내의 각각의 및 모든 유형의 고유한 mRNA의 양의 변화, 뿐만 아니라 세포 내의 미리 결정된 mRNA 분자 세트의 양의 변화를 지칭할 수 있다. "트랜스크립톰의 변화"는 검출 하한치 미만으로부터 검출가능하게 되는 것까지의 변화, 뿐만 아니라 검출가능한 것으로부터 검출 하한치 미만으로의 하락까지의 변화를 포함하며, 여기서 이들 변화는 비드-결합된 화합물의 방출과 연관된다.
세포는 세제 또는 계면활성제를 피코웰 어레이에 첨가함으로써 용해될 수 있다. 예를 들어, 세제를 함유하는 소정 부피의 완충제가 내부에 수천개의 피코웰을 함유하는 마이크로웰 내로 피펫팅될 수 있다. 세제는 모든 피코웰 내로 확산되어, 내부 세포의 용해, mRNA의 방출 및 최종적으로 비드-결합된 "포획 반응 요소"에 의한 결합을 유발할 수 있다.
세포 용해. 세포는 동결 및 해동의 1회 이상의 주기에 의해 용해될 수 있다 (Bose, Wan, Carr (2015) Genome Biology. 16:120. DOI 10.1186). 세포는 또한 진탕하면서 퍼플루오로-1-옥탄올로 용해될 수 있다 (Macosko, Basu, Satija (2015) Cell. 161:1202-1214, Ziegenhain (2017) Molecular Cell. 65:631-643, Eastburn, Sciambi, Abate (2014) Nucleic Acids Res. 42:e128). 또한, 세포는 계면활성제 (트윈-20®)와 프로테아제의 조합에 의해 용해될 수 있다 (Eastburn, Sciambi, Abate (2013) Anal. Chem. 85:8016-8021). 세포의 용해는 mRNA의 방출을 유발한다. mRNA는 용해된 세포 (또는 세포들)와 동일한 피코웰에 존재하는 비드에 의해 포획된다. 비드는 매우 많은 수의 비드-결합된 폴리뉴클레오티드를 함유하고, 여기서 각각의 폴리뉴클레오티드는 2개의 핵산을 함유하고, 여기서 제1 핵산은 공통 DNA 바코드를 함유하고, 제2 핵산은 "반응 포획 요소"를 함유한다. 목적이 세포 내의 모든 mRNA의 무차별적 포획인 경우에, "반응 포획 요소"는 폴리(dT)의 형태를 취할 수 있다. 이러한 폴리(dT)는 mRNA 분자의 폴리(A) 테일에 결합한다.
보다 많은 세포 용해 조건. 세포 용해는 나트륨 염을 갖는 세제, 예를 들어 15 mM NaCl, 25 mM NaCl, 50 mM NaCl, 75 mM NaCl, 100 mM NaCl을 갖는 0.05% 트리톤 X-100, 15 mM NaCl, 25 mM NaCl, 50 mM NaCl, 75 mM NaCl, 100 mM NaCl을 갖는 0.1% 트리톤 X-100, 15 mM NaCl, 25 mM NaCl, 50 mM NaCl, 75 mM NaCl, 100 mM NaCl을 갖는 0.2% 트리톤 X-100, 또는 15 mM NaCl, 25 mM NaCl, 50 mM NaCl, 75 mM NaCl, 100 mM NaCl을 갖는 0.5% 트리톤 X-100, 또는 칼륨 염을 갖는 세제, 예컨대 15 mM KCl, 25 mM KCl, 50 mM KCl, 75 mM KCl, 100 mM KCl을 갖는 0.05% 트리톤 X-100, 15 mM KCl, 25 mM KCl, 50 mM KCl, 75 mM KCl, 100 mM KCl을 갖는 0.1% 트리톤 X-100, 15 mM KCl, 25 mM KCl, 50 mM KCl, 75 mM KCl, 100 mM KCl을 갖는 0.2% 트리톤 X-100, 또는 15 mM KCl, 25 mM KCl, 50 mM KCl, 75 mM KCl, 100 mM KCl을 갖는 0.5% 트리톤 X-100에 대한 노출에 의해 수행될 수 있다. 노출은 약 4℃ 또는 실온 (23℃) 등에서 10분, 20분, 40분 또는 60분 동안 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 발현 프로파일에 대한 화합물의 영향을 평가할 수 있다. 비드-결합된 포획 요소는 1개 이상의 관심 mRNA 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 1개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 1개 이상의 mRNA 분자는 특정 질환과 연관된다. 다양한 질환, 예를 들어 결장암 (Llarena (2009) J. Clin. Oncol. 25:155 (e22182), 난소암 (Spentzos (2005) J. Clin. Oncol. 23:7911-7918) 및 폐 선암종 (Takeuchi (2006) J. Clin. Oncol. 11:1679-1688)에 대한 발현 프로파일이 이용가능하다. 유사한 예를 제공하자면, 간으로 전이된 비-간 종양 세포와 연관된 mRNA에 대한 방출된 화합물의 영향이 또한 특징화될 수 있다 (문헌 [Barshack, Rosenwald, Bronfeld (2008) J. Clin. Oncol. 26:15 Suppl. 11026, Barshack (2010) Int. J. Biochem. Cell Biol. 42:1355-1362] 참조).
트랜스크립톰 포획. 폴리A 기를 고정화된 폴리(dT)에 혼성화시킴으로써 mRNA를 포획하는 방법이 이용가능하다 (문헌 [Dubiley (1997) Nucleic Acids Res. 25:2259-2265, Hamaguchi, Aso, Shimada (1998) Clinical Chem. 44:2256-2263, D.S. Hage (2005) Handbook of Affinity Chromatography, 2nd ed, CRC Press, page 549] 참조).
용해된 세포 (또는 세포들)로부터 방출된 mRNA 분자의 포획 후에, 비드-결합된 폴리뉴클레오티드는 mRNA로부터의 역전사를 지지하는 프라이머로서의 역할을 하여, 비드-결합된 상보적 DNA (cDNA)를 생성하고, 여기서 이 비드-결합된 cDNA가 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 비드-결합된 cDNA는 비드로부터 방출될 수 있으며, 여기서 비드-결합된 "반응 포획 요소"는 절단가능한 링커, 예컨대 광절단가능한 링커에 의해 비드에 커플링된다. 광절단가능한 링커가 사용되는 경우에, 비드-결합된 화합물 (화학적 단량체 라이브러리로부터 제조된 화합물)을 방출시키기 위한 절단 조건은 비드-결합된 "반응 포획 요소"를 또한 절단하지는 않는다.
세포가 비드-결합된 화합물 또는 비드로부터 방출된 화합물에 노출되는 경우에, 세포는, 예를 들어 화합물에 대한 노출의 존재 또는 부재 하에 트랜스크립톰의 임의의 변화를 특징화함으로써 유전자 반응에 대해 스크리닝될 수 있다. 또한, 세포는 표현형 반응, 예를 들어 아폽토시스, 1종 이상의 세포-신호전달 단백질의 활성의 변화 또는 1종 이상의 CD 단백질의 세포-표면 발현의 변화에 대해 스크리닝될 수 있다. CD는 분화 클러스터이다 (문헌 [Lal (2009) Mol. Cell Proteomics. 8:799-804, Belov (2001) Cancer Res. 61:4483-4489, IUIS/WHO Subcommittee on CD Nomenclature (1994) Bull.World Health Org. 72:807-808, IUIS-WHO Nobenclature Subcommittee (1984) Bull.World Health Org. 62:809-811] 참조). 일부 표현형 반응 검정의 경우, 세포는 용해되지 않아야 한다.
