JP2019516393A - オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用 - Google Patents

オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用 Download PDF

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Abstract

関心対象の標的に結合するオリゴヌクレオチドを同定するための方法および組成物が提供される。標的は、組織、細胞、循環バイオマーカー、たとえば微小胞、たとえば様々な疾患に由来する微小胞を含む。オリゴヌクレオチドは、診断および治療用途に使用することができる。

Description

相互参照
本出願は、以下の米国特許仮出願：2016年3月18日出願の第62/310,665号；2016年10月26日出願の第62/413,361号；2016年11月10日出願の第62/420,497号；2016年12月9日出願の第62/432,561号；2017年2月10日出願の第62/457,691号；および2017年3月17日出願の第62/472,953号の恩典を主張する。これらの出願はすべて全体として参照により本明細書に組み入れられる。
EFS-Webを介して提出された配列リスト
MPEP §1730 II. B.2(a）において認可され、記載されているUSPTOのEFS-Webサーバを介する以下の配列リストの電子提出の全内容があらゆる趣旨に関して全体として参照により本明細書に組み入れられる。配列リストは、以下のように特定される電子出願されたテキストファイル内にある。
ファイル名: 836601_SEQUENCES.txt
作成日: March 18, 2017
サイズ（バイト）: 40,256,606 bytes
発明の背景
本発明は一般に、癌および／または他の疾患もしくは障害の診断にとって、また、そのような医学的状態を治療するための治療物質として有用であるオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明はさらに、関心対象の細胞に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブの投与のための材料および方法に関する。
オリゴヌクレオチドプローブまたはアプタマーとは、標準的なワトソン-クリック塩基ペアリング以外の相互作用を介し得る、分子への特異的結合親和性を有するオリゴマー核酸分子である。別段指定されない限り、用語「アプタマー」は、本明細書において使用されるとき、標的を認識するやり方にかかわらず、標的と会合することができる核酸分子を指すことができる。別段指定されない限り、用語「アプタマー」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチドプローブ」などは、本明細書において互換可能に使用され得る。
オリゴヌクレオチドプローブは、ファージディスプレイによって生成されたペプチドまたはモノクローナル抗体（「mAb」）のように、選択された標的に特異的に結合し、標的の活性を変調させることができる、たとえば、結合するアプタマーを介して、標的が機能する能力をブロックし得る。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからインビトロ選択プロセスによって創製されて、アプタマーは、成長因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよび受容体を含む数多くのタンパク質に関して生成されている。一般的なアプタマーは、サイズが10〜15kDa（30〜45ヌクレオチド）であり、サブナノモル親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的を差別する（たとえば、アプタマーは、同じ遺伝子ファミリーの他のタンパク質には結合しないように設計されることができる）。一連の構造研究が、アプタマーが、抗体-抗原複合体において親和性および特異性を駆動する同じタイプの結合相互作用（たとえば水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体排除）を使用することができることを示した。
本発明者らは、以前、体液試料中の微小胞の検出に有用なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのライブラリーを同定した。微小胞は、罹患細胞、たとえば癌細胞によって様々な体液、たとえば血液の中に放出されることができる。したがって、血液ベースの診断法を非限定的に含む、液体生検の手段を提供する。いくつかの場合、組織試料が利用可能である。本発明は、オリゴヌクレオチドライブラリーを関心対象の組織に対して富化する方法を提供する。本発明の用途は、非限定的に、セラノーシス（たとえば薬物応答を予測する）および診断（たとえば癌試料を検出する）を含む。本発明の方法は、罹患細胞を特異的に認識するアプタマーを提供するため、アプタマーそのものを治療用途に使用することができる。
参照による組み入れ
本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示される場合と同じ程度に、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の組成物および方法は、関心対象の表現型を有する組織を認識するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。様々な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、その試料の表現型を特徴決定するために、診断、予後判定またはセラノーシスプロセスに使用される。診断は癌に関連し得る。他の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、治療用途のために薬学的組成物中で化学的に修飾または構成される。
ある局面において、本発明は、(a）実施例19〜31のいずれか1つに記載される可変配列；(b）表20〜23、25、27、38〜40もしくは45のいずれか1つに記載される可変配列；または(c）SEQ ID NO. 1〜206506のいずれか1つに列挙された配列に対応する領域を含むオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはさらに、配列
Figure 2019516393
を有する5'領域、配列
Figure 2019516393
を有する3'領域、または両方を含む。本発明はさらに、そのようなオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその一部分を含むオリゴヌクレオチドを提供する。関連する局面において、本発明は、、上記のような異なるオリゴヌクレオチド配列を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000または少なくとも100000個含む複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
ある態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、2'-O-メチルまたはホスホロチオエート主鎖またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNA、LNA、UNAおよびそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む。オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのメンバーは、DNA、RNA、ビオチン化、非天然由来ヌクレオチド、欠失、挿入、付加および化学的修飾からなる群より選択される少なくとも1つの機能的修飾を有することができる。いくつかの態様において、化学的修飾は、C18、ポリエチレングリコール（PEG）、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12およびジゴキシゲニンの少なくとも1つを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは標識されることができる。たとえば、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、金、磁性標識、蛍光標識、発光粒子、ビオチン部分または放射性標識に結合していることができる。
ある局面において、本発明は、複数ラウンドのポジティブおよびネガティブ選択を使用してオリゴヌクレオチドライブラリーを富化する方法を提供する。複数のオリゴヌクレオチドを富化する方法は、(a）少なくとも1ラウンドのポジティブ選択を実施する工程であって、該ポジティブ選択が、(i）組織を含む少なくとも1つの試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；および(ii）少なくとも1つの試料と会合した複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む、工程；(b）任意で、少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を実施する工程であって、該ネガティブ選択が、(i）組織を含む少なくとも1つのさらなる試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；および(ii）少なくとも1つのさらなる試料と会合しなかった、複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む、工程；および(c）工程（a）（ii）および工程（b）（ii）の少なくとも1つにおいて回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを増幅し、それにより、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程を含み得る。ある態様において、工程（a）（ii）において回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーは工程（a）（i）の次の繰り返しのための投入物として使用される。ある態様において、工程（b）（ii）において回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーは工程（a）（i）の次の繰り返しのための投入物として使用される。富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは大きな多様性を有し得る。たとえば、富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、本明細書において記載されるようなナイーブなF-Trinライブラリーを含む。
本発明の富化法のいくつかの態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は固定組織を含む。固定組織はホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を含み得る。ある態様において、FFPE組織は、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性流体および微細針吸引液（FNA）の少なくとも1つを含む。FFPE組織は基体上に固定されることができる。たとえば、基体はガラススライドまたは膜であることができる。
いくつかの態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は様々な基体上に固定される。あるいはまた、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は単一の基体上に固定される。いくつかの態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は、溶解される、基体から掻き取られる、またはマイクロダイセクションに供される。溶解した試料は基体上に配列されることができる。いくつかの態様において、基体は膜を含む。たとえば、膜はニトロセルロース膜であることができる。
本発明の富化法の様々な態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は関心対象の表現型の点で異なる。少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は、同じ基体の異なる区分に由来することができる。非限定的な例として、試料は、固定組織試料からの癌組織および隣接する正常組織を含み得る。そのような場合、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料は、富化を容易にするために、同じ基体から掻き取られる、またはマイクロダイセクションされ得る。
オリゴヌクレオチドライブラリーは、任意の所望の表現型の分析のために富化されることができる。態様において、表現型は、組織、解剖学的起源、医学的状態、疾患、障害またはそれらの任意の組み合わせを含む。たとえば、組織は、筋、上皮、結合組織および神経組織、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。たとえば、解剖学的起源は、胃、肝臓、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、鼻、気管支、腎臓、膀胱、尿道、下垂体、松果体、副腎、甲状腺、膵臓、副甲状腺、前立腺、心臓、血管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、皮膚、舌、鼻、目、耳、歯、子宮、膣、精巣、陰茎、卵巣、乳房、乳腺、脳、脊髄、神経、骨、靭帯、腱またはそれらの任意の組み合わせであることができる。
本発明の富化法の様々な態様において、方法はさらに、オリゴヌクレオチドライブラリーの富化されたメンバーの標的を決定する工程を含む。そのような決定のための技術が本明細書において提供される。
ある局面において、本発明は、試料中の表現型を特徴決定する方法であって、a）試料を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；およびb）少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと試料との間で形成された複合体の存在またはレベルを同定する工程を含み、存在またはレベルを使用して表現型を特徴決定する、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、試料を可視化する方法であって、a）試料を少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；b）試料に結合しない少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを取り除く工程；およびc）試料に結合した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを可視化する工程を含む方法を提供する。表現型を特徴決定するために可視化を使用してすることができる。
特徴決定される試料は、組織試料、体液、細胞、細胞培養物、微小胞またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む任意の有用な試料であることができる。いくつかの態様において、組織試料は固定組織を含む。固定組織はたとえばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織であることができる。様々な態様において、FFPE試料は、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性流体および微細針吸引液（FNA）の少なくとも1つを含む。
存在またはレベルを同定する工程は、核酸配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、クロマトグラフィーまたは可視化を非限定的に含む任意の有用な技術を含み得る。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションによって同定する工程は、試料を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成されている少なくとも1つの標識されたプローブと接触させる工程を含む。少なくとも1つの標識されたプローブは標識に直接的または間接的に結合することができる。標識はたとえば蛍光、放射性または磁性標識であることができる。間接的標識はたとえばビオチンであることができる。いくつかの態様において、配列決定は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの次世代配列決定である、ダイターミネーション配列決定および／またはパイロシーケンシングを含む。可視化は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドに直接的または間接的に結合したシグナルの可視化であり得る。シグナルは、任意の有用なシグナル、たとえば蛍光シグナルまたは酵素シグナルであることができる。いくつかの態様において、酵素シグナルは、ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよびミクロペルオキシダーゼの少なくとも1つによって生成される。可視化は、光学顕微鏡検査または蛍光顕微鏡検査の使用を含み得る。
試料を特徴決定または可視化するための本発明の方法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの標的は既知であり得る。たとえば、オリゴヌクレオチドは公知のタンパク質標的に結合し得る。いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの標的は未知である。たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、そのものが、オリゴヌクレオチドのいくつかまたはすべてと結合した抗原の知識を必ずしも必要としないバイオシグネチャーまたは他の有用な結果を提供し得る。
試料を特徴決定または可視化する方法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは上記のように提供されることができる。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書において提供される発明の富化法を使用して決定されたものであってもよい。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型はたとえば肺癌または前立腺癌であり得る。
もう1つの例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型はたとえば前立腺癌であり得る。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型はたとえばHER2状態（+/-）であり得る。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば、抗HER2療法に対する応答であり得、任意で、抗HER2療法はトラスツズマブを含む。
一例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば、FOLFOXおよびベバシズマブの少なくとも1つに対する応答であり得る。
もう1つの例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型はたとえば組織同一性であり得、非限定的に、組織は乳房、結腸、腎、肺または膵組織を含む。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する、試料を特徴決定する、または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、表現型はバイオマーカー状態であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは表4より選択される。いくつかの態様において、バイオマーカー状態は、HER2陽性、HER2陰性、EGFR陽性、EGFR陰性、TUBB3陽性またはTUBB3陰性の少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、バイオマーカー状態は、ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1（22c3）、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TSおよびTUBB3の少なくとも1つの発現、コピー数、変異、挿入、欠失または他の変化を含む。様々な態様において、バイオマーカー状態は、EGFR vIIIまたはMET Exon 14スキッピング変異の少なくとも1つの存在または非存在を含む。態様において、バイオマーカー状態は、ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1およびRSPO3の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含む。態様において、バイオマーカー状態は、
Figure 2019516393
Figure 2019516393
の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含む。バイオマーカー状態は、
Figure 2019516393
の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含み得る。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する、試料を特徴決定する、または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、表現型は疾患または障害を含む。方法は、疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供する際に支援するために用いられることができる。たとえば、富化する工程は、疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供する際に支援するために富化されたライブラリーを使用することができるように試料を使用して実施され得る。同様に、特徴決定は、疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供する際に支援する工程を含み得る。可視化もまた、疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供する際に支援する工程を含み得る。いくつかの態様において、セラノーシスは、治療効能もしくはその欠如を予測すること、患者を、治療に対する応答者もしくは非応答者として分類すること、または治療効能をモニタリングすることを含む。セラノーシスは、任意の適切な治療に向けられることができ、たとえば、治療は、化学療法、免疫療法、標的化癌療法、モノクローナル抗体、抗HER2抗体、トラスツズマブ、抗VEGF抗体、ベバシズマブおよび／または白金／タキサン療法の少なくとも1つを含み得る。いくつかの態様において、治療は、アファチニブ、アファチニブ＋セツキシマブ、アレクチニブ、アスピリン、アテゾリズマブ、ビカルタミド、カボザンチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、セリチニブ、セツキシマブ、シスプラチン、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン＋エベロリムス、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ホルモン療法、イリノテカン、ラパチニブ、リポソーム化ドキソルビシン、マチニブ、マイトマイシン-c、ナブパクリタキセル、ニボルマブ、オラパリブ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パルボシクリブ併用療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、スニチニブ、T-DM1、テモゾロミドドセタキセル、テムシロリムス、トポテカン、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブおよびベムラフェニブの少なくとも1つを含む。ホルモン療法は、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、酢酸メゲストロール、ロイプロリド、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、アビラテロン、エンザルタミド、トリプトレリン、アバレリクスおよびデガレリクスの1つまたは複数であることができる。
試料を特徴決定することに関する本発明の方法において、特徴決定は、存在またはレベルを参照と比較する工程を含み得る。いくつかの態様において、参照は、疾患もしくは障害を有しない個体由来または疾患もしくは障害の異なる状態を有する個体由来の試料中で決定された存在またはレベルを含む。存在またはレベルは、可視化工程によって決定された視覚的レベル、たとえばIHCスコアの存在またはレベルであることができる。非限定的な例として、本発明によって提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの参照との比較は、試料が癌試料または非癌／正常試料を含むことを示す。
本発明の方法のいくつかの態様において、1つまたは複数の試料は体液を含む。体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪油、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血を非限定的に含む任意の有用な体液であることができる。
試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、試料は、医学的状態、疾患もしくは障害を有するまたはその素因を有すると疑われる対象に由来することができる。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程、または試料を可視化する工程を含む、本発明の方法において、医学的状態、疾患、または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛であり得る。いくつかの態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。いくつかの態様において、前癌状態はバレット食道を含む。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症性筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症を含む。いくつかの態様において、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性事象を含む。いくつかの態様において、神経学的疾患は、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血性再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群を含む。いくつかの態様において、疼痛は、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む。いくつかの態様において、感染症は、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む。
ある局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む、本発明によって提供される方法を実施するための少なくとも1つの試薬を含むキットを提供する。関連する局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む、本発明によって提供される方法を実施するための少なくとも1つの試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つの試薬は、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。また、さらなる有用な試薬が本明細書において提供される。たとえば、実施例に提供されるプロトコルを参照すること。
ある局面において、本発明は、少なくとも1つの細胞または組織を、本明細書において提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、および少なくとも1つの細胞または組織と接触した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、少なくとも1つの細胞または組織を画像化する方法を提供する。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化はたとえば肺癌または前立腺組織に関し得る。
もう1つの例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型はたとえば前立腺癌であり得る。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化はたとえば細胞または組織のHER2状態に関し得る。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化はたとえば細胞または組織のHER2状態に関し得る。
一例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化はたとえば結腸直腸細胞または組織に関し得る。
もう1つの例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば乳房、結腸、腎、肺または膵組織を非限定的に含む組織に関し得る。
本発明によって提供される画像化法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書において記載される様々な有用な化学構造または修飾を有することができる。
本発明によって提供される画像化法においては、検出する工程の前に、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することができる。そのような方法は、対象中の少なくとも1つの細胞または組織の画像化を可能にし得る。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または組織は、新生物性、悪性、腫瘍、過形成または異形成細胞を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または組織は、リンパ腫、白血病、腎癌、肉腫、血管周囲細胞腫、黒色腫、腹部癌、胃癌、結腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌または非小細胞肺癌細胞の少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または組織は医学的状態、疾患または障害を含む。
ある局面において、本発明は、治療有効量の、本明細書において提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む構築物と、薬学的に許容される担体、希釈剤または両方とを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書において表28に列挙された少なくとも1つのタンパク質と会合する。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は肺癌または前立腺癌を含む。
