ES2296422B1

ES2296422B1 - Procedimiento y medios para la determinacion del marcador biologico mal2 y su uso para el diagnostico de tumores humanos.

Info

Publication number: ES2296422B1
Application number: ES200301505A
Authority: ES
Inventors: Miguel Angel Alonso Lebrero; Monica Marazuela Azpiroz
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2009-03-16
Anticipated expiration: 2023-06-27
Also published as: ES2296422A1

Abstract

Procedimiento y medios para la determinación del marcador biológico MAL2 y su uso para el diagnóstico de tumores humanos. La presente invención describe un procedimiento para determinar la diferente expresión del marcador biológico MAL2 asociado enfermedades o tumores humanos. Otro objeto adicional lo constituye un medio que permita la puesta a punto de la determinación de la expresión de dicho marcador biológico asociado a estos tumores humanos, por ejemplo un microarray de DNA o proteína que permita la determinación de MAL2 o una composición biológica que contenga el anticuerpo monoclonal anti-MAL2 9D1 específico de MAL2. Finalmente, otro objeto lo constituye el uso del procedimiento y los medios anteriormente mencionados en procedimientos para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de tumores que tienen su origen en células epiteliales, como por ejemplo tumores de riñón, tiroides, próstata, ovario, mama, pulmón, colon, vejiga, etc, así como en mastocitos, neuronas y células dendríticas foliculares.

Description

Procedimiento y medios para la determinación del marcador biológico MAL2 y su uso para el diagnóstico de tumores humanos.

Sector de la técnica

La invención presente trata de la utilización de la proteína MAL2 como un nuevo marcador y diana molecular en tumores epiteliales y otras patologías humanas. El sector primario dónde se encuadraría la invención seria el sector farmacéutico/biodiagnóstico y el sector dónde se aplicaría la invención seria el sector clínico/sanitario.

Estado de la técnica

El análisis inmunohistoquímico de la expresión de marcadores específicos es uno de los métodos más utilizados para caracterizar el estadio de las neoplasias y contribuye a establecer las pautas a seguir para su tratamiento (Rosai, J., Ackerman, S. (1996). Surgical Pathology. Mosby Inc., St. Louis, Mo.). Por lo tanto, la identificación de nuevos marcadores que permitan definir mejor la progresión tumoral puede proporcionar herramientas sumamente útiles para establecer diagnósticos y pronósticos.

Las células epiteliales son las células blanco de una gran diversidad de procesos tumorales (carcinomas y adenomas). Una característica de muchos epitelios es su capacidad de polarizarse, esto es de diferenciar regiones especializadas en su membrana plasmática, denominadas superficie apical y basolateral, que desempeñan funciones específicas relacionadas con la función del tejido en cuestión. La superficie apical está en contacto con el exterior del organismo (que equivale al lumen en el caso de las glándulas) mientras que la basolateral está asociada a las células adyacentes y a la matriz extracelular. La adquisición de la polaridad conlleva la existencia de mecanismos que aseguren el transporte específico de las proteínas de membrana a una u otra superficie y que son regulados por una maquinaria de transporte especializada. El transporte de proteínas a la superficie apical se realiza por dos mecanismos diferentes. Por un lado, muchas proteínas de nueva síntesis son enviadas a la superficie apical siguiendo la llamada ruta directa que implica el transporte de la proteína directamente a la superficie apical después de su paso por el aparato de Golgi. Otra ruta, denominada indirecta, implica el transporte de la proteína primero a la superficie basolateral para luego ser internada y transportada a través del interior de la célula, mediante un mecanismo denominado transcitosis, hasta la membrana apical. El mayor o menor uso de la ruta directa o indirecta es dependiente depende de la proteína que es transportada y del tipo concreto de epitelio. Así, los hepatocitos utilizan casi de forma exclusiva la ruta indirecta mientras que la línea celular MDCK de células epiteliales de riñón utiliza preferentemente la ruta
directa.

