JP2023512042A - オリゴヌクレオチドによってコードされた化学ライブラリー、関連するシステム、デバイス、ならびに生物物質／遺伝物質を検出、分析、定量、および試験する方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、共有結合で結合した化合物および共有結合で結合したＤＮＡバーコードを有するビーズ、ならびにそのようなビーズを使用する方法を提供する。ビーズは、実質的に同一の化合物の多くのコピーおよび実質的に同一のＤＮＡバーコードの多くのコピーを有する。化合物は１つまたは複数の化学モノマーからなり、ＤＮＡバーコードはバーコードモジュールの形態を取り、それぞれのモジュールは対応する化学モノマーに対応し、その特定を可能にする。核酸バーコードは、連結された構造または独立した構造を有し得る。化合物をビーズから切断するため、および放出された化合物の生物活性を評価するために、ビーズ結合核酸バーコードをシーケンシングする方法が提供される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年１月２８日に出願した同時係属の米国特許出願第１６／７７４，８７１号の一部継続出願であり、その利益および優先権を主張する。
本出願はまた、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０２０年５月８日に出願した同時係属の米国特許出願第１６／８７０，８０９号の一部継続出願であり、その利益および優先権を主張する。
開示の分野
本開示は、化合物のライブラリーを使用する高スループットスクリーニングに関し、化合物はビーズに結合しているか、ビーズの中に含まれており、それぞれのビーズは１種類の化合物の多数のコピーを含み、さらにビーズは、ビーズの中またはその上に含まれる化合物のアイデンティティー（identity）または合成履歴をコードするＤＮＡタグも含む。本開示はまた、化合物が担持されたビーズおよびアッセイ材料を含むピコウェルの中で実施される高スループットアッセイに関する。本開示はさらに、ビーズ結合化合物を放出し、その生物活性をスクリーニングすることに関する。概して本開示は、ビーズを化合物のデリバリー媒体として使用するアッセイおよびそのような化合物担持ビーズを創成する方法を意図している。
本開示は、それぞれの化合物が化学ライブラリーに属する１つまたは複数のモノマーからなっているビーズ結合化合物に関する。本開示はまた、ビーズ結合ＤＮＡバーコード、即ちそれぞれの核酸の配列が１つの特定の化学ライブラリーモノマーを意味するコード（遺伝子コードには関係ない）である核酸に関する。本開示はさらに、ビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物の生物活性をスクリーニングすることに関する。
本開示はまた一般に、細胞またはいくつかの細胞を用量制御した化合物で撹乱（perturbing）し、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の分析によって、細胞の状態における変化を解析する方法に関連する。本明細書で開示する方法は、高スループットスクリーニング、標的の発見、または診断、およびその他の同様の応用の目的のために、単一細胞レベルでまたは複数の細胞に適用することができる。
さらに本開示は、それぞれ細胞を撹乱し、その撹乱に対する細胞の応答を捕捉する、コンピュータで実行される方法、コンピュータで実行されるシステム、およびコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。
例えばスプリットアンドプールケミストリーを含むコンビナトリアルケミストリーは、大量の化合物を合成するために使用することができる。このようにして作製された化合物は医化学の分野に用途があり、化合物は種々の生化学活性についてスクリーニングすることができる。これらの活性には１つまたは複数のタンパク質に対する結合が含まれ、タンパク質はスクリーニング試験が実施される時点で既知である。あるいは、試験される化合物が結合するタンパク質は、結合事象が検出された後でのみ特定される。化合物は、既知のタンパク質を阻害または活性化する活性についてもスクリーニングすることができる（これは単に「結合」活性についてのスクリーニングではない）。あるいは、化合物は、スクリーニングの時点で分子標的が研究者には知られていない場合に、細胞機能を阻害または活性化する活性についてスクリーニングすることができる。
スプリットアンドプール法によって作製された化学物質の巨大なライブラリーに属する化合物等の化合物のスクリーニングは、数千個のマイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルのアレイによるスクリーニングを実施することによって容易にすることができる。さらに、ビーズによってそれぞれのピコウェルに異なる化合物を提供することにより、またそれぞれのビーズが同じ化合物の数百個のコピーを含み、同じビーズが、同じビーズに結合した化合物を特定するために使用できる「ＤＮＡバーコード」の数百個のコピーを含む場合に、スクリーニングを容易にすることができる。さらに、ビーズからの化合物の制御放出を可能にする切断性リンカーを使用することにより、また放出された化合物が同じピコウェル内での生化学アッセイまたは細胞に基づくアッセイのために使用される場合に、化合物のスクリーニングはさらに容易になる。
極めて小さな限定された体積、例えば液滴、ピコウェル、または微小流体環境の中で化合物をアッセイすることは、例えば必要なアッセイ試薬の量が少ないこと、したがってコンビナトリアルに生成された化合物に限定する必要がないことから、概して有益である。化合物をビーズ上に担持することができ、後に化合物がビーズから溶出することを可能にする任意の方法が、小さな限定された体積中でのアッセイにビーズ結合化合物をデリバリーするために使用され得る。核酸バーコードをビーズに付加することにより、ビーズ内に存在する化合物のアイデンティティーをアッセイ体積まで持ち込むことが可能になる。このようにして、マイクロタイタープレート内での化合物のロボット工学または空間的指標付けを必要とすることなく、極めて高いスループットのアッセイが実施できる。数百万～数十億個の化合物が１つの小さなバイアルの中に保持され、化合物のアイデンティティーは、それぞれの個別の化合物を含む同じビーズにタグ付けされる（ＤＮＡで）。
薬物発見のための一般的な方法は、目的の標的を選び、標的のタンパク質または酵素と化合物の大きなライブラリーとの相互作用をモニターすることを含む。多くの場合に、最初にヒットしたものの多数は身体に毒性があるか、体内の他のタンパク質と交差反応することが見出されており、標的に基づく選択は薬物スクリーニングには非効率な方法になっている。予め選択した標的を必要とすることも、疾患の生物学的な根拠が周知かつ理解されていることが必要であるので、固有の限界となっている。生命体全体について化合物をスクリーニングすることは困難であり、高価であり、極めてスループットが低い仕事である。
細胞に対する従来の表現型スクリーニングには、疾患状態の細胞のモデルを創成すること、細胞を種々の薬物ライブラリーと接触させること、および疾患の表現型が測定可能なアッセイによって補正されるか否かをモニターすることが含まれてきた。そのようなスクリーニング法は表現型スクリーニングと呼ばれている。それは、根底にある生物学的機序が当初は必ずしも理解されていないが、治癒的応答の指標となる測定可能な表現型の変化が、関係のある基準であると考えられるからである。種々のベースラインおよび疾患を有する細胞の状態を反映する膨大な数の細胞系および疾患モデルが、現在利用可能である。より多い数の化合物ライブラリーおよび生物学的薬物候補も利用可能である。表現型応答を探すための様々な細胞モデルと様々な薬物候補とを組み合わせた分かりやすいスクリーニング活動は技術的な限界を伴っている。それは、アッセイがマイクロタイタープレートフォーマットおよびイメージング手段に限られており、これらのいずれもスループットにおいて厳しく限定されているからである。
スループットの限界を克服する１つの方法は、薬物の発見のために高スループット単一細胞スクリーニングアプローチを採用することである（例えばHeath et al., Nat Rev Drug Discov. 15:204-216, 2016を参照）。これらのアプローチでは、単一細胞が分離されて、細胞のそれぞれについて個別のアッセイを実施することができる区画の中に単離される。例えば液滴カプセル化を使用する単一細胞のｍＲＮＡスクリーニングを介する遺伝子解析は、組合せ測定の中に隠された複雑な細部を明らかにする良く知られた方法である（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるMacosko et al., Cell 161:1202-1214, 2015およびZiegenhain et al., Mol Cell 65:631-643, 2017を参照されたい）。現在の最新技術の単一細胞解析プラットフォームによって、それらの転写状態に基づいて細胞を特徴付け、フィンガープリントを得るために単一細胞の分解能でｍＲＮＡ転写物を定量することが可能になった。このアプローチによって、対象から抽出されまたは実験で調製された組織試料の間の比較、ならびに単一細胞の転写およびしたがってタンパク質の発現状態の検討が可能になる。トランスクリプトームの配列決定およびプロファイリングによる単一細胞のｍＲＮＡの測定は、疾患の進行の間の細胞の家系的表現型のみならず、薬物の有効性、耐性、および治療標的の発見の分子機序を検討するための重要なアプローチである（例えばChu et al., Cell Biol and Toxicol 33:83-97, 2017、Wang, Cell Biol Toxicol 32:359-361, 2016、およびWang et al., Cell Biol Toxicol 33:423-427, 2017を参照されたい）。トランスクリプトームの細胞間変動によって証明された細胞間不均一性を明らかにするために、単一細胞ＲＮＡ配列決定の適用が使用されてきた。この細胞間不均一性は、薬物の有効性および特異性、転写の偶然性、トランスクリプトームの可塑性、ならびにゲノムの進化との関連性が極めて高い。ピコウェルにおけるカプセル化も実証されている（例えばGierahn et al., Nat Methods 14:395-398, 2017を参照されたい）。同様の単離方法を使用する単一細胞タンパク質測定も可能である（Butnik et al., BioRxiv, Jan. 2017、Su et al., Proteomics 17:3-4, 2017）。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃ１、１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓ、または１ＣｅｌｌＢｉＯシステム等の自動化プラットフォームの市販化バージョンを含む高スループットの単一細胞ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）法の急速な進歩にも関わらず、標的の不可知の高スループット薬物スクリーニングおよび標的の発見のための単一細胞ＲＮＡプロファイリングの応用は、様々な細胞に様々な薬物を効率的に分離することができる方法がないことによって制約されている。細胞または組織をウェルプレート内で様々な撹乱のもとにインキュベートし、続いて単一細胞の解析および転写物プロファイルの間の比較を行なうことは可能であるが、試験することができる薬物の数には、プレートの収容力による限界がある。さらに、単離においてそれぞれの試料からバーコードを付与したｍＲＮＡを調製し、次いで試料ごとに包括的なＲＮＡプロファイルを実施する必要があることも、主要な障害を創成している。
本明細書に記載したような大スケールのアッセイに伴う現在の課題の１つは、多くの場合に単一のウェル中に単一のビーズが必要であることである。これは典型的には９６ウェルプレートを採用した場合には問題ではないが、１００，０００ウェルを超えるアッセイデバイスを採用した場合には大きな問題になる。例えば、Vannら、米国特許出願公開第２００３／００２１７３４号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、単一のウェル中に単一のビーズを提供するように設計されたロボットのビーズ分配システムを開示しているが、この参考文献は実際上、２個以上のビーズがウェルに入ることがあり、ウェルの中に１つだけのビーズが含まれていることを目視で確認する必要があると述べている（Vannらの段落［０１３１］を参照）。
単一のビーズを単一のウェルに投入するビーズ分配デバイスを提供することが大スケールアッセイの必要な成分である場合に、それを提供する、細胞を撹乱し、その撹乱に対する細胞の応答を捕捉するためのシステム、デバイス、および方法の改善を本明細書に記載する。
簡単に述べると、本開示は、（ａ）それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有する複数のピコウェルを含み、上部アパチャーが床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在する、ピコウェルアレイプレート、ならびに（ｂ）実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードおよび実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含む、ピコウェル中に配置されたビーズを含む、化合物をスクリーニングするためのシステムを提供し、（ｃ）ビーズは、連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードの形態を取るビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、ＤＮＡバーコードが連結されたＤＮＡバーコードの形態を取る場合には、連結されたＤＮＡバーコードは（ｉ）クリック化学を使用するか、もしくは（ｉｉ）工程繰り返しサイクルを使用する方法によって作製され、工程繰り返しサイクルは部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードにハイブリダイズすることができるスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を使用することを含み、ハイブリダイゼーションは、スプリントオリゴ上のアニーリング部位および部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードにおける対応する相補的アニーリング部位によって媒介され、アニールされたスプリントオリゴは、部分的に作製されたＤＮＡバーコードを、ＤＮＡポリメラーゼを使用して延長するための鋳型として使用され、スプリントオリゴは部分的に作製されたＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含み、（ｄ）実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれ１つが１つまたは複数の化学ライブラリーモノマーを含み、それぞれのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールによって対応する化学ライブラリーモノマーが特定され、用語「化合物」は１つまたは複数の化学ライブラリーメンバーを含む完成された産生物を意味するために使用され、完成されたＤＮＡバーコードによって化合物が特定される。
マイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルの床面は平坦である必要はない。床面は、ガラス製試験管または金属製遠心分離管の底面のように曲面であってもよい。また床面は円錐形遠心分離管のように円錐形状であってもよい。床面は平坦であってよいが、ノッチ、例えばピコウェル中にある任意のビーズの底の近辺にあるアッセイ溶液または細胞培養溶液の運動を容易にするノッチを有してもよい。平坦床面の実施形態では、本システムおよび方法は平坦床面を必要とすることがある。
連結されたＤＮＡバーコードは、完全に有機化学の方法、例えばクリック化学によって作製することができる。また、オルソゴナルなＤＮＡバーコードは、完全に例えばクリック化学を含む有機化学の方法によって作製することができる。
それぞれのキャップが異なるピコウェルの開口部に合致することができ、それぞれのキャップがピコウェル内の流体の蒸発を最小化または防止することができ、それぞれがピコウェル内の流体の漏洩を最小化または防止することができる、複数のキャップをさらに含む、上記のシステムも提供される。
さらに、（ｉ）クリック化学と、スプリントオリゴを使用する工程繰り返しサイクルの両方、（ｉｉ）クリック化学と、クリック化学法ではない化学的方法の両方、（ｉｉｉ）クリック化学のみ、または（ｉｖ）スプリントオリゴを使用する工程繰り返しサイクルのみを使用する方法によって、連結されたＤＮＡバーコードが作製される上記のシステムが包含される。この特定の実施形態については、問題の「連結されたＤＮＡバーコード」には、核酸をビーズに直接連結するために使用されるいずれの化学的カプラーも含まれない。
球形キャップの実施形態では、それぞれのキャップが、アパチャーが円形であるピコウェルのアパチャーに適合することができ、それぞれのキャップがピコウェル内の流体の蒸発を最小化または防止することができ、それぞれのキャップがピコウェル内の流体の漏洩を最小化または防止することができる、複数の球状キャップをさらに含む、上記のシステムが提供される。
応答エレメントの実施形態では、少なくとも１つのピコウェルに配置された少なくとも１つのビーズが前記少なくとも１つのビーズに連結された少なくとも１つの応答捕捉エレメントを含む、上記のシステムが提供される。また、少なくとも１つのピコウェルに配置された少なくとも１つのビーズが前記少なくとも１つのビーズに連結された少なくとも１つの応答捕捉エレメントを含み、少なくとも１つの応答捕捉エレメントが（ａ）ポリ（ｄＴ）または（ｂ）エクソン標的ＲＮＡプローブを含む、上記のシステムが意図される。
ＤＮＡバーコードが連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードであり、ＤＮＡバーコードが１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれが化学ライブラリーモノマーを特定する情報をコードし、連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードが（ａ）１つまたは複数の機能性核酸および（ｂ）化学ライブラリーモノマーのアイデンティティー以外の型の情報をコードする１つまたは複数の核酸の一方または両方をさらに含む、上記のシステムも意図される。
以下は、「～のみからなる」実施形態および「～を含む」実施形態を開示する。これは、ＤＮＡバーコードを構成するビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールの数に適用される。ＤＮＡバーコードがただ１つのＤＮＡバーコードモジュール、もしくは２つだけのＤＮＡバーコードモジュールからなるか、または３つだけのＤＮＡバーコードモジュール、もしくは４つだけのＤＮＡバーコードモジュールを含むか、あるいはＤＮＡバーコードが少なくとも１つのＤＮＡバーコードモジュールを含むか、少なくとも２つのＤＮＡバーコードモジュールを含むか、少なくとも３つのＤＮＡバーコードモジュールを含むか、または少なくとも４つのＤＮＡバーコードモジュールを含むか、等々の実施形態が提供される。
ビーズ結合した連結されたＤＮＡバーコードが、（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、および第２のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第３のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、および第４のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｉｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、および第５のＤＮＡバーコードモジュール、または（ｖ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、第５のＤＮＡバーコードモジュール、第５のアニーリング部位、および第６のＤＮＡバーコードモジュールを含む、システムも包含される。
さらに、ＤＮＡ配列決定プライマーに結合することができるプライマー結合部位をさらに含み、前記プライマー結合部位が第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第５のＤＮＡバーコードモジュール、または第６のＤＮＡバーコードモジュールの１つまたは複数の配列決定を方向付けることができ、プライマー結合部位が第１のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、第２のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、第３のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、第４のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、第５のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、もしくは第６のＤＮＡバーコードモジュールの３プライムに位置するか、またはプライマー結合部位が第１と第２のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、または第２と第３のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、または第３と第４のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、または第４と第５のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、または第５と第６のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置する、上記のシステムが意図される。
さらに、プライマー結合部位が第１と第２のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、第２と第３のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、第３と第４のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、第４と第５のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置するか、または第５と第６のＤＮＡバーコードモジュールの間に位置する、上記のシステムが提供される。プライマー結合部位の位置に関する実施形態では、上流ＤＮＡバーコードモジュールに関し、また下流ＤＮＡバーコードモジュールに関して、プライマー結合部位が連続するＤＮＡバーコードモジュールのあらゆる対の間に位置している、上記のシステムが提供される。
さらに、ビーズがオルソゴナルなＤＮＡバーコードであるＤＮＡバーコードを含み、ビーズが外部表面を含み、オルソゴナルなＤＮＡバーコードが（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第１の位置でビーズに連結された第１の核酸、（ｂ）第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第２の位置でビーズに連結された第２の核酸、および（ｃ）第３のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第３の位置でビーズに連結された第３の核酸を含み、ビーズ上の第１、第２、および第３の位置がそれぞれビーズの外部表面の異なる位置に位置している、上記システムが提供される。
コーディングの実施形態では、ＤＮＡバーコードが、化学ライブラリーモノマーを特定しないが、その代わりに（ａ）切断可能にビーズに結合した化合物のクラス、（ｂ）有機合成の多工程経路における工程数、（ｃ）ビーズ結合化合物が合成された日付、（ｄ）ビーズ結合化合物が処置しようとしている疾患、（ｅ）ビーズ結合化合物が刺激または阻害しようとしている細胞事象、または（ｆ）所与の化学ライブラリーモノマーをビーズに連結するために用いた反応条件を特定する、１つまたは複数の核酸を含む、上記のシステムが提供される。
リンカーの実施形態では、実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されている、上記のシステムが提供される。実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれが光切断性リンカーによってビーズに連結されている、上記のシステムも提供される。実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれが非切断性リンカーによってビーズに連結されている、上記のシステムも提供される。
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）の実施形態では、少なくとも１つのビーズが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた低架橋のポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマーを含む、上記のシステムが提供される。
放出モニターの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのピコウェルが放出モニタービーズを含み、いずれの他の型のビーズをも含まず、
放出モニタービーズがビーズ結合クエンチャーおよびビーズ結合蛍光色素を含み、ビーズ結合クエンチャーがビーズ結合蛍光色素の直近に消光可能に位置してビーズ結合蛍光色素の蛍光の少なくとも５０％（または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％）を消光することができ、ビーズ結合蛍光色素が第１の光切断性リンカーによって結合されており、放出モニタービーズを含むピコウェルが第１のピコウェルであり、第１のピコウェルが第１の溶液を含み、第１のピコウェルを切断条件に曝露することによって光切断性リンカーを切断して蛍光色素を第１のピコウェルの第１の溶液中に放出することができ、曝露によって蛍光色素を第１のピコウェル中の第１の溶液全体に拡散させることができ、拡散した蛍光色素を含む第１の溶液を含む第１のピコウェルに光を照射することによって獲得される蛍光シグナルによって、使用者が蛍光シグナルを使用して放出モニタービーズからのビーズ結合蛍光色素の放出のパーセントを計算することができて計算された放出パーセントの値がもたらされ、第２のピコウェルが第１の光切断性リンカーと同じ型の光切断性リンカーと連結されたビーズ結合化合物を含み、第２のピコウェルが第２の溶液を含み、
第１のピコウェルにおける放出モニタービーズからの計算された放出パーセントの値によって、第２のピコウェルにおける第２の溶液中の放出された化合物の濃度の計算が可能になる、上記のシステムを提供する。
所与のビーズに結合した化合物の全てのアイデンティティーに関する、または所与のビーズに結合したＤＮＡバーコードの全てのアイデンティティーに関する実施形態では、少なくとも１つのビーズが実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、複数が実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードの１千万～１億個のコピーである、上記のシステムが提供される。少なくとも１つのビーズが実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、複数が実質的に同一のビーズ結合化合物の１千万～１億個のコピーである、上記のシステムも提供される。
細胞（例えば哺乳動物細胞、がん細胞、細菌細胞）に関する実施形態では、少なくとも１つのピコウェルが少なくとも１つの細胞を含み、実質的に同一の複数のビーズ結合化合物が切断性リンカーによって少なくとも１つのビーズに結合しており、切断性リンカーを切断することによってビーズからビーズ結合化合物が放出されて放出された化合物が産生され、放出された化合物が少なくとも１つの細胞と接触することができる、上記のシステムが提供される。細胞の他の実施形態では、少なくとも１つのピコウェルが少なくとも１つの細胞を含み、実質的に同一の複数のビーズ結合化合物が切断性リンカーによって少なくとも１つのビーズに結合しており、切断性リンカーの切断によってビーズからビーズ結合化合物が放出されて放出された化合物が産生され、放出された化合物が少なくとも１つの細胞と接触することができ、少なくとも１つの細胞が、（ｉ）がん細胞ではない哺乳動物細胞、（ｉｉ）哺乳動物のがん細胞、（ｉｉｉ）哺乳動物の死細胞、（ｉｖ）アポトーシス性哺乳動物細胞、（ｖ）壊死性哺乳動物細胞、（ｖｉ）細菌細胞、（ｖｉｉ）変形体細胞、（ｖｉｉ）代謝的に活性であるが架橋ゲノムを有し細胞分裂を受けることができない細胞、または（ｉｘ）ウイルスに感染した哺乳動物細胞である、上記のシステムが提供される。
デバイスの実施形態では、それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有し、上部アパチャーが床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、アパチャーが円形であり、床面が円形であり、壁が切断された円錐の形態を取っており、アパチャーが第１の直径を有し、床面が第２の直径を有し、第１の直径が第２の直径より大きい、上記のシステムが提供される。
他のデバイス関連実施形態では、それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有し、上部アパチャーが床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、アパチャーが円形であり、床面が円形であり、壁が切断された円錐の形態を取っており、アパチャーが第１の直径を有し、床面が第２の直径を有し、第１の直径が第２の直径より大きく、アパチャーにぴったりと適合するキャップをさらに含み、アパチャーがより大きなデュロメーターを有する（硬い）ポリマーからなっており、キャップがより小さなデュロメーターを有する（軟らかい）ポリマーから作られており、キャップとアパチャーの相対的なデュロメーターによってキャップがアパチャーに可逆的かつぴったりと適合し、キャップが、（ｉ）ピコウェルを閉塞して漏洩を防ぐことのみを意図しているキャップ、（ｉｉ）受動的キャップであって、細胞培地中の細胞がピコウェル中で培養される状況で細胞によって放出される代謝物を吸収することができるキャップ、（ｉｉｉ）能動的キャップであって、本質的に同一の複数の化合物を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の化合物のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されている、キャップ、（ｉｖ）能動的キャップであって、同一の複数の薬剤を含むビーズの形態を取るキャップであり、本質的に同一の複数の薬剤のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されている、上記のシステムが提供される。キャップが球状であるか、またはキャップが非球状である、上記のシステムも提供される。
マットの実施形態では、上記のシステムは、上部の一般に平坦な表面および複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートを含み、それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有し、上部アパチャーが壁によって床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、前記複数のピコウェルの少なくとも１つにビーズが配置されていてもよく、ビーズは実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードおよび実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、ピコウェルアレイプレートは、複数のピコウェルの少なくとも１つまたは全ての上部の開口を緊密に覆うことができるか、または複数のピコウェルの少なくとも１つまたは全ての上部の開口を実際上緊密に覆うことができるマットをさらに含み、緊密な覆いは可逆的であり、マットは、（ａ）ピコウェルアレイプレートの上部の一般に平坦な表面と接するように設けられた際に、複数のピコウェルの１つまたは複数に含まれ得る任意の代謝産物、生化学物質、またはタンパク質を吸収することができる吸収表面、および（ｂ）ピコウェルアレイプレートの上部の一般に平坦な表面への可逆的な付着を維持することができる付着性表面の１つまたは全てを含んでもよい。
生化学アッセイの実施形態では、実質的に同一の複数の化合物および実質的に同一の複数のバーコードを含むビーズを含む少なくとも１つのピコウェルを含み、少なくとも１つのピコウェルがセレブロンＥ３ユビキチンリガーゼおよびセレブロンＥ３ユビキチンリガーゼの基質、例えばＩｋａｒｏｓまたはＡｉｏｌｏｓを含むアッセイ媒体を含み、システムはセレブロンのＥ３ユビキチンリガーゼの活性を活性化する化合物をスクリーニングすることができ、したがってＩｋａｒｏｓまたはＡｉｏｌｏｓの細胞内濃度を低減することができる、上記のシステムが包含される。
別の生化学的アッセイの実施形態では、実質的に同一の複数の化合物および実質的に同一の複数のバーコードを含むビーズを含む少なくとも１つのピコウェルを含み、少なくとも１つのピコウェルがＭＤＭ２ Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびＭＤＭ２ Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質、例えばｐ５３を含むアッセイ媒体を含み、システムはＭＤＭ２のＥ３ユビキチンリガーゼ活性を活性化する化合物をスクリーニングすることができ、したがってｐ５３の細胞内濃度を増加させることができる、上記のシステムが意図される。
さらなるバーコードの実施形態では、ＤＮＡバーコードがいずれの化学モノマーもコードしないが、その代わりに（ａ）切断可能にビーズに結合した化合物のクラス、（ｂ）ビーズ結合核酸がビーズ結合化合物を作製するために使用される所与の化学モノマーに対応し、所与の化学モノマーに対応するビーズ結合核酸がその化学モノマーを特定する、有機合成の多工程経路における工程、（ｃ）ビーズ結合化合物が合成された日付、（ｄ）ビーズ結合化合物が処置しようとしている疾患、（ｅ）ビーズ結合化合物が刺激または阻害しようとしている細胞事象の１つまたは複数を特定する、１つまたは複数の核酸を含む、上記のシステムが提供される。
いずれのヘッドピースをも欠く実施形態では、少なくとも１つのビーズが実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、また実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み、ビーズ結合化合物のいずれかをビーズ結合ＤＮＡバーコードのいずれかに連結するヘッドピースが存在しない、上記のシステムが提供される。
さらに、実質的に同一のビーズ結合ＤＮＡバーコードの少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％が同一の構造を有する、上記のシステムが意図される。さらに、実質的に同一のビーズ結合化合物の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％が同一の構造を有する、上記のシステムが意図される。
さらに、連結されたＤＮＡバーコードがＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸を含む上記のシステム、または連結されたＤＮＡバーコードがＤＮＡバーコードモジュールであるただ１つの核酸を含む上記のシステムが供給される。
配列決定プライマーアニーリング部位の実施形態では、連結されたＤＮＡバーコードが、ＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸、および（ａ）配列決定プライマーのためのアニーリング部位として使用することができるか、（ｂ）配列決定プライマー、配列決定プライマーのためのアニーリング部位、および配列決定プライマーに対して５プライム、かつ配列決定プライマーのためのアニーリング部位に対して３プライムであるベンドをその中に含むヘアピン構造を形成することができるか、または（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、上記のシステムが提供される。
他の配列決定プライマーの実施形態では、オルソゴナルなＤＮＡバーコードが複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、ＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれが直接またはリンカーを介してビーズ上の異なる部位に連結され、複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれが、（ａ）配列決定プライマーのためのアニーリング部位として使用することができるか、（ｂ）配列決定プライマー、配列決定プライマーのためのアニーリング部位、および配列決定プライマーに対して５プライム、かつ配列決定プライマーのためのアニーリング部位に対して３プライムであるベンドをその中に含むヘアピン構造を形成することができるか、または（ｃ）スペーサー核酸である、少なくとも１つの機能性核酸を含む、上記のシステムが提供される。
スプリントオリゴに関する機能的表現を列挙する実施形態では、（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュールならびに３つの核酸、即ち第１のアニーリング部位にハイブリダイズする相補体である核酸、第２のＤＮＡバーコードモジュールにハイブリダイズする相補体である核酸、および第２のアニーリング部位である核酸を含む第１のスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）のための第１のアニーリング部位、ならびに（ｂ）第２のＤＮＡバーコードモジュールならびに３つの核酸、即ち第２のアニーリング部位にハイブリダイズする相補体である核酸、第３のＤＮＡバーコードモジュールである核酸、および第３のアニーリング部位である核酸を含む第２のスプリントオリゴのための第２のアニーリング部位を含む、連結されたＤＮＡバーコードを含むビーズが提供される。
スプリントオリゴに関する機能的表現を含む別の実施形態では、第３のＤＮＡバーコードモジュール、ならびに３種の核酸、即ち第３のアニーリング部位にハイブリダイズする相補体である核酸、第４のＤＮＡバーコードモジュールである核酸、および第４のアニーリング部位である核酸を含む第３のスプリントオリゴのための第３のアニーリング部位をさらに含む、上記のビーズが提供される。
さらに、スプリントオリゴに関する機能的表現を含むさらに別の実施形態では、（ｉ）第４のＤＮＡバーコードモジュール、ならびに第４のアニーリング部位にハイブリダイズする相補体である核酸、第５のＤＮＡバーコードモジュールである核酸、および第５のアニーリング部位である核酸を含む第４のスプリントオリゴのための第４のアニーリング部位、（ｉｉ）応答捕捉エレメント、（ｉｉｉ）放出モニターの１つまたは複数をさらに含む、上記のビーズが提供される。
リンカーの実施形態では、連結されたＤＮＡバーコードがビーズに連結されているが、（ｉ）いずれの光切断性リンカーによってもビーズに連結されていないか、（ｉｉ）いずれの酵素切断性リンカーによってもビーズに連結されていないか、または（ｉｉｉ）いずれの種類の切断性リンカーによってもビーズに連結されていない、上記のビーズが包含される。
区別できる連結位置に関する実施形態では、連結されたＤＮＡバーコードがビーズ上の第１の位置に連結され、ビーズがビーズ上の第２の位置に連結された化合物も含み、第１の位置が第２の位置と同じではない、上記のビーズが提供される。
表面（内表面および外表面）の実施形態では、ビーズが外表面および内表面を含み、ビーズがビーズに連結された少なくとも１０，０００個の実質的に同一の連結されたＤＮＡバーコードを含み、少なくとも１０，０００個の実質的に同一の連結されたＤＮＡバーコードの少なくとも９０％が外表面に連結されている、上記のビーズが提供される。
本開示を他の実施形態と区別することができる排他的な実施形態では、ポリアクリルアミドを何ら含まないビーズであって、連結されたＤＮＡバーコードが（ｉ）プロモーターである核酸を何ら含まないか、（ｉｉ）ポリＡである核酸を何ら含まないか、または（ｉｉｉ）プロモーターである核酸を何ら含まず、かつポリＡである核酸を何ら含まない、上記のビーズが提供される。
放出モニタービーズの実施形態では、本開示は、水性媒体中で機能することができる放出モニタービーズを供給し、放出モニタービーズはビーズ結合クエンチャーおよびビーズ結合蛍光色素を含み、ビーズ結合クエンチャーはビーズ結合蛍光色素の直近にクエンチ可能に位置してビーズ結合蛍光色素の蛍光の少なくとも５０％を消光することができ、ビーズ結合蛍光色素は第１の光切断性リンカーによって結合しており、放出モニタービーズを含むピコウェルは第１のピコウェルであり、第１のピコウェルは第１の溶液を含み、第１のピコウェルを切断条件に曝露することによって光切断性リンカーを切断して蛍光色素を第１のピコウェルの第１の溶液中に放出することができ、曝露することによって蛍光色素が第１のピコウェル中の第１の溶液全体に拡散し、拡散した蛍光色素を含む第１の溶液を含む第１のピコウェルに光を照射することによって取得される蛍光シグナルによって、使用者が蛍光シグナルを使用して放出モニタービーズからのビーズ結合蛍光色素の放出パーセントを計算して計算された放出パーセントの値を得ることができ、第２のピコウェルが第１の光切断性リンカーと同じ型の光切断性リンカーと連結されたビーズ結合化合物を含み、第２のピコウェルが第２の溶液を含み、第１のピコウェル中の放出モニタービーズからの計算された放出パーセントの値によって第２のピコウェルの第２の溶液中の放出された化合物の濃度の計算が可能になる。他の放出モニターの実施形態では、蛍光色素がＴＡＭＲＡであってクエンチャーがＱＳＹ７である放出モニタービーズ、図９に示す構造を有する放出モニタービーズ、図１０に示す構造を有する放出モニタービーズ、および消光能力が少なくとも９０％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％である放出モニタービーズが提供される。
製造の実施形態の方法では、放出モニタービーズを合成する方法であって、放出モニタービーズがビーズ、クエンチャー、蛍光色素、および蛍光色素をビーズに連結する光切断性リンカーを含み、本方法は、（ｉ）樹脂を準備すること、（ｉｉ）リシンリンカーを含む薬剤がＬ－Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（４－メチルトリチル）－ＯＨであるリシンリンカーを樹脂に連結すること、（ｉｉｉ）Ｆｍｏｃ保護基を除去すること、（ｉｖ）クエンチャーの供給源としてクエンチャー－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（クエンチャー－ＮＨＳ）である薬剤を使用してクエンチャーを連結すること、（ｖ）トリフルオロ酢酸を含む薬剤を使用して４－メチルトリチル保護基を除去すること、（ｖｉ）Ｆｍｏｃ－光切断性リンカー－ＯＨである薬剤によって提供される光切断性リンカーをリシンのイプシロンアミノ基に連結すること、（ｖｉｉ）蛍光色素を連結することをこの順に含む、方法が包含される。工程の順序に関係ない上記の実施形態も提供される。他の方法の実施形態では、蛍光色素がＴＡＭＲＡであってクエンチャーがＱＳＹ７である上記の方法が提供される。
放出モニタービーズの有用性に関する方法では、ピコウェル中に存在する溶液中の化合物の濃度を制御する方法であって、本方法はピコウェル中のビーズ結合化合物に適用され、ピコウェルが溶液を含み、ビーズ結合化合物が切断性リンカーによってビーズに連結されており、本方法は（ａ）切断性リンカーの切断を生じ、ビーズ結合化合物がビーズから放出されて放出された化合物を生成し、放出に続いて放出された化合物が溶液中で拡散または分散して溶液中で実質的に均一な化合物の濃度をもたらす条件にビーズ結合化合物を曝露することを含み、（ｂ）条件は切断性リンカーを切断することができる光を含み、（ｃ）条件は実質的に均一な濃度の所定の濃度を生じるように調整され、（ｄ）所定の濃度はビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度に関連して決定される、方法が提供される。条件が光の波長、光の強度、および光曝露の時間のうち１つまたは複数を調整することによって調整される上記の方法、ビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度がビーズ結合化合物をビーズから放出して放出された化合物を生成するのと同時に決定される上記の方法、およびビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度がビーズ結合化合物をビーズから放出して放出された化合物を生成する実質的に前に決定される上記の方法も提供される。
用語「決定された」は、ビーズを光に曝露する前に所望の濃度として予定し決定した濃度を意味し得る。また、用語「決定された」は、「リアルタイム」で決定された濃度、即ちビーズを光に曝露するのと同時に決定された濃度を意味し得る。
キャップの実施形態では、複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと組み合わせたキャップであって、キャップは複数のピコウェルを含むピコウェルプレートとともに使用することができ、複数のピコウェルのそれぞれはアパチャー、床面、および壁によって画定することができ、壁は上部のアパチャーおよび底部の床面によって画定され、アパチャーは円形であり、床面は円形であり、壁は切断された円錐の表面の形状を取っており、アパチャーは第１の直径を有し、床面は第２の直径を有し、第１の直径は第２の直径より大きく、
キャップはアパチャーにぴったりと適合することができる球状キャップであり、アパチャーはより大きなデュロメーターを有する（硬い）ポリマーからなっており、キャップはより小さなデュロメーターを有する（軟らかい）ポリマーから作られており、キャップとアパチャーの相対的なデュロメーターによって球状キャップがアパチャーに可逆的かつぴったりと適合することが可能であり、キャップは（ｉ）ピコウェルを閉塞して漏洩を防ぐことができ、（ｉｉ）細胞培地中の細胞がピコウェル中で培養される状況で細胞によって放出される代謝物を吸収することができる受動的キャップ、（ｉｉｉ）本質的に同一の複数の化合物を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の化合物のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されており、切断性リンカーの切断によって複数の化合物の少なくともいくらかがビーズから放出される、能動的キャップ、（ｉｖ）同一の複数の薬剤を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の薬剤のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されており、切断性リンカーの切断によって複数の薬剤の少なくともいくらかがビーズから放出される、能動的キャップである、キャップが包含される。
多孔質キャップの実施形態では、ピコウェルプレートおよび固体ポリマーコーティングと組み合わせた複数の多孔質キャップであって、複数の多孔質キャップのそれぞれが上表面および下表面を含み、ピコウェルプレートは複数のピコウェルを含み、少なくとも１つの多孔質キャップはピコウェルと接触してピコウェルに可逆的かつぴったりと適合し、ピコウェルプレートおよび複数の多孔質キャップの上表面のそれぞれは固体ポリマーコーティングによって覆われており、固体ポリマーコーティングはそれぞれのキャップの上表面の少なくともいくらかと接触して前記上表面の少なくともいくらかに接着して付着しており、（ｉ）複数のピコウェルのそれぞれは水溶液を保持することができ、溶液中で反応産生物が生成し、産生物の少なくともいくらかは複数の多孔質キャップのそれぞれの下表面によって吸収され、（ｉｉ）重合することができる重合性薬剤の溶液がピコウェルプレートと組み合わされた複数の多孔質キャップの上に注がれ、重合性薬剤が重合してピコウェルプレートの上表面の実質的に全てを被覆する実質的に平坦な表面を形成し、それにより、重合した薬剤が複数の多孔質キャップのそれぞれに固定され、（ｉｉｉ）複数の多孔質キャップの全てが剥離動作によって複数のピコウェルから除去可能であり、複数の多孔質キャップと重合した薬剤との間で接着が維持されて、重合した薬剤の中に埋め込まれたそれぞれのキャップの上表面および吸収された反応産物の分析のために接近可能であるそれぞれのキャップの下表面を部分的に有する接着性キャップのアレイがもたらされる、複数の多孔質キャップが提供される。
これにより、スプリントオリゴを使用してＤＮＡバーコードの酵素的合成を導くための製造の実施形態の方法が提供される。ビーズに結合した連結ＤＮＡバーコードを作製する方法であって、ビーズに結合した連結ＤＮＡバーコードが複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、１つまたは複数の機能性核酸を含んでもよく、化学ライブラリーモノマーのアイデンティティー以外の何かのアイデンティティーをコードする１つまたは複数のアイデンティティーコード核酸を含んでもよく、本方法は、（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュールおよび第１のアニーリング部位を含む連結されたポリヌクレオチドをビーズに付与する工程であって、第１のアニーリング部位が第１のスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）とハイブリダイズすることができ、第１のスプリントオリゴがハイブリダイズした第１のスプリントオリゴのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの、連結されたポリヌクレオチドへの重合を触媒するＤＮＡポリメラーゼの鋳型として働くことができ、重合の後のハイブリダイズした第１のスプリントオリゴのヌクレオチドに相補的な重合したヌクレオチドがビーズに結合した第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび第２のアニーリング部位を含む、工程、（ｂ）連結されたポリヌクレオチドを前記第１のスプリントオリゴとともに前記ビーズに付与し、前記第１のスプリントオリゴを前記連結されたポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を添加して、ＤＮＡポリメラーゼに前記ｄＮＴＰの連結されたポリヌクレオチドへの重合を触媒させる工程であって、連結されたポリヌクレオチドが３’自由端を有し、重合が３’自由端への重合である、工程、（ｄ）第１のスプリントオリゴを洗浄除去する工程を含む、方法が提供される。第１のスプリントオリゴが第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位を含む上記の方法も意図される。
製造の実施形態のさらなる方法では、第１のスプリントオリゴが第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第１の配列決定プライマーアニーリング部位をコードする核酸を含む上記の方法が提供され、第１の配列決定プライマーアニーリング部位は配列決定プライマーにハイブリダイズしてハイブリダイズした配列決定プライマーを生じることができ、ハイブリダイズした配列決定プライマーは第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび第１のＤＮＡバーコードモジュールの配列決定を方向付けることができる。
さらに、第１のスプリントオリゴ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを全て同時に添加する上記の方法、または第１のスプリントオリゴ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰをそれぞれ別のときに添加する上記の方法が意図される。
ビーズの内部と外部の位置に関しては、ビーズが外部位置と内部位置を含み、ビーズに結合した連結されたＤＮＡバーコードが実質的にビーズの外部である位置でビーズに連結され、ビーズの内部位置ではわずかに連結されており、ビーズはその全てが相互に比較して実質的に同一の構造を有する連結された複数の化合物をも含み、ビーズが実質的に疎水性ポリマーからなっている、上記の方法が提供される。
さらなる方法の実施形態では、（ａ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコード、および第２のアニーリング部位を含む連結された第１の長いポリヌクレオチドをビーズに付与する工程であって、第２のアニーリング部位が第２のスプリントオリゴとハイブリダイズすることができ、第２のスプリントオリゴがハイブリダイズした第２のスプリントオリゴのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの、連結された第１の長いポリヌクレオチドへの重合を触媒するＤＮＡポリメラーゼの鋳型として働くことができ、重合の後のハイブリダイズした第２のスプリントオリゴのヌクレオチドに相補的な重合したヌクレオチドがビーズに結合した第３のＤＮＡバーコードモジュールおよび第３のアニーリング部位を含む、工程、（ｂ）連結されたポリヌクレオチドを前記第２のスプリントオリゴとともに前記ビーズに付与し、前記第２のスプリントオリゴを前記連結された第１の長いポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を添加して、ＤＮＡポリメラーゼに前記ｄＮＴＰの連結された長いポリヌクレオチドへの重合を触媒させる工程であって、連結された長いポリヌクレオチドが３’自由端を有し、重合が３’自由端への重合である、工程、（ｄ）第２のスプリントオリゴを洗浄除去する工程をさらに含む、上記の方法が提供される。
これは、ＤＮＡバーコード全体の製造のための、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュール、等々の連続的な番号付けに関する。これはまた、ＤＮＡバーコード全体の製造における方法工程のサイクルの何回もの繰り返しに関する。前記複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれが数によって特定されまたは命名される上記の方法であって、本方法は列挙した工程を反復することをさらに含み、第１の反復についてはＤＮＡバーコードモジュールの名称は既存の名称に１つの数を加えることによって増加し、アニーリング部位の名称は既存の名称に１つの数を加えることによって増加し、スプリントオリゴの名称は既存の遠位末端ＤＮＡバーコードモジュールの名称に１つの数を加えることによって増加し、「第１の長いポリヌクレオチド」の名称は既存の名称に１つの数を加えることによって変化し、列挙した工程の反復は１回の反復、または２回の反復、または３回の反復、または４回の反復、または５回の反復、または５回を超える反復、または１０回を超える反復を含む、方法が提供される。
それぞれのスプリントオリゴが配列決定プライマーアニーリング部位を含む複数のスプリントオリゴを含み、配列決定プライマーアニーリング部位が配列決定プライマーとハイブリダイズしてハイブリダイズした配列決定プライマーをもたらすことができ、ハイブリダイズした配列決定プライマーが、少なくとも１つのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールおよび少なくとも１つのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールの配列決定を方向付けることができる、上記の方法も意図される。
これは、機能性核酸および種々の型の情報提供核酸を合成するようにＤＮＡポリメラーゼを導くスプリントオリゴに関する実施形態に関する。少なくとも１つのスプリントオリゴが機能性核酸を含むか、または少なくとも１つのスプリントオリゴが化学ライブラリーモノマーに関する情報以外の情報をコードする上記方法が提供される。少なくとも１つのＤＮＡバーコードモジュールをクリック化学によって連結する工程であって、スプリントオリゴを何ら使用しない工程をさらに含む上記の方法が提供される。
簡単に述べると、本開示は、（ａ）それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有する複数のピコウェルを含み、上部アパチャーが床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在する、ピコウェルアレイプレート、ならびに（ｂ）実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードおよび実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含む、少なくとも１つのピコウェル中に配置された少なくとも１つのビーズを含む、化合物をスクリーニングするためのシステムを提供し、（ｃ）少なくとも１つのビーズは、連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードの形態を取るＤＮＡバーコードを含み、ＤＮＡバーコードが連結されたＤＮＡバーコードの形態を取る場合には、連結されたＤＮＡバーコードは（ｉ）クリック化学を使用するか、もしくは（ｉｉ）工程繰り返しサイクルを使用する方法によって作製され、繰り返しサイクルにおける工程は部分的に作製されたＤＮＡバーコードにアニーリングするためにスプリントオリゴを使用することを含み、アニールされたスプリントオリゴは、部分的に作製されたＤＮＡバーコードを、ＤＮＡポリメラーゼを使用して延長するための鋳型として使用され、スプリントオリゴは部分的に作製されたＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含む。
別の態様では、ＤＮＡバーコードが（ａ）１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれが化学ライブラリーモノマーのアイデンティティーに関する情報をコードする１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、（ｂ）１つまたは複数の機能性核酸を含んでもよく、（ｃ）化学ライブラリーモノマーのアイデンティティーに関する情報以外の型の情報をコードする１つまたは複数の核酸を含んでもよい、上記のシステムが提供される。
さらに、それぞれが異なるピコウェルの開口に適合することができ、それぞれがピコウェル内の流体の蒸発を最小化または防止することができ、それぞれがピコウェル内の流体の漏洩を最小化または防止することができる複数のキャップをさらに含む、上記のシステムが提供される。
それぞれがピコウェルの円形のアパチャーに適合することができ、それぞれがピコウェル内の流体の蒸発を最小化または防止することができ、それぞれがピコウェル内の流体の漏洩を最小化または防止することができる複数の球状キャップをさらに含む、上記のシステムも包含される。
少なくとも１つのビーズが連結されたＤＮＡバーコードの形態を取るＤＮＡバーコードを含む場合に、連結されたＤＮＡバーコードが（ｉ）配列決定プライマー結合部位、（ｉｉ）第１のＤＮＡバーコードモジュール、（ｉｉｉ）第２のＤＮＡバーコードモジュールの酵素的合成を導くために使用することができる第１のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズすることができる第１のアニーリング部位、（ｉｖ）第２のＤＮＡバーコードモジュール、（ｖ）第３のＤＮＡバーコードの合成を導くために使用することができる第２のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズすることができる第２のアニーリング部位、（ｖｉ）第３のＤＮＡバーコードモジュール、（ｖｉｉ）第４のＤＮＡバーコードを合成するために使用することができる第３のオリゴヌクレオチドスプリントとハイブリダイズすることができる第３のアニーリング部位を含む、上記のシステムも意図される。
方法の実施形態では、所望の特性を有する化合物について化合物ライブラリーをスクリーニングする方法であって、（ａ）それぞれのビーズがビーズの表面に結合した複数のオリゴヌクレオチドおよびビーズの表面に結合した実質的に関連する複数の化合物を含み、ビーズに結合したオリゴヌクレオチドの配列がビーズの表面に結合した実質的に関連する複数の化合物の合成履歴をコードする、複数のビーズを準備すること、（ｂ）化合物ライブラリー中の化合物の所望の特性についてのアッセイに複数のビーズを組み込むこと、（ｃ）アッセイにおけるビーズ上の化合物の性能を反映するシグナルを少なくとも１つのビーズから捕捉すること、（ｄ）ビーズからオリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルが捕捉された少なくとも１つのビーズに結合した複数のオリゴヌクレオチドを配列決定すること、および（ｅ）工程（ｄ）の配列決定読み取りから少なくとも１つの化合物を特定し、これを工程（ｃ）のシグナルで捕捉された対応するアッセイ性能に関連付けることを含む、方法が提供される。
さらなる詳細では、アッセイが結合アッセイを含むか、またはアッセイが活性アッセイを含むか、またはアッセイが競合結合アッセイもしくは競合阻害アッセイを含むか、またはアッセイが束縛されていない化合物と他のアッセイ試薬との相互作用を含み、束縛されていない化合物がビーズの表面から放出される化合物であるか、もしくは化合物が化合物をビーズに連結している切断性リンカーを切断することによって放出されるか、またはアッセイが限定された複数の体積の中で行なわれ、限定された体積あたり名目上１個のビーズが分散している、上記の方法が包含される。
別の態様では、限定された体積が水滴を含むか、または
水滴が油媒体もしくは疎水性液体媒体の中に懸濁しているか、または限定された体積がピコウェルを含むか、またはピコウェルが規則的なアレイの中に組織化されているか、または複数の限定された体積が規則的なアレイの中に組織化されている、上記の方法がさらに意図される。
さらに、限定された体積がビーズの周囲の接着性水性媒体の層を含み、ビーズが疎水性媒体の中に懸濁している、上記の方法、およびオリゴヌクレオチドを配列決定する前にアッセイ試薬を洗浄除去する、上記の方法、およびアッセイ工程（ｂ）の前に配列決定工程（ｄ）を実施する上記の方法が、さらに包含される。配列決定工程の後であるがアッセイ工程の前でビーズ上のオリゴヌクレオチドを除去する上記の方法も、提供される。さらに、オリゴヌクレオチドの除去が酵素消化、化学的切断、熱分解、または物理的剪断を含む上記の方法、および結合アッセイがビーズへのＲＮＡ分子の結合を含む上記の方法、およびビーズからのシグナルが結合したＲＮＡ分子の配列決定を含む上記の方法が、さらに意図される。
さらに別の態様では、結合アッセイが蛍光標識した結合アッセイを含み、ビーズ上の化合物に結合する分子が蛍光色素を含む、上記の方法、または結合アッセイが核酸標識結合アッセイを含み、ビーズ上の化合物に結合する分子が核酸タグを含み、さらにアッセイからのシグナルがビーズ上の化合物に結合する分子に結合した核酸タグの配列決定を含む、上記の方法が提供される。
さらに特性に関連する方法の実施形態では、所望の特性が、（ｉ）酵素の触媒活性を阻害または刺激すること、（ｉｉ）細胞に基づくアッセイまたはインビボ（in vivo）アッセイによって測定できるＴｈ１型免疫応答を刺激すること、（ｉｉｉ）細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ２型免疫応答を刺激すること、（ｉｖ）細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ１型免疫応答を阻害すること、（ｖ）細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ２型免疫応答を阻害すること、（ｖｉ）精製されたタンパク質、細胞に基づくアッセイ、またはインビボアッセイによって測定できるタンパク質のユビキチン媒介分解を刺激または阻害すること、のうち１つまたは複数を含む、上記の方法が提供される。
システムの実施形態では、（ａ）化合物が結合し、オリゴヌクレオチドによってコードされた複数のビーズを受容する試料区画、（ｂ）それぞれのカプセル化区画がアッセイ媒体中に分散した単一のビーズを名目上含み、アッセイ媒体がさらにビーズ上の化合物との相互作用がアッセイされて測定可能なシグナルを生じる試薬を含む、試料区画内の複数のカプセル化区画、（ｃ）シグナルを測定するための検出器、（ｄ）配列決定プラットフォーム、および（ｅ）ユーザーからの１つまたは複数のコマンドを受容するユーザーインターフェースを含む、所望の活性を有する化合物について化合物ライブラリーをスクリーニングするためのシステムが提供される。カプセル化区画が液滴を含む上記のシステムも提供される。別の態様では、カプセル化区画がピコウェルを含むか、さらにカプセル化区画がアッセイ試薬を含むか、検出器が光学検出器を含むか、またはシーケンサーが光学検出器を含む、上記のシステムが提供される。
一態様では、本開示は、（ａ）核酸によってコードされる撹乱を準備し、細胞を核酸によってコードされる撹乱の中に閉じ込めること、（ｂ）細胞を限定された体積の中で核酸によってコードされる撹乱と接触させ、ここで撹乱の開始および用量が制御されること、（ｃ）細胞を核酸によってコードされる撹乱と特定した時間、インキュベートすること、および（ｄ）核酸によってコードされる撹乱をコードする核酸を細胞に移送すること、によって細胞を撹乱するための方法を特徴とする。
本態様の一部の実施形態では、核酸によってコードされる撹乱は、核酸によってコードされる化合物または薬物分子である。一部の実施形態では、核酸によってコードされる撹乱は、ＤＮＡによってコードされるライブラリーである。
一部の実施形態では、撹乱および撹乱をコードする核酸は、結合しておらず、溶液中で遊離している。一部の実施形態では、撹乱および撹乱をコードする核酸は、互いに結合している。一部の実施形態では、撹乱および撹乱をコードする核酸は、同じ基質に結合しているが、互いに結合していない。一部の実施形態では、基質への撹乱の結合および基質への核酸の結合は、切断可能な結合である。特定の実施形態では、切断可能な結合は、光切断性結合、温度切断性結合、ｐＨ感受性結合、酸切断性結合、塩基切断性結合、音響切断性結合、塩切断性結合、酸化還元感受性結合、または物理的切断性結合からなる群から選択される。
本開示のこの態様の一部の実施形態では、細胞および撹乱を閉じ込めることには、液滴カプセル化、エマルジョンカプセル化、ピコウェルカプセル化、マクロウェルカプセル化、物理的結合、気泡カプセル化、または微小流体閉じ込めが含まれる。
一部の実施形態では、撹乱の制御には、光曝露の制御、温度曝露の制御、ｐＨ曝露の制御、曝露時間の制御、音響曝露の制御、塩曝露の制御、化学的もしくは物理的な酸化還元電位の制御、または機械的撹拌への曝露の制御が含まれる。
特定の実施形態では、インキュベーションには、基質から撹乱を切断した後で、または基質から核酸を切断した後で、細胞を撹乱に曝露することが含まれる。一部の実施形態では、インキュベーションには、基質から撹乱を切断せずに、または撹乱から核酸を切断せずに、細胞を撹乱に曝露することが含まれる。