もう1つの例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は前立腺癌を含む。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は乳癌を含む。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は乳癌を含む。
ある例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は結腸直腸癌を含む。
さらに別の例において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌に関連する治療に有用であり得、任意で、癌は乳房、結腸、腎臓、肺または膵臓の癌を含む。
薬学的組成物内の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、任意の有用な所望の化学的修飾を有することができる。ある態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは毒素または化学療法剤に結合している。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはマルチパータイト構築物内に含まれ得る。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドはリポソームまたはナノ粒子に結合していることができる。いくつかの態様において、リポソームまたはナノ粒子は毒素または化学療法剤を含む。
関連する局面において、本発明は、その必要がある対象における疾患または障害を治療するまたは寛解させる方法であって、本発明の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。もう1つの関連する局面において、本発明は、対象において細胞傷害性を誘導する方法であって、本発明の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む方法を提供する。非限定的に、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、局所投与またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む任意の有用な投与手段を使用することができる。
（図１）図1A〜1Bは、細胞表面抗原または微小胞表面抗原のようなバイオマーカーを評価する方法を示す。図1Aは、捕捉物質の標的抗原を発現する細胞または微小胞を捕捉する捕捉物質、たとえばアプタマーまたは抗体でコートされた平面基体の模式図である。捕捉物質は、罹患細胞または小胞の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された細胞または微小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、起始細胞または疾患、たとえば癌と広く関連している抗原を、検出することができる。図1Bは、捕捉物質の標的抗原を発現する細胞または微小胞を捕捉する、捕捉物質にコンジュゲートした粒子ビーズの模式図である。捕捉物質は、罹患細胞または小胞の表面に発現するタンパク質に結合し得る。同じくアプタマーまたは抗体であってもよい検出物質は、検出可能な標識、ここでは蛍光シグナルを有する。検出物質は、捕捉された細胞または微小胞に結合し、その蛍光標識によって検出可能なシグナルを提供する。検出物質は、起始細胞もしくは疾患、たとえば癌と広く関連している抗原を、検出することができる。
（図２）図2A〜Bは、アプタマーヌクレオチド配列およびその二次構造の非限定的な例を示す。図2Aは、配列
Figure 2019516393
を有する32量体オリゴヌクレオチド、アプタマー4の二次構造を示す。図中、配列は、6個のチミンヌクレオチドが端部に付加された状態で示されており、これらのチミンヌクレオチドが、ビオチン分子を付着させるためのスペーサーとして働くことができる。この特定のオリゴは、標的EpCAMに対する高い結合親和性を有する。配列決定されたオリゴのデータベース全体をこのオリゴの二次構造にモデル化することにより、さらなる候補EpCAM結合物質が同定される。図2Bは、図2Aのアプタマーとは異なる二次構造を有する配列
Figure 2019516393
を有するもう一つの32量体オリゴを示す。このアプタマーもまた、6チミンテールを有する状態で示されている。
（図３）標的が特定の疾患と関連するバイオマーカーであるとき、細胞サブトラクション法を使用して標的特異的なアプタマーのセットを生成するプロセスを示す。工程1において、オリゴヌクレオチドのランダムなプールを正常患者由来の生物学的試験試料と接触させる。工程2において、工程1において結合しなかったオリゴを、罹患患者から単離された生物学試料に加える。次いで、この工程からの結合オリゴを溶離させ、そのビオチン結合によって捕捉したのち、再び正常な生物学的試料と合わせる。次いで、非結合オリゴを再び疾患由来生物学的試料に加え、単離する。このプロセスを反復的に繰り返すことができる。最後の溶離アプタマーを患者試料に対して試験して、セットの感度および特異度を計測する。生物学的試料は、血漿もしくは血清を含む血液または循環系の他の成分、たとえば微小胞を含むことができる。
（図４）選択されたアプタマー、たとえば本発明のプロセスによって選択されたアプタマーの標的を同定するための模式図を含む。図は、基体401につながれた結合物質402、ここでは例としてアプタマーを示す。結合物質402は基体401に共有結合していることができる。結合物質402はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質402は、基体に引き寄せられることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン／ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。結合物質402は微小胞404の表面抗原403に結合する。矢印（i）によって示される工程において、微小胞が分断されるが、結合物質402と表面抗原403との複合体は無傷のまま残る。分断された微小胞405は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原403が結合物質402から解放される。表面抗原403を分析してその正体を決定することができる。
（図５）図5A〜5Gは、オリゴヌクレオチドライブラリーを使用して癌試料と非癌試料とを区別する工程を示す。
（図６）銀染色されたSDS-PAGEゲル上に流されるオリゴヌクレオチドプローブのタンパク質標的を示す。
（図７）図7A〜Bは、交差検証のラウンドからのトレーニング（図7A）およびテスト（図7B）セットを使用して生成したモデルを示す。テストセットのAUCは0.803であった。トレーニング（図7C）およびテスト（図7D）セットを用いた交差検証のもう1つの例示的なラウンドが図7C〜Dに示されている。テストセットのAUCは0.678であった。
（図８）マルチパートオリゴヌクレオチド構築物を示す。
（図１８）図18A〜Cは、一本鎖DNA（ssDNA）オリゴヌクレオチドライブラリー調製のためのプロトコルであるSUPRA（SsDNA by Unequal length PRimer Asymmetric PCR）を示す。
（図１０）図10A〜Cは、表現型を特徴決定する方法におけるアプタマーの使用を示す。図10Aは、関心対象の標的を検出および／または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1000である。図中、捕捉アプタマー1002が基体1001に取り付けられている。関心対象の標的1003が捕捉アプタマー1002と結合している。また、検出アプタマー1004が関心対象の標的1003に結合している。検出アプタマー1004は標識1005を有し、この標識を検出すると、捕捉アプタマー1002を介して基体1001に捕捉された標的を同定することができる。図10Bは、表現型を特徴決定するためのアプタマープールの使用を示す模式図1010である。関心対象の標的に対するアプタマーのプールを提供する（1011）。プールを、特徴決定する試料と接触させる（1012）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去する。残るアプタマーを分離させ、捕集する（1013）。捕集したアプタマーを同定し（1014）、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1015）。図10Cは、図10Bの方法の具現化を示す模式図1020である。微小胞集団に結合すると同定されたアプタマーのプールを提供する（1019）。投入試料は、試験試料から単離された（1020）微小胞を含む。プールを、特徴決定すべき単離された微小胞と接触させる（1023）。混合物を洗浄して非結合アプタマーを除去し、残るアプタマーを分離させ、捕集する（1025）。捕集したアプタマーを同定し、保持されたアプタマーの正体を使用して表現型を特徴決定する（1026）。
（図１１）図11A〜Iは、生物学的試料タイプを区別するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの開発および使用を示す。
（図１２）図12A〜Cは、血漿試料に由来する乳癌微小胞と非癌微小胞とを区別するオリゴヌクレオチドに関して均衡設計のナイーブオリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程を示す。
（図１３）オリゴヌクレオチドライブラリーを細胞株に対して富化するための模式図を示す。
（図１４）図14A〜Cは、前立腺癌細胞株によって放出された微小胞（エキソソーム）を認識するオリゴヌクレオチドプローブを示す。
（図１５）図15A〜Eは、HER2+癌試料を認識するオリゴヌクレオチドプローブの同定を示す。
（図１６）図16A〜Fは、トラスツズマブ応答者乳癌試料を区別するオリゴヌクレオチドプローブを示す。
（図１７）図17A〜Pは、トラスツズマブ応答者乳癌組織試料を区別するオリゴヌクレオチドプローブを示す。
（図１８）図18A〜Gは、結腸直腸癌と診断された個体におけるFOLFOX／ベバシズマブ併用療法に対する応答を予測するオリゴヌクレオチドプローブの開発を示す。
（図１９）図19A〜Kは、固定組織試料のオリゴヌクレオチドプローブ染色のバックグラウンド最適化を示す。
（図２０）図20A〜Dは、チューブリン3（TUBB3）陽性および陰性膵臓癌組織試料を区別するオリゴヌクレオチドプローブを示す。
（図２１）図21A〜Bは、卵巣癌と診断された個体における白金／タキサン治療に対する応答を予測するオリゴヌクレオチドプローブの開発を示す。
（図２２）図22A〜Bは、腎組織抗ジゴキシゲニン（DIG）抗体検出に対するオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの富化および染色を示す。
（図２３）図23A〜Dは、固定組織試料からの溶解産物を使用するオリゴヌクレオチドプローブライブラリー富化を示す。
（図２４）図24A〜Bは、固定組織試料からの癌および非癌領域から掻き取られた組織を使用するオリゴヌクレオチドプローブライブラリー富化を示す。
（図２５）図25A〜Bは、固定組織試料のマイクロダイセクションを使用するオリゴヌクレオチドプローブライブラリー富化を示す。
（図２６）図26A〜Bは、癌を治療する場合の利益および利益の欠如がバイオマーカー状態に依存し得る治療物質を示す。
発明の詳細な説明
本発明の1つまたは複数の態様の詳細が以下の詳細な説明に記載される。本明細書において記載されるものに類似する、または等価である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、ここで、好ましい方法および材料を記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は詳細な説明から明らかになる。本明細書中、文脈がそうでないことを明らかに指図しない限り、単数形は複数も含む。別段定義されない限り、本明細書において使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
本明細書において開示されるものは、表現型を特徴決定する、または生物学的試料を評価するために使用することができる組成物および方法である。本発明の組成物および方法は、組織、細胞、微小胞またはそれらのフラグメントを非限定的に含む関心対象の生物学的実体に結合するオリゴヌクレオチドプローブ（アプタマー）の使用を含む。オリゴヌクレオチドアプタマーによって認識される抗原は、タンパク質もしくはポリペプチドまたは任意の他の有用な生物学的成分、たとえば核酸、脂質および／または糖質を含み得る。一般に、開示されるオリゴヌクレオチドは、DNAおよびRNAを含む合成核酸分子ならびにそれらの変種である。別段指定されない限り、オリゴヌクレオチドプローブは、所望により、DNAまたはRNA形態で合成することもできるし、ハイブリッド分子として合成することもできる。本明細書において開示される方法は、本発明の1つまたは複数のアプタマーを使用する診断、予後判定およびセラノーシスプロセスおよび技術を含む。あるいはまた、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、細胞、細胞フラグメント、微小胞または抗原もしくはその機能フラグメントを含む任意の他のフラグメントもしくは複合体を捕捉、単離または富化するための結合物質として使用されることもできる。
本発明の組成物および方法はまた、生物学的試料を評価するために使用することができる個々のオリゴヌクレオチドを含む。本発明はさらに、試料中のバイオシグネチャーを検出するために使用することができるオリゴヌクレオチドプールの組成物および方法を開示する。
本発明の組成物および方法において開示されるオリゴヌクレオチドプローブおよび配列は、本明細書においてはDNAまたはRNAの形態で同定され得る。別段指定されない限り、当業者は、オリゴヌクレオチドが一般に、いずれかの形態の核酸として合成され、様々な化学的修飾を有し、本発明の範囲内にとどまり得るということを理解するであろう。用語「アプタマー」は、特定の抗原へのモノクローナル抗体の結合と同様に、ワトソン-クリック塩基ペアリング以外の機構を通して関心対象の標的に特異的に結合する単一のオリゴヌクレオチドを指すために当技術分野において使用され得る。本開示の範囲内で、明示的に述べられない限り、または文脈において別段暗示されない限り、用語「アプタマー」、「オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチドプローブ」ならびにそれらの変形は、特定の実体が同定されたかどうか、または正確な結合モードが決定されたかどうかにかかわらず、関心対象の生物学的実体（たとえば組織、細胞、微小胞、バイオマーカー）を区別することができるオリゴヌクレオチドを指すために互換可能に使用され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブまたは複数のそのようなプローブはまた、インビトロまたはインビボ検出または画像化を提供し、診断、予後判定またはセラノーシス目的のために診断読み出しを提供するために使用されることもできる。
別に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、治療のために、または細胞、組織、臓器などを特異的に標的とするための治療物質として使用されることもできる。本発明は、特定の組織、細胞、微小胞または関心対象の他の生物学的実体に結合するオリゴヌクレオチドプローブを同定する方法を提供するので、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、そのような実体を標的とし、かつ本質的に、薬物候補物質、標的化薬物送達のために使用することができる作用物質または両方である。
表現型
本明細書に開示されるものは、本発明の方法および組成物を使用して表現型を特徴決定するための生成物およびプロセスである。本明細書において使用される語「表現型」は、本発明の組成物および／または方法を部分的または完全に使用して同定できる任意の特性または特徴を意味することができる。たとえば、表現型は、対象から得られた試料に関して特徴決定されたバイオマーカープロフィールに基づく診断、予後判定またはセラノーシスであることができる。表現型は、任意の観測可能な特徴または特性、たとえば疾患もしくは病状、病期もしくは病状期、疾患もしくは病状に対する感受性、病期もしくは病状の予後、生理学的病状または治療剤に対する応答／潜在的応答であることができる。表現型は、対象の遺伝的構成ならびに環境要因の影響および二つの間の相互作用ならびに核酸配列に対する後成的修飾から生じることができる。
対象における表現型は、対象から生物学的試料を取得し、本発明の組成物および／または方法を使用してその試料を分析することによって特徴決定することができる。たとえば、対象または個体の表現型の特徴決定は、疾患または病状を検出すること（前駆症状早期検出を含む）、疾患または病状の予後、診断またはセラノーシスを判定すること、または疾患または病状の病期または進行を決定することを含むことができる。表現型の特徴決定はまた、特定の疾患、病状、病期および病状期に適切な治療または治療効能を同定すること、疾患進行、特に疾患再発、転移拡散または疾患回帰の予測および尤度分析を含むこともできる。表現型はまた、病状または疾患の臨床的に明確なタイプまたはサブタイプ、たとえば癌または腫瘍であることもできる。表現型決定はまた、生理学的病状の判定または移植後のような臓器窮迫もしくは臓器拒絶反応の評価であることもできる。本明細書に記載される組成物および方法は、個体ベースにおける対象の評価を可能にし、それが、治療におけるより効率的かつ経済的な決定の恩典を提供することができる。
ある局面において、本発明は、疾患または病状の診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供するための、組織、微小胞、および循環バイオマーカーの分析に関する。セラノーシスは、疾患または疾患状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、精密医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から利益を得る可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。したがって、本発明の組成物および方法を使用する分析は、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹患率の犠牲を避け得る。
表現型の評価において、バイオシグネチャーを対象において解析し、治療に応答するかまたは応答しないことが知られている以前の対象のそれに対して比較することができる。バイオシグネチャーは、特定のバイオマーカーを含んでもよく、特定の検出剤、たとえば本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。対象におけるバイオシグネチャーが、治療に応答することが知られている以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する応答者として特徴決定または予測することができる。同様に、対象におけるバイオマーカープロファイルが、治療に応答しなかった以前の対象のバイオマーカープロファイルとより密接に合致するならば、その対象を、その治療に対する非応答者として特徴決定または予測することができる。治療は、本明細書で開示されたものを非限定的に含む任意の適切な疾患、障害または他の病態に対する治療であることができる。
いくつかの態様において、表現型は、表1に記載された疾患または障害を非限定的に含む医学的状態を含む。たとえば、表現型は、腫瘍、新生物または癌の存在またはそれらを発生させる可能性の検出、あるいは、腫瘍、新生物または癌の特徴決定（例えば病期、悪性度、侵攻性、転移または再発の可能性など）を含むことができる。本明細書に記載される方法または組成物によって検出または評価することのできる癌は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、過形成性ポリープ、腺腫、結腸直腸癌、高度異形成、低度異形成、前立腺肥大症、前立腺癌、黒色腫、膵臓癌、脳癌（たとえば神経膠芽腫など）、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、食道癌、消化管間質腫瘍（GIST）、腎細胞癌（RCC）または胃癌を含むが、これらに限定されない。結腸直腸癌はCRCデュークスBまたはデュークスC〜Dであり得る。血液悪性腫瘍は、B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞リンパ腫DLBCL、B細胞リンパ腫DLBCL胚中心様、B細胞リンパ腫DLBCL活性化B細胞様およびバーキットリンパ腫であり得る。
表現型は、前癌状態、たとえば光線角化症、萎縮性胃炎、白板症、紅色肥厚症、リンパ腫様肉芽腫症、前白血病、線維症、頸部異形成、子宮頸部異形成、色素性乾皮症、バレット食道、結腸直腸ポリープまたは悪性腫瘍に発展する可能性がある他の異常な組織増殖もしくは病変であることができる。悪性転換性ウイルス感染症、たとえばHIVおよびHPVもまた、本発明にしたがって評価することができる表現型を提示する。
本発明の組成物および方法によって特徴決定することができる癌は、非限定的に、癌腫、肉腫、リンパ腫もしくは白血病、胚細胞腫、芽細胞腫または他の癌を含むことができる。癌腫は、非限定的に、上皮新生物、扁平上皮新生物、扁平上皮癌腫、基底細胞新生物、基底細胞癌腫、移行上皮乳頭腫および癌腫、腺腫および腺癌腫（腺）、腺腫、腺癌腫、形成性胃組織炎インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ビポーマ、胆管癌腫、肝細胞癌、腺様嚢胞癌腫、虫垂カルチノイド腫、プロラクチノーマ、好酸性顆粒細胞腫、ヒュルトレ細胞腺腫、腎細胞癌腫、グラビッツ腫、多発性内分泌腺腫、子宮内膜腺腫、付属器および皮膚付属器新生物、粘膜表皮新生物、嚢胞、粘液および漿液新生物、嚢胞腺腫、腹膜偽粘液腫、管、小葉および髄質新生物、腺房細胞新生物、複合上皮新生物、ウォーシン腫、胸線腫、特定化生殖腺新生物、性索間質腫、きょう膜腫、顆粒膜細胞腫、男性胚細胞腫、セルトリライディッヒ細胞腫、グロムス腫、傍神経節腫、褐色細胞腫、グロムス腫、母斑および黒色腫、メラノサイト母斑、悪性黒色腫、黒色腫、結節性黒色腫、異形成母斑、悪性黒子黒色腫、表在拡大型黒色腫および悪性末端性ほくろ性黒色腫を含む。肉腫は、非限定的に、アスクン腫瘍、ブドウ状肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、たとえば胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢肉腫、皮膚線維肉腫、デスモイド腫、線維形成性小円形細胞腫、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫を含む。リンパ腫および白血病は、非限定的に、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、B細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（たとえばワルデンストロームのマクログロブリン血症）、脾臓辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、重鎖病、maltリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯B細胞リンパ腫、結節辺縁帯B細胞リンパ腫（nmzl）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型B細胞リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、T細胞前リンパ球性白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、活性NK細胞白血病、成人T細胞白血病／リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫、鼻型腸症型T細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、芽球NK細胞リンパ腫、菌状息肉腫／セザリー症候群、原発性皮膚CD30陽性T細胞リンパ増殖性疾患、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽細胞T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫、不特定の未分化大細胞リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節性硬化症、混合細胞充実度、リンパ球豊富、リンパ球枯渇または非枯渇）および結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫を含む。胚細胞腫は、非限定的に、胚細胞腫、未分化胚細胞腫、精上皮腫、非胚細胞腫、胎児性癌腫、内胚葉洞腫、絨毛癌腫、奇形腫、多胚腫および生殖腺芽細胞腫を含む。芽細胞腫は、非限定的に、腎芽腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫を含む。他の癌は、非限定的に、口唇癌腫、喉頭癌腫、下咽頭癌腫、舌癌腫、唾液腺癌腫、胃癌腫、腺癌腫、甲状腺癌腫（髄様および甲状腺乳頭癌腫）、腎癌腫、腎実質癌腫、子宮頸癌腫、子宮内膜癌腫、子宮内膜癌腫、絨毛癌腫、精巣癌腫、泌尿器癌腫、黒色腫、脳腫瘍、たとえば神経膠芽腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽腫および末梢神経外胚葉性腫瘍、胆嚢癌腫、気管支癌腫、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫を含む。
さらなる態様において、解析される癌は、非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞／大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または固形腫瘍であってもよい。
複数の態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌のいずれかの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
いくつかの態様において、癌は、急性骨髄性白血病（AML）、乳癌、胆管癌、結腸直腸腺癌、肝外胆管腺癌、女性生殖器悪性腫瘍、胃腺癌、食道腺癌、消化管間質腫瘍（GIST）、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、白血病、肝臓肝細胞癌、低悪性度の神経膠腫、肺細気管支肺胞上皮癌（BAC）、肺非小細胞肺癌（NSCLC）、肺小細胞癌（SCLC）、リンパ腫、男性生殖器悪性腫瘍、胸膜の悪性孤立線維性腫瘍（MSFT）、黒色腫、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、結節びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、非上皮性卵巣癌（非EOC）、卵巣表面上皮癌、膵臓腺癌、下垂体癌、乏突起膠腫、前立腺腺癌、後腹膜もしくは腹膜癌、後腹膜もしくは腹膜肉腫、小腸悪性腫瘍、軟部組織腫瘍、胸腺癌、甲状腺癌またはブドウ膜黒色腫を含む。本発明の方法は、これらおよび他の癌を特徴決定するために使用することができる。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される癌の一つの診断、予後判定またはセラノーシスを提供することであることができる。
該表現型はまた、炎症性疾患、免疫疾患、または自己免疫疾患であり得る。例えば、該疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症であり得る。
該表現型はまた、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、または虚血等の心血管疾患を含み得る。該心血管疾患または病態は、高血圧症、狭窄、血管閉塞、または血栓性事象であり得る。
該表現型はまた、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血性再灌流障害（例えば、脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群等の神経系疾患を含み得る。該表現型はまた、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛等の病態であり得る。
該表現型はまた、細菌、ウイルス、または酵母菌感染症等の感染症を含み得る。例えば、該疾患もしくは病態は、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、またはインフルエンザであり得る。HIVまたはHCV様粒子等のウイルスタンパク質は、ウイルスの状態を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。
該表現型はまた、周産期または妊娠に関連した病態（例えば、子癇前症もしくは早産）、鉄代謝に関連する代謝性疾患もしくは病態等の代謝性疾患もしくは病態を含み得る。例えば、ヘプシジンは、鉄分不足を特徴決定するために、小胞中で評価され得る。該代謝性疾患または病態はまた、糖尿病、炎症、または周産期の病態であり得る。
本発明の組成物および方法は、これらならびに他の疾患および障害を特徴決定するために使用され得る。したがって、表現型の特徴決定は、本明細書に開示される疾患および障害のうち1つを非限定的に含む、医学的状態、疾患、または障害の診断、予後判定、またはセラノーシスを提供することであることができる。
対象
対象の1つ以上の表現型を、対象から得られる生体試料を分析することによって決定することができる。対象または患者としては、ウシ、トリ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、または霊長類動物（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）等の哺乳動物を挙げることができるが、これらに限定されない。対象はまた、シベリアトラ等の絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物、ヒトによって消費用に農場で育てられる動物等の経済的に重要な哺乳動物、またはペットとして、または動物園で飼育されている動物等の、ヒトにとって社会的に重要な動物が含まれ得る。このような動物の例としては、ネコおよびイヌ等の肉食動物、ブタ（pig）、雄ブタ、およびイノシシを含むブタ（swine）、ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダ、またはウマ等の反芻動物または有蹄動物が挙げられるが、これらに限定されない。また、絶滅の危機に瀕したトリ、または、動物園で飼育されるトリ、ならびに家禽（fowl）、さらに具体的には、家畜化された家禽、たとえば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ等の家禽類（poultry）も含まれる。また、家畜化されたブタおよびウマ（競争馬を含む）も含まれる。加えて、農業および水産、ならびに他の活動と関係がある動物等の、商業活動と関係がある任意の動物種も含まれ、ここで、疾患のモニタリング、診断、および治療の選択は、経済的生産性および／または食物連鎖の安全性のため、畜産において通常の業務である。
該対象は、癌を非限定的に含む既存の疾患もしくは病態を有し得る。あるいは、該対象は、いかなる既知の既存の病態を有していなくてもよい。該対象はまた、癌の治療等の、現行または過去の治療に対し非応答性であり得る。
試料