MAL es una proteína integral de membrana de aproximadamente 17 kilodaltons, con varios segmentos hidrofóbicos y con algunas regiones hidrofílicas (Alonso, M.A., and Weissman, S.M. (1987). cDNA cloning and sequence of MAL, a hydrophobic protein associated with human T-cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1997-2001). La proteína MAL puede purificarse asociada a una fracción de membranas celulares que presenta un contenido elevado en glicolípidos y colesterol. Dicha fracción consiste en una mezcla compleja de membranas lipídicas que tienen la característica común de ser insolubles en detergentes no fónicos (tales como el Tritón X-100) a 4°C (Brown, D.A., and London, E. (2000). Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275, 17221-17224). En la célula intacta, se piensa que estas membranas forman microdominios denominados también balsas lipídicas (en inglés, "lipid rafts") que se distribuyen en la superficie o en el interior celular (Simons, K., and Ikonen, E. (1997). Functional rafts in cell membranes. Nature 387, 569-572; Brown, D.A., and London, E. (2000). Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol. Chem. 275, 17221-17224). Una serie de trabajos utilizando oligonucleótidos antisentido para reducir los niveles de la proteína MAL realizados en líneas celulares polarizadas de carácter epitelial utilizadas como modelo pusieron de manifiesto que la proteína MAL es un componente esencial de la maquinaria proteica implicada la ruta directa de transporte a la superficie apical (Puertollano, R., Martín-Belmonte, F., Millán, J., de Marco, M.C., Albar, J.P., Kremer, L., and Alonso, M.A. (1999). The MAL proteolipid is necessary for normal apical transport and accurate sorting of the influenza virus hemagglutinin in Madin-Darby canine kidney cells. J. Cell Biol. 145, 141-145; Cheong, K.H., Zacchetti, D., Schneeberger, E.E., and Simons, K. (1999). VIP17/MAL, a lipid raft-associated protein, is involved in apical transport in MDCK cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6241-6248; Martín-Belmonte, F., Puertollano, R., Millán, J., and Alonso, M.A. (2000). The MAL proteolipid is necessary for the overall apical delivery of membrane proteins in the polarized epithelial Madin-Darby canine kidney and Fischer rat thyroid cell lines. Mol. Biol. Cell 11, 2033-2045; Martín-Belmonte, F., Arvan, P., and Alonso, M.A. (2001). MAL mediates apical transport of secretory proteins in polarized epithelial Madin-Darby canine kidney cells. J. Biol. Chem. 276, 49337-49342).

Parte de la secuencia del ADN complementario (ADNc) humano del gen MAL2 fue identificada inicialmente durante el desarrollo de los proyectos internacionales encaminados a obtener la secuencia del repertorio completo de ADNc humanos. Posteriormente, utilizando la técnica del doble híbrido en levadura, se aisló una parte del ADNc de MAL2 que codificaba por un segmento de proteína que mostraba interacción con la proteína TPD52 utilizada como cebo en el rastreo (Wilson, S.H., Bailey, A.M., Nourse, C.R., Mattei, M.G. and Byrne, J.A. (2001). Identification of MAL2, a novel member of the MAL proteolipid family, through interactions with TPD52-like proteins in the yeast two-hybrid system. Genomics 76, 81-88). Esto condujo al aislamiento de la copia completa del ADNc portador de la secuencia codificadora completa. La proteína predicha a partir de esta secuencia contiene 179 aminoácidos y presenta un grado de identidad significativo a nivel de aminoácidos con la proteína MAL. El gen MAL2 se expresa en la línea celular hepática HepG2, y en las líneas epiteliales Caco-2 y MDCK, derivadas de colon y riñón, respectivamente. A diferencia de MAL, MAL2 está modificada covalentemente por glicosilación y, de forma similar a MAL, MAL2 se encuentra asociada a balsas lipídicas (de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., and Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44). Utilizando oligonucleótidos antisentido modificados químicamente para aumentar su estabilidad hemos demostrado recientemente un papel esencial para MAL2 en la ruta indirecta de transporte de proteínas a la superficie apical en células HepG2 (de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., and Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol.
159, 37-44).

Pese a que el transporte de proteínas es un proceso esencial para el funcionamiento normal de muchos epitelios, y a que la pérdida de la polaridad celular es un fenómeno muy común en la transformación tumoral y en otras patologías (Schoenenberger, C.A., and Matlin, K.S. (1991). Cell polarity and epithelial oncogenesis. Trends Cell Biol. 1, 87-92; Fish, E.M., and Molitoris, B.A. (1994). Alterations in epithelial polarity and the pathogenesis of disease states. New Engl. J. Med. 330, 1580-1588), no se conocía hasta hace poco la identidad de los componentes de la maquinaria de transporte de transporte directo a la membrana apical ni, por consiguiente, si su expresión se veía afectada por la transformación tumoral. Estas consideraciones nos llevaron con anterioridad a examinar la expresión de la proteína MAL en distintos epitelios y en otros tipos celulares y a investigar si las diferencias de expresión y/o distribución subcelular de la proteína MAL en tejido normal y en tumores procedentes de los mismos tejidos. Nuestros resultados indicaron claramente que los niveles de expresión y la distribución de MAL estaban afectados en ciertos tipos de tumores, y esto llevó a proponer la utilidad de la proteína MAL como un nuevo marcador de la progresión tumoral (Alonso, M.A., Marazuela, M., and Acevedo, A. (2002). Uso de la proteína MAL como marcador tumoral. Número de solicitud: 200200615. Fecha de presentación: 14 de Marzo de 2002. Titular de la patente: Consejo Superior de Investigaciones Científicas y Hospital de la Princesa. Lugar de la patente: España. Solicitud internacional número: ESO 300119, fecha de expedición: 14 de marzo de 2002). Más recientemente, se ha descrito que, al menos en tumores de esófago, MAL parece actuar como una proteína supresora de tumores de forma que la pérdida de su expresión se correlaciona con la actividad proliferativa descontrolada característica de la transformación tumoral (Mori, M., Mimori, K., Shiraishi, T., Mashino, K., Yoshinaga, K., Masuda, T., Yamashita, K., Utsunomiya, T., Alonso, M. A., and Inoue, H. (2003). MAL gene expression in esophageal cancer supresses motility, invasion and tumorigenicity and enhances apoptosis through the Fas pathway. Oncogene 22, 3463-3471). Pese a la importancia que tiene la ruta apical de transporte indirecta o transcitótica en la polarización celular y al papel central que la proteína MAL2 desempeña en esta ruta, no se ha estudiado hasta la fecha ni la expresión ni la distribución subcelular de la proteína MAL2 en muestras de tejidos normales ni en muestras tumorales u otras patologías, para investigar el posible uso de la proteína MAL2 como un nuevo marcador.