一部の実施形態では、核酸によってコードされる撹乱をコードする核酸を細胞に移送することには、核酸を細胞の細胞表面に結合することが含まれる。特定の実施形態では、核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸を細胞膜にインターカレートすることが含まれる。特定の実施形態では、核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸を細胞表面上の生体分子に結合することが含まれる。特定の実施形態では、生体分子はタンパク質または炭水化物である。他の実施形態では、核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸上の光学タグを通して結合することが含まれる。
別の態様では、本開示は、細胞を撹乱によって撹乱し、撹乱のアイデンティティーによって細胞をコードする方法を特徴とする。本方法には、（ａ）ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーを準備すること、（ｂ）細胞をビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーとともに閉じ込めることであって、ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーがコンビナトリアルに合成された化合物の１つまたは複数のコピーおよびコードする核酸タグの１つまたは複数のコピーを含み、化合物およびコードする核酸がビーズに結合しており、コードする核酸が化合物のアイデンティティーをコードし、ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーおよび細胞が限定する体積の中に閉じ込められる、こと、（ｃ）ビーズから化合物を放出し、限定する体積の中で化合物を細胞とともにインキュベートすること、（ｄ）コードする核酸タグをビーズから放出してもよいこと、および（ｅ）コードする核酸タグを細胞に結合し、それにより、細胞に結合したコードする核酸タグを通して化合物のアイデンティティーを保存することが含まれる。
さらに別の態様では、本開示は、細胞を撹乱し、撹乱のアイデンティティーによって細胞をコードし、撹乱に対する細胞の応答を測定する方法を特徴とする。本方法には、（ａ）第１の限定された体積の中で細胞をビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーと接触させることであって、ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーがコンビナトリアルに合成された化合物の１つまたは複数のコピーおよびコードする核酸タグの１つまたは複数のコピーを含み、化合物およびコードする核酸がビーズに結合しており、コードする核酸が化合物のアイデンティティーをコードする、こと、（ｂ）ビーズからライブラリー中の化合物を放出し、第１の限定された体積の中でライブラリー中の化合物を細胞とともにインキュベートすること、（ｃ）第１の限定された体積の中でコードする核酸タグをビーズから放出してもよいこと、（ｄ）コードする核酸タグを細胞の細胞表面に捕捉し、それにより、細胞がライブラリー中の化合物に曝露され、曝露された化合物のアイデンティティーが細胞表面上に捕捉されること、（ｅ）第１の限定する体積から細胞を放出することであって、コードする核酸タグが細胞に結合しており、コードする核酸タグが、細胞が曝露される化合物のアイデンティティーをコードする、こと、（ｆ）既に撹乱され核酸タグ付けされた細胞を第２の限定された体積の中で応答検出ビーズによって捕捉することであって、細胞が、細胞の細胞内容物を応答捕捉ビーズに曝露する細胞溶解条件に曝露され、応答捕捉ビーズが、細胞内容物および既に撹乱され核酸でタグ付けされた細胞における撹乱をコードする核酸タグを捕捉する捕捉用プローブを含む、こと、（ｇ）第２の限定する体積の中で応答捕捉ビーズを溶解した細胞とともにインキュベートし、それにより、細胞内容物と撹乱をコードする核酸タグの両方を応答捕捉ビーズ上に捕捉すること、（ｈ）撹乱に対する細胞の応答を核酸シグナルに変換してもよいことであって、撹乱に対する細胞の応答が核酸シグナルではない、こと、および（ｉ）応答捕捉ビーズに結合した核酸タグを配列決定し、それにより、撹乱のアイデンティティーを撹乱に対する細胞の応答と相関させることが含まれる。
さらに別の態様では、本開示は、（ａ）ピコウェルのアレイおよび機能化撹乱ビーズのライブラリーを準備することであって、ピコウェルが単一の細胞および単一の機能化撹乱ビーズを収容することができ、それぞれの機能化撹乱ビーズが実質的に同一の放出可能な異なる複数の化合物および化合物をコードする複数のヌクレオチドバーコードを含み、ヌクレオチドバーコードが細胞の細胞内容物を捕捉することができる機能化バーコードであり、細胞の細胞内容物が機能化撹乱ビーズに含まれる撹乱に対する細胞応答を含む、こと、（ｂ）単一の細胞をピコウェルアレイのそれぞれのピコウェル内に捕捉すること、（ｃ）単一の機能化撹乱ビーズを、単一の細胞を含むピコウェルに捕捉すること、（ｄ）機能化撹乱ビーズから化合物を放出し、放出された化合物と細胞をインキュベートすることであって、ピコウェルの間の化合物の拡散が最小である、こと、（ｅ）細胞を溶解して細胞内容物を放出すること、（ｆ）細胞内容物の１つまたは複数の成分を機能化撹乱ビーズ上の機能化オリゴヌクレオチドに捕捉することであって、捕捉することがヌクレオチドバーコードと細胞内容物の核酸エレメントとを組み合わせるハイブリダイゼーションおよび酵素的延長を含み、それにより、ヌクレオチドバーコードと細胞内容物の核酸エレメントとのハイブリッドが形成される、こと、および（ｇ）ハイブリッドを放出し、機能化撹乱ビーズのライブラリーからハイブリッドを収集し、ハイブリッドを配列決定して、それにより、撹乱を撹乱に対する細胞応答と関連付けることによる、細胞を撹乱し、撹乱に対する細胞の応答を捕捉する方法を特徴とする。
化合物をスクリーニングするためのシステムが提供される。可能な実施形態には下記が含まれる。
システムは、それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有し、上部アパチャーが床面から壁によって分離されている、複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートを含み得る。壁は上部アパチャーと床面との間に存在する。
システムは、ピコウェル中に配置された単一のビーズを含み得る。ビーズはビーズに結合した実質的に同一の複数のＤＮＡバーコードおよびビーズに結合した実質的に同一の複数の化合物を含む。
ビーズは、連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードの形態を取るビーズ結合ＤＮＡバーコードを含み得る。ＤＮＡバーコードが連結されたＤＮＡバーコードの形態を取る場合には、連結されたＤＮＡバーコードは、クリック化学または工程繰り返しサイクルの一方または両方を使用する方法によって作製される。
工程繰り返しサイクルは、部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードにハイブリダイズすることができるスプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を使用することを含み得る。ハイブリダイゼーションは、スプリントオリゴ上のアニーリング部位および部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードにおける対応する相補的アニーリング部位によって媒介される。
アニールされたスプリントオリゴは、部分的に作製されたＤＮＡバーコードを、ＤＮＡポリメラーゼを使用して延長するための鋳型として使用され得る。スプリントオリゴは、部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードに重合されるＤＮＡバーコードモジュールに相補的な塩基を含む。スプリントオリゴは、部分的に作製されたビーズ結合ＤＮＡバーコードに重合されるアニーリング部位に相補的な塩基も含む。
実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれ１つは１つまたは複数の化学ライブラリーモノマーを含み、それぞれのビーズ結合ＤＮＡバーコードモジュールによって対応する化学ライブラリーモノマーが特定され、用語「化合物」は１つまたは複数の化学ライブラリーメンバーを含む完成された産生物を意味するために使用される。完成されたＤＮＡバーコードによって化合物が特定される。
システムは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードに含まれる１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールの配列決定を導くことができるオリゴヌクレオチド配列決定プライマーをさらに含んでよく、システムはＤＮＡ配列決定装置を含んでもよく、ＤＮＡ配列決定装置は発光に基づくシーケンサーではなく、ｐＨに基づくＤＮＡ配列決定装置ではない。
システムは複数の球状キャップをさらに含んでよく、それぞれのキャップはピコウェルの円形のアパチャーに合致することができ、それぞれのキャップはピコウェル内の流体の蒸発を最小化または防止することができ、それぞれのキャップはピコウェル内の流体の漏洩を最小化または防止することができる。
少なくとも１つのピコウェルの中に配置された少なくとも１つのビーズは、前記少なくとも１つのビーズに連結された少なくとも１つの応答捕捉エレメントを含む。
ピコウェルの中に配置されたビーズの少なくとも１つは、前記少なくとも１つのビーズに連結された少なくとも１つの応答捕捉エレメントを含む。少なくとも１つの応答捕捉エレメントは、ポリ（ｄＴ）、エクソンを標的とするＲＮＡプローブ、抗体、またはアプタマーを含む。
ＤＮＡバーコードは、連結されたＤＮＡバーコード、またはオルソゴナルなＤＮＡバーコードである。ＤＮＡバーコードは、１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールを含む。１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれは、化学ライブラリーモノマーを特定する情報をコードしている。連結されたＤＮＡバーコードまたはオルソゴナルなＤＮＡバーコードは、１つもしくは複数の機能性核酸および化学ライブラリーモノマーのアイデンティティー以外の型の情報をコードする１つもしくは複数の核酸の一方または両方をさらに含む。
ビーズに結合した連結されたＤＮＡバーコードは、第１のＤＮＡバーコードモジュール、または第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、および第２のＤＮＡバーコードモジュール、または第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、および第３のＤＮＡバーコードモジュール、または第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、および第４のＤＮＡバーコードモジュール、または第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、および第５のＤＮＡバーコードモジュール、または第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第４のアニーリング部位、第５のＤＮＡバーコードモジュール、第５のアニーリング部位、および第６のＤＮＡバーコードモジュールを含む。
ビーズはオルソゴナルなＤＮＡバーコードであるＤＮＡバーコードを含み、ビーズは外部表面を含む。オルソゴナルなＤＮＡバーコードは、第１のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第１の位置でビーズに連結された第１の核酸、第２のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第２の位置でビーズに連結された第２の核酸、第３のＤＮＡバーコードモジュールおよび配列決定プライマーのためのアニーリング部位を含み、第３の位置でビーズに連結された第３の核酸を含み、ビーズ上の第１、第２、および第３の位置は、それぞれビーズの外部表面の異なる位置に位置している。
連結されたＤＮＡバーコードは、クリック化学およびスプリントオリゴを使用する工程繰り返しサイクルの両方、クリック化学およびクリック化学法ではない化学的方法の両方、クリック化学のみ、またはスプリントオリゴを使用する工程繰り返しサイクルのみを使用する方法によって、作製される。
実質的に同一の複数のビーズ結合化合物のそれぞれは、切断性リンカーによって、または光切断性リンカーである切断性リンカーによって、または非切断性リンカーによって、ビーズに連結される。
少なくとも１つのビーズは、その上にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた低架橋のポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマーを含む。
少なくとも１つのピコウェルは、少なくとも１つの細胞を含む。
実質的に同一の複数のビーズ結合化合物は、切断性リンカーによって少なくとも１つのビーズに結合しており、切断性リンカーを切断することによって、ビーズ結合化合物がビーズから放出されて放出された化合物が産生される。
放出された化合物は、少なくとも１つの細胞と接触することができる。少なくとも１つの細胞は、がん細胞ではない哺乳動物細胞、哺乳動物のがん細胞、哺乳動物の死細胞、アポトーシス性哺乳動物細胞、壊死性哺乳動物細胞、細菌細胞、変形体細胞、代謝的に活性であるが架橋ゲノムを有し細胞分裂を受けることができない細胞、またはウイルスに感染した哺乳動物細胞である。
それぞれのピコウェルは、ピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有し、上部アパチャーは床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、アパチャーは円形である。床面は円形である。壁は切断された円錐の形態を取っている。アパチャーは第１の直径を有し、床面は第２の直径を有する。第１の直径は第２の直径より大きい。
それぞれのピコウェルは、ピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有する。上部アパチャーは床面から分離されており、上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、アパチャーは円形である。床面は円形である。壁は切断された円錐の形態を取っている。アパチャーは第１の直径を有し、床面は第２の直径を有する。第１の直径は第２の直径より大きい。
キャップは、アパチャーにぴったりと適合する。アパチャーはより大きなデュロメーターを有する（硬い）ポリマーからなっている。キャップはより小さなデュロメーターを有する（軟らかい）ポリマーから作られている。キャップとアパチャーの相対的なデュロメーターによってキャップがアパチャーに可逆的かつぴったりと適合する。
キャップは、ピコウェルを閉塞して漏洩を防ぐことのみを意図しているキャップ、受動的キャップであって、細胞培地中の細胞がピコウェル中で培養される状況で細胞によって放出される代謝物を吸収することができるキャップ、能動的キャップであって、本質的に同一の複数の化合物を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の化合物のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されている、キャップ、能動的キャップであって、同一の複数の薬剤を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の薬剤のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されている、キャップである。
システムは、少なくとも１つの球状キャップを含んでよい。
システムは、少なくとも１つの非球状キャップを含んでよい。
ＤＮＡバーコードは、いずれの化学モノマーもコードしないが、その代わりに、切断可能にビーズに結合した化合物のクラス、および有機合成の多工程経路における工程の１つまたは複数を特定する１つまたは複数の核酸を含み、ビーズ結合核酸は、ビーズ結合化合物を作製するために使用する所与の化学モノマーに対応する。所与の化学モノマーに対応するビーズ結合核酸は、その化学モノマー、ビーズ結合化合物が合成された日付、ビーズ結合化合物が処置しようとしている疾患、ビーズ結合化合物が刺激または阻害しようとしている細胞事象、または所与の化学ライブラリーモノマーをビーズに連結するために用いた反応条件を特定する。
ビーズ結合化合物のいずれかをビーズ結合ＤＮＡバーコードのいずれかに連結するヘッドピースは存在しない。
連結されたＤＮＡバーコードは、ＤＮＡバーコードモジュールである少なくとも１つの核酸を含み、配列決定プライマーのためのアニーリング部位として使用することができる少なくとも１つの機能性核酸は、ヘアピン構造を形成することができる。ヘアピン構造は、配列決定プライマー、配列決定プライマーのためのアニーリング部位、およびヘアピン構造におけるベンドを含み、ベンドは配列決定プライマーに対して５プライム、配列決定プライマーのためのアニーリング部位に対して３プライムであるか、またはスペーサー核酸である。
オルソゴナルなＤＮＡバーコードは複数のＤＮＡバーコードモジュールを含み、ＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれはビーズ上の異なる部位に直接またはリンカーを介して連結されており、複数のＤＮＡバーコードモジュールのそれぞれは、配列決定プライマーのためのアニーリング部位として使用することができ、ヘアピン構造を形成することができる少なくとも１つの機能性核酸を含む。ヘアピン構造は、配列決定プライマー、配列決定プライマーのためのアニーリング部位、およびヘアピン構造におけるベンドを含む。ベンドは配列決定プライマーに対して５プライム、配列決定プライマーのためのアニーリング部位に対して３プライムであるか、またはスペーサー核酸である。
ピコウェル中に存在する溶液中の化合物の濃度を制御する方法。本方法は、ピコウェル中のビーズ結合化合物に適用される。ピコウェルは溶液を含む。ビーズ結合化合物は切断性リンカーによってビーズに連結される。本方法は、切断性リンカーの切断を生じる条件にビーズ結合化合物を曝露する工程を含み得る。条件には、切断性リンカーを切断することができる光が含まれる。
本方法は、ビーズ結合化合物がビーズから放出されて放出された化合物を生成し、放出に続いて放出された化合物が溶液中で拡散または分散して溶液中で実質的に均一な化合物の濃度をもたらす工程を含み得る。
本方法は、実質的に均一な濃度の所定の濃度を生じるために条件を調整する工程を含み得る。所定の濃度は、ビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度に関連して決定される。
条件は、光の波長、光の強度、および光曝露の時間のうち１つまたは複数を調整することによって調整され、ビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度は、ビーズ結合化合物をビーズから放出して放出された化合物を生成するのと同時に決定してもよく、またはビーズ結合放出モニターから放出される放出された蛍光色素の濃度は、ビーズ結合化合物をビーズから放出して放出された化合物を生成するよりも実質的に前の時点で決定してもよい。
複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと組み合わせたキャップ。キャップは、前記ピコウェルプレートとともに使用することができる。
複数のピコウェルのそれぞれは、アパチャー、床面、および壁によって画定できる。壁は、上部のアパチャーおよび底部の床面によって画定される。アパチャーは円形である。床面は円形である。壁は切断された円錐の表面の形状を取っており、アパチャーは第１の直径を有し、床面は第２の直径を有する。第１の直径は第２の直径より大きい。キャップはアパチャーにぴったりと適合することができる球状キャップである。アパチャーはより大きなデュロメーターを有する（硬い）ポリマーからなっている。キャップはより小さなデュロメーターを有する（軟らかい）ポリマーから作られている。キャップとアパチャーの相対的なデュロメーターによって球状キャップがアパチャーに可逆的かつぴったりと適合することが可能である。キャップは、ピコウェルを閉塞して漏洩を防ぐことができ、細胞培地中の細胞がピコウェル中で培養される状況で細胞によって放出される代謝物を吸収することができる受動的キャップ、本質的に同一の複数の化合物を含むビーズの形態を取り、本質的に同一の複数の化合物のそれぞれが切断性リンカーによってビーズに連結されており、複数のピコウェルの少なくとも１つが水性媒体を含み、切断性リンカーの切断によって本質的に同一の複数の化合物の少なくともいくらかがビーズから水性媒体の中に放出される、能動的キャップである。
上部の一般に平坦な表面、それぞれのピコウェルがピコウェルの上部における開口を画定する上部アパチャーおよび床面によって画定される底部を有する複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートを含むシステム。上部アパチャーは壁によって床面から分離されている。上部アパチャーと床面との間に壁が存在し、前記複数のピコウェルの少なくとも１つにビーズが配置されてもよい。ビーズは、実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードおよび実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、ピコウェルアレイプレートは、複数のピコウェルの少なくとも１つまたは全ての上部における開口を緊密に覆うことができるか、複数のピコウェルの少なくとも１つまたは全ての上部における開口を実際上緊密に覆うことができるマットをさらに含む。緊密な覆いは可逆的である。マットは、ピコウェルアレイプレートの上部の一般に平坦な表面と接するように設けられた際に、複数のピコウェルの１つまたは複数に含まれ得る任意の代謝産物、生化学物質、またはタンパク質を吸収することができる吸収表面、およびピコウェルアレイプレートの上部の一般に平坦な表面への可逆的な付着を維持することができる付着性表面の１つまたは全てを含んでもよい。
それぞれのビーズがビーズに結合した実質的に互いに関連する複数の化合物および複数のオリゴヌクレオチドを含む、複数のビーズを準備する工程を含む、アッセイからのシグナルおよびビーズ上の配列決定読み取りを決定し、それにより、目的の１つまたは複数の化合物をアッセイから特定する方法。それぞれのビーズに結合した複数のオリゴヌクレオチドは、同じビーズに結合した複数の化合物を特定し、ビーズに結合した複数の化合物が関与するアッセイを実施し、工程ｂのアッセイにおける化合物の性能を反映する少なくとも１つのシグナルを決定し、オリゴヌクレオチドをビーズから除去することなくビーズに結合した複数のオリゴヌクレオチドを配列決定し、それにより、それぞれのビーズについて配列決定読み取りを決定し、工程ｄの配列決定読み出しによってビーズに結合した化合物を特定し、これを工程ｃの決定されたシグナルに含まれるアッセイ性能と関連付け、アッセイからのシグナルおよび配列決定読み取りを有するビーズによって目的の化合物を特定する。
それぞれのビーズがビーズ表面に結合した複数のオリゴヌクレオチドおよびビーズ表面に結合した実質的に関連する複数の化合物を含む、複数のビーズを準備することを含む、所望の特性を有する化合物について化合物ライブラリーをスクリーニングする方法。ビーズに結合したオリゴヌクレオチドの配列は、ビーズ表面に結合した実質的に関連する複数の化合物のアイデンティティーをコードし、複数のビーズを化合物ライブラリー中の化合物の所望の特性についてのアッセイに組み込み、少なくとも１つのビーズからのシグナルを捕捉する。シグナルは、アッセイ中のビーズ上の化合物の性能を反映し、オリゴヌクレオチドをビーズから除去することなくアッセイシグナルも捕捉される少なくとも１つのビーズに結合した複数のオリゴヌクレオチドを配列決定し、工程（ｄ）の配列決定読み出しから少なくとも１つの化合物を特定し、これを工程（ｃ）のシグナルに捕捉されたその対応するアッセイ性能と関連付ける。
それぞれのビーズは、異なる複数のオリゴヌクレオチドおよび実質的に関連する複数の異なる化合物を含む。
複数のオリゴヌクレオチドは、複数のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
複数の化合物は、多数の化合物構築ブロックをタンデムに連結することによってビーズ表面に結合され、全ての化合物構築ブロックは、ともに化合物を作り上げている。
それぞれのＤＮＡモジュールおよびそれぞれの化合物構築ブロックは、連続的かつ択一的に組み立てられている。
複数の同一の化合物中のそれぞれの化合物は、切断性リンカーによってビーズ表面に結合している。
切断性リンカーは、光切断性リンカー、プロテアーゼ切断性リンカー、または酸切断性リンカーである。
化合物は、工程（ａ）の後、かつ工程（ｄ）の前に、ビーズ表面から切断される。
化合物の所望の特性を反映するシグナルは、蛍光シグナルである。
それぞれのビーズの大きさは１μｍ～１００μｍである。
それぞれのビーズの大きさは、１μｍ～１０μｍである。
それぞれのビーズの大きさは約３μｍである。
本方法は、複数の可能な標的の中の標的候補を特定することをさらに含む。所望の特性を有する化合物は、標的候補に結合する。
工程（ｂ）は、複数の可能な標的の中で複数のビーズをインキュベートすることを含む。
可能な標的は、タンパク質または核酸である。
配列決定は、単一分子リアルタイム配列決定、イオン半導体配列決定、熱配列決定、合成による配列決定、架橋増幅による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ナノポア配列決定、鎖停止配列決定、大規模並列シグネチャ配列決定、ポロニー配列決定、ヘリスコープ単一分子配列決定、ショットガン配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、トンネリング電流ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量分析を伴う配列決定、微小流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定、およびオリゴヌクレオチド延長配列決定によって実施される。
それぞれのビーズがビーズ表面に結合した複数のオリゴヌクレオチドおよびビーズ表面に結合した実質的に関連する複数の化合物を含む複数のビーズを準備することを含む、所望の特性を有する化合物について化合物ライブラリーをスクリーニングする方法。ビーズに結合したオリゴヌクレオチドの配列は、ビーズ表面に結合した実質的に関連する複数の化合物の合成履歴をコードし、複数のビーズを化合物ライブラリー中の化合物の所望の特性についてのアッセイに組み込み、少なくとも１つのビーズからのシグナルを捕捉する。シグナルは、アッセイ中のビーズ上の化合物の性能を反映し、ビーズからオリゴヌクレオチドを除去することなくアッセイシグナルも捕捉される少なくとも１つのビーズに結合した複数のオリゴヌクレオチドを配列決定し、工程（ｄ）の配列決定読み出しから少なくとも１つの化合物を特定し、これを工程（ｃ）のシグナルに捕捉されたその対応するアッセイ性能と関連付ける。
アッセイは結合アッセイを含む。
アッセイは活性アッセイを含む。
アッセイは競合結合アッセイまたは競合阻害アッセイを含む。
アッセイは、束縛されていない化合物と他のアッセイ試薬との相互作用を含む。束縛されていない化合物は、ビーズ表面から放出された化合物である。
化合物は、化合物をビーズに連結している切断性リンカーを切断することによって放出される。
アッセイは限定された複数の体積の中で行なわれ、限定された体積あたり名目上１個のビーズが分散している。
限定された体積は水滴を含む。
水滴は油媒体もしくは疎水性液体媒体の中に懸濁している。
限定された体積はピコウェルを含む。
ピコウェルは規則的なアレイの中に組織化されている。
複数の限定された体積は規則的なアレイの中に組織化されている。
限定された体積はビーズの周囲の接着性水性媒体の層を含む。ビーズは疎水性媒体の中に懸濁している。
アッセイ試薬はオリゴヌクレオチドを配列決定する前に洗浄除去される。
配列決定工程（ｄ）はアッセイ工程（ｂ）の前に実施される。
ビーズ上のオリゴヌクレオチドは、配列決定工程の後であるがアッセイ工程の前で除去される。
オリゴヌクレオチドの除去は、酵素消化、化学的切断、熱分解、または物理的剪断を含む。
結合アッセイは、ビーズへのＲＮＡ分子の結合を含む。
ビーズからのシグナルは、結合したＲＮＡ分子の配列決定を含む。
結合アッセイは蛍光標識した結合アッセイを含む。ビーズ上の化合物に結合する分子は蛍光色素を含む。
結合アッセイは核酸標識結合アッセイを含む。ビーズ上の化合物に結合する分子は核酸タグを含み、さらにアッセイからのシグナルはビーズ上の化合物に結合する分子に結合した核酸タグの配列決定を含む。
所望の特性は、酵素の触媒活性を阻害または刺激すること、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ１型免疫応答を刺激すること、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ２型免疫応答を刺激すること、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ１型免疫応答を阻害すること、細胞に基づくアッセイまたはインビボアッセイによって測定できるＴｈ２型免疫応答を阻害すること、精製されたタンパク質、細胞に基づくアッセイ、またはインビボアッセイによって測定できるタンパク質のユビキチン媒介分解を刺激または阻害すること、のうち１つまたは複数を含む。
化合物が結合し、オリゴヌクレオチドによってコードされた複数のビーズを受容する試料区画、それぞれのカプセル化区画がアッセイ媒体中に分散した単一のビーズを名目上含み、アッセイ媒体がさらにビーズ上の化合物との相互作用がアッセイされて測定可能なシグナルを生じる試薬を含む、試料区画内の複数のカプセル化区画、シグナルを測定するための検出器、配列決定プラットフォーム、およびユーザーからの１つまたは複数のコマンドを受容するユーザーインターフェースを含む、所望の活性を有する化合物について化合物ライブラリーをスクリーニングするためのシステム。
カプセル化区画は液滴を含む。
カプセル化区画はピコウェルを含む。
カプセル化区画はアッセイ試薬を含む。
検出器は光学検出器を含む。
シーケンサーは光学検出器を含む。
核酸によってコードされる撹乱を準備し、細胞を核酸によってコードされる撹乱の中に閉じ込めることおよび細胞を限定された体積の中で核酸によってコードされる撹乱と接触させることを含む、細胞を撹乱するための方法。撹乱の開始および用量は制御され、細胞を核酸によってコードされる撹乱と特定した時間、インキュベートし、核酸によってコードされる撹乱をコードする核酸を細胞に移送する。
核酸によってコードされる撹乱は、核酸によってコードされる化合物または薬物分子である。
核酸によってコードされる撹乱は、ＤＮＡによってコードされるライブラリーである。
撹乱および撹乱をコードする核酸は、結合しておらず、溶液中で遊離している。
撹乱および撹乱をコードする核酸は、互いに結合している。
撹乱および撹乱をコードする核酸は、同じ基質に結合しているが、互いに結合していない。
基質への撹乱の結合および基質への核酸の結合は、切断可能な結合である。
切断可能な結合は、光切断性結合、温度切断性結合、ｐＨ感受性結合、酸切断性結合、塩基切断性結合、音響切断性結合、塩切断性結合、酸化還元感受性結合、または物理的切断性結合からなる群から選択される。
細胞および撹乱を閉じ込めることには、液滴カプセル化、エマルジョンカプセル化、ピコウェルカプセル化、マクロウェルカプセル化、物理的結合、気泡カプセル化、または微小流体閉じ込めが含まれる。
撹乱の制御には、光曝露の制御、温度曝露の制御、ｐＨ曝露の制御、曝露時間の制御、音響曝露の制御、塩曝露の制御、化学的もしくは物理的な酸化還元電位の制御、または機械的撹拌への曝露の制御が含まれる。
インキュベーションには、基質から撹乱を切断した後で、または基質から核酸を切断した後で、細胞を撹乱に曝露することが含まれる。
インキュベーションには、基質から撹乱を切断せずに、または撹乱から核酸を切断せずに、細胞を撹乱に曝露することが含まれる。
核酸によってコードされる撹乱をコードする核酸を細胞に移送することには、核酸を細胞の細胞表面に結合することが含まれる。
核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸を細胞膜にインターカレートすることが含まれる。
核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸を細胞表面上の生体分子に結合することが含まれる。
生体分子はタンパク質または炭水化物である。
核酸を細胞の細胞表面に結合することには、核酸上の光学タグを通して結合することが含まれる。
ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーを準備することおよび細胞をビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーとともに閉じ込めることを含む、細胞を撹乱によって撹乱し、撹乱のアイデンティティーによって細胞をコードする方法。ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーは、コンビナトリアルに合成された化合物の１つまたは複数のコピーおよびコードする核酸タグの１つまたは複数のコピーを含む。化合物およびコードする核酸はビーズに結合している。コードする核酸は化合物のアイデンティティーをコードする。ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーおよび細胞は限定する体積の中に閉じ込められ、ビーズから化合物を放出し、限定する体積の中で化合物を細胞とともにインキュベートし、コードする核酸タグをビーズから放出してもよく、コードする核酸タグを細胞に結合し、それにより、細胞に結合したコードする核酸タグを通して化合物のアイデンティティーを保存する。
第１の限定された体積の中で細胞をビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーと接触させることを含む、細胞を撹乱し、撹乱のアイデンティティーによって細胞をコードし、撹乱に対する細胞の応答を測定する方法。ビーズに結合したＤＮＡによってコードされるライブラリーは、コンビナトリアルに合成された化合物の１つまたは複数のコピーおよびコードする核酸タグの１つまたは複数のコピーを含む。化合物およびコードする核酸はビーズに結合している。コードする核酸は化合物のアイデンティティーをコードし、ビーズからライブラリー中の化合物を放出し、第１の限定された体積の中でライブラリー中の化合物を細胞とともにインキュベートし、第１の限定された体積の中でコードする核酸タグをビーズから放出してもよく、コードする核酸タグを細胞の細胞表面に捕捉し、それにより、細胞がライブラリー中の化合物に曝露され、曝露された化合物のアイデンティティーが細胞表面上に捕捉され、第１の限定する体積から細胞を放出する。コードする核酸タグは細胞に結合しており、コードする核酸タグは、細胞が曝露される化合物のアイデンティティーをコードし、既に撹乱され核酸タグ付けされた細胞を第２の限定された体積の中で応答検出ビーズによって捕捉する。細胞は、細胞の細胞内容物を応答捕捉ビーズに曝露する溶解条件に曝露される。応答捕捉ビーズは、細胞成分および既に撹乱され核酸タグ付けされた細胞における撹乱をコードする核酸タグを捕捉する捕捉用プローブを含み、第２の限定する体積の中で応答捕捉ビーズを溶解した細胞とともにインキュベートし、それにより、細胞内容物と撹乱をコードする核酸タグの両方を応答捕捉ビーズ上に捕捉し、撹乱に対する細胞の応答を核酸シグナルに変換してもよい。撹乱に対する細胞の応答は核酸シグナルではなく、応答捕捉ビーズに結合した核酸タグを配列決定し、それにより、撹乱のアイデンティティーを撹乱に対する細胞の応答と相関させる。
ピコウェルのアレイおよび機能化撹乱ビーズのライブラリーを準備することを含む、細胞を撹乱し、撹乱に対する細胞の応答を捕捉する方法。ピコウェルは単一の細胞および単一の機能化撹乱ビーズを収容することができ、それぞれの機能化撹乱ビーズは実質的に同一の放出可能な異なる複数の化合物および化合物をコードする複数のヌクレオチドバーコードを含む。ヌクレオチドバーコードは細胞の細胞内容物を捕捉することができる機能化バーコードである。細胞の細胞内容物は機能化撹乱ビーズに含まれる撹乱に対する細胞応答を含み、単一の細胞をピコウェルアレイのそれぞれのピコウェルの中に捕捉し、単一の機能化撹乱ビーズを、単一の細胞を含むピコウェルに捕捉し、機能化撹乱ビーズから化合物を放出し、放出された化合物と細胞をインキュベートする。ピコウェルの間の化合物は最小の拡散を有し、細胞を溶解して細胞内容物を放出し、細胞内容物の１つまたは複数の成分を機能化撹乱ビーズ上の機能化オリゴヌクレオチドに捕捉する。捕捉することは、ヌクレオチドバーコードと細胞内容物の核酸エレメントとを組み合わせるハイブリダイゼーションおよび酵素的延長を含み、それによりヌクレオチドバーコードと細胞内容物の核酸エレメントとのハイブリッドを形成し、ハイブリッドを放出し、機能化撹乱ビーズのライブラリーからハイブリッドを収集し、ハイブリッドを配列決定して、それにより撹乱を撹乱に対する細胞応答と関連付ける。
細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするためのシステムが提供される。システムは、それぞれのウェルが他のウェルから分離された複数のウェルを含むアッセイデバイスを含み得る。システムは、単一のビーズが単一のウェルに配置された複数のビーズを含み得る。それぞれのビーズは、ビーズに結合した実質的に同一の複数の化合物を含み得る。ビーズ結合化合物は切断可能性リンカーによってビーズに共有結合で連結されており、それにより、前記化合物はアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式で前記ビーズから放出可能である。
また、細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするための方法が提供される。本方法とともに、システムも提供される。システムは、それぞれのウェルが他のウェルから分離された複数のウェルを含むアッセイデバイスを含み得る。システムは、それぞれのビーズがそれぞれのウェルへの配置に適した複数のビーズを含んでよく、それぞれのビーズは、ビーズに結合した実質的に同一の複数の化合物を含んでよく、前記ビーズ結合化合物は切断性リンカーによってビーズに共有結合で連結されており、それにより、前記化合物はアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式でビーズから放出可能である。
ビーズは、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによってビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み、ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによってビーズに連結されている場合には、切断性リンカーはビーズ結合化合物をビーズに連結するために使用される切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、化合物はＤＮＡバーコードによって特定される。
システムは、単一のビーズのみが単一のウェルに含まれることを可能にする移送ディスペンサーを使用してビーズをウェルに移送することをさらに含む。一実施形態では、これらのデバイスは、それぞれのキャビティが単一の開口直径を有し、複数のビーズのうち単一のビーズのみを保持するように構成されてよい、多数のキャビティを有する。アッセイデバイスおよび移送ディスペンサーは互いに適合または嵌合するように構成してよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。アッセイデバイスと移送ディスペンサーとが互いに適合または嵌合した場合に、移送ディスペンサーのキャビティはデバイスのウェルと整列してよい。
それぞれのウェルは、前記キャビティのそれぞれの開口直径より大きな開口直径を有してよく、それにより、それぞれのキャビティをそれぞれのウェルの上に置いた場合に、前記キャビティと前記ウェルとを含む閉じ込めスペースが形成され得る。
単一のビーズは、キャビティから前記閉じ込めスペースを通って放出され、前記ウェルの中に投入される。
ビーズは非磁性ビーズであってよい。
前記間隙は、存在する場合には、デバイスの中に移送されるビーズの大きさ（例えば直径）より小さな大きさ（例えば直径）を有してよい。これにより、間隙を通るビーズの移動が防止される。
本方法とともに、デバイスが提供される。デバイスは、少なくとも１つのプロセッサおよび少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを保存するメモリを含み、少なくとも１つのプログラムは、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に少なくとも１つのプロセッサに操作を実施させる命令を含む。
操作は互いに適合または嵌合するようにアッセイデバイスと移送ディスペンサーとを移動させることを含んでよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。
操作は、移送ディスペンサーのキャビティとデバイスのウェルを整列させることを含んでよい。
操作は、アッセイデバイスと移送ディスペンサーとを互いに適合または嵌合させて閉じ込めスペースを形成することを含んでよい。
操作は、キャビティから前記閉じ込めスペースを通して単一のビーズを放出することを含んでよい。
さらに、細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするための少なくとも１つのプログラムを保存する非一時的なコンピュータ読み取り可能な保存媒体が提供される。非一時的なコンピュータ読み取り可能な保存媒体とともに、システムが提供される。システムには、それぞれのウェルが他のウェルから分離された複数のウェルを含むアッセイデバイスが含まれる。システムは、それぞれのビーズがそれぞれのウェルへの配置に適した複数のビーズを含み、それぞれのビーズは実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、前記ビーズ結合化合物は切断性リンカーによってビーズに共有結合で連結されており、それにより、前記化合物はアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式で前記ビーズから放出可能である。
前記ビーズは、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによってビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含んでよく、ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによってビーズに連結されている場合には、切断性リンカーはビーズ結合化合物をビーズに連結するために使用される切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、化合物はＤＮＡバーコードによって特定される。
非一時的なコンピュータ読み取り可能な保存媒体とともに、システムは、それぞれのキャビティが単一の開口直径を有し、複数のビーズのうち単一のビーズのみを保持するように構成された複数のキャビティを有する移送ディスペンサーをさらに含み得る。アッセイデバイスおよび移送ディスペンサーは互いに適合または嵌合するように構成してよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。アッセイデバイスと移送ディスペンサーとが互いに適合または嵌合した場合に、移送ディスペンサーのキャビティはデバイスのウェルと整列してよい。
それぞれのウェルは、前記キャビティのそれぞれの開口直径より大きな開口直径を有してよく、それにより、それぞれのキャビティをそれぞれのウェルの上に置いた場合に、前記キャビティと前記ウェルとを含む閉じ込めスペースが形成され得る。
単一のビーズは、キャビティから前記閉じ込めスペースを通って放出され、前記ウェルの中に投入される。
ビーズは非磁性ビーズであってよい。
前記間隙は、存在する場合には、デバイスの中に移送されるビーズの大きさ（例えば直径）より小さな大きさ（例えば直径）を有してよい。
少なくとも１つのプログラムは、少なくとも１つのプロセッサおよび少なくとも１つのプログラムを保存するメモリによる実行のためであってよく、少なくとも１つのプログラムは、少なくとも１つのプロセッサによって実行された場合に少なくとも１つのプロセッサに操作を実施させる命令を含む。操作は、互いに適合または嵌合するようにアッセイデバイスと移送ディスペンサーとを移動させることを含んでよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。操作は、移送ディスペンサーのキャビティとデバイスのウェルが整列するように移動させることを含んでよい。操作は、アッセイデバイスと移送ディスペンサーとが互いに適合または嵌合するように移動させて閉じ込めスペースを形成することを含んでよい。操作は、キャビティから前記閉じ込めスペースを通して単一のビーズが放出されるように移動させることを含んでよい。操作は、単一のビーズが前記ウェルの中に投入されるように移動させることを含んでよい。
ビーズは、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによってビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み得る。ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによってビーズに連結されている場合には、切断性リンカーはビーズ結合化合物をビーズに連結するために使用される切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、化合物はＤＮＡバーコードによって特定される。
システムは、それぞれのキャビティが単一の開口直径を有し、複数のビーズのうち単一のビーズのみを保持するように構成された複数のキャビティを有する移送ディスペンサーをさらに含み得る。アッセイデバイスおよび移送ディスペンサーは互いに適合または嵌合するように構成してよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。アッセイデバイスと移送ディスペンサーとが互いに適合または嵌合した場合に、移送ディスペンサーのキャビティはデバイスのウェルと整列してよい。
それぞれのウェルは、前記キャビティのそれぞれの開口直径より大きな開口直径を有してよく、それにより、それぞれのキャビティをそれぞれのウェルの上に置いた場合に、前記キャビティと前記ウェルを含む閉じ込めスペースが形成され得る。
単一のビーズは、キャビティから前記閉じ込めスペースを通って放出され、前記ウェルの中に投入される。
ビーズは非磁性ビーズであってよい。
前記間隙は、存在する場合には、デバイスの中に移送されるビーズの大きさ（例えば直径）より小さな大きさ（例えば直径）を有してよい。
上で参照したシステム、方法、および非一時的コンピュータ読み取り可能な保存媒体のそれぞれは、以下に列挙する特徴のそれぞれの１つまたは複数を、任意の好適な組合せで含み得る。
ビーズ結合化合物がビーズから放出される場合には、ビーズ結合ＤＮＡバーコードはビーズから放出されなくてよい。
限定された体積のそれぞれは、単一のビーズを含み得る。
限定された体積はピコウェルまたは液滴であってよい。
切断性共有結合リンカーは、光、温度変化、ｐＨ変化、音響、塩、または酸化の変化によって切断され得る。
切断性リンカーは、光によって切断され得る。
光は紫外光であってよい。
細胞の成分は脂質、タンパク質、炭水化物、または核酸であってよい。
細胞の成分は核酸であってよい。
核酸はｍＲＮＡであってよい。
細胞の成分は、サイトカイン、抗原、または酵素であってよい。
試験のために測定可能な用量依存的様式でビーズから放出される化合物の量は、ビーズに結合し、試験される化合物とは区別されるシグナル生成化合物から生成されたシグナルの変化によって測定され、シグナル生成化合物はビーズ上ではシグナルを生成しないか減衰されたシグナルを生成し、いったんビーズから放出されれば増大したシグナルを生成することができ、シグナルの増大はビーズから放出された試験すべき化合物の量と相関し、ビーズから放出される化合物とビーズから放出されるシグナル生成化合物とは同じ条件下で放出され得る。
化合物とシグナル生成化合物とは同じビーズに結合してよい。
シグナル生成化合物は、シグナル生成化合物とクエンチャーが同じビーズに結合した場合に、その蛍光がクエンチャーによって消光される蛍光化合物であってよい。
少なくとも１つの限定された体積は、別の限定された体積中のビーズ上のビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物とは異なってもよいビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物を有するビーズを含み得る。
ＤＮＡバーコードは切断性リンカーによってビーズに連結され、切断性リンカーは、ビーズ結合化合物をビーズに連結する切断性リンカーとは異なってよい。
ＤＮＡバーコードは非切断性リンカーによってビーズに連結されてよい。
ＤＮＡバーコードは切断性リンカーによってビーズに連結されてよく、切断性リンカーは、ビーズ結合化合物をビーズに連結する切断性リンカーとは異なる機構によって切断されてよい。
移送ディスペンサーは、移送ディスペンサーとアッセイデバイスとを適正な整列に固定する固定機構をさらに含んでよい。
キャビティのそれぞれの直径は、ビーズを収容するために可逆的に拡張可能であってよい。
キャビティのそれぞれの直径は、元の形態またはビーズを収容するために拡張した形態において、ビーズの直径の少なくとも１００．１％であってよい。
キャビティのそれぞれの深さは、ビーズの大きさ（例えば直径）の少なくとも５０％からビーズの大きさ（例えば直径）の約１２５％までであってよい。
移送ディスペンサーは、アッセイデバイスの下の移送ディスペンサーの多数のキャビティにビーズを移送するための封じ込めキャップと一体化するように構成してよい。
単一のビーズは大きさによって排除されるビーズであり、前記ビーズの大きさ（例えば直径）によって、２つのビーズが単一のキャビティに適合するような大きさ（例えば直径）を有するビーズは排除される。
ビーズは、約０．５～約１００ミクロンの大きさ（例えば直径）を有してよい。
移送ディスペンサーはその上で前記アッセイデバイスに適合するように構成され、前記移送ディスペンサーは反転した位置でアッセイデバイスの下に位置してこれと整列し、それにより、前記移送ディスペンサーが所与のキャビティの中に２個以上のビーズを含まないことを前提として、移送ディスペンサー中のそれぞれのキャビティがアッセイデバイス中の単一のウェルと整列してよい。
移送ディスペンサーはその上で前記アッセイデバイスに適合するように構成され、前記アッセイデバイスは、移送ディスペンサーの下でこれと整列し、それにより、アッセイデバイス中のそれぞれのウェルは単一のビーズを含み、単一のビーズは前記移送ディスペンサーから移送され、前記移送は移送ディスペンサーへのアッセイデバイスの単一の適合を必要とする。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、キャビティの開放端に対向する底表面を含んでよく、底表面は底表面の中に陥凹したサブキャビティを含み、サブキャビティは単一のビーズを保持するように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、開放底表面および開放上表面を含んでよく、開放底表面の大きさは開放上表面の大きさより小さく、キャビティは、単一のビーズが開放上表面と開放底表面との間の中間点に留まるように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、キャビティの開放端に対向する底表面を含んでよく、底表面は底表面の中または上に磁石を有し、磁石は単一のビーズを保持するように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、内側寸法を有する開口を含んでよく、開口は閉鎖構造によって封鎖してよく、閉鎖構造は、その中に副開口を有する固体材料のメッシュ、多孔質繊維製品、および開口の内部寸法より小さく、単一のビーズの最大寸法より大きい、少なくとも１つの副開口を有する副構造からなる群のうちの少なくとも１つを含み得る。
細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするためのシステムが提供される。前記システムは、それぞれのウェルが他のウェルから分離された、少なくとも５０，０００のウェルを含む多数のウェルを含むアッセイデバイスを含み得る。前記システムは、それぞれのビーズがそれぞれのウェルの中への配置に適している、複数のビーズを含み得る。それぞれのビーズは、実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含む。前記ビーズ結合化合物は切断性リンカーによってビーズに共有結合で連結されており、それにより、前記化合物はアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式で前記ビーズから放出可能である。
他の実施形態では、前記システムは、それぞれのウェルが他のウェルから分離された多数のウェルおよび単一のビーズが単一のウェルの中への配置に適した複数のビーズを含むアッセイデバイスを含み、それぞれのビーズは実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、ビーズ結合化合物は切断性リンカーによってビーズに共有結合で連結されており、それにより、化合物はアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式でビーズから放出可能であり、ビーズは（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによってビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み、ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによってビーズに連結されている場合には、切断性リンカーはビーズ結合化合物をビーズに連結するために使用される切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、化合物はＤＮＡバーコードによって特定され、それぞれのビーズは少なくとも約１０，０００個の実質的に同一のＤＮＡバーコードを含む。
前記ビーズは、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによってビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み得る。ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによってビーズに連結されている場合には、切断性リンカーはビーズ結合化合物をビーズに連結するために使用される切断性リンカーに対してオルソゴナルであってよい。化合物はＤＮＡバーコードによって特定される。
前記システムは、単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送ディスペンサーをさらに含み得る。
移送デバイスは、単一のビーズを伝送することができる少なくとも１つのピペットをさらに含んでよく、少なくとも１つのピペットは可撓性先端部を含む。ピペットの可撓性先端部はポリイミドを含み得る。可撓性先端部はピペットの全長の２０％以下に沿って延在してよい。可撓性先端部はピペットの全長の１０％以下に沿って延在してよい。
細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、上で参照したシステムによって実施してよい。
前記方法は、互いに適合または嵌合するようにアッセイデバイスと移送ディスペンサーとを移動させることを含んでよく、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に間隙が存在してもよい。前記方法は、移送ディスペンサーのキャビティとデバイスのウェルを整列させることを含んでよい。前記方法は、アッセイデバイスと移送ディスペンサーとを互いに適合または嵌合させて閉じ込めスペースを形成することを含んでよい。前記方法は、キャビティから前記閉じ込めスペースを通して単一のビーズを放出することを含んでよい。前記方法は、単一のビーズを前記ウェルの中に投入することを含んでよい。
移送デバイスはロボットによって、または人手によって、またはロボットと人手のプロセスの組合せによって操作される。
移送デバイスは、単一のビーズを単一のウェルの中に投入するために、磁気的引力、静電的引力、または大きさおよび重力に基づく工学原理を採用し得る。
移送ディスペンサーは、多数のキャビティを含み得る。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、キャビティの開放端に対向する底表面を含み得る。底表面は底表面の中に陥凹したサブキャビティを含み得る。サブキャビティは単一のビーズを保持するように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、開放底表面および開放上表面を含み得る。開放底表面の大きさは開放上表面の大きさより小さくてよい。キャビティは、単一のビーズが開放上表面と開放底表面との間の中間点に留まるように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、キャビティの開放端に対向する底表面を含み得る。底表面は底表面の中または上に磁石を有し得る。磁石は単一のビーズを保持するように構成してよい。
移送ディスペンサーの多数のキャビティのそれぞれのキャビティは、内側寸法を有する開口を含み得る。開口は閉鎖構造によって封鎖してよい。閉鎖構造は、その中に副開口を有する固体材料のメッシュ、多孔質繊維製品、および開口の内部寸法より小さく、単一のビーズの最大寸法より大きい、少なくとも１つの副開口を有する副構造からなる群のうちの少なくとも１つを含み得る。
化合物によって誘起された細胞におけるトランスクリプトームの変化を特定する方法であって、前記化合物がコンビナトリアルライブラリーのアッセイの中に含まれる、方法。本方法は、上で参照したシステムによって実施してよい。
本方法は、アッセイアレイを生成することを含み得る。アッセイアレイは、それぞれのウェルが他のウェルから分離されており、それぞれのウェルが少なくとも１つの目的の細胞を含み、アッセイアレイが５０，０００を超えるウェルを含む、複数のウェルを含む。アッセイアレイは、それぞれのビーズが前記コンビナトリアルライブラリー由来の特有の化合物を含み、前記ライブラリー中のそれぞれの化合物が潜在的薬物候補として選択されるように、それぞれのビーズが複数の同じビーズ結合化合物を含む、複数のビーズを含んでよい。アッセイアレイは、複数の機能化オリゴヌクレオチドを含み得る。機能化オリゴヌクレオチドは、特有の化合物の構造または前記特有の化合物を作製するために用いる合成工程をコードするオリゴヌクレオチド部分、およびＲＮＡ捕捉エレメントを含み得る。単一のビーズは単一のウェルの中に配置してよい。
本方法は、細胞をそれぞれの限定された体積の中で、ビーズから限定された体積の中に放出された化合物と接触させ、前記接触に応答して細胞によって発現されたＲＮＡにおけるトランスクリプトームの変化を生じるために十分な時間、前記接触を維持することを含み得る。
本方法は、細胞を溶解し、ＲＮＡを前記ビーズ上のＲＮＡ捕捉エレメントと接触させることによって、それぞれのウェルの中の細胞からＲＮＡを捕捉することを含み得る。
本方法は、複数のビーズの少なくとも一部からの捕捉されたＲＮＡを特定し、前記捕捉されたＲＮＡにおいてトランスクリプトームの変化があればこれを評価することを含み得る。
本方法は、前記トランスクリプトームの変化を生じた化合物の構造を特定することを含み得る。
ビーズは、単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送デバイスを使用して前記アッセイアレイのウェルに添加してよい。
開示した主題のこれらのおよびその他の可能性は、以下の図面、詳細な説明、および特許請求の範囲を概観した後で、さらに完全に理解されよう。
これらおよび他の特徴は、添付の図面と共に含まれる以下の詳細な説明から、より容易に明らかとなるであろう。
連結式ビーズ。連結式ビーズでは、ＤＮＡバーコードは、スペーサーとしてのプライマーアニーリング部位などの機能を有する任意の他の核酸と共に、一本鎖で互いに接続された全てのＤＮＡバーコードモジュール、または製造日に関する情報の形態をとる。この図面上の番号は、構造番号ではない。番号は、ＤＮＡバーコード中の「ＤＮＡバーコードモジュール」の配列を指す。 オルソゴナル式ビーズ。オルソゴナル式ビーズでは、ＤＮＡバーコードは、ＤＮＡバーコードモジュールが一本鎖中に一緒に存在しないが、その代わりに、ビーズ上の異なる位置に別々に連結されて存在する、全てのＤＮＡバーコードモジュールの形態をとる。この図面上の番号は、構造番号ではない。番号は、ＤＮＡバーコード中の「ＤＮＡバーコードモジュール」の配列を指す。 切断性リンカー、切断のための条件（ＵＶ光または化学物質）、および切断生成物。Yinliang Yang (2014) Design of Cleavable Linkers and Applications in Chemical Proteomics. Technische Universitat Munchen Lehrstuhl fur Chemie der Biopolymereからの情報。各リンカーの左側のアルファベット文字は、この参考文献からのものである。 同上。 同上。 本開示の組成物および方法に関する例示的なアミノ酸誘導体。 同上。 同上。 同上。 写真は、添加されるレナリドミドの濃度の増大と共に、ＨｅＬａ細胞の内部での、融合タンパク質の分解の増加を開示する。上：ＩＫＺＦ１／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ（登録商標）対照の発現。レナリドミドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモル濃度で添加した。 写真は、添加されるレナリドミドの濃度の増大と共に、ＨｅＬａ細胞の内部での、融合タンパク質の分解の増加を開示する。上：ＩＫＺＦ３／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ（登録商標）対照の発現。レナリドミドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモル濃度で添加した。 ビーズ結合ＤＮＡバーコードを作出するための方法および試薬。「ＤＮＡバーコード」の最も正確な説明は、全てのＤＮＡバーコードモジュールの合計に含まれる全ての情報の合計である。しかし便宜上、本明細書で使用される用語「ＤＮＡバーコード」は、全てのＤＮＡバーコードモジュールの全ての情報の合計、および工程数などの情報を提供する任意の追加の核酸、またはビーズ結合化合物を構成する一般的な型の化学的単量体、およびリンカー、配列決定プライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位を有するヘアピン、またはスペーサーなどの機能を果たす任意の追加の核酸を指す。ＤＮＡバーコードの少なくとも一部がクリック化学によって作製される場合、ＤＮＡバーコードは、クリック化学反応に由来する残存化学基を含んでもよい。 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の構造。この図面の目標は、商標名を使用することに頼る必要なく化合物を特定することである。 ビーズ結合放出モニターの単純化された図。放出モニターは、ビーズからの可溶性化合物のＵＶにより誘導される放出後に、この化合物の濃度の測定値をユーザーに提供する。好ましい実施形態では、１つの型のビーズは、放出モニター専用である、すなわち、このビーズは、ビーズ結合化合物を含有しないだけでなく、ビーズ結合ＤＮＡライブラリーも含有しない。「ＰＣＬ」は、光切断性リンカーである。 ビーズ放出モニターの詳細な図。 ビーズ放出モニターの化学合成。 同上。 同上。 同上。 リンカーがリシン残基を含む、二機能性リンカーを有するアミン機能化ビーズ。 第１の型のカルボキシル基で改変されたレナリドミドの化学合成の工程。 第２の型のカルボキシル基で改変されたレナリドミドの化学合成の工程。 第３の型のカルボキシル基で改変されたレナリドミドの化学合成の工程。 図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃは、レナリドミドアナログを示す。 同上。 同上。 ＤＮＡバーコードのクリック化学合成にとって好適なデオキシシチジンアナログの化学合成の工程。 同上。 同上。 同上。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃは、ピコウェルの上に置くため、およびピコウェルを密封するためのキャップを示す。図１８Ａは、化合物が切断性リンカーによって放出可能である、能動的キャップを示す。図１８Ｂは、抗体などの試薬が結合している、別の型の能動的キャップを示す。結合した試薬は恒久的に連結されてもよく、それは切断性リンカーによって連結されてもよく、またはそれは水素結合によって結合し、ピコウェル中の溶液への曝露によってのみ放出された後、能動的キャップからこの溶液中に拡散してもよい。図１８Ｃは、ピコウェル中の溶液に由来する代謝物を吸収する、吸着する、収集する、または捕捉するために使用することができる受動的キャップを示す。続いて、吸収された代謝物を分析することができる。 同上。 同上。 図１９Ａは、ピコウェル上にキャップを有しないピコウェルプレートを示す。図１９Ｂは、それぞれのピコウェル上にキャップを有するピコウェルプレートを示す。図１９Ｃは、１つのキャップがそれぞれのピコウェル上にしっかりと固定されたピコウェルプレート上に注がれるポリアクリルアミド溶液を示す。次いで、ポリアクリルアミドは、多孔性キャップ中に入り込み、固化し、それぞれのキャップへの安定な接着を形成する。図１９Ｄは、次いで、固化したポリアクリルアミドの「屋根」が、それぞれのキャップと共に、ピコウェルプレートから剥がされることを示す。次いで、ピコウェル溶液から移送され、それぞれのキャップ中に吸収された代謝物を分析することができる。好ましくは、ピコウェルプレート上に、およびビーズ上に注がれる溶液は、ヒドロゲルになり、好ましくは、ビーズは、ヒドロゲルから作製される。 排他的な実施形態では、本開示は、少なくとも１つのウェルがキャッピングされ、液体ポリマー溶液がプレート上およびキャッピングされたウェル上に注がれる、システム、マイクロタイタープレート、マイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルを有するマイクロタイタープレート、および関連する方法を除外してもよい。また、液体ポリマーがポリマー化して、それぞれのキャップに接着する固体ポリマーを形成する上記のものも除外してもよい。また、固体ポリマーが引き裂かれ、接着しているキャップをそれと共に除去する方法および得られる組成物も除外してもよい。 同上。 同上。 同上。 ＩＫＺＦ１遺伝子を細胞のゲノム中に組み込むために使用される環状プラスミドのマップ。プラスミドは、ＩＫＺＦ１ ｍＮＥＯＮ－ｐ２ａ－ｍＳｃａｒｌｅｔ－ｗ３－２ＦＢ（９０８１塩基対）である。ＩＫＺＦ１は、Ｉｋａｒｕｓタンパク質をコードする。 ＩＫＺＦ３遺伝子を細胞のゲノム中に組み込むために使用される環状プラスミドのマップ。プラスミドは、ＩＫＺＦ３ ｍＮｅｏｎ－ｐ２ａ－ｍＳｃａｒｌｅｔ－ｗ３－２ＦＢ（９０５１ｂｐ）である。ＩＫＺＦ３は、Ａｉｏｌｏｓタンパク質をコードする。 化学的単量体（化合物１～６）およびそのＤＮＡバーコード。 同上。 化学的単量体（化合物７～１０）およびそのＤＮＡバーコード。 化学的単量体（化合物１１～１６）およびそのＤＮＡバーコード。 同上。 化学的単量体（化合物１７～２１）およびそのＤＮＡバーコード。 同上。 化学的単量体（化合物２２～１６）およびそのＤＮＡバーコード。 同上。 化学的単量体（化合物２７～３０）およびそのＤＮＡバーコード。 同上。 ビーズ結合ＤＮＡバーコードの配列決定。この図面は、５個の連続する塩基がビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である、５個の連続する塩基のそれぞれに関する蛍光シグナルの強度を開示する。 段階的ピコウェル。 ビーズからのフルオロフォアの放出の時間経過。これは、ｔ＝０秒、ｔ＝１秒、ｔ＝１１秒、およびｔ＝７１秒での蛍光データの取得であるビーズ結合放出モニターの操作を示す。 クエンチャー－フルオロフォア基質に対するアスパルチルプロテアーゼの触媒作用後に得られる放射データ。 同上。 種々の工程を例示する、ピコウェルの横断面の図。 ＵＶ用量の増加がどのようにビーズからのフルオロフォアのより多い切断をもたらすのかを示す滴定データ。わかりやすく言うと、これは、斧のより強力なスイングがどのようにビーズからのフルオロフォアの細断に影響するかを示す（ＵＶ用量の力は、１平方センチメートルあたりのジュール数で測定される）。「曝露」の表記は、写真を撮影する時のパラメーターのみを指す。それは写真を撮影する時の単に曝露時間である（それは、切断を行う光の、または励起を行う光への曝露時間を指すわけではない）。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 ＴＡＭＲＡ濃度対光束。３６５ｎｍでのＵＶ光への曝露後の放出後の、遊離ＴＡＭＲＡの濃度が示される。 クエンチャー－フルオロフォア基質、および酵素によるこの基質の切断と共に、その結果として生じる酵素の阻害の手書き図を提供する。また、ビーズ結合ペプスタチン－Ａ、およびビーズ結合Ｆｍｏｃ－バリン（陰性対照）の分子構造も示される。 同上。 溶解した細胞からのｍＲＮＡの最終的な捕捉における使用のためのビーズの調製と共に、その後のｃＤＮＡライブラリーの製造における工程。この図面はまた、本出願の優先権が主張される、仮出願（単一細胞上での化合物ライブラリーのスクリーニングのための組成物および方法）の１つにも存在する。 同上。 タグ付けが細胞膜中に埋め込まれた脂質によるものである、ＤＮＡバーコードによる細胞のタグ付け。この図面はまた、本出願の優先権が主張される、仮出願（単一細胞上での化合物ライブラリーのスクリーニングのための組成物および方法）の１つにも存在する。 同上。 図３８は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのプロセッサと、少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを保存するメモリとを含む、細胞を撹乱し、撹乱に対する細胞の応答を捕捉するためのコンピュータデバイスまたはシステムの概略図である。 図３９は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、およびキャビティ内の下位構造を有するディスペンサーの垂直断面図である。 図４０は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、先細の側壁、開いた上端、および開いた下端を有するディスペンサーの垂直断面図である。 図４１は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、およびそれぞれのキャビティの底に配置された磁石を有するディスペンサーの垂直断面図である。 図４２は、例示的な実施形態による、必要に応じたメッシュインサートを有するピペットの垂直断面図である。