本発明の組成物および方法によって使用および／または評価される試料は、非限定的に組織切片、たとえば外科的もしくは他の処置の間に除去された生検材料もしくは組織、体液、検死試料、組織学的目的に採取された凍結切片および細胞培養物を含む、関心対象の表現型を特徴決定するために使用することができる任意の適切な生物学的試料を含む。そのような試料は、血液および血液分画または産物（たとえば血清、バフィーコート、血漿、血小板、赤血球など）、痰、悪性浸出液、頬細胞組織、培養細胞（たとえば初代培養物、外植片および形質転換細胞）、糞便、尿、他の生物学的または体液（たとえば前立腺液、胃液、腸液、腎臓液、肺液、脳脊髄液など）などを含む。試料は、新鮮な凍結ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックである、ホルマリン固定パラフィン包埋されている、またはRNA保存液＋ホルマリン固定液内にある生物学的材料を含むことができる。患者ごとに一つより多いタイプの一つより多い試料を使用することができる。
本明細書に記載される方法において使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料であることができる。FFPE試料は、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、コア針生検材料、悪性液および微細針吸引液（FNA）の一つまたは複数であることができる。ある態様において、固定組織は、手術または生検からの腫瘍含有ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックを含む。もう一つの態様において、非染色スライドは、パラフィンブロックからの非染色荷電アンベークドスライドを含む。もう一つの態様において、骨髄コアまたはクロットはカルシウム除去コアを含む。ホルマリン固定コアおよび／またはクロットはパラフィン包埋されていることができる。さらに別の態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くの、たとえば3〜6個のパラフィン包埋生検試料を含む。18ゲージ針生検を使用することができる。悪性流体は、5×5×2mmの細胞ペレットを生成するのに十分な量の新鮮な胸／腹水を含むことができる。流体は、パラフィンブロック中でホルマリン固定されることができる。ある態様において、コア針生検材料は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはより多くの、たとえば4〜6のパラフィン包埋吸引液を含む。
試料は、当業者によって理解される技術にしたがって処理され得る。試料は、非限定的に、新鮮な、凍結された、または固定された細胞または組織であることができる。いくつかの態様において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織、新鮮な組織または新鮮凍結（FF）組織を含む。試料は、対象試料由来の一次または不死化細胞系を含む培養細胞を含むことができる。試料はまた、対象由来の試料からの抽出物をいうこともできる。たとえば、試料は、組織または体液から抽出されたDNA、RNAまたはタンパク質を含むことができる。そのような目的のために多くの技術および市販のキットが利用可能である。個体由来の新鮮な試料は、さらなる処理、たとえば細胞溶解および抽出の前に、RNAを保存するための薬剤で処理することができる。試料は、他の目的のための捕集された凍結試料を含むことができる。試料は、関連する情報、たとえば年齢、性別および対象中に存在する臨床症候；試料の出所；ならびに試料の捕集および貯蔵の方法と関連させることができる。試料は一般的に対象、たとえばヒト対象から得られる。
生検は、診断または予後評価のために、および組織標本そのものに組織試料を取り出すプロセスを含む。当技術分野において公知の任意の生検技術を本発明の分子プロファイリング法に適用することができる。適用される生検技術は、とりわけ、評価される組織タイプ（たとえば結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血液細胞、肺、乳房など）、腫瘍のサイズおよびタイプ（たとえば固形または懸濁状態、血液または腹水）に依存することができる。代表的な生検技術は、切除生検、切開生検、針生検、外科的生検および骨髄生検を含むが、これらに限定されない。「切除生検」とは、腫瘍塊全体をそれを包囲する正常組織の小さな縁と共に取り出す生検をいう。「切開生検」とは、腫瘍の断面直径を含むくさび状組織の取り出しをいう。本発明は、腫瘍塊の「コア針生検」または概して腫瘍塊内から細胞の懸濁液を得る「微細針吸引生検」を使用可能にできる。生検技術は、たとえばHarrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70およびPart V全体で詳述されている。
概して、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)およびPerbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)およびWatson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York and in Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)ならびに米国特許第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号および第5,272,057号におけるような、当技術分野において公知であり、具体的には説明されない標準的分子生物学的技術が踏襲される。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、概してPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)におけるように実施することができる。
本発明の組成物および方法を用いて評価される生物学的試料は任意の有用な体液または生物学的液体であることができ、たとえば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液（前立腺液を含む）、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、もしくは他の洗浄液、細胞、細胞培養物、または細胞培養上清を含むがこれらに限定されない。生物学的試料はまた、胎児もしくは母体起源であってもよい胚盤胞腔液、臍帯血または母体循環物を含むこともある。生物学的試料はまた、微小胞、循環腫瘍細胞（CTC）、および他の循環バイオマーカーを得ることができる、細胞培養物、組織試料、または生検材料であってもよい。たとえば、関心対象の細胞を培養し、培養物から微小胞を単離することができる。様々な態様において、本明細書に開示されるバイオマーカーまたはより具体的にはバイオシグネチャーは、様々な方法、たとえば血液、血漿、血清または前記生物学的試料のいずれかからの核酸分子の抽出、ポリペプチド（または機能性フラグメント）バイオマーカーを同定するためのタンパク質または抗体アレイの使用ならびに核酸およびポリペプチド分子の同定および評価のための当技術分野において公知の他のアレイ、配列決定、PCRおよびプロテオミック技術を使用して、そのような生物学的試料から直接評価することができる（たとえば、核酸もしくはポリペプチドバイオマーカーまたはそれらの機能性フラグメントの存在またはレベルの同定）。加えて、そのような試料中に存在する1つまたは複数の成分をまず単離または富化して、選択されたバイオマーカーの存在またはレベルを評価するため、所与のバイオシグネチャーを評価するために、さらに処理することができる。（例えば、微小胞を試料から単離した後に、タンパク質および/または核酸バイオマーカーに関してプロファイリングする）。
表1は、本発明の方法による解析のために使用され得る、疾患、病態または生物学的状態と対応する生物学的試料との非限定的なリストを示す。
（表１）様々な疾患、病態または生物学的状態に対する生物学的試料の例
Figure 2019516393
Figure 2019516393
本発明の方法は、血液試料または血液由来物を使用して表現型を特徴決定するために使用することができる。血液由来物は血漿および血清を含む。血漿は、全血の液体成分であり、全血量の約55％までを構成する。血漿は、主に水ならびに小量のミネラル、塩、イオン、栄養素および溶解状態のタンパク質で構成されている。全血中、赤血球、白血球および血小板が血漿内に懸濁している。血清とは、フィブリノーゲンまたは他の凝固因子を有しない血漿（すなわち、全血から血球および凝固因子を差し引いたもの）をいう。
生物学的試料は、該試料の解析を実施しない当事者のような第三者を通して得ることができる。たとえば、試料は、試料が由来する対象の臨床医、医師または他の健康管理者を通して得ることができる。または、生物学的試料は、該試料を解析する同じ当事者によって得ることもできる。加えて、アッセイされる生物学的試料は、保管（たとえば凍結）されるか、または他の様式で保存条件下に貯蔵される。
様々な態様において、生物学的試料は、起始細胞に由来しかつ対象の生物学的液体において細胞外でまたは細胞外環境で利用可能である、微小胞または細胞膜断片を含む。本発明の方法は、一つまたは複数のそのような微小胞を評価する工程、例えばその集団を評価する工程を含んでもよい。本明細書において使用される小胞または微小胞とは、細胞から流出した膜小胞である。小胞または膜小胞は、非限定的に、循環微小胞（cMV）、微小胞、エキソソーム、ナノ小胞、デキソソーム、ブレブ、小水疱、プロスタソーム、微粒子、内腔内小胞、膜フラグメント、内腔内エンドソーム小胞、エンドソーム様小胞、エキソサイトーシスビヒクル、エンドソーム小胞、エンドソーマル小胞、アポトーシス体、多胞体、分泌小胞、リン脂質小胞、リポソーム小胞、アルゴソーム、テキサソーム、セクレソーム、トレロソーム、メラノソーム、オンコソームまたはエキソサイトーシスビヒクルを含む。さらに、小胞は、様々な細胞プロセスによって産生され得るが、本発明の方法は、そのような小胞が生物学的試料中に存在し、本明細書に開示される方法によって特徴決定することができる限り、任意の一つの機構に限定されない、または依存しない。断りない限り、ある種の小胞を使用する方法を他の種類の小胞に適用することができる。小胞は、ペイロードとも呼ばれる可溶性成分を含むことができる内部区画を包囲する細胞膜に類似した脂質二重層を有する球形構造を含む。いくつかの態様において、本発明の方法は、直径約40〜100nmの小さな分泌小胞であるエキソソームを使用する。種類および特徴の決定を含む膜小胞の考察に関しては、Thery et al., Nat Rev Immunol. 2009 Aug; 9(8):581-93を参照すること。様々な種類の小胞のいくつかの性質は表2におけるものを含む。
（表２）小胞の性質
Figure 2019516393
略号:ホスファチジルセリン（PPS）、電子顕微鏡（EM）
小胞は、原形質膜または内部膜に由来する流出膜結合粒子または「微粒子」を含む。小胞は、細胞から細胞外環境に放出され得る。小胞を放出する細胞は、非限定的に、外胚葉、内胚葉または中胚葉から生じるかまたはそれらに由来する、細胞を含む。細胞は、遺伝子的、環境的および／または他の変動または変更を有することもある。たとえば、細胞は腫瘍細胞であり得る。小胞は、ソース細胞における任意の変化を反映し、それにより、発生する細胞、たとえば様々な遺伝子突然変異を有する細胞における変化を反映することができる。一つの機構において、小胞は、細胞膜のセグメントが自発的に陥入し、最終的に開口分泌されるとき、細胞内に生成される（たとえば、Keller et al., Immunol. Lett. 107(2):102-8 (2006)を参照すること）。小胞はまた、原形質膜の部分の脱出膨出（ブレブ形成）分離および封止から生じるか、または腫瘍起源の種々の膜結合タンパク質を含有する任意の細胞内膜に画定された小胞構造の輸送から生じる、脂質二重膜によって画定された細胞由来構造も含み、これには、腫瘍由来マイクロRNAまたは細胞内タンパク質を非限定的に含む、小胞内腔中に含有される分子とともに腫瘍由来タンパク質に選択的に結合する宿主循環に由来する表面結合分子を含む。ブレブおよびブレブ形成は、Charras et al., Nature Reviews Molecular and Cell Biology, Vol. 9, No. 11, p. 730-736 (2008)にさらに記載されている。腫瘍細胞から循環または体液中に流出した小胞は「腫瘍由来循環小胞」と呼ばれることもある。そのような小胞がエキソソームである場合、それは腫瘍由来循環エキソソーム（CTE）と呼ばれることもある。場合によっては、小胞は、特定の起始細胞に由来することもできる。CTEは一般に、起始細胞特異的小胞と同様に、ときには特異的な様式で、たとえば体液からのCTEまたは起始細胞特異的小胞の単離を可能にする一つまたは複数の固有のバイオマーカーを有する。たとえば、細胞または組織特異的マーカーは、起始細胞を同定するために使用される。そのような細胞または組織特異的マーカーの例は本明細書に開示されており、さらに、bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/で入手可能なTissue-specific Gene Expression and Regulation（TiGER）データベース、Liu et al. (2008) TiGER: a database for tissue-specific gene expression and regulation. BMC Bioinformatics. 9:271、genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.htmlで入手可能なTissueDistributionDBsにおいてアクセスすることもできる。
小胞は、約10nm、20nmまたは30nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1500nm、2000nmよりも大きい、または10,000nmよりも大きい直径を有することができる。小胞は、約20〜2000nm、約20〜1500nm、約30〜1000nm、約30〜800nm、約30〜200nmまたは約30〜100nmの直径を有することができる。いくつかの態様において、小胞は、10,000nm、2000nm、1500nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm未満または10nm未満の直径を有する。本明細書において数値に関して使用される「約」という用語は、その数値の上下10％の変動が、指定された値に帰される範囲内であることを意味する。様々な種類の小胞の一般的なサイズが表2に示されている。小胞を評価して、一つの小胞またはいくつかの小胞の直径を計測することができる。たとえば、小胞集団の直径の範囲または小胞集団の平均直径を測定することができる。小胞直径は、当技術分野において公知の方法、たとえば電子顕微鏡法のような画像化技術を使用して評価することができる。ある態様において、一つまたは複数の小胞の直径は、光学粒子検出を使用して測定される。たとえば、「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月6日発行の米国特許第7,751,053号および「Optical Detection and Analysis of Particles」と題する2010年7月15日発行の米国特許第7,399,600号を参照すること。
いくつかの態様において、本発明の方法は、たとえば、生物学的試料の事前の単離、精製または濃縮なしに生物学的試料において、小胞を直接評価する工程を含む。たとえば、試料中の小胞の量それ自体が、診断、予後判定またはセラノーシス用の決定を提供するバイオシグネチャーを提供することができる。または、試料中の小胞は、解析の前に試料から単離、捕捉、精製または濃縮することもできる。前記のように、本明細書において使用される単離、捕捉または精製は、試料中の他の成分からの、部分的単離、部分的捕捉または部分的精製を含む。小胞単離は、本明細書に記載されるような様々な技術、たとえばクロマトグラフィー、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面またはビーズへの）および／またはマイクロ流体工学を使用して実施することができる。図10B〜Cは、アプタマープールを用いて微小胞を評価するための本発明の方法の概要を示す。
小胞特徴を参照と比較することによって表現型特徴決定を提供するために、エキソソームのような小胞を評価することができる。いくつかの態様においては、小胞の表面抗原が評価される。表面抗原は、小胞の解剖学的起源および／または細胞ならびに他の表現型情報、たとえば腫瘍の状態の指標を提供することができる。たとえば、患者試料、たとえば血液、血清または血漿のような体液中に見られる小胞は、結腸直腸起源および癌の存在を示す表面抗原に関して評価される。表面抗原は、表面タンパク質、脂質、糖質および他の膜成分を非限定的に含む、小胞膜表面上で検出することができる、情報をもたらす任意の生物学的実体を含み得る。たとえば、腫瘍抗原を発現する結腸由来の小胞の陽性検出は、患者が結腸直腸癌を有していることを示すことができる。このように、本発明の方法を使用して、たとえば、対象から得られた一つまたは複数の小胞の疾患特異的および細胞特異的バイオマーカーを評価することにより、解剖学的または細胞起源と関連する任意の疾患または病態を特徴決定することができる。
もう一つの態様において、本発明の方法は、表現型特徴決定を提供するために一つまたは複数の小胞ペイロードを評価する工程を含む。小胞のペイロードは、小胞内に封じ込められた状態で検出することができる情報をもたらす任意の生物学的実体を含み、タンパク質および核酸、たとえばゲノムもしくはcDNA、mRNAまたはそれらの機能性フラグメントおよびマイクロRNA（miR）を非限定的に含む。加えて、本発明の方法は、小胞表面抗原（小胞ペイロードに加えて、またはそれを除いて）を検出して表現型特徴決定を提供することに関する。たとえば、小胞は、小胞表面抗原に特異的である結合物質（たとえば抗体またはアプタマー）を使用して特徴決定することができ、結合した小胞をさらに評価して、本明細書に開示される一つまたは複数のペイロード成分を同定することができる。本明細書に記載されるように、関心対象の表面抗原または関心対象のペイロードを有する小胞のレベルを参照と比較して表現型を特徴決定することができる。たとえば、試料中の癌関連表面抗原または小胞ペイロード、たとえば腫瘍関連mRNAまたはマイクロRNAの、参照に比べた場合の過剰発現は、その試料中の癌の存在を示すことができる。評価されるバイオマーカーは、所望の標的試料の選択および所望の参照試料と標的試料との比較に基づいて、存在しても存在しなくてもよく、増加していても減少していてもよい。標的試料の非限定的な例は、疾患、治療／非治療、長期的研究におけるような様々な時点を含み、参照試料の非限定的な例は、非疾患、正常、様々な時点および候補治療に対する感受性または耐性を含む。
診断方法
本発明のアプタマーは、生物学的試料中のバイオマーカー、たとえば、タンパク質、核酸または微小胞のような関心対象の生物学的実体の存在またはレベルを評価するための様々な方法において使用することができる。生物学的実体は、より大きな実体、たとえば複合体、細胞、もしくは組織の一部であることができ、または、体液中で循環することができる。アプタマーは、標的分子の存在またはレベルを評価するために使用され得る。したがって、診断、予後判定またはセラノーシスに関する本発明の様々な態様において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、本発明の1種または複数種のアプタマーを、選択された生物学的試料と接触させ、1種または複数種のアプタマーがその標的分子と結合する、リガンド-標的ベースのアッセイにおいて構成される。本発明のアプタマーは、評価される生物学的試料および検出されるバイオマーカーに基づいて候補バイオシグネチャーを同定するために使用される。いくつかの態様において、アプタマーもしくはオリゴヌクレオチドプローブ、またはそれらのライブラリーは、それ自体が特定の病状または疾患のバイオシグネチャーを提供し得る。バイオシグネチャーとは、1種または複数種の関心対象のバイオマーカーの存在、レベルまたは評価することができる他の特徴（非限定的に、配列、突然変異、再配列、転座、欠失、後成的修飾、メチル化、翻訳後修飾、対立遺伝子、活性、複合体パートナー、安定性、半減期などを含む）を含む生物学的試料のバイオマーカープロフィールをいう。バイオシグネチャーは、診断および／または予後判定基準、たとえば疾患の存在、病期決定、疾患モニタリング、疾患層別化または疾患の検出、転移もしくは再発もしくは進行の監視を評価するために使用することができる。たとえば、微小胞表面抗原に対するアプタマーを使用する本発明の方法は、微小胞抗原を含むバイオシグネチャーを、選択された病状または疾患と相関させるのに有用である。別の例として、組織に対するアプタマーを使用する本発明の方法は、組織抗原を含むバイオシグネチャーを、選択された病状または疾患と相関させるのに有用である。バイオシグネチャーはまた、治療介入を含む治療モダリティに関する決定を下す際に臨床的に使用することもできる。バイオシグネチャーはさらに、手術を実施するかどうか、または手術と共にどの治療標準を使用すべきかを含む治療の決定を下すために臨床的に使用することもできる（たとえば術前または術後に）。説明のための例として、循環バイオマーカーまたは固定組織上に提示されたバイオマーカーのバイオシグネチャーは、侵攻型の癌を示し得、かつ、患者を治療するために、より積極的な外科処置および／またはより積極的な治療計画を必要とし得る。
表現型を特徴決定する工程、たとえば診断、予後判定またはセラノーシスを提供する工程は、バイオシグネチャーを参照と比較する工程を含み得る。たとえば、罹患状態におけるバイオマーカーのレベルは、疾患を有しない、または異なる疾患状態を有する参照対照に比べて増加または減少し得る。本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、特定の表現型を検出し、別の表現型を検出しないように操作され得る。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、イムノアッセイを使用して癌組織を染色し得るが、非癌参照組織を染色し得ない。あるいはまた、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、イムノアッセイを使用して癌組織を非癌参照組織よりも高い検出可能レベルで染色し得る。また、当業者は、イムノアッセイを使用して非癌組織を癌組織よりも高い検出可能レベルで染色するようにオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを操作し得ることを理解するであろう。
バイオシグネチャーは、本発明に開示される任意の方法において、たとえば、対象が、罹患しているかどうか、疾患を発症する危険にあるかどうかを評価する、または疾患の病期もしくは進行を評価するために使用することができる。たとえば、バイオシグネチャーを使用して、対象が、前立腺癌、結腸癌または本明細書に記載される他の癌を有するかどうかを評価することができる。たとえば、「表現型」と名付けられた項を参照されたい。さらに、バイオシグネチャーを使用して、癌のような疾患または病状の病期を決定することができる。
微小胞を含むバイオシグネチャー／バイオマーカープロフィールは、微小胞内のペイロードの評価を含むことができる。たとえば、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して微小胞集団を捕捉し、それにより、微小胞抗原の読み出しを提供したのち、捕捉された微小胞内のペイロード内容物を評価し、それにより、ペイロード内容物のさらなるバイオマーカー読み出しを提供することができる。
表現型を特徴決定するためのバイオシグネチャーは、任意の数の有用な基準を含み得る。本明細書において使用される語「表現型」は、バイオシグネチャー／バイオマーカープロフィールに帰される任意の特性または特徴を意味することができる。表現型は、本発明の組成物および／または方法を使用して部分的または全体的に検出または同定することができる。いくつかの態様においては、バイオマーカーごとに少なくとも一つの基準が使用される。いくつかの態様においては、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90または少なくとも100の基準が使用される。たとえば、癌を特徴決定する場合、対象を癌と診断するとき、多数の異なる基準を使用することができる：1）対象由来の試料中のバイオマーカーの量が基準値よりも高い場合；2）特定の細胞型もしくは特定の微小胞（たとえば、特定の組織または臓器に由来する微小胞）内のバイオマーカーの量が基準値よりも高い場合；または3）1種または複数種の癌特異的バイオマーカーを有する細胞、組織、もしくは微小胞内のバイオマーカーの量が基準値よりも高い場合。バイオマーカーの量が基準以下である場合にも、同様な規則を適用することができる。方法はさらに、試料が品質管理尺度を満たす場合に対象に関する結果が提供されるような品質管理尺度を含むことができる。いくつかの態様において、基準は満たされるが、品質管理が疑わしい場合、対象は再評価される。
バイオシグネチャーは、治療関連の診断において、疾患を診断するのに有用な試験を提供する、または正しい治療計画を選択する、たとえばセラノーシスを提供するために使用することができる。セラノーシスは、罹患状態の治療法または治療に影響する能力を提供する診断試験を含む。セラノーシス試験は、診断または予後判定試験がそれぞれ診断または予後判定を提供するのと同様なやり方でセラノーシスを提供する。本明細書において使用されるセラノーシスは、予測的医療、個別化医療、統合医療、薬理診断学およびDx/Rxパターニングを含む、任意の所望の形態の治療関連の試験を包含する。治療関連の試験は、個々の対象における薬物応答を予測および評価する、すなわち、個別化医療を提供するために使用することができる。薬物応答の予測は、たとえば対象が暴露される、または他のやり方で治療される前にその対象が候補治療物質に対して応答者である可能性が高いのか、非応答者である可能性が高いのかを決定することであることができる。薬物応答の評価は、薬物に対する応答をモニターすること、たとえば治療の開始後、時間経過と共に対象の改善またはその欠如をモニターすることであることができる。治療関連の試験は、治療から利益を得る可能性が特に高い対象をその治療に選択する、または個々の対象において治療効能の早期的かつ客観的指示を提供するのに有用である。このように、本明細書に開示されるバイオシグネチャーは、より有望な治療を選択するために治療を変更すべきであることを示し、それにより、有益な治療を遅らせる多大な損失を避け、効果のない薬物を投与する金銭的および罹患率の犠牲を避け得る。
本発明の組成物および方法は、非限定的に心血管疾患、癌、感染症、敗血症、神経学的疾患、中枢神経系関連の疾患、血管内関連の疾患および自己免疫関連の疾患を含む様々な疾患および障害と関連するバイオシグネチャーを同定または検出するために使用することができる。治療関連の診断はまた、薬物毒性、薬物耐性または薬物応答の予測に役立つ。治療関連の試験は、非限定的にたとえば免疫組織化学的試験、臨床化学、イムノアッセイ法、細胞ベースの技術、核酸試験または全身画像化法を含む任意の適当な診断試験形式において展開されてもよい。治療関連の試験はさらに、治療の決定を支援する試験、治療毒性をモニターする試験または治療に対する応答の試験を含むことができるが、これらに限定されない。したがって、バイオシグネチャーを使用して、治療に対する対象の応答を予測またはモニターすることができる。バイオシグネチャーは、特定の治療を開始、排除または変更した後の様々な時点で対象ごとに判定することができる。
いくつかの態様において、本発明の組成物および方法は、バイオシグネチャーの1種または複数種の成分（たとえば、関心対象のバイオマーカー）の量の変化、特定のバイオシグネチャーの1種または複数種の成分の量または成分に関して検出されるバイオシグネチャーに基づいて下される、対象が治療に応答しているかどうかの決定または予測を提供する。もう一つの態様において、対象の病状は、様々な時点でバイオシグネチャーを判定することによってモニターされる。病状の進行、後退または再発が判定される。また、時間経過と共に治療に対する応答を計測することもできる。したがって、本発明は、対象由来の生物学的試料からバイオシグネチャーを単離または検出する工程、特定のバイオシグネチャーの成分の全量を検出する工程、または1種または複数種の成分のバイオシグネチャー（たとえばバイオマーカーの存在、非存在または発現レベル）を検出する工程を含む、対象における疾患または他の病状の状態をモニターする方法を提供する。バイオシグネチャーは、疾患または病状の状態をモニターするために使用される。
また、1種または複数種の新規なバイオシグネチャーを本発明の方法によって同定することもできる。たとえば、ある薬物治療または治療計画に応答する対象から1種または複数種の小胞を単離し、それを基準、たとえばその薬物治療または治療計画に応答しない別の対象と比較することができる。バイオシグネチャー間の差を判定し、使用して、他の対象を、特定の薬物または治療計画に対する応答者または非応答者として同定することができる。
いくつかの態様において、バイオシグネチャーは、特定の疾患または病状が薬物に耐性であるかどうかを判定するために使用され、該疾患または病状が薬物耐性であるならば、医師は、そのような薬物治療のせいで貴重な時間を無駄にする必要はない。薬物選択または治療計画の早期確認を得るために、対象から得られた試料に関してバイオシグネチャーが判定される。そのバイオシグネチャーを使用して、特定の対象の疾患が薬物耐性と関連したバイオマーカーを有するかどうかを評価する。そのような判定は、医師が重要な時間および患者の財源を有効な治療に充てることを可能にする。
バイオシグネチャーは、疾患、たとえば癌のセラノーシスに、たとえば、疾患を患う対象が特定の治療に対して応答者である可能性が高いのか非応答者である可能性が高いのかを同定することに、使用可能である。本方法は、本明細書中、たとえば本明細書の「表現型」の項で列挙されたものを非限定的に含む癌のセラノーシスに使用することができる。癌は、非限定的に、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌（小細胞癌腫（燕麦細胞癌）、混合小細胞／大細胞癌腫および複合小細胞癌腫を含む）、結腸癌、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、黒色腫、骨癌、胃癌、乳癌、神経膠腫、神経膠芽腫、肝細胞癌腫、乳頭状腎臓癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫または他の固形腫瘍を含む。
癌を患う対象由来の試料中の生物学的試料（たとえば細胞、細胞フラグメント、細胞由来微小胞）中に存在する成分と結合したマーカーを含む循環バイオマーカーのバイオシグネチャーは、対象のための候補治療を選択するために使用することができる。バイオシグネチャーは、本明細書に提示される発明の方法にしたがって判定することができる。いくつかの態様において、候補治療は癌のための標準治療を含む。治療は、癌治療、たとえば放射線、外科手術、化学療法またはそれらの組み合わせであることができる。癌治療は、抗癌剤のような治療剤および化学療法計画であることができる。本発明の態様において使用されるさらなる薬物関連および規則は、その全文がそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる、2007年5月18日出願のPCT/US2007/69286、2009年10月14日出願のPCT/US2009/60630、2010年2月11日出願のPCT/2010/000407、2012年6月7日出願のPCT/US12/41393、2013年12月4日出願のPCT/US2013/073184、2010年10月27日出願のPCT/US2010/54366、2011年12月28日出願のPCT/US11/67527、2015年1月29日出願のPCT/US15/13618、および、2016年3月3日出願のPCT/US16/20657に見られる。
バイオマーカー