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La presente invención se basa en que los inventores han observado que la proteína MAL2 presenta una expresión alterada en determinados tumores humanos, lo que la convierte en un marcador biológico de dichos tumores, con posible valor diagnóstico y predictivo de dichos pacientes.

Un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para determinar la diferente expresión de dicho marcador asociado a estos tumores humanos, en adelante procedimiento de la presente invención.

Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye un medio que permita la puesta a punto de la determinación de la expresión de dicho marcador biológico asociado a estos tumores humanos y en consecuencia del procedimiento de la presente invención.

Finalmente, otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el uso del procedimiento y el medio anteriormente mencionados en procedimientos para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursan con una expresión alterada de MAL2, como tumores que tienen su origen en células epiteliales, como por ejemplo tumores de riñón, tiroides, próstata, ovario, mama, pulmón, colon, vejiga, etc., así como en mastocitos, neuronas y células dendríticas foliculares.

Descripción detallada de la invención

La proteína integral de membrana denominada MAL2 ha sido caracterizada como un componente esencial de la maquinaria de la ruta indirecta de transporte a la superficie apical en células hepáticas HepG2 (de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., and Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44). Para caracterizar los distintos tipos celulares que expresan la proteína MAL2 y poder correlacionar posteriormente las alteraciones en su expresión y/o distribución con el desarrollo de estados celulares patológicos, los inventores han descrito, en primer lugar, en la presente invención la realización de un análisis inmunohistoquímico extensivo de la expresión de MAL2 en un panel amplio de tejidos humanos utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón denominado 9D 1 que reconoce a la proteína MAL2 humana. Este análisis ha permitido identificar la expresión de MAL2 en tipos específicos de células epiteliales, en mastocitos, neuronas y células dendríticas foliculares. Por otro lado, en el estudio inmunohistoquímico de diversos tipos tumorales, tomados como ejemplo de patologías que afectan a estos tipos celulares mencionados anteriormente, se ha observado que algunos tipos concretos de tumores no muestran expresión de MAL2 y/o presentan alteraciones en su distribución celular. En resumen, estos hallazgos sugieren que el estudio de la expresión y/o distribución de MAL2 en tumores, y posiblemente en otros tejidos patológicos, puede servir para una mejor caracterización de las muestras patológicas con fines pronósticos o diagnósticos y para la detección de neoplasias incipientes.

Así, un objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para determinar la diferente expresión del marcador biológico MAL2 asociada a tumores de mamíferos, preferentemente humanos, en adelante procedimiento de la presente invención, y caracterizado porque está constituido por los siguientes pasos:

a): determinación de la expresión alterada o no de MAL2 en una muestra biológica potencialmente patológica,

b): comparación con la expresión de MAL2 asociada a un tejido sano representativo de la estirpe tumoral de a), y

c): la identificación de un tumor en dicha muestra si dicha expresión observada en a) difiere del patrón de expresión asociado a un tejido sano.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "expresión alterada" se refiere a diferencias cuantitativas de los niveles de expresión de MAL2, así como si existe o no dicho marcador biológico MAL2 y a un patrón de distribución de la proteína MAL2 diferente con respecto al observado en el tejido sano correspondiente. El término "marcador biológico MAL2" tal como se utiliza en la presente invención se refiere tanto a su forma genómica, RNAm o su correspondiente cDNA transcrito por RT-PCR, como a la proteína MAL2. Los niveles de expresión genómica, RNAm o su correspondiente cDNA transcrito por RT-PCR, se correlacionan con la expresión de la proteína resultado de la misma, y es una práctica habitual la determinación de una de ellas, o de ambas, a la hora de analizar la presencia o no de un determinado marcador biológico.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "tumores humanos" se refiere a tumores que tienen su origen en células epiteliales, como por ejemplo tumores de riñón, tiroides, próstata, ovario, mama, pulmón, colon, vejiga, etc., así como en tumores de mastocitos, neuronas y células dendríticas foliculares.