図面は拡大縮小する必要はないことがわかる。図面は、本明細書に開示される主題の典型的な態様のみを描写することを意図するものであり、したがって、本開示の範囲を限定するものと考えられるべきではない。当業者であれば、本明細書に具体的に記載され、添付の図面に例示される構造、システム、デバイス、および方法が、非限定的な例示的実施形態であり、本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ定義されることを理解するであろう。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの単数形の用語は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、それらの対応する複数の参照を含む。本明細書において引用されるすべての参考文献は、各々、個々の特許および公開された特許出願、図、図面、配列表、コンパクトディスクなどと同様に、参照により組み込まれることが具体的であり、個別に示されているのと同程度に参照により組み込まれる。
略称
表１は、略称および非限定的な定義を提供する。
Figure 2023512042000002
Figure 2023512042000003
Figure 2023512042000004
Figure 2023512042000005
Figure 2023512042000006
試薬、キット、酵素、緩衝剤、生細胞、器具などを入手することができる。例えば、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Oakwood Chemical, Estill, SC, Epicentre, Madison, WI, Invitrogen, Carlsbad, CA, ProMega, Madison, WI, Life Technologies, Carlsbad, CA, ThermoFisher Scientific, South San Francisco, CA, New England BioLabs, Ipswich, MA, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, Illumina, San Diego, CA, 10X Genomics, Pleasanton, CAを参照されたい。
バーコード化ゲルビーズ、非バーコード化ゲルビーズ、およびマイクロ流体先端部は、1CellBio, Cambridge, MAから入手可能である。フローサイトメトリーについてはガイダンスおよび機器が利用可能である（例えば、FACSCalibur（登録商標）, BD Biosciences, San Jose, CA, BD FACSAria II（登録商標） User’s Guide, part no. 643245, Rev.A, December 2007, 344 pagesを参照されたい）。
「標識された」組成物は、直接的または間接的に、分光学的、光化学的、蛍光定量的、生化学的、免疫化学的、同位体的法または化学的方法、ならびにプラズモンナノ粒子を伴う方法によって検出可能である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、１２５Ｉ、安定同位体、エピトープタグ、蛍光色素、ラマンタグ、電子密度の高い試薬、基質、または酵素が含まれ、例えば、酵素結合イムノアッセイにおいて使用されるもの、またはフルオレットにおいて使用される（Rozinov and Nolan (1998) Chem. Biol. 5:713-728）。
詳細な記載についての目次
（Ｉ）ビーズ
（ＩＩ）１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）
（ＩＩＩ）核酸をビーズに連結させる
（ＩＶ）ＤＮＡバーコード
（Ｖ）化合物をビーズに連結させる
（ＶＩ）化学モノマーを互いに連結させて化合物を作製する
（ＶＩＩ）スプリットプール合成およびパラレル合成
（ＶＩＩＩ）ピコウェルを製造する
（ＩＸ）ビーズをピコウェルに堆積させる
（Ｘ）ピコウェル内のビーズ結合核酸を配列決定する
（ＸＩ）ビーズからのビーズ結合化合物を放出する
（ＸＩＩ）化合物の生化学的アッセイ
（ＸＩＩＩ）化合物についての細胞に基づくアッセイ
（ＸＩＶ）細胞の撹乱－応答分析
（Ｉ）ビーズ
本開示の方法および組成物は、モノサイズのＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍ ＮＨ２ビーズ（直径が１０、２０、３０マイクロメートルなど）－、標準なＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）アミノレジン（直径が９０、１３０マイクロメートルなど）、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｍａｃｒｏｂｅａｄｓ（登録商標）（直径が２８０～３２０マイクロメートル）などのビーズを使用する（上記のすべてが、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，７２０７２ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）。これらはポリエチレングリコールを用いて誘導体化されたポリスチレンコアを有する（Paulick et al (2006) J. Comb. Chem. 8:417-426）。ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）レジンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマーである。したがって、本開示は、ＤＮＡバーコードおよび化合物の一方または両方を含むように修飾されたビーズまたはレジンを提供し、ここで、未修飾ビーズは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマーの形態をとる。
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）は、最大２０キロダルトンの分子量の「ＰＥＧ鎖が、官能化され架橋されたポリスチレンに固定化されている」ことによって特徴付けられる。約２０００～３０００ダルトンのＰＥＧ鎖を有するグラフトコポリマーは、動態速度、移動性、膨張およびレジン容量」の点で最適であることが証明されている（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。したがって、本開示は、約２０００～３０００ダルトンのＰＥＧ鎖を有するグラフトコポリマーの形態をとるビーズまたはレジンを提供する。膨張に関して、Ｃｏｍｅｌｌａｓらは、例えば、ＤＣＭ、ＤＭＦ、メチルアルコール、水、または酵素アッセイにおいて使用される緩衝剤に浸漬した場合のビーズの膨張能力を測定するためのガイダンスを提供する（Comellas et al (2009) PLoS ONE. 4:e6222 (12 pages)）。膨張の単位は、ビーズ１グラムあたりのミリリットルである。
代替のビーズの実施形態では、本開示は、ＰＥＧスペーサーがアルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着されるレジンを使用し、レジンは、マイクロスフェア的およびモノサイズである（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍレジン）。
さらに代替のビーズの実施形態では、本開示は、アルキル連結を介してポリスチレン骨格に付着されるＰＥＧスペーサーを有するレジンを使用し、レジンタイプは２つの二官能性種に存在し、第１の表面改質レジンは、ビーズの外表面の反応部位が、ビーズの内部体積の反応部位に対してオルソゴナルに保護されており、第２のハイブリッドレジンは、切断性および非切断性リガンドが、この支持に存在し、連続的な切断用に開発された（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｂレジン）。
さらに、別の実施形態では、本開示は、ＰＥＧスペーサーが、アルキル連結を介してポリスチレン骨格に付着しており、マクロビーズレジンが、非常に大きな粒子径および高容量を示す、レジンを使用する（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ＭＢレジン）。また、本開示は、ＰＥＧスペーサーが、ベンジルエーテル連結を介してポリスチレン骨格に付着されるレジンを使用する。このレジンは、免疫化手順またはＰＥＧ修飾誘導体（ＰＥＧ結合ＰＥＧ修飾化合物）（ＴｅｎｔａＧＥｌ（登録商標）ＰＡＰレジン）についての合成に使用することができる。
さらに、ビーズは、ＨｙｐｏＧｅｌ（登録商標）２００レジンであり得る。これらのレジンは、低架橋ポリスチレンマトリックス（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ＣＨ－９４７１ Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にグラフトされたオリゴエチレングリコール（ＭＷ ２００）の複合材料である。
一部の実施形態では、ＰＥＧリンカーを含まないアミノ官能化ポリスチレンビーズは、例えば、モノサイズのポリスチレンＭ ＮＨ２マイクロビーズ（直径が５、１０、２０マイクロメートルなど、これらもＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、７２０７２ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）が使用され得る。
一部の実施形態では、化合物は、ビーズへの共有結合の付着なしで、ビーズ内の孔またはチャンバーまたはトンネル内にカプセル化され得る。化合物は、様々な手段によってビーズのこのような孔内に拡散または強制され得る。一部の実施形態では、化合物を、拡散によってビーズ内に担持し得る。一部の実施形態では、高温を使用して、ビーズを膨張させ、ビーズ内に化合物を担持し得る。一部の実施形態では、高圧を使用して、化合物をビーズに強制し得る。一部の実施形態では、ビーズを膨張させる溶媒を使用して、ビーズ内に化合物を担持し得る。一部の実施形態では、真空または低圧を使用して、化合物をビーズに分割し得る。一部の実施形態では、穏やかな、または激しい物理的撹拌を使用して、化合物をビーズに担持し得る。
化合物が共有結合の付着なしで、ビーズ上に担持されるこのような実施形態では、化合物は、拡散によってビーズから除去され得る。一部の実施形態では、非限定的な様式で、温度、圧力、溶媒、ｐＨ、塩、緩衝材、もしくは界面活性剤、またはこのような条件の組み合わせを使用して、このようなビーズから化合物を除去し得る。一部の実施形態では、例えば、非架橋重合ビーズによるビーズの物理的完全性を使用して、このようなビーズ内に含まれる化合物を放出し得る。
排他的な実施形態では、本開示は、上記のビーズの１つを含む、任意のビーズ、およびビーズ－化合物複合体、または任意の方法を排除することができる。
本開示のビーズはまた、以下を含む。メリフィールドレジン（クロロメチルポリスチレン）；ＰＡＭレジン（４－ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチルポリスチレン）；ＭＢＨＡレジン（４－メチルベンズヒドリルアミン）；臭素化ワングレジン（アルファ－ブロモプリオピオフェノン）；４－ニトロベンゾフェノンオキシム（Ｋａｉｓｅｒ）レジン；ワングレジン（４ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン；ＰＨＢレジン（ｐ－ヒドロキシベンジルアルコール；ＨＭＰＡレジン（４－ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸）；ＨＭＰＢレジン（４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシルブタン酸）；２－クロロトリチルレジン；４－カルボキシトリチルレジン；リンク酸レジン（４－［（２，４－ジメトキシペヘニル）ヒドロキシメチル）フェノキシメチル）；リンクアミド（ＲＡＭ）レジン「Ｋｎｏｒｒ」レジン（４－（（２，４－ジメチルフェニル）（Ｆｍｏｘ－アミノ）メチル）フェノキシアルキル）；ＰＡＬレジン（５－［４－（Ｆｍｏｃ－アミノ）メチル－３，５－ジメトキシフェノキシ］バレルアミドメチルポリスチレン）；シーバーアミドレジン（９－Ｆｍｏｘ－アミノ－キサンタン－３－イル－オキシメチル）；ＨＭＢＡレジン（ヒドロキシメチル安息香酸）；４－スルファモイルベンゾイルレジン「Ｋｅｎｎｅｒの安全装置」レジン（Ｎ－（４－スルファモイルベンゾイル）アミノメチル－ポリスチレン）；ＦＭＰ－レジン（４－（４－ホルミル－３－メトキシフェノキシ）－エチル）（ChemFiles Resins for Solid-Phase Peptide Synthesis Vol.3(32 pages)(Fluka Chemie GmbH, CH-9471 Buchs, Switzerland)を参照されたい）。
本開示のビーズは、化合物の受動的なカプセル化物質として使用される上記のビーズ（化合物への共有結合的な連結なしに化合物を受動的に保持する）をさらに含み、非官能化ポリスチレンビーズ、シリカビーズ、アルミナビーズ、多孔性ガラスビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、酸化チタンビーズ、アルギン酸ビーズ、セラミックビーズ、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）ビーズ、メラミンビーズ、ゼオライトベッド、ポリラクチドビーズ、デブロックコポリマーミセル、デキストランビーズなどをさらに含む。この段落に列挙されているビーズの多くは、Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ－Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ １０５１６，ＵＳＡなどのベンダーから購入され得る。
ビーズに加えて、小胞または小滴はまた、本開示の一部の実施形態のための化合物を送達するための媒体として使用され得る。脂質、非ブロックコポリマー、トリブロックコポリマーまたは他の膜形成材料を使用して、化合物が担持され得る内部体積が形成され得る。界面活性剤、機械的撹拌、温度、塩、ｐＨまたは他の手段を追加することにより、これらのカプセル化された体積から化合物が放出され得る。油中水滴乳濁液または水中油滴乳濁液は、アッセイ体積に送達され得る化合物を受動的にカプセル化するさらに他の手段である。
受動的カプセル化が化合物を送達するために使用されるすべての実施形態では、ＤＮＡタグは、さらに受動的に担持され得るか、または代替的に、ＤＮＡタグは、ビーズ、小胞、または液滴に共有結合的に付着され得る。
除外的な実施形態では、本開示は、上記の化学物質のいずれかで作製された、または上記の化学物質のいずれか１つの誘導体で作製されたビーズまたはレジンを除外することができる。
実施形態では、ビーズは、球状体であり得、約０．１～１マイクロメートル、約１～５マイクロメートル、約１～１０、約５～１０、約５～２０、約５～３０、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約５０～１００、約５０～２００、約５０～３００、約５０～４００、約１００～２００、約１００～４００、約１００～６００、約１００～８００、約２００～４００、約２００～６００、約２００～８００マイクロメートルなどの直径を有し得る。
上記の値および範囲に関して、定義可能な非球状体ビーズも提供される。例えば、軸の１つ、または一次寸法の１つ（例えば、側面）、または二次寸法の１つ（例えば、対角線）は、上記の範囲の値を含み得る。除外的な実施形態では、本開示は、上記の値または範囲のうちの１つまたは複数に該当する球状体ビーズ（または非球状体ビーズ）を包含する任意の試薬、組成物、システム、または方法を除外することができる。
ビーズの鎖。一実施形態では、提供されるものは、複数のビーズ二量体であり、ビーズ二量体は、互いに付着した２つのビーズの形態をとり、一方のビーズには複数の付着した核酸バーコード（オルソゴナル核酸モジュール、または連結された核酸モジュールのいずれか）が含まれており、もう一方のビーズには複数の付着された化合物が含まれ、すべての化合物は、互いに実質的に関連している（またはすべての化合物が化学構造において互いに実質的に同一である）。ビーズ二量体は、化合物が付着した第１のビーズを調製し、核酸バーコードが付着した第２のビーズを別々に調製して、次に２つのビーズを連結することで合成され得る。一態様において、ビーズは可逆的リンカーによって互いに付着され、別の態様において、ビーズは非可逆的リンカーによって互いに付着される。
ビーズ透過性。実施形態では、本開示は、様々な範囲または程度の透過性を有するビーズを提供する。透過性は、溶媒によって到達可能なビーズの体積のパーセンテージとして測定することができ、測定の単位は、形態もしくは孔をとるビーズの表面のパーセンテージであり、または測定の単位は、ビーズの表面（および外部媒体）と流体連通しているチャネル、ネットワーク、もしくはチャンバーの形態をとるビーズの内部のパーセンテージである。本開示は、多孔性ビーズを包含することができるか、または代替的に、多孔性ビーズを除外することができる。
Ｒｏｔｈｂｅｒｇの米国特許第９，０６２，３０４号は、外部および内部領域を有するビーズを開示する。「内部表面（孔表面）」、「より大きな分子を排除するであろう適切な孔」、任意で「内および外表面の開発した差次的な機能化」、様々な孔径、ポリ（スチレンスルホン酸）およびポリスチレンなどのポリマーが示される。Ｒｏｔｈｂｅｒｇの図１は、ビーズの表面およびビーズの孔の写真を提供する。Ｂｅｄｒｅの米国特許第９，７４５，４３８号は、多孔性ビーズの透過性電子顕微鏡画像を提供する。Ｓｍｉｔｈの米国特許第５，８８８，９３０号は、多孔性ビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真を提供する。表面に小さな孔、および内部に大きな孔を有する球状ビーズが示され、ビーズは、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、セルロース、またはポリウレタンから作製される。Ｃｏｏｋｅの米国特許第５，０４７，４３７号は、スキンレス表面（図１）および表面に外部スキンを有するビーズ（図５）を備えた球状ポリ（アクリロニトリル）コポリマーの孔形態を開示する。Ｔｓａｏの米国特許第４，０９０，０２２号は、セルロースビーズの多孔性開口および内部空間を開示する。
すべての図を含む上記で特定される特許の各々は、それぞれ全体が参照により個々に組み込まれるように、その全体が本明細書に組み込まれる。
いかなる限定も意味することなく、ビーズまたは微粒子の外表面は、ビーズまたは微粒子全体を弾性フィルムでしっかりと包むことによって決定することができる。ビーズもしくは微粒子は、思考実験を介して包むことができるか、または包まれたビーズは、図もしくは写真で描くことができるか、またはビーズは、実際に包むことができる。いかなる限定も意味することなく、ビーズの外表面は、包みに物理的に接触するビーズの部分である。
例えば、本開示は、表面積の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％を占める孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの体積が、ビーズの総体積の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外表面（および外部媒体）と流体連通している。
さらに、本開示は、表面積の１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満を占める孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの体積が、ビーズの総体積の１％未満、２％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外表面（および外部媒体）と流体連通している。
鉄心ビーズ。本開示は、鉄心ビーズまたは磁気ビーズを包含する。これらのビーズは、磁石を用いて操作し、それらを１つの反応容器から別の反応容器に、または１つの容器から別の容器に移動することができる。これらのビーズを使用することにより、ロボット工学による操作を強化することができる。磁気ビーズの製造および使用方法が利用可能である（Szymonifka and Chapman (1994) Tetrahedron Letters. 36:1597-1600, Liu, Qian, Xiao (2011) ACS Comb. Sci. 13:537-546, Alam, Maeda, Sasaki (2000) Bioorg. Med. Chem. 8:465-473）。
除外的な実施形態では、本開示は、任意のビーズまたは任意のビーズの集団を除外することができ、ビーズまたは集団は、上記の値または範囲の一方を満たす。
ビーズへの化合物の担持
多くの実験において、事前に合成された化合物をビーズに担持することが有利であり、ビーズは、化合物をアッセイに送達するための媒体として使用することができる。生物学的検体への薬物送達に使用される標準的な技術の多くは、化合物をアッセイに送達するために適合され得る（Wilczewska et al (2012) Nanoparticles as drug delivery systems. Pharmacological Reports. 64:1020-1037, Kohane DS (2007) Microparticles and nanoparticles for drug delivery. Biotechnol. Bioeng. 96: 203-209, Singh et al (2010) Microencapsulation: A promising technique for controlled drug delivery. Res Pharm Sci. 5: 65-77を参照されたい）。
事前に合成された化合物がビーズに担持されこのような実施形態では、化合物は、従来の９６、３８５、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートに保持され得る。これらのプレートにビーズが添加され得、拡散または他の活性な担持法によって化合物が担持される。好ましい実施形態では、含浸用に選択されたビーズは、母液から除去される際に化合物がすぐに枯渇するのを防ぐ孔サイズまたは浸透形状を有する。ビーズの外部への拡散は、必要に応じて、熱、圧力、添加剤、または他の刺激剤によって強化され得る。一部の実施形態では、化合物を担持したビーズは、外部衝撃によって引き起こされるまで内部内容物の漏出を防ぐ様式でキャップされ得る。多孔性ビーズの外側をキャップする１つの方法は、脂質または両親媒性分子をビーズ化合物溶液に添加して、ビーズの表面に露出したキャビティが両親媒性分子によって形成された二重層によって密封されるようにすることである。一部の実施形態では、事前に形成された小胞は、薬物を担持したビーズと混合され得、その結果、撹拌すると、小胞は破裂し、膜は薬物を担持したビーズの表面上で再形成され、それによってそれらを密封する。このようなビーズの密封を行う方法が記載される（Tanuj Sapra et al (2012) Nature Scientific Reports volume 2, Article No.: 848を参照されたい）。シリカビーズを密封するためのさらなる実験プロトコルは、Sandia Laboratories by Ryan Davis et al, Nanoporous Microbead Supported Bilayers: Stability, Physical Characterization, and Incorporation of Functional Transmembrane Proteins, SAND2007-1560による報告の公表において利用可能であり、ｂＳＵＭ法は、Hui Zheng et al (bSUM: A bead-supported unilamellar membrane system facilitating unidirectional insertion of membrane proteins into giant vesicles) in J. Gen. Physiol. (2016) 147: 77-93に記載される。
事前に合成された化合物を利用する一部の実施形態では、ビーズは、適切な試薬の添加により、例えば、脂質またはジブロックコポリマーを添加し、続いて撹拌することにより、化合物から生成され、それにより、小胞が形成され、それらの内部または二重層膜内に化合物を含む。一部の実施形態では、化合物は、マイクロ流体Ｔ接合部を介して押し出され、油相に水相の液滴を作製し、化合物は、水相内、または水相および油相の間の界面に含まれる。一部の実施形態では、形成された液滴は、さらに重合され、ヒドロゲルを作製するが、取り扱うのに、非重合水性相液滴よりも頑丈で安定している。液滴に基づくカプセル化およびアッセイは、Oliver et al (2013) Droplet Based Microfluidics, SLAS Discovery Volume: 19 issue: 4, page(s): 483-496に開示される。ゾルゲルカプセル化プロセスは、ビーズ内に化合物をカプセル化するためにさらに利用され得る。ゾルゲルビーズの形成は、Sol-gel Encapsulation of Biomolecules and Cells for Medicinal Applications, Xiaolin Wang et al (2015) Current Topics in Medicinal Chemistry. 15: 223に記載される。
１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）
コンビナトリアルライブラリーの製造に使用される方法は、（１）ライブラリーの調製、（２）ライブラリー内の化合物のスクリーニング、（３）化合物の構造、例えば、すべての化合物またはスクリーニングで興味深い結果が提供された化合物のみ構造を決定する３つの工程を含む（Lam et al (1997) The One-Bead-One-Compound Combinatorial Library Method. Chem. Rev. 97:411-448を参照されたい）。ビーズ結合合成を介した化合物の合成の利点は、「スプリットプール」法によって化合物を迅速に作製することができることである。
コード戦略と組み合わせたＯＢＯＣ。ＯＢＯＣの別の特徴は、各ビーズに、化合物だけでなくコード戦略をさらに含むことである。ビーズ結合核酸が、同じビーズと結合している化合物をコードするために使用される場合、用語「コードする」は遺伝コードを指さない。代わりに、用語「コードする」とは、ユーザーが数千の短い核酸配列の各々を単一のビーズ結合化合物と関連付けるレジェンド、キー、またはコードを所有していることを意味する。
核酸が関連化合物をコードする、ビーズ結合化合物およびビーズ結合核酸を有するビーズの使用の劇的な変形形態は、以下のとおりである。劇的な変形形態は、コンジュゲートのライブラリーを製造することであり、ライブラリーの各メンバーは、小分子とＤＮＡ部分とのコンジュゲートの形態をとり、ＤＮＡ部分は、小分子をコードする）。このコンジュゲートは、可溶性であり、ビーズ結合ではない。細胞または精製されたタンパク質でスクリーニングした後、コンジュゲートは、細胞または精製されたタンパク質と結合したままであり、それによりコンジュゲートを単離し、コンジュゲートされた核酸を配列決定することで最終的に化合物を特定することができる（Satz et al (2015) Bioconjugate Chemistry. 26:1623-1632を参照されたい）。
ここでは、本特許文献のほとんどと同様に、用語「コードする」は、遺伝暗号を指すものではなく、その代わりに、研究者が、それに結合する化合物の特定の既知の構造を示すために特定の核酸配列を使用するという事実を指す。
ＤＮＡバーコードの使用などのコード戦略を使用する代わりに、陽性をスクリーニングする（それにより陽性をスクリーニングする化合物を示す）ビーズは、エドマン分解または質量分析に供して、ビーズ結合化合物を特定することができる（Shih et al (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223を参照されたい）。ビーズ結合化合物がペプチドの場合、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して、陽性スクリーニングペプチド化合物の配列を直接的に決定することができる。レーザー照射下で切断およびイオン化が同時に起こるため、直接的な配列決定が可能である（Song, Lam (2003) J. Am. Chem. Soc. 125:6180-6188）。
コンビナトリアルライブラリーのスプリットプール合成を行う際の１つの微細なポイントは、すべての化合物が共通のモチーフを共有するように化合物を製造することができることである。この戦略は、「化合物のライブラリーではなく、モチーフのライブラリーの生成」として記載されている（Sepetov et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.92:5426-5430, Lam et al, 前掲, at 418を参照されたい）。
大きなビーズの典型的な例を提供するために、ビーズは、０．１ｍｍの直径であり、同じ化合物の約１０１３コピーを保持することができる（Lam et al、前掲）。ビーズ結合化合物のライブラリーの調製後、各ビーズは、個々のアッセイで使用することができ、アッセイは、生化学的活性、または代替的に、結合活性を測定する。アッセイは、「ビーズ上」アッセイであるか、または代替的に、化合物をビーズから切り離して、液相アッセイで使用することができる（Lam et al、前掲）。
任意のタイプのビーズのパラメーターは、所定のアッセイ培地で膨張する傾向、ビーズのポリマーは、疎水性であるか、または親水性であるか、各化合物を付着させるためのビーズ上の付着部位のアイデンティティー、ビーズの表面から各化合物をいくらか分離させるためにポリエチレングリコールなどのスペーサーを使用するかどうかの問題、およびビーズの内部体積を含む。
ビーズに化合物を付着させる必要性を考慮するが、ビーズの疎水性表面から遠く離れていることは、Ｌａｍら（前掲）が、ポリオキシエチレングラフト化スチレン（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標））が、官能化可能基がポリオキシエチレン鎖の末端にあり、したがって疎水性ポリスチレンから遠く離れているという利点を有することを開示する。水溶性リンカーを有するビーズには、ＴｅｎｔａＧｅｌ、およびポリジメチルアクリルアミドビーズ（ＰｅｐＳｙｎ（登録商標）ｇｅｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｔｈｗｉｔｃｈ，ＵＫ）が含まれる。
内部体積のパラメーターは利点を提供することができ、ビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物の標的の間の相互作用を防ぐ必要がある。この利点を活用するために、ＤＮＡバーコードがビーズの内側に位置するようにビーズを製造することができ、これに対して、スクリーニングされる化合物はビーズの表面に付着される（Lam et al、前掲、４３８～４３９）。内部体積のこの利点は、ビーズ結合化合物が切断性リンカーによって付着されている場合、および化合物のアッセイが、切断および放出されている化合物に対してのみ行われる場合、無関係であり得る。
Ａｐｐｅｌｌらは、化学ライブラリーを合成し、続いてスクリーニングを行って活性化合物を検出するためのスプリットプール法の非限定的な例を提供する（Appell et al (1996) J. Biomolecular Screening. 1:27-31）。ライブラリービーズは、第１のマイクロウェルプレート、ナノウェルプレート、またはピコウェルプレート上のウェルのアレイにおける各ウェルに１つずつ配置される。ビーズは、ビーズ結合化合物の約５０％を切断するために光に曝露され、ウェル内の溶液に放出される。次に、放出された化合物は、第２のマイクロウェルプレートに移され、活性化合物を含むウェルを検出するためのアッセイを行い、それにより第１のプレートのどのビーズが活性なビーズ結合化合物を含むかを特定する。次に、「活性［化合物］が単一ビーズから特定されると、ビーズが回収されて解読され、したがって、活性化合物の合成履歴および構造が得られる」（Appell et al、前掲）。
ビーズ結合化合物をスクリーニングする細胞系スクリーニングアッセイでは、Ｓｈｉｈらは新しいタイプのビーズを提供する（Shih et al (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223）。この新しいタイプのビーズは、「卵巣がんに指向する合成的な死リガンド」のライブラリーのメンバーであるビーズ結合化合物を含む。ビーズはビオチンでさらに装飾されており、サンドイッチを作製する２つの化学物質がさらに添加され、サンドイッチは細胞とビーズの接着を維持する。サンドイッチは、ストレプトアビジンとビオチン－ＬＸＹ３０複合体とが含まれる。このサンドイッチは、ビーズをＬＸＹ３０の受容体に接続するが、これは偶然、細胞表面上の周知であるタンパク質、すなわち、インテグリンである。Ｓｈｉｈら（前掲）の方法は、がん細胞を殺傷することができる新しい分子（「ＬＬＳ２」）の発見をもたらした。上記の方法では、ビーズ結合化合物を使用し、化合物は、細胞と結合する（化合物が依然としてビーズ結合を介する場合であっても）。Ｃｈｏらは、同様の１つのビーズ、１つの化合物ライブラリーを作製し、スクリーニングされる化合物は、細胞と結合するのに十分であった（上述されるサンドイッチについての任意の必要性なしに）（Cho et al (2013) ACS Combinatorial Science. 15:393-400）。Ｃｈｏらの報告の目的は、がん細胞によって発現されるインテグリンと結合するＲＧＤ含有ペプチドを発見することであった。上記に開示された試薬および方法は、本開示に有用である。
核酸をビーズに連結させる（オルソゴナル式；連結式）
連結されたバーコードおよびオルソゴナルバーコードのトピックを理解する１つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連結されたバーコード化を超えるオルソゴナルバーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、パラレルに付着されるのは、ＤＮＡバーコードモジュールである。連結されたバーコード化では、所定のモジュールの付着が不完全である場合（つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に連結されなかった場合）、完成されたバーコードの配列は、正確ではない。「正確ではない」という表現は、不完全な連結を意味し、完成された正しいＤＮＡバーコードであると想定された小さな塊から欠落し得る塊を意味する。ここで、すべてのモジュールの付着に失敗したため、完成されたバーコード配列は誤りを含む。対照的に、オルソゴナルバーコード化は、各個々のモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、モジュールがビーズ上の所定の部位に付着されると、すでに付着されているモジュールにさらなるモジュールは接続されない。
本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに付着する前に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとることができ、このｄｓＤＮＡは、マイトマイシンＣなどのＤＮＡ架橋剤で処理される。ｄｓＤＮＡ形態のＤＮＡバーコードの合成の完了後、このｄｓＤＮＡはｓｓＤＮＡに変換される。ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの変換は、ＤＮＡ鎖の１つにウラシル（Ｕ）残基を有する場合に有効であり、ウラシル残基の位置でのＤＮＡの切断は、ウラシル－Ｎ－グリコシダーゼによって触媒される（２０１７年９月２５日に出願されたシリアル番号第６２／５６２，９０５号の図５を参照されたい。シリアル番号第６２／５６２，９０５号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、ＤＮＡバーコードを二本鎖ＤＮＡの形態で合成することであり、相互に付着されているＤＮＡバーコードモジュールの各々は、ｄｓＤＮＡの形態をとり、二本鎖の各々は、ＤＮＡヘッドピースを介して安定化される。完成されたＤＮＡバーコードの最終的な配列決定のために、鎖の１つは、ＤＮＡヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物（この化合物が化学ライブラリーのメンバーである場合）を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してＤＮＡバーコードを合成することであり、このＤＮＡバーコードは、ヘアピンの第１の突起がヘアピンの第２の突起にアニールすることで自己組織化する。
合成されるＤＮＡバーコードが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとる場合、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＭＡなどの溶媒は、ＤＮＡバーコードを変性させることができる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
上述されるように、用語「ＤＮＡバーコード」は、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「ＤＮＡバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの１つのみを指すことができる。
ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用し、７－アザ－ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを介してこのｄｓＤＮＡの末端を密封することである。
代替の実施形態では、本方法は、「連結されたＤＮＡバーコード化」および「オルソゴナルＤＮＡバーコード化」の間の中間体を使用することができ、この中間体は、ＤＮＡバーコードのブロックを伴い、すなわち、各ブロックは、２つのＤＮＡモジュールを含むか、または３つのＤＮＡモジュールを含むか、または４つのＤＮＡモジュールを含むか、または５つのＤＮＡモジュールなどを含む（しかし、完全長の化合物を特定するすべてのＤＮＡモジュールは含まれない）。
図１は、連結された構造化ビーズの例示的および非限定的な図を開示する。ビーズは、複数のＤＮＡバーコード（各々がＤＮＡバーコードモジュールで作製される）および複数の化合物（各々が化学ライブラリーモノマーで作製される）を含む。話を簡単にするために、用語「ＤＮＡバーコード」は、「ＤＮＡバーコードモジュール」であるすべての核酸、およびいくつかの機能を提供するすべての核酸を含むポリマーを指すために使用され得る。機能は、配列決定プライマーについてのアニーリング部位にすることができるか、または機能を使用して、ビーズ結合化合物の化学合成の工程を特定することができる。図１は、ビーズ結合化合物をさらに示しており、各化合物は、いくつかの化学ライブラリーメンバーで作製されており、各化学ライブラリーメンバーは、四角形、円形、または三角形で表される。図１は、各ＤＮＡバーコードモジュールに１から８まで連続して付番されることを示しており、これらの番号は、それぞれの８つの形状（四角形、円形、三角形）に対応する。明確にするために、機能を果たす（および任意の特定の化学単位を表さないまたは「コードしない」）核酸は、図には示されない。
図２は、オルソゴナル構造化ビーズの例示的および非限定的な実施形態を開示する。ビーズは、複数のＤＮＡバーコード（各々がＤＮＡバーコードモジュールで作製される）を含むが、各ＤＮＡバーコードモジュールは、ビーズ上の別々の連結部位に付着される。ＤＮＡバーコード全体は、８つのＤＮＡバーコードモジュールからなり、図では、１～８に付番される。特定のＤＮＡバーコードからの情報が読み取られ、同じビーズと結合された化合物を特定するために使用される場合、別々に付着されるＤＮＡバーコードモジュールの各々でＤＮＡ配列決定を行う必要がある。図２において、ビーズは、８つの形状（円形、四角形、三角形）によって示されるように、各々が８つのユニットを有する複数の付着した化合物をさらに含有する。
図２において、明確にするために、各ＤＮＡバーコードモジュールに付着された機能性核酸は示されていない。当然であるが、ＤＮＡバーコードモジュールの各々は、完成された完全長の化合物における化学ライブラリーモノマーの位置を特定する核酸が必要である。図２に示される例では、位置は、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８である必要がある。
一実施形態では、化学モノマーが最初に付着され、次に、対応するＤＮＡバーコードモジュールが付着される。代替的な実施形態では、ＤＮＡバーコードモジュールが最初に付着され、次に、対応する化学モノマーが付着される。また、「一実施形態」を使用することもあれば、「代替的な実施形態」を使用することもある有機合成の手順に従うことができる。さらに別の代替的な実施形態では、本方法は、いくつかのＤＮＡバーコードモジュールのブロックの付着とパラレルに、ビーズに付着したいくつかの化学モノマーのブロックのブロックごとの追加を提供する。
除外的な実施形態では、除外することができるものは、ビーズへの化学モノマー、ＤＮＡバーコードモジュール、または化学モノマーおよびＤＮＡバーコードモジュールの両方のブロックごとの追加を使用した試薬、組成物、および方法である。
これは、ビーズ結合ポリヌクレオチドに存在し得る核酸に関係し、ビーズ結合化合物のモノマーを「コードする」または特定するのに役立つ核酸を含む。除外的な実施形態では、本開示は、「工程特異的ＤＮＡ配列決定プライマー部位」をコードする核酸を除外することができる。この状況では、化合物に存在する化学モノマーごとに、対応するＤＮＡバーコードモジュールが存在する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、少なくとも１つの対応するプライマー結合部位、すなわち、「工程特異的ＤＮＡ配列決定プライマー部位」が隣接する。また、除外することができるのは、工程１、工程２、工程３、または工程４などの、化合物の化学合成における特定の工程をコードするかまたは指定する核酸である。
さらに、本開示は、スペーサーとして機能する核酸を含み得る。例えば、スペーサーは、配列決定プライマーのアニーリング部位である第１の部位および化学モノマーを特定する第２の部位の間に、ポリヌクレオチド鎖に沿った距離を作製することができる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を使用することができる。また、本開示は、ＰＣＲプライマー結合部位をコードする核酸を使用することができる。ＰＣＲプライマー結合部位を有するポリヌクレオチドは２つのＰＣＲプライマー結合部位を有し、これらの部位の両方が同じ融点（ＰＣＲプライマーがＰＣＲプライマー結合部位にアニーリングする場合の融点）を有するように設計されているため、ＰＣＲプライマー結合部位は、配列決定プライマーと区別することができる。
除外的な実施形態では、本開示は、スペーサーとして、または単独のスペーサーとして機能する核酸を除外することができる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を除外することができる。さらに、本開示は、ＰＣＲプライマー結合部位として機能する核酸を除外することができ、ＰＣＲプライマーではないプライマーのための結合部位として機能する核酸を除外することができる。
追加的に、本開示は、化学ライブラリーが作製された日付を特定する、または特定の化合物の化学合成における工程を特定する、またはプライマーアニーリング配列として機能する核酸を除外することができる。
特定のＤＮＡバーコードモジュールに対する配列決定プライマーの提供。本開示は、ＤＮＡバーコードモジュールおよび１つまたは複数の配列決定プライマーアニーリング部位を含むＤＮＡバーコードを提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、それ独自の専用の配列決定プライマー結合部位を有し得る。代替的に、ビーズ結合ＤＮＡバーコード上に存在し得るように、１つの特定の配列決定プライマー結合部位を使用して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の連続したＤＮＡバーコードモジュールが配列決定され得る。
以下に、各ＤＮＡバーコードモジュールが、それ独自の専用の配列決定プライマー結合部位を有する状況を記載する。本開示は、ＤＮＡ配列決定プライマーに結合することが可能なプライマー結合部位を含むビーズ結合した連結されたバーコードを提供し、前記プライマー結合部位は、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第４のＤＮＡバーコードモジュール、第５のＤＮＡバーコードモジュール、および第６のＤＮＡバーコードモジュールのうちの１つまたは複数の配列決定を方向付けることが可能であり、プライマー結合部位は、第１のＤＮＡバーコードモジュールおよびプライマー結合部位の間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第１のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第２のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第３のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第４のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第５のＤＮＡバーコードモジュールの３プライム、または間に他のＤＮＡバーコードモジュールを有しない第６のＤＮＡバーコードモジュールの３プライムに位置する。
コード配列およびコード配列に相補的な配列。本開示は、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてを包含することができる。除外的な実施形態では、除外することができるものは、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてである。また、本文書の上述または他の場所に記載されるコード配列のいずれか１つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてをコードする二本鎖核酸をさらに含むことができる、または除外することができる。
オルソゴナル式ＤＮＡバーコード（各ＤＮＡバーコードモジュールがビーズ上の別々の位置に付着される）
オルソゴナル式ビーズの合成。オルソゴナル合成では、各ＤＮＡモジュールが、ビーズ上の別々の部位に共有結合的に付着され、その結果、ＤＮＡバーコード全体が複数のＤＮＡモジュールによって提供される。ＤＮＡバーコードがオルソゴナル構造を有する場合、ＤＮＡバーコードモジュールは、相互に付着されておらず、代わりに、ＤＮＡバーコード分子の各々すべては、その特定のＤＮＡバーコードモジュール専用のそれ独自のビーズ付着部位を有する。
各ＤＮＡバーコードモジュールの合成工程数を特定する核酸。実施形態では、オルソゴナルＤＮＡバーコードは、化合物合成の第１の工程を特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第１の化学モノマーおよび第１のＤＮＡバーコードモジュールのパラレルな付着より、第１のＤＮＡバーコードモジュールは、実際には、［第１のＤＮＡバーコードモジュール］に接続された［「工程１」を意味する短い核酸］の２つの核酸のこの複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、配列決定アッセイで読み取ることができるが、第１の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第１のＤＮＡバーコードモジュールに必要に応じて付着されてもよい。
以下は、オルソゴナルＤＮＡバーコードの上記の記載の続きである。オルソゴナルＤＮＡバーコードは、化合物合成の第２の工程を特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第２の化学モノマーおよび第２のＤＮＡバーコードモジュールのパラレルな付着より、第２のＤＮＡバーコードモジュールは、実際には、［第２のＤＮＡバーコードモジュール］に接続された［「工程２」を意味する短い核酸］の２つの核酸の複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、配列決定アッセイで読み取ることができるが、第２の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第２のＤＮＡバーコードモジュールに必要に応じて付着されてもよい。
上述される方法は、任意の所定のビーズについて、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、および最後のＤＮＡバーコードモジュールならびに最後の化学モノマーまで繰り返される。上記の方法は、スプリットプール合成を使用して、ビーズ結合したＤＮＡバーコードおよび化合物を作製する場合に使用することができる。
オルソゴナル構造は、連結された構造を超えて次の利点を提供する。連結合成（すべてのＤＮＡバーコードモジュールが１つの連続したポリマーで相互に付着されている）の場合、中間体連結工程のいずれかの合成の達成を失敗すると、最終的に完成された連結されたＤＮＡバーコードの意味が損なわれる可能性がある。対照的に、オルソゴナル合成（ビーズ上の専用サイトに付着された各々すべてのＤＮＡバーコードモジュール）では、ＤＮＡバーコードモジュールのいずれかの付着に失敗した場合、ビーズ上の付着部位が空になるだけの結果となり、他の付着されたＤＮＡバーコードモジュールのいずれの意味も損なわれない。好ましい実施形態では、各付着されたＤＮＡバーコードモジュールは、付着された第２の核酸を含み、この第２の核酸は、工程（ＤＮＡバーコードおよび化合物のパラレル合成中の工程）を特定する。
オルソゴナル合成の場合、ビーズ上のすべての付着部位を使い切ることが許容される（成長する化学ライブラリーメンバーを付着するための部位）。しかしながら、オルソゴナル合成の場合、化学反応は、多くのＤＮＡバーコードモジュールの第１の付着により、ビーズ上の付着部位の集団全体が部分的にしか使用されないように設計する必要がある。以下は、オルソゴナルバーコードの化学合成中に部位を使い切る任意の限定を提供する。非修飾ビーズの場合、ＤＮＡバーコードモジュールを付着するために使用可能な部位の総数は１００％である。
オルソゴナル構成ビーズの合成（第１のＤＮＡバーコードに関して）による、所定のビーズ上の付着部位を使い切る程度。以下は、第１のＤＮＡバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態では、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、ビーズ上のＤＮＡバーコード付着部位の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％が使い切られる。他の実施形態では、ビーズ上のＤＮＡバーコード付着部位の約２％未満、約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が使い切られる。さらに他の実施形態では、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、ＤＮＡバーコード付着部位の２～４％の間、２～６％の間、２～８％の間、２～１０％の間、２～１２％の間、２～１４％の間、２～１６％の間、２～１８％の間、２～２０％の間、１０～２０％の間、１０～２５％の間、１０～３０％の間、１０～３５％の間、１０～４０％の間が使い切られる。
限定については、特定のＤＮＡバーコードを構成する最後のＤＮＡバーコードモジュールを付着すると、部位の２０％未満が使い切られ、部位の３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、９５％未満、または９８％未満が使い切られる。
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
以下は、各々がＤＮＡバーコードである１つまたは複数の核酸を含むポリマー、および２つ以上の核酸を含むポリマーに関するものであり、いくつかの核酸は、プライマーアニーリング部位またはスペーサーとして機能するなどの生化学的機能を有し、他の核酸は、情報機能を有し、ＤＮＡバーコードである。除外的な実施形態では、本開示は、ソラレンなどのＤＮＡ架橋剤を含むＤＮＡバーコードを除外することができる。また、除外することができるものは、ＤＮＡバーコードモジュールよりも高い融解温度（または低い融解温度）のプライマー結合領域を有するＤＮＡバーコードである。この温度は、単に「より高く」または「より低く」することができるか、または、少なくとも２℃高く、少なくとも４℃高く、少なくとも６℃高く、少なくとも８℃高く、もしくは少なくとも２℃低く、少なくとも４℃低く、少なくとも６℃低く、少なくとも８℃低くすることができる。
また、除外することができるものは、ＤＮＡリガーゼを使用したＤＮＡバーコードを作製する方法である。また、除外することができるのは、ヘアピン（ｓｓＤＮＡがループ状に屈曲し、ｓｓＤＮＡの一部が同じｓｓＤＮＡの別の部分とハイブリダイズする）を構成するＤＮＡバーコードおよび方法である。さらに、除外することができるのは、核酸ヘアピンを含む組成物であり、核酸ヘアピンは、例えば、化学リンカーで共有結合的に閉じられている。追加的に、除外することができるのは、「ヘッドピース」に直接的、または「ヘッドピース」に間接的（ＤＮＡバーコードおよびヘッドピースの間に存在する１つまたは複数の化学物質への共有結合を介して間接的に）のどちらかで共有結合的に連結されているＤＮＡバーコードである。
他の除外的な実施形態では、除外することができるものは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードであり、完成されたＤＮＡバーコードは、任意の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含まず、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のみを含む。
オルソゴナル構成ビーズの合成（第２のＤＮＡバーコードに関して）による、所定のビーズ上の付着部位を使い切る程度。以下は、第２のＤＮＡバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態では、第２のＤＮＡバーコードモジュールの付着により（オルソゴナル構成ビーズの作製の場合）、ビーズ上の残存する自由なＤＮＡバーコード付着部位の約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％が使い切られる。他の実施形態では、ビーズ上の残存する自由なＤＮＡバーコード付着部位の約５％未満、約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、または約５０％未満が使い切られる。さらに他の実施形態では、第１のＤＮＡバーコードモジュールの付着により、残存する遊離ＤＮＡバーコード付着部位の２～４％の間、２～６％の間、２～８％の間、２～１０％の間、２～１２％の間、２～１４％の間、２～１６％の間、２～１８％の間、２～２０％の間、１０～２０％の間、１０～２５％の間、１０～３０％の間、１０～３５％の間、１０～４０％の間が使い切られる。
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
上記の実施形態は、上記の除外的な実施形態と同様に、第３のＤＮＡモジュールバーコードを付着することを伴う、または第４のＤＮＡモジュールバーコードを付着することを伴う、または第５のＤＮＡバーコードモジュールを付着することを伴う方法などにも適用することができる。
連結式ＤＮＡバーコード（すべてのＤＮＡバーコードモジュールは１つの鎖またはポリマーに存在し、鎖またはポリマー全体がビーズ上の１つの位置に付着される）。
ビーズ結合連結式ＤＮＡバーコードの合成。本開示は、ビーズ結合連結式ＤＮＡバーコードを提供し、ビーズは、複数の連結式ＤＮＡバーコードを含み、複数の連結式ＤＮＡバーコードのほとんどまたはほとんどすべては、本質的に同じ構造を有する。連結式ＤＮＡバーコードは、１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールを含むことができ、ＤＮＡバーコード全体に沿ったこれらのＤＮＡバーコードモジュール（ビーズ付着末端から遠位末端への）の順序は、ビーズ結合連結式ＤＮＡバーコードが合成される時間と同じ順序をとる。また、ＤＮＡバーコード全体に沿ったこれらのＤＮＡバーコードモジュールの順序は、対応する化学ライブラリーモノマーが成長するビーズ結合化合物に連結される時間と同じ順序をとる。
連結式ＤＮＡバーコードは、この順序で、連結式ＤＮＡバーコード全体をビーズに連結するために使用されるリンカーを含むことができる。また、それは、この順序で、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、および第３のアニーリング部位を含むことができる。
ビーズ結合ＤＮＡバーコード内の配列決定プライマーをハイブリダイズする部位の１つの順序。配列決定プライマーをハイブリダイズする部位の実施形態では、連結式ＤＮＡバーコードは、この順序で、リンカー、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１のアニーリング部位、第１の配列決定プライマー結合部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２のアニーリング部位、第２の配列決定プライマー結合部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３のアニーリング部位、第３の配列プライマー結合部位などを含むことができる。
ビーズ結合ＤＮＡバーコード内で発生する、配列決定プライマーをハイブリダイズする部位の別の順序。別の配列決定プライマーをハイブリダイズする部位の実施形態では、連結式ＤＮＡバーコードは、この順序で、リンカー、第１のＤＮＡバーコードモジュール、第１の配列決定プライマー結合部位、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、第２の配列決定プライマー結合部位、第２のアニーリング部位、第３のＤＮＡバーコードモジュール、第３の配列決定プライマー結合部位、第３のアニーリング部位などを含むことができる。
用語「アニーリング部位」。用語「アニーリング部位」は、スプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）の一部であるアニーリング部位を指し、また、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上に存在する対応するビーズ結合アニーリング部位を指すためにも使用される。当業者は、スプリントオリゴ上の「アニーリング部位」が、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上の対応する「アニーリング部位」と同じＤＮＡ配列を有しないことを理解する。換言すれば、当業者は、１つの配列が、他の配列に相補的であることを理解する。したがって、ここでの記載では、両方のアニーリング部位が同じ名前を有することは重要ではない。換言すれば、スプリントオリゴ上の第２のアニーリング部位が、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコード上の第２のアニーリング部位にハイブリダイズするものとして開示されることは重要ではない。
ブロックでの合成。代替的な実施形態では、成長する化合物および成長するＤＮＡバーコードモジュールの配列は、ブロックで合成することができる。例えば、２化学ライブラリー単位で構成されるブロックは、対応する２－ＤＮＡバーコードモジュールで構成されるブロックの付着とパラレルに、ビーズに付着させることができる。同様に、３化学ライブラリー単位で構成されるブロックは、対応する３－ＤＮＡバーコードで構成されるブロックの付着とパラレルに、ビーズに付着させることができる。４個のブロック、５個のブロック、６個のブロック、７個のブロック、８個のブロック、９個のブロック、１０個のブロックなどを伴うブロック合成も提供される。これらのブロック転移の実施形態の各々は、本開示によって除外することもできる。ＤＮＡバーコードモノマーのブロックごとの転移は、オルソゴナルに行うことができ、ＤＮＡバーコードモノマーの連続するブロックの各々を受け取るための固有の付着ポイントを有する。代替的に、ＤＮＡバーコードモノマーのブロックごとの転移を行って、コンカテマー構造を生成することもできる（すべてのＤＮＡバーコードモジュールは、１つの連続した直鎖状ポリマーとしてのみ発生する）。
また、ビーズ結合ＤＮＡバーコードおよびビーズ結合化合物をパラレルにスプリットプール合成する間、ブロックでの合成が発生する可能性がある。ブロックは、２つ以上の化学ライブラリーモノマーの形態をとることができ、ブロックは、２つ以上のＤＮＡバーコードモジュールの形態をとることができる。
スプリットプール合成の位置。スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合した連結されたＤＮＡバーコードのパラレル合成に使用することができる。また、スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合オルソゴナルＤＮＡバーコードのパラレル合成に使用することができる。連結されたＤＮＡバーコードは、「スプリントオリゴ」法によって作製することができる。代替的に、連結されたＤＮＡバーコードは、クリックケミストリーによって作製することもできる。また、「スプリントオリゴ」法およびクリックケミストリーを組み合わせて使用することもできる。スプリットプール合成は、９６ウェルプレートで行うことができ、各ウェルは、０．２５マイクロメートルのフィルターで作製された床を有する。通常の重力条件下では、水溶液は、このフィルターを通過しない。しかしながら、例えば、第１の水溶液を第２の水溶液で置き換える必要がある場合、吸引を適用して、９６ウェルのすべてから任意の水溶液を除去することができる。この吸引法は、ビーズが第１の試薬セットに曝露された場合、または第１の試薬セットを洗い流す必要がある場合、またはだい１の試薬セットを第２の試薬セットで置き換える必要がある場合に使用される。マニホールドは、９６ウェルプレートを保持するために使用され（Ｒｅｓｐｒｅｐ ＶＭ－９６マニホールド）、ポンプを使用してすべてのフィルターの底部から流体を引き出すことができる（ＢＵＣＨＩ Ｖａｃ Ｖ－５００ポンプ）。フィルター底部を有する９６ウェルプレートは、ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６ウェル、３５０μＬ、０．４５ｕｍ、ＲＥＦ ８０４８（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｍｕｌｔｉ－Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）であった。