本発明の方法および組成物は、一つまたは複数の関心対象のバイオマーカーの存在またはレベルを検出するためのアッセイにおいて使用することができる。本発明の順応可能な性質が与えられるので、バイオマーカーは、本明細書もしくは学術論文に開示されるもの、または将来発見されるものを含む、任意の有用なバイオマーカーであることができる。ある態様において、バイオマーカーはタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。バイオマーカーは、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような、DNA、RNAおよびそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。バイオマーカーは脂質を含むことができる。バイオマーカーは糖質を含むことができる。バイオマーカーはまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは微小胞を含む。ある態様において、本発明は、アプタマーのプールを使用して、プールの各メンバーによって標的化される正確な微小胞抗原を知ることなく、関心対象の微小胞集団の存在および／またはレベルを評価する方法を提供する。たとえば図10B〜Cを参照すること。他の場合、微小胞と結合したバイオマーカーが本発明の方法にしたがって評価される。たとえば図10Aを参照すること。本発明のオリゴヌクレオチドプールを使用して、個々のオリゴヌクレオチドアプタマーの標的バイオマーカーが既知であるかどうか、細胞および組織を評価することもできる。本発明は、そのようなオリゴヌクレオチドアプタマープールおよびそのメンバーの標的を決定することをさらに含む。実施例19〜31を参照すること。
バイオシグネチャーは、一つのタイプのバイオマーカーまたは複数のタイプのバイオマーカーを含んでもよい。非限定的な例として、バイオシグネチャーは、複数のタンパク質、複数の核酸、複数の脂質、複数の糖質、複数のバイオマーカー複合体、複数の微小胞またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。たとえば、バイオシグネチャーは、1種または複数種の微小胞、1種または複数種のタンパク質および1種または複数種のマイクロRNAを含み得、その場合、1種または複数種のタンパク質および／あるいは1種または複数種のマイクロRNAは、場合によっては適宜、表面抗原および／またはペイロードとして微小胞と結合している。別の例として、バイオシグネチャーはオリゴヌクレオチドプールシグネチャーであってよく、オリゴヌクレオチドプールのメンバーは、様々なバイオマーカーまたは複数種類のバイオマーカーに結合することができる。
いくつかの態様において、微小胞は、小胞表面抗原を使用して検出される。一般的に発現される小胞表面抗原は、「ハウスキーピングタンパク質」または一般的小胞バイオマーカーと称され得る。バイオマーカーは、CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、アネキシンV、またはMFG-E8であってよい。四つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質のファミリーであるテトラスパニンを一般的小胞バイオマーカーとして使用することができる。テトラスパニンはCD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9およびCD63を含む。TSPAN1（TSP-1）、TSPAN2（TSP-2）、TSPAN3（TSP-3）、TSPAN4（TSP-4、NAG-2）、TSPAN5（TSP-5）、TSPAN6（TSP-6）、TSPAN7（CD231、TALLA-1、A15）、TSPAN8（CO-029）、TSPAN9（NET-5）、TSPAN10（オキュロスパニン）、TSPAN11（CD151様）、TSPAN12（NET-2）、TSPAN13（NET-6）、TSPAN14、TSPAN15（NET-7）、TSPAN16（TM4-B）、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20（UP1b、UPK1B）、TSPAN21（UP1a、UPK1A）、TSPAN22（RDS、PRPH2）、TSPAN23（ROM1）、TSPAN24（CD151）、TSPAN25（CD53）、TSPAN26（CD37）、TSPAN27（CD82）、TSPAN28（CD81）、TSPAN29（CD9）、TSPAN30（CD63）、TSPAN31（SAS）、TSPAN32（TSSC6）、TSPAN33およびTSPAN34を含む、哺乳動物において同定された30種類超のテトラスパニンが存在する。他の一般的に認められた小胞マーカーは、表3に記載されたものを含む。1つまたは複数のこれらのタンパク質は、本発明の方法および組成物を使用した表現型の特徴決定のために有用なバイオマーカーであり得る。
（表３）複数の細胞型由来の微小胞中に認められるタンパク質
Figure 2019516393
本明細書に記載されるタイプのバイオマーカーのいずれかを本方法および本組成物によって使用および／または評価することができる。例示的なバイオマーカーは非限定的に表4におけるバイオマーカーを含む。マーカーは、自由に循環している、または他の生物学的分子との複合体であることができるタンパク質、RNA、またはDNAとして適宜検出することができる。所望のように、表4におけるマーカーはまた、腫瘍組織を検出するために、または、本明細書に開示されるような表現型の特徴決定のための小胞の捕捉および／もしくは検出に、使用することもできる。いくつかの場合、複数の捕捉および／または検出物質を使用して特徴決定を増強する。マーカーは、小胞表現抗原および／または小胞ペイロードとして検出することができる。「例示的クラス」は、マーカーが既知のマーカーであるところの適応症を示す。当業者は、特定の場合、マーカーを代替設定において使用することもできることを理解するであろう。たとえば、一つのタイプの疾患を特徴決定するために使用することができるマーカーを、適宜、別の疾患を特徴決定するために使用してもよい。様々な系統の腫瘍のバイオマーカーとして使用することができる腫瘍マーカーの非限定的な例を考えてみる。表3および4におけるまたは本明細書全体を通じたバイオマーカー参考例は、当技術分野において一般に使用されているものである。遺伝子の別名および記述は、GeneCards（登録商標）（www.genecards.org）、HUGO Gene Nomenclature（www.genenames.org）、Entrez Gene（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene）、UniProtKB/Swiss-Prot（www.uniprot.org）、UniProtKB/TrEMBL（www.uniprot.org）、OMIM（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM）、GeneLoc（genecards.weizmann.ac.il/geneloc/）およびEnsembl（www.ensembl.org）を含む多様なオンラインデータベースを使用して見いだすことができる。概して、以下の遺伝子記号および名称は、HUGOによって承認されたものに対応し、タンパク質名は、UniProtKB/Swiss-Protによって推奨されるものである。また、一般的な代替が提供されている。タンパク質名が前駆体を示す場合、その成熟タンパク質が同じく暗示される。本出願を通じて、遺伝子およびタンパク質記号は互換可能に使用され得、意味は、必要に応じて文脈から導き出すことができる。
（表４）例示的なバイオマーカー
Figure 2019516393
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Figure 2019516393
Figure 2019516393
Figure 2019516393
本発明の方法および組成物に組み込むことができるさらなるバイオマーカーの例は、非限定的に、その全文がそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる、2009年10月30日に出願された国際特許出願PCT/US2009/62880、2009年11月12日に出願されたPCT/US2009/006095、2011年3月1日に出願されたPCT/US2011/26750、2011年4月6日に出願されたPCT/US2011/031479、2011年8月18日に出願されたPCT/US11/48327、2008年7月25日に出願されたPCT/US2008/71235、2010年11月30日に出願されたPCT/US10/58461、2011年1月13日に出願されたPCT/US2011/21160、2013年3月11日に出願されたPCT/US2013/030302、2012年2月17日に出願されたPCT/US12/25741、2008年9月12日に出願されたPCT/2008/76109、2012年6月14日に出願されたPCT/US12/42519、2012年8月8日に出願されたPCT/US12/50030、2012年8月3日に出願されたPCT/US12/49615、2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41387、2013年11月26日に出願されたPCT/US2013/072019、2013年5月28日に出願されたPCT/US2014/039858、2013年10月23日に出願されたPCT/IB2013/003092、2013年12月19日に出願されたPCT/US13/76611、2014年8月28日に出願されたPCT/US14/53306、および2015年11月23日に出願されたPCT/US15/62184、2016年6月29日に出願されたPCT/US16/40157、2016年7月28日に出願されたPCT/US16/44595、ならびに2016年3月9日に出願されたPCT/US16/21632に開示されているものを含む。
本発明の様々な態様において、本明細書に開示される病状または疾患のいずれかを検出または評価するために使用されるバイオマーカーまたはバイオシグネチャーは、いくつかの異なるマーカーカテゴリーの一つに入る一つまたは複数のバイオマーカーを含むことができ、その場合、カテゴリーは、非限定的に、1）疾患特異的バイオマーカー；2）細胞または組織特異的バイオマーカー；3）小胞特異的バイオマーカー（たとえば一般的小胞バイオマーカー）；4）血管形成特異的バイオマーカー；および5）免疫調節バイオマーカーの、一つまたは複数を含む。全てのそのようなマーカーの例が本明細書に開示され、当業者に公知である。さらには、特定の疾患または病状において役割を有することが特徴として決定されている当技術分野において公知のバイオマーカーを、本発明の組成物および方法における標的としての使用に適合させることもできる。さらなる態様において、そのような関心対象のバイオマーカーは、細胞表面マーカーまたは小胞表面バイオマーカーであってもよく、表面マーカーと可溶性マーカーもしくはペイロードマーカー（たとえば、微小胞によって包囲された分子）との組み合わせであってもよい。評価されるバイオマーカーは、供給源の組み合わせに由来することができる。たとえば、疾患または障害は、タンパク質、核酸、小胞、循環バイオマーカー、組織試料由来のバイオマーカーなどの組み合わせを評価することによって検出または特徴決定され得る。加えて、本明細書に記されるように、評価される生物学的試料は、任意の生物学的流体であることもできるし、またはそのような生物学的流体内に存在する個々の成分（たとえば小胞、核酸、タンパク質またはそれらの複合体）を含むことができる。
バイオマーカー検出
本発明の組成物および方法は、生物学的試料と関連する表現型を特徴決定するために生物学的試料中の任意の有用なバイオマーカーを評価するために使用することができる。そのようなバイオマーカーは、すべての種類の生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質、それらのいずれかの複合体および微小胞を含む。
本発明のアプタマーは、組織または体液中のバイオシグネチャーを、たとえばそれらの内部の様々なバイオマーカーを評価することにより提供するために使用することができる。たとえば図10B〜Cを参照すること。本発明のアプタマーはまた、それらの特異的標的分子のレベルまたは存在を評価するために使用することもできる。たとえば図10Aを参照すること。加えて、本発明のアプタマーは、存在するアプタマーの標的分子を有する生物学的試料中に存在する成分を捕捉または単離するために使用される。たとえば、所与の表面抗原が細胞、細胞フラグメントまたは細胞由来細胞外小胞上に存在する場合、非限定的に本発明によって提供されるアプタマーを含む、バイオマーカーへの結合物質は、細胞、細胞フラグメントまたは細胞由来細胞外小胞を捕捉または単離するために使用されてもよい。たとえば図1A〜B、10Aを参照すること。そのような捕捉または単離された実体をさらに特徴決定して、さらなる表面抗原または内部「ペイロード」分子、たとえば、核酸分子、脂質、糖、ポリペプチドもしくはそれらの機能性フラグメントまたはバイオマーカーとして使用され得る、細胞環境中に存在する他の何か）を評価してもよい。したがって、本発明のアプタマーは、関心対象の1種または複数種の表面抗原を評価するためだけでなく、生物学的試料中に存在する成分を分離するためにも使用され、その場合、その成分そのものがバイオシグネチャーに含まれることができる。
本発明の方法は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、またはそれ以上の異なるバイオマーカーの多重化分析を含むことができる。たとえば、オリゴヌクレオチドプールは、異なるバイオマーカーを標的とすることができる任意の数の個々のアプタマーを含み得る。別の例として、示差的に標識された複数の粒子を用いて、アッセイを実施することができる。少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100個の示差的に標識された粒子があることができる。粒子は、たとえばタグにより、外部的に標識されてもよいし、または内在的に標識されてもよい。示差的に標識された各粒子を捕捉物質、たとえば抗体またはアプタマーに結合させることができ、かつ、その標的を捕捉するために用いることができる。関心対象の表現型を特徴決定するために、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞特異的バイオマーカーおよび疾患バイオマーカーに対する捕捉物質を含む複数の捕捉物質を選択することができる。1種または複数種の捕捉されたバイオマーカーを複数の結合物質によって検出することができる。結合物質は、検出を容易にするために直接標識されることができる。または、結合物質は二次的物質によって標識される。たとえば、結合物質は、バイオマーカーに対する抗体またはアプタマーであり得、その場合、結合物質はビオチンに結合する。二次的物質は、レポーターに結合したストレプトアビジンを含み、かつバイオマーカーを検出するために添加されることができる。いくつかの態様において、捕捉された小胞は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75または100の異なるバイオマーカーに関してアッセイされる。たとえば、複数の検出物質、すなわち、捕捉された小胞または小胞集団の複数のバイオマーカーの検出は、得られるシグナルを増大させて、感度、特異度または両方の増大およびより少量の試料の使用を可能にすることができる。検出は、非限定的に表3〜4および表10〜17のいずれかに示すような一つより多い小胞マーカーを含む一つより多いバイオマーカーを用いて実施することができる。
イムノアッセイベースの方法（たとえばサンドイッチアッセイ法）を使用して、関心対象のバイオマーカーを検出することができる。例はELISA法を含む。結合物質をウェルに結合することができる。たとえば、関心対象のバイオマーカーに対するアプタマーまたは抗体のような結合物質をウェルに取り付けることができる。捕捉されたバイオマーカーを、本明細書に記載される方法に基づいて検出することができる。図1Aは、サンドイッチタイプのイムノアッセイ法の例示的模式図を示す。捕捉物質は、その細胞抗原または小胞抗原に対する捕捉物質であることができる。図中、捕捉された実体は、関心対象の抗原に対する蛍光標識された結合物質（検出物質）を使用して検出される。複数の捕捉結合物質を、たとえばアレイ上の区別可能なアドレスまたはイムノアッセイプレートの異なるウェルにおいて使用することができる。検出結合物質は、捕捉結合物質と同じ抗原に対するものであることもできるし、または他のマーカーに対して向けられたものであることもできる。捕捉結合物質は、任意の有用な結合物質、たとえばつながれたアプタマー、抗体またはレクチンであることができ、および／または、検出抗体は、たとえば検出可能な（たとえば標識された）アプタマー、抗体、レクチンまたは他の結合タンパク質もしくは実体で同様に置換されていることもできる。
ある態様において、一般的小胞バイオマーカー、起始細胞マーカーおよび／または疾患マーカーに対する一つまたは複数の捕捉物質が、一般的小胞バイオマーカー、たとえば、非限定的にCD9、CD63およびCD81の一つまたは複数を含むテトラスパニン分子または本明細書の表3の他のマーカーに対する検出物質と共に使用される。微小胞表面抗原の例は、本明細書中、たとえば表3〜4、および10〜17に開示されている。さらなるバイオマーカーおよび検出技術は、その全文がそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる、2009年10月30日に出願された国際特許出願PCT/US2009/62880、2009年11月12日に出願されたPCT/US2009/006095、2011年3月1日に出願されたPCT/US2011/26750、2011年4月6日に出願されたPCT/US2011/031479、2011年8月18日に出願されたPCT/US11/48327、2008年7月25日に出願されたPCT/US2008/71235、2010年11月30日に出願されたPCT/US10/58461、2011年1月13日に出願されたPCT/US2011/21160、2013年3月11日に出願されたPCT/US2013/030302、2012年2月17日に出願されたPCT/US12/25741、2008年9月12日に出願されたPCT/2008/76109、2012年6月14日に出願されたPCT/US12/42519、2012年8月8日に出願されたPCT/US12/50030、2012年8月3日に出願されたPCT/US12/49615、2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41387、2013年11月26日に出願されたPCT/US2013/072019、2013年5月28日に出願されたPCT/US2014/039858、2013年10月23日に出願されたPCT/IB2013/003092、2013年12月19日に出願されたPCT/US13/76611、2014年8月28日に出願されたPCT/US14/53306、2015年11月23日に出願されたPCT/US15/62184、2016年6月29日に出願されたPCT/US16/40157、2016年7月28日に出願されたPCT/US16/44595、および2016年3月9日に出願されたPCT/US16/21632に開示されている。
本発明のアプタマーを使用してバイオマーカーを検出する、または試料成分を捕捉する技術は、平面基体、たとえばアレイ（たとえばバイオチップまたはマイクロアレイ）を、特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする捕獲物質として基体に固定化された分子と共に使用することを含む。アレイは、一つまたは複数のバイオマーカーをアッセイするためのキットの一部として提供することができる。本発明のアプタマーは、前駆症状的疾患を含む疾患の検出および診断のためのアレイに含められることができる。いくつかの態様において、アレイは、関心対象のバイオマーカーを特異的に同定するように選択された生体分子を含むカスタムアレイを含む。カスタマイズされたアレイは、統計的性能を高めるバイオマーカー、たとえばバイオシグネチャーを同定するさらなる生体分子を検出するように修正されることができ、それが、多変量予測モデル（たとえばロジスティック回帰、弁別分析または回帰木モデル）における交差確認エラー率の改善につながる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、疾患、病状または徴候の生物学を研究し、所定の生理学的状態においてバイオシグネチャーをプロファイリングするように構成される。カスタマイズされたアレイに含まれるマーカーは、統計的基準、たとえば、表現型または生理学的状態を区別する際に所望のレベルの統計的有意性を有することに基づいて選択される。いくつかの態様において、マイクロアレイ上の生体分子を排除または包含するために、p値＝0.05の標準有意性が選択される。p値は、複数の比較に関して補正することができる。説明のための例として、有疾患対象または無疾患対象由来の試料から抽出された核酸を、何千もの遺伝子配列に結合する高密度マイクロアレイにハイブリダイズさせることができる。有疾患試料または無疾患試料の間でレベルが有意に異なる核酸を、試料を有疾患または無疾患として区別するためのバイオマーカーとして選択することができる。選択されたバイオマーカーを検出するために、カスタマイズされたアレイを構成することができる。いくつかの態様において、カスタマイズされたアレイは、比較的少ない数、たとえば何千ではなく何十または何百のアドレス指定可能な結合物質を有するアレイをいう低密度マイクロアレイを含む。低密度アレイは基体上に形成されることができる。いくつかの態様において、カスタマイズ可能な低密度アレイは、プレートウェル中のPCR増幅、たとえばTaqMan（登録商標）Gene Expression Assays（Applied Biosystems by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA）を使用する。
本発明のアプタマーまたは他の有用な結合物質は、固い表面もしくは基体に直接的に結合してもよいし、または間接的に結合してもよい。固い表面または基体は、非限定的に、マイクロアレイおよびウェルによって提供される面、粒子、たとえばビーズ、カラム、光ファイバ、ワイプ、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、石英、雲母、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体、量子ドット、コートされたビーズまたは粒子、他のクロマトグラフィー材料、磁性粒子；プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン、スチレンまたは他の材料のコポリマー、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon材料などを含む）、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカ系材料、たとえばシリコンおよび変性シリコン、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、セラミックス、導電性ポリマー（ポリピロールおよびポリインドールのようなポリマーを含む）；ミクロもしくはナノ構造化面、たとえば核酸タイリングアレイ、ナノチューブ、ナノワイヤもしくはナノ粒子状装飾面；または多孔質面もしくはゲル、たとえばメタクリレート、アクリルアミド、糖ポリマー、セルロース、シリケートまたは他の繊維状もしくはストランド状ポリマーを含む、結合物質を直接的または間接的に取り付けることができる任意の物理的に分離可能な固体であることができる。加えて、当技術分野において公知であるように、基体は、パッシブまたは化学的誘導体化コーティングを使用して、デキストラン、アクリルアミド、ゼラチンまたはアガロースのようなポリマーを含む任意の数の材料でコートされてもよい。そのようなコーティングは、生物学的試料とのアレイの使用を容易にすることができる。
アプタマーまたは他の有用な結合物質は、検出可能な実体または標識にコンジュゲートさせることができる。適切な標識は、非限定的に、磁気標識、蛍光部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、高分子色素粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子、フルオロフォア、量子ドットまたは放射性標識を含む。タンパク質標識は、以下に記すような、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのバリアント（たとえばシアン色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質）；および発光タンパク質、たとえばルシフェラーゼを含む。放射性標識は、非限定的に、放射性同位体（放射性核種）、たとえば3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211Atまたは213Biを含む。蛍光標識は、非限定的に、とりわけ、希土類キレート（たとえばユーロピウムキレート）、ローダミン；非限定的にFITC、5-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシフルオレセインを含むフルオレセインタイプ；非限定的にTAMRAを含むローダミンタイプ；ダンシル；リサミン；シアニン；フィコエリスリン；テキサスレッド；Cy3、Cy5、ダポキシル、NBD、カスケードイエロー、ダンシル、PyMPO、ピレン、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸および他のクマリン誘導体、マリーナブルー（商標）、パシフィックブルー（商標）、カスケードブルー（商標）、2-アントラセンスルホニル、PyMPO、3,4,9,10-ペリレン-テトラカルボン酸、2,7-ジフルオロフルオレセイン（オレゴングリーン（商標）488-X）、5-カルボキシフルオレセイン、テキサスレッド-X（商標）、Alexa Fluor 430、5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）、6-カルボキシテトラメチルローダミン（6-TAMRA）、BODIPY FL、ビマンおよびAlexa Fluor 350、405、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700および750ならびにそれらの誘導体を含む。たとえば「The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies」第10版（インターネット上、probes(dot)invitrogen(dot)com/handbookで入手可能）を参照すること。蛍光標識は、FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540およびLIZの一つまたは複数であることができる。
従来技術を使用して、アプタマーは直接的または間接的に標識されることができる。非限定的な例において、標識はビオチン-ストレプトアビジン/アビジン化学を介してアプタマーに取り付けられる。たとえば、ビオチン化アプタマーを合成すると、それがストレプトアビジン分子に結合することができ、そのストレプトアビジン分子そのものが、検出可能な標識にコンジュゲートする；非限定的な例は、ストレプトアビジン、フィコエリスリンにコンジュゲートされている（SAPE）。多工程手法を使用する化学結合の方法は、ビオチン化、たとえばこれらの化合物のスクシンイミドエステルを使用するトリニトロフェノール（TNP）またはジゴキシゲニンの結合を含む。ビオチン化は、たとえば、D-ビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミドの使用によって達成することができる。スクシンイミド基は、7を超えるpHでアミノ基と効果的に反応し、約pH8.0〜約pH8.5で優先的に反応する。標識は二次標識系を含み得る。非限定的な例として、アプタマーは、ビオチンまたはジゴキシゲニンにコンジュゲートさせることができる。標的結合アプタマーは、ストレプトアビジン／アビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体をそれぞれ使用して検出されることができる。
また、様々な酵素-基体標識を本発明の組成物または方法と共に使用し得る。そのような酵素-基体標識は市販されている（たとえば米国特許第4,275,149号）。酵素は概して、様々な技術を使用して計測することができる色素生成基体の化学的変化を触媒する。たとえば、酵素は、基体における変色を触媒し得、それを分光測光的に計測することができる。または、酵素は、基体の蛍光または化学発光を変化させ得る。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（たとえばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（たとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素-基体組み合わせの例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と基体としての水素ペルオキシダーゼ（水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（たとえばオルトフェニレンジアミン（OPD）または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（TMB））を酸化させる）；アルカリホスファターゼ（AP）と色素生成基体としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；およびβ-D-ガラクトシダーゼ（β-D-Gal）と色素生成基体（たとえばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）または蛍光生成基体4-メチルウンベリフェニル-β-D-ガラクトシダーゼを含むが、それらに限定されない。
アプタマーは、平面基体のような基体に結合することができる。平面アレイは概して、アレイフォーマットにある生体分子のアドレス指定可能位置（たとえばパッド、アドレスまたは微小位置）を含む。アレイのサイズはアレイの組成および最終用途に依存する。2個の異なる分子から何千個もの分子までを含むアレイを製造することができる。概して、アレイは、アレイの最終用途および製造方法に依存して、2個から100,000個以上までの分子を含む。本発明と共に使用するためのマイクロアレイは、関心対象のバイオシグネチャー中に存在するバイオマーカー、たとえば細胞、マイクロRNAまたはそのバイオシグネチャーを構成する他の生体分子もしくは小胞を同定または捕捉する少なくとも一つの生体分子を含む。いくつかのアレイにおいては、異なる組成または同一組成のいずれかの複数の基体が使用される。したがって、平面アレイは、より小さい複数の基体を含み得る。
本発明は、バイオマーカー、たとえば関心対象のバイオシグネチャーと結合したバイオマーカーを検出するための多くのタイプのアレイを利用することができる。有用なアレイまたはマイクロアレイは、非限定的に、DNAマイクロアレイ、たとえばcDNAマイクロアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびSNPマイクロアレイ、マイクロRNAアレイ、タンパク質マイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、細胞マイクロアレイ（トランスフェクションマイクロアレイとも呼ばれる）、化学物質マイクロアレイおよび糖質アレイ（グリコアレイ）を含む。これらのアレイは上記でさらに詳細に説明されている。いくつかの態様において、マイクロアレイは、バイオマーカー結合が間接的に（たとえば蛍光を介して）モニターされる、認識分子（たとえばアプタマーまたは抗体）の高密度固定化アレイを提供するバイオチップを含む。