Un objeto particular de la presente invención lo constituye el procedimiento de la presente invención en el que la determinación de la expresión alterada o no de MAL2 en una muestra biológica potencialmente patológica se realiza, sobre una muestra extraída de un ser humano, mediante una técnica de biología molecular, como por ejemplo, las pertenecientes al siguiente grupo: Northern blot, hibridación in situ utilizando sondas específicas del gen de MAL2, microarrays de cDNA o de oligonucleótidos, la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cDNA como molde (RT-PCR) para la determinación de material genómico; y western blot y análisis de inmunohistoquímica para la determinación de proteínas, y que son ampliamente conocidas en el estado del arte.

Un objeto adicional de la presente invención lo constituye un medio especialmente concebido que permita la puesta a punto de la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 asociado a tumores humanos y en consecuencia del procedimiento de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente invención el término "medio" se refiere a cualquier dispositivo, kit, solución o composición química o biológica como por ejemplo, un biochip o microarray, ya sea de material genómico, RNAm o cDNA, o de proteínas, una composición que contenga un anticuerpo que reconoce MAL2 o que contenga sondas u oligonucleótidos complementarios de las formas genómicas de MAL2. La técnica de biochips o microarrays se ha convertido en una importante herramienta de la industria biotecnológica en el campo de la determinación de la expresión génica, en el diagnóstico y pronóstico de enfermedades, farmacogenómica y detección de agentes infecciosos entre otros (Microarrays y biochips de ADN. Informe de Vigilancia Tecnológica. GENOMA ESPAÑA/CIBT-FGUAM, 2002. www.gen-es.org, Haab et al. Protein microarray for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biology Vol. 2 No. 2; Below, Larissa et al. Immunophenotyping of leukemias using cluster of differentiation antibody microarray. Cancer Research 61 June 1, 2001; Fung et al. Protein biochips for differential profiling. Anal. Biotech. 2001, 12: 65-69). Por otro lado, un objeto particular de la presente invención lo constituye un dispositivo tipo biochip de DNA que incluya en el mismo secuencias de nucleótidos que permiten la determinación de la expresión génica del mRNA ó cDNA correspondiente de MAL2. Adicionalmente, un objeto particular de la presente invención lo constituye un dispositivo tipo biochip o microarray de proteínas de captura basados en anticuerpos (también llamados microarrays de detección, que permiten la detección de proteínas diana y su cuantificación) que incluya un anticuerpo específico de MAL2, ya sea monoclonal o policlonal, por ejemplo el utilizado en la presente invención: anticuerpo monoclonal anti-MAL2 9D1, y que permite la determinación de los niveles de expresión de la proteína MAL2 en una muestra biológica. Los microarrays de proteínas basados en proteínas, descritos inicialmente en los inicios de los 80, han sido en los últimos años objeto de atención de múltiples grupos y se están poniendo a punto para distintas aplicaciones a partir de los desarrollos realizados previamente para los biochips de DNA (Huang, RP Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system. J. Immunol Meth. 225 (2001): 1-13). Hay que indicar que dentro del ámbito de la presente invención quedan incluidos todos aquellos biochips de proteínas basados en anticuerpos como agentes de captación, entre otros, que comprendan anticuerpos monoclonales (hibridomas) o policlonales, fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies, fragmentos Fab y scFv de anticuerpos, los engineered scaffolds (dominios de proteínas de unión a ligando) y aptámeros proteicos; y los basados en ligandos no proteicos como agentes de captura, entre otros, aptámeros de ácidos nucleicos o pequeñas moléculas obtenidas por síntesis química, y que se encuentran descritos en el estado del arte (Brent et al. Genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibit cyclin-dependent kinase 2. Nature 380 (1996): 548-550; Hesselberth J et al. In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications. Rev. Mol. Biotech. 74 (2000): 15-25; http://www.functionalgenomics.org.uk/sections/resources/protein; Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems. Chemistry and Biology 8/2 (2001): 105-115). Igualmente, forman parte de la presente invención todas aquellas composiciones o kits para la realización de cualquier otra técnica de biología molecular que permitan la puesta a punto de un procedimiento para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 asociada a tumores, entre otras, composiciones que contengan sondas genómicas específicas y complementarias de MAL2 para su utilización en técnicas de Northern blot e hibridación in situ o composiciones de oligos específicos de MAL2 para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cDNA como molde (RT-PCR) para la determinación de material genómico; composiciones conteniendo un anticuerpo específico de MAL2, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-MAL2 9D1, para su utilización en técnicas de western blot y análisis de inmunohistoquímica para la determinación de proteínas. Todas estas técnicas son ampliamente conocidas e implantadas en el sector de aplicación al que se dirige la presente invención (Sambrook y
cols., 1989).