본 개시내용은, 예를 들어 단일 세포를 한 유형의 약물에 노출시킴으로써 (피코웰에서 노출이 일어남) 상이한 약물을 상이한 세포로 분할하는 미충족 필요를 다룬다.
본 개시내용은 또한 mRNA가 세포로부터 방출된 후 cDNA가 제조되는 바코딩된 mRNA 제조에 대한 필요성을 제거한다 (이러한 유형의 바코드에서, 주어진 세포로부터의 모든 mRNA는 트랜스크립톰이 상응하는 cDNA 라이브러리로 전환될 때 동일한 바코드를 수용함).
교란제와의 세포 인큐베이션 동안의 파라미터. 임의의 주어진 화합물 또는 일부 다른 유형의 교란제에 대해, 파라미터는 달라질 수 있거나 또는 제어된 광, 온도, 세포 배지의 pH, 소리, 농도 및 시약에 대한 노출 시간 (시약은 비드로부터 방출된 화합물, 효소 기질, 시토카인, 이미 확립된 약물인 화합물, 염일 수 있음), 기계적 교반, 세포-표면 단백질에 대한 항체 등일 수 있다.
세포 바코딩. 세포는 비드-결합된 화합물과 함께 또는 비드-결합된 절단가능한 링커로부터의 절단 후의 화합물과 함께 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 동안 또는 후에, 세포는 교란제를 확인하는 막-결합된 바코드로 바코딩될 수 있다. 이러한 막-결합된 바코드는 세포 막의 올리고사카라이드, 세포 막의 폴리펩티드 또는 세포 막의 인지질에 커플링될 수 있다.
폴리(dT) 이외의 다른 반응 포획 요소. 메신저 RNA는 5-프라임 7-메틸구아노신 캡에 의해 포획될 수 있다. 이 방법은 폴리A 테일이 짧은 경우에 특히 유용하다 (문헌 [Blower, Jambhekar (2013) PLOS One. 8:e77700] 참조). 또한, mRNA는 mRNA의 코딩 영역에 특이적인 고정화된 DNA를 사용하여 포획될 수 있다. 이 방법은 "RNA 엑솜 포획" 및 이 명칭의 변형으로 불린다. 문헌 [Cieslik et al.]에 따르면, "엑손-표적화 RNA 프로브를 사용하는 밤샘 포획 반응 (RNA-DNA 혼성화)이 트랜스크립톰을 포획하는 데 고유하다" (Cieslik (2015) Genome Res. 25:1372-1381).
마이크로RNA (miRNA). 본 개시내용은 주어진 세포에서의 miRNA의 발현 프로파일 또는 대안적으로 주어진 miRNA 종에 의해 특이적으로 결합되는 mRNA의 집단의 발현 프로파일에 대한 방출된 비드-결합된 화합물의 영향을 평가할 수 있다 (Jain, Ghosh, Barh (2015) Scientific Reports. 5:12832). 예를 들어, 본 개시내용은 ( 1 ) 비드-결합된 화합물, ( 2 ) 비드-결합된 DNA 바코드 및 ( 3 ) 비드-결합된 반응 포획 요소를 함유하는 비드를 제공하며, 여기서 반응 포획 요소는 miRNA를 포획하거나 또는 반응 포획 요소는 miRNA 종을 (반응 포획 요소의 일부로서) 포함한다. 마이크로RNA에 대한 발현 프로파일은 다양한 유형의 암, 예를 들어 유방암에 대해 밝혀졌다 (Tanja (2009) J. Clin. Oncol. 27:15 Suppl. 538).
전체 트랜스크립톰으로부터 선택된 mRNA 집단을 포획하는 방법이 이용가능하다. "풀-다운" 검정에서 가교 화합물로서 한 유형의 마이크로RNA, 예컨대 miR-34a를 사용함으로써 선택성이 부여될 수 있다. 간략하게, "miR-34a로 풀 다운된 전사체는 . . . 성장 인자 신호전달 및 세포 주기 진행에 있어서의 그의 역할이 강화되었다" (Lal, Thomas, Lieberman (2011) PLOS Genetics. 7:e1002363). 포획되는 mRNA 분자는 miR-34A에 결합하는 것이다.
mRNA를 포획하고 발현 수준을 분석하는 추가의 방법이 이용가능하다 (Bacher (2016) Genome Biology. 17:63, Svensson (2017) Nature Methods. 14:381, Miao and Zhang (2016) Quantitative Biol. 4:243, Gardini (2017) Nature Methods. 12:443). 인핸서 RNA의 변화 형태를 취하는 세포 반응이 측정될 수 있다 (문헌 [Rahman (2017) Nucleic Acid Res. 45:3017] 참조).
전달 장치
검정 조건이 단일 비드가 단일 웰 내로 침착되는 것을 요구할 때 그를 보장하기 위해, 전달 장치를 사용하여 단일 웰당 단일 비드를 달성한다. 전달 장치는 로봇 공정, 수동 공정 또는 로봇 공정과 수동 공정의 조합에 포함될 수 있다. 전달 장치는 자기 또는 비-자기 비드에 기초할 수 있다. 자기 비드는 바람직하게는 가역적 자성을 갖는 자기 전달 장치를 사용한다. 비-자기 비드는 크기 및 중력에 기초한 정전기 인력 또는 공학 원리를 사용한다.
본원에 사용된 비-자기 비드는 그에 결합된 성분, 예컨대 pH 7에서 음으로 하전된 DNA로 인해 정전기적으로 하전될 수 있다. 양으로 하전된 수지는 음으로 하전된 비드와 상호작용하고, 비드 픽업에 참여할 수 있는 결합 친화도를 가질 것이다. 임의로, 진공 공급원이 정전기적으로 하전된 비드 및 반대로 하전된 수지와 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 조합은 로봇으로 사용되어 단일 비드를 포획한 다음 이를 단일 웰 내로 방출시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서, 포획 요소, 예컨대 피펫은 단일 비드를 보유하기에 충분히 넓은 직경으로 크기조정될 수 있다. 피펫에는 하전된 비드에 반대로 하전된 정전기 다공성 수지가 피팅된다. 진공 공급원은 비드 공급원으로부터 비드의 회수를 보조하는 데 사용된다. 다수의 비드가 공급원으로부터 단일 피펫 내로 추출될 수 있다. 그러나, 단일 비드만이 수지와 접촉된다. 회수 후에, 진공은 부분 진공 압력까지 서서히 해제되고, 단일 비드와 수지 사이의 정전기적 상호작용은 그 비드를 보유하기에 충분한 반면, 피펫에 남아있는 비드는 비드 공급원 내로 다시 돌아가 단일 피펫에 단일 비드를 남긴다. 이 장치의 로봇공학은 단일 어레이로 다수의 피펫 세트를 포함할 수 있고, 이는 이어서 장치의 웰 상에 위치할 수 있다. 남아있는 부분 진공은 제거되고, 개별 비드는 개별 웰 내로 떨어진다.
대안적으로, 단일 비드를 보유하도록 크기조정된 복수의 공동을 갖는 분배기는, 각각의 공동이 검정 장치 상의 단일 웰과 정렬되고 검정 장치가 분배기 위 또는 아래에 존재하도록 설계된다. 분배기 상의 공동은 비드로 충전되고, 검정 장치는 분배기 위에 피팅되고, 각각의 공동이 단일 웰에 상응하도록 정렬된다. 분배기 및 검정 장치의 벽은 비드가 분배기 또는 검정 장치의 또 다른 부분으로 재배치될 수 없도록 각각의 공동과 각각의 웰 사이에 폐쇄 챔버를 형성한다. 분배기 아래에 놓이도록 검정 장치의 위치를 역전시키는 것은 단일 비드의 단일 웰 내로의 전달을 유발한다.