本発明の1種または複数種のアプタマーを含む、バイオシグネチャーを検出するために使用することができるアレイまたはマイクロアレイは、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第6,329,209号；第6,365,418号；第6,406,921号；第6,475,808号；および第6,475,809号ならびに米国特許出願第10/884,269号に記載されている方法にしたがって製造することができる。特異的に検出するためのカスタムアレイは、これらの特許に記載されている方法を使用して製造することができる。また、非限定的にAffymetrix（Santa Clara, CA）、Illumina（San Diego, CA）、Agilent（Santa Clara, CA）、Exiqon（Denmark）またはInvitrogen（Carlsbad, CA）から市販されているものを含む市販のマイクロアレイを使用して本発明の方法を実施することもできる。カスタムおよび／または市販のアレイは、本明細書に記載されるような、タンパク質、核酸ならびに他の生物学的分子および実体（たとえば細胞、小胞、ビリオン）の検出のためのアレイを含む。
いくつかの態様においては、複数の捕捉分子、たとえばタンパク質、ペプチドまたはさらなる核酸分子がアレイ上に配置される。特定の態様において、タンパク質は、タンパク質の変性を最小限にする、タンパク質の活性の変化を最小限にする、またはタンパク質とタンパク質が固定化される表面との間の相互作用を最小限にする方法および材料を使用して固定化される。捕捉分子は、本発明の1種または複数種のアプタマーを含むことができる。一つの態様において、アレイは、アプタマーのプールのハイブリダイゼーションのために構成される。そして、アレイは、試料に結合するプールメンバーを同定するために使用されることができ、それにより、表現型の特徴決定を容易にする。さらなる詳細に関しては、図10B〜10Cおよび関連の開示を参照すること。
有用なアレイ表面は、任意の所望の形、形態またはサイズであり得る。表面の非限定的な例は、チップ、連続面、曲面、フレキシブル面、フィルム、プレート、シートまたはチューブを含む。表面は、約1平方ミクロンから約500cm2までの範囲の面積を有することができる。表面の面積、長さおよび幅は、実施されるアッセイの要件にしたがって異なり得る。考慮される要素は、たとえば、取り扱い易さ、表面を形成している材料の制限、検出システムの要件、付着システム（たとえばアレイヤ）の要件などを含み得る。
特定の態様においては、結合アイランドまたは固定化生体分子の群またはアレイを分離するための物理的手段を用いることが望ましく、そのような物理的分離は、様々な関心対象溶液への様々な群またはアレイの暴露を容易にする。したがって、特定の態様において、アレイは、任意の数のウェルを有するマイクロウェルプレート内に配置される。そのような態様においては、ウェルの底がアレイ形成のための面として働いてもよいし、またはアレイが他の面に形成されたのち、ウェルの中に配置されてもよい。ウェルを有しない面が使用されるような特定の態様においては、結合アイランドが形成されてもよいし、または分子を表面に固定化し、アイランドまたは生体分子に対応するように空間的に配設された穴を有するガスケットがその表面に配置されてもよい。そのようなガスケットは好ましくは液密である。ガスケットは、アレイを製造するプロセスの任意の時点で表面に配置され得、群またはアレイの分離がもはや所望されていないならば、取り除かれてもよい。
いくつかの態様において、固定化された分子は、その固定化された分子と接触する生物学的試料中に存在する一つまたは複数のバイオマーカーに結合することができる。試料を接触させることは一般に、試料をアレイの上に重ねることを含む。
溶液中の分子またはアレイ上に固定化された分子の修飾または結合は、当技術分野において公知の検出技術を使用して検出することができる。そのような技術の例は、免疫学的技術、たとえば競合的結合アッセイ法およびサンドイッチアッセイ法；共焦点スキャナ、共焦点顕微鏡またはCCDベースのシステムのような機器および蛍光、蛍光偏光（FP）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、全内反射蛍光（TIRF）、蛍光相関分光法（FCS）のような技術を使用する蛍光検出法；比色／分光分析技術；表面で吸着される物質の質量の変化を計測する表面プラズモン共鳴法；従来の放射性同位体結合およびシンチレーション近接アッセイ法（SPA）を含む、放射性同位体を使用する技術；質量分析法、たとえばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（MALDI）およびMALDI飛行時間（TOF）型質量分析法；タンパク質フィルムの厚さを計測する光学的方法である偏光解析法；表面に吸着する物質の質量を計測するための非常に高感度の方法である水晶結晶板微量天秤法（QCM）；走査型プローブ顕微鏡法、たとえば原子間力顕微鏡法（AFM）、走査力顕微鏡法（SFM）または走査型電子顕微鏡法（SEM）；ならびに電気化学、インピーダンス、音響、マイクロ波およびIR／ラマン検出のような技術を含む。たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるMere L, et al., "Miniaturized FRET assays and microfluidics: key components for ultra-high-throughput screening," Drug Discovery Today 4(8):363-369 (1999)およびその中に引用されている参照文献；Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999)またはJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007を参照すること。
マイクロアレイ技術は、質量分析法（MS）および他のツールと組み合わせることができる。質量分析計へのエレクトロスプレーインタフェースをマイクロ流体装置中の毛管と一体化させることができる。たとえば、一つの市販のシステムは、固有かつ明確な電気泳動移動度を有する蛍光標識であるeTagレポーターを含み；各標識が切断可能な結合を介して生物学的または化学的プローブに結合している。各eTagレポーターの明確な移動度アドレスが、これらのタグの混合物が毛管電気泳動によって速やかに逆重畳積分され、定量化されることを可能にする。このシステムは、同じ試料からの同時並行的な遺伝子発現、タンパク質発現およびタンパク質機能分析を可能にする。参照により全体として本明細書に組み入れられるJain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N. J.: Humana Press, 2007。
バイオチップは、マイクロ流体またはナノ流体アッセイのための構成要素を含むことができる。マイクロ流体装置は、バイオマーカーを単離または分析する、たとえばバイオシグネチャーを決定するために使用することができる。マイクロ流体システムは、バイオシグネチャーを検出するための一つまたは複数のプロセスまたは他のプロセスの小型化および区画化を可能にする。マイクロ流体装置は、システムの少なくとも一つの局面において一つまたは複数の検出試薬を使用することができ、そのような検出試薬を使用して一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。様々なプローブ、抗体、タンパク質または他の結合物質を使用して、マイクロ流体システム内のバイオマーカーを検出することができる。検出物質、たとえば本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、マイクロ流体装置の様々な区画中に固定化されてもよいし、または装置の様々なチャネルを通してハイブリダイゼーションまたは検出反応に導入されてもよい。
ナノ加工技術が、高密度の精密アレイ、たとえば不均一ナノアレイとしても知られるヌクレオチドベースのチップおよびタンパク質アレイの加工に依存するバイオセンシング用途の可能性を開拓している。ナノ流体工学が、マイクロチップ中の流体分析対象物の量をナノリットルレベルまでさらに減らすことを可能にし、ここで使用されるチップがナノチップと呼ばれる。たとえば、参照により全体として本明細書に組み入れられるUnger M et al., Biotechniques 1999; 27(5): 1008-14、Kartalov EP et al., Biotechniques 2006; 40(1):85-90を参照すること。現在、市販のナノチップは、試料を試薬と合わせ、混合し、反応をモニターすることによって実施することができる簡単な一工程アッセイ、たとえば総コレステロール、総タンパク質またはグルコースアッセイを提供する。液クロマトグラフィー（LC）およびナノLC分離に基づくゲルフリーの分析法（いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられるCutillas et al. Proteomics, 2005; 5:101-112およびCutillas etal., Mol Cell Proteomics 2005; 4:1038-1051）をナノチップと組み合わせて使用することもできる。
疾患、病状、症候群または生理学的状態を同定するのに適したアレイはキットに含まれることができる。キットは本発明のアプタマーを含むことができ、非限定的な例としてアレイの結合アイランドまたは区域の上への固定化のために分子を調製するのに有用な1種または複数種の試薬、固定化された分子たとえばアプタマーへのバイオマーカーの結合を検出するのに有用な試薬ならびに取り扱い説明を含むことができる。
さらに本明細書に提供されるものは、生物学的試料中の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にする高速検出装置である。装置は、チップ上で生物学的試料調製をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と統合することができる。装置は、生物学的試料中の小胞の特定のバイオシグネチャーの検出を容易にすることができ、ある例が、参照により全体として本明細書に組み入れられるPipper et al., Angewandte Chemie, 47(21), p. 3900-3904 (2008)に記載されているように提供されている。バイオシグネチャーは、参照により全体として本明細書に組み入れられるLi et al., Adv Dent Res 18(1):3-5 (2005)に記載されているように、診断用途のために、マイクロ／ナノエレクトロケミカルシステム（MEMS/NEMS）センサおよび口腔液を使用して組み込むことができる。
平面アレイに代わるものとして、粒子を使用するアッセイ法、たとえばビーズベースのアッセイ法もまた、本発明のアプタマーを使用することができる。アプタマーは市販のビーズと容易にコンジュゲートする。たとえば、Srinivas et al. Anal. Chem. 2011 Oct. 21, Aptamer functionalized Microgel Particles for Protein Detectionを参照すること。また、治療物質および診断物質としてのアプタマーに関するレビュー文献、Brody and Gold, Rev. Mol. Biotech. 2000, 74:5-13を参照すること。
高感度オートメーションと合致した特定の活性を有する同族リガンドおよびレポーター分子によるビーズコーティングを使用するマルチパラメーターアッセイ法または他のハイスループット検出アッセイ法を使用することができる。ビーズベースのアッセイシステムにおいては、結合物質、たとえば抗体またはアプタマーをアドレス指定可能なミクロスフェア上に固定化することができる。個々の結合アッセイそれぞれのための各結合物質を別個のタイプのミクロスフェア（すなわちマイクロビーズ）に結合することができ、図1Bに示すように、アッセイ反応がそのミクロスフェアの表面で起こる。非限定的な例において、細胞または微小胞のための結合物質は、ビーズに結合した捕捉抗体またはアプタマーであることができる。別々の蛍光強度を有する染色されたミクロスフェアは、それらの適切な結合物質または捕捉プローブを別々に付加される。所望に応じて、異なる結合物質を有する異なるビーズセットをプールしてカスタムビーズアレイを生成することができる。そして、ビーズアレイを試料と共に一つの反応容器中でインキュベートしてアッセイを実施する。
また、ビーズベースのアッセイ法を本発明の1種または複数種のアプタマーと共に使用することができる。ビーズ基体が、アプタマーを含む1種または複数種の結合物質を取り付けるためのプラットフォームを提供することができる。多重化の場合、複数の異なるビーズセット（たとえばIllumina, Luminex）が、異なる結合物質（異なる標的分子に特異的）を有することができる。たとえば、ビーズは、関心対象の抗原の存在を検出する（定量的または定性的に）ために使用される本発明のアプタマーにコンジュゲートさせることもできるし、または選択された生物学的試料中に存在する成分（たとえば、アプタマーが結合するように構成されている標的分子を含む細胞、細胞フラグメントまたは小胞）を単離するために使用することもできる。市販のキットの使用を通して、有機起源の任意の分子をポリスチレンビーズにうまくコンジュゲートさせることができる。
一つまたは複数の本発明のアプタマーは、非限定的に磁気捕捉法、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）またはレーザーサイトメトリーを含む任意のビーズベースの基体と共に使用することができる。磁気捕捉法は、磁気活性化細胞ソーター（MACS）マイクロビーズまたは磁気カラムの使用を含むことができるが、それらに限定されない。本発明のアプタマーを使用するように修正することができるビーズまたは粒子ベースの方法の例は、米国特許第4,551,435号、第4,795,698号、第4,925,788号、第5,108,933号、第5,186,827号、第5,200,084号または第5,158,871号；第7,399,632号；第8,124,015号；第8,008,019号；第7,955,802号；第7,445,844号；第7,274,316号；第6,773,812号；第6,623,526号；第6,599,331号；第6,057,107号；第5,736,330号；国際公開公報WO/2012/174282；WO/1993/022684に記載されている方法およびビーズシステムを含む。
生物学的試料由来の循環バイオマーカー、たとえばタンパク質抗原またはバイオマーカー包含細胞、細胞フラグメントもしくは小胞の単離または検出はまた、サイトメトリープロセスにおいて本発明のアプタマーを使用して達成されてもよい。非限定的な例として、本発明のアプタマーは、ビーズまたはミクロスフェアのような粒子の使用を含むアッセイ法において使用することができる。本発明は、粒子にコンジュゲートし得るアプタマーを結合物質として提供する。流体流中に懸濁した微視的粒子をソートするためにはフローサイトメトリー法を使用することができる。粒子が通過するとき、粒子は選択的に荷電され、出るとき、別々の流路の中にそらされることができる。したがって、元の混合物、たとえば生物学的試料から高い精度および速度で集団を分離することが可能である。フローサイトメトリー法は、光学／電子検出装置の中を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特徴の同時マルチパラメータ分析を可能にする。一つの波長（色）の光ビーム、通常はレーザービームが流体力学的に集束した流体流に向けて送られる。いくつかの検出器：光ビームと平行である一つの検出器（前方散乱またはFSC）、それに対して垂直であるいくつかの検出器（側方散乱またはSSC）および一つまたは複数の蛍光検出器が、流れが光ビームを通過する点に照準を定めている。
ビーム中を通過する各懸濁粒子は光を何らかのやり方で散乱させ、粒子中の蛍光化学物質が励起されると、光源よりも低い周波数の光を放出し得る。散乱光と蛍光とのこの組み合わせが検出器によって捕捉され、各検出器（蛍光放出ピークごとに一つ）における明るさの変動を分析することにより、個々の粒子それぞれの物理的および化学的構造に関する様々な事実を演繹することが可能である。FSCは細胞サイズと相関し、SSCは、粒子の内部複雑さ、たとえば核の形状、細胞質顆粒の量およびタイプまたは膜の粗さに依存する。いくつかのフローサイトメーターは蛍光の必要性を除いており、光散乱だけを計測に使用する。
フローサイトメーターは、毎秒数千個の粒子を「リアルタイム」で分析することができ、指定された性質を有する粒子をアクティブに分別し、単離することができる。フローサイトメーターは、各分析期間中、多数の単一細胞に関する設定パラメータのハイスループット自動化定量および分離を提供する。フローサイトメーターは複数のレーザーおよび蛍光検出器を有し、それにより、多数の標識を使用してそれらの表現型により標的集団をより正確に特定することが可能になる。したがって、フローサイトメーター、たとえばマルチカラーフローサイトメーターを、複数の蛍光標識または色を用いて関心対象の標的を検出するために使用することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターはまた、関心対象の様々な標的を、たとえばサイズごとに、または異なるマーカーごとに、ソートまたは単離することもできる。
フローサイトメーターは、一つまたは複数のレーザー、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはより多くのレーザーを有し得る。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つより多い色または蛍光標識、たとえば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20の異なる色または蛍光標識を検出することができる。たとえば、フローサイトメーターは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の蛍光検出器を有することができる。
市販のフローサイトメーターの例は、MoFlo（商標）XDP Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、MoFlo（商標）Legacy Cell Sorter（Beckman Coulter, Brea, CA）、BD FACSAria（商標）Cell Sorter（BD Biosciences, San Jose, CA）、BD（商標）LSRII（BD Biosciences, San Jose, CA）およびBD FACSCalibur（商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）を含むが、これらに限定されない。多重分析には、マルチカラーまたはマルチ蛍光サイトメーターを使用することができる。いくつかの態様において、フローサイトメーターは、一つまたは複数の特徴に基づいて、細胞、微小胞、または粒子の一つより多い集団をソートし、それにより、捕集またはソートすることができる。たとえば、類似したサイズ範囲を有するように異なるサイズを有する二つの集団は、示差的に検出またはソートされることができる。もう一つの態様において、二つの異なる集団は示差的に標識される。
フローサイトメーターから得られるデータは、ヒストグラムを生成するために一次元にプロットすることもできるし、または二次元でドットプロットとして見ることもできるし、またはより新規なソフトウェアを用いて三次元で見ることもできる。これらのプロット上の領域は、ゲートと呼ばれる一連のサブセット抽出によって順次に分けることができる。特に血液学に関する診断および臨床目的のためには特定のゲート制御プロトコルが存在する。プロットは、多くの場合、対数目盛において作成される。異なる蛍光色素の放出スペクトルは重なり合うため、検出器におけるシグナルは電子的かつ計算的に補正されなければならない。バイオマーカーを標識するための蛍光体は、参照により本明細書に組み入れられるOrmerod, Flow Cytometry 2nd ed., Springer-Verlag, New York (1999)およびNida et al., Gynecologic Oncology 2005; 4 889-894に記載されたものを含み得る。非限定的にフローサイトメトリー法を含む多重化アッセイ法においては、本発明のアプタマーを使用して一つまたは複数の異なる標的分子を評価することができる。
本発明の1種または複数種のアプタマーは、任意の有用な平面またはビーズ基体の上に配置することができる。本発明の一つの局面において、本発明の1種または複数種のアプタマーは、マイクロ流体装置上に配置され、それにより、関心対象のポリペプチド抗原またはその機能性フラグメントを含む生物学的試料の成分の評価、特徴決定または単離を容易にする。たとえば、循環抗原またはその抗原を含む細胞、細胞フラグメントもしくは細胞由来の微小胞は、本発明の1種または複数種のアプタマーを使用して（または、さらなる結合物質と共に）評価することができる。また、「lab-on-a-chip」システム、バイオメディカルマイクロエレクトロメカニカルシステム（bioMEMs）またはマルチコンポーネント集積システムとも呼ばれ得るマイクロ流体装置をそのような実体の単離および分析のために使用することができる。そのようなシステムは、バイオシグネチャーの検出および他のプロセスを可能にするプロセスを小型化し、区画化する。
マイクロ流体装置はまた、サイズ差別選択またはアフィニティー選択による細胞、細胞断片、または細胞由来の微小胞の単離に使用することもできる。たとえば、マイクロ流体装置は、サイズに基づいてまたは一つもしくは複数の結合物質を使用することによって生物学的試料から実体を単離するための、一つまたは複数のチャネルを使用することができる。生物学的試料は、実体の通過を選択的に可能にする一つまたは複数のマイクロ流体チャネルに導入することができる。選択は、性質、たとえばサイズ、形状、変形性またはバイオシグネチャーに基づくことができる。
一つの態様においては、細胞、細胞断片、微小胞、または他のバイオマーカー（たとえばタンパク質複合体）の不均一集団をマイクロ流体装置に導入することができ、そのような実体の一つまたは複数の異なる均一集団を得ることができる。たとえば、異なるチャネルが、そのような実体の異なる集団を選択するための異なるサイズ選択または結合物質を有することができる。したがって、マイクロ流体装置は複数の実体を単離することができ、その場合、その複数の少なくとも一つのサブセットが、その複数の別のサブセットとは異なるバイオシグネチャーを含む。たとえば、マイクロ流体装置は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90または100の異なるサブセットを単離することができ、その場合、各サブセットが異なるバイオシグネチャーを含む。
いくつかの態様において、マイクロ流体装置は、関心対象の標的のさらなる富化または選択を可能にする一つまたは複数のチャネルを含むことができる。第一のチャネルを通過した後の富化された集団を第二のチャネルに導入することができ、その第二のチャネルが、所望の集団の通過が第二のチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質などによってさらに富化されることを可能にする。
アレイベースのアッセイ法およびビーズベースのアッセイ法をマイクロ流体装置と共に使用することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドプローブなどの結合物質をビーズに結合することができ、マイクロ流体装置中でビーズと結合物質の標的との間の結合反応を実施することができる。また、マイクロ流体装置を使用して多重化を実施することもできる。異なる区画が異なる標的集団のための異なる結合物質を含むことができる。一つの態様において、各集団は異なるバイオシグネチャーを有する。ミクロスフェアと標的との間のハイブリダイゼーション反応をマイクロ流体装置中で実施することができ、反応混合物を検出装置に送ることができる。検出装置、たとえばデュアルまたはマルチレーザー検出システムは、マイクロ流体システムの一部であることができ、かつレーザーを使用して各ビーズまたはミクロスフェアをそのカラーコーディングによって同定することができ、かつ別のレーザーが、各ビーズと関連するハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる。
任意の適切なマイクロ流体装置を本発明の方法に使用することができる。使用され得るマイクロ流体装置の例は、それぞれ参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第7,591,936号、第7,581,429号、第7,579,136号、第7,575,722号、第7,568,399号、第7,552,741号、第7,544,506号、第7,541,578号、第7,518,726号、第7,488,596号、第7,485,214号、第7,467,928号、第7,452,713号、第7,452,509号、第7,449,096号、第7,431,887号、第7,422,725号、第7,422,669号、第7,419,822号、第7,419,639号、第7,413,709号、第7,411,184号、第7,402,229号、第7,390,463号、第7,381,471号、第7,357,864号、第7,351,592号、第7,351,380号、第7,338,637号、第7,329,391号、第7,323,140号、第7,261,824号、第7,258,837号、第7,253,003号、第7,238,324号、第7,238,255号、第7,233,865号、第7,229,538号、第7,201,881号、第7,195,986号、第7,189,581号、第7,189,580号、第7,189,368号、第7,141,978号、第7,138,062号、第7,135,147号、第7,125,711号、第7,118,910号、第7,118,661号、第7,640,947号、第7,666,361号、第7,704,735号；および国際特許公開公報WO2010/072410に記載されているものを含むが、それらに限定されない。本明細書に開示される方法と共に使用するためのもう一つの例が、Chen et al., "Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum vesicles," Lab on a Chip, Dec. 8, 2009 DOI:10.1039/b916199fに記載されている。
本発明と共に使用するための他のマイクロ流体装置は、非限定的に、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,376,252号、第6,408,878号、第6,645,432号、第6,719,868号、第6,793,753号、第6,899,137号、第6,929,030号、第7,040,338号、第7,118,910号、第7,144,616号、第7,216,671号、第7,250,128号、第7,494,555号、第7,501,245号、第7,601,270号、第7,691,333号、第7,754,010号、第7,837,946号；米国特許出願第2003/0061687号、第2005/0084421号、第2005/0112882号、第2005/0129581号、第2005/0145496号、第2005/0201901号、第2005/0214173号、第2005/0252773号、第2006/0006067号；ならびに欧州特許第0527905号および第1065378号に開示されているものを含む、エラストマー層、弁およびポンプを含む装置を含む。
マイクロ流体装置は、チャネル中の表面に付いた、またはチャネル中に存在する1種または複数種の結合物質を有することができる。たとえば、マイクロチャネルは、一つまたは複数の捕捉物質、たとえば本発明のオリゴヌクレオチドプローブを有することができる。また、所望であれば、チャネルの表面を本発明のブロッキングアプタマーと接触させることもできる。一つの態様において、マイクロチャネル表面をアビジンで処理し、ビオチン化された捕捉物質、たとえば抗体またはアプタマーをチャネルに注入してアビジン/ストレプトアビジンと結合させることができる。他の態様において、捕捉物質は、マイクロ流体装置のチャンバーまたは他の構成要素の中に存在する。捕捉物質はまた、マイクロ流体チャネル中で動かすように操作することができるビーズに取り付けることもできる。一つの態様において、捕捉物質は磁性ビーズに取り付けられる。ビーズは、磁石を使用して操作することができる。
生物学的試料は、少なくとも毎分約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45または50μl、たとえば毎分約1〜50、5〜40、5〜30、3〜20または5〜15μlの速度でマイクロ流体装置またはマイクロチャネル中に流すことができる。関心対象の一つまたは複数の標的をマイクロ流体装置中で捕捉し、直接検出することができる。または、分析の前に、捕捉された標的を解放し、マイクロ流体装置から出してもよい。もう一つの態様においては、一つまたは複数の捕捉された細胞または微小胞をマイクロチャネル中で溶解させ、その溶解産物を分析することができる。溶解バッファをチャネル中に流すことができる。溶解産物を捕集し、たとえばRT-PCR、PCR、質量分析、ウエスタンブロットまたは他のアッセイを実施することによって分析して、捕捉された細胞または微小胞の一つまたは複数のバイオマーカーを検出することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用して微小胞および関連するバイオマーカーを分析することができる。微小胞単離は、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外ろ過、免疫吸着、アフィニティー精製、アフィニティーキャプチャー、イムノアッセイ、免疫沈降、マイクロ流体分離、フローサイトメトリー、ポリマー単離（たとえばポリエチレングルリコール（PEG）を使用）またはそれらの組み合わせを非限定的に含む様々な技術を使用して実施することができる。微小胞および小胞ペイロード単離および分析のための方法および技術が、以下の国際特許出願：2009年10月30日出願のPCT/US2009/62880；2009年11月12日出願のPCT/US2009/006095；2011年3月1日出願のPCT/US2011/26750；2011年4月6日出願のPCT/US2011/031479；2011年8月18日出願のPCT/US11/48327；2008年7月25日出願のPCT/US2008/71235；2010年11月30日出願のPCT/US10/58461；2011年1月13日出願のPCT/US2011/21160；2013年3月11日出願のPCT/US2013/030302；2012年2月17日出願のPCT/US12/25741；2008年9月12日出願のPCT/2008/76109；2012年6月14日出願のPCT/US12/42519；2012年8月8日出願のPCT/US12/50030；2012年8月3日出願のPCT/US12/49615；2012年6月7日出願のPCT/US12/41387；2013年11月26日出願のPCT/US2013/072019；2013年5月28日出願のPCT/US2014/039858；2013年10月23日出願のPCT/IB2013/003092；2013年12月19日出願のPCT/US13/76611；2014年8月28日出願のPCT/US14/53306；および2015年11月23日出願のPCT/US15/62184；2016年6月29日出願のPCT/US16/40157；2016年7月28日出願のPCT/US16/44595；および2016年3月9日出願のPCT/US16/21632に開示されている。これらの出願それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明の組成物および方法は様々なイムノアッセイフォーマットにおいてかつそれと共に使用することができる。イムノアフィニティーアッセイは、タンパク質または他の関心対象のバイオマーカーと選択的に免疫反応性である抗体およびアプタマーに基づくことができる。これらの技術は、非限定的に、免疫沈降、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素結合免疫ろ過アッセイ（ELIFA）、蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）、免疫組織化学（IHC）などを含む。たとえば、試料中のバイオマーカーの発現を検出する任意の方法は、試料を、バイオマーカーに対する抗体もしくはアプタマーまたはその免疫反応性フラグメント、またはバイオマーカーに対する抗原結合領域を含有する組み換えタンパク質と接触させる工程；および次いで、試料中のバイオマーカーの結合を検出する工程を含む。抗体およびアプタマーを製造するための様々な方法が当技術分野において公知である。そのような結合物質を使用して、溶液試料から特定のタンパク質を免疫沈降させる、またはたとえばポリアクリルアミドゲルによって分離されたタンパク質をイムノブロットすることができる。また、組織または細胞中の特定のタンパク質多型を検出する際に免疫細胞化学的方法を使用することもできる。他の周知のイムノアッセイ技術、たとえばELISA、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫ラジオメトリックアッセイ（IRMA）および免疫酵素アッセイ（IEMA）、たとえばサンドイッチアッセイを使用することもできる。たとえば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,376,110号および第4,486,530号を参照すること。