Las técnicas y métodos para la preparación y desarrollo de anticuerpos, monoclonales o policlonales, que reconocen específicamente la proteína MAL2 están ampliamente descritas y conocidas en el estado del arte (de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, I., Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., and Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44) por lo que el uso de composiciones que contienen anticuerpos específicos de MAL2 en técnicas de determinación de la proteína MAL2 en muestras biológicas potencialmente patológicas, como tumores, forma parte de la presente invención.

Un objeto específico de la presente invención lo constituye el uso del procedimiento de la presente invención así como de los medios específicos para su puesta en marcha para la detección e identificación de la proteína MAL2 en células normales y tumorales, en procedimientos para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursen con una expresión alterada de MAL2, como tumores que tienen su origen en células epiteliales, como por ejemplo tumores de riñón, tiroides, próstata, ovario, mama, pulmón, colon, vejiga, etc., así como de mastocitos, neuronas y células dendríticas foliculares.

Por otro lado, la pérdida de la polaridad celular es un fenómeno muy común en la transformación neoplásica y en otras patologías, modifica la morfología y características de las células afectadas (Schoenenberger, C.A., and Matlin, K.S. (1991). Cell polarity and epithelial oncogenesis. Trends Cell Biol. 1, 87-92; Fish, E.M., and Molitoris, B.A. (1994). Alterations in epithelial polarity and the pathogenesis of disease states. New Engl. J. Med. 330, 1580-1588) y está relacionada con su etiopatogénia como se ha demostrado en el caso de la proteína MAL, que parece actuar como un supresor de tumores (Mori, M., Mimori, K., Shiraishi, T., Mashino, K., Yoshinaga, K., Masuda, T., Yamashita, K., Utsunomiya, T., Alonso, M. A., and Inoue, H. (2003). MAL gene expression in esophageal cancer supresses motility, invasion and tumorigenicity and enhances apoptosis through the Fas pathway. Oncogene 22, 3463-3471). Dado el papel de MAL2 en la ruta indirecta de transporte apical, los tratamientos que modifiquen los niveles de MAL2 en las células patológicas podrían alterar profundamente el transporte en estas células y modificar de esta forma el curso de la enfermedad o su tratamiento terapéutico. En este sentido, la utilización de MAL2 como diana molecular para la búsqueda de fármacos que alteren su expresión o actividad, puede abrir nuevas estrategias de búsqueda de nuevos fármacos antitumorales.

Descripción de las figuras

Figura 1. Análisis inmunohistoquímico de la expresión y distribución de la proteína MAL2 en riñón humano. (a) Corteza renal. Los túbulos contorneados distales (cabeza de flecha) y los glomérulos (flechas) fueron positivos para la expresión de MAL2. (b) El lado epitelial de las asas capilares mostró tinción positiva, que sugiere expresión de MAL2 en los podocitos (flechas). (c) Los túbulos contorneados distales se tiñeron muy intensamente en su borde apical (flechas) con el anticuerpo anti-MAL2.

Figura 2. Análisis inmunohistoquímico de la expresión y distribución de la proteína MAL2 en distintos tipos de tumores renales humanos. (a) Las células del oncocitoma renal fueron negativas para la expresión de MAL2, mientras que los epitelios de los túbulos normales adyacentes fueron positivas (flechas). (b) Carcinoma de células claras. En la mayoría de los casos examinados no se encontró expresión en las células tumorales pero sí en las células normales adyacentes (flechas). (c) En otros casos de carcinoma de células claras la tinción fue intensa en todas las células tumorales. (d) En todos los casos de carcinoma cromófobo examinados se encontró una tinción difusa en todas las células cuya intensidad variaba de unas células a otras (flechas). (e) En las muestras de carcinoma renal papilar la tinción fue normal, más pronunciada en el lado apical y con intensidad variable de unas células a otras. (f) En carcinomas granulares, todas las células mostraron una tinción granular citoplásmica intensa (flechas).