자기 분배기는 자기 비드와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 자기 분배기는 약한 자기력 또는 가역적 자기력을 배치시킬 수 있다. 약한 자기력의 경우, 자석이 피펫에 피팅된다. 진공 공급원을 자석과 합하여 비드를 피펫 내로 회수한다. 피펫은 다수의 비드를 보유할 가능성이 있지만, 이 중 하나만이 자석과 접촉한다. 진공 압력이 감소됨에 따라, 진공에 의해서만 보유된 비드는 비드 공급원 내로 다시 방출되어 단일 피펫에 단일 비드만을 남긴다. 비드를 검정 장치의 웰 내로 분배할 때, 진공은 제거되고, 남아있는 비드는 그 웰 내로 떨어진다.
하기 실시예는 다수의 웰을 갖는 검정 장치의 각각의 웰에 단일 비드를 제공하기 위한 장치 또는 시스템에 대한 예시적 실시양태를 제공한다. 웰당 단일 비드를 갖는 검정 장치는 본원에 기재된 임의의 검정에 사용될 수 있다.
실시예 12: 단일 비드를 (분배기의) 단일 공동 및/또는 (검정 장치의) 단일 웰 내로 분배하는 방법
예시적 실시양태에 따라 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하는 방법이 제공된다. 방법은 검정 장치의 적어도 1개의 웰과 정렬되도록 구성된 적어도 1개의 공동을 갖는 전달 장치를 제공하는 것으로 시작할 수 있다. 검정 장치 및 전달 분배기는 서로 피팅되거나 정합되도록 이동될 수 있다. 검정 장치 및 전달 분배기는 상기 검정 장치와 상기 전달 장치 사이에 갭이 존재하거나 또는 존재하지 않으면서 서로 피팅되거나 정합될 수 있다. 방법은 전달 분배기의 공동을 검정 장치의 웰과 정렬하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 봉쇄 공간을 형성하도록 검정 장치 및 전달 분배기를 서로 피팅하거나 정합시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 공동으로부터 상기 봉쇄 공간을 통해 단일 비드를 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 방법은 단일 비드를 상기 웰 내로 침착시키는 것을 포함할 수 있다. 방법의 임의의 단계를 반복할 수 있다. 방법은 상기 언급된 순서 내의 임의의 지점에서 시작 또는 종료할 수 있다.
실시예 13: 컴퓨터-구현 제어 시스템
도 38은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 프로세서 및 적어도 1개의 프로세서에 의한 실행을 위한 적어도 1개의 프로그램을 저장하는 메모리를 포함하는, 세포를 교란시키고 교란에 대한 세포의 반응을 포획하기 위한 컴퓨터 장치 또는 시스템의 개략적 다이어그램이다. 구체적으로, 도 38은 적어도 1개의 프로세서(3830) 및 적어도 1개의 프로세서(3830)에 의한 실행을 위한 적어도 1개의 프로그램(3850)을 저장하는 메모리(3840)를 포함하는 컴퓨터 장치 또는 시스템(3800)을 도시한다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 컴퓨터 시스템(3800)은 장치 또는 컴퓨터 시스템(3800)의 적어도 1개의 프로세서(3830)에 의한 실행을 위한 적어도 1개의 프로그램(3850)을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체(3860)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 컴퓨터 시스템(3800)은 외부 장치 (도시되지 않음), 적어도 1개의 프로세서(3830), 메모리(3840), 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체(3860) 및 적어도 1개의 출력 장치(3870) 중 어느 하나로 또는 그로부터 정보를 송신 또는 수신하도록 구성될 수 있는 적어도 1개의 입력 장치(3810)를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 1개의 입력 장치(3810)는 무선 통신 수단, 예컨대 안테나(3820), 송수신기 (도시되지 않음) 등을 통해 외부 장치로 또는 그로부터 정보를 무선 송신 또는 수신하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 장치 또는 컴퓨터 시스템(3800)은 외부 장치 (도시되지 않음), 적어도 1개의 입력 장치(3810), 적어도 1개의 프로세서(3830), 메모리(3840) 및 비-일시적 컴퓨터-판독가능 저장 매체(3860)로 이루어진 군으로부터의 어느 하나로 또는 그로부터의 정보를 송신 또는 수신하도록 구성될 수 있는 적어도 1개의 출력 장치(3870)를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 1개의 출력 장치(3870)는 무선 통신 수단, 예컨대 안테나(3880), 송수신기 (도시되지 않음) 등을 통해 외부 장치로 또는 그로부터 정보를 무선 송신 또는 수신하도록 구성될 수 있다.
일부 예시적 실시양태에서, 컴퓨터 장치 또는 시스템(3800)은 본원에 기재된 요소 중 1개 이상을 이동시키기 위한 명령을 1개 이상의 로봇 구성요소에 전송하도록 구성된다. 본 발명은 보조 또는 로봇 팔 또는 손으로 완전히 자동으로 실시될 수 있거나 또는 수동 및 로봇 접근법의 조합으로 실시될 수 있다.
상기 확인된 모듈 또는 프로그램 각각은 상기 기재된 기능을 수행하기 위한 명령의 세트에 상응한다. 이들 모듈 및 프로그램 (즉, 명령의 세트)은 개별 소프트웨어 프로그램, 절차 또는 모듈로서 구현될 필요가 없고, 따라서 이들 모듈의 다양한 하위세트는 다양한 실시양태에서 조합되거나 달리 재배열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 메모리는 상기 확인된 모듈 및 데이터 구조의 하위세트를 저장할 수 있다. 추가로, 메모리는 상기 기재되지 않은 추가의 모듈 및 데이터 구조를 저장할 수 있다.
본 개시내용의 예시된 측면은 또한 통신 네트워크를 통해 연결된 원격 처리 장치에 의해 특정 과제가 수행되는 분산 컴퓨팅 환경에서 실시될 수 있다. 분산 컴퓨팅 환경에서, 프로그램 모듈은 로컬 및 원격 메모리 저장 장치 둘 다에 위치할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 다양한 구성요소는 본 발명(들)의 실시양태를 구현하기 위해 적합한 값의 구성요소 및 회로 요소를 포함할 수 있는 전기 회로(들)를 포함할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 추가로, 많은 다양한 구성요소가 적어도 1개의 집적 회로 (IC) 칩 상에서 구현될 수 있는 것으로 인지될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 성분의 세트는 단일 IC 칩에서 구현될 수 있다. 다른 실시양태에서, 각각의 구성요소 중 적어도 1개는 개별 IC 칩 상에 제작 또는 구현된다.
실시예 14: 하위-공동을 갖는 공동
도 39는 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동 및 공동 내의 하위-구조를 갖는 분배기(3901)의 측면 횡단면도이다. 분배기(3901)는 비드 크기의 스펙트럼의 더 큰 단부에서 크기 배제를 용이하게 하도록 구성된다. 분배기(3901)는 상대적으로 더 큰 비드를 배제하도록 구성된다. 구체적으로, 분배기(3901)는 주 공동 및 하위-공동을 포함할 수 있다. 주 공동은 분배기(3901)의 상단 표면(3905) 내로 함요될 수 있다. 주 공동은 측벽(3910)을 가질 수 있다. 주 공동은 하단 바닥(3915)을 가질 수 있다. 하단 바닥(3915)은 그 안에 함볼된 하위-공동을 가질 수 있다. 하위-공동은 측벽(3920)에 의해 형성될 수 있고, 하위-공동 바닥(3925)을 가질 수 있다. 하위-공동은 단일 비드(10)를 수용하도록 구성될 수 있다. 분배기(3901)가 직선 에지로 도시되어 있지만, 에지는 만곡된 또는 모따기된 에지 등을 포함한 임의의 적합한 구조를 포함할 수 있다.