プライマーアニーリング部位からＤＮＡバーコードモジュールまでの距離。ビーズ結合ＤＮＡバーコードを配列決定する目的、すなわち、ＤＮＡバーコードを形成するすべてのＤＮＡバーコードモジュールを配列決定する目的で、配列決定プライマーのアニーリング部位である第１の核酸を含むポリヌクレオチド、およびＤＮＡバーコードモジュールである第２の核酸、第１の核酸は、第２の核酸のすぐ上流にあり得る。代替的に、第１の核酸は、第２の核酸の上流であり得、第１および第２の核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチドによって、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、または約１５ヌクレオチドによって互いに分離される。分離は、単にスペーサーとして機能する核酸を用いることができるか、または代替的に、分離は、有機合成の多段階経路における工程数、または化合物のクラスの名称、またはビーズ結合化合物で処置することができる可能性のある疾患、または日付、またはロット番号などの情報をコードする第３の核酸を用いることができる。
クリックケミストリーを使用するビーズ結合した連結されたＤＮＡバーコードの合成
クリックケミストリーは、ＤＮＡバーコードの段階的な合成に使用することができる。ここで、連結することができるものは、ビーズに直接的に結合された第１のＤＮＡバーコードモジュール、またはビーズ結合リンカーに結合された第１のＤＮＡバーコードモジュールである。
また、連結することができるものは、第１の配列決定プライマー結合部位である第２の核酸に付着した、第１のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。この配列決定プライマー結合部位により、オペレーターは第１のＤＮＡバーコードモジュールの配列を決定することができる。
別の例を提供するために、連結することができるものは、ビーズ結合した第１のＤＮＡバーコードモジュールに直接的に結合された第２のＤＮＡバーコードモジュールである。代替的に、連結することができるものは、第２の配列決定プライマー結合部位である第２の核酸に付着した、第２のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。この配列決定プライマー結合部位により、オペレーターは第２のＤＮＡバーコードモジュールの配列を決定することができる。第１のＤＮＡバーコードモジュールへのリードスルーがある場合、決定することができるのは、これらのＤＮＡバーコードモジュールの両方の配列である。
さらに別の例を提供するために、連結することができるものは、第１のＤＮＡバーコードモジュールである第１の核酸、およびＤＮＡバーコードおよび化合物の多段階パラレル合成における工程を特定する第２の核酸を含むポリヌクレオチドである。さらに、または代替的に、第２の核酸は、スプリットプール合成によって作製される化合物の一般的なクラスを特定することができる。さらに、または代替的に、第２の核酸は、スクリーニングされる化合物によって処置される疾患を特定することができる。さらに、第２の核酸は、日付または化学者の名前などを特定することができる。
ＤＮＡバーコードを合成するための好ましい方法を以下に示し、各ＤＮＡバーコードモジュールを徐々に付着させる、同じ反応サイクルを使用する。
工程１．ＴＣＯ基が付着されたビーズを提供する。実際には、ビーズは、数百または数千の同様に付着されたＴＣＯ基を有し、各ＴＣＯ基は、ビーズ上の異なる部位に付着される。また、実際には、スプリットプール法を使用し、クリックケミストリーにより多数のビーズを同時に修飾する。
工程２．［テトラジン］－［第１のＤＮＡバーコードモジュール］－［アジド］をビーズに添加し、ＴＣＯ基をテトラジン群と縮合させる。結果は、以下の構築物である：ＢＥＡＤ－ＴＣＯ－テトラジン－第１のＤＮＡバーコードモジュール－アジド。実際には、この構築物は任意のＴＣＯまたはテトラジンは含まれないが、代わりに、ＴＣＯがテトラジンと縮合した際に生成される縮合生成物が含まれる。
工程３．任意の洗浄。
工程４．アジドをキャップし、ＴＣＯ末端を作製するためにＤＢＣＯ－ＴＣＯを添加する。結果は以下の構造である：
ＢＥＡＤ－ＴＣＯ－テトラジン－第１のＤＮＡバーコードモジュール－アジド－ＤＢＣＯ－ＴＣＯ
工程５．任意の洗浄。
工程６．第２のＤＮＡバーコードモジュールを付着する以下の試薬を添加する。付着は、成長するＤＮＡバーコードの遠位末端にする。試薬は：
ビーズに対して［テトラジン］－［第２のＤＮＡバーコードモジュール］－［アジド］であり、ＴＣＯ基をテトラジン群と縮合させる。結果は、以下の構築物である：
ＢＥＡＤ－ＴＣＯ－テトラジン－第１のＤＮＡバーコードモジュール－アジド－ＤＢＣＯ－ＴＣＯ－［テトラジン］－［第２のＤＮＡバーコードモジュール］－［アジド］
上記のスキームは、より多くのＤＮＡバーコードモジュールを段階的に添加するための一連の工程を含み、これらの添加は、より多くの化学モノマーの添加とパラレルにある。他で述べたように、この「パラレル」合成は、化学モノマーを付着した後、そのモノマーを特定するＤＮＡバーコードモジュールを付着するか、あるいは、ＤＮＡバーコードモジュールを付着した後、その特定の化学モノマーによって特定される化学モノマーを付着することを伴うことができる。
ＤＮＡバーコードのクリックケミストリー合成のための化合物
図１７は、ＤＮＡバーコードモジュール、最終的にはＤＮＡバーコード全体の合成中にデオキシシチジン残基（ｄＣ）を接続するのに適した化合物の化学合成を開示する。出発物質は、Ｎ４－アセチル－２’－デオキシ－５’－Ｏ－ＤＭＴシチジンである。「ＤＭＴ」という略称は、４，４－ジメトキシトリチルを表す。この有機合成の多段階経路の最終生成物は、シトシン部分、三リン酸基、およびリボース基の３’位置に付着しているプロパルギル基を有する。プロパルギル基は、クリックケミストリーに使用され、アジド基と縮合して共有結合を生成する。縮合後の結果は、残った化学物質（核酸において自然には決して存在しない）が、実行されているクリックケミストリーからの「痕跡」として発生することである。利用可能なのは、クリックケミストリーによって作製されたＤＮＡバーコードの合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）について使用することができるＤＮＡポリメラーゼであり、ＤＮＡポリメラーゼは、痕跡をわたって移動することができ、痕跡は、配列決定のエラーを引き起こさない。ＴＢＡＩは、ヨウ化テトラブチルアンモニウムである。
連結構成ＤＮＡバーコードの合成
以下の記載では、ＤＮＡバーコードを作製するために、ＤＮＡバーコードモジュールが一列に組み立てられている。しかしながら、以下に示すテキスト中の図では、テキスト中の図をページに合わせるために、「ＤＮＡバーコードモジュール」の代わりに用語「ＤＮＡバーコード」が使用される。図７は、ここに示されるのと同じ工程を示すが、ビーズの図などの詳細が追加される。各追加のＤＮＡバーコードモジュールを追加するために、繰り返される一連の反応を使用することができる。
ＤＮＡヘアピンをコードする末端核酸を含むＤＮＡバーコードを作製するオプション。これは、３プライム末端において、配列決定プライマーのアニーリング部位を有する核酸、塩基対でない約４塩基の形態をとる屈曲、および配列決定プライマーのアニーリング部位の周りを曲がって塩基対を形成することが可能な配列決定プライマーを含むＤＮＡバーコードに関係する。繰り返すが、配列決定プライマーは、配列決定プライマーのアニーリング部位にアニーリングし、実際の配列決定反応は、アニールされた配列決定プライマーの３’末端から開始する。
ＤＮＡバーコードを合成する最終的な工程を行う時、および最終的なＤＮＡバーコードモジュールを成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに連結する場合、「スプリントオリゴ」は、ＤＮＡヘアピンを包括する配列を含むことができる（ＤＮＡヘアピンは、この順序で、配列決定プライマーのアニーリング部位、相互にまたは任意の塩基の近くの配列と塩基対でない、いくつかのヌクレオチド、および配列決定プライマーを含む）。「スプリントオリゴ」をアニーリングした後、次にＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを添加し、重合は、成長するＤＮＡバーコードの３’末端で起こり、スプリントオリゴを鋳型として使用して重合するものは、次の順序で、（１）配列決定プライマーのアニーリング部位、（２）互いに塩基対を形成しない４つまたは５つのデオキシリボヌクレオチドの形態をとるヘアピンにおける屈曲、（３）配列決定プライマーである。
ヘアピン配列決定プライマーの３’末端にある可逆的ターミネーター基。本開示は、ヌクレオチド／可逆的ターミネーター基の予め形成された複合体を、アニールされた配列決定プライマーの３’末端に付着させるための試薬、組成物、および方法を提供する。可逆的ターミネーター基は、ヘアピン配列決定プライマーの任意の成分であり、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である。
工程１．最初に、ピコウェル内にビーズが配置され、ビーズは、連結したポリヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドの５’末端は、任意でリンカーを用いてビーズに連結される。図７は、ビーズ結合ポリヌクレオチドが、第１のＤＮＡバーコードおよび第１のアニーリング部位を含むことを示す。リンカーは、核酸から作製することができるか、またはそれは、いくつかの他のものから化学的に作製することができる。好ましくは、リンカーは疎水性であり、好ましくは、リンカーは、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードを疎水性ポリスチレンビーズ、例えば、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズから分離する。
表記の便宜上、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である第１のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第１のアニーリング部位は、同じ塩基の配列を有しないが、どちらも「第１のアニーリング部位」と称される（代わりに、塩基の配列は互いに相補的であり、その結果、スプリントオリゴは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの第１のアニーリング部位にハイブリダイズすることができ、したがって、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型として機能し、スプリントオリゴ上にあるものをコピーすることにより、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを伸長する。
また、表記の便宜上、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部である第２のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第２のアニーリング部位は、同じ配列を有しないが（しかし、代わりに相補的な塩基を有する）、どちらも「第２のアニーリング部位」と称される。
５’末端から３’末端までのビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、以下の順序で核酸を含み得る：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
代替的に、５’末端から３’末端までのビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、工程数をコードする核酸を含み得、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、以下の順序で、核酸を有する：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／工程数をコードする核酸／第１のアニーリング部位／
代替的に、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードは、以下に示すように、機能性核酸（配列決定プライマーアニーリング部位）である核酸を含むことができる：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／配列決定プライマーアニーリング部位／第１のアニーリング部位／
これらのテキスト中の図に示されていないものは、ビーズへのＤＮＡバーコードの連結を媒介する任意のリンカーである。リンカーは、核酸の形態をとることができるか、またはいくつかの他の有機化学物質で作製することができる。
工程２．可溶性スプリントオリゴヌクレオチド（スプリントオリゴ）を添加し、このスプリントオリゴは、第１のアニーリング部位、第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位で構成される。
図７はまた、ハイブリダイズされたスプリントオリゴが鋳型として使用される工程を示しており、ＤＮＡポリメラーゼは、第２のＤＮＡバーコードモジュール、および第２のアニーリング部位のビーズ結合成長ＤＮＡバーコードへの付着を触媒する。図７は、ＤＮＡポリメラーゼがスプリントオリゴを鋳型として使用して触媒作用を及ぼし、その結果、ビーズ結合ＤＮＡバーコードが少し長く成長する（第２のＤＮＡバーコードおよび第２のアニーリング部位の共有結合的な付着による成長）酵素生成物を示す。テキストのすぐ下に示されているのは、ビーズ結合成長ＤＮＡバーコードにハイブリダイズしたスプリントオリゴの複合体である：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
図７に示されているいくつかの情報を繰り返すと、すぐ下に示されているのは、スプリントオリゴである：
「第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位」
工程３．ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを添加して、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを伸長する。以下は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードであり、スプリントオリゴは、依然としてハイブリダイズされ、「第２のＤＮＡバーコードモジュール」である核酸および「第２のアニーリング部位」である核酸が付着されているため、ビーズ結合成長バーコードは以前より長くなる。図７はさらにこの工程を示す。スプリントオリゴは、ビーズ結合成長バーコードの下に表示される：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
工程４．スプリントオリゴを洗浄する。スプリントオリゴは、加熱することにより、すなわち、ピコウェルプレート全体を、例えば、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃に約１０分間加熱することによりビーズ結合成長バーコードから解離するように促すことができ、または、代替的に、希釈ＮａＯＨをピコウェルアレイに添加して中和する。
工程５．第２のスプリントオリゴを添加し、これは、ビーズ結合成長スプリントオリゴにハイブリダイズした後、第３のＤＮＡバーコードおよび第３のアニーリング部位のＤＮＡポリメラーゼ触媒による付着を媒介するための鋳型として使用することができる。第２のスプリントオリゴは、可溶性試薬であり、以下に示される（しかし、図７には示されない）：
第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位／
工程６．このオリゴヌクレオチドが、対応するビーズ結合した「第２のアニーリング部位」にアニーリングすることができるようにし、ＤＮＡポリメラーゼがビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長することができるようにし、これにより、以下の補足物を含む：「第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位／」
工程７．第２のスプリントオリゴを洗浄する。
工程４．以下のスプリントオリゴを添加する（この特定の添加は図７には示されない）。
第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位／
この可溶性オリゴヌクレオチドは、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの「第３のアニーリング部位」にアニーリングすることができる核酸を有する。アニールすると、４つのｄＮＴＰを有するＤＮＡポリメラーゼが利用され、ビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長して、さらに別のＤＮＡバーコードモジュール（第４のＤＮＡバーコード）をコードするために使用される。上記の工程のサイクルは、化合物のライブラリーおよび関連するＤＮＡバーコードをパラレルに作製するスプリットプール手順全体で繰り返され、各ＤＮＡバーコードは、所定の化合物に関連付けされる（各ＤＮＡバーコードは、関連する化合物の化学合成の履歴を通知する）。化合物のライブラリーの化学合成が完了されている場合、上記の工程のサイクルが停止される。完成されたビーズ結合ＤＮＡバーコード化学ライブラリーを制御して、次にビーズは、ピコウェルアレイのピコウェルに分配することができる。
各ビーズのＤＮＡバーコードはまた、各ピコウェルに関連付けられたＤＮＡバーコードを構成する。ＤＮＡバーコードは、ビーズ結合化合物の特定を可能にし得る。本開示の配列決定法は、ビーズが依然としてピコウェル内にある間にピコウェル内で行われる。除外的な実施形態では、本開示は、任意の配列決定法を除外することができ、配列決定に使用される任意の試薬を除外することができ、配列決定は、ビーズ結合したＤＮＡ鋳型では行われず、または配列決定は、ピコウェル内に配置されたビーズ結合ＤＮＡ鋳型では行われない。
配列決定プライマーのアニーリング部位。一実施形態では、完成されたＤＮＡバーコード内の各ＤＮＡバーコードモジュールは、独自の配列決定プライマーのアニーリング部位と機能的に連結され、同部位とインフレームであり、したがって、オペレーターに各ＤＮＡバーコードモジュール上で別々の配列決定手順を行う能力を提供する（この実施形態では、各ＤＮＡバーコードモジュールは、ＤＮＡバーコード全体の合成の工程を特定する（コードする）独自の核酸とも機能的に連結されていることが好ましい）。
別の実施形態では、各ＤＮＡバーコードは、１つのみの配列決定プライマーのアニーリング部位を有し、これは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの３’末端またはその近くに配置することができ、配列決定プライマー自体は可溶性であり、ピコウェルに添加され、次に配列決定プライマーのアニーリング部位にハイブリダイズすることができる。代替的に、配列決定プライマーが、ＤＮＡヘアピンの一部である場合、このＤＮＡヘアピンは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを作製する最終的な工程で「スプリントオリゴ」を介して添加される。図７には、配列決定プライマーのアニーリング部位が示されない。
核酸の３’末端を介してビーズに連結させた核酸
本発明で開示される様々な実施形態は、ＤＮＡの５’末端を介してＤＮＡをビーズに連結することに関するが、他の実施形態では、ＤＮＡバーコードまたはＤＮＡタグなどのＤＮＡは、それらの３’末端を介してビーズに連結され得る。ＤＮＡの３’ヒドロキシル基は、特定の化学合成条件下（例えば、光延変換）で反応する可能性があり、３’末端が損傷し、伸長、連結、または他の工程に関与することができなくなる。したがって、ＤＮＡタグは、３’末端を介してビーズに付着し、不要な化学反応を防ぎ、ＤＮＡバーコードへの損傷を防ぎ得る。
本開示のビーズ結合ＤＮＡバーコードに関する除外的な実施形態。除外することができるのは、任意のビーズ、微粒子、マイクロスフェア、レジン、またはポリマー組成物であり、連結されたＤＮＡバーコードは、光切断性リンカーまたは切断性リンカーを介してビーズに連結される。
除外することができるのは、任意のビーズ、微粒子、マイクロスフェア、レジン、またはポリマー組成物であり、以下の（１）ビーズ上の第１の位置に連結された連結されたＤＮＡバーコード、（２）ビーズ上の第２の位置に連結され、第１の位置が第２の位置と同じではない化合物の両方を含まない。好ましい実施形態では、この「化合物」は、複数の化学ライブラリーモノマーで作製される。
除外することができるのは、任意のビーズ、微粒子、マイクロスフェア、レジン、またはポリマー組成物であり、ここで、外表面（または複数の外表面）および内表面（または複数の内表面、または複数の内部領域）を有さず、ビーズは、ビーズに連結された少なくとも１０，０００の実質的に同一の連結されたＤＮＡバーコードを含まず、少なくとも１０，０００の実質的に同一の連結されたＤＮＡバーコードの少なくとも９０％は、外表面に連結される。換言すると、除外することができるのは、連結された連結されたＤＮＡバーコードの少なくとも９０％が、外表面に連結されていない任意のビーズである。
除外することができるのは、実質的にポリアクリルアミドで作製された、または任意のポリアクリルアミドを含む任意のビーズ、微粒子、マイクロスフェア、レジン、またはポリマー組成物である。
除外することできるのは、任意のビーズ、微粒子、マイクロスフェア、ヒドロゲル、レジン、またはポリマー組成物であり、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターを含むか、またはポリＡ領域を含むか、またはプロモーターおよびさらにはポリＡ領域を含有する。
２つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、１サイクルのみのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードがアニーリング／重合工程を１つのみ含む、システム、試薬、および方法を包含する。この実施形態は、以下の図によって表され、第１の図は、スプリントオリゴのアニーリングを示し、第２の図は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した充填を示す。最終結果は、２つのＤＮＡバーコードモジュールを含む、ビーズ結合ＤＮＡバーコードである。この特定の手順では、ビーズ結合出発材料は、任意でリンカー（しかし、好ましくは、任意の切断性リンカーではない）、任意で、化合物の特定以外の情報をコードする核酸、および任意で、配列決定プライマーまたはＤＮＡヘアピンなどの機能性核酸を含むことができる。２つの図がテキスト内で示される（すぐ下を参照されたい）：
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
ビーズ／第１のＤＮＡバーコード／第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位
３つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、２サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、２つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、構造：第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位を含み、第２のスプリントオリゴは、構造：第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位を含む。
４つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、３サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、３つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ；第３のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、構造：第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位を含み、第２のスプリントオリゴは、構造：第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位を含み、第３のスプリントオリゴは、構造：第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位を含む。
５つのＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成する、４サイクルのアニーリング／重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、４つの異なるスプリットオリゴが使用される（第１のスプリントオリゴ；第２のスプリントオリゴ；第３のスプリントオリゴ；第４のスプリントオリゴ）。この状況では、第１のスプリントオリゴは、構造：第１のアニーリング部位／第２のＤＮＡバーコード／第２のアニーリング部位を含み、第２のスプリントオリゴは、構造：第２のアニーリング部位／第３のＤＮＡバーコード／第３のアニーリング部位を含み、第３のスプリントオリゴは、構造：第３のアニーリング部位／第４のＤＮＡバーコード／第４のアニーリング部位を含み、第４のスプリントオリゴは、構造：第４のアニーリング部位／第５のＤＮＡバーコード／第５のアニーリング部位を含む。
複数のＤＮＡバーコードモジュールを有するビーズ結合ＤＮＡバーコードを生成するための、複数の工程のアニーリング／重合を用いた実施形態。本開示は、連結されたバーコードに関連し、１つのスプリントオリゴのみを使用する（２モジュールＤＮＡバーコードを作製する）、２つのスプリントオリゴのみを使用する（３モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、３つのスプリントオリゴのみを使用する（４モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、４つのスプリントオリゴのみを使用する（５モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、５つのスプリントオリゴのみを使用する（６モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）、６つのスプリントオリゴのみを使用する（７モジュールのＤＮＡバーコードを作製する）などのビーズ結合組成物、システム、および方法を包含する。
包含されるのは、少なくとも１つのスプリントオリゴ、少なくとも２つのスプリントオリゴ、少なくとも３つのスプリントオリゴ、少なくとも４つのスプリントオリゴ、少なくとも５つのスプリントオリゴ、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも２０のスプリントオリゴ、または２０未満、１５未満、１０未満、８未満、６未満、４未満、３未満、２未満のスプリントオリゴを使用するビーズ結合組成物、システム、および方法である。これらの数は、スプリントオリゴ自体、ならびにスプリントオリゴを添加する工程の数、および成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに追加されるＤＮＡモジュールの番号付けを示す。
ＤＮＡバーコードへの損傷を低減する
オルソゴナルＤＮＡバーコードを使用して損傷を低減する（連結されたＤＮＡバーコードの代わりに）。連結されたＤＮＡバーコードおよびオルソゴナルＤＮＡバーコードのトピックを適応する１つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連結されたバーコード化を超えるオルソゴナルバーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、パラレルに付着されるのは、化学ライブラリーを作製するための化合物ライブラリーモノマー、および完成された完全長ＤＮＡバーコードを作製するＤＮＡバーコードモジュールである。
連結されたバーコード化では、任意の所定のモジュールの付着が不完全である場合（つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に連結されなかった場合）、完成されたバーコードの配列は、正確ではない。「正確ではない」という表現は、不完全な連結により塊が欠落し、完成された生成物が、完成された正しいＤＮＡバーコードであるとユーザーが想定していたことを意味する。ここで、すべてのＤＮＡモジュールの付着に失敗したため、完成されたＤＮＡバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、オルソゴナルバーコード化は、各個々のＤＮＡモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、ＤＮＡモジュールが、ビーズ上の所定の部位に付着されると、すでにビーズに連結されているＤＮＡモジュールに、さらにＤＮＡモジュールを連結する必要はない。
架橋剤を使用することにより損傷を低減する。本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各ＤＮＡバーコードモジュールは、成長するビーズ結合ＤＮＡバーコードに付着させる前に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとることができ、このｄｓＤＮＡは、マイトマイシンＣなどのＤＮＡ架橋剤で処理される。ｄｓＤＮＡ形態のＤＮＡバーコードの合成の完了後、このｄｓＤＮＡはｓｓＤＮＡに変換される。ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの変換は、ＤＮＡ鎖の１つにウラシル（Ｕ）残基を有する場合、および、ウラシル残基の位置でのＤＮＡの切断は、ウラシル－Ｎ－グリコシダーゼによって触媒されるに有効である（２０１７年９月２５日に出願されたシリアル番号第６２／５６２，９０５号の図５を参照されたい。シリアル番号第６２／５６２，９０５号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
ＤＮＡバーコードを作製するために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用して損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、ＤＮＡバーコードを二本鎖ＤＮＡの形態で合成することであり、相互に付着されているＤＮＡバーコードモジュールの各々は、ｄｓＤＮＡの形態をとり、二本鎖の各々は、ＤＮＡヘッドピースを介して安定化される。完成されたＤＮＡバーコードの最終的な配列決定のために、鎖の１つは、ＤＮＡヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物（この化合物が化学ライブラリーのメンバーである場合）を作製するために使用される試薬によって、成長するＤＮＡバーコードに与えられる損傷について言及する。
ヘアピンを含むことにより損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してＤＮＡバーコードを合成することであり、このＤＮＡバーコードは、ヘアピンの第１の突起がヘアピンの第２の突起にアニールすることで自己組織化する。
合成されるＤＮＡバーコードが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態をとる場合、ＤＣＭ、ＤＭＦ、およびＤＭＡなどの溶媒は、ＤＮＡバーコードを変性することができる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
ｄｓＤＮＡの密封された末端を使用することにより損傷を低減する。ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたＤＮＡバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用し、７－アザ－ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを介してこのｄｓＤＮＡの末端を密封することである。
タンパク質性溶媒を回避、強酸および強塩基を回避、強力な還元剤および酸化剤を回避することにより損傷を低減する。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の存在と適合性がある化学物質の種類は、ビーズ結合ＤＮＡまたはビーズ結合してないＤＮＡであるかどうかに関わらず、タンパク質性溶媒の欠如が必要であり得、強酸性条件を回避し、ｔ－ブチルリチウムのような強塩基を回避し、水素化アルミニウムリチウムなどの強力な還元剤を回避し、いくつかのハロゲン化アルキルなどのＤＮＡ塩基と反応する試薬を回避し、いくつかの酸化剤を回避する（Luk and Sats (2014) DNA-Compatible Chemistry (Chapter 4) in A Handbook for DNA-Encoded Chemistry, 1st ed. John Wiley and Sons, Inc.を参照されたい）。
他で述べたように、用語「ＤＮＡバーコード」とは、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「ＤＮＡバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの１つのみを指すことができる。
ＤＮＡ適合性のある化学物質を使用することにより核酸への損傷を低減する。Ｓａｔｚらは、ビーズ結合核酸と適合性のある様々な化学物質を開示する（Satz et al (2015) Bioconjugate Chemistry. 26:1623-1632；Satz et al (2016) Bioconjugate Chem. 27:2580-2580で補正）。Ｓａｔｚら（前掲）の記載は、ＤＮＡ／化学ライブラリーメンバーコンジュゲートで実行される化学反応に関するものであるが、記載されるＤＮＡ適合性のある化学物質の種類も関連し、有機化学は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合ＤＮＡを含むビーズ上で行なわれるべきである。
ベンズイミダゾール化合物、イミダゾリジノン化合物、キナゾリノン化合物、イソインドリノン化合物、チアゾール化合物、およびイミダゾピリジン化合物の形成のためのＤＮＡ適合性のある反応が開示される（Satzら、表１、エントリー１～６を参照されたい）。
さらに、ＤＮＡ適合性のある保護基には、ａｌｌｏｃ脱保護、ＢＯＣ脱保護、ｔ－ブチルエステル加水分解、メチル／エチルエステル加水分解、ならびにヒドラジンおよびラネーニッケルによるニトロ還元が含まれると開示される（Ｓａｔｚら、表１、エントリー７～１１を参照されたい）。
さらに、試薬をＤＮＡに連結する方法が開示されており、連結は、すでにＤＮＡに付着されている官能基で起こる。本方法には、アルキンおよびハロゲン化アリールの間の薗頭連結の最適化された手順であるスズキ連結、ジメチル－１－ジアゾ－２－オキソプロピルホスホネートを使用したアルデヒドのアルキンへの変換、精製されたアルキンから直接的にトリアゾールを付加環化する新しい方法、ｐＨ９．４緩衝剤でイソシアネート試薬を用いると改善された反応が発生する、イソシアネート構成要素とアミン官能基化ＤＮＡとの反応について改善された方法が含まれる（Satzら、表１、エントリー１２～１５を参照されたい）。
試薬をＤＮＡに連結する追加の方法が開示されており、連結は、すでにＤＮＡに付着されている官能基で起こる。これらには、第一級アミンをＤＮＡにコンジュゲートさせる方法、ＤＮＡをコンジュゲートしたチオ尿素を形成するための最適化された手順、アミン官能化ＤＮＡコンジュゲートと反応することができる構成要素としてヘタリルハライドを使用した、第二級アミンをアルキル化および脂肪族第一級アミンをビスアルキル化、第一級アミンＤＮＡコンジュゲートをモノアルキル化する方法、ならびにＷｉｔｔｉｇ反応の方法が含まれる（Satzら、表１、エントリー１６～２０を参照されたい）。
ＤＮＡ修復酵素を介して損傷されたＤＮＡを低減する。酵素、ＤＮＡ損傷結合タンパク質、およびヘリカーゼを含む、様々なタンパク質は、ＤＮＡ損傷の修復に利用可能である。市販されているのは、酸化による損傷、放射線誘導性損傷、紫外線誘導性損傷、ホルムアルデヒド付加物からの損傷、およびアルキル基付加物の形態をとる損傷を修復することができるＤＮＡ修復タンパク質である。損傷した塩基を除去するグリコシド酵素（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを切断しない）は、５－ホルミルウラシル、デオキシウリジン、および５－ヒドロキシメチルウラシルの修復に利用可能である。Ｔ４ＰＤＧは、ピリミジン二量体の修復に利用可能である。ｈＮＥＩＬ１およびＦｐｇは、酸化ピリミジン、酸化プリン、アプリン部位、およびアピリミジン部位の修復に利用可能である。ＥｎｄｏＶＩＩＩは、酸化ピリミジンおよびアピリミジン部位の修復に利用可能である。ＥｎｄｏＶは、ミスマッチの修復に利用可能である。ＨａａＧは、アルキル化プリンの修復に利用可能なグリコシラーゼである。ＤＮＡ修復酵素がギャップを残す場合、二本鎖ＤＮＡが、ギャップを有する場合、１つまたは複数の連続したデオキシリボヌクレオチドが、鎖の１つを欠損している場合は、ギャップを埋めるために様々なＤＮＡポリメラーゼが利用可能である（Catalog (2018) New England BioLabs, Ipswich, MAを参照されたい）。
様々なＤＮＡ修復酵素およびＤＮＡ修復システムは、哺乳動物、酵母、および細菌から単離されている。これらには、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、直接修復、塩基除去修復、転写共役ＤＮＡ修復、および組換え修復を媒介するものが含まれる。鎖間ＤＮＡ架橋は、ＮＥＲおよび相同組換えを組み合わせて使用することで修復することができる。直接修復には、フォトリアーゼ酵素を介したシクロブタンピリミジンダイマーおよび６～４生成物の修復が含まれる。直接修復には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるＯ６－メチルグアニンからのＯ６－メチルの除去も含まれる。Sancar et al (2004) Ann. Rev. Biochem. 73:39-85, Hu, Sancar (2017) J. Biol. Chem. 292:15588-15597を参照されたい。
本開示は、ＤＮＡ修復酵素による処理によって、またはＤＮＡ修復タンパク質の複合体などによって、ビーズ結合ＤＮＡバーコードへの損傷を修復するためのシステム、試薬、および方法を提供する。
ＤＮＡをそれらの３’末端を介してビーズに連結することにより、損傷を低減する。特定の化学変換は、核酸の露出した３’－ヒドロキシル基を損傷し得る。例えば、光延反応は、第一級および第二級アルコールからエステル、フェニルエーテル、チオエーテル、および様々な他の化合物への変換を可能にし、これにより、露出した３’末端が、後続の処理工程に反応しなくなるか、または現在変更されている３’末端を、さらなる化学反応に関与させる可能性がある。一部の実施形態では、ＤＮＡタグは、それらの３’末端を介してビーズに付着され得、したがって５’末端のみが溶液に曝露される。
本開示の試薬、システム、および方法は、ビーズ結合ＤＮＡまたはビーズ結合ＤＮＡタグなどのビーズ結合核酸を包含し、ビーズへの連結は、ＤＮＡの３’末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）（または３’末端（ｅｎｄ））を伴う。ＤＮＡバーコードを含むｓｓＤＮＡがｓｓＤＮＡの３’末端を介して連結されている場合、１つの配列決定プライマーのみをハイブリダイズすることにより配列決定を開始することができ、この配列決定プライマーは、ＤＮＡバーコード全体の上流にハイブリダイズし、このハイブリダイズは、連結されたｓｓＤＮＡのビーズ結合末端であるか、またはその近くである。１つの配列決定プライマーのみを使用する代わりに、複数の配列決定プライマーを使用することができ、各配列決定プライマーは、上流で特定のＤＮＡバーコードモジュールにハイブリダイズする。例えば、所定のＤＮＡバーコードに５つのＤＮＡバーコードモジュールが含まれている場合、ＤＮＡは、３’末端を介してビーズに連結され、ＤＮＡバーコードは、５つの異なるプライマーアニーリング部位を含むことができ、各プライマーアニーリング部位は、所定のＤＮＡバーコードモジュールのまさに上流、またはすぐ上流に位置される。
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）連結の実施形態。他の実施形態では、ビーズに連結されるのは、ｄｓＤＮＡであり、ｄｓＤＮＡ中の鎖の１つのみの３’末端が、ビーズに連結される。ｄｓＤＮＡを伴う５’連結の実施形態では、連結することができるのはｄｓＤＮＡであり、ｄｓＤＮＡの鎖の１つのみの５’末端が、ビーズに連結される。
（Ｖ）化合物とビーズへの連結
本開示は、（１）化学ライブラリーメンバーをビーズなどの基質に付着させるリンカー、（２）核酸バーコードをビーズなどの基質に付着させるリンカー、（３）例えば、ＵＶ光により切断可能であり、プロテアーゼなどの酵素により切断可能である、切断性リンカー、（４）切断不可能なリンカー、（５）二官能性リンカー、（６）多機能性リンカー、（７）連鎖に使用される複数のビーズを提供する。例えば、利用可能なものは、４－ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）リンカー、４－ヒドロキシメチルフェニル酢酸リンカーである（Camperi, Marani, Cascone (2005) Tetrahedron Letters. 46:1561-1564を参照されたい）。
「非切断性リンカー」は、所定の有機化学手順の工程中に使用される任意の試薬、条件、または環境によって検出可能に切断されないリンカーとして特徴付けられ得る。代替的に、「非切断性リンカー」は、所定の有機化学手順の他の反応物、生成物、または試薬に対して許容することができないほど破壊的である試薬、条件、または環境を除いて、切断することができないリンカーとして特徴付けられ得る。
二官能性リンカー、または他の多機能性リンカーは、フォーク（ヒトが食物を消費するために使用するフォーク）の形態をとることができ、フォークのハンドルは、ビーズに付着されており、フォークの各尖叉は、様々な化学物質の１つに連結される。例えば、１つの尖叉は、化学ライブラリーメンバーに連結することができる。別の尖叉は、ＤＮＡバーコードに連結することができる。さらに別のフォークの尖叉は、金属イオンに連結することができる。
複数のビーズの使用に関して、本開示は、（１）第２のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第１のビーズであって、第２のビーズが、付着された化学ライブラリーメンバーを含む、第１のビーズ、（２）第２のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第１のビーズであって、第２のビーズが、付着された化学ライブラリーメンバーを含み、第３のビーズが、付着され（第１のビーズおよび第２のビーズの一方または両方に）、第３のビーズが、共有結合的に付着される試薬を含む、第１のビーズなどの複数のビーズの実施形態を提供する。付着された試薬は、酵素であることができ、酵素は、付着された化学ライブラリーメンバーの活性をアッセイするために使用される。
（ＶＩ）化合物を作製するためにモノマーを一緒に連結させる
例示的な化学モノマー。本開示の組成物および方法のための化学モノマーとしての使用に適したアミノ酸誘導体を図４に示す。図は、例えば、ＡｎａＳｐｅｃ ＥＧＴ Ｇｒｏｕｐ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａｎ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）、またはＣｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡなどの化学物質の供給元を示す。
追加の化学モノマーは、図２２～２７に示される。図２２～２７の各々は、構造、化学名、および関連するＤＮＡモジュールバーコードを提供する。図の化合物１～６（図２２）に開示されるように、それぞれのバーコードは、ＡＣＧＴ、ＡＣＴＣ、ＡＧＡＣ、ＡＧＣＧ、ＡＧＴＡ、およびＡＴＡＴである。化合物７～１０（図２３）の場合、それぞれのバーコードは、ＡＴＧＡ、ＣＡＣＧ、ＣＡＧＣ、およびＣＡＴＡである。化合物１１～１６（図２４）の場合、それぞれのバーコードは、ＣＧＡＧ、ＣＧＣＴ、ＣＧＴＣ、ＣＴＡＣ、ＣＴＧＴ、およびＧＡＣＴである。化合物１７～２１（図２５）の場合、それぞれのバーコードは、ＧＡＧＡ、ＧＣＡＣ、ＧＣＴＧ、ＧＴＡＧ、およびＧＴＣＡである。化合物２２～２６（図２６）の場合、それぞれのバーコードは、ＧＴＧＣ、ＴＡＧＴ、ＴＡＴＣ、ＴＣＡＧ、およびＴＣＧＣである。また、化合物２７～３０（図２７）の場合、それぞれのバーコードは、ＴＣＴＡ、ＴＧＡＴ、ＴＧＣＡ、およびＴＧＴＧである。これらのバーコードは、単なる例示である。任意の所定の化合物のライブラリーについて、ＤＮＡバーコードの異なるコレクションを使用して、そのライブラリーで化合物を構築するために使用される化学モノマーの各々を特定し得る。
連結反応。以下は、化学モノマーをビーズに、および互いに連結することを記載しており、すなわち、第１の工程は、切断性リンカーを介してビーズに第１の化学モノマーを直接的に連結し、その後、後続の化学モノマーは、１つずつ相互に接続される。以下に開示される条件は、ＤＮＡ適合性である。
Ｔｅｎｔａｇｅｌ（登録商標）ビーズ上で３つのアミノ酸化合物を作製する方法について記載する。Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ、４－｛４－［１－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ｝ブタン酸）で修飾されたＦｍｏｃ保護レジン（１ｍｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ、１０ｕｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｍ－ＮＨ２、０．２３ｍｍｏｌ／ｇ）、またはＦｍｏｃ保護を備えた別の適切なリンカーは、ＤＭＡ（１５０μＬ）の反応プレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ、０．４５μｍ疎水性ＰＴＦＥ）の各ウェル内に懸濁された。Ｒｅｓｐｒｅｐ ＶＭ－９６真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶媒を除去した。Ｆｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中の５％ピペラジン、２％ＤＢＵの混合物１５０μＬにレジンを懸濁することで除去した。プレートをＥｘｃｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｌｕｍｎａ Ｓｅａｌで密封し、４０℃で１５分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を５分間繰り返した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各１５０μＬで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で２分間放置した６０ｍＭのＦｍｏｃ－アミノ酸、８０ｍＭのＯｘｙｍａ、２００ｍＭのＤＩＣ、および８０ｍＭの２，４，６－トリメチルピリジンの前活性化混合物１５０μＬを添加して、レジンの各ウェルを適切なアミノ酸でアシル化した。プレートを再度密封し、４０℃で１時間振とうした。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡおよび３ＸＤＣＭの各々１５０μＬで洗浄した。各ウェル内のビーズを１５０ｕｌのＤＣＭに再懸濁し、各ウェルの内容物をピペット操作を介して１つの容器に組み合わせた。組み合わせたビーズを完全に混合し、適切なウェル（１ｍｇ／ウェル）内に等量でピペッティングしてプレートに再分配する。真空を適用することにより溶媒を除去することで、各ウェルは次の適切な工程の準備をすることができる。追加のアミノ酸連結ごとに、最初にＦｍｏｃ脱保護工程が繰り返され、続いて目的のアミノ酸との連結工程が繰り返される。スプリットプールが必要な場合は、結合および再分配の方法が繰り返される。
ビーズ上でスプリットプール法により３マーのアミノ酸を作製する方法を記載する。Ｆｍｏｃ－Ｐｈｏｔｏ－Ｌｉｎｋｅｒ、４－｛４－［１－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ）エチル］－２－メトキシ－５－ニトロフェノキシ｝ブタン酸）で修飾されたＦｍｏｃ保護レジン（１ｍｇ、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ、１０μｍ、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｍ－ＮＨ２、０．２３ｍｍｏｌ／ｇ）、または任意の他の適切なリンカーは、ＤＭＡ（１５０μＬ）の反応プレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ、０．４５μｍ疎水性ＰＴＦＥ）の各ウェル内に懸濁された。Ｒｅｓｐｒｅｐ（登録商標）ＶＭ－９６真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶媒を除去した。Ｆｍｏｃ保護基は、ＤＭＦ中の５％ピペラジン、２％ＤＢＵの混合物１５０μＬにレジンを懸濁することで除去した。プレートをＥｘｃｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｌｕｍｎａ Ｓｅａｌで密封し、４０℃で１５分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を５分間繰り返した。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各１５０μＬで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で２分間放置した６０ｍＭのＦｍｏｃ－アミノ酸、８０ｍＭのＯｘｙｍａ、２００ｍＭのＤＩＣ、および８０ｍＭの２，４，６－トリメチルピリジンの前活性化混合物１５０μＬを添加して、レジンの各ウェルを適切なＡＡでアシル化した。プレートを再度密封し、４０℃で１時間振とうした。濾過後、各ウェルを２ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、１ＸＤＭＡの各々１５０μＬで洗浄した。追加のＡＡ連結ごとに、最初にＦｍｏｃ脱保護工程が繰り返され、続いて所望のＡＡとの連結工程が繰り返される。各連続する連結を分析するために、１ｍｇのビーズの部分を１００μＬのＤＭＳＯに懸濁し、３６５ｎｍ ＬＥＤの全出力に２時間曝露した。レジンを濾過し、濾液をＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ＳＢ－Ｃ－１８、３．０×５０ｍｍ、２．７μｍカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣＭＳに注入する。１．２ｍＬ／分の流量で、４分間にわたって水中の０．１％ＴＦＡ中の５％ＣＨ３ＣＮから０．１％ＴＦＡ中の１００ ＣＨ３ＣＮへの勾配、および２２０ｎｍでモニタリングを行った。
レナリドマイド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））を付着させた非アミノ酸ペンダントを作製する実験。これは、脱保護後の最終的なアミノ酸に付着する。これはまたスピン中で行われた。レジンの各ウェルを、ＤＭＡ中の４０ｍＭのクロロ酢酸、４０ｍＭのＯｘｙｍａ、８０ｍＭのＤＩＣ、および４０ｍＭのＴＭＰの５分間前処理した混合物１５０ｕＬでアシル化した（Ｆｍｏｃ脱保護後）。プレートを密封し、４０℃で１時間振とうした。各ウェルを３ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、および２ＸＤＭＡの各々１５０μＬで洗浄した。次に、レジンをＤＭＡ中の１００ｍＭのＫ２ＣＯ３、および１００ｍＭのＲｅｖの懸濁液に再懸濁した。プレートを密封し、室温で３時間振とうした。レジンを、２×５０／５０ ＤＭＡ／水、３ＸＤＭＡ、３ＸＤＣＭ、および２ＸＤＭＡの各１５０μＬで洗浄した。
所定のビーズに付着された化合物の合成の忠実度の程度を定義する。これは完成された化合物に関係し、化合物は、化学ライブラリーのメンバーである。各化学化合物は、部分的または完全に、化学モノマーから作製され得る。以下は、所定のビーズに付着された化合物を特徴付ける。この所定のビーズは、化合物のライブラリーのスプリットプール系合成の生成物であり得、各ビーズは、固有の化合物を有する。
化学ライブラリーのメンバーは、固相合成を介して、ビーズ上などの固体担体上で合成することができる。ペプチド結合を有する化学物質の固相合成は、以下の２つの化学基の１つの使用によって特徴付けられる。第１の化学基は、Ｎ－アルファ－９－フルオレニル－メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ、塩基不安定）である。第２の化学基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ、酸不安定）である（Vagner, Barany, Lam (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8194-8199を参照されたい）。ＦｍｏｃおよびｔＢｏｃは、ペプチド基質を保護するために使用することができる保護基であり、Ｆｍｏｃ基またはｔＢｏｃ基は、アルファ－アミノ基に付着される（Sigler, Fuller, Verlander (1983) Biopolymers. 22:2157-2162）。
好ましくは、所定のビーズに結合した化学ライブラリーのメンバーの少なくとも９９．５％、少なくとも９９．０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、または少なくとも８０％は、合成が完了した後、完全に同じ化学構造を有する。化学ライブラリーメンバーの多段階合成における１つまたは複数の工程で発生する可能性がある不完全な連結が起こり得る。この理由で、本開示の組成物は、以下の限定または範囲のうちの１つによって特徴付けられ、限定され得る。
本開示によってさらに提供されるのは、所定のビーズに結合された化学ライブラリーのメンバーの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、完全な合成後、正確に同じ化学構造を有する方法および試薬である（これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のあるエラー、例えば、１つの成長する化合物が化学モノマーの１つを受け取ることができないことを考慮し、反映している。また、これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のある任意のモノマーへの化学的損傷を考慮し、反映している）。
除外的な実施形態では、本開示は、「正確に同じ構造」についての上記のカットオフ値の１つを満たさない任意の方法または試薬を除外することができる。
代替の実施形態では、２個のビーズ、３個のビーズ、４個のビーズ、５個のビーズ、約５～１０個のビーズ、約１０～２０個のビーズ、約２０～４０個のビーズ、約４０～８０個のビーズは、ビーズの集団において、同様であり、同一の化合物を含む（固相合成中の化学モノマーの取り込みの任意のエラーを考慮せず、有機合成中に化学モノマーに発生する任意の化学的損傷を考慮しない）。
クリックケミストリーの導入。Ｊｅｗｅｔｔらにより、「クリック反応は、．．．選択的であり、高収率であり、良好な反応速度を有するものとして、．．．定義される。成分が周囲の生物学的環境に対して不活性であるクリック反応のサブクラスは、バイオルソゴナルと称される（Jewett and Bertozzi (2010) Chem. Soc. Rev. 39:1272-1279）。「クリックケミストリー」は、炭素－Ｘ－炭素などのヘテロ原子連結と一緒に、小単位を接合するために使用することができる。クリックケミストリーは、薬物または薬物候補の合成のために、単独で、または他の種類の化学反応と組み合わせて使用することができる。クリックケミストリーは、コンビナトリアルケミストリーに使用される手順でうまく機能する。クリックケミストリーの反応は、高収率、不可逆的、酸素または水に反応しないことによって特徴付けられる。「クリックケミストリー」で使用される化学反応のクラスには、（１）環状付加反応、特に１，３－双極性ファミリーおよびヘテロ－ディールスアルダー反応から、（２）エポキシド、アジリジン、および環状硫酸塩などの歪んだ複素環式分子と同様の求核開環反応、（４）非アルドール型のカルボニル化学、ならびに（５）酸化反応およびいくつかのマイケル付加反応と同様に、炭素－炭素多重結合への付加が含まれる。クリックケミストリー反応は、通常２０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える高い熱力学的な駆動する力によって区別されるが、対照的に、非クリックケミストリー反応は、適度な熱力学的な駆動する力のみで結合を形成することを伴う（Kolb and Sharpless (2003) Drug Discovery Today. 8:1128-1137, Kolb, Finn, Sharpless (2001) Angew. Chem. Int. Ed. 40:2004-2021)）。
テトラジンおよびトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）。１，２，４，５－テトラジンなどのテトラジンは、Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒシクロ付加を介して、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）と反応することができる（Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016）。
ハートウィッグ・バックワルドアミノ化。ハートウィッグ・バックワルドアミノ化反応は、医薬品の固相合成に使用することができる。このアミノ化反応は、炭素－窒素結合を合成するために使用され、反応は、ハロゲン化アリールとアミン（Ｒ１－ＮＨ－Ｒ２）が、パラジウムによって触媒され、アミンが、ハロゲン化物に置き換わるアリール生成物を生成し、アミノ基の窒素が、芳香環に直接的に付着されることを伴う。最終的な結果は、（アリール基の）炭素と（アミノ基の）窒素の結合を伴う生成物である。別の言い方をすれば、この反応は、ハロゲン化アリールを対応するアニリンに変換する。ハートウィッグ・バックワルドアミノ化は、様々なアミンと適合性があり、コンビナトリアルケミストリーに十分に適切である（Zimmermann and Brase (2007) J. Comb. Chem. 9:1114-1137）。
ヒュスゲン環化付加。ヒュスゲン１，３－双極性環化付加反応は、アルキンおよび有機アジドを伴う。アルキンは、Ｒ－Ｃ＝ＣＨの構造を有する。アジドは、Ｒ－Ｎ＋＝Ｎ＝Ｎ－の構造を有する。銅触媒は、ヒュスゲン環化付加反応の速度を加速する。ヒュスゲン反応は、「クリックケミストリー」または「クリック反応」を介して機能する。ヒュスゲン反応は、銅で触媒されると、小分子剤を作製するのに適した１，２，３－トリアゾール核を生成することができる。ヒュスゲン反応は、少なくとも保護された形態の場合、アミノ酸側鎖の存在と適合性がある。１，２，３－トリアゾールで作製された分子は、ポリペプチドのアミド結合と同様の結合を有し得、したがって、これらの分子は、ペプチド結合の代替となり得る（Angell and Burgess (2007) Chem. Soc. Rev. 36:1674-1689)。
ペプチド核酸（ＰＮＡ）。本開示は、ペプチド核酸を合成するためのスプリットプールケミストリー、コンビナトリアルケミストリー、または固相化学の方法を提供する。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドのアナログである。それらは、ヌクレアーゼによる加水分解に抵抗性である。それらは、それらの標的ＲＮＡ配列に強く結合することができる。ペプチド核酸の細胞への取り込みは、「細胞透過性ペプチド」によって増強することができる（Turner, Ivanova, Gait (2005) Nucleic Acids Res. 33:6837-6849, Koppelhus (2008) Bioconjug. Chem. 19:1526-1534）。ペプチド核酸は、固相合成およびコンビナトリアル合成によって作製することができる（Quijano, Bahal, Glazer (2017) Yale J. Biology Medicine. 90:583-598, Domling (2006) Nucleosides Nucleotides. 17:1667-1670を参照されたい）。
本開示は、ビーズ結合化合物を包含し、化合物は、１つのみのモノマーの形態をとる。例えば、このビーズ結合化合物は、レナリドマイドの形態をとることができるか、またはカルボン酸基が付着されたレナリドマイドの形態、またはアミノ基が、カルボン酸基を有する小さな化学部分で修飾されているレナリドマイドの形態をとることができ、またはこの化合物は、レナリドマイドの立体異性体もしくは鏡像異性体であるレナリドマイドアナログである。
（ＶＩＩ）スプリットプール合成およびパラレル合成
これは、化合物のライブラリーを合成するための「スプリットプール」法の使用、ならびにビーズ結合化合物およびビーズ結合ＤＮＡバーコードの同時合成に「スプリットプール」法が使用される方法に関する。これは、化合物の混合セットを作製するためのスプリット化およびプール化についても記載する。後のある時点で、以下に開示されているのは、非アミノ酸の連結、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたビーズの調製である。
本開示は、化学ライブラリーを生成するためのスプリットプール合成を提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）ビーズを異なる容器に分割する、（ｂ）各容器に異なる構成要素を添加する工程を伴う。例えば、３つの容器が使用される場合、第１の容器（containing）に種Ａ、第２の容器に種Ｂ、第３の容器に種Ｃを添加して反応させ、種は、容器内のビーズの付着部位に共有結合的に結合し、（ｃ）すべてのビーズを１つの容器にプールし、（ｄ）ビーズを３つの容器に分割し、（ｅ）各容器に異なる構成要素を添加し、種Ａは、第１の容器に添加され、種Ｂは、第２の容器に添加され、種Ｃは、第３の容器に添加され、種は、以前に付着されていた第１の種に共有結合的に結合する（Stockwell (2000) Trends Biotechnol. 18:449-455を参照されたい）。
本開示のスプリットプール合成は、各化学的連結工程（化学ライブラリーメンバーを作製する）の前または後のいずれかに、ＤＮＡバーコード連結工程を含み、このＤＮＡバーコードは、その工程で連結されている化学物質を特定する。
除外的な実施形態では、本開示は、パラレル合成の所定の工程について、化学物質を付着させる前にバーコードが付着される方法および試薬を除外することができる。逆に、本開示は、パラレル合成の所定の工程について、バーコードを付着させる前に化学物質が付着される方法および試薬を除外することができる。
スプリットプール法により調製されるビーズ結合化学ライブラリーの特徴の１つは、各ビーズに１種類の化合物のみが付着することである。連結が不完全な場合、例えば、所定のスプリットプール工程で、５，０００付着部位のうち、４，０００のみが目的の化学種と正常に連結された場合、いくつかの不均一性が発生する。
パラレル合成。本開示の好ましい実施形態では、化合物および関連するＤＮＡバーコードの有機合成にパラレル合成を使用することができる。実際には、１つまたは複数の化学モノマーによるビーズの修飾および１つまたは複数のＤＮＡバーコードモジュールによる同じビーズの修飾は、厳密にパラレルであるわけではない。実際には、ビーズは、１つまたは複数の化学単位（化学モノマー）を受け取り、続いてその特定の化学単位をコードするＤＮＡバーコードモジュールを受け取る。用語「パラレル」は、化学ライブラリーモノマーのポリマーが成長するにつれて、ＤＮＡバーコードモジュールのポリマーも成長するという事実を指す。すべてのＤＮＡバーコードモジュールがビーズに付着されており、連結された構造またはオルソゴナル構造を形成する場合、完全長ＤＮＡバーコードは、「ＤＮＡバーコード」と称される（ＤＮＡバーコードモジュールだけではない）。
付着された化学ライブラリーメンバーの総数に対する、外部に付着されたＤＮＡバーコードの数の比率。
これは、ビーズの外部表面および内部表面に関する。外部に付着されたＤＮＡバーコード（内部に付着されたＤＮＡバーコードの数を考慮しない）、および付着された化学ライブラリーメンバー（外部表面および内部表面の両方に付着された）を有する所定のビーズの場合、外部に付着されたＤＮＡバーコード数の、付着された化学ライブラリーメンバーの総数に対する比率は、例えば、約０．１：１００、約０．２：１００、約０．５：１００、約１．０：１００、約２：１００、約５：１００、約１０：１００、約２０：１００、約３０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、約７０：１００、約８０：１００、約９０：１００、約１：１、約１００：１５０、約１００：２００、約１００：４００、約１００：６００などであり得る。除外的な実施形態では、本開示は、上記の値の１つに適合する任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができる。
典型的なビーズのＤＮＡバーコードの均一性、典型的なビーズの化学ライブラリーメンバーの均一性
本開示は、任意の所定のビーズ（または任意のビーズの集団）について、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などである「化学ライブラリーの均一性」を提供する。
厳密性の低い実施形態では、本開示は、任意の所定のビーズ、または代替的に、任意の所定のビーズ集団について、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％である「化学ライブラリーの均一性」を提供する。
同様に、本開示は、ＤＮＡバーコードなどのバーコードの均一性を評価するための上記のカットオフ値を提供する。
ＤＮＡバーコードの均一性および化学ライブラリーメンバーの均一性は、実験室マニュアルまたはノートの方法項で計画され、所望されるとおりの正確な配列に一致する総集団の割合で定義され得る。
除外的な実施形態では、本開示は、上記のカットオフ値の１つまたは複数に適合しない任意の試薬、組成物、または方法を除外することができる。
ビーズの集団の均一性を評価する場合、ビーズの集団全体にわたって均一性が所望される状況では、ビーズ＃１、ビーズ＃２、ビーズ＃３、ビーズ＃４、ビーズ＃５、ビーズ＃６、ビーズ＃７などの合計の均一性を考慮する必要がある。
除外的な実施形態では、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、ＤＮＡバーコードの均一性は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などではない。また、除外的な実施形態では、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、化学ライブラリーメンバーの均一性は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９．５％などではない。
内部に付着されたＤＮＡバーコードの、外部に付着されたＤＮＡバーコードに対する比率