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación, tinción e identificación de tejidos normales y tumorales con el anticuerpo monoclonal anti-MAL2 9D1

Las muestras de tejido utilizadas fueron recibidas en el Departamento de Patología del Hospital de la Princesa (Madrid) como especímenes rutinarios obtenidos mediante cirugía. Todas las muestras fueron fijadas durante varias horas en 10% formalina tamponada a pH neutro y sometidas al procesado rutinario y a inclusión en bloques de parafina. Se prepararon secciones de 5 \muM de grosor a partir de los bloques de parafina y se montaron en portaobjetos cubiertos con poli-L-lisina. Las secciones, una vez eliminada la parafina, se sometieron a un tratamiento en una olla a presión durante 1 minuto en tampón citrato 200 mM, pH 6,0. Las muestras fueron bloqueadas después con una dilución 1:20 de un suero normal de conejo en tampón Tris-HCl salino, pH 7,6, tal y como se ha descrito previamente (Marazuela, M., Sánchez-Madrid, F., Acevedo, A., Larrañaga, E., and Landazuri, M.O. (1995). Expression of vascular adhesion molecules on human endothelia in autoimmune thyroid disorders. Clin. Exp. Immunol. 102, 328-334). Las secciones fueron incubadas secuencialmente con una dilución 1:50 de una preparación de anticuerpo monoclonal anti-MAL2 9D1 de líquido ascítico obtenido de ratones inoculados con el hibridoma 9D1 productor del anticuerpo monoclonal (de Marco, M. C., Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, P. J., Correas, L, Vaerman, J. P., Marazuela, M., Byrne, J. A., and Alonso, M. A. (2002) MAL2, a novel raft protein of the MAL family, is an essential component of the machinery for transcytosis in hepatoma HepG2 cells. J. Cell Biol. 159, 37-44) y, después con anticuerpos de conejo acoplados a peroxidasa específicos contra la IgG de ratón (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca). Cada incubación fue seguida de tres lavados con tampón Tris-HCl salino. Las secciones fueron reveladas con medio de Graham-Karnovsky que incluye tetracloruro de 3,3'-diaminobencidina (Sigma Chem. Co., St. Louis, USA) y peróxido de hidrógeno. Las secciones fueron teñidas también con hematoxilina de Carazzi, deshidratadas, y montadas por métodos rutinarios. Al menos 4 muestras de
cada espécimen fueron etiquetadas con un código secreto y analizadas de forma independiente por dos especialistas.

Ejemplo 1.1

Resultados sobre la expresión de MAL2 obtenidos en tejidos humanos normales

La expresión de la proteína MAL2 en diferentes epitelios así como en glándulas endocrinas y exocrinas, y la ausencia de niveles detectables de expresión de MAL2 en linfocitos, fibroblastos, células endoteliales y células musculares son algunos de los rasgos comunes más sobresalientes observados en el análisis inmunohistológico que hemos realizado de muestras humanas normales y cuyo resultado aparece recopilado en la Tabla I. Otras observaciones generales encontradas durante este análisis son la expresión de MAL2 en mastocitos, células dendríticas foliculares y en neuronas periféricas (Tabla I).

De forma resumida se describen a continuación algunos de los resultados más sobresalientes obtenidos en el análisis inmunohistoquímico de la expresión de MAL2 en tejidos normales:

- En piel, el tercio más apical del epitelio plano queratinizado fue positivo para la expresión de MAL2. También se encontró expresión de MAL2 en la región apical de las células epiteliales que delimitan las glándulas sebáceas. El tejido fibroadiposo subcutáneo fue negativo.

- En la evaluación de la expresión de MAL2 en el tracto gastrointestinal se examinaron muestras de esófago, estómago, íleon colon, hígado y páncreas. El epitelio plano estratificado del esófago fue positivo para la expresión de MAL2. La tinción fue más acentuada en la capa basal. El epitelio cilíndrico plano del estómago, que incluye células productoras de moco, las células parietales y las células principales ofrecieron tinción positiva para la expresión de MAL2. En el intestino delgado, los enterocitos con microvellosidades del borde en cepillo, las células productoras de moco o células caliciformes, y las células de la base de las criptas de Lieberkühn fueron también positivas. A través de todo el tracto gastrointestinal, los linfocitos de las placas de Peyer y el músculo liso de la muscularis de la mucosa y el músculo estriado de la capa muscular fueron negativos. La expresión de MAL2 en el epitelio de la mucosa del intestino grueso fue similar a la que se acaba de describir en el intestino delgado.

- En hígado, el epitelio del conducto biliar y los canalículos biliares fueron teñidos fuertemente con el anticuerpo anti-MAL2. Las células que delimitan los sinusoides y las células de Kupffer fueron negativas. Las células acínicas del páncreas exocrino mostraron expresión de MAL2. Los conductos pancreáticos fueron teñidos fuertemente. En el pan-
ceras endocrino, algunas células esporádicas de los islotes de Langerhans fueron positivas para la expresión de MAL2.

- Muchas regiones del tracto genitourinario fueron positivas para la expresión de MAL2. En el riñón se encontró expresión de MAL2 en regiones específicas de los glomérulos y de los túbulos contorneados (Figura 1a). En las asas de los glomérulos la tinción se localizó en el lado epitelial sugiriendo expresión de MAL2 en los podocitos (Figura 1b). Las células endoteliales de los glomérulos fueron negativas. En la corteza del riñón, MAL2 fue detectado en los túbulos contorneados (Figura. 1c). La tinción es más pronunciada en unas células que en otras (Figura. 1c). En la medula renal se observó una fuerte expresión de MAL2 en los túbulos colectores.