분배기(3901)의 공동 또는 하위-공동은 대략 피코미터의 직경을 갖는 개구부를 포함한 임의의 적합한 크기로 제공될 수 있다. 분배기(3901)는 단지 1개의 정확히-크기조정된 비드(10)가 각각의 하위-공동 내로 로딩 (포획)될 수 있도록 구성될 수 있다. 피코웰 내 포획되지 않은 비드는 난류에 의해 세척되어질 수 있다. 분배기(3901)는 도시된 바와 같이 사용될 수 있거나; 또는 분배기(3901)를 뒤집어 비드를 검정 장치로 전달할 수 있다.
실시예 15: 테이퍼형 공동
도 40은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동, 테이퍼형 측벽, 개방 상단 단부 및 개방 하단 단부를 갖는 분배기(4001)의 측면 횡단면도이다. 분배기(4001)는 원추 형상 공동을 포함할 수 있다. 원추 형상의 공동은 분배기(4001)의 상단 표면 상에 주로 입사되는 유체와의 난류에 의해 상대적으로 더 큰 비드를 거부하도록 구성될 수 있다. 분배기(4001)는 테이퍼형 공동을 포함할 수 있다. 테이퍼형 공동은 분배기(4001)의 상단 표면(4005) 내로 함요될 수 있다. 테이퍼형 공동은 측벽(4010)을 가질 수 있다. 테이퍼형 공동은 그의 하단에 개구부를 가질 수 있다. 개구부는 분배기(4001)의 하단 표면(4025) 내로 함요될 수 있다. 테이퍼형 공동은 테이퍼형 공동의 하부 부분의 더 작은 형상 대비 테이퍼형 공동의 상부 부분의 형상의 차이에 의해 단일 비드(10)를 수용하도록 구성될 수 있다. 분배기(4001)는 직선 에지 또는 비교적 날카로운 코너로 도시되어 있지만, 에지는 만곡된 또는 모따기된 에지 등을 포함한 임의의 적합한 구조를 포함할 수도 있다.
분배기(4001)의 테이퍼형 공동은 원추 형상을 가질 수 있다. 테이퍼형 공동은 대략 피코미터의 직경을 갖는 개구부를 포함한 임의의 적합한 크기로 제공될 수 있다.
분배기(4001)는 단지 1개의 정확히-크기조정된 비드가 테이퍼형 공동에 로딩 (보유)될 수도 있도록 구성될 수 있다. 분배기(4001)는 상대적으로 더 작은 비드가 분배기(4001)의 하단 표면(4025) 내의 개구부를 통과하도록 구성될 수 있다. 상대적으로 더 큰 비드는 세척되어질 수 있다. 분배기(4001)는 도시된 바와 같이 사용될 수 있거나; 또는 분배기(4001)를 뒤집어 비드를 검정 장치로 전달할 수 있다.
하나의 예시적 실시양태에서, 하단 표면(4025) 내의 개구부는 대신 단지 1개의 비드가 1개의 상응하는 공동에 피팅되면 바닥을 포함하도록 폐쇄될 수도 있다.
관련 미국 특허 출원 번호 16/774,871에 언급된 바와 같이, 예시적 실시양태에 따라 임의적인 갭이 제거될 수 있다. 구체적으로, 분배기는 비드를 공동으로부터 검정 장치의 웰로 전달하기 위해 검정 장치에 통합되거나 피팅될 수 있다. 분배기와 검정 장치의 정렬은 임의적인 잠금 메카니즘에 의해 용이해질 수 있다. 제자리에 잠길 때, 분배기 및 검정 장치는 서로에 대해 같은 높이일 필요는 없다. 갭이 비드 또는 다른 검정 성분보다 더 작은 한, 임의적인 갭이 존재할 수 있다. 피팅된 분배기 및 검정 장치는 분배기로부터의 비드 또는 다른 검정 성분을 검정 장치의 웰 내로 전달하기 위해 뒤집어질 수 있다.
전달 분배기 및 검정 장치의 서로에 대한 위치는 단일 검정 성분이 단일 웰에 침착되도록 하는 비드의 분배를 가능하게 한다. 구체적으로, 한 실시양태에서, 다수의 공동을 포함하는 분배기가 제공되며, 여기서 각각의 공동은 단지 단일 검정 성분, 예컨대 비드만을 가역적으로 보유/포획하도록 구성되고, 추가로 여기서 분배기는 다수의 웰을 포함하는 검정 장치에 피팅되거나 정합되도록 구성되어, 피팅될 때, 상기 분배기의 각각의 공동이 상기 검정 장치의 단일 웰과 정렬된다. 방출 시, 검정 성분은 단일 검정 성분이 단일 웰에 침착되도록 분배기로부터 검정 장치 내로 이동한다.
또한, 공동 및 웰의 정렬은 단일 비드가 단일 웰에 침착되는 것을 보장한다.
실시예 16: 자석을 갖는 공동
도 41은 예시적 실시양태에 따른 적어도 1개의 공동을 갖고 각각의 공동의 하단에 자석이 배치된 분배기(4101)의 측면 횡단면도이다. 분배기(4101)는 자석에 직접 입사되는 비드 상의 자기력이 비드를 보유하고 분배기(4101)의 상단 표면에 주로 입사되는 유체의 난류에 저항하기에 충분하도록 구성될 수 있다. 또한, 분배기(4101)는 자석 상에 직접 입사되는 비드의 상단 또는 그에 인접한 제2 비드 상의 자기력이 제2 비드를 보유하기에 불충분하여 분배기(4101)의 상단 표면 상에 주로 입사되는 유체의 난류에 의한 제2 비드의 제거를 촉진하도록 구성될 수 있다.
분배기(4101)는 주 공동을 포함할 수 있다. 주 공동은 분배기(4101)의 상단 표면(4105) 내로 함요될 수 있다. 주 공동은 측벽(4110)을 가질 수 있다. 주 공동은 하단 바닥(4115)을 가질 수 있다. 하단 바닥(4115)은 자석 또는 자기 표면(4120)을 포함할 수 있다. 자석 또는 자기 표면(4120)은 단일 비드(10)와 자기 결합을 형성하도록 구성될 수 있다. 분배기(4101)가 직선 에지로 도시되어 있지만, 에지는 만곡된 또는 모따기된 에지 등을 포함한 임의의 적합한 구조를 포함할 수 있다.
일부 예시적 실시양태에서, 자석 또는 자기 표면(4120)은 편평할 수 있다. 반면, 다른 예시적 실시양태에서, 자석 또는 자기 표면(4120)은 오목할 수 있으며 (도 41에 도시된 바와 같이), 이는 유리하게는 표면(4120)과 단일 비드(10) 사이의 접촉을 위한 표면적을 증가시킨다.
분배기(4101)는 각각의 공동의 하단에 비교적 작고 비교적 약한 자석을 갖는 공동을 포함할 수 있다. 공동은 대략 피코미터의 직경을 갖는 개구부를 포함한 임의의 적합한 크기로 제공될 수 있다. 각각의 비드(10)는 자기 비드일 수 있다. 분배기(4101)는 단지 1개의 비드가 자석(4120)에 의해 공동에 로딩 (보유)될 수 있도록 구성될 수 있다. 자석(4120)에 의해 보유되지 않거나 또는 비교적 작은 자기력에 적용되지 않은 비드는 세척되어질 수 있다. 분배기(4101)는 도시된 바와 같이 사용될 수 있거나; 또는 분배기(4101)를 뒤집어 비드를 검정 장치로 전달할 수 있다. 뒤집힌 상태에서, 중력 단독으로는 비드(10)를 제거하기에 충분하지 않은 경우, 비드(10)를 분배기(4101)로부터 제거하기 위해 비교적 온화한 진동 또는 다른 온화한 기계적 힘이 분배기(4101)에 부여될 수 있다.