本開示の一部の実施形態では、ＤＮＡバーコードが主に外表面に付着されているビーズを製造および使用することが所望される場合がある。内部ＤＮＡバーコードを伴うビーズを作製および使用しない１つの理由は、内部空間へのＤＮＡオリゴマーの浸透が低く、内部空間へのＤＮＡリガーゼ（完成されたＤＮＡバーコードを作製するためにＤＮＡモジュールを相互に接続するためのリガーゼ）の浸透が低いことである。配列決定の目的で、内部ＤＮＡバーコードを作製および使用しない理由は、バーコードの最終的な配列決定に必要なＤＮＡを増幅するために必要な酵素の浸透が低いことである。内部ＤＮＡバーコードを伴うビーズを作製および使用しない、さらなる別の理由は、化学ライブラリーのメンバーを付着させるための内部空間に費用がかかるためである。
本開示は、ＤＮＡバーコードを有するビーズを提供し、内部に付着されたＤＮＡバーコードの、外部に付着されたＤＮＡバーコードに対する比率は、約０．１：１００、約０．２：１００、約０．４：１００、約０．８：１００、約１：１００、約２：１００、約４：１００、約８：１００、約１０：１００、約２０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、約７０：１００、約８０：１００、約９０：１００、約１：１などである。
また、本開示は、ＤＮＡバーコードを有するビーズを提供し、内部に付着されたＤＮＡバーコードの、外部に付着されたＤＮＡバーコードに対する比率は、０．１：１００を下回る、０．２：１００を下回る、０．４：１００を下回る、０．８：１００を下回る、１：１００を下回る、２：１００を下回る、４：１００を下回る、８：１００を下回る、１０：１００を下回る、２０：１００を下回る、４０：１００を下回る、５０：１００を下回る、６０：１００を下回る、７０：１００を下回る、８０：１００を下回る、９０：１００を下回る、１：１を下回るなどである。
水性懸濁液中のビーズの集団は、ピコウェルアレイなどの基板に接触させることができ、その結果、ビーズがピコウェルに入り、ピコウェルを占有する。懸濁液中のビーズの数および基板中のピコウェルの数の比率を調整して、目的の占有率を達成することができる。例えば、懸濁液が１つのみのビーズを含む場合、ビーズを含むすべてのピコウェルはビーズを１つのみ含み、残りのピコウェルは、いかなるビーズも含まない。懸濁液が２０，０００個のビーズを含み、基板が２００，０００個のピコウェルを含む場合、少なくとも１８０，０００個のピコウェルは、完全にビーズが空になり、ビーズを含むほとんどのピコウェルは、１つのみのビーズを含む。少ないパーセンテージの占有されたピコウェルが２つのビーズを包含する。
価値のある実施形態では、懸濁液中のビーズ数の、ピコウェル数に対する比率は、約０．２：１００、約０．４：１００、約０．６：１００、約０．８：１００、約１：１００、約２：１００、約４：１００、約６：１００、約８：１００、約１０：１００、約２０：１００、約３０：１００、約４０：１００、約５０：１００、約６０：１００、８０：１００、約１００：１００（１：１と同じ）、約２：１、約４：１、約６：１、約８：１、約１０：１などであり得る。
除外的な実施形態では、本開示は、上記の値または範囲の１つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
範囲の実施形態では、懸濁液中のビーズ数の、ピコウェル数に対する比率は、約０．２：１００～約０．４：１００、約０．４：１００～約０．６：１００、約０．６：１００～約０．８：１００、約０．６：１００～約１：１００、約１：１００～約２：１００、約２：１００～約４：１００、約４：１００～約６：１００、約０．６：１００～約８：１００、約８：１００～約１０：１００、約１０：１００～約２０：１００、約２０：１００～約３０：１００、約３０：１００～約４０：１００、約４０：１００～約５０：１００、約５０：１００～約６０：１００、約６０：１００～８０：１００、約８０：１００～約１００：１００（１：１と同じ）、約１００：１００（１：１と同じ）～約２：１、約２：１～約４：１、約４：１～約６：１、約６：１～約８：１、約８：１～約１０：１などであり得る。
除外的な実施形態では、本開示は、上記の値または範囲の１つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
（ＶＩＩＩ）ピコウェルを製造する
ピコウェルアレイプレートを作製するためのＵＶ光、フォトマスク、およびフォトレジストの組み合わせ。多数のマイクロウェルまたはピコウェルを含むプレートは、本開示で使用するために以下のように作製することができる。簡単に述べると、３層のサンドイッチが組み立てられる。上部層は、フォトレジストである。中間層は、ガラスウエハである。底部層は、フォトマスクである。ピコウェルは、ＵＶ光によりフォトレジストから切り分けられる。ピコウェルがフォトレジストの平らなシートから切り分けられると、フォトレジストは、マフィンを焼くためのカップを含有する一般的な金属製の皿に類似し、皿の中の、マフィンバッターを保持するために使用されるカップは、傾いた側面を有する。ＵＶ光は、フォトレジストのポリマーを分解するため、「非架橋剤」として機能する。ＵＶ処理後、溶媒が添加され、ＵＶ処理されたフォトレジストが洗い流され、クリーンに見えるピコウェルが残る。
傾けて回転させ、傾いた壁を作製する。傾いた壁を有するピコウェルは、以下のように作製される。フォトマスクは多数の開口部を有し、各開口部は、ピコウェルの所望される底部の寸法に対応する。底部の寸法は、円周、直径、および形状、すなわち、円形形状を含むことができる。ウェルの上部の寸法は、光源を回転するか、またはサンドイッチ（フォトマスク／ガラスウエハ／フォトレジストサンドイッチ）を保持するステージを回転させたりしながら、傾いたＵＶ光をフォトマスクの開口部に方向付けることによって作製される。回転では、光源は、フォトマスク／ウエハ／フォトレジストサンドイッチに対して９０度の角度ではなく、代わりに、各ピコウェルの傾いた壁を切り分けるために、９０度の位置から少し傾けられる。多くのピコウェルを含む、得られるピコウェルアレイプレートは、そのまま使用することができる。代替的に、このピコウェルアレイプレートは、多数のピコウェルアレイプレートを安価に作製するための型として使用することができる。
Ｈａｎらは、マイクロウェルが傾いた壁を有するマイクロウェルプレートを製造するための機器および試薬について記載する（Han et al (2002) J. Semiconductor Technology and Science. 2:268-272を参照されたい）。記載されるのは、ＵＶ光源、接触ステージ、傾斜ステージ、およびＳＵ－８フォトレジストである。製造は、片面研磨シリコンウエハから開始する。ＳＵ－８フォトレジストを、ウエハ上に約０．１０～０．１５ｍｍの厚さでコーティングする。次に、フォトレジストを、６５℃のホットプレート上で１０分間、穏やかに焼き、次に、９５℃のホットプレート上で３０分間、穏やかに焼く。得られたフォトレジスト／ウエハサンドイッチは、接触ステージを使用してＵＶマスクと接触する。用語「傾斜および回転ＵＶリソグラフィー」とは、マイクロウェルアレイプレートまたはピコウェルアレイプレートを製造する方法を指し、各ウェルは、傾いた壁を有する。ここでは、ウェルの床は、小さな直径を有し、ウェルの上部（ウェルの上部端が、プレートの平らな表面と接触する部分）は、幅広の直径を有する。ＵＶ光で露出するために、回転台が使用され、ＵＶ光が傾斜される（Hanら、前掲）。マスクは、マスクの開口部の各々が円形であるフォトレジストと接触する。Ｈａｎら（前掲）の図８は、ＵＶ光の方向、ＵＶマスク、フォトレジスト構造、ウエハ基板、および回転台の写真を提供する。Ｈａｎらは、円錐台の製造方法を記載する。ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などの柔らかい材料を、円錐形アレイにわたって注ぎ、硬化させると、ＰＤＭＳ層が剥がれ、円錐形ウェルを形成する。
ピコウェルアレイプレートの大量生産に使用する型を作製する。ピコウェルアレイプレートが製造されている場合は、エポキシをプレートにわたって注ぎ、すべてのピコウェルを充填し、充填されたすべてのピコウェルをエポキシのプラットフォームに接触することができる。エポキシが固化したら、ピコ突起のアレイの付着した固体プラットフォームを除去する（ピコ突起は、所望のピコウェルの逆である）。ピコ突起を伴う固体プラットフォームは、多くのピコウェルアレイプレートの製造に使用することができる再利用可能な成形である。
エポキシ型（または任意の硬質な材料で作製された円錐形アレイ型）から複製を作製する手順は、「ホットエンボス」と称される。簡単に述べると、基板材料を、そのガラス転移温度または軟化温度に加熱し、その時点でピコ突起を有する型が熱軟化材料に均一に押し付けられる。ピコ突起が、ピコ陥入として基材材料に移された後、型を基材から分離することができる。この開示は、好ましくは、型および基板のそれぞれのパターンとしてピコ円錐形およびピコウェルを開示する。
ホットエンボス、エポキシマスター、およびＳＵ－８フォトレジストなどのフォトレジストについて記載する（Bohl et al (2005) J. Micromechanics and Microengineering. 15:1125-1130, Jeon et al (2011) Biomed Microdevices. 13:325-333, Liu, Song, Zong (2014) J. Micromechanics and Microengineering. 24:article ID:035009, del Campo and Greiner (2007) J. Micromechanics and Microengineering. 17:R81-R95を参照されたい）。
他のマイクロウェルプレートの実施形態。プラスチックマイクロウェルアレイは、シリコン型を使用した熱成形を介して製造することができ、シリコン型は、マイクロウェルのアレイ、例えば、８００，０００マイクロウェルのアレイを有する。テーパ形状、および滑らかな側壁、およびサブミクロンの許容誤差をもたらす高度な制御は、非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して作製することができる。対照的に、Ｂｏｓｃｈプロセスなどのパルス式ドライエッチングプロセスを使用する方法では、側壁が粗くなり、エッチング中に横方向の寸法を制御することができない場合がある。
非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して、クロムマスクを使用した非パルス式等方性ドライエッチングプロセスによって作製されたシリコンマスター上にプラスチックを熱成形することにより、プラスチックアレイを製造する。このプロセスは、Ａｒ、ＳＦ６、Ｃ４Ｆ８の３つのガスを使用する。このプロセスは、１２００～２０００ワットのＲＦ電力、および１５０ワットのバイアスで行われる。３つのガス間のガスフローを変化させることにより、シリコン型のテーパを微調整して、滑らかな側壁を作製することができる。変更されるのは、ＳＦ６のＣ４Ｆ８に対する比率であり、比率を変更した結果は、例えば、１８度（非常に傾斜した壁）、９度（わずかに傾斜した壁）、または２度（基板にほぼ垂直な壁）の傾きで存在する型（シリコンピラー）のテーパ壁である（Perry, Henley, and Ramsey (Oct. 26-30, 2014) Development of Plastic Microwell Arrays for Improved Replication Fidelity. 18th Int. Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences. San Antonio, TX (pages 1700-1703)を参照されたい）。
実施形態では、本開示は、マイクロウェルのアレイを含む、基板、アレイ、グリッド、マイクロ流体デバイスなどを提供する。一実施形態では、すべてのマイクロウェルは、本質的に同じ体積を有する。この体積は、約１フェムトリットル、約２、約４、約６、約８、約１０、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、または約１，０００フェムトリットルであることができる。
さらに、体積は、約４０フェムトリットル～約６０フェムトリットルの範囲など、上記の２つの隣接する値のいずれかの間の範囲の形態をとることができる。また、体積は、上記のリストで互いに直接的に隣接していない、上記の２つの値のいずれかの間の範囲の形態をとることができる。
さらに、体積は、約１ピコリットル、約２、約４、約６、約８、約１０、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約２００、約４００、約６００、約８００、または約１，０００、約２，０００、約５，０００、約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約５００，０００、または約１，０００，０００ピコリットルであることができる。また、体積は、上記のリスト内で互いに直接的に隣接していない、上記の２つの値のいずれかの間の範囲の形態をとることができる。
除外的な実施形態では、本開示は、マイクロウェルを含む任意の基板、またはマイクロウェルを含む任意のアレイを除外することができ、各マイクロウェルの体積は、上記の値の１つによって定義可能であるか、または互いに隣接する上記の２つの値のいずれかの範囲によって定義可能であるか、またはリスト内で互いに隣接していない上記の２つの値のいずれかの範囲によって定義可能である。
ピコウェル上の球状栓（キャップ化ビーズとしても公知である）。本開示は、球状栓、または代替的に、ピコウェルアレイのウェルごと、または実質的にすべてのウェル用の多孔性球状栓を提供する。栓の目的は、薬物、候補薬物、細胞内容物、代謝産物をウェル内に保持することである。栓は、ピコウェルの内容物を互いに単離するのにも役立つ。球状栓は、ピコウェルの上部（または開口もしくは口）を覆うという目的が満たされ得る限り、完全な球状である必要はない場合がある。ウェルは、上部直径および底部直径を有することができる。ウェルをキャップする前の球状栓の直径は、約１０マイクロメートル、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約７０、約９０、約１２０、または約２００マイクロメートルである。ピコウェルアレイにわたって栓を流すだけで、栓を加えてピコウェルを覆い得る。遠心分離、圧力、撹拌、または他の方法を使用して、ピコウェルの上部（または口もしくは開口）にビーズを詰め込み、しっかりと密封することができる。一部の実施形態では、溶媒を使用して、キャップ化ビーズの膨張および／またはサイズを変更することができる。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、ビーズを収縮させる溶媒にロードされ、アッセイ緩衝剤または異なる溶媒に置き換えられると、キャップ化ビーズは、それらの元のサイズに戻るか、または膨張して、それにより、ピコウェルをしっかりと密封する。一部の実施形態では、温度を使用して、キャップ化ビーズを膨張または細断し、ピコウェルの口でより良好な密封を得ることができる。必要に応じて、キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルアレイにおけるステップの１つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぎ得る。
キャップ化ビーズは、本開示の化合物を運ぶ同じ種類のビーズであり得るか、または異なる種類のビーズであり得る。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、実際には、ビーズ自体を有する化合物であり得る。キャップ化ビーズは、ピコウェルからの分子の拡散を防止または遅延させる受動的キャップとして機能し得るか、またはビーズは、活性ビーズであり得、キャップ化ビーズに付着された機能的な部分を使用して、ピコウェルから試薬を捕捉し得る。一部の実施形態では、多孔性キャップ化ビーズは、ピコウェル内で実行される細胞に基づくアッセイから放出された代謝産物を受動的に捕捉し得る。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、脂質、タンパク質、炭水化物、および核酸などの細胞物質を非特異的に捕捉し得る。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、抗体を用いて機能化し、健康、疾患、溶解、または固定された細胞から放出されたタンパク質を特異的に捕捉し得る。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、細胞の核酸を特異的に捕捉するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて機能化され得る。一部の実施形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡ機能化されたキャップ化ビーズを使用して、キャップされたピコウェル内の細胞から放出されたマイクロＲＮＡを捕捉し得る。一部の実施形態では、ピコウェルは、２つのビーズ、ピコウェル内部の化合物含有ビーズ、およびピコウェルの口を覆うキャップ化ビーズを含む。一部の実施形態では、キャップ化ビーズはまた、化合物を有するビーズである。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、化合物ビーズから放出された材料を捕捉する。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、化合物ビーズから放出された化合物の試料を捕捉する。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、化合物ビーズから放出されたＤＮＡバーコードを捕捉する。一部の実施形態では、キャップ化ビーズは、それらがキャップするピコウェル内から放出される異なる種類の分析物を捕捉する。
キャップおよびピコウェルの相対的な硬度。好ましい装置は、マイクロタイタープレートであり、各マイクロタイターは、その底面に何千ものピコウェルを含む。キャップが適切に位置する能力、または各ピコウェルを密封する能力は、キャップの硬度に対する、ピコウェルの開口部およびピコウェルの内壁を構成するプラスチックの硬度の機能であり得る。
プラスチックの硬度は、「デュロメーター」の値の観点において定義することができる。硬度は、圧入に対する材料の耐性として定義され、試験される。球状栓の硬度、およびピコウェルの壁の硬度は、その「デュロメーター」の観点において定義することができる。硬度は、例えば、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００であり得る。これらのデュロメーター値のいずれかをプラスチック物質または他の物質に帰する場合、使用されるスケールも明記する必要がある。例えば、スケールは、より柔らかい材料に使用されるＡＳＴＭ Ｄ２２４０タイプＡスケール、またはより硬い材料に使用されるＡＳＴＭ Ｄ２２４０タイプＤスケールにすることができる（Silicon Design Manual, 6th ed., Albright Technologies, Inc., Leominster, MAを参照されたい）。
ピコウェルの形状。一部の実施形態では、ピコウェルは、ピコウェルの上部および底部で円筒の直径がほぼ同じである円筒形ピコウェルであり得る。一部の実施形態では、ピコウェルはわずかなテーパを有し得、ピコウェルの上部は、ピコウェルの底部よりもわずかに大きい。一部の実施形態では、ピコウェルは、円錐ピコウェルであり得、角度は１度～３０度の間のどこかで法線から外れている。一部の実施形態では、ピコウェルは、ステップ付きピコウェルであり、ピコウェルは、上部の直径から底部の直径まで不連続なステップを有する（直径が上部から底部に滑らかに変化する円錐ピコウェルとは対照的に）。一部の実施形態では、ステップ付きピコウェルは、ピコウェルの開口の近くに幅広い円筒、およびピコウェルの底部の近くに狭い円筒を有する。一部の実施形態では、ステップ付きピコウェルは、上部から底部への複数の不連続なステップを有し得る。多ステップ付きピコウェルの一部の実施形態では、すべての段の直径は、その下の段の直径より大きくてもよい。一部の実施形態では、小さなビーズは、ステップ付きピコウェルの底部に堆積され得、キャップ化ビーズは、ステップ付きピコウェルの最上部の開口に堆積され得る。一部の実施形態では、ピコウェルは、２つを超えるビーズを含み得る。
ステップ付きピコウェルを作製する方法。図２９は、ステップ付きピコウェルを開示した。示される実施形態は、３つの区画および２つのステップを有する。上部区画は最も広く、ピコウェルがキャップされている状況で、上部区画の大部分がキャップで占められ、キャップを受け入れるように構成される。中央区画は、主に試薬によって、または試薬単独で占められるように構成される。試薬は、緩衝材、酵素基質、１つまたは複数の塩、およびジチオトレイトール、ＲＮＡｓｅ阻害剤、グリセロール、もしくはＤＭＳＯなどの防腐剤または安定剤を含むことができる。最下部区画は、ビーズ、すなわち、ＤＮＡライブラリーおよび放出可能な化合物の両方が連結したビーズで占められるように構成される。ＤＮＡバーコードおよび解放可能な化合物を有することに加えて、同じビーズは、「応答捕捉エレメント」を有することもできる。キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルにおけるステップの１つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぐ。図２９では、構造１は、キャップであり、構造２は、ビーズであり、構造３は、第１のステップのすぐ上に位置する上部領域である。構造４は、中央領域であり、アッセイ試薬を配置するのに使用することができる。中央領域は、第２のステップのすぐ上である。中央領域内のアッセイ試薬は、最も低い領域に拡散することができる。構造５は、最も低い領域であり、ビーズを配置し、１つまたは複数の細胞を配置するのに使用することができる。
ビーズが占める最も低い区画の空間について（ピコウェル内にビーズが１つのみ存在すると仮定する）、ビーズの直径は、最も低い区画の直径の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９８％であり得る（ピコウェルが円形ウェルであると仮定する）。ピコウェルが円形ウェルでない場合、上記の値は、ウェルの最も広い寸法を参照することができる。除外的な実施形態では、本開示は、上記のパラメーターのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
さらに、ビーズが占める空間について（ピコウェル内にビーズが１つのみ存在すると仮定する）、ビーズの約５０％は、最も低い区画にあり、および同じビーズの約５０％は、中央区画にあり、これらのパラメーターはまた、約５５％が最も低いおよび約６５％が中央、約６０％が最も低いおよび約４０％が中央、約６５％が最も低いおよび約４５％が中央、約７０％が最も低いおよび約３０％が中央、約７５％が最も低いおよび約２５％が中央、約８０％が最も低いおよび約２０％が中央、約８５％が最も低いおよび約１５％が中央、約９０％が最も低いおよび約１０％が中央、約９５％が最も低いおよび約５％が中央、ならびに約１００％が最も低い区画であり得る。これらの計算を行うために、ビーズが占める空間は、ビーズが多孔性ではないと（仮説的に）仮定する。除外的な実施形態では、本開示は、上記のパラメーターのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
円錐および円筒ピコウェルと同様に、成形システムの使用は、ステップ付きピコウェルを作製するための１つの好ましい実施形態である。この目的のために、多層柱のアレイを含む型が所望され、熱可塑性または他の硬化性ポリマー基板に打ち込むと、ステップ付きピコウェルの跡が形成され得る。複数のステップを備えた層状柱アレイ、異なる直径の各ステップは、（上に行くほど小さくなる）、多層リソグラフィープロセスで形成され得る。簡単に述べると、マイクロピラーアレイの第１の層を架橋するために、フォトレジストの第１の層が、第１のマスクを介して曝露される。フォトレジストの第２の層は、第１の層（以前に曝露された）に直接的に堆積され得、第２のフォトマスクを使用して、後に第２のフォトレジストの第２のパターンが架橋され得る。多層パターン化の最後に、レジストの積層は、架橋されていない領域を洗い流すために開発され、多層柱のアレイを残すことができる。多層柱アレイを作製するための詳細なプロトコルは、Francisco Perdigones et al., (January 8th, 2011). Microsystem Technologies for Biomedical Applications, Biomedical Engineering, Trends in Electronics Anthony N. Laskovski, IntechOpenに見出され得る。多層柱アレイのアレイが作製されると、標準のプロセスが使用され、型を使用してステップ付きピコウェルアレイをインプリントし得る。
キャップ化ビーズを除去する。多くの実施形態では、ピコウェル内の化学的撹乱に対する反応、分析物、または細胞応答を研究するためにキャップ化ビーズを採取することが有利である。一部の実施形態では、ピコウェルアレイを反転させ、機械的撹拌を使用することにより、キャップ化ビーズをピコウェルの口から取り除くことができる。一部の実施形態では、ピコウェルを収縮させるために溶媒を使用して、ピコウェルの口から容易に取り除くことができる。一部の実施形態では、キャップ化ビーズよりも高い密度の液体をピコウェルアレイの上部に添加し、浮力によってキャップ化ビーズを上昇させ、高密度媒体の上部に浮遊させることができる。
一部の実施形態では、キャップ化ビーズを互いに架橋して、キャップ化ビーズをピコウェルアレイの上部から剥離することができるキャップ化シートに変換することができる。一部の実施形態では、架橋ゲルをキャップされたピコウェル上に注ぐことができ、架橋ゲルは、キャップ化ビーズおよびそれら自体に架橋し、キャップ化ビーズが、剥離することができる架橋シートに埋め込まれるようにする。
ピコウェルの相対的な位置を、剥離した層の形態で保持する。キャップ化ビーズが、剥離することができるゲル層に噛み合わされるような実施形態では、互いに対するおよびピコウェルに対するキャップ化ビーズの相対的な位置は、剥離された層に保持されることを理解されたい。これにより、ピコウェル、ピコウェルでのアッセイ、ピコウェル内のビーズ、およびキャップ化ビーズに捕捉されたあらゆる材料を直接的に接続することができる。
一部の実施形態では、基準マーカーを使用して、ピコウェルアレイの相対的な特徴を、剥離された層のキャップ化ビーズに向けることができる。
ピコウェルの位置合わせおよび整列を可能にする基準マーカー。ピコウェルを不規則なアレイに配置すると、ピコウェルアレイのイメージング中にシフトおよびドリフトを簡単に特定することができる。一部の実施形態では、イメージング中に光学的および機械的ドリフトの検出を容易にするために、ピコウェルは不規則な順序で配置される。一部の実施形態では、ピコウェルアレイは、イメージング中のシフトおよびドリフトを特定するのを助けるための基準マーカーを含む。一部の実施形態では、基準マーカーは、ピコウェルアレイのピコウェル間に散在する、容易に特定可能な形状、パターン、または特徴である。一部の実施形態では、少数のピコウェルは、それ自体が容易に特定可能なパターンで配置され、イメージング中の光学的または機械的ドリフトの場合に容易な位置合わせを可能にすることができる。一部の実施形態では、蛍光ビーズなどの外部マーカーをピコウェルアレイ上に霧状にして、基準パターンを提供することができる。
キャップフリーマットの実施形態。キャップフリーマットの実施形態は、少なくともいくつかの形態または例では、「キャップレスフィルム」の形態をとることができる。ピコウェルの上部にある開口を密封する代わりに、例えば、ピコウェル内にあり得る任意の細胞培地または酵素アッセイ培地の蒸発を防止するために、マットを介して密封することができる。好ましくは、マットは、所定のピコウェルアレイ内のすべてのピコウェルを覆うようなサイズである。代替的に、マットは、アレイ内のピコウェルの所定の区画を覆うようなサイズにすることができる。マットは、ピコウェルプレートの上部に固定して、ピコウェルを覆い、ピコウェルの間にあるピコウェルプレートのほぼ平坦な上面も覆うことができる。確実な接触は、（ｉ）例えば、マットの上部に置かれ、マットの上部の重りとして機能する硬いゴム製プラテンによって、一定の圧力を維持すること、（ｉｉ）硬いゴム製プラテンなどの重りに接続されたマットを使用すること、（ｉｉｉ）マット全体に適用することができるリバーシブル化学接着剤（マットが吸収マットではない場合）のうちの１つまたは複数によって達成することができる。マットが吸収マットになる場合、マットには、可逆的な化学接着剤で囲まれた円形の吸収パッドが含まれる。ここで、マットはピコウェルアレイと接触して整列し、円形の吸収パッドが各ピコウェルの開口のみを覆い、開口から「こぼれ出して」ピコウェルプレートの平面に接触しないようにする。
ピコウェルプレートの実質的な平面と接触するためのマットとして使用するための、およびピコウェルのキャップレス密封化で使用するための膜が利用可能である。Ｄｏｗ Ｆｉｌｍ Ｔｅｘ、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ、Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｄｉｒ、Ｔｏｒａｙ、ＴｒｉＳｅｐ、Ｓｙｎｄｅｒ、Ｎｏｖａｍｅｍ、Ｅｖｏｎｉｋ、およびＡｑｕａｐｏｒｉｎフラットシート膜などのフラットシート膜は、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ、Ｋｅｎｔ、ＷＡから入手可能である。これらには、ポリアミド－ＴＦＣ、セルロースアセテート、ポリアミド－尿素－ＴＦＣ、セルロースアセテートブレンド、ポリピペラジン－アミド－ＴＦＣ、ＰＥＳ、複合ポリアミド－ＴＦＣ、ＰＥＳ、ＰＡＮ、ＰＶＤＦ、ＰＳＵＨ、ＲＣ、ＰＥＳＨ、ポリエーテルエーテルケトン、およびポリイミドなどで作製された膜が含まれる。分子量カットオフの観点での孔サイズには、１５０Ｄａ、２００Ｄａ、３００Ｄａ、５００Ｄａ、９００Ｄａ、６００Ｄａ、１，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、１００，０００Ｄａ、２００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、４００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ、８００，０００Ｄａ、３５００Ｄａ、０．００５マイクロメートル、０．０３０マイクロメートル、０．０５マイクロメートル、０．１０マイクロメートル、０．２０マイクロメートルなどが含まれる。本開示のシステム、組成物、試薬、および方法に関して、これらのカットオフ値は、他のクラスの化合物を除外して、特定のクラスの化合物の選択的な収集を可能にすることができる。例えば、上記の膜のいくつかは、小分子代謝産物が通過して吸収性マットによって吸収されることを可能にする一方で、タンパク質および他の高分子を除外することができる。水、金属イオン、塩、代謝産物、タンパク質、および核酸を含むすべての分子に対して不透過性であるフラットシート膜も、本開示のシステム、組成物、および方法での使用に利用可能である。
可逆的な接着は、「分子ベルクロ」、例えば、メタロポルフィリン含有ポリマーとピリジン含有ポリマーによって媒介される（Sievers, Namyslo, Lederle, Huber (2018) eXPRESS Polymer Letters. 12:556-568）。他の分子ベルクロ接着剤は、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、ｓｓＤＮＡの相補鎖（ピコウェルプレートの平らな上面に共有結合的に付着された１種類のｓｓＤＮＡ、およびマットに共有結合的に付着された他の種類のｓｓＤＮＡ）、カテコール側鎖を含むコポリマーなどを伴う（Sieversらの（前掲）を参照されたい）。また、可逆的な接着は、ガリウム接着剤によって媒介することができ、接着の程度は、温度のわずかな変化によって制御することができる（Metin Sitti (May 18, 2016) Switch and Stick. The chemical element gallium could be used as a new reversible adhesive that allows its adhesive effect to be switched on and off with ease. Max-planck-Gesellschaft）。さらに別のリバーシブル接着剤は、オランダのズウォルのＤＳＭ－Ｎｉａｇａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である。
吸収性物質（非特定の吸収剤；特定の吸収剤）。マットに組み込んで吸収特性を提供することができる吸収性物質には、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標）などの「分子ふるい」ビーズ、およびＤＥＡＥセルロース、カルボキシメチルセルロース、ホスホセルロースで作製されたイオン交換ビーズ、または上記の任意の組み合わせが含まれ、すべて１つの吸収性マットに組み合わされる。吸収性リガンドには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で使用されるものが含まれる（ＢｉｏＲａｄカタログ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡを参照されたい）。特定の吸収剤には、ｐｏｌｙＡテイルとのハイブリダイズによってｍＲＮＡを捕捉することができるｐｏｌｙ（ｄＴ）などの応答捕捉要素が含まれる。また、応答捕捉要素には、エクソン標的化ＲＮＡプローブ、抗体、およびアプタマーが含まれる。これらのいずれか、または任意の組み合わせをマットに共有結合的に付着させ、吸収性マットを作製することができ、吸収性マットをピコウェルの上面に接触させると、ピコウェルの内側にある可能性のある水性アッセイ培地または水性細胞培養培地を捕捉することができる。
（ＩＸ）ピコウェルにビーズを堆積させる
ピコウェルを伴うプレートは、９６ウェルプレートの形態をとることができ、これらの９６ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。また、ピコウェルを伴うプレートは、２４ウェルプレートの形態をとることができ、これらの２４ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。９６ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液０．１～０．２ｍＬを使用して充填することができる。２４ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液約０．５ｍＬを使用して充填することができる。懸濁液は、使い捨て先端部付きの通常のピペットを使用して添加することができる。懸濁液中にあるビーズの数は、１つのビーズのみを含むピコウェルの約３分の１、２つのビーズを含むピコウェルの約３分の１、およびビーズを含まないか、または２つ超のビーズのいずれかを含むビーズの約３分の１をもたらすことができる。また、懸濁液中のビーズの数は、１つまたは複数のビーズを含むこれらのウェルのうち少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％は、これらのウェルの１つのみのビーズを含む状況を生じる数であり得る。
ビーズが定着した後、あらゆる余分な液体は、９６ウェルプレートの各ウェルの壁にピペット先端部を接触させるか、２４ウェルプレートの各ウェルの壁にピペット先端部を接触させて、余分な液体を取り除くことで除去することができる。
アッセイ試薬に関しては、ピコウェルが反応を行うために使用される場合、例えば、ＤＮＡ配列決定、生化学アッセイ、または培養細胞のアッセイの場合、沈降したビーズをすでに含むピコウェルにアッセイ試薬を添加することができる。ビーズ懸濁液の最初の添加について上述したように、アッセイ試薬の添加はピペットを使用する。アッセイ試薬がすでに各ピコウェルにある溶液と平衡化されている後、９６ウェルプレートの９６ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液、または２４ウェルプレートの２４ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液は、９６ウェルプレートの９６ウェルの各々の壁に接触するか、または２４ウェルプレートの２４ウェルの各々の壁に接触するピペット先端部で抜き取ることができる。
ピコウェルアレイのフローセルの実施形態。ピコウェルアレイは、フローセルの一部であり得、入口および出口を備えた流体チャンバーが、ピコウェルアレイの上部に取り付けられている。かかる実施形態では、本開示のビーズ、細胞、および他のアッセイ材料は、入口から流入し、出口を通って流出し得る。重力または遠心力を使用して、ビーズがフローセルを通って流れるときに、ビーズをピコウェルに留めることができる。
（Ｘ）ピコウェル内のビーズ結合核酸を配列決定する
ビーズ結合核酸は、ビーズに付着したまま配列決定することができる。代替的に、または追加的に、ビーズ結合核酸は、ビーズからのＤＮＡバーコードの切断後に配列決定され得る。
配列決定前にビーズからＤＮＡバーコードを切断する。一部の実施形態では、本開示は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードがビーズから切断され、それにより、増幅の前、または配列決定前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列特定技術の前に、可溶性形態でＤＮＡバーコードを放出する方法を包含することができる。
除外的な実施形態。実施形態では、本開示は、任意の方法、関連する試薬、システム、組成物、またはビーズを除外することができ、ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、増幅の前、または配列決定の前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列特定技術の前に切断される。また、本開示は、ＤＮＡバーコードを含むポリヌクレオチドが切断されるか、または、ＤＮＡバーコードの一部のみを含む核酸が、増幅の前、配列決定の前、もしくは核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列特定技術の前に切断される任意の方法を除外することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）。ＰＣＲ法およびｑＰＣＲ法は、（１）高温でＤＮＡ鋳型を変性させ、低減された温度でプライマーをアニーリングし、最後にＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるように、ＤＮＡ合成を介してプライマーを伸長させる、３工程の方法に依存する（Gadkar and Filion (2014) Curr. Issues Mol. Biol. 16:1-6）。ｑＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」とも称される（Kralik and Ricchi (2017) Frontiers Microbiology. 8 (9 pages))。
ＰＣＲ法およびｑＰＣＲ法の最近の変更または改善には、ヘリカーゼ依存（ＨＤＡ）増幅の使用、内部増幅標準の使用、ロックド核酸（ＬＮＡ）の使用、および阻害剤に結合する添加剤の使用が含まれる（Gadkar and Filion (2014) Curr. Issues Mol. Biol. 16:1-6）。ロックド核酸は、その標的を極めて正確に認識して結合するという利点を提供する。
ｑＰＣＲは、標的ＤＮＡ分子の増幅および定量を同時に行うことができる。ｑＰＣＲ法は、応答曲線が特定の蛍光閾値に到達するために必要な増幅サイクルの数を比較する（Pabinger, Rodiger, Kriegner (2014) Biomolecular Detection Quantification. 1:23-33）。Ｒｅｆｓｌａｎｄらは、ｑＰＣＲを実施するための明らかに典型的な条件の簡潔な記載を提供する（Refsland, Stenglein, Harris (2010) Nucleic Acids Res. 38:4274-4284）。
ＰＣＲプライマーの設計および検証、ならびにアニーリング温度（Ｔａ）、融解温度（Ｔｍ）、伸長工程の温度、緩衝剤の種類などの変数に関するガイダンスが利用可能である（Bustin and Huggett (2017) Biomolecular Detection Quantification. 14:19-28）。
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）。ＤＮＡは、ビーズに付着させたまま増幅させることができる。増幅された形態のＤＮＡは、増幅されていないＤＮＡの配列よりも簡単である。ローリングサークル増幅法では、ＤＮＡタグ（ＤＮＡバーコード）を一本鎖に作製する。一本鎖になると、スプリントオリゴが、タグＤＮＡの末端を架橋するために添加され、その後スプリントオリゴの伸長およびライゲーションが続く。ＤＮＡポリメラーゼ（マイナス５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）を使用すると、ＤＮＡが、スプリントオリゴの伸長を触媒した後、連結可能な接合部が保証される。次に、環状化されたＤＮＡは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼなどの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを加えることにより、ローリングサークル増幅に供され得る。ＤＮＡバーコードタグでローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実行する能力により、任意の生き残ったＤＮＡ分子を簡単に配列決定するのに十分な量に熱増幅させることができるため、ＤＮＡに損傷を与え得る合成化学物質を用いることができる。ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ消化、ニッキング、および高温での融解、または水酸化ナトリウムでの処理によって一本鎖を作製することができる。
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のさらなる詳細は、ＲＣＡの実施に使用することができる次の工程で明らかになる。
工程１：ビーズ結合ｓｓＤＮＡで開始される。ビーズ結合ＤＮＡが最初に二本鎖形態（ｄｓＤＮＡ）になっている場合、ＲＣＡに使用しない鎖は、チミン（Ｔ）の残基が、ビーズ結合末端またはそのすぐ近くで、ウラシル（Ｕ）の残基に置き換えられるように調整することができる。この方法でｄｓＤＮＡを調製すると、ウラシルＮグリコシダーゼを使用して、ウラシル残基を切断し、それによって不安定な糖リン酸を（ＤＮＡ骨格の一部として）残すことができ、この不安定な位置は、ヌクレアーゼ処理によって切断することができる（Ostrander et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3419-3423）。
工程２：「スプリントオリゴ」をビーズ結合ｓｓＤＮＡに添加する。スプリントオリゴは、ビーズに共有結合的に連結されるｓｓＤＮＡの末端（５’末端）で約１０～２０塩基対にハイブリダイズするように設計されており、ビーズ結合ｓｓＤＮＡのフリー末端（３’末端）で約１０～２０塩基対にもハイブリダイズする。スプリントオリゴは、ｓｓＤＮＡのビーズ結合末端をビーズ結合ｓｓＤＮＡのフリー末端に近接させる必要はない。必要とされるすべてのものは、巨大なループを形成するために、ビーズ結合ｓｓＤＮＡ配列の遠端をつなぎ合わせることである。
工程３：スルホロブスＤＮＡポリメラーゼＩＶを添加して、このポリメラーゼがｓｓＤＮＡの巨大なループを鋳型として使用し、片端でスプリントオリゴに共有結合的に付着される相補的な巨大なループを作製する。
工程４：ＤＮＡリガーゼを使用して、相補的な巨大なループを共有結合的に閉鎖し、環状のｓｓＤＮＡをもたらす。ＲＣＡの間に「ローリング」を行うのは、この閉鎖されたｓｓＤＮＡの輪である。
工程５：鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを添加し、ｄＮＴＰを添加する。添加されたＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰをビーズ結合ｓｓＤＮＡに共有結合的に付着させ、ビーズ結合ｓｓＤＮＡの遠位末端を伸長して、「ローリングサークル」上にあるものの相補的なコピーを作製し、次にさらに伸長して、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製し、さらにより伸長して、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製する。潜在的に無限の増幅のこのプロセスの間、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性により、ＤＮＡポリメラーゼの継続的な活性が可能になる。
任意に、本開示の方法は、蛍光分子ビーコンを介したローリングサークル増幅（ＲＣＡ）のリアルタイムモニタリングを含む（Nilsson, Gullberg, Raap (2002) Nucleic Acids Res. 30:e66 (7 pages)）。ＲＣＡ用試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｙｇｎｉｓ ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＴｒｕｅＰｒｉｍｅ（登録商標）ＲＣＡキット）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ ５００（登録商標）増幅キット）から入手可能である。フルオロフォアおよびクエンチャーは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。
工程６．ＲＣＡによって増幅されたｓｓＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、プライマーが添加され、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが添加され、ＰＣＲ産物は、その後、次世代配列決定によって配列決定される。
本開示の一態様では、ＲＣＡ増幅されたｓｓＤＮＡは、ＰＣＲ産物を作製するＰＣＲ増幅の前にビーズから切断される。本開示の別の態様において、ＰＣＲ産物を作製するＰＣＲ増幅は、ビーズからＲＣＡ増幅されたｓｓＤＮＡを切断することなく作製することができる。
Ｂａｎｅｒらによって記載されるように、「ＲＣＡ反応により、環状分子への補体のタンデムコピーの多くを表す鎖を生成することができる」（Baner, Nilsson, Landegren (1998) Nucleic Acids Res. 26:5073-5078）。枯草菌相ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼは、その鎖置換活性および高い処理能力のため、適切な酵素である。ＲＣＡは、Ｌｉらによって以下のように同様に特徴付けられている：「ＲＣＡでは、環状鋳型は、鎖置換特性を有するＤＮＡポリメラーゼｐｈｉ２９によって等温で増幅される。長い一本鎖ＤＮＡ産物は、何千もの配列反復を含む」（Li and Zhong (2007) Anal. Chem. 79:9030-9038）。
本開示のＤＮＡバーコードの配列決定は、いかなる限定を意味することなく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｄｅｒ Ｈｏｒｎの米国特許第８，６３２，９７５号の方法を用いることができる。また、本開示のＤＮＡバーコードは、例えば、サンガー配列決定法などの合成による配列決定を使用する方法によって、または「次世代配列決定」を使用する方法によって配列決定することができる。
ＤＮＡ配列決定のためのイルミナ法。ＤＮＡ配列決定のためのイルミナ法は、以下のとおりである。ＤＮＡは、超音波処理により１００～４００塩基対（ｂｐ）のサイズ範囲に断片化され得る（Hughes, Magrini, Demeter (2014) PLoS Genet. 10:e1004462）。イルミナ法では、ＤＮＡライブラリーが作製され、細胞からのＤＮＡの断片または細胞から、ＤＮＡアダプター（断片の末端に付着される）によって修飾される。反応生成物はサンドイッチの形態をとり、配列決定されるＤＮＡはサンドイッチの中央にある。反応生成物は、（第１のアダプター）－（配列決定されるＤＮＡ）－（第２のアダプター）の形態をとる。アダプター－ＤＮＡ－アダプター複合体は、さらに別のアダプターに関連付けられ、この他のアダプターは、固体表面に共有結合的に付着される。固体表面は、平らなプレートであり得る。固体表面は、平面から突き出る多くのアダプターの芝生を有する。アダプターは、サンドイッチ内であるアダプターの１つに相補的なＤＮＡ配列を有する。実際に、芝生は、２種類のアダプターを含み、１つのアダプターは、複合体内のアダプターの１つに結合（ハイブリダイズ）し、複合体をプレートに非共有結合的に係留する。これらは、「第１の芝生結合アダプター」および「第２の芝生結合アダプター」と称され得る。ＤＮＡポリメラーゼの第１のタスクは、係留された（ただし非共有結合的に結合した）ＤＮＡを鋳型として使用して、娘鎖を作製することであり、ＤＮＡ重合が発生すると、娘鎖は「第１の芝生結合アダプター」に共有結合的に付着した形態になる。この共有結合的な連結は、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用によって生成される。娘鎖が完全に合成された後、遠位末端（媒体に突き出る末端）は、上記で称されたサンドイッチにおける第２のアダプターに相補的なＤＮＡ配列を含む。この相補的なＤＮＡ配列により、新しく合成された娘ＤＮＡの遠位末端が屈曲し、「第２の芝生結合アダプター」にハイブリダイズすることができる。上記で記載されているのは、サンドイッチの両方のアダプターがどのように使用されるか、ならびに「第１の芝生結合アダプター」および「第２の芝生結合アダプター」の両方がどのように使用されるかである。
次に、反応のサイクルが何度も行われ、その結果、元のｄｓＤＮＡの増幅されたバージョンのクラスターになる。実際に、クラスターは共有結合的に付着された（係留された）ｓｓＤＮＡ分子の形態をとり、これらのｓｓＤＮＡ分子のすべては、元のｄｓＤＮＡ（生細胞または組織から単離されたｄｓＤＮＡ）の鎖の１つのみに対応する。係留されたｓｓＤＮＡ分子のこのクラスターは、「ポロニー」と称される。ポロニーの生成は、「ブリッジ増幅」と称される手法によるものである。最後に、ブリッジ増幅およびポロニーの作製後、固体表面に共有結合的に付着されたリバース鎖は、その係留から切断され、洗い流されて廃棄され、フォワード鎖のみが残る。
イルミナ（登録商標）法に関する情報は、Goodwin, McPherson, McCombie (2016) Nature Rev. Genetics. 17:333-351, Gierahn, Wadsworth, Hughes (2017) Nature Methods. 14:395-398, Shendure and Hanlee (2008) Nature Biotechnology. 26:1135-1145, Reuter, Spacek, Snyder (2015) Molecular Cell. 58:586-597, Illumina Sequencing by Synthesis (5 minute video on YouTube)から入手可能である。
オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出による配列決定（ＳＯＬｉＤ配列決定）。ＳＯＬｉＤは、色素標識された分子からの蛍光強度を測定して、ＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ断片のライブラリーは、配列決定される試料から調製され、クローンビーズ集団の調製に使用される（各磁気ビーズの表面に１種類の断片のみ）。ビーズに付着された断片には、すべての断片の開始配列が公知および同一の両方であるように、付着された普遍的なＰ１アダプター配列が与えられる。ＰＣＲが行われ、ビーズに付着したＰＣＲ産物がスライドに共有結合的に結合する。
次に、プライマーは、ライブラリー鋳型内のＰ１アダプター配列にハイブリダイズする。４つの蛍光標識された二塩基プローブのセットは、配列決定プライマーへのライゲーションについて競合する。二塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応の第１および第２のすべての塩基を調べることによって達成される。ライゲーション、検出、および切断の複数のサイクルは、最終的な読み取りの長さを決定するサイクルの数を伴って実行される。一連のライゲーションサイクルに続いて、伸長産物が除去され、鋳型は、２巡目のライゲーションサイクルのｎ－１位置に相補的なプライマーでリセットされる（Wu et al (2010) Nature Methods. 7:336-337を参照されたい）。
ｐＨに基づくＤＮＡ配列決定。ｐＨに基づくＤＮＡ配列決定は、ポリメラーゼ触媒による伸長反応の副産物として生成される水素イオンを測定することにより、塩基の取り込みが決定されるシステムおよび方法である。作動可能に結合したプライマーおよびポリメラーゼをそれぞれ有するＤＮＡ鋳型を反応チャンバーまたはマイクロウェルにロードし、その後、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の添加および洗浄の繰り返しサイクルを行う。ＤＮＡ鋳型は、鋳型がクローン集団として固体支持体に付着される。各々のこのような取り込みにより、水素イオンが放出され、水素イオンを放出する鋳型の集団が集合し、反応チャンバーの局所ｐＨに検出可能な変化を引き起こす（Pourmand (2006) Proc. Nat’l. Acad. Sci.103:6466-6470を参照されたい）。本開示は、ｐＨに基づくＤＮＡ配列決定を除外することができる。
連結されたＤＮＡバーコードに関して、連結されたＤＮＡバーコード全体を１回の実行で配列決定をすることができる（連結されたＤＮＡバーコード全体の配列決定には１つの配列決定プライマーのみが必要である）。代替的に、連結されたＤＮＡバーコードを構成する一部またはすべてのＤＮＡバーコードモジュールを、別々に配列決定に供することができる（別々に配列決定されたＤＮＡバーコードモジュールの各々は、その独自の配列決定プライマーを取得する）。オルソゴナルＤＮＡバーコードに関しては、ＤＮＡバーコードモジュールの各々が、ビーズ上の独自の部位に付着されるという事実により、オルソゴナルＤＮＡバーコードを構成するＤＮＡバーコードモジュールの各々は、それ独自の専用の配列決定プライマーが必要である。
除外的な実施形態。実施形態では、本開示は、マイクロ流体工学、油媒体中に存在する水性液滴、水性試薬を含む第１のチャネルが、油を含む第２のチャネルと接合され、接合領域から始まる第３のチャネルを介して油媒体を移動する水性液滴を生成することにより作製される水性液滴を伴う、任意のシステム、デバイス、デバイスの組み合わせ、および方法を除外することができる。マイクロ流体工学デバイスおよび試薬が記載される（例えば、Brouzes, Medkova, Savenelli (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:14195-14200, Guo, Rotem, Hayman (2012) Lab Chip. 12:2146-2155, Debs, Utharala, Balyasnikova (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. 109:11570-11575, Sciambi and Abate (2015) Lab Chip. 15:47-51を参照されたい）。
他の除外的な実施形態では、除外することができるのは、「ＤＮＡヘッドピース」を構成する任意の試薬、組成物、核酸、もしくはビーズ、または「ＤＮＡヘッドピース」に共有結合的に付着される試薬、組成物、核酸、もしくはビーズである。MacConnell, Price, Paegel (2017) ACS Combinatorial Science. 19:181-192は、ＤＮＡヘッドピースの例を提供し、ビーズは、アジドＤＮＡヘッドピース部分を伴って機能化される。
配列決定法および配列決定試薬に関する追加の除外的な実施形態。実施形態では、本開示は、ＤＮＡ配列決定における「可逆的ターミネーター」の使用を伴わない試薬、システム、または方法を除外することができる。また、除外することができるのは、メトキシ保護基を含まない任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外することができるのは、ＤＮＡ配列決定を伴うが、配列決定されているＤＮＡが、ポリヌクレオチドの順序に関する情報が検出および収集されているときに、ビーズに共有結合的に結合されていない、任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外することができるのは、配列決定反応を行う前にＤＮＡ鋳型を増幅する、例えば、ＰＣＲ技術またはローリングサークル技術により増幅する任意の試薬、システム、または方法である。実施形態では、除外することができるのは、バーコード化、例えば、連結されたである（化学ライブラリーのメンバーの合成に関するすべての情報が、１つの単一の核酸上に存在する）核酸バーコード化の任意の方法である。別の態様において、除外することができるのは、例えば、オルソゴナルである（化合物ライブラリーの所定のモノマーの合成に関する情報が、ビーズ上の複数の付着位置に分散している）核酸バーコード化のようなバーコード化の任意の方法である。ＤＮＡリガーゼに関する除外的な実施形態では、本開示は、核酸バーコードのモジュールを接続するためにＤＮＡリガーゼを使用する任意の試薬、システム、または方法を除外することができる。
フルオロフォア、クエンチャー、およびＦＲＥＴに基づくアッセイ。本開示は、化学ライブラリーのメンバーをスクリーニングするため、または化学ライブラリーの単離されたメンバーを特徴付けるためのフルオロフォアおよびクエンチャーを提供する。ＦＲＥＴは、フェルスター共鳴エネルギー移動である。
アッセイは、ビーズ結合化学ライブラリー上で行うことができる。また、アッセイは、ビーズからの切断後すぐに、フリー化学ライブラリーメンバーで実行することができ、すなわち、ビーズと同じマイクロウェルで、またはビーズと同じヒドロゲルマトリックスの近傍で実行される。さらに、アッセイは、いかなるビーズにも付着されたことがないか、またはビーズから切断され、次に精製されている、可溶性の化学ライブラリーメンバーについて行なうことができる。
本開示の試薬として適切なフルオロフォアには、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６３３、Ａ６４７、Ａｌｅｘａ ６８０、フルオレセイン、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、クマリン、Ａｌｅｘａ ４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ６６０、ＡＴＴＯ６５５、ＡＴＴＯ６４７ｎ、Ｓｅｔａｕ－６６５（ＳＥＴＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、およびジョー色素（４’－５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシ－６－カルボキシフルオレセイン）、ＳＹＢＲグリーンＩ（吸収４９７ｎｍ、発光５２０ｎｍ）、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）（吸収４９２ｎｍ、発光５１８ｎｍ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）（吸収４９２ｎｍ、発光５１８ｎｍ）、ＦＩＴＣ、およびローダミンが含まれる。クエンチャーには、ＴＡＭＲＡクエンチャー、ブラックホールクエンチャー－１（ＢＨＱ１）、ブラックホールクエンチャー－２（ＢＨＱ２）、およびＤＡＢＣＹＬクエンチャーが含まれる。この特許文書における他の場所で開示されているように、ＴＡＭＲＡは、フルオロフォアであり得、クエンチャーでもあり得ることに留意されたい。
ガイダンスは、ＦＲＥＴに基づくアッセイ用の試薬について利用可能であり、ＦＲＥＴ試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャーが含まれる（Johansson (2006) Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching. Methods Mol. Biol. 335:17-29を参照されたい）。ＦＲＥＴに基づくアッセイの例は、「ＳｃｅＤペプチド」の基質を用いたシグナルペプチダーゼ（ＳｐｓＢ）の活性測定を含む。ペプチドに付着したＦＲＥＴペアは、４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）５－（（２－アミノエチル）アミノ）－１－ネフタレンスルホン酸である（Rao et al (2009) FEBS J. 276:3222-3234を参照されたい）。別の例は、ＫＶＳＬＮＦＰＩＬのペプチド基質を用いたＨＩＶ－１プロテアーゼのアッセイに由来する。ドナー／アクセプターＦＲＥＴペアは、ＥＤＡＮＳ（ドナー）およびＤＡＢＣＹＬ（アクセプター）であった。ＥＤＡＮＳ蛍光は、非蛍光ＤＡＢＣＹＬへの共鳴エネルギー移動を介してＤＡＢＣＹＬによって消光され得る（Meng et al (2015) J. Biomolecular Screening. 20:606-615を参照されたい）。さらに別の例は、ボツリヌス毒素のアッセイに由来する。ＳＮＡＰ－２５の活性は、ＢｏＮＴ－Ａの基質を使用して測定することができる。ＦＲＥＴに基づくアッセイでは、基質は、Ｎ末端に連結したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を有し、およびＣ末端に連結したクエンチャーは、４－（４－ジメチルアミノフェニル）ジアゼニル安息香酸（ＤＡＢＳＹＬ）である。ペプチド基質は、ＳＮＡＰ－２５のアミノ酸１９０～２０１に対応される（Rasooly and Do (2008) Appl. Environ. Microbiol. 74:4309-4313を参照されたい）。
本開示は、酵素阻害剤、酵素活性剤を発見および特定し、所定のタンパク質の生体内分解の速度を増強することができる化合物を発見するために、化合物のライブラリーをスクリーニングするための試薬、組成物、ならびに方法を提供する。これらの試薬、組成物、および方法は、ＦＲＥＴに基づくアッセイを使用することができ、代替的に、ＦＲＥＴに基づくアッセイ以外のアッセイを使用することもできる。
分子ビーコンが記載される（Baruch, Jefferey, Bogyo (2004) Trends Cell Biology. 14:29-35を参照されたい）。分子ビーコンは、フルオロフォアがリンカーを介してクエンチャーに結合している試薬である。リンカーは、ヌクレアーゼによって切断可能であり得、したがって、ヌクレアーゼ活性を測定する。本開示は、ヌクレアーゼ阻害因子を特定するために、代替的に、ヌクレアーゼ活性化因子を特定するために、化学ライブラリーをスクリーニングするための方法を提供する。Ｆｅｎｇらは、様々なヌクレアーゼの活性を測定するための分子ビーコンの使用およびＦＲＥＴに基づくアッセイの使用について記載した（Feng, Duan, Liu (2009) Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48:5316-5321）。Ｆｅｎｇらは、様々な制限酵素の活性を測定するためのＦＲＥＴに基づくアッセイの使用を示した。
（ＸＩ）ビーズ結合化合物を放出する
切断性リンカー。提供されるものは、切断することができないリンカーである。また、提供されるものは、切断性リンカーである（Holmes and Jones ((1995) J. Org. Chem. 60:2318-2319, Whitehouse et al (1997) Tetrahedron Lett. 38:7851-7852, and Yoo and Greenberg ((1995) J. Org. Chem. 60:3358-3364, as cited by Gordon et al (1999) J. Chem. Technology Biotechnology. 74:835-851を参照されたい）。また、切断性リンカーには、アルカリ加水分解に存在するアシルスルホンアミドリンカー、ならびに穏やかな条件下で切断される活性化Ｎ－アルキル誘導体、およびアリール－シリコン結合に基づくトレースレスリンカー、およびシリルエーテル連結に基づくトレースレスリンカーも含まれる（Gordon et al (1999) J. Chemical Technology Biotechnology. 74:835-851の８３９および８４２頁に記載される）。さらに、提供されるのは、切断時にＣ末端アルデヒドを生成する酒石酸に基づくリンカーであり、切断は、過ヨウ素酸酸化によるものである（Paulick et al (2006) J. Comb. Chem. 8:417-426を参照されたい）。
図３は、本開示の組成物および方法に適した様々な切断性リンカーを開示する。図３は、Yinliang Yang (2014) Design of Cleavable Linkers and Applications in Chemical Proteomicsの表１から複製される。Technische Universitat Munchen Lehrstuhl fur Chemie der Biopolymere。図３から、本開示に好ましい切断性リンカーは、ａ、ｃ、ｄ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｔのリンカーである。リンカーｐが、本明細書に開示される実験結果で使用された。これらの切断条件は、ＤＴＴ（リンカーａ）、Ｎａ２ＳＯ４（リンカーｃ）、Ｎａ２ＳＯ４（リンカーｄ）、ＵＶ光（リンカーｐ）、ＵＶ光（リンカーｑ）、ＵＶ光（リンカーｒ）、およびＴＥＶプロテアーゼ（リンカーｔ）である。これらの特定の切断条件は穏やかであり、ビーズを損傷したり、ビーズ結合化合物を損傷したり、ビーズ結合化合物の化学ライブラリメンバー（単位）を損傷したりすることは期待されない。
クリックケミストリーと適合性のある化学的に切断性リンカー。Ｑｉａｎら（２０１３）は、クリックケミストリーと適合性のある多くの切断性リンカーについて記載する（Qian, Martell, Pace (2013) ChemBioChem. 14:1410-1414）。これらには、アゾ結合を有するリンカーが含まれ、アゾ結合は、亜ジチオン酸塩で切断可能である。このリンカーの構造は以下のとおりである：Ｒ１－ベンゼン１－Ｎ＝Ｎ－ベンゼン２－Ｒ２。第１のベンゼン環は、Ｒ１に対してパラの水酸基を有し、第２のベンゼン環は、Ｒ２に連結するカルボニル基を有し、このカルボニル基は、アゾ部分に対してパラである。
光不安定性切断性リンカー。本開示は、ｏ－ニトロベンジル基を有する光切断性リンカーを包含する。この基は、３３０～３７０ｎｍでの照射により切断することができる（Saran and Burke (2007) Bioconjugate Chem. 18:275-279, Mikkelsen, Grier, Mortensen (2018) ACS Combinatorial Science. DOI:10.1021を参照されたい）。ｏ－ニトロベンジルリンカーよりも光分解時間が短いリンカーは、２－（２－ニトロフェニル）－プロピルオキシカルボニル（ＮＰＰＯＣ）リンカーである。ｏ－ニトロベンジルリンカーの変形形態は、ｏ－ニトロベンジルアミノリンカーである。ペプチド鎖に付着し、その後切断されると、このリンカーはアミドを放出する。ｏ－ニトロベラトリル基を有するリンカーが利用可能であり、これらは非置換ｏ－ニトロベンジルリンカーよりも短い光分解時間、およびより大きな放出収率を有する。フェナシルリンカー、ベンゾインリンカー、およびピバロイルリンカーも利用可能である（Mikkelsen et al (2018) ACS Combinatorial Science. DOI:10.1021を参照されたい）。