- Los tejidos hematopoyéticos analizados incluyeron el timo, los ganglios linfáticos y la amígdala. En los ganglios linfáticos y en la amígdala los patrones de tinción con el anticuerpo anti-MAL2 fueron similares con una tinción fuerte en las células dendríticas foliculares. En contraste con la falta de expresión de MAL2 en células endoteliales, las vénulas de endotelio alto (vénulas postcapilares) fueron claramente positivas para MAL2. En el timo, se encontró expresión de MAL2 en las células epiteliales y en los corpúsculos de Hassall pero no en los timocitos.

- En el pulmón, el epitelio cilíndrico ciliado de los bronquios y los bronquiolos fue positivo. En los alveólos, tanto los pneumocitos tipo 1, que delimitan las paredes alveolares, como los pneumocitos tipo 2, que son los que segregan surfactante, mostraron expresión de MAL2.

Como ejemplos de glándulas endocrinas se examinaron las glándulas suprarrenales, el tiroides, el testículo y la próstata. En las glándulas suprarrenales, la médula presentó un marcaje intenso para MAL2. Aunque todas las capas de la corteza fueron positivas, la expresión de MAL2 fue más pronunciada en la zona reticular. El epitelio tiroideo fue teñido para MAL2 con su típica distribución apical. En testículo, las células de Leydig fueron teñidas fuertemente con el anticuerpo anti-MAL2. El epitelio de las glándulas de la próstata también resultó también ser positivo.

TABLA I Resumen de la expresión de MAL2 en diferentes tejidos

1

Ejemplo 1.2

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Resultados sobre la expresión de MAL2 obtenidos en tumores humanos

Se examinó la expresión y distribución de MAL2 por técnicas inmunohistoquímicas en distintos tipos de tumores renales y tiroideos para su comparación con el tejido normal. Los tumores renales estudiados incluyeron las variedades principales de carcinoma renal: carcinoma renal de células claras (8 casos), carcinoma papilar renal (4 casos), carcinoma cromófobo renal (5 casos), carcinoma renal sarcomatoide (2 casos), y oncocitoma renal (6 casos). Los tipos de tumores tiroideos examinados incluyeron el carcinoma papilar tiroideo (7 casos), carcinoma folicular (5 casos) y carcinoma anaplásico (2 casos). Las muestras tumorales fueron definidas de acuerdo con criterios morfológicos utilizando secciones teñidas con hematoxilina siguiendo los criterios establecidos para la clasificación de tumores de riñón (Murphy, W.M., Beckwith, J.B., and Farrow, G.M. (1994). Tumors of the kidney, bladder and related urinary structures. In Atlas of tumor pathology. Rosai, J., and Sobin, L.H. (Eds.). Published by the Armed Forces Institute of Pathology, Bethesda, pp. 92-136) y tiroides (Rosai, J., Carcangui, M.L., and Delellis, R.A. (1992). Tumors of the thyroid gland. In Atlas of tumor pathology. Rosai, J., and Sobin, L.H. (Eds.). Published by the Armed Forces Institute of Pathology, Bethesda, pp. 19-161).

Tumores renales

Dentro de los tumores renales, los oncocitomas constituyen aproximadamente el 5% de las neoplasias renales y presentan carácter benigno. Los oncocitomas renales examinados no mostraron expresión de MAL2 (Fig. 2a). Los carcinomas de células claras constituyen el 70-80% de los cánceres de células renales. Aunque no se detectó expresión de MAL2 en la mayoría de los carcinomas de células claras examinados (Fig. 2b), en algunos tumores se encontró una tinción intensa con el anticuerpo anti-MAL2 (Fig. 2c). El carcinoma cromófobo constituye aproximadamente un 5% de los carcinomas de células renales. Las células de los carcinomas cromófobos mostraron una tinción intensa con una distribución difusa, siendo más intensa en la parte apical y en unas células más que en otras (Fig. 2d). El carcinoma papilar constituye el 10-15% de los carcinomas renales. La tinción de estos carcinomas fue semejante a la del riñón normal (Fig. 2e). Los tumores de tipo granular mostraron una tinción citoplásmica intensa (Fig. 20. Los carcinomas sarcomatoides constituyen aproximadamente un 1% de los tumores de células renales. La expresión de MAL2 en estos carcinomas fué indetectable (no mostrado).