실시예 17: 메쉬 삽입물을 갖는 피펫
도 42는 예시적 실시양태에 따른 분배기(4280) 및 임의적인 메쉬 삽입물(4255)을 갖는 피펫(4220)을 포함한 시스템(4200)의 측면 횡단면도이다. 피펫(4220)은 밸브 또는 펌핑 메카니즘을 피펫(4220)의 단부(4250)에 커플링시킬 수 있는 도관을 포함할 수 있다. 도관은 대향 단부에 2개의 개구부를 가질 수 있다. 단부에서의 형상은 실질적으로 원형을 포함한 임의의 적합한 형상일 수 있다. 도관은 단부(4250)를 갖는 감압 펌프의 밀봉된 경로를 제공하기 위해 일련의 튜브 및 커넥터를 포함할 수 있다. 도관의 직경은 시험 중인 가장 큰 비드(4290)의 직경보다 더 넓을 수 있다. 도관 및/또는 단부(4250)는 폴리비닐 클로라이드 (PVC), 투명 플라스틱, 타이곤, 플렉시글라스 및/또는 기타 등으로 제조될 수 있다. 도관 및/또는 단부(4250)는 강성, 반강성 또는 가요성일 수도 있다.
도관은 단일 비드를 재배치하도록 구성될 수 있다. 도관은 임의의 유형의 장치에 사용될 수 있다. 다양한 예시적 실시양태에서, 도관은 분배기의 공동에 비드를 배치하고/거나; 검정 장치의 웰에 비드를 배치하고/거나; 분배기의 공동으로부터 비드를 제거하고/거나; 검정 장치의 웰로부터 비드를 제거하도록 구성될 수 있다.
일부 예시적 실시양태에서, 도관 및/또는 단부(4250)는 중합체로부터 형성될 수 있다. 중합체는 굴곡 또는 좌굴에 저항하기에 충분히 강성이지만, 마이크로웰 플레이트를 포함한 기판과 접촉 시 구부러져 기판의 파괴를 피하기에 충분히 가요성인 폴리이미드일 수 있다. 도관 및/또는 단부(4250)가 폴리이미드로 형성되고 비교적 얇은, 즉, 대략 약 8 마이크로미터 두께의 벽 두께를 갖는 경우, 물질은 비교적 취성일 수 있다. 이와 같이, 폴리이미드 도관 및/또는 단부(4250)는 보호 물질, 예컨대 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE)과 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리이미드 도관 및/또는 단부(4250)가 약 45.0 cm 초과의 길이를 갖는 경우에, 폴리이미드 도관 및/또는 단부(4250)는 보호 물질, 예컨대 PTFE로 보호될 수 있다.
예시적 실시양태에서, 가요성 팁을 갖는 도관 및/또는 단부(4250)의 제공은 작업자가, 예를 들어 웰의 벽에 달라붙은 비드를 골라낼 수 있게 허용한다. 가요성 팁은 작업자가 웰의 반경을 통해 도관 및/또는 단부(4250)를 돌릴 수 있게 허용한다. 가요성 팁은 프로테아제와 같은 효소를 사용할 필요 없이 작업자가 비드를 골라낼 수 있게 한다는 점에서 가요성 팁은 매우 관대할 수 있다. 가요성 팁은 웰의 표면과 안정하게 접속하도록 구성될 수 있다. 일부 용도에서, 작업자는 벽에 가요성 팁을 밀어 웰의 벽에 달라붙은 비드를 추출할 수 있다. 개발된 기술의 비교적 강성 및 취성인 유리 피펫은 이러한 기능을 갖지 않는다.
폴리이미드는 단일 층, 유사한 물질의 다중 층 또는 비유사 물질의 다중 층을 포함한 임의의 적합한 구성으로 제공될 수 있다.
가요성 팁은 가요성 팁 내에 보유된 비드를 침착시킬 수 있다. 가요성 팁은 또 다른 장치에 보유된 비드를 회수 또는 추출할 수 있다.
일부 예시적 실시양태에서, 도관 및/또는 단부(4250)의 벽의 두께는 대략 약 8 내지 450 마이크로미터일 수 있다. 일부 예시적 실시양태에서, 도관 및/또는 단부(4250)는 보강재를 포함할 수 있다. 일부 예시적 실시양태에서, 도관 및/또는 단부(4250)는 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 예를 들어 테플론 (TEFLON)과 같은 코팅을 포함할 수 있지만; 이러한 코팅이 요구되는 것은 아니고, 바람직한 반투명 특성을 유지하기 위해 생략될 수도 있어, 도관 및/또는 단부(4250)의 내강의 가시화를 허용하고 검증을 용이하게 한다.
분배기(4280)는 복수의 공동(4285a, 4285b, 4285c ... 4285n)을 포함할 수 있다.
피펫(4220) 내의 내부 공간은 메쉬 층(4255)을 포함할 수 있다. 메쉬 층(4255)은 메쉬 필터일 수 있다. 또 다른 예에서, 층(4255)은 단지 단부(4250)의 제1 내부 벽으로부터 단부(4250)의 제2 내부 벽까지의 바일 수 있다.
메쉬 층(4255)은 피펫(4220)의 내부 공간에 신장된 메쉬 스크린일 수 있다. 메쉬 스크린은 작은 섬유, 플라스틱 막대, 금속 와이어 및/또는 기타로 제조될 수 있다. 층(4255)은 피펫(4220)의 내부 공간을 가로질러 연장되는 플레이트일 수 있다. 플레이트는 적어도 1개의 개구를 함유할 수 있으며, 이는 과량의 액체가 통과하게 허용할 수 있다.
비드는 피펫(4250)에 연결된 진공에 의해 피펫(4220)으로 골라내질 수 있다. 메쉬 삽입물(4255)은 비드가 피펫(4220)의 팁 내부에 보유되는 것을 보장할 수 있다. 즉, 비드를 위로 당기는 진공에 의해, 메쉬 삽입물(4255)은 피펫(4220) 내의 개구부 내의 정지부로서 기능할 수 있다. 비드를 전달하기 위해, 피펫(4220)의 팁이 검정 장치의 상단에 배치될 수 있다. 비드를 방출시키기 위해, 진공력을 해제할 수 있거나 또는 양압을 가하여 비드를 검정 장치 내로 이동시킬 수 있다.
사용 시에, 피펫(4220)은 1개 초과의 비드와 마주칠 수 있다. 피펫(4220)의 구성은 단일 비드(10)가 메쉬 삽입물(4255)에 의해 보유되도록 하는 것이다. 단일 비드(10)에 입사되는 정전기력은 피펫(4220)이 진공의 존재 또는 부재 하에 단일 비드(10)를 보유하게 허용할 수 있다. 자기력, 진공력 또는 중력의 조합이 피펫(4220) 내의 비드(10)를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 메쉬 삽입물(4255)은, 공기가 물질을 통해 유동할 수 있게 하는 가역적 자기 물질을 포함할 수 있다.
실시예 18: 가상 웰
물리적 웰 또는 공동 대신에, 가상 웰이 제공될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어 평면 표면으로 시작하여, 물 및/또는 시험 용액의 액적이 평면 표면 상에 첨가될 수 있다. 1개 이상의 비드를 함유하는 물 또는 시험 용액은 비드를 함유하지 않는 물 또는 시험 용액보다 상대적으로 더 무거울 것이다. 난류는 평면 표면으로부터 비교적 가벼운 (비드-무함유) 물 또는 용액을 제거하여 평면 표면 상에 비교적 무거운 (비드-함유) 물 또는 용액을 보유시키는 데 이용될 수 있다. 단위 부피당 물 또는 시험 용액에 배치된 적절한 크기 및 질량의 단일 비드의 중량은 공지되어 있기 때문에, 중량이 모니터링될 수 있다. 공정은 평면 표면이 각각의 가상 웰 위에 위치한 단일 비드를 가질 때까지, 필요에 따라, 수행, 검증 및 반복될 수 있다.