光切断性エーテル結合を有するリンカーが利用可能である。この光切断性リンカーは、リンカーがビーズに付着されており、切断性基が「Ｒ基」である場合に使用することができ、切断後、解放された基は、ＲＯＨの形態をとる（Glatthar and Giese (2000) Organic Letters. 2:2315-2317を参照されたい）。光切断性エステル結合を有するリンカーも利用可能である（Rich et al (1975) 97:1575, Renil and Pillai (1994) Tetrahedron Lett. 35:3809-3812, Holmes (1997) J. Org. Chem. 62:2370-2380を参照されたく、GlattharおよびGiese（前掲）によって引用される）。リンカーのエーテル結合は、酸、塩基、酸化、還元、およびフッ化物感受性シリル－酸素結合切断、および光分解によって切断することができる（GlattharおよびGiese、前掲）。
ペプチド（Ｒ１）および核酸（Ｒ２）を連結するために使用されている別の光切断性リンカーは、以下のとおりである。Ｒ１は、ベンジル基のメチレン部分に直接的に接続される。メチレン基に対するパラは、環が付着したニトロ基である。メチレン部分に対するメタは、環が付着したエチル基である。エチル基の１炭素は、リン酸を有する。このリン酸の酸素原子にＲ２基が付着される（Olejnik et al (1999) Nucleic Acids Res. 27:4626-4631）。
Ａｋｅｒｂｌｏｍらは、アミノ、ヒドロキシル、ブロモ、およびメチルアミノ基、ならびに４－ニトロフェノキシカルボニル活性化ヒドロキシルおよびアミノ基を含む、アルファ－メチル２－ニトロベンジルタイプの光不安定性リンカーを開示する（Akerblom and Nyren (1997) Molecular Diversity. 3:137-148を参照されたい）。カテプシンＢは、標的配列である「バリン－シトルリン」を有するリンカーを切断することができる（Dal Corso, Cazzamalli, Neri (2017) Bioconjugate Chemistry. 28:1826-1833）。
酵素切断性リンカー。プロテアーゼなどの酵素によって切断可能なリンカーが利用可能である（Leriche, Chisholm, Wagner (2012) Bioorganic Medicinal Chem. 20:571-582を参照されたい）。ヒドロキシメチルフェノキシリンカーは、キモトリプシンで切断することができる（Maltman, Bejugam, Flitsch (2005) Organic Biomolecular Chem. 3:2505-2507）。タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断可能なリンカーが利用可能である（Weerapana, Speers, Cravatt (2007) Nature Protocols. 2:1414-1425, Dieterich, Link, Graumann (2006) Proc. Nat’l. Acad. Sci. 103:9482-9487を参照されたい）。ＬＶＰＲＧおよびＬＶＰＲＧＳのリンカー配列は、トロンビンによって切断することができる（Jenny, Mann, Lundblad (2003) Protein Expression Purification. 31:1-11）。プラスミン切断性リンカーが利用可能である（Devy, Blacher, Noel (2004) FASEB J. 18:565-567）。
ビーズ結合放出モニター。本開示は、ビーズ結合化合物の放出を評価することが可能な新規であり、固有の放出モニターを提供する。放出モニターは、フルオロフォアおよびクエンチャーのビーズ結合複合体の形態をとり、フルオロフォアは、切断性リンカーを介してビーズに接続される。好ましくは、切断性リンカーは、光切断性リンカーである。好ましくは、ビーズ結合放出モニターは、専用のピコウェル内に配置され、そのピコウェルは、他の種類のビーズを含まない。光切断性リンカーが切断されると、フルオロフォアはビーズから放出され、ピコウェル内の媒体に拡散し、ビーズ結合クエンチャーからある程度の距離を達成し、その結果、放出量に比例する蛍光が増強する。蛍光の増強により、ピコウェル内にある遊離フルオロフォアの濃度の計算が可能になり、さらに重要なことに、他のウェル内にある他のビーズから放出される化合物の量の計算が可能になる。
要約すると、ビーズ結合放出モニターは、それ独自の専用のウェル内に位置し、他のウェルは、薬物候補であるビーズ結合化合物を含む。
図８は、ビーズ結合放出モニターの好ましい非限定的な例の簡易化されたバージョンを開示する。放出モニターは、フルオロフォアの近くに保持されるクエンチャーの形態をとり、フルオロフォアのクエンチングをもたらす。実施形態では、クエンチングは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９５％などである。ピコウェルにおいて、１つのビーズは、放出モニター専用であり、別のビーズまたは複数のビーズは、化合物を付着することおよびＤＮＡライブラリーを付着することに使用される。ピコウェル内のすべてのビーズをＵＶ光に曝露すると、フルオロフォアおよび化合物が同時に切断される。ＱＳＹ７は、好ましいクエンチャーである。ＱＳＹ７の構造およびＣＡＳ番号は、以下のとおりである（下記を参照されたい）：
ＣＡＳ名／番号：キサンチリウム、９－［２－［［４－［［（２，５－ジオキソ－１－ピロリジニル）オキシ］カルボニル］－１－ピペリジニル］スルホニル］フェニル］－３，６－ｂｉｓ（メチルフェニルアミノ）－、塩化物 ３０４０１４－１２－８
クエンチャーからのフルオロフォアの分離により生じる蛍光の増加を使用して、同時に放出された化合物のピコウェル中での濃度を推測し得る。同様に、クエンチャーからのフルオロフォアの分離により生じる蛍光の増加を使用して、ピコウェル中において遊離形態で存在する分子（元はビーズ結合化合物であった化合物の形態を取る分子）の数を推測し得る。より好ましい実施形態では、放出モニターは、クエンチャーおよびフルオロフォアを含み、切断によりフルオロフォアが放出される（クエンチャーは放出されない）。この実施形態は、下記のあまり好ましくない実施形態と比べてバックグラウンドノイズが低い。あまり好ましくない実施形態では、切断によりクエンチャーが放出され、ビーズ結合フルオロフォアからの蛍光の増加の形態が読み取られる。
放出モニターは、ビーズからの可溶性化合物のＵＶにより誘導される放出後に、この化合物の濃度の測定値をユーザーに提供する。好ましい実施形態では、ビーズの１つのタイプは、放出モニター専用である。「専用」とは、このビーズが、ビーズ結合化合物だけでなくビーズ結合ＤＮＡライブラリーも含まないことを意味する。
一般命題として、化合物が感光性リンカーの切断によりビーズから放出されているからといって、この化合物が可溶性化合物になったと推論すべきではない。第一に、化合物が「疎水性である」とみなされるかまたは「水不溶性である」とみなされるからといって、この分子が溶媒中で自由に移動していないことを意味するものではないことに留意されたい。例えば、コレステロールであっても、水中での溶解度が測定可能である（Saad and Higuchi (1965) Water Solubility of Cholesterol. J. Pharmaceutical Sciences. 54:1205-1206を参照されたい）。さらに、界面活性剤、洗浄剤、ＤＭＳＯ等の添加剤、またはヒト血清アルブミン等の担体により、ビーズ結合水不溶性化合物の生化学的効果を増加させ得る。そのため、放出モニターを使用して、ピコウェルが上記薬剤の内の１つを含む条件下で、或いは水不溶性化合物が、ピコウェル内で培養された生細胞の形質膜の近くに放出される条件下で、水溶性が低いかまたは水不溶性である化合物の全濃度を評価し得る。
図９は、ビーズ結合放出モニターの好ましい実施形態の簡略版を開示しており、図１０は、ビーズ結合放出モニターのこの好ましい実施形態の完全な且つ詳細な構造を開示している。
図３０は、ビーズがピコウェル中に存在する場合のビーズ放出モニターの使用を示すデータを提供する。光切断性リンカーを使用して結合しているビーズ結合フルオロフォアは、ＴＡＭＲＡ（励起波長５３０ｎｍ、発光波長５７０ｎｍ）であった。この図は、ビーズからのフルオロフォアの放出の時間経過を示す。これは、ｔ＝０秒、ｔ＝１秒、ｔ＝１１秒、およびｔ＝７１秒での蛍光データの取得であるビーズ結合放出モニターの操作を示す。図３０はまた、４つのより小さい図の内の２つに関して、これらのより小さい図の引き伸ばしを示す挿入図も含む。図３０は、アスパルチルプロテアーゼであるカテプシン－Ｄと、「ペプチドＱ－蛍光基質」およびビーズとのインキュベーションから得られた。試薬を、４℃でウェルに入れた。３６５ｎｍでの紫外線を使用して、ビーズからフルオロフォアを切断し、それにより、このフルオロフォアが放出されてクエンチャーから分離された。このアッセイの目標は、別のウェルで行なわれる放出の時間経過を評価することであり、この別のウェルには、別のタイプのビーズが含まれていた。この異なるタイプのビーズは、同一の光切断性リンカーを有したが、この光切断性リンカーは、ペプスタチン－Ａに結合していた。放出されたペプスタチン－Ａは、同一のアッセイ媒体中に存在するアスパルチルプロテアーゼに結合して阻害し得る。ビーズ結合ペプスタチン－Ａおよびアスパルチルプロテアーゼを備えるこのセットアップは、陽性対照として機能し得る。
ＵＶを、２０倍対物レンズを通して照射した。画像をＧａｉｎ＝５で取得し、露出は４００ｍｓであった。５３０ｎｍでのＴＡＭＲＡでの励起。ＴＡＭＲＡは、５７０ｎｍで発光する。
図３５は、ビーズ結合ペプスタチン－Ａが放出され、放出されたペプスタチン－Ａが酵素阻害をもたらす酵素アッセイのさらなる詳細を開示する。光切断性ペプスタチン－Ａ（陽性対照）および共有結合性Ｃｙ５標識を示す１０μｍ ＴｅｎｔａＧｅｌビーズと、光切断性Ｆｍｏｃ－バリン（陰性対照）を示す１０μｍ ＴｅｎｔａＧｅｌビーズとを、ＰＢＳＴ緩衝剤中で混合した。このビーズ集団をピコウェルに導入し、次いで緩衝剤を、カテプシン－ＤプロテアーゼおよびペプチドＱ－Ｆｌｕｏｒ基質（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）を含むプロテアーゼ阻害アッセイへと交換した。ウェルを空気で封入し、スライド全体にＵＶ（３６５ｎｍ、７７Ｊ／ｃｍ２）を照射し、感光性リンカーを切断し、約１３μＭに達するまで化合物を放出させた。このフローセルを、インキュベートした（３０分、３７℃）。陽性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン－Ｄによるペプチドタンパク質分解を阻害するため、蛍光シグナルが低いはずである。陰性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン－Ｄ阻害を全く示さず、空のウェルと同様の蛍光強度のはずである。
クエンチャーおよびフルオロフォアに関する用語は、所与の化学物質に関して、その近傍に存在する他の化学物質が何かに応じて変化し得る。ビーズ結合放出モニターの実験室データで使用されるＴＡＭＲＡは、フルオロフォアであるが、他の文脈では、ＴＡＭＲＡはクエンチャーであり得る。ＴＡＭＲＡは、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡを含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ中ではクエンチャーとして機能する。
実験セットアップおよび実験室データの追加の説明。本開示は、空気により区画化されている充填ピコウェル内のリン酸緩衝剤（１０ｍＭのリン酸、１５４ｍＭのナトリウム、ｐＨ８．０）中における制御された５（６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）濃度に関するデータを提供する。濃度対蛍光強度の較正曲線を生成するための、取り込まれた蛍光画像（１０ｍｓ、２ｍｓ露光）および平均ピクセル強度（ｎ≧１００）により定量化されたウェル領域。上記のデータは標準曲線の形を取っており、様々な所定濃度の遊離ＴＡＭＲＡ（２、１０、３０、６０、１００ｍＭのＴＡＭＲＡ）での蛍光を示す。この標準曲線を、２種の異なる条件（即ち、画像を、２ミリ秒の露光で取得したか、または１０ミリ秒の露光で取得した）下で作成した。この標準曲線を作成するために使用する実験を、ピコウェルで実行したが、この実験ではビーズを全く使用しなかった（既知の量のＴＡＭＲＡのみ）。この画像は、この特許文献では示されておらず、なぜならば、このデータは、較正曲線とも呼ばれる場合がある標準曲線の形を取るだけだからである。
実験セットアップは、下記を含んだ。スキームＸ）に関して、ＴｅｎｔａＧｅｌ－Ｌｙｓ（ＰＣＬ１－Ｔａｍｒａ）－ＱＳＹ７ビーズ構造。ＱＳＹ７（灰色）は、光切断性リンカー（紫色）を介してビーズに供給結合した状態で、Ｔａｍｒａフルオロフォア（オレンジ色）を消光する。ＵＶ（３６５ｎｍ）の照射により、化合物の放出の定量がｉｎ ｓｉｔｕで行なわれる。
図３１は、クエンチャー－フルオロフォア基質に対するアスパルチルプロテアーゼの触媒作用後に得られる発光データを開示する。蛍光がより大きいことは、この酵素は触媒活性がより高いことを意味する。蛍光がより小さいことは、この酵素は触媒活性がより低いことを意味しており、即ち、阻害剤がビーズから遊離し、光切断性リンカーの切断により自由度が得られた場合には、この酵素は、遊離阻害剤によってより阻害される。ＵＶ放出およびカテプシン－Ｄアッセイインキュベーション（λｅｘ＝４８０ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）の後に、画像を取り込んだ。陽性対照ビーズを含むウェルを、Ｃｙ５フルオロフォア（λｅｘ＝６４５ｎｍ、λｅｍ＝６６５ｎｍ、オレンジ色の偽色）によりスペクトル的に識別し得た。切片を、オープンウェル容量全体でのラインプロットにより分析しており、陰性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン－Ｄ阻害を誘発しない。陽性対照ビーズを含むウェル内でのアッセイ量は暗く、強い阻害を示している。空のウェル内のアッセイ量は、陰性対照ビーズを含むウェルと同等である。
図３２は、下記の手順を示す。さらにスキームＸ）に関して、ピコウェル基質（１つのウェル当たり４６ｐＬ）を、フローセルに封入し、ウェルを真空下で濡らし、ＴｅｎｔａＧｅｌ－Ｌｙｓ（ＰＣＬ１－ＴＡＭＲＡ）－ＱＳＹ７ビーズの懸濁液を導入し、フローセル全体にわたり空気を引き込み、各ウェルを区画化する（上部）。フローセルに、光束が制御されているＵＶ ＬＥＤ（λｍｅａｎ ３６５ｎｍ）を照射し、平衡化を可能にした（２０分）後、蛍光顕微鏡画像を撮影して、放出された化合物（ＴＡＭＲＡ）の濃度を定量化する（下部）（図３２）。詳細には、図３２は、ピコウェルの断面図を示しており、フローセル内でピコウェルを濡らす工程、懸濁液中のビーズがピコウェル上に導入され、ピコウェル毎に１つのビーズが得られる工程、過度の分散溶液を減少させ、その結果、メニスカスがピコウェルプレートの平面上面の表面より下に落とすために、フローセル全体にわたり空気を引き込む工程、ＵＶ露光を制御し（３６５ｎｍ）、その結果、いくつかのＴＡＭＲＡが放出される工程、およびＴＡＭＲＡからの発光を誘発して蛍光顕微鏡で蛍光シグナルを検出する工程（励起５３１／４０ｎｍ）（発光５９４／４０ｎｍ）を示す。「スラッシュ４０」という表記は、帯域幅を指しており、即ち、カットオフフィルタが光を５３１ｎｍ±２０ｎｍおよび５９４ｎｍ±２０ｎｍの範囲に制限したことを意味している（このスラッシュ表記は、励起波長に使用され得、発光波長にも使用され得る）。
本発明者らは、下記のデータを示す写真を取得した（図３３を参照されたい）。ピコウェルフローセル内でのＵＶ ＬＥＤ（３６５ｎｍ）露光後での、１０μｍ ＴｅｎｔａＧｅｌ－Ｌｙｓ（ＰＣＬ１－ＴＡＭＲＡ）－ＱＳＹ７ビーズから放出されたフルオロフォア（ＴＡＭＲＡ）の蛍光発光（λｅｘ ５３１／４０ｎｍ、λｅｍ ５９３／４０）。Ａ）ＱＳＹ７のＦＲＥＴ消光効果により、ＵＶ露光前のバックグラウンド（０Ｊ／ｃｍ２）を超える有意の発光はない。ＴＡＭＲＡ放出は、（Ｂ）２５Ｊ／ｃｍ２、（Ｃ）２５７Ｊ／ｃｍ２、（Ｄ）４８９Ｊ／ｃｍ２、（Ｅ）７２１Ｊ／ｃｍ２、（Ｆ）９５３Ｊ／ｃｍ２のＵＶ露光後に平衡となり（２０分）、次いで適切な露光時間を使用して画像化した。各ビーズを囲む体積内で蛍光発光を測定して、ＴＡＭＲＡ濃度を測定した（図３３）。「スラッシュ４０」という表記は、帯域幅を指しており、即ち、カットオフフィルタが光を５３１ｎｍ±２０ｎｍの範囲に制限したことを意味している（このスラッシュ表記は、励起波長に使用され得、発光波長にも使用され得る）。
下記は、本発明者らによる、ＵＶ露光（３６５ｎｍ）後のピコウェル（４５ｐＬ）内のビーズ放出ＴＡＭＲＡの濃度である、ビーズ結合放出モニターの試験および使用からの蛍光データの内のいくつかの解釈である（図３４を参照されたい）。画像解析では、ビーズ充填ウェルの周囲の溶液の平均ピクセル強度（ｎ≧１４）を使用し、画像露光時間に対して正規化し、次いでピコウェル中の既知のＴＡＭＲＡ濃度の標準曲線と相関させた。エラーバーは、１σを表しており、ＲＳＤ％から算出した。ＵＶ放出化合物濃度は、１．１μＭ（ＲＳＤ％８．９）、５４．３μＭ（ＲＳＤ％５．２）、１４２μＭ（ＲＳＤ％４．２）、１７４μＭ（ＲＳＤ％７．７）、１９７．３μＭ（ＲＳＤ％１０．１）であった（図３４）。
（ＸＩＩ）化合物の生化学アッセイ（細胞ベースではないアッセイ）
ピコウェル内のビーズを使用して、様々な生化学アッセイが可能である。非限定的な例として、結合アッセイ、酵素アッセイ、触媒アッセイ、蛍光に基づくアッセイ、ルミネセンスに基づくアッセイ、散乱に基づくアッセイ等が挙げられる。例を下記で詳述する。
プロテアーゼおよびペプチダーゼの阻害剤に敏感な生化学アッセイ。プロテアーゼを阻害する薬物を検出して次いで開発することを目標とする場合には、スクリーニングアッセイは、特定のプロテアーゼまたはペプチダーゼの混合物、好適な切断性基質、および候補薬物化合物による阻害の程度に敏感な色に基づくアッセイまたは蛍光に基づくアッセイを使用し得る。例えば、ある試薬は、ビーズ結合化合物であって、活性に関して未だ試験されていない化合物であり得る。別の試薬は、ビーズ結合ペプスタチン（ＨＩＶ－１プロテアーゼの確立された阻害剤）の形を取り得る（Hilton and Wolkowicz (2010) PLoS ONE. 5:e10940 (7 pages)）。さらに別の試薬は、ＨＩＶ－１プロテアーゼの切断性基質であり得、ＨＩＶ－１プロテアーゼによる切断により、色の変化または蛍光の変化が生じる。特定のアッセイ（所与のマイクロウェル中）が色の差違（または蛍光の差違）を生じる場合に、陽性スクリーニング薬物候補が特定される。切断性基質は、クエンチャーおよび蛍光剤に共有結合してこれらに隣接する感受性ペプチドの形を取る。切断前は、フルオロフォアは、近くのクエンチャーのために蛍光を発しないが、切断後は、蛍光が生じる（Lood et al (2017) PLoS ONE. 12:e0173919 (11 pages)、Ekici et al (2009) Biochemistry. 48:5753-5759、Carmona et al (2006) Nature Protocols. 1:1971-1976を参照されたい）。本開示の試薬および方法は、上記で開示されている技術を包含する。
試薬がＭＤＭ２（酵素）およびｐ５３（基質）を含む、ユビキチンリガーゼを阻害する化合物に関する酵素に基づくスクリーニングアッセイ。出願人らは、下記の技術に基づいて、実用試験を実行した。ＭＤＭ２は、細胞中におけるｐ５３の量を調節する。ＭＤＭ２は、いくつかのがんにおいて過剰発現されている。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、精製されたＭＤＭ２・・・は、ｐ５３をユビキチン化するのに十分であることが示されている」（Leslie et al (2015) J. Biol. Chem. 290:12941-12950）との記述から分かるように、ＭＤＭ２は酵素である。出願人の目標は、ＭＤＭ２の阻害剤を発見することであり、これらの阻害剤は、ｐ５３のユビキチン化を減少させ、そのため、その後のｐ５３の分解を減少させることが期待される。細胞中におけるｐ５３の予想される増加を考慮して、上記の性質を有する阻害剤は、がんの処置に有用であることが期待される。
出願人らは、ＭＤＭ２／ＨＤＭ２により媒介される、ｐ５３のユビキチン化へのレナリドマイドの影響を評価するために、下記の酵素に基づくアッセイを使用した。出願人らは、下記のキットの試薬を使用した：ＭＤＭ２／ＨＤＭ２ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｋｉｔ－ｐ５３ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。このアッセイで使用する試薬の１つは、抗体が共有結合しているビーズであった。このビーズは、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）Ｍ ＮＨ２（カタログ番号Ｍ３０１０２、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であり、この抗体は、マウス中で生合成された抗ヒトｐ５３モノクローナル抗体であった。ＭＤＭ２は、基質としてｐ５３を使用し得るＥ３リガーゼであり、ＭＤＭ２は、ｐ５３のユビキチン化を触媒する。
がんを減少させるためのｐ５３の活性化という目標。「ｐ５３」と呼ばれる転写因子であるＭＤＭ２と、抗がん治療との間の関係は、下記の説明により示唆される。その説明とは、「ＭＤＭ２は、ｐ５３をユビキチン化してプロテアソーム分解の標的とするＥ３ユビキチンリガーゼである」（Ortiz, Lozano (2018) Oncogene. 37:332-340）である。ｐ５３は、腫瘍抑制活性を有する。ｐ５３活性は、ＭＤＭ２により阻害される可能性がある。Ｗｕ他によれば、ＭＤＭ２は「ｐ５３結合タンパク質」である（Wu, Buckley, Chernov (2015) Cell Death Disease. 6:e 2035を参照されたい）。化合物が、例えばＭＤＭ２とｐ５３との相互作用をブロックすることによりｐ５３のユビキチン化を防ぐ場合には、この化合物は、抗がん剤として機能することが予想される。
このスクリーニングアッセイの目標。このスクリーニングアッセイの目的は、ｐ５３のユビキチン化に影響を及ぼす化合物を発見することであり、例えば、ｐ５３ユビキチン化を刺激する化合物、およびｐ５３ユビキチン化を阻害する化合物を発見することである。詳細には、この目的は、阻害しているかまたは活性化している化合物を発見することであり、これらの効果は、ＭＤＭ－２と、Ｅ１リガーゼ、Ｅ２リガーゼ、またはＥ３リガーゼのいずれかとを介する。ＭＤＭ２は、「マウス二重微小染色体」を意味している。ＭＤＭ２は、「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」と呼ばれている。ＭＤＭ２が細胞中に存在する場合には、証拠から、ｐ５３のユビキチン化の触媒でのその活性には、ＣＵＬ４Ａ、ＤＤＢ１、およびＲｏＣ１等の多くの他のタンパク質が必要であることが示唆されている（Banks, Gavrilova (2006) Cell Cycle. 5:1719-1729、Nag et al (2004) Cancer Res. 64:8152-8155を参照されたい）。Ｂａｎｋｓ他は、「Ｌ２ＤＴＬ、ＰＣＮＡ、およびＤＤＢ１／ＣＵＬ４Ａ複合体は、ｐ５３腫瘍抑制因子およびその制御因子ＭＤＭ２／ＨＤＭ２と物理的に相互作用することが分かった」として、ｐ５３およびＭＤＭ２が関与する物理的相互作用を説明している（Banks, Gavrilova (2006) Cell Cycle. 5:1719-1729）。Ｎａｇ他もまた、「Ｃｕｌ４ＡはＥ３リガーゼとして機能し、ユビキチン－プロテアソーム経路を介していくつかの制御タンパク質のタンパク質分解に関与している。ここで、我々は、Ｃｕｌ４ＡがＭＤＭ２およびｐ５３と会合することを示す」として、ｐ５３およびＭＤＭ２が関与する物理的相互作用を説明している（Nag et al (2004) Cancer Res. 64:8152-8155）。
ｐ５３ユビキチン化のモジュレータに関するビーズに基づくアッセイからの望ましい読取り。化合物のスクリーンニングにより陽性スクリーニングヒットが得られる場合には、即ち、ＡＦ４８８蛍光がより多い場合には、このことは、活性化剤が発見されたことを意味する。そして、化合物のスクリーニングにより陽性スクリーニグヒットが得られる場合には（蛍光が減少している場合には）、このことは、阻害剤が発見されたことを意味する。ｐ５３のユビキチン化を阻害する化合物は、この化合物ががんの処置に使用され得ることを示唆する。また、ｐ５３のユビキチン化を特異的に阻害する化合物（即ち、他のタンパク質のユビキチン化を阻害しない化合物、または他のタンパク質のユビキチン化を阻害するがｐ５３の場合と比べて阻害がそれほどひどくない化合物）も、この化合物ががんの処置に使用され得ることを示唆する。
材料。材料は、Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏｃｈｅｍのＥ３ ＬｉｇａｓｅキットＫ－２００Ｂを含んだ。Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍのカタログは、このキットをＭｄｍ２／ＨＤＭ２ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｋｉｔ－ｐ５３ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅと説明している。下記は、このキットの一部であるＭｄｍ２に関するものである。このキットは、セレブロンを含まない。レナリドマイドおよび類似の化合物は、セレブロンまたはＭｄｍ２に結合し得、その結果、ユビキチンリガーゼが活性化される。材料はまた、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｇｌａｓｓ顕微鏡用スライド，２５ｍｍ×７５ｍｍ（Ｇｌｏｂｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ）も含んだ。Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｔｉｒｒｅｒ／Ｈｏｔ Ｐｌａｔｅ（０から１０までの設定）６９８ワット、Ｍｏｄｅｌ ＰＣ－４２０。Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）。メチルテトラジン（ｍＴＥＴ）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＴｅｎｔａＧｅｌ ビーズＭ ＮＨ２（カタログ番号Ｍ３０１０２）（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ）。パラフィルム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。図８は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８の構造を示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）の構造は、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－Ｎａｎｏｇｏｌｄ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）に示されている。
（ＸＩＩＩ）化合物用の細胞に基づくアッセイ
ピコウェル中で実行される細胞に基づくアッセイは、ヒト細胞、非ヒト細胞、ヒトがん細胞、非ヒトがん細胞、細菌細胞、寄生生物の細胞（例えば、マラリア原虫細胞）を使用し得る。また、細胞に基づくアッセイを、「死滅しているが代謝活性がある」（即ち、代謝は可能ではあるが細胞分裂しないようにゲノムが架橋されている）ヒト細胞または非ヒト細胞により実行し得る（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｕｂｅｎｓｋｙの米国特許出願公開第２００７／０２０７１７０号明細書を参照されたい）。さらに、細胞に基づくアッセイを、アポトーシス細胞、壊死細胞、または死滅細胞により実行し得る。細菌細胞による細胞に基づくアッセイを使用して、抗生物質に関してスクリーニングし得る。ウイルスに感染しているヒト細胞を使用して、抗ウイルス剤に関してスクリーニングし得る。細胞に基づくアッセイに、細胞の組合せを提供する。例えば、抗原提示を刺激する化合物あるいは抗原提示を損なう化合物に関してスクリーニングしてこれらの化合物を特定するために、樹状細胞とＴ細胞との組合せを提供する。
細胞に基づくアッセイは、例えば、正常組織の生検、固形腫瘍、血液がん、または循環固形腫瘍細胞からの生検から得られる細胞の初代培養物に基づき得る。また、細胞に基づくアッセイは、１回または複数回継代している細胞に基づき得る。
ピコウェル中で実行される細胞に基づくアッセイは、１つのみの細胞を含む培養物を使用し得るか、または２つの細胞、３つの細胞、４つの細胞、５つの細胞、もしくは約２つの細胞、約３つの細胞、約４つの細胞、約５つの細胞、もしくは複数の細胞、もしくは３つ未満、４つ未満、５つ未満の細胞等を含む培養物を使用し得る。
出願人は、下記の技術に基づく実用試験を実行している。これは、レナリドマイド（試験化合物）が転写因子のユビキチン媒介タンパク質分解を阻害する例示的な実施形態の化合物をスクリーニングするための細胞に基づくアッセイを説明する。この転写因子として、ＩｋａｒｏｓおよびＡｉｏｌｏｓが挙げられる。
本開示は、ビーズ結合化合物の化合物をスクリーニングする細胞に基づくアッセイを提供し、スクリーニングを、多くのピコウェルを有するプレートにより実行する。この細胞に基づくアッセイの構成要素として、ビーズ結合化学物質ライブラリーを保持するためのピコウェルが挙げられ、各ビーズは、実質的に１種のみの均一なタイプの化合物に結合している。この化合物は、切断性リンカーにより放出される。このピコウェル中で、哺乳類細胞を培養する。このピコウェルはまた、培養培地も含む。レナリドマイドによる本開示の非限定的な例は、所与の標的タンパク質のユビキチン化を調節する他の化合物を発見するための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る原理証明の一例である。
細胞に基づくアッセイのより短い説明。組換え細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のタンパク質分解を誘発する化合物を検出してスクリーニングするための試薬として使用し、陽性スクリーニング化合物を特定する読取りは、緑色に着色された細胞が無色の細胞または緑色が減少した細胞になる状態である。この細胞に基づくアッセイのメカニズムに関して、緑色に着色された細胞を無色の細胞または緑色が減少した細胞にするレナリドマイドの作用のメカニズムは、レナリドマイドが「セレブロン」と呼ばれるタンパク質に結合することである。細胞中では、セレブロンは、「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」と呼ばれるタンパク質の複合体の一部である。セレブロンは、抗がん剤であるレナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドの直接標的である。Ｅ３ユビキチンリガーゼの正常で恒常的な活性、およびそのセレブロンとの関係は、「セレブロン・・・は、・・・Ｅ３ユビキチンリガーゼに関与することにより［標的タンパク質の」プロテオソーム分解を促進する」と説明されている（Akuffo et al (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200を参照されたい）。Ｅ３ユビキチンリガーゼの通常の活性とは対照的に、レナリドマイド、サリドマイド、またはポマリドマイド等の薬物を添加した場合には、結果は、「レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイド・・・は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ・・・による・・・基質のユビキチン化および分解を促進し、これらの薬物のそれぞれは、転写因子ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦ３の分解を誘発する」ということである（Kronke et al (2015) Nature. 523:183-188）。
用語法に関して、セレブロンは、「Ｅ３リガーゼ」と呼ばれており「Ｅ３ユビキチンリガーゼ」とも呼ばれているタンパク質の複合体の一部であると説明されている。一般的に、セレブロン自体は、「Ｅ３リガーゼ」とは呼ばれていない。下記の抜粋は、「セレブロン」という単語がどのように使用されるかを明らかにする。Akuffo et al (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200によれば、「サリドマイドへの結合時に・・・、Ｅ３リガーゼ基質受容体セレブロン・・・は、ＤＤＢ１－ＣＵＬ４Ａ－Ｒｏｃ１－ＲＢＸ１ Ｅ３ユビキチンリガーゼに関与することにより［基質の］プロテオソーム破壊を促進する」。一貫して、Yang et al (2018) J. Biol. Chem. 293:10141-10157では、「セレブロン・・・は、タンパク質［基質］ユビキチン化を媒介するためのカリン－４ ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの基質受容体として機能する」ことが開示されている。Zhu et al (2014) Blood. 124:536-545では、「サリドマイドは、ＣＲＢＮ［セレブロン］に結合して、ＣＲＢＮ、ＤＤＢ１、およびＣＵＬ４で構成されているＥ３ユビキチンリガーゼ複合体・・・の機能を変更する」ことが述べられている。Lopez-Girona et al (2012) Leukemia. 26:2326-2335では、「研究から、サリドマイド・・・ＣＲＢＮの直接分子標的・・・としてＥ３リガーゼタンパク質セレブロン（ＣＲＢＮ）が特定され、・・・ＤＤＢ１は、Ｃｕｌ４ＡおよびＲｏｃ１との機能的Ｅ３リガーゼ複合体を形成する」ことが述べられている。
本出願人らにより考案されて使用される細胞に基づくアッセイの全体像を見るために、最初の工程は、レナリドマイドを細胞に添加することである。最後の工程は、ＩＫＺＦ１およびＩＫＺＦが分解されることである。ＩＫＺＦ１がＧＦＰとの融合タンパク質として生じる場合には、最後の工程は、融合タンパク質全体がプロテアソームにより分解されることである。同様に、ＩＫＺＦ３がＧＦＰとの融合タンパク質として生じる場合には、最後の工程は、この融合タンパク質全体がプロテアソームにより分解されることである。ＧＦＰ分解の結果、以前は緑色蛍光を発していた細胞である細胞が、非蛍光細胞に変化する。
細胞に基づくアッセイのより長い説明。これは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（タンパク質の複合体）のタンパク質の名称、この複合体に結合するタンパク質の名称、およびこの複合体の標的であるタンパク質の名称に関する。これらの名称に関して、公開された文献は一貫していない。時として、このタンパク質を、このタンパク質の名称で指し、時として、このタンパク質を、このタンパク質をコードする遺伝子の名称を使用して指す。この理由のために、下記の説明は、タンパク質の名称を遺伝子の名称と一緒に使用する（例えば、「セレブロム（ｃｅｒｅｂｌｏｍ）」（タンパク質の名称）および「ＣＲＢＮ」（遺伝子の名称））。同様に、「Ｉｋａｒｏｓ」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称はＩＫＺＦ１である。同様に、「Ａｉｏｌｏｓ」はタンパク質の名称であり、ＩＫＺＦ３は遺伝子の名称である。「カリン環フィンガーリガーゼ－４」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称はＣＲＬ４である。「カリン－１の制御因子」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称はＲＯＣ１である。ＲＯＣ１はまた、ＲＢＸ１としても既知である（Jia and Sun (2009) Cell Division. 4:16. DOI:10.1186）。「カリン－４Ａ」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称はＣＵＬ４Ａである。Schafer, Ye, Chopra (2018) Ann. Rheum. Dis. DOI:10.1136、Chen, Peng, Hu (2015) Scientific Reports. 5:10667、Matyskiela et al (2016) Nature. 535:252-257、Akuffo et al (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200)を参照されたい。
Ｅ３ユビキチンリガーゼは、標的タンパク質へのユビキチンの残基の転移を触媒し、その結果、この標的タンパク質は、分解のためにプロテアソームに送られる。このＥ３リガーゼは、標的タンパク質の１つまたは複数のリシン残基へのユビキチンの結合を触媒する。ヒトは、約６１７種の異なるＥ３ユビキチンリガーゼ酵素を発現する（Shearer et al (2015) Molecular Cancer Res. 13:1523-1532を参照されたい）。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、これらのタンパク質：ＤＮＡ損傷結合タンパク質－１（ＤＤＢ１）、カリン－４（ＣＵＬ４ＡまたはＣＵＬ４Ｂ）、カリン－１の制御因子（ＲｏＣ１）、およびＲＩＮＧ Ｂｏｘ－ドメインタンパク質（ＲＢＸ１）の複合体である。上述したように、ＲｏＣ１はＲＢＸ１と同一のタンパク質である（Jia and Sun (2009) Cell Division. 4:16. DOI:10.1186を参照されたい）。セレブロン（ＣＲＢＮ）がＥ３ユビキチンリガーゼ複合体に結合する場合には、得られたより大きな複合体はＣＲＬ４ＣＲＢＮと呼ばれる（Matyskiela et al (2016) Nature. 535:252-257）。「ＣＲＬ４」という用語は、「カリン－４ ＲＩＮＧリガーゼ」を意味する（Gandhi et al (2013) Brit. J. Haematol. 164:233-244、Chamberlain et al (2014) Nature Struct. Mol. Biol. 21:803-809）。命名法における上記の不一致を、セレブロンに関する文献を読む際に考慮する必要がある。
下記は、上記で開示された短い抜粋のより長いバージョンである。下記で示すのは、命名法のさらに別の形態であり、即ち、「ＣＲＬ４ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ」という用語である。このより長い説明は、様々な名称および細胞事象をより完全に統合する。「セレブロン（ＣＲＢＮ）とＥ３ユビキチンリガーゼ複合体との関係は、「セレブロン（ＣＲＢＮ）は、ＤＤＢ１－ＣＵＬ４Ａ－Ｒｏｃ１－ＲＢＸ１ Ｅ３ユビキチンリガーゼに関与することにより［標的タンパク質の］プロテオソーム分解を促進する」と説明されている」（Akuffo et al (2018) J. Biol. Chem. 293:6187-6200）。抗がん剤に関して、「レナリドミド、サリドマイド、およびポマリドマイド・・・は、Ｅ３ユビキチンリガーゼにより・・・基質のユビキチン化および分解を促進する。これらの化合物は、ＣＲＬ４ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼの基質アダプターであるＣＲＢＮに結合し・・・、これらの薬物のそれぞれは、・・・転写因子、ＩＫＺＦ１、およびＩＫＺＦ３の分解を誘発する」（Kronke et al (2015) Nature. 523:183-188）。
これは、細胞に基づくアッセイであって、任意の所与のマイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルがビーズを含み、ビーズが化合物に共有結合的に連結されており、この化合物が切断性リンカーを介して結合しており、かつこのウェルが１つまたは複数の培養哺乳類細胞を含む、細胞に基づくアッセイに関する。本開示の化合物および薬物候補に対する応答を、１種または複数種のバイオマーカーにより評価し得る。
バイオマーカーとして、診断用バイオマーカー、所与の患者が所与の薬物に応答する（よくなる）かどうかを予測するバイオマーカー、所与の患者が所与の薬物に対して許容されない毒性を経験するかどうかを予測するバイオマーカーが挙げられる（Brody, T. (2016) Clinical Trials: Study Design, Endpoints and Biomarkers, Drug Safety, and FDA and ICH Guidelines, 2nd ed., Elsevier, San Diego, CA)。本開示は、さらに別の種類のバイオマーカー（即ち、薬物療法が開示された後に所与の薬物に対する患者の応答をモニタリングするバイオマーカー）を使用する。一例を挙げると、下記は、バイオマーカー「ペルオキシレドキシン６（ＰＲＤＸ６）」および肺がんに関するものである。Ｈｕｇｈｅｓ他によれば、「細胞培地中のＰＲＤＸ６レベルは、ゲフィチニブ処置対媒体後に・・・細胞株が増加し・・・、ＰＲＤＸ６の経時的な蓄積は、ゲフィチニブ感受性と正の相関を示した。血清ＰＲＤＸ６レベルは・・・、処置の最初の２４時間の間に顕著に増加し・・・、ゲフィチニブ処置の期間中の血清ＰＲＤＸ６の変化は・・・、抗ＥＧＦＲ剤に対する応答をモニタリングするための撮像に基づく戦略よりも利点をもたらす」。このバイオマーカーは、応答の有効性のより直接的な測定（即ち、腫瘍のサイズおよび数の減少を検出するための「撮像」の使用）よりも利点を有するというコメントに留意されたい（Hughes et al (2018) Cancer Biomarkers. 22:333-344）。抗がん剤に対する応答をモニタリングする他のバイオマーカーとして、卵巣がんのプラチニン療法に対する応答をモニタリングするためのＣＡ１２５、および卵巣がんの化学療法に対する応答をモニタリングするための血清ＨＳＰＢ１が挙げられる（Rohr et al (2016) Anticancer Res. 36:1015-1022、Stope et al (2016) Anticancer Res. 36:3321-3327を参照されたい）。
サイトカイン発現。応答を、発現されたサイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－ガンマ、およびＴＮＦ－アルファ）を測定することにより評価し得る。これらのサイトカインの内の１つを特異的に認識する抗体を有する金ナノ構造を使用して、これらの特定のサイトカインを同時に測定し得、検出は、プラズモン共鳴を含む（Spackova, Wrobel, Homola (2016) Proceedings of the IEEE. 104:2380-2408、Oh et al (2014) ACS Nano. 8:2667-2676）。マイクロウェルを含むデバイスにおいて、単一のＴ細胞等の単一細胞により発現されるサイトカインを、蛍光抗体により測定し得る（Zhu, Stybayeva (2009) Anal. Chem. 81:8150-8156）。上記の方法は、本開示の試薬および方法として有用である。
一部の実施形態では、サイトカインに対する抗体をピコウェルの壁に付着させ得、薬物曝露の関数として細胞から放出されたかまたは差次的放出された任意のサイトカインを、ピコウェルの壁に結合した抗体により捕捉させ得る。捕捉されたサイトカインを、標識抗体の第２のセットにより特定し得る。一部の実施形態では、サイトカインの抗体をキャッピングビーズに結合させ得る。次いで、キャッピングビーズを架橋ヒドロゲルシートに埋め込み得、このシートを剥離して、さらなる分析（例えば、ＥＬＩＳＡ、質量分析、または他の分析技術による）に供し得る。
アポトーシス。アポトーシスに関するリアルタイムデータ、および単一細胞のアポトーシスの初期事象を、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）および局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）により測定し得る（Stojanovic, Schasfoort (2016) Sensing Bio-Sensing Res.7:48-54, Loo, Lau, Kong (2017) Micromachines. 8:338. DOI:10.3390を参照されたい）。Ｓｔａｊａｎｏｖｉｃ、上記参照は、シトクロムＣ、ＥｐＣａｍ、およびＣＤ４９ｅの細胞からの放出を検出する。Ｌｏｏ他、上記参照は、シトクロムＣの細胞からの放出を測定し、検出はＤＮＡアプタマーを含む（このＤＮＡアプタマーは、抗体のように機能する）。Ｚｈｏｕ他は、ＳＥＲＳを使用して単一細胞での初期アポトーシスを検出し、細胞膜上のホスファチジルセリンを測定する（Zhou, Wang, Yuan (2016) Analyst. 141:4293-4298を参照されたい）。アポトーシスの関するデータの収集に加えて、ＳＥＲＳを使用して、有糸分裂、代謝物の放出、形質膜に結合した生体分子の発現の段階に関するデータを収集することにより薬物活性を評価し得る（Cialla-May et al (2017) Chem. Soc. Rev. 46:3945-3961を参照されたい）。プラズモン共鳴は、アポトーシスで生じるタンパク質変性およびＤＮＡ断片化を測定し得る（Ｋａｎｇ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｅｌ－Ｓａｙｅｄ（２０１４）ＡＣＳ Ｎａｎｏ．８：４８８３－４８９２を参照されたい）。プラズモン共鳴（ＳＥＲＳ）は、アルファヘリックス型対ベータシート型での有糸分裂タンパク質の割合を測定することにより、がん細胞と正常細胞とを区別し得る（Panikkanvalappil, Hira, El-Sayed (2014) J. Am. Chem. Soc. 136:159-15968）。上記の方法は、本開示の試薬および方法として好適である。
アポトーシスをまた、プラズモン共鳴を使用しない方法で培養細胞中でも測定し得るが、代わりに、抗切断カスパーゼ－３抗体を使用する免疫細胞化学を使用する（Shih et al (2017) Mol. Cancer Ther. 16:1212-1223）。
細胞に基づくアッセイに関する一般的な情報。本開示の細胞に基づくアッセイを使用して、ヒトがん細胞、固形腫瘍からの細胞、血液がんからの細胞、ヒト幹細胞、ヒト肝細胞、病原性細菌、感染性細菌、細菌に感染したヒト細胞、ウイルスに感染したヒト細胞等からの応答を試験し得る。このアッセイは、移動等の細胞の形態学的応答、ならびに遺伝学的応答および生化学的応答を検出し得る。
本開示のアッセイは、ピコウェル内に位置する細胞の応答を検出するように設計され得るか、またはピコウェルのアレイ上の層として位置する栄養培地中等のピコウェル外に位置する細胞の応答を検出するように設計され得る。同様に、本開示のアッセイは、細胞およびビーズが培地内に位置する場合に、細胞が培地内に位置しており、かつビーズがこの培地の上または下に位置する場合に、細胞が培地の上部に位置しており、かつビーズがこの培地の上、または中、または下に位置する場合に、細胞の応答を検出するように設計され得る。
本開示は、ピコウェルアレイに細胞の集団を提供する。実施形態では、この細胞の集団の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％が、ピコウェル内に存在する（かつピコウェル上に位置するいかなる領域にも存在していない）。実施形態では、ウェルの内側に存在する細胞の集団（残部は、ウェルのアレイ上に存在する栄養培地の層中に位置する）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、またはこれらの数の内の２つにより定義される任意の範囲（例えば、「約６０％～約９０％」の範囲）中であり得る。
細胞用のマトリックス。細胞の生物活性のアッセイの場合に、かつ細胞が、ビーズから放出された化合物に曝露された場合には、または細胞が、ビーズ結合化合物に曝露された場合には、好適なマトリックスとして、下記の内の１つまたは複数を含むものが挙げられる：ポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＬＯ）、ビトロネクチン、オステオポンチン、コラーゲン、ＲＧＤ配列を含むペプチド、ＲＧＤ配列を含むポリペプチド、ラミニン、ラミニン／フィブロネクチン複合体、ラミニン／エンタクチン複合体等。好適なマトリックスとして、Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ．から入手可能な製品も挙げられ、例えば、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、Ｃｅｌｌ－Ｔａｋ（登録商標）細胞および組織接着剤、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）等も挙げられる。Corning Life Sciences (2015) Corning Cell Culture Surfaces, Tewksbury, MA (20 pages)、De Castro, Orive, Pedraz (2005) J. Microencapsul. 22:303-315を参照されたい。排他的な実施形態では、本開示は、上記マトリックスの内の１つまたは上記ポリマーの内の１つを含む任意の組成物または方法を除外し得る。
実施形態では、本開示は、個々のピコウェルが、ビーズ、１つまたは複数の細胞、ならびに溶液（いかなるマトリックスも含まれない）またはマトリックスまたは溶液およびマトリックスの組合せを含む、アレイを提供する。このマトリックスは、ヒドロゲル、ポリリジン、ビトロネクチン、ＭａｔｒｉＧｅｌ（登録商標）等であり得る。
ビーズ結合化合物またはビーズ放出化合物の活性を実行し得る。活性を評価するためのアッセイは、酵素の活性化または阻害、細胞シグナル伝達カスケードまたは個々の細胞シグナル伝達タンパク質の活性化または阻害、抗体（または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、抗体の可変領域）への結合、酵素（または抗体または抗体の可変領域）へのリガンドまたは基質の結合の阻害を含み得る。
上記アッセイに関して、読取りを、例えばクエンチャーに連結されたフルオロフォア（Ｆ－Ｑ）を含む蛍光アッセイにより決定し得る。このリンカーは、エンドプロテアーゼ、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ、またはホスホリパーゼ（ｐｈｏｓｏｐｈｏｌｉｐａｓｅ）により切断されるように設計され得る（Stefflova, Zheng (2007) Frontiers Bioscience. 12:4709-4721を参照されたい）。「分子ビーコン」という用語は、このタイプのＦ－Ｑ分子を指すが、「分子プローブ」はまた、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのようにＦおよびＱの分離がハイブリダイゼーションにより誘発されるコンストラクトを指すためにも使用されている（Tyagi and Kramer (1996) Nature Biotechnol. 14:303-308、Tsourkas, Behlke, Bao (2003) Nucleic Acids Res. 15:1319-1330）。
薬物曝露に応答した転写プロファイリング。本開示のＤＮＡバーコードを、応答捕捉要素を含むように改変し得、この応答捕捉要素は、このバーコードのコード部分によりコードされた撹乱に対する細胞の応答を捕捉する。一部の実施形態では、ＤＮＡバーコードは、ポリＴセクション（チミジンヌクレオチドの複数の繰り返し）で終了し得、このポリＴ配列を使用して、溶解した細胞から放出されたポリＡ末端ｍＲＮＡ分子を捕捉し得る。一部の実施形態では、応答捕捉配列は、目的の遺伝子に相補的であり得、それにより、この実施形態のビーズへのハイブリダイゼーションを介して所望の遺伝子の発現プロファイルが捕捉される。一部の実施形態では、ピコウェルは、転写プロファイルがビーズ上で捕捉される単一細胞ピコウェルを含み得る。一部の他の実施形態では、複数の細胞が、転写プロファイルが捕捉されるピコウェルに含まれ得る。
例示的な一ワークフローでは、下記の手順に従って、薬物に対する細胞の転写応答を捕捉し得る。（ａ）１つのウェル当たり単一の細胞を捕捉するように設計されたピコウェルを準備する。（ｂ）１つのピコウェル当たり１つのビーズが存在するように、このピコウェルに、化合物担持ＤＮＡバーコードビーズを導入する。（ｃ）適切な方法（実施形態のビーズに関して必要応じて、ＵＶ切断性リンカーを介して結合した化合物の場合にはＵＶ処理、化合物に浸されたビーズの場合には拡散、酸切断、塩基切断、温度切断等）により、各ピコウェル内のビーズから化合物を放出させる。（ｄ）このピコウェルを、このピコウェル内に内容物を保持するキャッピングビーズにより、またはこのピコウェルの上部上の空気障害もしくは油障害等の他の手段により、互いに単離し得る。（ｅ）このピコウェル中の細胞を、ある期間にわたり、ビーズから放出された化合物の存在下でインキュベートし得る。（ｆ）適切な時間（例えば、１時間、２時間、５時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、１日、３日、１週間、２週間、１カ月、またはこのアッセイに基づく別の適切な時間）の後、この細胞を、溶解方法により溶解させる。この溶解方法は、界面活性剤の添加、凍結および解凍の反復サイクル、加熱、膜破壊ペプチドの添加、機械的撹拌、または他の好適な手段を含み得る。（ｇ）溶解すると、細胞の内容物がピコウェル内のビーズに曝露され、その時点で、ピコウェルのビーズ上の応答捕捉要素が、設計された応答を捕捉できるようになる。一部の実施形態では、応答捕捉は、各ピコウェル内の細胞の完全なｍＲＮＡプロファイルを保続するポリＴ配列である。一部の実施形態では、応答捕捉要素は、細胞から特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を捕捉するように設計されている。一部の実施形態では、細胞の転写応答を、化合物の投与量（または濃度）の関数として捕捉し得る。
（ＸＩＶ）細胞に関する撹乱応答分析
本明細書で説明されている方法は、撹乱のライブラリーおよび細胞のライブラリーを含み得る。一部の実施形態では、この撹乱および細胞を、限定された環境中で培養する。このインキュベーションの最中または後に、撹乱を特定するバーコード（「撹乱バーコード」）が、一緒にインキュベートされている細胞に移され得る。この方法は、撹乱から細胞を放出すること（即ち、分離するかまたは除去すること）、および細胞内容物が撹乱バーコードと一緒に捕捉される第２の限定に細胞を供することをさらに含む。一部の実施形態では、第２の限定は、細胞特異的バーコードを含み得、このバーコードは、細胞内容物および撹乱バーコードを後に研究するために使用され得、それにより撹乱が細胞応答に関連付けられる。
一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法は、撹乱バーコードによりコードされている撹乱応答および測定応答という２つの応答を含み得る。撹乱応答では、細胞を撹乱に供し得る。測定応答では、細胞は、撹乱の結果としての細胞応答を測定し得る。一部の実施形態では、測定応答は、測定バーコードを含み得る。他の実施形態では、この方法は、撹乱バーコードを測定応答に持ち越すこと、ならびにこの測定応答に含まれる測定バーコードおよび撹乱バーコードの両方を捕捉することを含み得、それにより撹乱が細胞応答に関連付けられる。
本明細書で説明されている方法は、撹乱バーコードによりコードされている撹乱応答を含み得る。撹乱応答は、細胞を撹乱に供すること、その後、供された撹乱に対するこの細胞の細胞応答を測定することを含む。この撹乱バーコードを、細胞応答を測定する前または後のいずれかで解読し得、そのため、撹乱のアイデンティティーが、測定された細胞応答に関連付けられる。
一部の実施形態では、この方法は、ＤＮＡコード化ビーズ結合化合物ライブラリーを準備することであって、この化合物はこのビーズから放出され得る、準備すること、このＤＮＡコード化ビーズ結合化合物ライブラリーと、細胞のライブラリーとを接触させることであって、この接触することを、１つまたは複数の細胞を含むビーズを第１の限定された体積中に限定することにより実施し得る、接触させること、このビーズからこの化合物を放出すること、および第１の制限された体積中において、この化合物とこの細胞とをインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、同時かまたはインキュベーションの後に、このビーズから、この化合物を特定するＤＮＡバーコードが放出されて細胞に結合し得る。次いで、このＤＮＡバーコードを有する細胞が、第１の限定体積から放出されて第２の限定体積に再び限定され得、第２の限定体積は、細胞を溶解するための試薬、および細胞内容物と、細胞により運ばれるビーズ特異的バーコードとを捕捉するためのメカニズムを有する。一部の実施形態では、細胞内容物およびバーコードを捕捉するために使用されるメカニズムは、単一の細胞または細胞の小集団を一意的に特定するように機能し得る捕捉バーコードの使用を含み得る。一部の実施形態では、捕捉バーコードおよびビーズ特異的バーコードは連結され得る。一部の実施形態では、個別にバーコード化された物質を含む全ての限定体積は、バーコード化された細胞内容物と、細胞およびビーズに特異的なバーコードとのプールを作るために統合され得る。バーコード化物質のプールを配列決定により分析して、個々の細胞応答を研究し、この細胞応答を引き起こした撹乱に関連付け得た。
一部の実施形態では、この方法は、液滴内の個々の細胞を捕捉することを含む。この細胞は、この細胞が経験する撹乱を一意的に特定するために、細胞膜上に核酸バーコードを含み得る。この細胞は液滴内で溶解され得、この細胞のｍＲＮＡおよび細胞膜結合核酸バーコードは、バーコード化捕捉オリゴヌクレオチド（「捕捉バーコード」）のセットにより捕捉され得る。各液滴は、様々な一意的にバーコード化された捕捉オリゴヌクレオチドを含み得、１つの液滴内のバーコードは、実質的に同一の配列のストレッチを有する。ｍＲＮＡおよび細胞膜結合バーコードを、逆転写酵素を使用して、液滴バーコード化オリゴヌクレオチド上にコピーし得る。核酸物質を、液滴を破壊することにより液滴から一緒にプールし得る。個々の細胞の転写プロファイルを研究し、この転写プロファイルを、転写プロファイルに関連する撹乱に関連付けるために、全ての核酸物質を配列決定し得る。
本明細書で説明されている方法は、細胞のライブラリーを、撹乱限定および溶解限定という２つのバーコード化限定に供することを含み得る。細胞は、個々に限定され得るか、または小集団として限定され得る。バーコードは、細胞を撹乱しつつ細胞に導入されるバーコードと、細胞を溶解させつつ導入されるバーコードとを含み得る。一部の実施形態では、撹乱バーコードは、細胞により溶解工程に運ばれ得る。一部の実施形態では、溶解バーコードは、細胞内容物および／または撹乱バーコードに適用され得、その結果、細胞が経験する撹乱に細胞内容物を関連付けるバーコード化細胞内容物が確立される。一部の実施形態では、撹乱ビーズはまた、応答捕捉プローブも含み得る。この場合では、２つの区画化工程の代わりに、単一のピコウェル区画化工程で十分であり得る。そのような実施形態では、化合物バーコードは、細胞応答を捕捉し得るように機能化され得る。一部の実施形態では、撹乱バーコードは、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テイルがハイブリダイズし得るポリ（Ｔ）セグメント中で終わる。
一部の実施形態では、単一細胞撹乱－応答分析のワークフローは、下記の通りである：（１）撹乱バーコードが捕捉配列中で終わる機能化撹乱ビーズを準備し、この捕捉配列は、ｍＲＮＡの捕捉のためのポリ（Ｔ）ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、（２）ピコウェルアレイ中で細胞のライブラリーを捕捉し、（３）機能化撹乱のライブラリーを同一のピコウェル中に捕捉し、一部の実施形態では、単一の細胞および単一の機能化ビーズがウェル毎に捕捉され、他の実施形態では、細胞の集団がピコウェル中で捕捉され得、（４）ピコウェルを油媒体で覆って、ウェル間での試薬の交差汚染を防止してもよく、（５）撹乱ビーズから化合物を放出させ、各ウェル中の細胞を、この撹乱ビーズから放出された化合物と共にインキュベートし、（６）ピコウェル上で溶解緩衝剤を流すことにより、ピコウェル内で細胞を溶解させ、（７）ｍＲＮＡまたは他の細胞応答を、撹乱バーコードの先端部上に直接捕捉し、（８）ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を撹乱バーコード上にコピーし、（９）ビーズを、超音波処理によりピコウェルから放出させ、次いで、放出されたビーズから伸長撹乱バーコードを切断するか、またはビーズが依然としてピコウェル内に存在する間にビーズから撹乱バーコードを単に切断し、ならびに（１０）切断されたヌクレオチド（伸長撹乱バーコード）を適切なライブラリー調製方法に供し、そのように調製されたヌクレオチドを配列決定する。一部の実施形態では、配列決定されたヌクレオチドは、下記の２つのセグメントを含む：細胞が供される撹乱／化合物を特定する撹乱バーコード、およびこの撹乱バーコードにより特定される撹乱／化合物に供された細胞のｍＲＮＡ発現に対応する応答セグメント。このワークフローは、このプロセスのＱＣのための適宜の撮像工程と共に、図３６に示されている。逆転写酵素法は、捕捉されたＲＮＡをビーズ結合ＤＮＡ上に伸長させ、それにより機能化ビーズ上に細胞内容物情報を転写させるのに役立ち得る。次いで、このビーズをプールし、抽出し、シーケンサーにより分析し得る。一部の実施形態では、単一細胞からのＤＮＡも、機能化ビーズ上の特定のプライマーに捕捉し得る。そのような実施形態では、ポリメラーゼが逆転写酵素の代わりとなり得る。
一部の実施形態では、撹乱および細胞－応答捕捉は、図３７で説明されているように、２つの異なる限定で起こり得る。撹乱バーコードは、細胞－応答－捕捉限定に供される前に、細胞表面上に移され得る。細胞－応答－捕捉はまた、細胞表面上にある撹乱バーコードを捕捉することも含み得、それにより、細胞応答が、細胞が曝露された撹乱に直接関連付けられる。一部の実施形態では、細胞応答の捕捉は、Ｄｒｏｐ－ｓｅｑ法により達成され得る。一部の実施形態では、細胞応答の捕捉は、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞機器、Ｒａｉｎｄａｎｃｅ単一細胞分析プロトコル、ＢｉｏＲａｄ単一細胞単離機器、Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｂｉｏ単一細胞分析プロトコル、ＧｉｇａＧｅｎ機器およびプロトコル、ならびに／または任意の他の市販の単一細胞分析機器またはサービス等の任意の市販の単一細胞分析機器で起こり得る。
一部の実施形態では、細胞懸濁液を、撹乱ビーズによる限定を受ける細胞の出発点として使用し得る。細胞を水性培地中に懸濁させるかまたは細胞を懸濁液中で培養する方法は、当業者に公知である。細胞を懸濁して懸濁液中で細胞を培養する方法も、当技術分野で説明されている。例えば、一部の実施形態では、スフェロイド細胞培養物を、撹乱の出発点として使用し得、なえならば、このスフェロイド細胞培養物は、単離された単一細胞と比べて多くの細胞間相互作用シグネチャを捕捉するからである（例えば、Edmondson et al., Assay Drug Dev Technol. 12:207-218, 2014、Fennema et al., Trends Biotechnol. 31:108-115, 2013、Han et al., Sci Reports 5:11891, 2015、Zanoni et al., Sci Reports 6:19103, 2016（これらの開示は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一部の実施形態では、オルガノイドを単一細胞の代わりに使用して、ハイスループット撹乱を受け得る（例えば、Foley, Nat Methods 14:559-562, 2017、Liu et al., Front Pharmacol. 7:334, 2016、Neugebauer et al., BioRxiv April 2017、Skardal et al., Drug Discov Today 21:1399-1411, 2016、Boehnke et al., J Biomol Screen 21:931-941, 2016（これらの開示は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
一部の実施形態では、細胞は、疾患モデルから得られる。本明細書で説明されている方法は、撹乱／化合物ライブラリーの化合物の内の１つまたは複数への曝露により治癒応答が得られるかどうかを確認するための、疾患モデル細胞全体にわたる化合物の大規模なハイスループットスクリーニングを可能にする。他の実施形態では、細胞は、様々な系統の健康な細胞である。本明細書で説明されている方法は、様々な化合物に対する細胞応答の大規模なハイスループットマッピングを可能にする。一部の実施形態では、細胞上の組合せ化合物ライブラリーの偏りのないスクリーニングにより収集されたデータから、薬物－細胞相互作用の既知のマップに基づくｄｅ ｎｏｖｏ薬物予測が可能になる。
一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法で使用される限定は、液滴限定を含む。一部の実施形態では、この液滴は、油マトリックス中の水性液滴を含む。一部の実施形態では、液滴は、水相および油相の混合を含むマイクロ流体接合部中で生成される。一部の実施形態では、このマイクロ流体接合部は、細胞、撹乱ビーズ、および油相を含む。細胞およびビーズにより液滴を生成するためのマイクロ流体アーキテクチャの一実施形態は、「Ｄｒｏｐ－Ｓｅｑ」法により説明されている（例えば、Macosko et al., Cell 161:1202-1214, 2015を参照されたい）。
一部の実施形態では、この方法は、ヒドロゲル限定を含む。一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法で使用される限定は、ヒドロゲル限定を含み、細胞およびビーズは、これらの自由拡散を防止するヒドロゲルマトリックスに埋め込まれている。一部の実施形態では、細胞およびビーズが互いに近接する共局在化は、偶然に起こる。一部の実施形態では、ビーズは、細胞に結合する結合部分を含み、次いで、細胞－ビーズ二重がヒドロゲルに埋め込まれる。一部の実施形態では、細胞へのビーズの近接により、このビーズから放出された化合物が、拡散により誘発される交差反応を起こすことなく、この細胞のみを確実に撹乱する（細胞の間隔は、ヒドロゲル中の化合物の拡散半径と比べて離れている）。一部の実施形態では、撹乱後、細胞を、ヒドロゲルに溶解緩衝剤を通過させることにより溶解させ、放出された細胞内容物は、細胞に近接したビーズにより捕捉される。下記のいくつかの関連の刊行物が存在する：Zhu and Yang, Acc. Chem. Res. 50:22, 2017、Sung and Shuler, Lab Chip 9:1385-1394, 2009、Gurski et al., Biomaterials 30:6076, 2009, Microfluidic Immunophenotyping Assay Platform for Immunomonitoring of Subpopulations of Immune Cells, pages 1761-1763, 17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, MicroTAS, 2013、および米国特許出願公開第２００３０１７５８２４Ａ１号明細書（これらの開示は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法で使用される限定は、ピコウェル限定を含み、個々のビーズおよび細胞が、微細加工ピコウェル内で捕捉され、このアッセイを、ピコウェルのアレイで実施し得る。ピコウェルのアレイに細胞およびビーズをロードするための詳細な手順は、例えばYuan and Sims, Sci Rep. 6:33883, 2016で説明されている。一部の実施形態では、撹乱ビーズはまた、応答－捕捉プローブも含み、２つの区画化工程の代わりに、単一ピコウェル区画化工程で十分である。そのような実施形態では、撹乱バーコードは、細胞応答を捕捉し得るように機能化され得る。一部の実施形態では、撹乱バーコードは、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テイルがハイブリダイズし得るポリ（Ｔ）セグメント中で終わる。