代替法においては、試料を、バイオマーカーに特異的な抗体またはアプタマーと、複合体を形成させるのに十分な条件下、接触させたのち、そのような複合体を検出してもよい。バイオマーカーの存在は、いくつかの方法で、たとえば、血漿または血清のような体液を含む多様な組織および試料をアッセイするためのウェスタンブロッティングおよびELISA法によって検出し得る。そのようなアッセイフォーマットを使用する多様なイムノアッセイ技術が利用可能である。たとえば、米国特許第4,016,043号、第4,424,279号および第4,018,653号を参照すること。これらは、非競合タイプのシングルサイトおよび2サイトの両方または「サンドイッチ」アッセイならびに従来の競合的結合アッセイを含む。これらのアッセイはまた、標的バイオマーカーへの標識された抗体またはアプタマーの直接結合を含む。
本発明に包含されることができるサンドイッチアッセイ技術の変形が数多くある。一般的なフォワードアッセイにおいては、標識されていない結合物質、たとえば抗体またはアプタマーを固体基体上に固定化し、試験する試料を、結合した分子と接触させる。複合体の形成を許すのに十分な適当な期間ののち、検出可能なシグナルを生成することができるレポーター分子で標識された、抗原に特異的な第二の結合物質を加え、インキュベートして、標識された結合物質を含むもう1つの複合体の形成に十分な時間を許す。未反応物質があるならばそれを洗い流し、レポーター分子によって生成されたシグナルの観測によって抗原の存在を決定する。結果は、可視シグナルの簡単な観測によって定性的であってもよいし、既知の量のバイオマーカーを含有する対照試料と比較することによって定量化されてもよい。
上記アッセイの変形は、試料および標識された結合物質の両方が、つながれた結合物質に同時に加えられる同時アッセイを含む。一般的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、組織／細胞／バイオマーカーまたはそのような関心対象の標的に特異性を有する第一の結合物質、たとえば抗体またはアプタマーを固体面に共有結合的または受動的のいずれかで結合させる。固体面は一般的にガラスまたはポリマーであり、もっとも一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、またはイムノアッセイを実施するのに適した任意の他の面の形態にあり得る。結合プロセスは一般に、ポリマー-抗体複合体を支持体に架橋、共有結合または物理吸着させることからなり、次いで、それを試料の調製において洗浄する。次いで、試験する試料のアリコートを固相複合体に加え、適当な条件（たとえば室温〜40℃、たとえば25℃〜32℃（記載の数字を含む））下で十分な期間（たとえば2〜40分または一晩）インキュベートして、支持体への標的の結合を許す。インキュベーション期間ののち、支持体を洗浄し、バイオマーカーの一部分に特異的な第二の結合物質とともにインキュベートする。第二の結合物質は、分子マーカーへの第二の結合物質の結合を示すために使用されるレポーター分子に結合している。
代替法は、試料中の標的バイオマーカーを固定化し、次いで固定化された標的を特異的結合物質、たとえば抗体またはアプタマー（これらはレポーター分子で標識されていてもよいし、されていなくてもよい）に暴露する工程を含む。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合した標的は、結合物質による直接標識によって検出可能であり得る。あるいはまた、第一の結合物質に特異的な第二の標識された結合物質を第一の標的複合体に暴露して三次複合体を形成する。この複合体を、レポーター分子によって放出されるシグナルによって検出する。「レポーター分子」は、抗原結合複合体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する（その化学的性質により）分子を含む。このタイプのアッセイに一般に使用されるいくつかのレポーター分子は、酵素、蛍光体または放射性核種含有分子（すなわち放射性同位体）および化学発光分子を含む。そのような検出可能な標識の例は本明細書において開示されている。
酵素イムノアッセイの場合、酵素を二次結合物質にコンジュゲートさせる。一般に使用される酵素は、とりわけ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特定の酵素とともに使用される基体は一般に、対応する酵素によって加水分解されたとき検出可能な変色を発生させるように選択される。適当な酵素の例はアルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼを含む。上記色素産生基体ではなく、蛍光産物を生み出す蛍光原基体を用いることも可能である。すべての場合において、酵素標識された結合物質を第一の結合した分子マーカー複合体に加え、結合させたのち、過剰な試薬を洗い流す。次いで、適切な基体を含有する溶液を、一次結合物質、抗原および二次結合物質を含む三次複合体に加える。基体は、二次結合物質に結合した酵素と反応して定性的な可視シグナルを与え、それを、通常は分光測光的にさらに定量化して、試料中に存在した抗原の量の指示を与え得る。あるいはまた、蛍光化合物、たとえばフルオレセインおよびローダミンを、それらの結合能力を変えることなく、二次結合物質に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光の照射によって活性化されると、蛍光色素で標識された二次結合物質は光エネルギーを吸着して、分子中に励起可能な状態を誘導したのち、光学顕微鏡によって目視的に検出可能な特徴的な色の光を放出する。EIAにおけるように、蛍光標識された二次結合物質を抗原複合体に結合させる。結合していない試薬を洗い流したのち、残る三次複合体を適切な波長の光に暴露する。観測される蛍光が関心対象の分子マーカーの存在を示す。免疫蛍光およびEIA技術はいずれも当技術分野において非常に十分に確立されている。しかし、他のレポーター分子、たとえば放射性同位体、化学発光または生物発光分子を用いてもよい。
免疫組織化学（IHC）は、組織中の抗原に特異的な結合物質（たとえば抗体またはアプタマー）を使用して、組織の細胞中の抗原（たとえばタンパク質）を限局化するプロセスである。抗原結合性結合物質は、たとえば可視化を介してその検出を可能にするタグにコンジュゲートまたは融合させることができる。いくつかの態様において、タグは、発色反応を触媒することができる酵素、たとえばアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼである。酵素は、結合物質に融合させることもできるし、たとえばビオチン-アビジン／ストレプトアビジン系を使用して非共有結合的に結合させることもできる。あるいはまた、結合物質を蛍光体、たとえばフルオレセイン、ローダミン、DyLight FluorまたはAlexa Fluorでタグ付けすることもできる。結合物質は、直接的にタグ付けされることもできるし、タグを担持する二次検出結合物質（抗体または抗原）によってそれ自体が認識されることもできる。IHCを使用すると、1つまたは複数のタンパク質を検出し得る。遺伝子産物の発現は、対照レベルに比較されるその染色強度に関連することができ。いくつかの態様において、遺伝子産物は、その染色が、対照に対し、試料中で少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、4、5、6、7、8、9または10倍変化するならば、差次的に発現したものとみなされる。
IHCは、組織化学技術へのそのようなイムノアッセイフォーマットの適用を含む。例示的な例においては、組織切片をスライドに載せ、結合物質とともにインキュベートする。結合物質は一般に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり、抗原に特異的な、本発明のオリゴヌクレオチドプローブのようなアプタマーであることができる。一次反応は、組織切片をこの一次結合物質と接触させて一次複合体を形成することを含む。その後、抗原-抗体シグナルを、可視シグナルを提供することができる複合体にコンジュゲートした第二の結合物質、たとえばペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（PAP）、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ（ABC）またはアビジン-ビオチンアルカリホスファターゼを非限定的に含む酵素を使用して増幅する。基体および色素原の存在下、酵素は一次複合体の部位に着色付着物を形成する。免疫蛍光が、抗原を可視化するための代替手法である。この技術においては、蛍光色素にコンジュゲートした第二の結合物質を使用して一次シグナルを増幅する。UV光を吸収すると、蛍光色素は、より長い波長でそれ自体の光を放出し（蛍光）、それによって一次複合体の限局化を可能にする。
本発明は、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用してIHCアッセイを実施する方法を提供する。これは、ポリリガンド組織化学アッセイ（PHC）と呼ばれ得る。この手法の例として、組織切片を、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる。ライブラリーのメンバーは、たとえば、適宜、ビオチン分子、ジゴキシゲニンまたは他の標識で標識されることができる。結合したライブラリーメンバーを、二次標識系、たとえばストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ（SA-HRP）または抗ジゴキシゲニンセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して可視化する。得られたスライドを読み出し、一般的な抗体ベースのIHC法におけるように採点することができる。本明細書における実施例19〜31を参照すること。
オリゴヌクレオチドプローブ/アプタマー
アプタマーは、高い特異性および親和性、生物学的有効性、ならびに優れた薬物動態学的特性を含む、治療薬および診断薬として使用するための複数の望ましい特徴を有する。加えて、これらは抗体および他のタンパク質生物製剤と比較して、特定の利点を有している。例えば、アプタマーは、全体的にインビトロであるプロセスによって作製され、このことは、迅速な合成を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性が厳しく管理されることを可能にする。さらに、あるクラスのアプタマーは、毒性も免疫原性もほとんど無いかまたは全くないことが実証されている。多くのモノクローナル抗体の有効性は、抗体自身に対する免疫応答によって激しく制限され得るが、アプタマーに対する抗体を誘導することは困難であり、その最も可能性が高い理由は、アプタマーがMHCを介してT細胞により提示されることができず、かつ免疫応答が一般に核酸断片を認識しないようにされていることである。最も最近承認された抗体治療薬は静脈内注入（典型的に2〜4時間にわたる）によって投与されるが、アプタマーは、皮下注射によって投与することができる。この違いは、大多数の治療用mAbの比較的低い溶解性およびこれにより大きな用量が必要であることに主に起因する。良好な溶解性（>150 mg/mL）かつ比較的低い分子量（アプタマー：10〜50 kDa；抗体：150 kDa）により、アプタマーの一週間用量は、0.5 mL未満の量の注射により送達され得る。加えて、小さいサイズのアプタマーは、これらが、抗体または抗体断片は侵入することができない立体構造的に狭窄の領域中に侵入することを可能にする。このことは、アプタマーをベースにした治療薬または予防法のさらに別の利点を示している。
アプタマーは、化学的に合成され、かつ診断的または治療的用途のための製品への要望を満たすために必要に応じて容易にスケール変更される。加えて、アプタマーは、化学的に頑強である。これらを、熱および変性剤などの因子への暴露後に活性を回復するように適合化させることができ、かつ、凍結乾燥粉末として室温で長期間（>1年）貯蔵することができる。
SELEX法
アプタマーを生成するための古典的な方法は、たとえば、1990年6月11日に出願され、今や放棄された米国特許出願第07/536,428号、「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,475,096号および「Nucleic Acid Ligands」と題する米国特許第5,270,163号（WO91/19813も参照）に概して記載されている「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment」（「SELEX法」）と呼ばれるプロセスを用いる方法である。各SELEX同定核酸リガンド、すなわち各アプタマー（またはオリゴヌクレオチドプローブ）は、所与の標的化合物または分子に特異的なリガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、多様な二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力と、モノマーであるかポリマーであるかを問わず任意の様々な化学物質と共にリガンドとして働く（すなわち、特異的結合対を形成する）のに十分な、それらのモノマー内で利用可能な化学的融通性とを有するという、洞察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的として働くことができる。
SELEX法は、出発点として、ランダム化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーまたはプールに依存する。オリゴヌクレオチドは、修飾されたまたは非修飾の、DNA、RNAまたはDNA/RNAハイブリッドであることができる。いくつかの例において、プールは、100％ランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、ランダム化された配列内に組み込まれた少なくとも一つの固定および／または保存配列を含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例において、プールは、オリゴヌクレオチドプールのすべての分子によって共有される配列を含み得る少なくとも一つの固定および／または保存配列をその5'および／または3'末端に含むランダムまたは部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列とは、PCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼ（たとえばT3、T4、T7およびSP6）のためのプロモーター配列、制限部位またはホモポリマー配列、たとえばポリAもしくはポリTトラクト、触媒コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位ならびに関心対象のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列のような配列である。保存配列とは、同じ標的に結合するいくつかのアプタマーによって共有される、前記固定配列以外の配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ランダム化された配列部分および効率的な増幅に必要な固定配列を含む。一般に、出発プールのオリゴヌクレオチドは、30〜50個のランダムなヌクレオチドの内側領域に隣接する固定5'および3'末端配列を含む。ランダム化されたヌクレオチドは、化学合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含むいくつかの方法で生成することができる。また、選択／増幅反復の前または最中に、試験核酸中の配列変異を突然変異誘発によって導入する、または増大させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の適切な長さであることができ、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾されたまたは非天然の、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を含むことができる。たとえば、米国特許第5,958,691号；米国特許第5,660,985号；米国特許第5,958,691号；米国特許第5,698,687号；米国特許第5,817,635号；米国特許第5,672,695号およびPCT公開公報WO92/07065を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、ホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。たとえば、Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986)およびFroehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)を参照すること。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法のような溶液相法を使用して合成することもできる。たとえば、Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977)およびHirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978)を参照すること。自動DNA合成装置上で実施される一般的な合成は、たいていのSELEX実験には十分な数である1014〜1016個の分子を生じさせる。配列設計中の十分に大きなランダム配列の領域は、合成される各分子が独自の配列を表す可能性を高める。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置上での自動化学合成によって生成され得る。ランダム化配列を合成するためには、合成プロセス中、各ヌクレオチド添加工程において四つすべてのヌクレオチドの混合物を加えて、ヌクレオチドのランダムな配合を可能にする。上述したように、一つの態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、しかし、他の態様において、ランダムなオリゴヌクレオチドは、非ランダムまたは部分的にランダムな配列の部分を含むこともできる。部分的にランダムな配列は、各添加工程において四つのヌクレオチドを異なるモル比で加えることによって創製することができる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、たとえばRNA、DNAまたはRNA／DNAハイブリッドであり得る。出発RNAライブラリーは、T7 RNAポリメラーゼまたは修飾T7 RNAポリメラーゼを使用してDNAラブラリーをインビトロで転写することによって産生され、精製されることができる。次いで、結合に好ましい条件下、ライブラリーを標的と混合し、同じ一般的選択スキームを使用して、結合、分割および増幅の工程ごとの反復に供すると、事実上、任意の所望の基準の結合親和性および選択性が達成される。より具体的には、核酸の出発プールを含む混合物から出発して、SELEX法は、（a）結合に好ましい条件下、混合物を標的と接触させる工程；（b）非結合核酸を、標的分子に特異的に結合した核酸から分割する工程；（c）核酸-標的複合体を分離させる工程；（d）核酸-標的複合体から分離させた核酸を増幅して、リガンド富化された核酸混合物を得る工程；および（e）結合、分割、分離および増幅の工程を所望のサイクル数だけ反復して、標的分子に対する高特異性で高親和性の核酸リガンドを得る工程を含む。RNAアプタマーが選択される場合、SELEX法はさらに、（i）工程（d）における増幅の前に、核酸-標的複合体から分離させた核酸を逆転写する工程；および（ii）プロセスを再開する前に、工程（d）からの増幅された核酸を転写する工程を含む。
多数の可能な配列および構造を含む核酸混合物内には、所与の標的に対する広い範囲の結合親和性が存在する。たとえばヌクレオチド20個のランダム化セグメントを含む核酸混合物は、420個の候補の可能性を有することができる。標的に対してより高い親和定数を有するものは標的に非常に結合しやすい。分割、分離および増幅ののち、第二の核酸混合物を生成し、より高い結合親和性の候補に関して富化する。さらなるラウンドの選択が漸進的により良好なリガンドを優先させ、最後に、得られる核酸混合物は主として一つまたはいくつかの配列のみで構成されるようになる。そして、それらをクローニングし、配列決定し、高純度リガンドまたはアプタマーとしての結合親和性に関して個々に試験することができる。
選択および増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な場合、選択／増幅は、サイクルを繰り返しても結合強度の有意な改善が達成されなくなるまで継続される。この方法は一般に、約1014種の異なる核酸種をサンプリングするために使用されるが、約1018種もの異なる核酸種をサンプリングするために使用されることもある。概して、核酸アプタマー分子は、5〜20サイクルの手順において選択される。一つの態様において、不均一性は初回の選択段階のみで導入され、反復プロセス中には生じない。
SELEX法の一つの態様において、選択プロセスは、選択された標的に非常に強く結合する核酸リガンドの単離において非常に効率的であるため、一つの選択・増幅サイクルしか必要とされない。そのような効率的な選択は、たとえば、クロマトグラフィー型プロセスにおいて実施され得、その場合、カラム上に結合した標的と結合できる核酸の能力は、親和性が最高である核酸リガンドの分離および単離をカラムが十分に可能にすることができるような様式で作用する。
多くの場合、一つの核酸リガンドが同定されるまでSELEXの反復工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響することなく置換または付加されることができるいくつかの配列を有する、核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。完了前にSELEXプロセスを終了させることにより、核酸リガンド溶液ファミリーのいくつかのメンバーの配列を決定することが可能である。本発明は、試験試料を特徴決定するためにいっしょに使用することができるアプタマープールの同定およびその使用を提供する。たとえば、アプタマープールを、疾患または病状を示す細胞、組織、または微小胞を同定するための複数ラウンドのポジティブ選択およびネガティブ選択を通して同定することができる。本発明はさらに、試料中のそのような細胞、組織、または微小胞を染色、検出、および／または定量し、それにより、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを可能にするための、そのようなアプタマープールの使用を提供する。
多様な核酸一次、二次および三次構造が存在することが知られている。非ワトソン-クリック型相互作用に非常に一般的に関与することが示された構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、擬似ノットおよびそれらの無数の組合せと呼ばれている。そのようなモチーフは通常、ヌクレオチド30個以下の核酸配列中に形成されることができる。この理由のため、多くの場合、隣接するランダム化セグメントを用いるSELEX法は、ヌクレオチド約20〜約50個、いくつかの態様においてはヌクレオチド約30〜約40個のランダム化セグメントを含む核酸配列によって開始されることが好ましい。一例において、5'固定：ランダム：3'固定配列は、ヌクレオチド約30〜約50個のランダム配列を含む。本明細書において、ランダム領域は可変領域とも称され得る。
コアSELEX法は、いくつかの具体的な目的を達成するように改変されている。たとえば、米国特許第5,707,796号は、特定の構造的特徴を有する核酸分子、たとえば、ベントDNAを選択するための、SELEX法とゲル電気泳動法との併用を記載している。米国特許第5,763,177号は、標的分子と結合および／または標的分子に光架橋および／または標的分子を光不活性化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,567,588号および米国特許第5,861,254号は、標的分子に対して高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと、標的分子に対して低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの高効率分割を達成するSELEXベースの方法を記載している。米国特許第5,496,938号は、SELEXプロセスを実施したのち、改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許第5,705,337号は、リガンドをその標的に共有結合させる方法を記載している。
SELEX法はまた、標的分子上の一つより多い部位に結合する核酸リガンドを得るために、また、標的上の特定の部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために、使用することもできる。SELEX法は、大小の生体分子、たとえば核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク質ならびに脂質、補因子、および他の小分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離し、同定するための手段を提供する。たとえば、米国特許第5,580,737号は、カフェインおよびその近縁類似物テオフィリンに高い親和性で結合することができる、SELEXによって同定された核酸配列を開示している。
カウンターSELEX法は、1種または複数種の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターSELEX法は、（a）核酸の候補混合物を調製する工程；（b）候補混合物を標的と接触させる工程であって、候補混合物に比べて標的に対して増大した親和性を有する核酸を候補混合物の残りから分割し得る、工程；（c）増大した親和性の核酸を候補混合物の残りから分割する工程；（d）増大した親和性の核酸を標的から分離させる工程；（e）増大した親和性の核酸を1種または複数種の非標的分子と接触させて、非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドを除去する工程；および（f）標的分子のみに対して特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合のための相対的に高い親和性および特異性を有する核酸配列に関して富化された核酸の混合物を得る工程で構成される。SELEX法に関して上述したように、選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用において遭遇する潜在的な問題が、ホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが、細胞内および細胞外の酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼにより、所望の効果が発現する前に体液中で急速に分解され得ることである。したがって、SELEX法は、改善された特性、たとえば改善されたインビボ安定性または改善された送達特性をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例は、リボースおよび／またはホスフェートおよび／または塩基位置における化学的置換を含む。修飾ヌクレオチドを含有するSELEX同定核酸リガンドは、たとえば、リボースの2'位、ピリミジンの5’位およびプリンの8’位が化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,660,985号、様々な2'修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する米国特許第5,756,703号および2'-アミノ(2'-NH2)、2'-フルオロ(2'-F)および／または2'-O-メチル(2'-OMe)置換基で修飾された1種または複数種のヌクレオチドを含有する高特異性核酸リガンドを記載する米国特許第5,580,737号に記載されている。
本発明において考慮される核酸リガンドの修飾は、さらなる電荷、分極性、疎水性、水素結合、静電気的相互作用および流出性を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に組み込む他の化学基を提供する修飾を含むが、それらに限定されない。また、耐ヌクレアーゼ性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するための修飾は、一つまたは複数の代替ヌクレオチド間結合、修飾糖、修飾塩基またはそれらの組合せを含むことができる。そのような修飾は、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨードウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートまたはアリルホスフェート修飾、メチル化および異例の塩基対組合せ、たとえばイソ塩基イソシチジンおよびイソグアノシンを含むが、これらに限定されない。修飾はまた、3'および5'修飾、たとえばキャッピングを含むことができる。
一つの態様においては、P(O)O基が、P(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、P(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COもしくはCH2（「ホルムアセタール」）または3'-アミン(-NH-CH2-CH2-)（式中、各RまたはR'は、独立して、Hまたは置換もしくは非置換のアルキルである）によって置換されているオリゴヌクレオチドが提供される。結合基は、-O-、-N-または-S-結合によって隣接ヌクレオチドに取り付けられることができる。オリゴヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。本明細書において使用される語「ホスホロチオエート」は、一つまたは複数の硫黄原子によって置換されているホスホジエステル結合中の一つまたは複数の非架橋酸素原子を包含する。