본 발명은 본 개시내용의 조성물, 시약, 방법, 시스템, 진단, 실험실 데이터 등에 의해 제한되지 않는다. 또한, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 바람직한 실시양태에 의해 제한되지 않을 것이다.
본원에 기재된 대상은 목적하는 구성에 따라 시스템, 장치, 방법 및/또는 물품으로 구현될 수 있다. 상기 설명에 제시된 실시양태는 본원에 기재된 대상과 일치하는 모든 실시양태를 나타내지는 않는다. 대신, 이들은 단지 기재된 대상과 관련된 측면과 일치하는 일부 예이다. 몇몇 변형이 상기에 상세히 기재되었지만, 다른 변형 또는 첨가가 가능하다. 특히, 본원에 제시된 것에 추가로 추가의 특색 및/또는 변형이 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 실시양태는 개시된 특색의 다양한 조합 및 하위조합 및/또는 상기 개시된 여러 추가의 특색의 조합 및 하위조합에 관한 것일 수 있다. 추가로, 첨부 도면에 도시되고/거나 본원에 기재된 논리 흐름은 바람직한 결과를 달성하기 위해 제시된 특정한 순서 또는 순차적 순서를 반드시 요구하지는 않는다. 다른 실시양태가 하기 청구범위의 범주 내에 있을 수 있다.
특히, 상기 기재된 구성요소, 장치, 회로, 시스템 등에 의해 수행되는 다양한 기능과 관련하여, 이러한 구성요소를 기재하는 데 사용된 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 청구된 대상의 본원에 예시된 예시적 측면에서 기능을 수행하는 개시된 구조와 구조적으로 동등하지 않더라도, 기재된 구성요소의 명시된 기능을 수행하는 임의의 구성요소 (예를 들어, 기능적 등가물)에 상응하는 것으로 의도된다. 이와 관련하여, 본 발명은 청구된 대상의 다양한 방법의 작용 및/또는 사건을 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 명령을 갖는 시스템뿐만 아니라 컴퓨터-판독가능 저장 매체를 포함한다는 것이 또한 인식될 것이다.
상기 언급된 시스템/회로/모듈은 여러 구성요소/블록 사이의 상호작용에 대해 기재되었다. 이러한 시스템/회로 및 구성요소/블록은 그러한 구성요소 또는 명시된 하위-구성요소, 명시된 구성요소 또는 하위-구성요소 중 일부 및/또는 추가의 구성요소를 포함할 수 있고, 상기의 다양한 순열 및 조합에 따른다는 것이 인지될 수 있다. 하위-구성요소는 또한 모 구성요소 내에 포함되기보다는 다른 구성요소에 통신가능하게 커플링된 구성요소로서 구현될 수 있다 (계층적). 추가적으로, 적어도 1개의 구성요소는 집합된 기능을 제공하는 단일 구성요소로 조합되거나 또는 여러 개별 하위-구성요소로 분할될 수 있고, 임의의 적어도 1개의 중간 층, 예컨대 관리 층은 통합된 기능을 제공하기 위해 이러한 하위-구성요소에 통신가능하게 커플링되도록 제공될 수 있다는 것이 주목될 것이다. 본원에 기재된 임의의 구성요소는 또한 본원에 구체적으로 기재되지 않았지만 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 적어도 1개의 다른 구성요소와 상호작용할 수 있다.
추가로, 본 발명의 특정한 특색이 여러 구현양태 중 단지 하나에 대해서만 개시되었을 수 있지만, 이러한 특색은 임의의 주어진 또는 특정한 적용에 대해 바람직하고 유리할 수 있는 다른 구현양태의 적어도 1개의 다른 특색과 조합될 수 있다. 추가로, 용어 "포함한다", "포함한", "갖는다", "함유한다", 그의 변형 및 다른 유사한 단어가 상세한 설명 또는 청구범위에서 사용되는 경우에, 이들 용어는 임의의 추가의 또는 다른 요소를 배제하지 않는 개방 전환 단어로서 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본 출원에 사용된 용어 "구성요소", "모듈", "시스템" 등은 일반적으로 컴퓨터-관련 엔티티, 하드웨어 (예를 들어, 회로), 하드웨어와 소프트웨어의 조합, 소프트웨어 또는 적어도 1개의 특정 기능을 갖는 작동 기계와 관련된 엔티티를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 구성요소는 프로세서 (예를 들어, 디지털 신호 프로세서) 상에서 실행되는 프로세스, 프로세서, 객체, 실행가능한 것, 실행 스레드, 프로그램 및/또는 컴퓨터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예시로서, 제어기 상에서 실행되는 애플리케이션과 제어기 둘 다는 구성요소일 수 있다. 적어도 1개의 구성요소는 프로세스 및/또는 실행 스레드 내에 존재할 수 있고, 구성요소는 1개의 컴퓨터 상에 국재화되고/거나 2개 이상의 컴퓨터 사이에 분산될 수 있다. 추가로, "장치"는 특수하게 설계된 하드웨어; 하드웨어가 특정 기능을 수행할 수 있게 하는 그에 대한 소프트웨어의 실행에 의해 특수화된 일반 하드웨어; 컴퓨터-판독가능 매체에 저장된 소프트웨어; 또는 그의 조합의 형태일 수 있다.
또한, 단어 "예" 또는 "예시적"은 예, 사례 또는 예시로서의 역할을 하는 것을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. "예시적"으로 본원에 기재된 임의의 측면 또는 설계는 다른 측면 또는 설계보다 바람직하거나 유리한 것으로 반드시 해석되어서는 안된다. 오히려, 단어 "예" 또는 "예시적"의 사용은 개념을 구체적인 방식으로 제시하는 것으로 의도된다. 본 출원에 사용된 용어 "또는"은 배타적 "또는"보다는 포함적 "또는"을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 달리 명시되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, "X는 A 또는 B를 사용한다"는 자연 포함적 순열 중 임의의 것을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, X가 A를 사용하거나; X가 B를 사용하거나; 또는 X가 A 및 B 둘 다를 사용하는 경우에, "X가 A 또는 B를 사용한다"가 상기 경우 중 임의의 것 하에 충족된다. 추가로, 본 출원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수형은, 달리 명시되거나 또는 문맥으로부터 단수 형태에 관한 것으로 명확하지 않는 한, 일반적으로 "1개 이상"을 의미하는 것으로 해석될 것이다.
컴퓨팅 장치는 전형적으로 컴퓨터-판독가능 저장 매체 및/또는 통신 매체를 포함할 수 있는 다양한 매체를 포함하며, 여기서 이들 두 용어는 본원에서 하기와 같이 서로 상이하게 사용된다. 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 컴퓨터에 의해 액세스될 수 있는 임의의 이용가능한 저장 매체일 수 있고, 전형적으로 비-일시적 성질을 가지며, 휘발성 및 비휘발성 매체, 제거가능한 및 비-제거가능한 매체 둘 다를 포함할 수 있다. 예로서 및 비제한적으로, 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 컴퓨터-판독가능 명령, 프로그램 모듈, 구조화된 데이터 또는 비구조화된 데이터와 같은 정보의 저장을 위한 임의의 방법 또는 기술과 관련하여 구현될 수 있다. 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 RAM, ROM, EEPROM, 플래쉬 메모리 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다목적 디스크 (DVD) 또는 다른 광학 디스크 저장 장치, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 장치 또는 다른 자기 저장 장치, 또는 목적하는 정보를 저장하는 데 사용될 수 있는 다른 유형 및/또는 비-일시적 매체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 컴퓨터-판독가능 저장 매체는 매체에 의해 저장된 정보에 대한 다양한 작업을 위해, 예를 들어 액세스 요청, 질의 또는 다른 데이터 검색 프로토콜을 통해 적어도 1개의 로컬 또는 원격 컴퓨팅 장치에 의해 액세스될 수 있다.