Tumores tiroideos

El carcinoma papilar constituye un 65-80% de los tumores tiroideos. En todos los casos de carcinoma tiroideo papilar examinados se encontró una tinción con el anticuerpo anti-MAL2 semejante a la del tiroides normal. El carcinoma folicular tiroideo, que constituye el 5-15% de los tumores tiroideos, mostró una tinción difusa en la región apical. En el carcinoma anaplásico, que es un tumor raro y agresivo que constituye menos del 5% de los carcinomas tiroideos, no se encontró expresión detectable de MAL2.

En conclusión, nuestros resultados indican: 1) que la proteína MAL2 se expresa en una gran variedad de tipos celulares, 2) que en algunos tipos de tumores se producen cambios drásticos en la expresión de la proteína MAL2, y 3) que los cambios observados en la expresión de MAL2 en algunos tipos de tumores puede ser necesaria para la progresión maligna y puede condicionar su morfología y características. Por lo tanto, la proteína MAL2 puede ser utilizada como marcador para una caracterización más detallada de tumores en los tipos celulares dónde MAL2 normalmente se expresa (puntos 1 y 2), y la manipulación clínica de los niveles de la expresión de MAL2 podría ser de utilidad para alterar el curso del desarrollo tumoral o su tratamiento terapéutico (punto 3). Aunque nuestro estudio se ha centrado en el análisis de tumores epiteliales, nuestras observaciones pueden extenderse a otros tipos celulares no identificados en el presente estudio que expresen la proteína MAL2 y a otros tipos de patología diferentes de la transformación tumoral.

Claims

1. Procedimiento para determinar la expresión del marcador biológico MAL2 asociada a tumores de mamíferos, preferentemente humanos, que comprende los siguientes pasos:

a): determinación de la expresión alterada o no de MAL2 en una muestra biológica potencialmente patológica

b): comparación con la expresión de MAL2 asociada a un tejido sano representativo de la estirpe tumoral de a)

2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde la determinación de la expresión alterada o no de MAL2 en una muestra biológica potencialmente patológica a) se realiza mediante una técnica de biología molecular, como por ejemplo, las pertenecientes al siguiente grupo: Northern blot, hibridación in situ utilizando sondas específicas del gen de MAL2, la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cDNA como molde (RT-PCR) para la determinación del material genómico; y western blot y análisis de inmunohistoquímica para la determinación de proteínas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 y 2 donde la determinación de la expresión alterada o no de MAL2 se refiere a diferencias cuantitativas de los niveles de expresión de MAL2, así como si existe o no dicho marcador biológico MAL2 y a un patrón de distribución de la proteína MAL2 diferente con respecto al observado en el tejido sano correspondiente.

4. Dispositivo para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2, que se utiliza en el procedimiento de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque es un biochip o microarray.

5. Dispositivo según la reivindicación 4, donde el biochip o microarray es un biochip de DNA que incluye en el mismo secuencias de nucleótidos para la determinación de la expresión génica del mRNA o cDNA correspondiente a MAL2.

6. Dispositivo según la reivindicación 4, donde el biochip o microarray es un biochip o microarray de proteínas de captura que incluye un anticuerpo especifico de MAL2.

7. Biochip o microarray según la reivindicación 6, donde el anticuerpo específico de MAL2 es un anticuerpo policlonal.

8. Biochip o microarray según la reivindicación 6, donde el anticuerpo específico de MAL2 es un anticuerpo monoclonal.

9. Biochip o microarray según la reivindicación 8, donde el anticuerpo monoclonal es el anti-MAL2 9D1.

10. Composición biológica para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 que se utiliza como reactivo en el procedimiento de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque contiene un anticuerpo específico de MAL2.

11. Composición biológica según la reivindicación 10, donde el anticuerpo específico de MAL2 es un anticuerpo policlonal.

12. Composición biológica según la reivindicación 10, donde el anticuerpo específico de MAL2 es un anticuerpo monoclonal.

13. Composición biológica según la reivindicación 11, donde el anticuerpo monoclonal es el anti-MAL2 9D1.

14. Kit para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 según el procedimiento de las reivindicaciones 1-3 que contiene al menos un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 4-9.

15. Kit para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 según el procedimiento de las reivindicaciones 1-3 que contiene al menos una composición biológica según la reivindicación 10.

16. Kit para la determinación de la expresión del marcador biológico MAL2 según la reivindicación 15 que contiene además un anticuerpo específico de MAL2 según cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

17. Uso del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursan con una expresión alterada de MAL2.

18. Uso de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 4-9 para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursan con una expresión alterada de MAL2.

19. Uso de una composición biológica según la reivindicación 10 para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursan con una expresión alterada de MAL2.

20. Uso de una composición biológica según la reivindicación 19, donde dicha composición biológica comprende además un anticuerpo específico MAL2 según cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

21. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 14-16 para predecir, diagnosticar y valorar la evolución de enfermedades o procesos patológicos que cursan con una expresión alterada de MAL2.