さらなる態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾された糖基を含み、たとえば、ヒドロキシル基の一つまたは複数が、ハロゲン、脂肪族基によって置換されている、またはエーテルもしくはアミンとして官能化されている。一つの態様において、フラノース残基の2'位が、O-メチル、O-アルキル、O-アリル、S-アルキル、S-アリルまたはハロ基のいずれかによって置換されている。2'修飾糖の合成法は、たとえば、Sproat, et al., Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991)；Cotten, et al., Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991)；およびHobbs, et al., Biochemistry 12:5138-5145 (1973)に記載されている。他の修飾が当業者に公知である。そのような修飾は、SELEXプロセス前の修飾であってもよいし、またはSELEXプロセス後の修飾（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）であってもよいし、またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾であってもよい。
SELEXプロセス前の修飾またはSELEXプロセスへの組み込みによって実施される修飾は、それらのSELEX標的に対する特異性および改善された安定性、たとえばインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じさせる。核酸リガンドに対して実施されるSELEXプロセス後の修飾は、核酸リガンドの結合能力に悪影響を及ぼすことなく、改善された安定性、たとえばインビボ安定性を生じさせ得る。
SELEX法は、米国特許第5,637,459号および米国特許第5,683,867号に記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを包含する。SELEX法はさらに、たとえば、米国特許第6,011,020号、米国特許第6,051,698号およびPCT公開公報WO98/18480に記載されているように、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性高分子量化合物と組み合わせて診断または治療複合体にすることを包含する。これらの特許および出願は、広範な形状および他の性質と、オリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製性ならびに他の分子の望ましい性質との組み合わせを教示している。
また、小さなフレキシブルペプチドに対する核酸リガンドをSELEX法によって同定することが研究されている。米国特許第5,648,214号により、11アミノ酸に対する高親和性RNA核酸リガンドが同定された。
関心対象の標的に対して所望の特異性および結合親和性を有する本発明のアプタマー/オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に記載されるSELEX Nプロセスによって選択することができる。SELEXプロセスの一部として、標的に結合するように選択された配列は、その後、場合によっては、所望の結合親和性を有する最小配列を決定するために最小化される。選択された配列および／または最小化された配列は、場合によっては、結合親和性を高める、または配列中のどの位置が結合活性にとって不可欠であるのか決定するために、配列のランダムまたは定方向突然変異誘発を実施することによって最適化される。加えて、選択は、アプタマー分子をインビボでの分解に対して安定化させるための修飾ヌクレオチドを組み込んだ配列を用いて実施することもできる。
治療剤としての使用に適したものとするアプタマーについては、合成が低コストであり、インビボで安全かつ安定であることが好ましい。野生型RNAおよびDNAアプタマーは一般に、ヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、インビボで安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、2'位における修飾基の組み込みによって大きく高めることができる。
フルオロおよびアミノ基がオリゴヌクレオチドプールにうまく組み込まれ、次いで、そのプールからアプタマーが選択されている。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを大きく増し、場合によっては、修飾オリゴヌクレオチドの分解および、その後の、DNA合成の基体としてのヌクレオチドの使用によって修飾ヌクレオチドが宿主DNA中に再循環される可能性のせいで、安全性の懸念を招くおそれがある。
本明細書に提供される、2'-O-メチル（「2'-OMe」）ヌクレオチドを含有するアプタマーは1つまたは複数の潜在的欠点を解消し得る。2'-OMeヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは耐ヌクレアーゼ性であり、安価に合成される。2'-OMeヌクレオチドは生物学的系中に遍在するが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下、2'-OMe NTPを基体として受け入れず、したがって、宿主DNA中への2'-OMeヌクレオチドの再循環に関して安全性の懸念はない。2'修飾アプタマーを生成するために使用されるSELEX法は、たとえば、いずれも参照により全体として本明細書に組み入れられる2002年12月3日に出願された米国特許仮出願第60/430,761号、2003年7月15日に出願された米国特許仮出願第60/487,474号、2003年11月4日に出願された米国特許仮出願第60/517,039号、2003年12月3日に出願された米国特許出願第10/729,581号および2004年6月21日に出願された「Method for in vitro Selection of 2'-O-methyl substituted Nucleic Acids」と題する米国特許出願第10/873,856号に記載されている。
治療
本明細書において使用される「治療有効量」とは、対象における疾患または障害などの医学的状態の一つまたは複数の症候を軽減する組成物の量（ある程度、熟練した医療実施者の判断による）をいう。加えて、組成物の「治療有効量」とは、疾患または病状と関連する、またはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを部分的または完全のいずれかに正常に戻す量を意味する。医療当業者は、たとえば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与または吸入によって投与されたとき特定の病状または障害を治療または予防するために、組成物の治療有効量を決定することができる。治療的に有効であるために求められる組成物の正確な量は、数多くの要因、たとえば有効薬剤の比活性、用いられる送達装置、薬剤の物理的特徴、投与の目的、さらには多くの患者固有の考慮事項に依存する。しかし、治療有効量の決定は、本明細書に記載される開示を考慮すると、通常の医療当業者の技能の範囲内である。
本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」は治癒的治療または予防的治療をいう。「予防的治療」の例は、標的の疾患（たとえば癌または他の増殖性疾患）またはそれに関連する病状の可能性の予防または軽減である。治療を必要とする者は、すでに疾患または病状を有する者ならびに予防される疾患または病状を有しやすい者を含む。本明細書において使用される語「治療する」、「治療」、「治療法」および「治療処置」はまた、疾患または関連の病状と戦うための哺乳動物の管理および看護をも指し、かつ疾患、病状の症候、副作用または他の合併症を緩和するための組成物の投与を含む。癌の治療処理は、手術、化学療法、放射線療法、遺伝子療法および免疫療法を含むが、それらに限定されない。
本明細書において使用される語「薬剤」または「薬」または「治療物質」とは、化学物質、化学物質の混合物、生物学的高分子または治療的性質を有することが疑われる生物学的材料、たとえばバクテリア、植物、真菌もしくは動物（特に哺乳動物）細胞または組織から作られる抽出物をいう。薬剤または薬は、精製、実質的に精製または部分的に精製されることができる。本発明の「薬剤」はまた、放射線治療剤または「化学療法剤」を含む。
本明細書において使用される語「診断物質」とは、罹患組織、たとえば腫瘍の画像化に使用される任意の化学物質をいう。
本明細書において使用される語「化学療法剤」とは、癌、新生物性および／もしくは増殖性疾患に対して活性を有する、または癌細胞を直接死滅させる能力を有する薬剤をいう。
本明細書において使用される「薬学的製剤」とは、有意な毒物学的有害作用を有しない、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を含む。本明細書において使用される「薬物学的に許容される製剤」とは、本発明の核酸分子をその所望の活性にとってもっとも適した物理的位置で効果的に分散させることができる組成物または製剤をいう。
本明細書において使用される語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与と適合性であるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に有効な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用は考慮される。
癌治療剤としてのアプタマー-毒素コンジュゲート
これまでの研究が、一定範囲の適応症のための、主に癌の治療に向けられ、第一に血液腫瘍に焦点を当てた潜在的治療としての抗体-毒素コンジュゲート（「免疫コンジュゲート」）の概念を広く展開している。タンパク質毒素、高効力小分子細胞毒、放射性同位体およびリポソーム封入薬物を含む、標的化送達のための多様な異なるペイロードが前臨床および臨床試験において試験されている。これらの努力は血液腫瘍のためのいくつかのFDA承認治療を生み出すことに成功したが、あるクラスとしての免疫コンジュゲート（特に固形腫瘍のための）は、非ヒト化抗体に対する中和抗体応答を発生させる傾向、固形腫瘍への限られた浸透、毒素コンジュゲートの結果としての標的結合親和性の損失および全体的治療指数を制限する抗体半減期と毒素コンジュゲート半減期との不均衡を含む抗体の複数の異なる性質に起因する困難に直面している（Reff and Heard, Critical Reviews in Oncology/Hematology, 40 (2001):25-35によって考察されている）。
アプタマーは標的認識の点で機能的に抗体に類似しているが、その吸収、分布、代謝および排泄（「ADME」）の性質が本質的に異なり、これらは通常、概して抗体と関連する免疫エフェクター機能（たとえば抗体依存的細胞傷害性、補体依存的細胞傷害性）の多くを欠いている。先に記載したアプタマーおよび抗体の性質の多くを比較する中で、いくつかの要因が、アプタマーを介する毒素送達が、抗体を用いる送達に対していくつかの具体的な利点を提供し、最終的には、治療としてより高い潜在能力をそれらに与えることを示唆する。抗体を介する毒素送達に対するアプタマーを介する毒素送達の利点のいくつかの例は以下のとおりである。
1）アプタマー-毒素コンジュゲートは完全に化学合成される。化学合成は、コンジュゲートの性質に対してより多大な制御を提供する。たとえば、化学量論比（アプタマーに対する毒素の比）および取り付けの部位を正確に定めることができる。様々なリンカー化学物質を容易に試験することができる。アプタマーフォールディングの可逆性は、コンジュゲート中の活性の損失が起こりにくく、かつコンジュゲート条件の調節においてより多くのフレキシビリティーを提供して収率を最大化することを意味する。
2）より小さなサイズがより良好な腫瘍への浸透を可能にする。固形腫瘍への抗体の不十分な浸透が、コンジュゲート手法の効能を制限する要因としてしばしば挙げられている。Colcher, D., Goel, A., Pavlinkova, G., Beresford, G., Booth, B., Batra, S. K. (1999) "Effects of genetic engineering on the pharmacokinetics of antibodies," Q. J. Nucl. Med., 43:132-139を参照すること。非PEG化抗テナシンCアプタマーの性質を対応する抗体と比較した研究が、腫瘍中への効率的な吸収（腫瘍：血液比によって決定される）を実証し、腫瘍に限局化されたアプタマーが予想外に長命である（t1/2＞12時間）ことを証明している（Hicke, B. J., Stephens, A. W., "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy", J. Clin. Invest., 106:923-928 (2000)）。
3）調節可能PK。ペイロードの性質に合致するようにアプタマー半減期／代謝をより容易に調節して、全身的暴露を最小限にしながらも毒素を腫瘍に送達する能力を最適化することができる。アプタマー主鎖の適切な修飾および高分子量PEGの付加がアプタマーの半減期をコンジュゲート毒素／リンカーの固有の半減期に合致させることを可能にし、非機能性毒素担持代謝産物への全身的暴露を最小限にし（t1/2（アプタマー）＜＜t1/2（毒素）の場合に予想される）、持続性の非コンジュゲートアプタマーがコンジュゲートアプタマーの吸収を機能的にブロックする可能性を下げる（t1/2（アプタマー）＞＞t1/2（毒素）の場合に予想される）。
4）相対的に低い材料要求基準。投薬レベルが細胞傷害性ペイロードに固有の毒性によって制限されることがあり得る。そのようなものとして、一つの治療過程がおそらく相対的に小さな量（＜100mg）のアプタマーしか必要とせず、オリゴヌクレオチド合成のコストがアプタマーベースの治療の障害となる可能性を減らす。
5）この適応症の場合には非経口投与が好ましい。患者／医師受諾を促すために代替の剤形を開発する特別な必要性はない。
本発明は、本明細書において提供されるアプタマーまたはその塩の治療的有効量、および、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物を提供する。本発明はまた、治療的有効量のアプタマーまたはその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。関連して、本発明は、それを必要とする対象に薬学的組成物を投与する工程を含む、疾患または障害を治療するかまたは寛解させる方法を提供する。対象に治療的有効量の組成物を投与する工程は、以下をもたらす：（a）活性物質単独の送達と比較した、疾患部位への活性物質の送達の増大；または（b）微小胞クリアランスの増大による、アプタマーの標的となる微小胞の血中濃度の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下；または（c）該アプタマーの標的となる微小胞の生物活性の、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、もしくは90%の低下。ある態様において、微小胞の生物活性は、免疫抑制または遺伝情報の伝達を含む。疾患または障害は、限定するわけではないが、本明細書に開示するものを含み得る。例えば、疾患または障害は、新生物性の、増殖性の、または炎症性の、代謝性の、心血管の、または神経性の疾患または障害を含み得る。「表現型」の項を参照すること。
抗標的および多価オリゴヌクレオチド
本明細書において記載されるように、オリゴヌクレオチドプローブの標的を同定することができる。たとえば、標的がタンパク質またはタンパク質複合体（たとえば核タンパク質またはリポタンパク質）を含む場合、標的を同定する工程は、質量分析法（MS）、ペプチド質量フィンガープリンティング（PMF；タンパク質フィンガープリンティング）、配列決定、N末端アミノ酸分析、C末端アミノ酸分析、エドマン分解、クロマトグラフィー、電気泳動、二次元ゲル電気泳動（2Dゲル）、抗体アレイまたはイムノアッセイの使用を含み得る。そのような手法は、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーによって認識される数多くの標的を同定するために適用されることができる。たとえば、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを関心対象の試料とともにインキュベートし、結合したライブラリーメンバーを捕捉し、捕捉されたメンバーに結合した標的を同定することができる。質量分析法を使用するそのような標的同定の例に関しては、本明細書における実施例9を参照すること。
様々な標的へのオリゴヌクレオチドアプタマーは複数の目的に使用することができる。いくつかの態様において、アプタマーは治療物質として使用される。外来性／ミスフォールド抗原（たとえば抗CD20、抗CD30、抗CD33、抗CD52、抗EGFR、抗ヌクレオリン、抗ヌクレオフォスミンなど）を認識する抗体を使用する免疫療法は、結合した治療物質を介して、または細胞媒介性細胞傷害性の活性化を介して免疫系を刺激することにより、標的細胞を選択的に死滅させることができる。アプタマーまたはオリゴヌクレオチドは、低いコスト、小さなサイズ、合成の容易さおよび速度、安定性ならびに低い免疫原性のような様々な理由のため、魅力的な免疫療法的代替である。ある態様においては、補体タンパク質および下流の膜攻撃複合体の動員を介する標的化細胞死滅のために、免疫療法剤を疾患特異的標的オリゴヌクレオチドまたは抗体（Ab）にコンジュゲートさせる。たとえば、Zhou and Rossi, Cell-type-specific, Aptamer-functionalized Agents for Targeted Disease Therapy, Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Jun 17;3:e l69. doi: 10.1038/mtna.2014.21；Pei et al., Clinical applications of nucleic acid aptamers in cancer, Mol Clin Oncol. 2014 May;2(3):341-348. Epub 2014 Feb 10を参照すること。この手法は、罹患宿主細胞、たとえば癌細胞、グラム陰性細菌、ウイルスおよび／または寄生生物感染などを標的とするように適用されることができる。
いくつかの態様において、本発明は、生物学的標的に特異的な結合物質を、免疫調節実体に特異的なもう1つの結合物質とともに含むマルチパータイト構築物を提供する。そのような構築物の例が図8に示されている。図中のデザイン1において、水平線はオリゴヌクレオチド構築物を示し、この構築物は、5'プライマー801（プライマー1）、関心対象の標的に対するアプタマーであることができる可変領域802、3'プライマー803（プライマー2）および免疫調節ドメイン領域（「IMD」）804を含む。完全なデザイン1構築物を使用して、関心対象の標的を免疫調節物質と近接させることができる。プライマーは、任意の所望の目的、たとえば増幅、捕捉、修飾、直接的または間接的な標識などのために設計されることができる。いくつかの態様において、可変領域の標的は疾患マーカーであり、したがって、構築物は、罹患組織、細胞または微小胞を標的とする。免疫調節ドメイン領域は、免疫刺激物質または抑制物質として作用することができる。任意の適切な免疫刺激物質または抑制物質、たとえば小分子、抗体またはアプタマーを使用することができる。したがって、構築物は、関心対象の標的における、たとえば標的を運ぶ細胞または微小胞における免疫応答を調節することができる。基本構築物を所望により改変することができる。たとえば、図8のデザイン2は、プライマー2（803）とIMD804との間にリンカー805を有する構築物を示す。このようなリンカーは、以下さらに説明され、所望により、構築物の任意の構成要素間に挿入されることができる。リンカーは構築物の領域間に所望の空間を提供することができ、かつ安定性のような他の特性に影響するように操作されることができる。図8のデザイン3は、IMD804がオリゴヌクレオチドであり、可変領域802およびIMD804がプライマー801と803との間にあるもう1つの例を示す。当業者は、デザイン2の805のような1つまたは複数のリンカーを、デザイン3に、たとえば可変領域802とIMD804との間に挿入することができることを理解するであろう。当業者はさらに、5'から3'へのオリゴヌクレオチドセグメントの順序を変更する、たとえば逆にすることができることを理解するであろう。
示したように、マルチパータイト構築物は、所望により、合成および／または修飾され得る。本発明のいくつかの態様において、マルチパータイトオリゴヌクレオチド構築物は、オリゴヌクレオチドセグメント間にリンカーを有して、または有さずに直接的に合成される。たとえば、プライマー1（801）およびプライマー2（803）による増幅を介して直接的に生成することができる図8のデザイン3を参照すること。1つまたは複数のリンカーは、可変領域セグメント802の標的とIMDセグメント804の標的との間に所望の間隔を作り出すためのスペーサーとして作用することができる。この間隔は、立体障害または他の考慮事項のために、コンピュータモデリングまたは実験によって決定することができる。
マルチパータイト構築物は、任意の適切な標的に対して生成することができる。標的は、非限定的に、腫瘍または罹患組織、細胞、癌細胞、循環腫瘍細胞（CTC）、免疫細胞（たとえばB細胞、T細胞、マクロファージ、樹状細胞）、微小胞、細菌、ウイルスまたは他の寄生生物を含むことができる。標的は、大きな生物学的複合体、たとえばタンパク質複合体、リボ核タンパク質複合体、脂質複合体またはそれらの組み合わせであることができる。マルチパータイト構築物の特異的標的は、前述の高分子標的の特定のメンバーであることができることが理解されよう。たとえば、マルチパータイト構築物の所望の標的が細胞または微小胞であると考えてみる。そのような場合、マルチパータイト構築物は、細胞または微小胞の特定のバイオマーカー、たとえば表面抗原に対することができる。非限定的な例として、関心対象の標的はB細胞であることができ、マルチパータイト構築物の可変領域の特異的標的はCD20であることができる。CD20は、B細胞リンパ腫および白血病の治療における薬剤として使用されるモノクローナル抗体（mAb）リツキシマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、イブリツモマブチウキセタンおよびトシツモマブによって標的とされるB細胞の細胞マーカーである。もう1つの非限定的な例として、関心対象の標的は癌細胞であることができ、マルチパータイト構築物の可変領域の特異的標的はc-METであることができる。METは、胚発育および創傷治癒に不可欠である膜受容体である。癌における異常なMET活性化は、異常に活性なMETが腫瘍増殖、新血管の形成（血管新生）および他の臓器への癌拡散（転移）を誘発する予後不良状態と相関する。METは、腎臓、肝臓、胃、乳房および脳の癌を含む多くのタイプのヒト悪性疾患において調節解除されることが認められている。所望により、他のバイオマーカーを特異的標的として使用することができる。たとえば、バイオマーカーは、本明細書における表3〜4または10〜17または2016年6月29日出願の国際特許出願PCT/US2016/040157の表4のいずれかより選択することができる。
上記のように、IDMドメインは、アポトーシスを誘導することができる補体媒介免疫応答を顕現させるように構築されることができる。そのようなIDMは、C1q、C1r、C1s、C1、C3a、C3b、C3d、C5a、C2、C4およびサイトカインを含むことができるが、それらに限定されない。IDM領域は、免疫刺激性であるCpG配列および／または抗増殖性またはアポトーシス促進性であることができるポリG配列のようなToll様受容体（TLR）アゴニストを非限定的に含むオリゴヌクレオチド配列を含み得る。この部分は、免疫応答を刺激するワクチン様部分または抗原であることができる。ある態様において、免疫刺激部分は超抗原を含む。いくつかの態様において、超抗原は、SE（staphylococcal enterotoxin）、SPE（Streptococcus pyogenes exotoxin）、TSST-1（Stapylococcus aureus toxic shock-syndrome toxin）、SME（streptococcal mitogenic exotoxin）、SSA（streptococcal superantigen）、肝炎表面抗原またはそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。本発明と使用することができる他の細菌性抗原は、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質A／トレハロースジコリノミコラート（Ribiアジュバント）、BCG（Calmette-Guerin Bacillus；Mycobacterium bovis）およびコルネバクテリウムパルバムなどの細菌性抗原を含む。免疫刺激部分はまた、非特異的な免疫刺激物質、たとえばアジュバントまたは他の非特異的免疫刺激物質であることもできる。有用なアジュバントは、非限定的に、アルミニウム塩、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、スクアレン、油、MF59およびAS03（「Adjuvant System 03」）を含む。アジュバントは、カチオン性リポソーム-DNA複合体JVRS-100、水酸化アルミニウムワクチンアジュバント、リン酸アルミニウムワクチンアジュバント、硫酸アルミニウムカリウムアジュバント、Alhydrogel、ISCOM(s）（商標）、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、CpG DNAワクチンアジュバント、コレラ毒素、コレラ毒素Bサブユニット、リポソーム、サポニンワクチンアジュバント、DDAアジュバント、スクアレン系アジュバント、Etx Bサブユニットアジュバント、IL-12ワクチンアジュバント、LTK63ワクチン変異体アジュバント、TiterMax Goldアジュバント、Ribiワクチンアジュバント、モンタナイドISA 720アジュバント、コルネバクテリウム由来P40ワクチンアジュバント、MPL（商標）アジュバント、AS04、AS02、リポ多糖ワクチンアジュバント、ムラミルジペプチドアジュバント、CRL1005、死菌コルネバクテリウムパルバムワクチンアジュバント、モンタナイドISA 51、Bordetella pertussis成分ワクチンアジュバント、カチオン性リポソームワクチンアジュバント、アダマンチルアミドジペプチドワクチンアジュバント、Arlacel A、VSA-3アジュバント、アルミニウムワクチンアジュバント、Polygenワクチンアジュバント、Adjumer（商標）、Algal Glucan、Bay R1005、Theramide（登録商標）、ステアリルチロシン、Specol、アルガムリン、Avridine（登録商標）、リン酸カルシウムゲル、CTA1-DD遺伝子融合タンパク質、DOC／ミョウバン複合、ガンマイヌリン、Gerbuアジュバント、GM-CSF、GMDP、組み換えhIFN-ガンマ／インターフェロン-g、インターロイキン-1β、インターロイキン-2、インターロイキン-7、Sclavoペプチド、Rehydragel LV、Rehydragel HPA、ロキソリビン、MF59、MTP-PEリポソーム、ムラメチド、ムラパルミチン、D-ムラパルミチン、NAGO、非イオン界面活性剤小胞、PMMA、タンパク質コクリエート、QS-21、SPT（抗原製剤）、ナノエマルションワクチンアジュバント、AS03、Quil-Aワクチンアジュバント、RC529ワクチンアジュバント、LTR192Gワクチンアジュバント、大腸菌易熱性毒素、LT、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウムアジュバント、リン酸カルシウムワクチンアジュバント、モンタナイド不完全セピックアジュバント、イミキモド、レシキモド、AF03、フラジェリン、Poly(I:C）、ISCOMATRIX（登録商標）、Abisco-100ワクチンアジュバント、アルブミン-ヘパリン微粒子ワクチンアジュバント、AS-2ワクチンアジュバント、B7-2ワクチンアジュバント、DHEAワクチンアジュバント、共刺激分子に対する抗体を含有する免疫リポソーム、SAF-1、センダイタンパクリポソーム、センダイ含有脂質マトリックス、トレオニルムラミルジペプチド（TMDP）、Ty粒子ワクチンアジュバント、ブピバカインワクチンアジュバント、DL-PGL（ポリエステルポリ（DL-ラクチド-co-グリコリド））ワクチンアジュバント、IL-15ワクチンアジュバント、LTK72ワクチンアジュバント、MPL-SEワクチンアジュバント、コレラ毒素mCT-E112Kの非毒性変異体E112KおよびMatrix-Sからなる群より選択することができる。本発明のマルチパータイト構築物と使用することができるさらなるアジュバントは、Vaxjoデータベースを使用して特定することができる。Sayers S, Ulysse G, Xiang Z, and He Y. Vaxjo: a web-based vaccine adjuvant, database and its application for analysis of vaccine adjuvants and their uses in vaccine development. Journal of Biomedicme and Biotechnology. 2012;2012:831486. Epub 2012 Mar 13. PMID: 22505817; www.violinet.org/vaxjo/を参照すること。他の有用な非特異的免疫刺激物質は、ヒスタミン、インターフェロン、トランスファーファクター、タフトシン、インターロイキン-1、女性ホルモン、プロラクチン、成長ホルモンビタミンD、デオキシコール酸（DCA）、テトラクロロデカオキシド（TCDO）およびイミキモドまたはレシキモド（toll様受容体7を介して免疫細胞を活性化する薬物である）を含む。たとえば、アポトーシスを刺激することができる補体指向性セグメントを有する、免疫刺激性であるCpG配列に及ぶセグメントを使用して、１つより多い免疫調節部分を含むマルチパータイト構築物を創製することができる。
修飾
インビボ安定性、特異性、親和性、結合活性またはヌクレアーゼ感受性を非限定的に含む所望の特性を変化させるために、本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチドに対して修飾を実施することができる。半減期の変化は、インビボで安定性を改善し得る、または安定性を低下させてインビボ毒性を制限し得る。そのような変更は、変異、切断または伸長を含むことができる。また、マルチパータイトオリゴヌクレオチド構築物の5'および／または3'末端は、安定性を調節するために保護または脱保護されることができる。インビボ安定性、特異性、親和性、結合活性またはヌクレアーゼ感受性を改善する、または半減期を変化させてインビボ毒性に影響するための修飾は、5'または3'末端にあり得、かつ、ロックド核酸（LNA）組み込み、アンロックド核酸（UNA）組み込み、ホスホジエステル主鎖に代わるホスホロチオエート主鎖、アミノ修飾物質（すなわちC6-dT）、色素コンジュゲート（Cy色素、蛍光体など）、ビオチン化、PEGリンカー、クリックケミストリーリンカー、ジデオキシヌクレオチド末端ブロッカー、逆転末端塩基、コレステロールTEGまたは他の脂質ベースの標識を含むが、これらに限定されない。
本発明のオリゴヌクレオチドのセグメントの結合オプションは、オリゴヌクレオチドの5'もしくは3'末端または抗体の第一級アミン、スルフヒドリルもしくはカルボキシル基にあることができ、かつ、ビオチン-標的オリゴヌクレオチド／Ab、ストレプトアビジン-補体オリゴヌクレオチドまたはその逆、アミノ修飾標的Ab／オリゴヌクレオチド、チオール／カルボキシ-補体オリゴヌクレオチドまたはその逆、クリックケミストリー-標的Ab／オリゴヌクレオチド、対応するクリックケミストリーパートナー-補体オリゴヌクレオチドまたはその逆を含むが、これらに限定されない。結合は、共有結合的であっても非共有結合的であってもよく、かつ、DNA足場（すなわちDNA折り紙構造）、薬物／化学療法剤、ナノ粒子、微粒子またはミセルもしくはリポソームへの一価、多価（すなわち二価、三価または四価）アセンブリを含み得るが、これらに限定されない。