다른 한편으로, 통신 매체는 전형적으로 컴퓨터-판독가능 명령, 데이터 구조, 프로그램 모듈 또는 변조된 데이터 신호와 같은 일시적일 수 있는 데이터 신호, 예를 들어 반송파 또는 다른 수송 메카니즘에서의 다른 구조화된 또는 비구조화된 데이터를 구현하고, 임의의 정보 전달 또는 수송 매체를 포함한다. 용어 "변조된 데이터 신호" 또는 신호들은 적어도 1개의 신호에서 정보를 코딩하는 방식으로 설정되거나 변화된 특징 중 적어도 1개를 갖는 신호를 지칭한다. 예로서 및 비제한적으로, 통신 매체는 유선 네트워크 또는 직접-유선 연결과 같은 유선 매체, 및 음향, RF, 적외선 및 다른 무선 매체와 같은 무선 매체를 포함한다.
상기 기재된 예시적 시스템의 관점에서, 기재된 대상에 따라 구현될 수 있는 방법론은 다양한 도면의 흐름도를 참조하여 보다 잘 인지될 것이다. 설명의 간소화를 위해, 방법론은 일련의 행위로서 도시되고 기재된다. 그러나, 본 개시내용에 따른 행위는 다양한 순서로 및/또는 공동으로 및 본원에 제시되고 기재되지 않은 다른 행위와 함께 발생할 수 있다. 추가로, 개시된 대상에 따라 방법론을 구현하기 위해 모든 예시된 행위가 요구되지는 않을 수 있다. 추가로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 방법론이 대안적으로 상태 다이어그램 또는 사건을 통해 일련의 상호관련된 상태로 표현될 수 있다는 것을 이해하고 인지할 것이다. 추가적으로, 본 명세서에 개시된 방법론은 이러한 방법론을 컴퓨팅 장치로 수송 및 전달하는 것을 용이하게 하기 위해 제조 물품 상에 저장될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 본원에 사용된 용어 제조 물품은 임의의 컴퓨터-판독가능한 장치 또는 저장 매체로부터 접근가능한 컴퓨터 프로그램을 포괄하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며, 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은, 본 명세서에서 사용되는 경우에, 언급된 특색, 정수, 단계, 작동, 요소 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특색, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분 및/또는 그의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 1개 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
적어도 하나의 예시적 실시양태가 예시적 방법을 수행하기 위해 복수의 유닛을 사용하는 것으로 기재되지만, 예시적 방법은 또한 하나 또는 복수의 모듈에 의해 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 용어 "제1", "제2", "제3" 등의 사용은 임의의 순서를 기재하지 않고 다양한 구조, 치수 또는 작동을 확인하기 위해 제공되고, 구조, 치수 또는 작동은 문맥에 특정 순서가 명확하게 명시되지 않는 한 언급된 순서와 상이한 순서로 실행될 수 있다.
명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 본원에 사용된 바와 같은 근사치 언어는 관련된 기초 기능의 변화를 유발하지 않으면서 허용가능하게 달라질 수 있는 임의의 정량적 표현을 수식하는 데 적용될 수 있다. 따라서, 용어 또는 용어들, 예컨대 "약" 및 "실질적으로"에 의해 수식된 값은 명시된 정확한 값으로 제한되지 않을 것이다. 적어도 일부 경우에, 근사치 언어는 값을 측정하기 위한 기기의 정확도에 상응할 수 있다. 여기서 및 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 범위 한계는 조합되고/거나 상호교환될 수 있으며, 이러한 범위는 확인되고, 문맥 또는 언어가 달리 나타내지 않는 한 그 안에 함유된 모든 하위-범위를 포함한다.
구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "약"은 관련 기술분야에서의 정상 허용오차의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준 편차 내인 것으로 이해된다. "약"은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치는 용어 "약"에 의해 수식된다.
상기 설명 및 청구범위에서, "중 적어도 1개" 또는 "중 1개 이상"과 같은 어구에는 요소 또는 특색의 연결 목록이 이어질 수 있다. 용어 "및/또는"은 또한 2개 이상의 요소 또는 특색의 목록에 나타날 수 있다. 사용된 문맥에 의해 달리 암시적으로 또는 명백하게 모순되지 않는 한, 이러한 어구는 열거된 요소 또는 특색 중 임의의 것을 개별적으로 의미하거나 또는 언급된 요소 또는 특색 중 임의의 것을 다른 언급된 요소 또는 특색 중 임의의 것과 조합하여 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 어구 "A 및 B 중 적어도 1개"; "A 및 B 중 1개 이상"; 및 "A 및/또는 B"는 각각 "A 단독, B 단독 또는 A 및 B 함께"를 의미하는 것으로 의도된다. 유사한 해석이 또한 3개 이상의 항목을 포함하는 목록에 대해 의도된다. 예를 들어, 어구 "A, B 및 C 중 적어도 1개"; "A, B 및 C 중 1개 이상"; 및 "A, B 및/또는 C"는 각각 "A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께 또는 A 및 B 및 C 함께"를 의미하는 것으로 의도된다. 추가로, 상기 및 청구범위에서 용어 "에 기초한"의 사용은 언급되지 않은 특색 또는 요소가 또한 허용가능하도록 "에 적어도 부분적으로 기초한"을 의미하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Plexium, Inc. Vijayan, Kandaswamy Mahakalkar, Kapil Zhang, Yi Macconnell, Andrew Boyd Rokicki, Joseph Franklin Van Nguyen, Michael <120> OLIGONUCLEOTIDE ENCODED CHEMICAL LIBRARIES, RELATED SYSTEMS, DEVICES, AND METHODS FOR DETECTING, ANALYZING, QUANTIFYING, AND TESTING BIOLOGICS/GENETICS <130> 057698-514001WO <140> PCT/US2021/015550 <141> 2021-01-28 <150> US 16/774,871 <151> 2020-01-28 <150> US 16/870,809 <151> 2020-05-08 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 ctcacatccc attttcgctt tagt 24

Claims (32)

  1. 화학적 화합물을 세포 또는 세포 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이며, 이는
    각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있는 다수의 웰을 포함하는, 50,000개 초과의 웰을 포함하는 검정 장치,
    복수의 비드
    를 포함하고, 여기서 단일 비드는 단일 웰에의 배치에 적합하고, 여기서 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 상기 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능하도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결되고,
    상기 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함하고, 여기서 DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교하고, 여기서 DNA 바코드는 화합물을 확인하는 것인,
    화학적 화합물을 세포 또는 세포 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 장치를 추가로 포함하는 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 전달 장치가 로봇으로 또는 수동으로 또는 로봇 및 수동 공정의 조합으로 작동되는 것인 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 전달 장치가 자기 인력, 정전기 인력 또는 크기 및 중력에 기초한 공학 원리를 사용하여 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시키는 것인 시스템.
  5. 제2항에 있어서, 전달 장치가 단일 비드를 전송할 수 있는 적어도 1개의 피펫을 추가로 포함하고, 적어도 1개의 피펫이 가요성 팁을 포함하는 것인 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 피펫의 가요성 팁이 폴리이미드를 포함하는 것인 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 20% 이하로 연장되는 것인 시스템.
  8. 제5항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 10% 이하로 연장되는 것인 시스템.