一部の実施形態では、単一細胞撹乱－応答分析のワークフローは、下記の通りである（例えば図３６を参照されたい）：（１）撹乱バーコードが捕捉配列中で終わる機能化撹乱ビーズを準備し、この捕捉配列は、ｍＲＮＡの捕捉のためのポリ（Ｔ）ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、（２）ピコウェルアレイ中で細胞のライブラリーを捕捉し、（３）機能化撹乱のライブラリーを同一のピコウェル中に捕捉し、一部の実施形態では、単一の細胞および単一の機能化ビーズがウェル毎に捕捉され、他の実施形態では、細胞の集団がピコウェル中で捕捉され得、（４）ピコウェルを油媒体で覆って、ウェル間での試薬の交差汚染を防止してもよく、（５）撹乱ビーズから化合物を放出させ、各ウェル中の細胞を、この撹乱ビーズから放出された化合物と共にインキュベートし、（６）ピコウェル上で溶解緩衝剤を流すことにより、ピコウェル内で細胞を溶解させ、（７）ｍＲＮＡまたは他の細胞応答を、撹乱バーコードの先端部上で直接捕捉し、（８）ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を撹乱バーコード上にコピーし、（９）ビーズを、超音波処理によりピコウェルから放出させ、次いで、放出されたビーズから伸長撹乱バーコードを切断するか、またはビーズが依然としてピコウェル内に存在する間にビーズから撹乱バーコードを単に切断し、ならびに（１０）切断されたヌクレオチド（伸長撹乱バーコード）を適切なライブラリー調製方法に供し、そのように調製されたヌクレオチドを配列決定する。一部の実施形態では、配列決定されたヌクレオチドは、下記の２つのセグメントを含む：細胞が供される撹乱／化合物を特定する撹乱バーコード、およびこの撹乱バーコードにより特定される撹乱／化合物に供された細胞のｍＲＮＡ発現に対応する応答セグメント。
一部の実施形態では、細胞応答を、形態学的応答として光学的に測定する。一部の実施形態では、この細胞応答を、ある特定の細胞の特徴を標識することにより測定して、撹乱後に測定されたシグナルの差違を研究する。一部の実施形態では、この細胞応答は、細胞中に操作された応答であり、有利な刺激により、細胞に、操作された応答を発現させる。一部の実施形態では、この操作された応答は、レポーター遺伝子である。一部の実施形態では、この操作された応答は、蛍光タンパク質の発現である。
一部の実施形態では、細胞応答は、細胞のトランスクリプトームを含む。一部の実施形態では、転写応答を、細胞のｍＲＮＡ含有量を捕捉し、ｍＲＮＡ転写物の発現レベルを分析することにより測定する（例えば、Bacher et al., Genome Biol 17:63, 2016、Svensson et al., Nat Methods 14:381, 2017、Miao and Zhang, Quantitative Biol 4:243, 2016（これらの開示は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞応答は、細胞中でのタンパク質または酵素の発現および／または翻訳後活性化状態を含む。一部の実施形態では、細胞応答を捕捉することは、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドを使用して細胞からポリ（Ａ）ｍＲＮＡを捕捉することを含む。一部の実施形態では、細胞応答は、細胞中でのエンハンサーＲＮＡの発現レベルを含む（例えば、Rahman et al., Nucleic Acid Res. 45:3017, 2017（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞応答は、細胞中での新生転写物のレベルを含む。一部の実施形態では、この新生転写物応答は、Ｇｌｏｂａｌ Ｒｕｎ－Ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＧＲＯ－Ｓｅｑ）により捕捉される（例えば、Gardini, Meth Mol Biol 1468:111-120, 2017、およびDanko et al., Nat Methods 12:433, 2015（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））を参照されたい）。一部の実施形態では、細胞応答は、タンパク質濃度を含み、このタンパク質は、ＤＮＡタグ付き交代により特定され、さらに、適切なタグがビーズ上に転移される。本明細書で説明されている方法の一部の実施形態では、細胞応答を、撮像、ゲノム解析、または分子生物学および配列決定での任意の他のツールにより捕捉し得る。
［実施例１］
第１のワークフロー
本開示は、「第１のワークフロー」および「第２のワークフロー」として以下に概略されるものを含む、方法を提供する。
第１のワークフローは、以下の工程を含む：（１）ＤＥＬＢを生成する、（２）ビーズをピコウェルに投入する、（３）アッセイ試薬をピコウェル中にロードする、（４）ビーズ結合化合物を放出させる、（５）アッセイリードアウトを測定する、（６）アッセイリードアウトを順位付ける、および（７）ＤＥＬＢの新しいセットを生成する。
ＤＥＬＢを生成する。最初に、ビーズ上のＤＮＡにコードされたライブラリー（ＤＥＬＢ）を作出する。それぞれのビーズは、正確に同じ化合物の集団を含有するが、製造された化合物の一部が不完全な連結を有していたか、または不慮の酸化などの化学的損傷を受けた場合、これからのわずかな逸脱があってもよい。
ビーズをピコウェル中に入れる。次いで、ビーズをピコウェル中に投入する。好ましい実施形態では、それぞれのピコウェルは、ただ１つのビーズを得る。それぞれのピコウェルは、丸い上縁部、丸い下縁部、固体の環状底部、開いた頂部、および壁を有してもよい。壁の底は、丸い上縁部および丸い下縁部によって定義される。好ましい実施形態では、壁は、角があり、丸い上縁部の直径は、丸い下縁部の直径よりも大きい。このように、壁（それ自体で見える）は、逆円錐型のスライスに似ている。ピコウェルアレイを、ビーズの冗長性が存在するように調製することができる。換言すれば、ピコウェル中に入れられる何千個ものビーズのうち、２個のビーズが正確に同じ化合物を含有するように、アレイを調製することができる。冗長性は、例えば、２個のビーズ、３個のビーズ、４個のビーズ、５個のビーズ、１０個のビーズ、２０個のビーズ、４０個のビーズ、６０個のビーズ、８０個のビーズ、１００個のビーズなど、または約２個、約３個、約４個、約１０個、約２０個、約４０個、約６０個、約８０個、約１００個、約２００個、約５００個、約１，０００個のビーズなど、または２個より多い、５個より多い、１０個より多い、２０個より多い、４０個より多い、６０個より多い、８０個より多い、１００個より多い、２００個より多い、５００個より多い、１，０００個より多いビーズなどであってもよい。
アッセイ試薬をピコウェル中にロードする。それぞれのビーズ結合化合物の生化学的活性を評価するために使用することができる試薬をそれぞれのピコウェル中に導入する。生化学的活性は、結合活性、酵素阻害活性、酵素活性化活性、生きている哺乳動物細胞の活性（分子標的が公知ではない場合）、生きている哺乳動物細胞の活性（分子標的が公知である場合）などの形態をとってもよい。試薬は、ＦＲＥＴ試薬プラス酵素の形態をとってもよい。ＦＲＥＴ試薬は、プロテアーゼ基質によってクエンチャーに連結されたフルオロフォアであってもよい。酵素は、そのプロテアーゼの基質であってもよく、そのプロテアーゼによって切断可能である。ビーズ結合化合物は、プロテアーゼを阻害する能力について試験される。
アッセイ材料をロードした後、それぞれのピコウェルをフィルムでキャッピングするか、または多くもしくは全部のピコウェルを１つのフィルムでキャッピングするか、または多くもしくは全部のピコウェルを、それぞれのピンプル（ｐｉｍｐｌｅ）がピコウェル中に適合するか、もしくはそれぞれのピコウェルが多孔性の球体と適合する、ピンプルを有するフィルムでキャッピングすることができる。実施形態では、球体の体積の約５％、体積の約１０％、体積の約２０％、体積の約３０％、または体積の約４０％が、ピコウェル中で適合する（残りは表面から洗い流されるか、または表面上に存在する）。実施形態では、ピンプルの約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、または約１００％が、ピコウェル中で適合する。
ビーズ結合化合物を放出させる。ビーズ結合化合物の放出を引き起こす工程を実施する。実施形態では、工程は、所与のビーズ結合化合物の約０．１％、約０．２％、約０．１％、約０．２％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９９％、または約１００％の放出を引き起こすことができる。放出は、光、化学的試薬、酵素、温度シフト、その任意の組合せなどによって行うことができる。
放出は、（ｉ）単一放出、（ｉｉ）複数放出、（ｉｉｉ）連続放出の形態をとってもよい。複数放出は、例えば、紫外光のいくつかの放射の形態をとってもよく、それぞれの放射は、ビーズ結合化合物の約１０％を切断するのに十分なものであり、その光放射の開始時にビーズへの結合が起こる。連続放出は、例えば、１時間の経過にわたる光の連続放射の形態をとってもよく、遊離化合物の濃度の定常的な増大をもたらす。この状況では、遊離化合物（切断化合物）の定常的に増大する濃度は、その化合物の標的を滴定するためのものであってよい。この種類の滴定実験を使用して、所与の化合物の効力を評価することができる。非限定例を提供するために、単一放出方法については、光曝露の期間は、リードアウトが取られるその後の期間の後であり、連続放出方法については、光曝露は、リードアウトが取られる一部、多く、または全部の期間、継続する。
排他的な実施形態では、本開示は、単一放出を使用する、複数放出を使用する、または連続放出を使用する、任意の方法、試薬、組成物、またはシステムを除外してもよい。
アッセイリードアウトを測定する。上に開示された生化学的活性、およびその活性に対する、放出された化合物の影響を検出する。この生化学的活性は、酵素活性、リポーター遺伝子の活性、遺伝子活性（例えば、転写または翻訳の速度）、結合活性（例えば、抗体に対する抗原）、細胞活性（例えば、遊走の変化、細胞シグナル伝達経路の変化、形態の変化）の形態をとってもよい。蛍光、発色活性、発光、光学顕微鏡、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ、分子ビーコン、質量分析、ラマン分光法、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）、表面プラズモン結合放射（ＳＰＣＥ）、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）などによって、活性を検出することができる。検出は、蛍光検出もしくは光学顕微鏡などの全体として遠隔である方法を用いたものか、あるいは、ピコウェルから試料を採取することを含む方法によるものであってもよい。一実施形態では、反応物と生成物との混合物を含有する試料を、ピコウェルの１つに部分的に挿入される球状の多孔性スポンジによって分析のために引き出すことができる。
アッセイリードアウトを順位付ける。この工程では、複数の異なる化合物（１つの特定のビーズと結合したそれぞれの型の化合物）からのアッセイリードアウトを、生化学的活性を活性化する、阻害する、または一部の様式では、モジュレートするその能力に関して順位付ける。
ＤＥＬＢの新しいセットを生成する。上記の工程は、ユーザーに、生化学的活性を示す種々の化合物を知らせる。情報は、１つの化合物が最大の活性を有し、残りは最大活性の約半分以下を有する形態をとってもよい。あるいは、情報は、いくつかの化合物が類似する最大活性を有し、他の化合物が最大活性の約半分以下を有する形態をとってもよい。ＤＥＬＢの新しいセットを、以下のように作出することができる。１つまたは複数の最も高い順位の化合物（リード化合物）を、１つまたは複数の以下の非限定的戦略に基づいて、ＤＥＬＢの新しいセットを製造するための基礎として使用することができる：（ｉ）プロパノール側鎖をブタノール側鎖で置き換えるなどの、脂肪族鎖をホモログで置き換える、（ｉｉ）プロパノール側鎖をイソプロパノール側鎖で置き換えるなどの、脂肪族鎖を異性体で置き換える、（ｉｉｉ）ペプチド結合を、ペプチダーゼによって加水分解することができない結合などの、ペプチド結合のアナログで置き換える、（ｉｖ）リン酸基をホスホン酸、硫酸、スルホン酸、またはカルボキシル基で置き換えるなどの、ある型の荷電した基を別の型の荷電した基で置き換える。
［実施例２］
第２のワークフロー
第２のワークフローは、キャップで密封されたピコウェルを含む。キャップは、ピコウェルの直径よりもわずかに大きい直径の球体の形態をとってもよく、この直径は、ピコウェルの上周縁部で測定される（ピコウェルの底部では測定されない）。キャップは、ピコウェルプレート全体を軽度の重力の遠心分離にかけることによって、ピコウェルの上部にぴったりと適合するように作ることができる。第２のワークフローでは、キャップは、それぞれのリンカーが化合物に連結される、リンカーを含有するビーズの形態をとってもよい。リンカーは、切断性リンカーであり、切断は化合物を放出させ、それらを細胞に拡散させる。この型のキャップは、「能動的キャップ」と呼ばれる。第２のワークフローは、以下の工程を含む：（１）ＤＥＬＢを生成する、（２）アッセイ試薬をピコウェル中にロードする、（３）ピコウェルをＤＥＬＢでキャッピングする、（４）ビーズ結合化合物を、キャップとして作用するビーズから放出させる、（５）アッセイリードアウトを測定する、（６）ビーズ上にあるＤＮＡバーコードの配列を決定する、（７）アッセイリードアウトを順位付ける、および（８）ＤＥＬＢの新しいセットを生成する。
［実施例３］
放出制御
これは、ビーズ結合化合物の放出の制御およびモニタリングに関する。出願人は、ビーズ結合放出モニターを合成するための以下の手順を考案した。図１１および以下の本文を参照されたい。
図１１は、ビーズ結合放出モニターの上の例示的実施形態の有機合成における工程を説明する。
工程１：樹脂を提供する
ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）樹脂（Ｍ３０１０２、１０μｍのＮＨ２、０．２３ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｍｇ、ＭＢ１６０２３０、１６０μｍのＲＡＭ、０．４６ｍｍｏｌ／ｇ、２ｍｇ）を、管（１．５ｍＬのエッペンドルフ）に量り取り、膨張（４００μＬ、ＤＭＡ）させた。
樹脂を、フリットスピンカラム（ＭｏＢｉＣｏｌ（登録商標）スピンカラム、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、減圧による濾過によって溶媒を除去し、付属するＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ中の２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４００μＬ、４０℃で２ｘ１０分）。ＭｏＢｉＣｏｌスピンカラムは、１０マイクロメートルの大きいフリットおよびルアーロックキャップを有する。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程２：リシンリンカーを樹脂に連結する
ＤＭＡ（３５０μＬ）中で混合した、Ｌ－Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ（２１μｍｏｌ、６．６当量）、ＤＩＥＡ（４２μｍｏｌ、１３．３当量）、ＣＯＭＵ（２１μｍｏｌ、６．６当量）を含有する溶液を調製し、インキュベート（１分、ＲＴ）した後、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に添加し、ボルテックスし、インキュベート（１５分、４０℃）して、遊離アミンをアミド化した。樹脂を、減圧により濾過し、この反応を１回繰り返した。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程３：Ｆｍｏｃ保護基を除去する
付属するＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ中の２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４００μＬ、４０℃で２ｘ１０分）。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程４：クエンチャーを連結する
ＤＭＡ（３５０μＬ）中で混合した、ＱＳＹ７－ＮＨＳ（４．９μｍｏｌ、１．５５当量）、Ｏｘｙｍａ（９．５当量、３．３当量）、ＤＩＣ（２１μｍｏｌ、６．６当量）、ＴＭＰ（３．５μｍｏｌ、１．１当量）を含有する溶液を調製し、インキュベート（１分、ＲＴ）した後、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に添加し、ボルテックスし、インキュベート（１４ｈ、４０℃）して、遊離アミンをアミド化した。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
ＤＭＡ（４００μＬ）中で混合した、無水酢酸（８０μｍｏｌ、２５．３当量）、ＴＭＰ（８０μｍｏｌ、２５．３当量）を含有する溶液を調製し、混合した後、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に添加し、ボルテックスし、インキュベート（２０分、ＲＴ）した。
樹脂を減圧濾過し、洗浄し（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ）、ＤＣＭ中でインキュベート（１ｈ、ＲＴ）した後、減圧濾過し、減圧チャンバー中で乾燥した（３０分、２．５ＰＳＩ）。
工程５：Ｍｔｔ保護基を除去する
ＤＣＭ（１４８８μＬ）中で混合した、ＴＦＡ（９６μＬ）、メタノール（１６μＬ）を含有するＭｔｔ脱保護カクテルを調製し、６：１：９３％のＴＦＡ：メタノール：ＤＣＭ溶液を得た。
Ｍｔｔ脱保護カクテルを、完全に乾燥した樹脂（４００μＬ）に添加し、混合し、減圧濾過によって溶出させた後、Ｍｔｔ脱保護カクテルの連続アリコート（４ｘ４００μＬ）を添加し、混合し、インキュベート（５分、ＲＴ）し、ＲＴで２０分の合わせた合計インキュベーション時間にわたって溶出させた。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ、２％ＤＩＥＡを含む１ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程６：光切断性リンカーをリシンのエプシロンアミノに連結する
ＤＭＡ（４００μＬ）中で混合した、Ｆｍｏｃ－ＰＣＬ－ＯＨ（３２μｍｏｌ、１０当量）、Ｏｘｙｍａ（３２μｍｏｌ、１０当量）、ＤＩＣ（５０μｍｏｌ、１５．８当量）、ＴＭＰ（３２μｍｏｌ、１０当量）を含有する溶液を調製し、インキュベート（１分、ＲＴ）した後、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に添加し、ボルテックスし、インキュベート（１４ｈ、４０℃）して、遊離ε－アミンをアミド化した。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程７：以前に連結した光切断性リンカーからＦｍｏｃ保護基を除去する
付属するＦｍｏｃを脱保護した（ＤＭＡ、４００μＬ中の２％ＤＢＵを含む５％ピペラジン、４０℃で２ｘ１０分）。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、１ｘＤＭＡ、４００μＬ）。
工程８：フルオロフォアを連結する
ＤＭＡ（４００μＬ）中で混合した、ＴＡＭＲＡ（６μｍｏｌ、１．９当量）、ＴＭＰ（２４μｍｏｌ、７．６当量）、ＣＯＭＵ（１６μｍｏｌ、５当量）を含有する溶液を調製し、インキュベート（１分、ＲＴ）した後、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に添加し、ボルテックスし、混合しながらインキュベート（２ｈｒ、８００ＲＰＭ）して、遊離アミンをアミド化した。
樹脂を減圧濾過し、洗浄した（２ｘＤＭＡ、４００μＬ、３ｘＤＣＭ、４００μＬ、２ｘＤＭＡ、４００μＬ、２ｘＤＭＳＯ）後、ＤＭＳＯ中で混合しながらインキュベートした（１６ｈ、４０℃）。
以下は、上に開示された実験室手順のより広い説明を提供する。
ビーズ結合二機能性リンカー。二機能性リンカーを、溶液中で合成し、アミン機能化ビーズに結合させた。図１１は、リシンから出発する、有機合成の経路を開示する。次いで、リシン－Ｂｏｃを、ＴＣＯリンカーによって接続した。リンカーの主要部分は、一方の末端に窒素を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の形態をとっていた。Ｂｏｃは、この接続反応における脱離基であった。使用したＴＣＡは、実際には、ヒドロキシ－ＴＣＯのラセミ体であった。このＴＣＯ誘導体のヒドロキシル基を、二重結合の一方の側から炭素原子４個分離れたところに位置する炭素原子に接続した（これは、二重結合の他方の型から炭素原子３個分離れたところに位置するのと同じことである）。図１１に示されるように、多工程合成における最初の生成物は、Ｂｏｃ－リシン－リンカー－ＴＣＯの形態をとっていた。一度ヒドロキシ－ＴＣＯの一部であったヒドロキシル基は、依然としてＴＣＯ基に結合しており、それはアミノ化ポリエチレングリコール基とＴＣＯ基との間に位置する（図１１）。
合成経路における第２のセットは、ＨＣｌによる処理および光切断性リンカー（ＰＣＬ）の付加を含んでいた。この第２の工程の生成物は、Ｂｏｃ基が光切断性リンカーで置き換えられていることを除いて、第１の工程の生成物と同じであった。リシン部分は、第２の工程の生成物における中心位置をとる。リシン部分に関して、このリシン部分は、遊離カルボキシル基を有し、手順の第３の工程においては、アミノ化されたビーズを、この遊離ヒドロキシル基に接続して、ビーズ結合試薬を合成し、この試薬は、２つの分枝の形態をとり、一方の分枝の末端は、ＴＣＯタグであり、他方の分枝の末端は、切断可能な結合を担持する芳香族環である。光切断性リンカーの遠位末端に化学的単量体を結合するために、最初にＦｍｏｃ基を除去し、ここで、Ｆｍｏｃ基を水素原子で置き換える。
Ｆｍｏｃの除去。Isidro-Llobet et alによれば、「Ｆｍｏｃは、塩基、主に第２級アミンによって除去されるが、これは、それらが除去中に生成されるジベンゾフルベンを捕捉するのが得意だからである」（Isidro-Llobet et al (2009) Chem. Rev. 109:2455-2504）。あるいは、Ｆｍｏｃを、Ｐｄ／ＢａＳＯ４を用いた触媒的水素化分解によって、または液体アンモニアおよびモルホリンもしくはピペリジンによって除去することができる。
Ｆｍｏｃ基の除去、次いで、化学的単量体の結合。次いで、出願人は、カルボン酸基を有する化学的単量体を縮合させ、その結果、アミド結合が生成された。
［実施例４］
活性化合物に関するセレブロンに基づくアッセイ
化合物の細胞に基づくアッセイ（セレブロンに基づくアッセイ）からの結果。細胞に基づくアッセイのための試薬および方法。出願人は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から取得したＣＣＬ－２ ＨｅＬａ細胞を使用した。細胞培地は、ＨＥＰＥＳで緩衝化したＧｉｂｃｏ ＤＭＥＭ高グルコース培地であった。細胞培養物上の空気は、３７℃のインキュベーターを用いた、５％二酸化炭素を添加した大気であった。細胞培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加した、ならびにまた、非必須アミノ酸およびペニシリンプラスストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を添加した、ＤＭＥＭプラス１０％ウシ胎仔血清であった。ＨｅＬａ細胞に、ＬＴＲ－ＣＴＣＦ－プロモーター－ＩＫＺＦ１（またはＩＫＺＦ３）－ｍＮｅｏｎ－Ｐ２Ａ－ｍＳｃａｒ－ＬＴＲ－ＣＴＣＦの形態をとるコンストラクトをトランスフェクトした。ｍＳｃａｒｌｅｔは、陽性対照として使用されるエレメントである。ｍＳｃａｒｌｅｔは、「ｍＳｃａｒｌｅｔ」と呼ばれる赤色蛍光タンパク質をコードする（Bindels et al (2017) Nature Methods. 14:53-56を参照されたい）。プロモーターは、ドキシサイクリン誘導性プロモーターであり、迅速な誘導開始および基質の滴定を可能にする。Ｐ２Ａは、２つの他のポリペプチドの間に位置するエレメントである。Ｐ２Ａは、翻訳中に、２つの別々のポリペプチドを産生するように機能し、かくして、ＩＫＺＦ１／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる融合タンパク質のユビキチン化および分解によって影響されることなく、ｍＳｃａｒポリペプチドに、赤色光を産生する陽性対照として機能させる。ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎは、ナメクジウオであるブランキオストマ・ランセオラタム（Ｂｒａｎｃｈｉｏｓｔｏｍａ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）の多量体黄色蛍光タンパク質（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に由来する。Ｐ２Ａは、Ｐ２Ａタンパク質中のある点での自己切断を可能にする領域である。より正確には、Ｐ２Ａペプチドは、リボソームに、２ＡペプチドのＣ末端でのグリシル－プロリルペプチド結合の合成をスキップさせ、２Ａペプチドと、そのすぐ下流のペプチドとの間の切断をもたらす（Kim, Lee, Li, Choi (2011) PLoS ONE. 6:e18556 (8 pages)）。
試験化合物の細胞に基づくアッセイの有効性の証明。以下は、レナリドミドおよびレナリドミドのアナログの形態をとる試験化合物に関する細胞に基づくアッセイの使用を証明する。図５は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ｍＳｃａｒｌｅｔ）を発現するレンチウイルスベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞からの結果を開示する。添加されるレナリドミドの濃度の増大は、次第に少ない緑色蛍光をもたらし、最も高い濃度では緑色蛍光の除去をもたらした。しかし、レナリドミドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上：ＩＫＺＦ１／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ対照の発現。レナリドミドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモル濃度で添加した。
図６は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ｍＳｃａｒｌｅｔ）を発現するレンチウイルスベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞からの結果を開示する。添加されるレナリドミドの濃度の増大は、次第に少ない緑色蛍光をもたらし、最も高い濃度では緑色蛍光の除去をもたらした。しかし、レナリドミドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上：ＩＫＺＦ３／ＧＦＰ融合タンパク質の発現。下：ｍＳｃａｒｌｅｔｔ対照の発現。レナリドミドは、０、０．１、１．０、または１０マイクロモル濃度で添加した。
レナリドミドが融合タンパク質のタンパク質分解を引き起こす経路をまとめるために、最初にレナリドミドをＨｅＬａ細胞に添加する。次いで、レナリドミドは、これらの細胞中に天然に存在するセレブロンに結合する。このセレブロンは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとの複合体で存在する。Ｅ３ユビキチンリガーゼは、組換えＩＫＺＦ１融合タンパク質（または組換えＩＫＺＦ３融合タンパク質）をユビキチンでタグ付けすることによってレナリドミドに応答する。最終結果は、ユビキチンタグ付融合タンパク質が細胞のプロテアソーム中で分解されることである。
ピコウェルプレートのコーティング。これは、ピコウェルプレートの上面に印加されるが、必ずしもピコウェルの内部に進入し内部をコーティングしない溶液のことである。これはまた、ピコウェルプレートの上面に印加され、ピコウェルに進入する溶液、およびピコウェルの底面をコーティングする溶液にも関する。出願人は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）１２７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液を、乾燥プラスチックに添加した。その結果は、親水性であり、最早疎水性ではない表面である。次いで、表面を、水で洗浄した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加したが、このＰＢＳは、ピコウェルの内部に進入する。減圧によって移動する空気を印加し、その結果、ピコウェル中に小さい気泡の拡大をもたらし、次いで、気泡をＰＢＳで置き換え、最終的に、多くのピコウェルは、ＰＢＳで充填される。次いで、ＰＢＳを、ビトロネクチンコーティング溶液（ＡＦ－ＶＭＢ－２２０）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）で置き換えた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）１２７は、Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘ（ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３）ｙ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｚＯＨである。ビトロネクチンコーティング溶液を印加した後、出願人は、３７℃で３０分にわたってインキュベートして、コーティング溶液をピコウェル中に入れた。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ １２７は、ピコウェルを隔てる頂部をコーティングし、ビトロネクチンはピコウェルの底部にある。ＨｅＬａ細胞はビトロネクチンに結合し、それらがビトロネクチンに結合する時に、それらはピコウェルの底部に付着する。
ＨｅＬａ細胞を、フローサイトメトリーによって上手くトランスフェクトされた細胞についてスクリーニングした。トランスフェクションの成功を決定するために、２つの基準を同時に使用した。最初に、レナリドミドを、フローサイトメトリーによる選別の２日前に細胞培地に添加した。陽性細胞は、赤色プラスおよび緑色マイナスであり、赤色－ＰＬＵＳは、細胞がｍＳｃａｒをコードする遺伝子でトランスフェクトされたことを意味し、緑色－ＭＩＮＵＳは、レナリドミドが実際に融合タンパク質ＩＫＺＦ１／ｍＮｅｏｎ（または融合タンパク質ＩＫＺＦ３／ｍＮｅｏｎ）のユビキチン化および分解を促進したことを意味していた。ドキシサイクリンに関しては、ドキシサイクリンを３マイクロモル濃度で使用して、レンチウイルスベクターコンストラクトの発現を誘導した。ドキシサイクリンを用いた濃度／誘導曲線は、Go and Ho (2002) J. Gene Medicine. 4:258-270によって示されている。レンチウイルスベクターをトランスフェクトした後、以下の条件を使用して、増殖中の細胞中でのＩＫＺＦ１の最小限の発現を維持した。その条件は、培地からドキシサイクリンを除くこと、およびまた、コンストラクト中で「絶縁配列（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を使用することであった。絶縁配列は、コンストラクトの外部のプロモーターからのリードスルーを防止する。絶縁配列は、記載されている（Anton et al (2005) Cancer Gene Therapy. 12:640-646、Carr et al (2017) PLoS ONE. 12:e0176013を参照されたい）。絶縁配列は、コンストラクトの外部にあるプロモーターが、コンストラクトの一部であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を駆動するのを防止する。細胞をピコウェル中に入れるために、細胞を、［細胞数］／［ピコウェル数］の所与の比で、ピコウェルプレートの上面に移すことができる。この比は、例えば、約１個の細胞／４０個のウェル、約１個の細胞／２０個のウェル、約１個の細胞／１０個のウェル、約２個の細胞／１０個のウェル、約４個の細胞／１０個のウェル、約８個の細胞／１０個のウェル、約１６個の細胞／１０個のウェル、約３２個の細胞／１０個のウェル、約５０個の細胞／１０個のウェル、約１００個の細胞／１０個のウェルなどであってもよい。細胞がピコウェルの底部をコーティングするビトロネクチンに結合するとすぐに、細胞をピコウェル中でのアッセイのために使用することができる。
レンチウイルスコンストラクトおよび細胞培養の詳細。これは、ＩＫＺＦ１／３のためのリポーター細胞系の構築、ピコウェル中でのそれらの培養、および多量のレナリドミドを用いたそれらのアッセイに関する。リポーターコンストラクトを担持するプラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーを使用して部品からアセンブリーした（添付のマップを参照されたい）。リポーターコンストラクトを含むレンチウイルス、ならびにＵｂＣにより駆動されるｒｔＴＡ－Ｍ２．２を、第３世代のパッケージングシステム（キメラＣＭＶプロモーターおよびｔａｔタンパク質なし）を用いてＬｅｎｔｉＸ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中で作製した。プラスミドを、カルシウム沈降法によってトランスフェクトした。ウイルス上清を、推奨されたＬｅｎｔｉＸ培地＋１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に収穫し、０．４５μｍの低タンパク質結合フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。宿主ＨｅＬａ細胞を、ＡＴＣＣから取得し、標準的な条件で培養した。ウイルス上清を、集密未満のＨｅＬａ培養物に印加し、２４時間後、ドキシサイクリンを含むＬｅｎｔｉＸ培地に交換した。クローン選択の２日前に、レナリドミドを培養物に添加した。クローンを、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（陰性）およびＣｙ３チャネル（陽性）の両方でゲート化した、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択した。クローンを、アッセイ前にレナリドミドを用いずに１０日間増殖させた。最も安定な発現レベルのクローンを、スクリーニングのために使用する。
これは、細胞をビーズで密封し、多孔性ビーズによって細胞を溶解する実験を説明する。ピコウェルパターンの底部を有する９６ウェルプレート（ＭｕＷｅｌｌｓ）を、ウェルの上部分を不動態化するために印加される減圧を用いずにＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７洗剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で処理する。３０分のインキュベーション後、過剰の洗剤を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または蒸留Ｈ２Ｏで洗浄除去する。ウェルをエタノールで洗い流し、空気を流動させながら生物安全キャビネット中で乾燥させる。ウェルを、強力な減圧下で完了までＰＢＳで湿潤させ、ＰＢＳをビトロネクチンコーティング試薬（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）で置き換える。プレートを、３７℃で３０分インキュベートする。ビトロネクチンコーティング試薬を除去し、リポーター細胞を所望の密度で播種する。細胞播種の瞬間から、培地はアッセイを通じて皿中に留まる。光切断性化合物を担持するＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）ビーズを、ビトロネクチンコーティングの前に、または細胞播種の後に播種することができる。ＰＥＧポリマービーズを、ウェル数よりも過剰に培養物の上にロードする。４００ｒｃｆで１分、プレートをスピンする。適切な時間量にわたって、３６５ｎｍのＬＥＤ光源を使用してビーズから化合物を光放出させる。イメージング（蛍光リポーターの読み出し）までＣＯ２インキュベーター中でインキュベートする。
コンストラクト。図２０および図２１は、関連するコンストラクトを開示する。これらの図面はそれぞれ、ＨｅＬａ細胞ゲノム中に組み込まれる配列を開示し、図面はそれぞれ、担体配列（レンチウイルスに属する配列）を開示する。レンチウイルスに属する配列は、約１時から約９時までのものであり、この配列は２つの長い末端反復配列（ＬＴＲ）によって囲まれている。約９時から約１時までの配列は、ＨｅＬａ細胞ゲノム中に組み込まれる。詳細に言うと、最初に、プラスミドを、産生細胞（ＨＥＫ９３Ｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）中にトランスフェクトする。産生細胞は、レンチウイルスを産生した後、それを放出する。次いで、放出されたレンチウイルスは、ＨｅＬａ細胞に感染し、核酸をＨｅＬａ細胞ゲノム中に組み込む。
光学。本発明の細胞培養実験のために、出願人は、Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓのステージ（Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌｔｄ．、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ、ＮＹ）を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００－Ｍ Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ顕微鏡に接続された、ＨＢＯ１００（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたＥＢＱ１００ Ｉｓｏｌａｔｅｄ水銀ランプを使用した。出願人はまた、フィルターキューブが励起波長を制御し、検出放射の波長も制御する、水銀ランプを備えたフィルターキューブも使用した。イメージを、Ｂａｓｌｅｒ ＡＣＡ２４４０－３５ＵＭ（Ｂａｓｌｅｒ ＡＧ、２２９２６、Ａｈｒｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて捕捉した。水銀ランプの代替手段として、ハロゲンランプを使用した。マイクロウェルプレート、ピコウェルプレートなどを、プレートホルダーおよびコントローラ付き「ＸＹステージ」を用いて所定の位置で保持した。ＸＹステージおよび光学使用のための他の正確な配置のステージは、Ｎｅｗｍａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｒａｎｃｈｏ Ｓａｎｔａ Ｍａｒｇａｒｉｔａ、ＣＡ、Ａｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ ＧｍＢＨ、７６２２８ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。
［実施例５］
活性化合物のためのＭＤＭ２に基づくアッセイ
アミノ基を含有するようにガラスを改変する。１つまたは複数のいくつかの「機能的シラン」によって、アミノ基を含有するようにシリカ基質を改変することができる。これらの「機能的シラン」は、３－アミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＥＡＰＴＥＳ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－３－アミノプロピル鳥目突起しシラン（ＡＥＡＰＴＭＳ）、およびＮ－（６－アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン（ＡＨＡＭＴＥＳ）である。これらの試薬と、ガラスとの反応を、蒸気相中で、または溶液相中で行うことができる（Zhu, Lerum, Chen (2012) Langmuir. 28:416-423を参照されたい）。
化合物の生化学的アッセイ（ＭＤＭ２に基づくアッセイ）からの結果。実験方法。以下の試薬を、スライドガラスに印加した。スライドガラスを、アミノ基を有するように改変した。試薬は、ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｍＴＥＴであった。ＮＨＳは、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドである。ＮＨＳは、ある型の活性化エステルである。ＮＨＳは、マイクロビーズまたはマイクロアレイスライドの表面活性化などのバイオコンジュゲーション反応において有用である（Klykov and Weller (2015) Analytical Methods. 7:6443-6448）。
ＰＥＧは、ポリエチレングリコールである。ｍＴＥＴは、メチルテトラジンである。この試薬を、ＤＭＳＯと混合した後、２マイクロリットルの容量をスライドガラスに印加した。１０マイクロリットルの５０ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＧ－ｍＴＥＴと、３０マイクロリットルのＤＭＳＯとを混合することにより、混合物を作製した。ＮＨＳ基は、ガラス側のアミノ基と反応し、その結果、ｍＴＥＴ基はスライドガラスに貼り付く。ｍＴＥＴの目的は、スライドとビーズとの間で共有的連結を作出することであった。
ＴＣＯおよびテトラジンは、「クリック化学」反応を媒介することができる。これらのクリック化学反応の例は、ＴＣＯによって機能化されたＤＮＡと連結するように、テトラジンで機能化された抗体を使用することである。または、テトラジン改変ビーズと連結するようにＴＣＯで改変された抗体を使用することである（van Buggenum et al (2016) Scientific Reports. 6:22675 (DOI:10.1038)、Rahim et al (2015) Bioconjug. Chem. 18:352-360、Haun et al (2010) Nature Nanotechnol. 5:660-665を参照されたい）。
詳細に言うと、パラフィルムのシートをスライドの上部に印加することによってスライドガラスを調製し、パラフィルムは中央から切り出された開口部を有し、上記混合物の液滴をスライドガラスに直接的に開口部で印加した。混合物を印加する前に、上部にパラフィルムを有するスライドガラスを９０秒間、完全熱処理によって加熱して、パラフィルムとスライドとの間で密封を作出し、混合物をパラフィルム中の開いた領域（開口部）に印加した後の液体の漏出を防止した。パラフィルム中で切断された開口部に２マイクロリットルの液滴を入れたスライドガラスを、室温で一晩インキュベートした。インキュベーション中、スライドガラスはペトリ皿の内部にあり、そこで皿を、ペトリ皿の上部および側部を覆うカバーガラスで覆った。一晩インキュベートする前に、四角形のパラフィンを液滴の上および周囲のパラフィルムの上に置き、液滴から水が蒸発するのを防止した。
スライド／ビーズ／抗体の複合体を作製するための本発明の方法。出願人の方法は、ＴＣＯによって機能化されたビーズを使用するものであった。ビーズのＴＣＯ基は、メチルテトラジン機能化スライドのビーズへの共有結合を媒介した。また、ビーズのＴＣＯ基は、メチルテトラジン機能化抗ｐ５３抗体のビーズへの共有結合も媒介した。
出願人は驚くべきことに、第１の工程がスライドとビーズとを接触させることである場合、その後の抗体の添加は抗体のビーズへの共有結合をもたらさないことを見出した。また、出願人は驚くべきことに、第１の工程がビーズと抗体とを接触させることである場合、この混合物のスライドへのその後の移動はビーズのスライドへの共有結合をもたらさないことも見出した。好ましい方法では、これらの３つの試薬－スライド、ビーズ、および抗体の全てを、同時に互いに接触させる。別の好ましい実施形態では、ビーズと抗体とを最初に一緒に混合して、ビーズの抗体への共有的連結を開始させ、直後に、または数分以内に、この混合物をスライドに印加し、その結果として、ビーズのスライドへの共有的連結をもたらす。
酵素に基づくスクリーニングアッセイの性質。アッセイは、ビーズが結合したスライドガラスの形態をとる。ビーズは、転写因子ｐ５３への結合に特異的である結合した抗体を含有する。この抗体は、ヒトｐ５３に結合し、また、ユビキチン化されたヒトｐ５３にも結合することができる。今までのところ、アッセイ方法は以下の試薬間のサンドイッチを含むと見ることができる：スライド／共有結合したビーズ／ビーズ結合抗ｐ５３ Ａｂ／ユビキチン化されたｐ５３。
このアッセイからのリードアウトは、ユビキチン化されたｐ５３であり、ユビキチン化されたｐ５３は、ユビキチンに特異的である蛍光抗体によって検出される。詳細に言うと、抗体は、フルオロフォア（ＡＦ４８８）でタグ付けされた、ヤギ中で作製されたポリクローナル抗体である。図８は、ＡＦ４８８の構造を開示する。この蛍光抗体は、ユビキチンに結合する。かくして、ユビキチン化されたｐ５３が検出される場合、存在するものは、以下のサンドイッチである：スライド／共有結合したビーズ／ビーズ結合抗ｐ５３ Ａｂ／ユビキチン化されたｐ５３／蛍光Ａｂ。
［実施例６］
ピコウェル中でのＤＮＡの配列決定
ビーズ結合ＤＮＡバーコードの配列決定を実施し、ビーズを、ピコウェルあたり１個のビーズでピコウェル中に投入した。アッセイ方法は、蛍光ヌクレオチドの一過的結合によって、一時に１回、ビーズ結合ＤＮＡバーコード上のそれぞれの位置を問い合わせることを含んでいた。それぞれのビーズは、約１００アトモルの連結したＤＮＡバーコードを含有し、連結はクリック化学によるものであった。この数は、ビーズあたりに連結した、約６０００万個のオリゴヌクレオチドと同等である。ＤＮＡバーコード上のそれぞれの塩基について、アッセイは、４つ全ての蛍光ｄＮＴＰを同時に添加することを含む。いかなる限定も意味するものではないが、４つの蛍光ｄＮＴＰは、ＡＦ４８８－ｄＧＴＰ、ＣＹ３－ｄＡＴＰ、ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｄＵＴＰ、およびＣＹ５－ｄＣＴＰであった。蛍光シグナルを捕捉した後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）によってプロセッシングして、対応する数値を得た。データは、ビーズ結合ＤＮＡバーコードの一部であった５つの連続するヌクレオチド（全て連続する）を配列決定することに由来するものである。ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、ＤＮＡヘアピン領域を含んでいた。ＤＮＡヘアピン領域中の塩基は、それ自身にアニーリングし、ヘアピンの形成をもたらし、このＤＮＡヘアピン中の３’末端ヌクレオチドは配列決定プライマーとして働いた。一過的結合による配列決定を、この３’末端で開始させた。配列決定アッセイを、３回反復で実施した、すなわち、３つの異なるビーズを使用し、１つのＤＮＡバーコード配列を、３つのビーズのそれぞれについて使用した。換言すれば、３つのビーズはそれぞれ、他の２つのビーズによって提供されるものと同一の配列決定リードアウトを提供することが予想された。
図２８は、配列決定をビーズ結合ＤＮＡバーコード上で行った、配列決定の結果を開示する。第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、第４の塩基、および第５の塩基を問い合わせる結果が示される。これらの塩基のそれぞれについて、別々のヒストグラムバーによって別々に示されるものは、それぞれ、ＡＦ４８８－ｄＧＴＰ、ＣＹ３－ｄＡＴＰ、ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｄＵＴＰ、およびＣＹ５－ｄＣＴＰを用いた問合せに関して産生される蛍光放射である。４つのヒストグラムバーはそれぞれ、異なる画像を有する：ＡＦ４８８－ｄＧＴＰ（黒色の輪郭、灰色の内部）、ＣＹ３－ｄＡＴＰ（黒色の輪郭、白色の内部）、ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｄＵＴＰ（黒色のヒストグラムバー）、およびＣＹ５－ｄＣＴＰ（灰色のヒストグラムバー）。ビーズの直径は、水性溶液中で膨張させた後、１０～１４マイクロメートルであった。ピコウェルの容量は、１２ピコリットルであった。
問い合わせた鋳型配列は、５’－ＣＴＣＡＣＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＴ－３’であった。この特定の配列決定アッセイのために、５つの連続する塩基を問い合わせたところ、最も大きい蛍光シグナルを与えた蛍光ｄＮＴＰは、蛍光ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＧＴＰであったが、これは、ｄＣ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＡ、およびｄＣである鋳型上の配列に一致する。かくして、配列決定の結果は、１００％正確であった。この結果は、ビーズ結合ＤＮＡバーコードを配列決定することができること、すなわち、ＤＮＡバーコードがビーズに依然として結合している場合を示している。換言すれば、ビーズ結合ＤＮＡバーコードは、配列決定可能である。
［実施例７］
細胞バーコーディング
バーコーディングの概念の導入。これは、バーコーディングの概念を導入するものである。一般的なバーコーディング技術は、所与の単一細胞のトランスクリプトームをバーコーディングする。図３６および図３７は、将来の配列決定に備えて、トランスクリプトームを捕捉および増幅する手順に関する工程を例示する。図３６は、ｍＲＮＡを放出させるための細胞の溶解、次いで、逆転写を示す。図３７は、固定されたポリ（ｄＴ）によるｍＲＮＡの捕捉、次いで、逆転写、および最終的には、配列決定を示す。配列決定は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を用いてもよい。
所与の細胞に由来するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の一部または多くを、共通のバーコードでタグ付けすることができ、このタグ付けにより、研究者は、任意の所与のｍＲＮＡ配列について、所与の細胞に関してそのコード配列の起源を決定することができる。例えば、１００個の異なる単一細胞に由来する別々のトランスクリプトームのそれぞれを代表する核酸を一緒に混合する場合、および１００個の異なる単一細胞のそれぞれに由来する核酸がそれ自身のバーコードを有する場合、以下の利点が得られるであろう。その利点とは、全てのトランスクリプトームに由来する核酸を１つの試験管中で一緒に混合した後、次世代配列決定にかけることができ、バーコードにより、ユーザーが同じ細胞に由来する情報を特定することができるというものである。
上記利点は、以下のように、異なる方法で説明される。ｍＲＮＡバーコーディングの使用において、所与の単一細胞は、その細胞に由来するｍＲＮＡ分子の一部または多くに由来する情報が、ｃＤＮＡの対応する分子に変換され、これらのｃＤＮＡ分子のそれぞれが正確に同じＤＮＡバーコードを有するようにプロセッシングされる。このバーコーディング手順を、１０個、２０個、１００個、数百個、または１，０００個を超える異なる細胞について繰り返すことができ、これらの細胞のそれぞれに由来するｃＤＮＡ分子は、特有の、細胞特異的バーコードを有することによって区別される。この方法により、研究者は、全ての細胞に由来する全てのバーコード化されたｃＤＮＡ分子のプールから、全て１回の配列決定の実行において、ＤＮＡ配列決定を行うことができる（配列決定の前に、全てのバーコード化されたｃＤＮＡ分子を一緒に混合する）（Avital, Hashimshony, Yanai (2014) Genome Biology. 15:110を参照されたい）。
細胞膜をタグ付けするバーコードと比較した、核酸をタグ付けするバーコード。それぞれの化学物質、またはそれぞれのクラスの化学物質の全メンバーが、特有のＤＮＡバーコードと関連する、化学物質のライブラリーを調製するための指針が利用可能である（Brenner and Lerner (1992) Proc. Nat’l. Acad. Sci. 89:5381-5383、Bose, Wan, Carr (2015) Genome Biology. 16:120. DOI 10.1186）。上記のバーコーディング例を考慮すると、以下は、特定の、単一細胞に適用することもできる別の型のバーコーディングを提供する。本開示は、細胞の細胞膜に安定に結合するタグの形態をとる細胞関連バーコーディングを提供する。
細胞膜結合型に結合する少なくとも２種類のバーコードの選択肢。所与の細胞の細胞膜をタグ付けするために使用されるバーコードは、細胞型を特定する第１のバーコードと、細胞に曝露された撹乱因子（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）を特定する第２のバーコードとを含んでもよい。例えば、第１のバーコードは、健康なヒト対象、臨床試験７番からのヒト対象３８番、ヒト原発性結腸直腸がん細胞系、５回継代されたヒト原発性結腸直腸がん細胞系、多発性骨髄腫を有する多発性骨髄腫ヒト対象、多発性骨髄腫を有する処置未経験のヒト対象２３番、または多発性骨髄腫を有する処置経験済ヒト対象３２番を起源とする細胞を特定することができる。
また、バーコードは、その特定の単一細胞に与えられた（バーコーディングの前または後に与えられた）「撹乱因子」を特定することができる。「撹乱因子」は、抗がん薬物、抗がん薬物の組合せ、組合せ的に生成された化合物、または抗体薬と低分子薬物との組合せであってもよい。バーコーディングを使用して、所与の単一細胞の経過を追うことができ、またそれを使用して、その細胞と、１つまたは複数の細胞シグナル伝達経路の活性化または阻害、遊走の増加または減少、アポトーシス、壊死、１つまたは複数のＣＤタンパク質（ＣＤ、分化クラスター）の発現の変化、１つまたは複数のがん遺伝子の発現の変化、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現の変化などの、その後の挙動とを相関させることができる。発現は、転写速度、細胞中での所与のポリペプチドのレベル、細胞質型から膜結合型への所与のタンパク質の位置の変化などに関するものであってよい。
膜結合型糖タンパク質の細胞表面オリゴ糖のタグ付け。ＤＮＡバーコードなどのタグを生きている細胞の細胞膜に接続するための方法および試薬が利用可能である。タグ付けを、ＤＮＡバーコードと、膜結合型糖タンパク質のオリゴ糖鎖を攻撃し、それに共有結合する反応部分との共有的複合体からなる試薬を用いて達成することができる。文献は、ヒドラジドビオシチンを使用して、ビオチンを膜結合型糖タンパク質上の炭水化物に接続することができると確立している。本開示は、ビオチンがＤＮＡバーコードで置き換えられることを除いて、この試薬を使用する。炭水化物は、アルデヒドを形成するために酸化される必要がある。ヒドラジドは、アルデヒドと反応して、ヒドラジン結合を形成する。オリゴ糖上のシアル酸成分は、１ｍＭのメタ－過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化される。酸化工程、およびヒドラジド結合工程を行う際に、第１級アミン基を含む緩衝剤を回避するべきである。例えば、Instructions. EZ-LinkHydrazide Biocytin. Number 28020. ThermoScientific (2016) (4 pages)、Bayer (1988) Analyt. Biochem. 170:271-281、Reisfeld (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:519-526、Wollscheid, Bibel, Watts (2009) Nature Biotechnol. 27:378-386を参照されたい。
生きている細胞上の糖タンパク質のオリゴ糖部分をタグ付けするための別の方法は、過ヨウ素酸塩酸化およびアニリン触媒オキシムライゲーションを使用することである。この方法は、シアル酸の温和な過ヨウ素酸塩酸化、次いで、アニリンの存在下でのアミノオキシタグによるライゲーションを使用する。この方法の変形形態では、ガラクトースオキシダーゼを使用して、アルデヒドを、オリゴ糖の末端ガラクトース残基および末端Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基中に導入することができる。ガラクトースオキシダーゼは、炭素－６で酸化を触媒して、アルデヒドを生成する。アルデヒド生成後、アニリンにより触媒されるライゲーションを使用してアミノオキシビオチンと連結することができる（Ramya, Cravatt, Paulson (2013) Glycobiology. 23:211-221を参照されたい）。本開示は、ビオチンをＤＮＡバーコードで置き換え、アミノオキシ－ＤＮＡバーコードのアニリンにより触媒されるライゲーションを提供する。
細胞表面に結合した抗体によって媒介されるタグ付け。本開示は、結合が膜結合型タンパク質に特異的に結合する抗体によって媒介される、バーコードを細胞の細胞膜に結合させるための方法および試薬を提供する。抗体は、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）で共有的に改変されていてもよく、この改変は、４℃で一晩のインキュベーションを用いて行うことができる（Supporting Information (5 pages) for Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016を参照されたい）。抗体のこの共有的改変を、ｔｒａｎｓ－シクロオクテンスクシンイミジルカルボネート試薬を用いて実行することができる（Devaraj, Haun, Weissleder (2009) Angew. Chem. Intl. 48:7013-7016）。次いで、抗体－テトラジン複合体を、細胞と接触させ、膜結合型抗体を得ることができる。膜結合型抗体はそれぞれ、抗体をＤＮＡバーコード－テトラジン複合体に曝露することなどによって、クリック化学による抗体のタグ付けを可能にするテトラジン部分を担持する。
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）試薬を使用して、抗体の遊離アミノ基でテトラジンを導入することができる（van Buggenum, Gerlach, Mulder (2016) Scientific Reports. 6:22675を参照されたい）。抗体が１つまたは複数のテトラジン基を含有すると、ＴＣＯ－ＤＮＡバーコードである試薬によって、ＤＮＡバーコードを結合させることによって、抗体をさらに改変することができる。次いで、この改変抗体を手にして、抗体を生きている細胞をタグ付けするために使用することができ、そこで抗体は細胞の膜結合型タンパク質に結合する。
テトラジン－ＤＮＡバーコードの複合体を調製することができる。次いで、培地が細胞を含み、細胞が結合した抗体－ＴＣＯ複合体を担持する、細胞培地中に、この複合体を導入することができる。テトラジン－ＤＮＡバーコードが膜結合型抗体－ＴＣＯ複合体と接触する場合、その結果は、細胞がＤＮＡバーコードでタグ付けされるようになるクリック化学反応である。このクリック化学反応を、３７℃で３０分間にわたって実行することができる。
上記手順における使用のための好ましい抗体は、細胞膜の膜結合型タンパク質に固く、特異的に結合するものであり、膜結合型タンパク質は、高い存在量で、例えば、細胞膜あたり５０，０００コピーを超えて存在し、膜結合型タンパク質は、細胞表面上で安定であり、細胞の内部であまり再循環せず、膜結合型膜は、培養培地中にあまり脱落しない。
アジド、次いで、オクチンコンジュゲートを用いたクリック化学による膜結合型タンパク質のタグ付け。リポ酸リガーゼ酵素、次いで、ＤＮＡバーコードにコンジュゲートされるフッ素化オクチン化合物の結合によって、生きている細胞の膜結合型タンパク質上にアジドを導入することができる。フッ素化オクチン化合物のフルオロフォアへのコンジュゲーションは、記載されている（Jewett and Bertozzi (2010) Chem. Soc. Rev. 39:1272-1279、Fernandez-Suarez, Bertozzi, Ting (2007) Nature Biotechnol. 25:1483-1487を参照されたい）。繰り返して言うと、「Ｔｉｎｇおよび共同研究者は、リポ酸リガーゼを使用して哺乳動物細胞表面タンパク質中にアジドを導入した後、そのタンパク質をフッ素化シクロオクチンコンジュゲート化蛍光色素コンジュゲート化蛍光色素で標識することができる」（Jewett et al, supra）。
［実施例７］
ピコウェル上のキャップ
ピコウェルのキャッピング。それぞれのピコウェルを、ピコウェルの開口部（上の開口）に適合する球体を用いて、それぞれのピコウェルに対して１個の球体でキャッピングした。球体をピコウェルプレートに印加するために、球体を増殖培地中に入れ、懸濁した後、ピコウェルプレートの上面に印加し、球体を沈降させる。次いで、プレート全体を遠心分離機に入れ、低重力でスピンして、それぞれのピコウェルの開口部での球体の堅い固定を得る。
能動的キャップおよび受動的キャップ。図１８Ａは、ピコウェルの上部に挿入される能動的キャップを示し、図１８Ｂは、ピコウェルの上部に挿入される受動的キャップを示す。好ましくは、キャップは、ピコウェルプレートを作製するために使用される材料よりも柔らかく、その結果、ピコウェルの開口部中で圧迫される時にキャップのわずかに変形し、ぴったりした固定が得られ、漏出を防止する。実施形態では、本開示は、１つまたは複数の能動的キャップ、受動的キャップ、または能動的キャップと受動的キャップとの両方を提供する。それぞれのキャップは、自立型であり、他の任意のキャップに接続されていなくてもよい。代替的な実施形態では、例えば、複数のキャップがポリマーのシートの底部から突出し、突出キャップがそれぞれのピコウェル中に適合するために所定の位置にある、プレートの上面に重ねることができるポリマーのシートによって、より多くのキャップを一緒に接続することができる。能動的キャップを、ピコウェルの床部に乗ることができるビーズの代わりに使用することができる。能動的キャップは、実質的に同一の化合物の多くの結合したコピーを含有し、それぞれの化合物は、能動的キャップ（ここでは球状ビーズの試料中に示される）に結合し、切断は、ピコウェル中に存在する溶液中への化合物の放出をもたらす（図１８Ａ）。
受動的キャップに関しては、受動的キャップは多孔性であり、それはスポンジのように作用する。それは生化学的反応に由来する生成物を吸収し、かくして、生成物の収集を容易にし、ユーザーの目標は、ピコウェル中の培養物である生きている生物学的細胞に対する所与の化合物の影響を決定することである。換言すれば、化合物は、細胞の応答を刺激し、その応答は、１つまたは複数の代謝物の発現の増加（または減少）の形態をとり、代謝物の一部は、受動的キャップに向かって拡散し、受動的キャップによって吸収される。次いで、ユーザーは、受動的キャップを収集し、受動的キャップに吸収された代謝物を分析することができる（図１８Ｂ）。
キャップのアレイに接着するポリマーマット。図１９は、多孔性キャップのアレイにおいてそれぞれのキャップに接着することができるポリマーマットを例示する。接着したら、ポリマーマットを剥がし、除去して、それぞれの多孔性キャップをアレイ中で一緒にする。結果として、多孔性キャップを有するポリマーマットを、多孔性キャップと結合している代謝物または他の化学物質を測定するアッセイのために使用することができる。
段階的な例を提供するために、何千個ものピコウェルのアレイ中のそれぞれのウェルは、１個のビーズを含有してもよく、それぞれのビーズは、１つの型の化合物を含有し、その化合物は切断性リンカーを介して結合する。ピコウェルはまた、溶液ならびに培養細胞を含有する。ピコウェルは多孔性キャップで密封され、多孔性キャップは、溶液と接触し、培養細胞から放出される代謝物を捕捉（試料化、吸収、吸収）することができる。代謝物は、化合物の代謝物であってもよいか、または代謝物は、サイトカイン、インターロイキン、中間代謝の生成物、マイクロＲＮＡ分子、エキソソームなどの形態をとってもよい。最後に、ポリアクリルアミドの溶液を、ピコウェルプレート上に注ぎ、ポリアクリルアミドを数千個の多孔性キャップ中に浸した後、それぞれの、かつ全てのキャップに固く接着するマットの形態で固化させる。次いで、固化したマットを除去し、それぞれのキャップを、吸収した代謝物について別々に分析する。
好ましい実施形態では、ポリアクリルアミドゲルを使用して、キャッピングビーズを捕捉層またはマット中で架橋する。キャッピングビーズを硬化させ、捕捉するためにピコウェルアレイ上に注ぐことができるポリアクリルアミド溶液の２０％溶液を作出するためのプロトコルは、以下の通りである。４ｍｌの４０％ビス－アクリルアミド溶液および２ｍｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８を、１．８ｍｌの蒸留した脱イオン水に添加する。キャッピングされたピコウェルアレイ上にこの混合物を注ぐ直前に、８０マイクロリットルのフリーラジカル初期化剤である過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、１０％ストック溶液）、および８マイクロリットルのフリーラジカル安定化剤であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレン－ジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加して、ゲルの架橋化を開始させる。完全な架橋の前にゲル層を注ぎ、キャッピングされたピコウェルアレイ上で完全に架橋させる。一度完全に架橋したら（取り扱うのに十分な硬さ、または大まかに６０分の設定）、ポリアクリルアミド層を、ピンセットを使用して剥がすことができる。キャッピングビーズはピコウェルの上部から持ち上がり、ポリアクリルアミド層に結合することが見出される。この挙動は、ポリアクリルアミドビーズ、Ｔｅｎｔａｇｅｌビーズ、ポリスチレンビーズおよびシリカビーズを含む複数のビーズ型について観察することができる。