  9. 조합 라이브러리의 검정에 포함되는 화합물에 의해 유도된 세포 내의 트랜스크립톰 변화를 확인하는 방법이며,
    a) 검정 어레이를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 검정 어레이는
    i) 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있고 각각의 웰이 적어도 1개의 관심 세포를 포함하는 복수의 웰을 포함하고, 50,000개 초과의 웰을 포함하고,
    ii) 복수의 비드 및 복수의 관능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    여기서 단일 비드로서 각각의 비드는 각각의 비드가 상기 조합 라이브러리로부터의 고유한 화합물을 포함하고 상기 라이브러리 내의 각각의 화합물이 잠재적 약물 후보로서 선택되도록 복수의 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 상기 관능화된 올리고뉴클레오티드는 고유한 화합물의 구조 또는 상기 고유한 화합물을 제조하는 데 사용된 합성 단계를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 부분 및 RNA 포획 요소를 포함하고, 여기서 단일 비드는 단일 웰에 배치되는 것인 단계;
    b) 세포를 각각의 국한된 부피에서 비드로부터 그 국한된 부피 내로 방출되는 화합물과 접촉시키고, 상기 접촉에 반응하여 세포에 의해 발현되는 RNA에서의 트랜스크립톰 변화를 생성하기에 충분한 기간 동안 상기 접촉을 유지하는 단계;
    c) 세포를 용해시키고 RNA를 상기 비드 상의 RNA 포획 요소와 접촉시킴으로써 각각의 웰에서 세포로부터 RNA를 포획하는 단계;
    d) 복수의 비드의 적어도 한 부분으로부터 포획된 RNA를 확인하고, 상기 포획된 RNA에서의 임의의 트랜스크립톰 변화를 평가하는 단계; 및
    e) 상기 트랜스크립톰 변화를 생성한 화합물의 구조를 확인하는 단계
    를 포함하는, 조합 라이브러리의 검정에 포함되는 화합물에 의해 유도된 세포 내의 트랜스크립톰 변화를 확인하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비드가 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 장치를 사용하여 상기 검정 어레이의 웰에 첨가되는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 전달 장치가 로봇으로 또는 수동으로 또는 로봇 및 수동 공정의 조합으로 작동되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 전달 장치가 자기 인력, 정전기 인력 또는 크기 및 중력에 기초한 공학 원리를 사용하여 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시키는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 전달 장치가 단일 비드를 전송할 수 있는 적어도 1개의 피펫을 추가로 포함하고, 적어도 1개의 피펫이 가요성 팁을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 피펫의 가요성 팁이 폴리이미드를 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 20% 이하로 연장되는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 10% 이하로 연장되는 것인 방법.
  17. 화학적 화합물을 세포 또는 세포 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템이며, 이는
    각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있는 다수의 웰을 포함하는 검정 장치,
    복수의 비드
    를 포함하고, 여기서 단일 비드는 단일 웰에의 배치에 적합하고, 여기서 각각의 비드는 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 상기 비드-결합된 화합물은 상기 화합물이 검정의 일부로서 측정가능한 용량 의존성 방식으로 상기 비드로부터 방출가능하도록 절단가능한 링커에 의해 비드에 공유 연결되고,
    상기 비드는 (i) 절단가능한 링커에 의해 또는 (ii) 비-절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 복수의 실질적으로 동일한 비드-결합된 DNA 바코드를 추가로 포함하고, 여기서 DNA 바코드가 절단가능한 링커에 의해 비드에 연결된 경우에, 그 절단가능한 링커는 비드-결합된 화합물을 비드에 연결하는 데 사용된 절단가능한 링커에 직교하고, 여기서 DNA 바코드는 화합물을 확인하고, 여기서 각각의 비드는 적어도 약 10,000개의 실질적으로 동일한 DNA 바코드를 포함하는 것인,
    화학적 화합물을 세포 또는 세포 성분의 생물학적 활성을 조정하는 그의 능력에 대해 스크리닝하기 위한 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 장치를 추가로 포함하는 시스템.
  19. 제17항에 있어서, 전달 장치가 로봇으로 또는 수동으로 또는 로봇 및 수동 공정의 조합으로 작동되는 것인 시스템.
  20. 제18항에 있어서, 전달 장치가 자기 인력, 정전기 인력 또는 크기 및 중력에 기초한 공학 원리를 사용하여 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시키는 것인 시스템.
  21. 제18항에 있어서, 전달 장치가 단일 비드를 전송할 수 있는 적어도 1개의 피펫을 추가로 포함하고, 적어도 1개의 피펫이 가요성 팁을 포함하는 것인 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 피펫의 가요성 팁이 폴리이미드를 포함하는 것인 시스템.
  23. 제21항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 20% 이하로 연장되는 것인 시스템.
  24. 제21항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 10% 이하로 연장되는 것인 시스템.
  25. 조합 라이브러리의 검정에 포함되는 화합물에 의해 유도된 세포 내의 트랜스크립톰 변화를 확인하는 방법이며,
    a) 검정 어레이를 생성하는 단계로서, 여기서 상기 검정 어레이는
    i) 각각의 웰이 다른 웰로부터 분리되어 있고 각각의 웰이 적어도 1개의 관심 세포를 포함하는 복수의 웰을 포함하고,
    ii) 복수의 비드 및 복수의 관능화된 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
    여기서 단일 비드로서 각각의 비드는 각각의 비드가 상기 조합 라이브러리로부터의 고유한 화합물을 포함하고 상기 라이브러리 내의 각각의 화합물이 잠재적 약물 후보로서 선택되도록 복수의 동일한 비드-결합된 화합물을 포함하고, 여기서 상기 관능화된 올리고뉴클레오티드는 고유한 화합물의 구조 또는 상기 고유한 화합물을 제조하는 데 사용된 합성 단계를 코딩하는 DNA 바코드 및 RNA 포획 요소를 포함하고, 여기서 단일 비드는 단일 웰에 배치되고, 여기서 DNA 바코드는 화합물을 확인하고, 여기서 각각의 비드는 적어도 약 10,000개의 실질적으로 동일한 DNA 바코드를 포함하는 것인 단계;
    b) 세포를 각각의 국한된 부피에서 비드로부터 그 국한된 부피 내로 방출되는 화합물과 접촉시키고, 상기 접촉에 반응하여 세포에 의해 발현되는 RNA에서의 트랜스크립톰 변화를 생성하기에 충분한 기간 동안 상기 접촉을 유지하는 단계;
    c) 세포를 용해시키고 RNA를 상기 비드 상의 RNA 포획 요소와 접촉시킴으로써 각각의 웰에서 세포로부터 RNA를 포획하는 단계;
    d) 복수의 비드의 적어도 한 부분으로부터 포획된 RNA를 확인하고, 상기 포획된 RNA에서의 임의의 트랜스크립톰 변화를 평가하는 단계; 및
    e) 상기 트랜스크립톰 변화를 생성한 화합물의 구조를 확인하는 단계
    를 포함하는, 조합 라이브러리의 검정에 포함되는 화합물에 의해 유도된 세포 내의 트랜스크립톰 변화를 확인하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 비드가 단일 비드를 단일 웰 내로 분배할 수 있는 전달 장치를 사용하여 상기 검정 어레이의 웰에 첨가되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 전달 장치가 로봇으로 또는 수동으로 또는 로봇 및 수동 공정의 조합으로 작동되는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 전달 장치가 자기 인력, 정전기 인력 또는 크기 및 중력에 기초한 공학 원리를 사용하여 단일 비드를 단일 웰 내로 침착시키는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 전달 장치가 단일 비드를 전송할 수 있는 적어도 1개의 피펫을 추가로 포함하고, 적어도 1개의 피펫이 가요성 팁을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 피펫의 가요성 팁이 폴리이미드를 포함하는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 20% 이하로 연장되는 것인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 가요성 팁이 피펫의 총 길이의 10% 이하로 연장되는 것인 방법.
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