漏出の防止におけるキャップの有効性の測定。実施形態では、光切断性リンカーを有するビーズを使用することによって、キャップの有効性を決定することができる。ピコウェルの、または１つの特定のピコウェルアレイ中のいくつかのピコウェルのイメージを、ピコウェルをＵＶ光に曝露する直前に、およびピコウェルをＵＶ光に曝露した後の時間枠で捕捉することができる。例えば、イメージを、ｔ＝－１０秒およびｔ＝１０秒、２０ｓｅｃ、４０ｓｅｃ、６０ｓｅｃ、２分、４分、８分、１５分、６０分、９０分、２時間、３時間、および４時間で捕捉することができる。２時間での所与のウェルの蛍光が、ｔ＝－１０秒で撮影されたバックグラウンドイメージを差し引いて、ｔ＝１０秒で見出された蛍光の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または約１００％に等しい場合、優れた有効性が示され得る。また、イメージを、例えば、キャップのすぐ近くで、ピコウェルの外部のピコウェルプレートの領域から取得することもできる。プレートの表面上（ピコウェルの外部）およびキャップのすぐ近くの領域の蛍光が、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、または０．００１％未満である場合、優れた有効性が示され得る。この比較を、ウェル中の流体の体積に関係なく、また、プレートの上部およびキャップの外部にある流体の体積に関係なく行うことができ、ここで、比較は、光検出器によって捕捉される視野全体を単に考慮に入れてもよい。あるいは、比較を、流体の深さ（ピコウェルの深さ、ピコウェルプレートの上部の流体の深さ）を補正して行うことができる。また、あるいは、比較は、ピコウェルプレートの表面全体を超えて漏出するフルオロフォアの拡散を考慮に入れてもよい。
バーコーディングが本開示の試薬および方法に適合する方法。以下は、本開示の試薬および方法のさらなる実施形態を提供する。
試薬および能力。顕微鏡的ビーズが提供される。単量体を用いた固相合成によってそれぞれ連結することができる、複数の第１のリンカーによって、顕微鏡的ビーズを共有的に改変することができ、固相合成の完了は、いくつかの化学物質ライブラリーを作出する。化学物質ライブラリーのこのメンバーは、ビーズ結合型である。それぞれ、複数のＤＮＡバーコードと連結することができる、複数の第２のリンカーによって、同じ顕微鏡的ビーズを共有的に改変することができる。ＤＮＡバーコードのこのメンバーは、ビーズ結合型である。
［実施例９］
本開示のＤＮＡバーコード
これは、ＤＮＡ配列を、化学物質ライブラリーメンバーと相関付ける「ＤＮＡバーコード」を提供する、紙に印刷することができるか、またはコンピュータ言語で保存することができる情報のセットに関する。このＤＮＡバーコードは、「凡例」または「鍵」と呼ぶことができる。ＤＮＡバーコードはまた、特定のＦＤＡに認可された抗がん薬物のアナログなどの、特定のクラスの化合物を特定することができるか、またはユーザー名を特定することができる、またはビーズ結合型化学物質ライブラリーを用いて試験される特定の疾患を特定することができる核酸も提供する。
［実施例１０］
レナリドミドアナログ
図１３、図１４および図１５は、それぞれの誘導体が、カルボン酸基を担持する、３つの異なる誘導体へのレナリドミドの変換を開示する。次いで、これらのカルボン酸基のそれぞれを使用して、ビーズ－リンカー複合体で縮合させることができる。この状況では、カルボン酸基がビーズ－リンカー複合体に縮合される場合、それは以前にＦｍｏｃによって占有されていた位置に結合する。
第１級アミンから開始して、それをカルボン酸に変換する（図１３）。出願人は、第１級アミンを有する化合物を、カルボキシル基を有する化合物に変換することによって、化合物のライブラリーを生成する手法を採用する。図１３は、レナリドミドからの出発を開示する。レナリドミドは、第１級アミンを有する。これに、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）中の無水コハク酸を添加する。無水コハク酸は、第１級アミノ基と縮合し、カルボン酸基を担持するレナリドミドが得られる。図面中の用語「ｃａｔ．」は、触媒を意味する。
続いて、このカルボン酸基を、ビーズに連結することができる。かくして、得られる複合体は、ＢＥＡＤ－コハク酸部分－レナリドミドである。
図１４は、レナリドミドから出発し、ｔ－ブチル－ブロモ酢酸を添加して、中間体を得ることを開示する。次いで、中間体を、ＦｍｏｃＯＳｕ（ｏ－スクシンイミド）で処理して、レナリドミドのカルボン酸誘導体である最終生成物を得る。次いで、カルボン酸部分を、遊離アミノ基、例えば、かつてＦｍｏｃ基が結合していた遊離アミノ基と縮合させることができる。あるいは、カルボン酸を、ビーズ上に存在する化学的単量体の遊離アミノ基と縮合させることができ、縮合の結果、互いに結合した２つの化学的単量体が得られる。
図１５は、出発材料としてのレナリドミドを開示する。レナリドミドを、３－カルボキシベンズアルデヒドと反応させ、アルデヒド基は、アミノ基と縮合し、レナリドミドのさらに別の型のカルボン酸誘導体が得られる。
図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃは、化合物をビーズから放出させた後、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイにおいて活性について試験することができる、新規かつ特有のビーズ結合化合物のライブラリーを生成するための出願人のさらに別の手法を開示する。３つの化合物はそれぞれ、第１級アミンがベンゼン環の特有の位置にある、レナリドミドアナログである。
［実施例１１］
連結された応答－捕捉エレメントを有するビーズと一緒に細胞を含有するピコウェル
本開示は、測定される応答が、トランスクリプトームの変化の形態をとる、化合物に対する細胞の応答を評価するための試薬、システム、および方法を提供する。「トランスクリプトームの変化」とは、いかなる限定も意味するものではないが、細胞中のそれぞれの、および全ての型の特有のｍＲＮＡの量の変化、ならびに細胞中の所定のセットのｍＲＮＡ分子の量の変化を指してもよい。「トランスクリプトームの変化」は、検出限界未満から検出可能になるまでの変化、ならびに検出可能であるものから検出限界未満に低下する変化を含み、これらの変化は、ビーズ結合化合物の放出と関連する。
洗剤または界面活性剤をピコウェルアレイに添加することによって、細胞を溶解することができる。例えば、ある容量の洗剤を含有する緩衝剤を、何千個ものピコウェルを中に含有するマイクロウェル中にピペットで入れることができる。洗剤を全てのピコウェル中に拡散させて、その中の細胞の溶解、ｍＲＮＡの放出、そして最終的には、ビーズ結合「捕捉応答エレメント」による結合を引き起こすことができる。
細胞溶解。細胞を、凍結および解凍の１回または複数のサイクルによって溶解することができる（Bose, Wan, Carr (2015) Genome Biology. 16:120. DOI 10.1186）。また、細胞を、振とうしながら、ペルフルオロ－１－オクタノールで溶解することもできる（Macosko, Basu, Satija (2015) Cell. 161:1202-1214、Ziegenhain (2017) Molecular Cell. 65:631-643、Eastburn, Sciambi, Abate (2014) Nucleic Acids Res. 42:e128）。また、細胞を、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標））と、プロテアーゼとの組合せによって溶解することもできる（Eastburn, Sciambi, Abate (2013) Anal. Chem. 85:8016-8021）。細胞の溶解は、ｍＲＮＡの放出をもたらす。ｍＲＮＡは、溶解した細胞（または複数の細胞）と同じピコウェル中に存在するビーズによって捕捉される。ビーズは、それぞれのポリヌクレオチドが２つの核酸を含有し、第１の核酸が共通のＤＮＡバーコードを含有し、第２の核酸が、「応答捕捉エレメント」を含有する、多数のビーズ結合ポリヌクレオチドを含有する。目標が細胞中の全てのｍＲＮＡの無差別の捕捉である場合、「応答捕捉エレメント」は、ポリ（ｄＴ）の形態をとってもよい。このポリ（ｄＴ）は、ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）尾部に結合する。
より多くの細胞溶解条件。ナトリウム塩を含む洗剤、例えば、１５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、もしくは１５ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはカリウム塩を含む洗剤、例えば、１５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌを含む０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌを含む０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌを含む０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、もしくは１５ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌを含む０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００への曝露によって、細胞溶解を行うことができる。曝露は、約４℃、または室温（２３℃）で１０分、２０分、４０分、または６０分などであってもよい。
本開示は、発現プロファイルに対する化合物の影響を評価することができる。ビーズ結合捕捉エレメントは、１つまたは複数のｍＲＮＡ分子が特定の疾患と関連する、１つまたは複数の目的のｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズすることができる１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドの形態をとってもよい。種々の疾患に関する発現プロファイルは、例えば、結腸がん（Llarena (2009) J. Clin. Oncol. 25:155 (e22182)）、卵巣がん（Spentzos (2005) J. Clin. Oncol. 23:7911-7918）、および肺腺癌（Takeuchi (2006) J. Clin. Oncol. 11:1679-1688）について利用可能である。同様の例を与えるために、特徴付けることもできるものは、肝臓に転移した非肝腫瘍細胞と関連するｍＲＮＡに対する放出された化合物の影響である（Barshack, Rosenwald, Bronfeld (2008) J. Clin. Oncol. 26:15 Suppl. 11026、Barshack (2010) Int. J. Biochem. Cell Biol. 42:1355-1362）。
トランスクリプトームの捕捉。ｍＲＮＡを、そのポリＡ基を固定されたポリ（ｄＴ）にハイブリダイズさせることによって捕捉するための方法が利用可能である（Dubiley (1997) Nucleic Acids Res. 25:2259-2265、Hamaguchi, Aso, Shimada (1998) Clinical Chem. 44:2256-2263、D.S. Hage (2005) Handbook of Affinity Chromatography, 2nd ed, CRC Press, page 549を参照されたい）。
溶解した細胞（または複数の細胞）から放出されたｍＲＮＡ分子の捕捉後、ビーズ結合ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡからの逆転写を支援するプライマーとして働き、ビーズ結合相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をもたらし、このビーズ結合ｃＤＮＡを配列決定することができる。あるいは、ビーズ結合ｃＤＮＡをビーズから放出させることができ、ビーズ結合「応答捕捉エレメント」を、光切断性リンカーなどの切断性リンカーを用いてビーズに連結する。光切断性リンカーが使用される場合、ビーズ結合化合物（化学的単量体ライブラリーから作製された化合物）を放出させるための切断条件は、ビーズ結合「応答捕捉エレメント」を切断するだけではない。
細胞がビーズ結合化合物またはビーズから放出された化合物に曝露される場合、例えば、化合物に曝露して、または曝露せずに、トランスクリプトームの任意の変化を特徴付けることによって、細胞を遺伝子応答についてスクリーニングすることができる。また、細胞を、表現型応答、例えば、アポトーシス、１つもしくは複数の細胞シグナル伝達タンパク質の活性の変化、または１つもしくは複数のＣＤタンパク質の細胞表面発現の変化についてスクリーニングすることもできる。ＣＤは、分化クラスターである（Lal (2009) Mol. Cell Proteomics. 8:799-804、Belov (2001) Cancer Res. 61:4483-4489、IUIS/WHO Subcommittee on CD Nomenclature (1994) Bull.World Health Org. 72:807-808、IUIS-WHO Nobenclature Subcommittee (1984) Bull.World Health Org. 62:809-811を参照されたい）。一部の表現型応答アッセイについては、細胞を溶解してはならない。
本開示は、例えば、曝露がピコウェル中で行われるある型の薬物に単一細胞を曝露することによって、異なる薬物を異なる細胞に分配するための満たされない要求に対処するものである。
本開示はまた、バーコード化されたｍＲＮＡを調製する必要性も除去し、ｍＲＮＡを細胞から放出させた後、ｃＤＮＡを調製する（この型のバーコードでは、所与の細胞に由来する全てのｍＲＮＡは、トランスクリプトームが対応するｃＤＮＡのライブラリーに変換される場合、同じバーコードを受容する）。
撹乱因子を用いた細胞インキュベーション中のパラメーター。任意の所与の化合物または一部の他の型の撹乱因子について、変化させる、または制御することができるパラメーターは、光、温度、細胞培地のｐＨ、音、濃度および試薬への曝露時間（試薬は、ビーズから放出される化合物、酵素基質、サイトカイン、既に確立された薬物である化合物、塩であってもよい）、機械的撹拌、細胞表面タンパク質に対する抗体などである。
細胞のバーコーディング。細胞を、ビーズ結合化合物と共に、またはビーズ結合切断性リンカーからの切断後の化合物と共にインキュベートすることができる。インキュベーション中、またはインキュベーション後に、細胞を、撹乱因子を特定する膜結合型バーコードを用いてバーコーディングすることができる。この膜結合型バーコードを、細胞膜のオリゴ糖、細胞膜のポリペプチド、または細胞膜のリン脂質に連結することができる。
ポリ（ｄＴ）以外の応答捕捉エレメント。メッセンジャーＲＮＡを、５－プライム７－メチルグアノシンキャップによって捕捉することができる。この方法は、３つのポリＡ尾部が短い場合に特に有用である（Blower, Jambhekar (2013) PLOS One. 8:e77700を参照されたい）。また、ｍＲＮＡのコード領域にとって特異的な固定されたＤＮＡを使用して、ｍＲＮＡを捕捉することもできる。この方法は、「ＲＮＡエクソーム捕捉」と呼ばれ、およびこの名称の変形形態もある。Ｃｉｅｓｌｉｋらによれば、「トランスクリプトミクスを捕捉するのに特有のものは、エクソン標的化ＲＮＡプローブを使用する一晩の捕捉反応（ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション）である」（Cieslik (2015) Genome Res. 25:1372-1381）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）。本開示は、所与の細胞中でのｍｉＲＮＡの発現プロファイルに対する、またはあるいは、所与の種のｍｉＲＮＡによって特異的に結合されるｍＲＮＡの集団の発現プロファイルに対する、放出されたビーズ結合化合物の影響を評価することができる。例えば、本開示は、（１）ビーズ結合化合物、（２）ビーズ結合ＤＮＡバーコード、および（３）応答捕捉エレメントがｍｉＲＮＡを捕捉するか、または応答捕捉エレメントがｍｉＲＮＡの種を含む（応答捕捉エレメントの一部として）、ビーズ結合応答捕捉エレメントを含有するビーズを提供する。マイクロＲＮＡに関する発現プロファイルは、種々の型のがん、例えば、乳がんについて見出されている（Tanja (2009) J. Clin. Oncol. 27:15 Suppl. 538）。
トランスクリプトーム全体からｍＲＮＡの選択された集団を捕捉するための方法が利用可能である。「プルダウン」アッセイにおける架橋化合物として、ｍｉＲ－３４ａなどのある型のマイクロＲＮＡを使用することによって、選択性を付与することができる。簡単に述べると、「ｍｉＲ－３４ａでプルダウンされた転写物は、増殖因子シグナル伝達および細胞周期進行におけるその役割について強化されていた」（Lal, Thomas, Lieberman (2011) PLOS Genetics. 7:e1002363）。捕捉されるｍＲＮＡ分子は、ｍｉＲ－３４Ａに結合するものである。
ｍＲＮＡを捕捉し、発現レベルを分析するためのさらなる方法が利用可能である（Bacher (2016) Genome Biology. 17:63、Svensson (2017) Nature Methods. 14:381、Miao and Zhang (2016) Quantitative Biol. 4:243、Gardini (2017) Nature Methods. 12:443）。エンハンサーＲＮＡの変化の形態をとる細胞応答を測定することができる（Rahman (2017) Nucleic Acid Res. 45:3017を参照されたい）。
移送デバイス
アッセイ条件がそれを必要とする場合に単一のビーズが単一のウェル中に投入されることを確保するために、単一ウェルあたり単一のビーズを達成する移送デバイスが用いられる。移送デバイスを、ロボットプロセス、マニュアルプロセスまたはロボットプロセスとマニュアルプロセスとの組合せに含ませることができる。移送デバイスは、磁気または非磁気ビーズに基づくものであってよい。磁気ビーズは、好ましくは、可逆的磁気を有する磁気移送デバイスを用いる。非磁気ビーズは、静電気引力またはサイズおよび重力に基づく工学原理を用いる。
本明細書で使用される非磁気ビーズは、ｐＨ７で負に帯電しているＤＮＡなどの、それに結合した成分のため、静電的に帯電していてもよい。正に帯電した樹脂は、負に帯電したビーズと相互作用し、ビーズのピックアップに参画することができる結合親和性を有する。適宜、減圧源を、静電的に帯電したビーズおよび反対に帯電した樹脂と組み合わせて使用することができる。そのような組合せを、ロボット的に使用して、単一のビーズを捕捉した後、それを、単一のウェル中に放出させることができる。そのような実施形態では、ピペットのような捕捉エレメントを、単一のビーズを保持するのに十分に広い直径に形成することができる。ピペットを、帯電したビーズに対して反対に帯電した静電的多孔性樹脂と適合させる。減圧源は、ビーズ源からのビーズの回収を支援するために使用される。複数のビーズを、供給源から、単一のピペット中に抽出することができる。しかしながら、単一のビーズのみが、樹脂と接触する。回収後、部分的減圧まで、減圧をゆっくりと解放し、単一のビーズと樹脂との間の静電的相互作用は、そのビーズを保持するのに十分なものとなるが、ピペット中の残存するビーズは、ビーズ供給源中に後退し、単一のピペット中に単一のビーズを残す。このデバイスのロボット工学は、単一アレイ中の複数のセットのピペットを含んでもよく、次いで、デバイスのウェル上に配置することができる。残存する部分的減圧を除去すると、個々のビーズは、個々のウェルに落下する。
あるいは、単一のビーズを保持するように形成された複数のキャビティを有するディスペンサーは、それぞれのキャビティが、アッセイデバイス上の単一のウェルと整列し、アッセイデバイスに、ディスペンサーの上または下に留まらせるように設計される。ディスペンサー上のキャビティに、ビーズを充填し、アッセイデバイスをディスペンサー上に取り付け、それぞれのキャビティが単一のウェルに対応するように整列させる。ディスペンサーの壁およびアッセイデバイスは、ビーズがディスペンサーまたはアッセイデバイスの別の部分に移動することができないように、それぞれのキャビティとそれぞれのウェルとの間で閉じたチャンバーを形成する。アッセイデバイスがディスペンサーの下に置かれるアッセイデバイスの位置の逆転は、単一のビーズの単一のウェルへの移送をもたらす。
磁気ディスペンサーを、磁気ビーズと共に使用することができる。一実施形態では、磁気ディスペンサーは、弱い磁力または可逆的磁力を探すことができる。弱い磁力の場合、磁石は、ピペットに適合する。減圧源を磁石と組み合わせて、ビーズをピペット中に回収する。ピペットは複数のビーズを保持する可能性が高いが、そのうちの１個のみが磁石と接触する。減圧が低下するにつれて、減圧によってのみ保持されるこれらのビーズは、ビーズ源に放出されて戻り、単一のピペット中に単一のビーズのみを残す。ビーズをアッセイデバイスのウェル中に分配する時に、減圧を除去し、残存するビーズはそのウェル中に落下する。
以下の実施例は、複数のウェルを有するアッセイデバイスのそれぞれのウェルに単一のビーズを提供するためのデバイスまたはシステムのための例示的実施形態を提供する。ウェルあたり単一のビーズを有するアッセイデバイスを、本明細書に記載の任意のアッセイにおいて使用することができる。
［実施例１２］
単一のビーズを、単一のキャビティ（ディスペンサーの）および／または単一のウェル（アッセイデバイスの）中に分配する方法
例示的実施形態に従って細胞を撹乱し、撹乱に対する細胞の応答を捕捉するための方法が提供される。方法は、アッセイデバイスの少なくとも１つのウェルと整列するように構成された少なくとも１つのキャビティを有する移送デバイスを提供することから開始してもよい。アッセイデバイスおよび移送ディスペンサーを動かして、互いに適合または嵌合させることができる。アッセイデバイスおよび移送ディスペンサーを、前記アッセイデバイスと前記移送デバイスとの間に存在する間隙を伴って、または伴わずに、互いに適合または嵌合させることができる。方法は、移送ディスペンサーのキャビティと、アッセイデバイスのウェルとを整列させることを含んでもよい。方法は、アッセイデバイスと移送ディスペンサーとを、互いに適合または嵌合させて、格納空間を形成させることを含んでもよい。方法は、キャビティから前記格納空間まで単一のビーズを放出させることを含んでもよい。方法は、単一のビーズを前記ウェル中に投入することを含んでもよい。方法の任意の工程を繰り返してもよい。方法は、上で参照された順序内の任意の点で開始または終了してもよい。
［実施例１３］
コンピュータに実装された制御システム
図３８は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのプロセッサと、少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを保存するメモリとを含む、細胞を撹乱し、撹乱に対する細胞の応答を捕捉するためのコンピュータデバイスまたはシステムの概略図である。具体的には、図３８は、少なくとも１つのプロセッサ３８３０と、少なくとも１つのプロセッサ３８３０による実行のための少なくとも１つのプログラム３８５０を保存するメモリ３８４０とを含む、コンピュータデバイスまたはシステム３８００を描写する。一部の実施形態では、デバイスまたはコンピュータシステム３８００は、デバイスまたはコンピュータシステム３８００の少なくとも１つのプロセッサ３８３０による実行のための少なくとも１つのプログラム３８５０を保存する非一時的コンピュータ可読記憶媒体３８６０をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、デバイスまたはコンピュータシステム３８００は、外部デバイス（示されない）、少なくとも１つのプロセッサ３８３０、メモリ３８４０、非一時的コンピュータ可読記憶媒体３８６０、および少なくとも１つの出力デバイス３８７０のいずれか１つに対して、またはそれから情報を送信するまたは受信するように構成することができる、少なくとも１つの入力デバイス３８１０をさらに含んでもよい。少なくとも１つの入力デバイス３８１０を、アンテナ３８２０、トランシーバー（示されない）などの無線通信のための手段によって、外部デバイスに対して、またはそれから情報を無線的に送信または受信するように構成させることができる。一部の実施形態では、デバイスまたはコンピュータシステム３８００は、外部デバイス（示されない）、少なくとも１つの入力デバイス３８１０、少なくとも１つのプロセッサ３８３０、メモリ３８４０、および非一時的コンピュータ可読記憶媒体３８６０からなる群に由来するいずれか１つに対して、またはそれから情報を送信する、または受信するように構成させることができる、少なくとも１つの出力デバイス３８７０をさらに含んでもよい。少なくとも１つの出力デバイス３８７０を、アンテナ３８８０、トランシーバー（示されない）などの無線通信のための手段によって、外部デバイスに対して、またはそれから情報を無線的に送信または受信するように構成させることができる。
一部の例示的な実施形態では、コンピュータデバイスまたはシステム３８００は、本明細書に記載の１つまたは複数のエレメントを移動させるための１つまたは複数のロボット成分に命令を送信するように構成される。本発明は、ロボットアームもしくはハンドの支援により完全に自動的に実行するか、または手動とロボット手法との組合せにより実行することができる。
上で特定されたモジュールまたはプログラムはそれぞれ、上記の機能を実施するための命令のセットに対応する。これらのモジュールおよびプログラム（すなわち、命令のセット）は、別々のソフトウェアプログラム、手順またはモジュールとして実装される必要はなく、かくして、種々の実施形態では、これらのモジュールの種々のサブセットを組み合わせるか、またはそうでなければ、再配置することができる。一部の実施形態では、メモリは、モジュールのサブセットおよび上で特定されたデータ構造を保存することができる。さらに、メモリは、上に記載されていない追加のモジュールおよびデータ構造を保存することもできる。
本開示の例示された態様を、ある特定のタスクが、通信ネットワークを介して連結される遠隔プロセッシングデバイスによって実施される分散コンピューティング環境で実行することもできる。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールを、ローカルと遠隔との両方の記憶保存デバイス中に配置することができる。
さらに、本明細書に記載の種々の成分が、対象となる革新の実施形態を実行するための好適な値の成分および回路エレメントを含んでもよい電気回路を含んでもよいことが理解されるべきである。さらに、種々の成分の多くを、少なくとも１つの集積回路（ＩＣ）チップ上に実装することができることが理解され得る。例えば、一実施形態では、成分のセットを、単一のＩＣチップ中に実装することができる。他の実施形態では、少なくとも１つのそれぞれの成分を、別々のＩＣチップ上で製造するか、または実装する。
［実施例１４］
サブキャビティを有するキャビティ
図３９は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、およびキャビティ内の下位構造を有するディスペンサー３９０１の垂直断面図である。ディスペンサー３９０１は、ビーズサイズの範囲の大きい方の末端でのサイズ排除を容易にするように構成される。ディスペンサー３９０１は、比較的大きいビーズを排除するように構成される。具体的には、ディスペンサー３９０１は、メインキャビティおよびサブキャビティを含んでもよい。メインキャビティを、ディスペンサー３９０１の上面３９０５に埋め込むことができる。メインキャビティは、側壁３９１０を有してもよい。メインキャビティは、底床部３９１５を有してもよい。底床部３９１５は、その中に埋め込まれたサブキャビティを有してもよい。サブキャビティは、側壁３９２０によって規定され、サブキャビティ床部３９２５を有してもよい。サブキャビティは、単一ビーズ１０を受容するように構成することができる。ディスペンサー３９０１は直線的な端部と共に示されるが、端部は、曲がった端部または面取りされた端部などを含む任意の好適な構造を含んでもよい。
ディスペンサー３９０１のキャビティまたはサブキャビティを、ピコメートル規模の直径を有する開口を含む任意の好適なサイズで提供することができる。ディスペンサー３９０１を、ただ１つの正確に形成されたビーズ１０をそれぞれのサブキャビティ中にロードする（捕捉する）ことができるように構成することができる。ピコウェル中の捕捉されなかったビーズを、乱流によって洗い流すことができる。ディスペンサー３９０１を、示されるように使用することができる；またはディスペンサー３９０１を、ビーズをアッセイデバイスに移送させるためにひっくり返すことができる。
［実施例１５］
先細のキャビティ
図４０は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、先細の側壁、開いた上端、および開いた下端を有するディスペンサー４００１の垂直断面図である。ディスペンサー４００１は、円錐形のキャビティを含んでもよい。円錐形のキャビティを、ディスペンサー４００１の上面に主に入射する流体を用いた乱流によって、比較的大きいビーズを拒絶するように構成することができる。ディスペンサー４００１は、先細のキャビティを含んでもよい。先細のキャビティを、ディスペンサー４００１の上面４００５に埋め込むことができる。先細のキャビティは、側壁４０１０を有してもよい。先細のキャビティは、その底部に開口を有してもよい。開口を、ディスペンサー４００１の底面４０２５に埋め込むことができる。先細のキャビティを、先細のキャビティの下部分のより小さい形状と比較した、先細のキャビティの上部分の形状の差異の理由で単一のビーズ１０を受容するように構成することができる。ディスペンサー４００１は、直線的な端部または比較的鋭い角と共に示されるが、端部は、曲がった端部または面取りされた端部などを含む任意の好適な構造を含んでもよい。
ディスペンサー４００１の先細のキャビティは、円錐形を有してもよい。先細のキャビティを、ピコメートル規模の直径を有する開口を含む任意の好適なサイズで提供することができる。
ディスペンサー４００１を、ただ１つの正確に形成されたビーズを先細のキャビティにロードする（保持させる）ことができるように構成することができる。ディスペンサー４００１を、比較的小さいビーズがディスペンサー４００１の下面４０２５中の開口を通過することができるように構成することができる。比較的大きいビーズを洗い流すことができる。ディスペンサー４００１を、示されるように使用することができる；またはディスペンサー４００１を、ビーズをアッセイデバイスに移送させるためにひっくり返すことができる。
１つの例示的な実施形態では、下面４０２５中の開口を、その代わりに、ただ１つのビーズが１つの対応するキャビティに適合するという条件で、床部を含むように閉鎖してもよい。
関連する米国特許出願第１６／７７４，８７１号に記載されたように、例示的な実施形態に従って、必要に応じた間隙を除去することができる。具体的には、ディスペンサーをアッセイデバイスと統合または適合させて、ビーズを、アッセイデバイスのキャビティからウェルに送達することができる。ディスペンサーと、アッセイデバイスとのアラインメントを、必要に応じた固定機構を用いて容易にすることができる。適所に固定した場合、ディスペンサーおよびアッセイデバイスは、互いに対して同一平面上にある必要がない。間隙がビーズまたは他のアッセイ成分よりも小さい限り、必要に応じた間隙が存在してもよい。適合したディスペンサーおよびアッセイデバイスを、ディスペンサーからアッセイデバイスのウェル中へのビーズまたは他のアッセイ成分の送達のために逆転させることができる。
互いに対する移送ディスペンサーとアッセイデバイスの位置は、単一のアッセイ成分が単一のウェル中に入るようなビーズの分配を可能にする。具体的には、一実施形態では、それぞれのキャビティが、ビーズなどの単一のアッセイ成分のみを可逆的に保持／捕捉するように構成され、さらに、ディスペンサーが、適合した場合、前記ディスペンサー中のそれぞれのキャビティが前記アッセイデバイス中の単一のウェルと整列するように、複数のウェルを含むアッセイデバイスと適合または嵌合するように構成される、複数のキャビティを含むディスペンサーが提供される。放出時に、アッセイ成分は、単一のアッセイ成分が単一のウェル中に投入されるように、ディスペンサーからアッセイデバイス中に移動する。
また、キャビティおよびウェルのアラインメントは、単一のビーズが単一のウェルに投入されることを確保する。
［実施例１６］
磁石を含むキャビティ
図４１は、例示的な実施形態による、少なくとも１つのキャビティ、およびそれぞれのキャビティの底に配置された磁石を有するディスペンサー４１０１の垂直断面図である。磁石に直接入射するビーズ上の磁力が、ビーズを保持し、ディスペンサー４１０１の上面に主に入射する流体の乱流に抵抗するのに十分なものとなるように、ディスペンサー４１０１を構成することができる。また、磁石に直接入射するビーズの上の、またはそれに隣接する第２のビーズ上の磁力が、第２のビーズを保持するには不十分なものであり、かくして、ディスペンサー４１０１の上面に主に入射する流体の乱流を用いた第２のビーズの除去を促進するように、ディスペンサー４１０１を構成することができる。
ディスペンサー４１０１は、メインキャビティを含んでもよい。メインキャビティを、ディスペンサー４１０１の上面４１０５に埋め込むことができる。メインキャビティは、側壁４１１０を有してもよい。メインキャビティは、底床部４１１５を有してもよい。底床部４１１５は、磁石または磁気表面４１２０を含んでもよい。磁石または磁気表面４１２０を、単一ビーズ１０との磁気結合を形成するように構成してもよい。ディスペンサー４１０１は直線的な端部と共に示されるが、端部は、曲がった端部または面取りされた端部などを含む任意の好適な構造を含んでもよい。
一部の例示的な実施形態では、磁石または磁気表面４１２０は、平面であってもよい。その一方、他の例示的な実施形態では、磁石または磁気表面４１２０は凹面（図４１に示される）であってもよく、有利には、表面４１２０と単一ビーズ１０との間の接触のための表面積を増大させる。
ディスペンサー４１０１は、それぞれのキャビティの底部に比較的小さく、比較的弱い磁石を有するキャビティを含んでもよい。キャビティを、ピコメートル規模の直径を有する開口を含む任意の好適なサイズで提供することができる。ビーズ１０はそれぞれ、磁気ビーズであってもよい。ディスペンサー４１０１を、ただ１個のビーズがキャビティ中の磁石４１２０によってロードされ得る（保持され得る）ように構成することができる。磁石４１２０によって保持されない、または比較的小さい磁力を受けるビーズを洗い流すことができる。ディスペンサー４１０１を、示されるように使用することができる；またはディスペンサー４１０１を、ビーズをアッセイデバイスに移送させるためにひっくり返すことができる。ひっくり返した状態で、ビーズを取り外すのに重力のみでは不十分である場合、比較的穏やかな振動または他の穏やかな機械力をディスペンサー４１０１に与えて、ディスペンサー４１０１からビーズ１０を取り外すことができる。
［実施例１７］
メッシュインサートを有するピペット
図４２は、例示的な実施形態による、ディスペンサー４２８０、および必要に応じたメッシュインサート４２５５を有するピペット４２２０を含むシステム４２００の垂直断面図である。ピペット４２２０は、ピペット４２２０の末端４２５０にバルブまたはポンプ機構を連結してもよい導管を含んでもよい。導管は、反対の末端に２つの開口を有してもよい。末端での形状は、実質的な環状を含む任意の好適な形状であってもよい。導管は、圧力低下ポンプの密閉経路を末端４２５０に提供するための一連の管およびコネクターを含んでもよい。導管の直径は、試験下で最も大きいビーズ４２９０の直径よりも広くでもよい。導管および／または末端４２５０は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、透明プラスチック、Ｔｙｇｏｎ、プレキシガラスなどから作られていてもよい。導管および／または末端４２５０は、剛性、半剛性、または可撓性であってもよい。
導管を、単一ビーズを移転させるために構成することができる。導管を、任意の型のデバイスにおいて使用することができる。種々の例示的な実施形態では、導管は、ディスペンサーのキャビティ中にビーズを入れるため；および／またはアッセイデバイスのウェル中にビーズを入れるため；および／またはディスペンサーのキャビティからビーズを取り出すため；および／またはアッセイデバイスのウェルからビーズを取り出すために構成することができる。
一部の例示的な実施形態では、導管および／または末端４２５０を、ポリマーから形成させることができる。ポリマーは、曲げまたは座屈に抵抗するには十分に剛性であるが、マイクロウェルプレートを含む、基質との接触時に屈曲し、基質の破壊を回避するには十分に可撓性である、ポリイミドであってもよい。導管および／または末端４２５０がポリイミドから形成され、比較的薄い壁の厚さ、すなわち、約８μｍ規模の厚さを有する場合、材料は比較的個割れやすいものであってもよい。そのため、ポリイミド導管および／または末端４２５０を、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などの保護材料と結合してもよい。例えば、ポリイミド導管および／または末端４２５０が約４５．０ｃｍを超える長さを有する場合、ポリイミド導管および／または末端４２５０を、ＰＴＦＥなどの保護材料で保護することができる。
例示的な実施形態では、可撓性先端部（ｔｉｐ）を有する導管および／または末端４２５０の提供により、操作者は、例えば、ウェルの壁にくっついているビーズを拾い上げることができる。可撓性先端部により、操作者は、ウェルの半径を通じて導管および／または末端４２５０を回転させることができる。可撓性先端部は、可撓性先端部により、操作者がプロテアーゼなどの酵素の使用を必要とすることなくビーズを拾い上げることができる点で、非常に寛大であり得る。可撓性先端部を、ウェルの表面と安定に整合するように構成することができる。一部の使用では、操作者は、可撓性先端部を壁に向かって押して、ウェルの壁にくっついているビーズを抽出することができる。開発された技術の比較的剛性かつ壊れやすいガラスピペットは、そのような機能を有しない。
単一の層、類似する材料の複数の層または類似しない材料の複数の層として含む任意の好適な構成でポリイミドを提供することができる。
可撓性先端部は、可撓性先端部内に保持されたビーズを入れることができる。可撓性先端部は、別のデバイスによって保持されたビーズを取り出す、または抽出することができる。
一部の例示的な実施形態では、導管および／または末端４２５０の厚さは、約８～４５０μｍの規模であってもよい。一部の例示的な実施形態では、導管および／または末端４２５０は、補強を含んでもよい。一部の例示的な実施形態では、導管および／または末端４２５０は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、例えば、ＴＥＦＬＯＮなどのコーティングを有してもよいが、そのようなコーティングは必要ではなく、導管および／または末端４２５０の内腔の可視化を可能にし、検証を容易にする、所望の半透明性を維持するために省略してもよい。
ディスペンサー４２８０は、複数のキャビティ４２８５ａ、４２８５ｂ、４２８５ｃ．．．４２８５ｎを含んでもよい。
ピペット４２２０内の内部空間は、メッシュ層４２５５を含んでもよい。メッシュ層４２５５は、メッシュフィルターであってもよい。別の例では、層４２５５は、末端４２５０の第１の内壁から、末端４２５０の第２の内壁までの単なるバーであってもよい。
メッシュ層４２５５は、ピペット４２２０の内部空間に延伸したメッシュスクリーンであってもよい。メッシュスクリーンは、小さい繊維、プラスチックロッド、金属線などで作られていてもよい。層４２５５は、ピペット４２２０の内部空間をわたって延在するプレートであってもよい。プレートは、過剰の液体を通過させることができる、少なくとも１つの開口部を含有してもよい。
ビーズを、ピペット４２５０に接続された減圧によってピペット４２２０を用いて拾うことができる。メッシュインサート４２５５は、ビーズがピペット４２２０の先端部の内側に保持されることを確実にしてもよい。すなわち、ビーズを持ち上げる減圧と共に、メッシュインサート４２５５は、ピペット４２２０内の開口内の滞在場所として機能することができる。ビーズを移送させるために、ピペット４２２０の先端部を、アッセイデバイスの上部に置くことができる。ビーズを放出させるために、当業者であれば、減圧力を開放するか、または陽圧を加えて、ビーズをアッセイデバイス中に移動させることができる。
使用において、ピペット４２２０は、１個より多いビーズに遭遇してもよい。ピペット４２２０の構成は、単一ビーズ１０がメッシュインサート４２５５によって保持されるようなものである。単一ビーズ１０に入射する静電気力により、ピペット４２２０は減圧があってもなくても単一ビーズ１０を保持することができる。磁力、減圧力または重力の組合せを使用して、ピペット４２２０内のビーズ１０を制御することができる。
一部の実施形態では、メッシュインサート４２５５は、可逆性磁気材料を含んでもよく、空気が材料を通って流動することができる。
［実施例１８］
仮想ウェル
物理的なウェルまたはキャビティの代わりに、仮想ウェルを準備してもよい。具体的には、例えば、平面で開始して、この平面上に、水および／または試験溶液の液滴を添加し得る。１つまたは複数のビーズを含む水または試験溶液は、ビーズを含まない水または試験溶液と比べて相対的に重いだろう。乱流を利用して、比較的軽い（ビーズを含まない）水または溶液を平面から除去し、そのため、比較的重い（ビーズを含む）水または溶液が平面上に保持される。単位体積当たりの、水または試験溶液中に配置された適切なサイズおよび質量の単一のビーズの重量は既知であることから、この重量をモニタリングし得る。このプロセスを、この平面が各仮想ウェル上に位置する単一ビーズを有するまで、所望に応じて実施し得、検証し得、および反復させ得る。
本発明は、本開示の組成物、試薬、方法、システム、診断、実験室データ等により限定されるべきではない。同様に、本発明は、本明細書で開示されている任意の好ましい実施形態により限定されるべきではない。
本明細書で説明されている主題は、所望の構成に応じて、システム、装置、方法、および／または物品で具現化され得る。上述の説明で示されている実施形態は、本明細書で説明されている主題と一致する全ての実施形態を示すものではない。代わりに、この実施形態は、説明されている主題に関する態様と一致するいくつかの例にすぎない。いくつかの変形形態が上記で詳細に説明されているが、他の改変または追加も可能である。具体的には、本明細書で示されているものに加えて、さらなる特徴および／または変形形態が提供され得る。例えば、上記で説明されている実施形態は、開示されている特徴の様々な組合せおよび部分的組合せ、ならびに／または上記で開示されているいくつかのさらなる特徴の組合せおよび部分的組合せを対象にし得る。加えて、添付の図面で示されているおよび／または本明細書で説明されている論理フローは、望ましい結果を達成するために、示された特定の順序または連続した順序を必ずしも必要とするものではない。他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内であり得る。
具体的には、および上記で説明されているコンポーネント、デバイス、回路、システム等により実施される様々な機能に関して、そのようなコンポーネントを説明するために使用される用語は、別途示さない限り、特許請求されている主題の本明細書で示されている例示的な態様で機能を実施する、（開示されている構造に構造的に等価でなくても）説明されているコンポーネント（例えば機能的等価物）の特定の機能を実施する任意のコンポーネントに対応するように意図されている。これに関して、本技術革新は、特許請求されている主題の様々な方法の作用および／または事象を実施するためのコンピュータにより実行可能な指令を有するシステムおよびコンピュータにより可読な記憶媒体を含むことも認識されるだろう。
上述したシステム／回路／モジュールは、いくつかのコンポーネント／ブロック間の相互作用に関して説明されている。そのようなシステム／回路およびコンポーネント／ブロックは、上述の様々な順列および組合せに従って、これらのコンポーネントもしくは指定のサブコンポーネント、指定のコンポーネントもしくはサブコンポーネントの一部、および／または追加のコンポーネントを含み得ることが認識され得る。サブコンポーネントはまた、親コンポーネントに含まれるよりも他のコンポーネントと通信可能に連結されたコンポーネントとしても実装され得る（階層型）。加えて、少なくとも１つのコンポーネントは、集約機能を提供する単一のコンポーネントへと組み合わされてもよいし、いくつかの別個のサブコンポーネントへと分割されてもよく、統合機能を提供するために、そのようなサブコンポーネントに、管理層等の任意の少なくとも１つの中間層が通信可能に連結され得ることに留意すべきである。本明細書で説明されている任意のコンポーネントも、本明細書で具体的に説明されていないが当業者に既知の少なくとも１つの他のコンポーネントと相互作用し得る。
加えて、本主題の技術革新の特定の特徴は、いくつかの実装の内の少なくとも１つに関して開示されている場合があるが、任意の所与のまたは特定の用途に対して所望され得、かつ有利であり得るように、そのような特徴は、他の実装の少なくとも１つの他の特徴と組み合わされ得る。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」という用語、これらの異形、ならびに他の同様の単語が、詳細な説明または特許請求の範囲のいずれかで使用されている限りにおいて、これらの用語は、任意の追加の要素または他の要素を除外することなく、オープン移行語（ｏｐｅｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｏｒｄ）として「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の方法で包含することが意図されている。
本明細書で使用される場合、「コンポーネント」、「モジュール」、「システム」等という用語は、一般的に、コンピュータ関連の実体、ハードウェア（例えば回路）、ハードウェアおよびソフトウェアの組合せ、ソフトウェア、または少なくとも１つの特定の機能を有する稼働中の機械に関する実体のいずれかを指すことが意図されている。例えば、コンポーネントは、プロセッサ（例えばデジタルシグナルプロセッサ）上で動作するプロセス、プロセッサ、オブジェクト、実行可能ファイル、実行スレッド、プログラム、および／またはコンピュータであり得るが、これらに限定されない。例として、コントローラ上で動作するアプリケーションと、コントローラとの両方が、コンポーネントであり得る。少なくとも１つのコンポーネントが、実行のプロセスおよび／またはスレッド内に存在し得、コンポーネントが、１つのコンピュータに局在化され得、および／または２つ以上のコンピュータ間で分散され得る。さらに、「デバイス」は、特別に設計されたハードウェア；このハードウェアが特定の機能を実施することを可能にするソフトウェアの実行により特殊化された汎用ハードウェア；コンピュータ可読媒体に記憶されたソフトウェア；またはこれらの組合せの形態で提供され得る。
さらに、「例」または「例示」という単語は、本明細書では、例、実例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）、または実例（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）としての役割を果たすことを意味するために使用される。「例示的」と本明細書で説明されている任意の態様または設計は、必ずしも他の態様または設計よりも好ましいかまたは有利であると解釈されるものではない。むしろ、「例」または「例示的」という単語の使用は、具体的な方法で概念を提示することが意図されている。本明細書で使用される場合、「または」という用語は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を意味することが意図されている。即ち、別途指定されない限り、または文脈から明らかでない限り、「ＸはＡまたはＢを用いる」は、自然な包括的順列の内のいずれかを意味することが意図されている。即ち、ＸがＡを用いる場合；ＸがＢを用いる場合；またはＸがＡおよびＢの両方を用いる場合には、上述のいずれの場合でも「ＸはＡまたはＢを用いる」が満たされる。加えて、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、本出願および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途指定されない限り、または単数形を示すことが文脈から明らかでない限り、「１つまたは複数」を意味すると一般に解釈されるべきである。
コンピューティングデバイスは、典型的には、コンピュータ可読記憶媒体および／または通信媒体を含み得る様々な媒体を含み、これら２種の用語は、本明細書では下記のように互いに別に使用される。コンピュータがアクセスし得る任意の利用可能な記憶媒体であり得るコンピュータ可読記憶媒体は、典型的には、非一過性の性質のものであり、揮発性媒体および不揮発性媒体、取り出し可能な媒体および非取り出し可能な媒体の両方を含み得る。限定ではなく例として、コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読命令、プログラムモジュール、構造化データ、または非構造化データ等の情報を記憶するための任意の方法または技術に関連して実装され得る。コンピュータ可読記憶媒体として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶装置、または所望の情報を記憶するために使用され得る他の有形および／もしくは非有形媒体。コンピュータ可読記憶媒体には、媒体により記憶された情報に関する様々な操作のために、例えば、アクセス要求、クエリ、または他のデータ検索プロトコルにより、少なくとも１つのローカルまたはリモートのコンピューティングデバイスがアクセスし得る。
一方、通信媒体は、典型的には、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または他の構造化データもしくは非構造化データを、変調されたデータシグナル（例えば、搬送波または他の輸送機構）等の一過性であり得るデータシグナルで具現化し、任意の情報送達または輸送媒体を含む。「変調されたデータシグナル」という用語は、少なくとも１つのシグナルの情報をコードするような方法で設定されたかまたは変更された特製の内の少なくとも１つを有するシグナルを指す。限定ではなく例として、通信媒体として、有線媒体（例えば、有線ネットワークまたは直接有線接続）、ならびに無線媒体（例えば、音響、ＲＦ、赤外線、および他の無線媒体）が挙げられる。
上記で説明されている例示的なシステムを考慮して、説明されている主題に従って実装され得る方法論は、様々な図のフローチャートを参照してより認識されるであろう。説明の単純化のために、この方法論は、一連の行為として描かれており、かつ説明されている。しかしながら、本開示に従う行為は、様々な順序でおよび／または同時に、かつ本明細書で提示されておらず説明もされていない他の行為と共に行なわれ得る。さらに、本開示の主題に従ってこの方法論を実装するために、図示された全ての行為が必要とならない場合がある。加えて、当業者は、この方法論が、代替的に、状態図または事象を介して一連の相互に関連する状態として表現される可能性があることを理解して認識するだろう。加えて、本明細書で開示されている方法論は、コンピューティングデバイスへのそのような方法論の移送および転送を容易にするために、製品に格納可能であることを認識すべきである。製品という用語は、本明細書で使用される場合、任意のコンピュータ可読デバイスまたは記憶媒体からアクセス可能なコンピュータプログラムを包含することが意図されている。
本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示を限定することは意図されていない。本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、別途文脈が明確に示さない限り、複数形も含むことが意図されている。「含む」および／または「含んでいる」という用語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を規定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはこれらの群の存在または追加を除外しないことがさらに理解されるだろう。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の内の１つまたは複数のありとあらゆる組合せを含む。
少なくとも１つの例示的な実施形態は、例示的なプロセスを実施するために複数のユニットを使用すると説明されているが、この例示的なプロセスはまた、１つまたは複数のモジュールによっても実施され得ることが理解される。
本明細書での「第１」、「第２」、「第３」等の用語の使用は、任意の順序を説明することなく、様々な構造、次元、または操作を特定するために提供されており、この構造、次元、または操作は、文脈中で特定の順序が明確に指定されない限り、述べられている順序とは異なる順序で実行され得る。
近似語（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ ｌａｎｇｕａｇｅ）は、本明細書および特許請求の範囲全体にわたり使用される場合、関連する基本機能に変化をもたらすことなく、許容範囲で変化し得る任意の量的表現を修飾するために適用され得る。従って、「約」および「実質的」等の用語で修飾された値は、明記された厳密な値に限定されるものではない。少なくともいくつかの場合には、近似語は、値を測定するための機器の精度に対応し得る。ここで、ならびに本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、範囲の限定は組み合わされ得、および／または置き換えられ得、そのような範囲は、別途文脈または文言が示さない限り、特定され、かつそのような範囲に含まれる全ての部分範囲を含む。
明記されていない限り、または文脈から明白でない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内と理解されており、例えば、平均の２標準偏差内と理解される。「約」は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％内と理解され得る。別途文脈から明らかでない限り、本明細書に記載されている全ての数値は、「約」という用語で修飾されている。
上記の説明および特許請求の範囲では、「の内の少なくとも１つ」または「の内の１つまたは複数」等の語句には、その後に要素または特徴の連続的リストが後続する場合がある。「および／または」という用語はまた、２つ以上の要素または特徴のリストで現れる場合がある。別途それが使用されている文脈により黙示的にまたは明示的に矛盾しない限り、そのような語句は、列挙された要素もしくは特徴の内のいずれかを個別に意味することが意図されているか、または他の列挙された要素もしくは特徴の内のいずれかと組み合わされた、列挙された要素もしくは特徴の内のいずれかを意味することが意図されている。例えば、「ＡおよびＢの内の少なくとも１つ」；「ＡおよびＢの内の１つまたは複数」；および「Ａおよび／またはＢ」という語句はそれぞれ、「Ａのみ、Ｂのみ、またはＡおよびＢの両方」を意味することが意図されている。３つ以上の項目を含むリストに関しても同様の解釈が意図されている。例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣの内の少なくとも１つ」；「Ａ、Ｂ、およびＣの内の１つまたは複数」；および「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」という語句はそれぞれ、「Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢの両方、ＡおよびＣの両方、ＢおよびＣの両方、またはＡおよびＢおよびＣの組合せ」を意味することが意図されている。加えて、上記および特許請求の範囲における「に基づく」という用語の使用は、列挙されていない特徴または要素も許容されるように「に少なくとも部分的に基づく」ことを意味することが意図されている。

Claims (32)

  1. 細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするシステムであって、前記システムが、
    それぞれのウェルが他のウェルから分離された、５０，０００を超える複数のウェルを含むアッセイデバイス、および
    複数のビーズであって、単一のビーズが単一のウェルの中への配置に適しており、それぞれのビーズが切断性リンカーによって共有結合で前記ビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、その結果、前記化合物がアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式で前記ビーズから放出可能である、複数のビーズ
    を含み、
    前記ビーズが、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによって前記ビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み、前記ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによって前記ビーズに連結されている場合には、前記切断性リンカーは前記ビーズ結合化合物を前記ビーズに連結するために用いられる前記切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、前記化合物が前記ＤＮＡバーコードによって特定される、システム。
  2. 単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送デバイスをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
  3. 前記移送デバイスがロボットによって、または人手によって、またはロボットと人手のプロセスの組合せによって操作される、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記移送デバイスが、単一のビーズを単一のウェルの中に投入するために、磁気的引力、静電的引力、または大きさおよび重力に基づく工学原理を採用する、請求項２に記載のシステム。
  5. 前記移送デバイスが、前記単一のビーズを伝送することができる少なくとも１つのピペットをさらに含み、前記少なくとも１つのピペットが可撓性先端部を含む、請求項２に記載のシステム。
  6. 前記ピペットの前記可撓性先端部がポリイミドを含む、請求項５に記載のシステム。
  7. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の２０％以下に沿って延在している、請求項５に記載のシステム。
  8. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の１０％以下に沿って延在している、請求項５に記載のシステム。
  9. 化合物によって誘起された細胞におけるトランスクリプトームの変化を特定する方法であって、前記化合物がコンビナトリアルライブラリーのアッセイの中に含まれ、前記方法が、
    ａ）アッセイアレイを生成することであって、前記アッセイアレイが、
    ｉ）複数のウェルであって、それぞれのウェルが他のウェルから分離されており、それぞれのウェルが少なくとも１つの目的の細胞を含み、アッセイアレイが５０，０００を超えるウェルを含む、複数のウェル、ならびに
    ｉｉ）複数のビーズであって、それぞれのビーズが前記コンビナトリアルライブラリー由来の特有の化合物を含み、前記ライブラリー中のそれぞれの化合物が潜在的薬物候補として選択されるように、それぞれのビーズが複数の同じビーズ結合化合物を含み、それぞれのビーズが、前記特有の化合物の構造または前記特有の化合物を作製するために用いる合成工程をコードするオリゴヌクレオチド部分、およびＲＮＡ捕捉エレメントを含む複数の機能化オリゴヌクレオチドを含む、複数のビーズ
    を含み、単一のビーズが単一のウェルの中に配置されている、こと、
    ｂ）前記細胞をそれぞれの限定された体積の中で、前記ビーズから前記限定された体積の中に放出された前記化合物と接触させ、前記接触に応答して前記細胞によって発現されたＲＮＡにおけるトランスクリプトームの変化を生じるために十分な時間、前記接触を維持すること、
    ｃ）前記細胞を溶解し、ＲＮＡを前記ビーズ上の前記ＲＮＡ捕捉エレメントと接触させることによって、それぞれのウェルの中の前記細胞から前記ＲＮＡを捕捉すること、
    ｄ）前記複数のビーズの少なくとも一部からの前記捕捉されたＲＮＡを特定し、前記捕捉されたＲＮＡにおいてトランスクリプトームの変化があればこれを評価すること、ならびに
    ｅ）前記トランスクリプトームの変化を生じた前記化合物の構造を特定すること
    を含む、方法。
  10. 前記ビーズが、単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送デバイスを用いて前記アッセイアレイの前記ウェルに添加される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記移送デバイスがロボットによって、または人手によって、またはロボットと人手のプロセスの組合せによって操作される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記移送デバイスが、単一のビーズを単一のウェルの中に投入するために、磁気的引力、静電的引力、または大きさおよび重力に基づく工学原理を採用する、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記移送デバイスが、前記単一のビーズを伝送することができる少なくとも１つのピペットをさらに含み、前記少なくとも１つのピペットが可撓性先端部を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ピペットの前記可撓性先端部がポリイミドを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の２０％以下に沿って延在している、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の１０％以下に沿って延在している、請求項１３に記載の方法。
  17. 細胞または細胞の成分の生物活性をモジュレートする能力について化合物をスクリーニングするシステムであって、前記システムが、
    それぞれのウェルが他のウェルから分離された複数のウェルを含むアッセイデバイス、および
    複数のビーズであって、単一のビーズが単一のウェルの中への配置に適しており、それぞれのビーズが切断性リンカーによって共有結合で前記ビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合化合物を含み、その結果、前記化合物がアッセイの一部として測定可能な用量依存的様式で前記ビーズから放出可能である、複数のビーズ
    を含み、
    前記ビーズが、（ｉ）切断性リンカーによってまたは（ｉｉ）非切断性リンカーによって前記ビーズに連結された実質的に同一の複数のビーズ結合ＤＮＡバーコードをさらに含み、前記ＤＮＡバーコードが切断性リンカーによって前記ビーズに連結されている場合には、前記切断性リンカーは前記ビーズ結合化合物を前記ビーズに連結するために用いられる前記切断性リンカーに対してオルソゴナルであり、前記化合物が前記ＤＮＡバーコードによって特定され、それぞれのビーズが少なくとも約１０，０００個の実質的に同一のＤＮＡバーコードを含む、システム。
  18. 単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送デバイスをさらに含む、請求項１７に記載のシステム。
  19. 前記移送デバイスがロボットによって、または人手によって、またはロボットと人手のプロセスの組合せによって操作される、請求項１７に記載のシステム。
  20. 前記移送デバイスが、単一のビーズを単一のウェルの中に投入するために、磁気的引力、静電的引力、または大きさおよび重力に基づく工学原理を採用する、請求項１８に記載のシステム。
  21. 前記移送デバイスが、前記単一のビーズを伝送することができる少なくとも１つのピペットをさらに含み、前記少なくとも１つのピペットが可撓性先端部を含む、請求項１８に記載のシステム。
  22. 前記ピペットの前記可撓性先端部がポリイミドを含む、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の２０％以下に沿って延在している、請求項２１に記載のシステム。
  24. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の１０％以下に沿って延在している、請求項２１に記載のシステム。
  25. 化合物によって誘起された細胞におけるトランスクリプトームの変化を特定する方法であって、前記化合物がコンビナトリアルライブラリーのアッセイの中に含まれ、前記方法が、
    ａ）アッセイアレイを生成することであって、前記アッセイアレイが、
    ｉ）複数のウェルであって、それぞれのウェルが他のウェルから分離されており、それぞれのウェルが少なくとも１つの目的の細胞を含む、複数のウェル、ならびに
    ｉｉ）複数のビーズであって、それぞれのビーズが前記コンビナトリアルライブラリー由来の特有の化合物を含み、前記ライブラリー中のそれぞれの化合物が潜在的薬物候補として選択されるように、それぞれのビーズが複数の同じビーズ結合化合物を含み、それぞれのビーズが、前記特有の化合物の構造または前記特有の化合物を作製するために用いる合成工程をコードするＤＮＡバーコード、およびＲＮＡ捕捉エレメントを含む複数の機能化オリゴヌクレオチドを含む、複数のビーズ
    を含み、単一のビーズが単一のウェルの中に配置され、前記化合物が前記ＤＮＡバーコードによって特定され、それぞれのビーズが少なくとも約１０，０００個の実質的に同一のＤＮＡバーコードを含む、こと、
    ｂ）前記細胞をそれぞれの限定された体積の中で、前記ビーズから前記限定された体積の中に放出された前記化合物と接触させ、前記接触に応答して前記細胞によって発現されたＲＮＡにおけるトランスクリプトームの変化を生じるために十分な時間、前記接触を維持すること、
    ｃ）前記細胞を溶解し、ＲＮＡを前記ビーズ上の前記ＲＮＡ捕捉エレメントと接触させることによって、それぞれのウェルの中の前記細胞から前記ＲＮＡを捕捉すること、
    ｄ）前記複数のビーズの少なくとも一部からの前記捕捉されたＲＮＡを特定し、前記捕捉されたＲＮＡにおいてトランスクリプトームの変化があればこれを評価すること、ならびに
    ｅ）前記トランスクリプトームの変化を生じた前記化合物の構造を特定すること
    を含む、方法。
  26. 前記ビーズが、単一のビーズを単一のウェルの中に分配することができる移送デバイスを用いて前記アッセイアレイの前記ウェルに添加される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記移送デバイスがロボットによって、または人手によって、またはロボットと人手のプロセスの組合せによって操作される、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記移送デバイスが、単一のビーズを単一のウェルの中に投入するために、磁気的引力、静電的引力、または大きさおよび重力に基づく工学原理を採用する、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記移送デバイスが、前記単一のビーズを伝送することができる少なくとも１つのピペットをさらに含み、前記少なくとも１つのピペットが可撓性先端部を含む、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記ピペットの前記可撓性先端部がポリイミドを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の２０％以下に沿って延在している、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記可撓性先端部が前記ピペットの全長の１０％以下に沿って延在している、請求項２８に記載の方法。
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