リンカー領域は、長さおよびタイプが異なることができるホモまたは多官能価反応基を有するスペーサーを含むことができる。これらは、スペーサーC18、PEG4、PEG6、PEG8およびPEG12を含むが、これらに限定されない。
本発明のマルチパータイトオリゴヌクレオチドはさらに、所望の生物学的効果を加えるためのさらなる要素を含むことができる。たとえば、本発明のオリゴヌクレオチドは膜分断部分を含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、そのような効果を提供する1つまたは複数の化学的部分にコンジュゲートされてもよい。たとえば、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的細胞または微小胞の膜を分断するために界面活性剤様部分にコンジュゲートされてもよい。有用なイオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、ラウリル硫酸ナトリウム（SLS））、ラウレス硫酸ナトリウム（SLS、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ラウリル硫酸アンモニウム（ALS）、臭化セトリモニウム、塩化セトリモニウム、ステアリン酸セトリモニウムなどを含む。有用な非イオン性（両性イオン性）界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコール、ポリソルベート20（Tween20とも知られる）、他のポリソルベート（たとえば40、60、65、80など）、トリトン-X（たとえばX100、X114）、3-[（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、CHAPSO、デオキシコール酸、デオキシコール酸ナトリウム、NP-40、グリコシド、オクチル-チオ-グルコシド、マルトシドなどを含む。当業者は、膜分断部分のような機能的フラグメントを本発明のオリゴヌクレオチドに共有結合的または非共有結合的に結合させることができることを理解するであろう。
マルチパータイト構築物のセグメントを含むオリゴヌクレオチドセグメントは、当技術分野において公知の任意の所望の塩基修飾を含むことができる。特定の態様において、オリゴヌクレオチドセグメントは10〜50ヌクレオチドの長さである。当業者は、これが、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチドの長さまたはその中で導かれ得る任意の範囲の長さのオリゴヌクレオチドを具現化するということを理解するであろう。
特定の態様において、マルチパータイト構築物は、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドでできている2つ以上の化学的に異なる領域を含有するキメラオリゴヌクレオチドを含む。そのようなキメラは、マルチパータイト、多価などの語を使用して参照されることができる。オリゴヌクレオチド部分は、1つまたは複数の有益な性質、たとえば増大したヌクレアーゼ耐性、バイオアベイラビリティ、標的に対する増大した結合親和性を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも1つの領域を含有し得る。本発明のキメラ核酸は、2つ以上のオリゴヌクレオチド、2つ以上のタイプのオリゴヌクレオチド（たとえばDNAおよびRNAセグメントの両方）、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成され得る。そのような化合物はまた、当技術分野においてハイブリッドとも呼ばれている。そのようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許は、米国特許第5,013,830号；第5,149,797号；第5,220,007号；第5,256,775号；第5,366,878号；第5,403,711号；第5,491,133号；第5,565,350号；第5,623,065号；第5,652,355号；第5,652,356号および第5,700,922号を含むが、これらに限定されない。これらの特許それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキルまたは2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを非限定的に含む、糖の2'位で修飾された少なくとも1つのヌクレオチドを含む。他の態様において、RNA修飾は、ピリミジンのリボース上の2'-フルオロ、2'-アミノおよび2'O-メチル修飾、RNAの3'末端の塩基残基または逆塩基を含む。このような修飾は慣例的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、いくつかの場合、所与の標的に対し、2'-デオキシオリゴヌクレオチドよりも高い標的結合親和性を有することが示されている。
多数のヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾が、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ消化に対してより耐性にし、それにより、インビボ半減期を延長することが示されている。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、たとえばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環糖間結合を含む主鎖を含むものを含む。本発明の構築物は、ホスホロチオエート主鎖および／またはヘテロ原子主鎖、たとえばCH2-NH-O-CH2、CH、〜N(CH3）〜0〜CH2（メチレン（メチルイミノ）またはMMI主鎖として知られる］、CH2-O-N（CH3）-CH2、CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2およびO-N（CH3）-CH2-CH2主鎖（天然ホスホジエステル主鎖はO-P―O-CHとして表される）；アミド主鎖（De Mesmaeker et ah, 1995）；モルホリノ主鎖構造（Summerton and Weller、米国特許第5,034,506号）；ペプチド核酸（PNA）主鎖（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖によって置換され、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している（Nielsen, et al., 1991）を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。これらのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。リン含有結合は、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'アルキレンホスホネートおよびキラルなホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体ならびにヌクレオシド単位の隣接対が3*-5*から5*-3*または2*-5*から5*-2*に結合している、逆の極性を有するものを含むが、これらに限定されない。それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,196号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,306号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；および第5,625,050号を参照すること。モルホリノ系オリゴマー化合物は、当技術分野において公知であり、Braasch & Corey, Biochemistry vol. 41, no. 14, 2002, pages 4503-4510；Genesis vol. 30, 2001, page 3；Heasman, J. Dev. Biol. vol. 243, 2002, pages 209-214；Nasevicius et al. Nat. Genet. vol. 26, 2000, pages 216-220；Lacerra et al. Proc. Natl. Acad. Sci. vol. 97, 2000, pages 9591-9596および1991年7月23日に発行された米国特許第5,034,506号に記載されている。これらのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物が、Wang et al., J. Am. Chem. Soc. Vol. 122, 2000, pages 8595-8602に記載されている。この内容は全体として本明細書に組み入れられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、所望により、少なくともそのような望まれる修飾を含むことができる。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成されることができる主鎖を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合N、O、SおよびCH2成分を有する他のものを含む。それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,264,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,610,289号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号および第5,677,439号を参照すること。本発明のオリゴヌクレオチドは、所望により、少なくともそのような修飾を含むことができる。
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の置換糖部分、たとえば以下の1つを2'位に含む：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2）nCH3、O（CH2）nNH2またはO（CH2）nCH3（nは1〜約10である）；Ci〜CIO低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールもしくはアラルキル；CI；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-もしくはN-アルキル；O-、S-もしくはN-アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA開裂基；レポーター基；インターカレータ；オリゴヌクレオチドの薬物動態性質を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬物動態／薬力学的性質を改善するための基ならびに類似の特性を有する他の置換基。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ［2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メトキシエチル）とも知られる］を含む。他の好ましい修飾は、2*-メトキシ（2*-O-CH3）、2*-プロポキシ（2*-OCH2CH2CH3）および2*-フルオロ（2*-F）を含む。オリゴヌクレオチド上の他の位置、たとえば3'末端ヌクレオチド上の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位で類似の修飾が加えられてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣物を有し得る。
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは1つまたは複数の塩基修飾および／または置換を含む。本明細書において使用される「非修飾」または「天然」塩基は、アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シトシン（C）およびウラシル（U）を含む。修飾塩基は、非限定的に、天然の核酸中にはまれに、または一時的にしか見られない塩基、たとえばヒポキサンチン、6-メチルアデニン、5-Meピリミジン、特に5-メチルシトシン（5-メチル-2'デオキシシトシンとも呼ばれ、しばしば当技術分野において5-Me-Cと呼ばれる）、5-ヒドロキシメチルシトシン（HMC）、グリコシルHMCおよびゲントビオシルHMCならびに合成塩基、たとえば2-アミノアデニン、2-（メチルアミノ）アデニン、2-（イミダゾリルアルキル）アデニン、2-（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-ブロモウラシル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6（6-アミノヘキシル）アデニンおよび2,6-ジアミノプリン（Kornberg, 1980；Gebeyehu, et ah, 1987）を含む。当技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、たとえばイノシンを含めることもできる。5-Me-C置換を含めることもできる。これらは、核酸二本鎖安定性を0.6〜1.20C高めることが示されている。たとえば、Sanghvi et al., 'Antisense Research & Applications', 1993, CRC PRESS pages 276-278を参照すること。さらなる適当な修飾塩基が、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第3,687,808号ならびに第4,845,205号；第5,130,302号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,596,091号；第5,614,617号；第5,750,692号および第5,681,941号に記載されている。
所与のオリゴヌクレオチド中のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、前述の修飾の1つよりも多くが単一のオリゴヌクレオチドに組み込まれてもよいし、さらには、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド内に組み込まれてもよい。
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチド内の1つまたは複数のヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、すなわち主鎖の両方が新規な基で置換される。塩基は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されることができる。ハイブリダイゼーション性を保持することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物の1つである、1つのそのようなオリゴマー化合物がペプチド核酸（PNA）と呼ばれる。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、たとえばアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持され、かつ主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。PNA化合物の調製を教示する代表的な特許は、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,539,082号；第5,714,331号および第5,719,262号を含むが、これらに限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、参照により本明細書に組み入れられるNielsen et al. Science vol. 254, 1991, page 1497に見ることができる。
特定の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性、細胞分布または限局化を増強する1つまたは複数の部分またはコンジュゲートに結合（共有結合的または非共有結合的に）している。そのような部分は、非限定的に、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Letsmger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. vol. 86, 1989, pages 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. vol. 4, 1994, pages 1053-1060）、チオエーテル、たとえばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al. Ann. N. Y. Acad. Sci. Vol. 660, 1992, pages 306-309；Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. vol. 3, 1993, pages 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al. Nucl. Acids Res. vol. 20, 1992, pages 533-538）、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Kabanov et al. Febs Lett. vol. 259, 1990, pages 327-330；Svinarchuk et al. Biochimie. vol. 75, 1993, pages 49-54）、リン脂質、たとえばジヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharan et al. Tetrahedron Lett. vol. 36, 1995, pages 3651-3654；Shea et al. Nucl. Acids Res. vol. 18, 1990, pages 3777-3783）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Mancharan et al. Nucleosides & Nucleotides vol. 14, 1995, pages 969-973）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al. Tetrahedron Lett. vol. 36, 1995, pages 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al. Biochim. Biophys. Acta vol. 1264, 1995, pages 229-237）またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-tオキシコレステロール部分（Crooke et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. vol. 277, 1996, pages 923-937）を含む。これらのそれぞれは全体として参照により本明細書に組み入れられる。また、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号；第5,580,731号；第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号；第5,391,723号；第5,416,203号；第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号および第5,688,941号を参照すること。
本発明のオリゴヌクレオチドは、所望により、多様な修飾ヌクレオチドを組み込むように修飾されることができる。たとえば、構築物は、修飾ヌクレオチドだけで合成されてもよいし、修飾ヌクレオチドのサブセットで合成されてもよい。修飾は、同じであることもできるし異なることもできる。一部またはすべてのヌクレオチドが修飾されてもよく、修飾されるヌクレオチドは同じ修飾を含有し得る。たとえば、同じ塩基を含有するすべてのヌクレオチドが1つのタイプの修飾を有し得、他方、他の塩基を含有するヌクレオチドは異なるタイプの修飾を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドは1つのタイプの修飾を有し得（または非修飾である）、他方、すべてのピリミジンヌクレオチドはもう1つの異なるタイプの修飾を有する（または非修飾である）。したがって、構築物は、たとえばリボヌクレオチド（2'-OH）、デオキシリボヌクレオチド（2'-デオキシ）、2'-アミノヌクレオチド（2'-NH2）、2'-フルオロヌクレオチド（2'-F）および2'-O-メチル（2'-OMe）ヌクレオチドを含む、所望の修飾の任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された構築物を生成するために、修飾ヌクレオチドを含有する転写混合物を使用して合成される。たとえば、転写混合物は、2'-OMe A、G、CおよびUおよび／またはT三リン酸（2'-OMe ATP、2'-OMe UTPおよび／または2*-OMe TTP、2*-OMe CTPおよび2*-OMe GTP）のみを含有してもよい（MNAまたはmRmY混合物と呼ばれる）。それから生成されるオリゴヌクレオチドは、MNAオリゴヌクレオチドまたはmRmYオリゴヌクレオチドと呼ばれ、2'-O-メチルヌクレオチドのみを含有する。すべての2'-OHヌクレオチドを含有する転写混合物は「rN」混合物と呼ばれ、それから生成されるオリゴヌクレオチドは「rN」、「rRrY」またはRNAオリゴヌクレオチドと呼ばれる。すべてのデオキシヌクレオチドを含有する転写混合物は「dN」混合物と呼ばれ、それから生成されるオリゴヌクレオチドは「dN」、「dRdY」またはDNAオリゴヌクレオチドと呼ばれる。あるいはまた、ヌクレオチドのサブセット（たとえばC、Uおよび/またはT）が第一の修飾ヌクレオチド（たとえば2'-OMe）ヌクレオチドを含み得、残り（たとえばAおよびG）が第二の修飾ヌクレオチド（たとえば2'-OHまたは2'-F）を含む。たとえば、2'-F Uおよび2'-OMe A、GおよびCを含有する転写混合物は「fUmV」混合物と呼ばれ、それから生成されるオリゴヌクレオチドは「fUmV」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。2'-F AおよびGならびに2'-OMe CおよびUおよび／またはTを含有する転写混合物は「fRmY」混合物と呼ばれ、それから生成されるオリゴヌクレオチドは「fRmY」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。2'-F Aおよび2'-OMe C、GおよびUおよび／またはTを含む転写混合物は「fAmB」混合物と呼ばれ、それから生成されるオリゴヌクレオチドは「fAmB」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。
当業者は、様々なプロセス変更を使用して、事前に同定されたアプタマーセグメント（たとえば、バイオマーカー標的または他の実体に対するアプタマーを含む可変領域または免疫調節領域）を改善することができる。そのようなプロセス変更の例は、糖または塩基の切断、欠失、置換もしくは修飾またはヌクレオチド間結合、キャッピングおよびPEG化を含むが、これらに限定されない。加えて、アプタマーの配列要件を、ドープされた再選択またはアプタマー医薬品化学によって探求し得る。ドープされた再選択は、関心対象のアプタマーに基づいて設計された合成縮重プールを使用して実施される。縮重のレベルは通常、関心対象のアプタマーから約70〜85％変化する。一般に、ニュートラル変異を有する配列は、ドープされた再選択プロセスを通して同定される。アプタマー医薬品化学は、変異体アプタマーのセットが化学的に合成されるアプタマー改良技術である。次いで、これらの変異体を互いおよび親アプタマーと比較する。アプタマー医薬品化学は、置換基の、大域的ではなく局所的な導入を探究するために使用される。たとえば、以下の変更を導入することができる。糖、塩基および／またはヌクレオチド間結合における修飾、たとえば2'-デオキシ、2'-リボまたは2'-O-メチルプリンまたはピリミジン、ホスホロチオエート結合をヌクレオチド間に導入してもよく、エキソヌクレアーゼによる分解をブロックするためにキャップをアプタマーの5'または3'末端に導入してもよく（たとえば3'逆転dTキャップ）、ポリエチレングリコール（PEG）要素をアプタマーに加えて対象におけるアプタマーの半減期を増加させてもよい。
発明のオリゴヌクレオチドを含むさらなる組成物およびその使用が以下にさらに記載される。本発明は、関心対象の特定の組織、細胞、微小胞または他の生物学的実体に結合するオリゴヌクレオチドプローブを同定する方法を提供するため、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはそのような実体を標的とし、本質的に、薬物候補物質、標的化薬物送達に使用することができる作用物質または両方である。
薬学的組成物
ある局面において、本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを、たとえば独立型薬物として、薬物送達物質として、上記のようなマルチパータイト構築物として、またはそれらの任意の組み合わせとして含む薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、そのような組成物を投与する方法を提供する。
本明細書において使用される用語「状態」とは、身体機能、系または臓器の中断、停止または障害をいう。代表的な状態は、疾患、たとえば癌、炎症、糖尿病および臓器不全を含むが、これらに限定されない。
語句「治療する」、「〜の治療」などは、特定された状態の寛解または停止を含む。
語句「予防する」、「〜の予防」などは、発生の回避を含む。
本明細書において使用される用語「塩」は、共有結合していないが、イオン相互作用によって化学的に結合している2つの化合物をいう。
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」とは、薬学的組成物の成分を参照するとき、その成分が、動物に投与されたとき、妥当なベネフィット／リスク比に見合って、過度な有害作用、たとえば過度な毒性、刺激またはアレルギー反応を生じさせないことをいう。したがって、本明細書において使用される用語「薬学的に許容される有機溶媒」とは、動物に投与されたとき、妥当なベネフィット／リスク比に見合って、過度な有害作用、たとえば過度な毒性、刺激またはアレルギー反応を生じさせない有機溶媒をいう。好ましくは、薬学的に許容される有機溶媒は、米国食品医薬品局（「FDA」；Food and Drug Administration）によって一般に安全と認められている（「GRAS」；generally recognized as safe）溶媒である。同様に、本明細書において使用される用語「薬学的に許容される有機塩基」とは、動物に投与されたとき、妥当なベネフィット／リスク比に見合って、過度な有害作用、たとえば過度な毒性、刺激またはアレルギー反応を生じさせない有機塩基をいう。
本明細書において使用される語句「注射可能」または「注射可能な組成物」とは、シリンジの中に引き込み、動物に皮下、腹腔内または筋内注射することができ、組成物中の固形物の存在のせいで有害作用を生じさせることのない組成物をいう。固形物は、結晶、ガム質およびゲルを含むが、これらに限定されない。一般的に、製剤または組成物は、その製剤を98°Fで0.22μmフィルタに通したとき、その約15％以下、好ましくは約10％以下、より好ましくは約5％以下、さらにより好ましくは約2％以下、もっとも好ましくは約1％以下しかフィルタ上に保持されないならば、注射可能とみなされる。しかし、シリンジから容易に小出しすることができるが、0.22μmフィルタ上に保持される、ゲルである本発明の組成物がいくつかある。1つの態様において、本明細書において使用される用語「注射可能」は、そのようなゲル組成物を含む。1つの態様において、本明細書において使用される用語「注射可能」はさらに、約40℃までの温度に加温されたのち、0.22μmフィルタに通してろ過されたとき、製剤の約15％以下、好ましくは約10％以下、より好ましくは約5％以下、さらにより好ましくは約2％以下、もっとも好ましくは約1％以下しかフィルタ上に保持されない組成物を含む。1つの態様において、注射可能な薬学的組成物の例は、薬学的に許容される溶媒中、薬学的活性の化合物（たとえば、本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチド、たとえばマルチパータイト構築物、抗C1Qオリゴヌクレオチド、上記のような10.36オリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせ）の溶液である。当業者は、注射可能な溶液が固有の性質、たとえば無菌性、薬学的に許容される賦形剤を有し、有害な量の発熱物質または類似の汚染物質を有しないことを理解するであろう。
本明細書において使用される用語「溶液」とは、1つまたは複数の物質（溶質）が1つまたは複数の他の物質（溶媒）、一般的には液体中に分子またはイオンレベルで均一に分散した混合物をいう。
本明細書において使用される用語「懸濁液」とは、水性または非水性であることができる溶媒中に固体粒子が均一に分散したものをいう。
本明細書において使用される用語「動物」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、両生類、爬虫類およびトリを含むが、これらに限定されない。代表的な動物は、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、有蹄類、チンパンジー、サル、ヒヒ、ニワトリ、シチメンチョウ、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、イヌ、ネコおよびヒトを含むが、これらに限定されない。1つの態様において、動物は哺乳動物である。1つの態様において、動物はヒトである。1つの態様において、動物は非ヒトである。1つの態様において、動物はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタである。
本明細書において使用される語句「薬物デポ」とは、本発明の1つまたは複数のオリゴヌクレオチド、たとえばマルチパータイト構築物、抗C1Qオリゴヌクレオチド、上記のような10.36オリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせを含む、治療される動物の体内で形成される析出物であって、オリゴヌクレオチドを時間とともに放出して薬学的有効量のオリゴヌクレオチドを提供する析出物をいう。
本明細書において使用される語句「〜を実質的に含まない」とは、約2重量％未満をいう。たとえば、語句「水を実質的に含まない薬学的組成物」とは、薬学的組成物中の水の量が薬学的組成物の約2重量％未満であることをいう。
本明細書において使用される用語「有効量」とは、動物における状態を治療または予防するのに十分な量をいう。
発明のオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、たとえば、動物に投与されたとき、それらの安定性を改善する、すなわちそれらのインビボ半減期を改善する、および／またはそれの排泄速度を低下させるように修飾されることができる。用語「修飾（された）」は、ヌクレオチドが、共有結合的に修飾された塩基および／または糖を有することを包含する。たとえば、修飾ヌクレオチドは、3'位のヒドロキシル基以外および5'位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドはまた、2'置換糖、たとえば2'-O-メチル；2'-O-アルキル；2'-O-アリル；2'-S-アルキル；2'-S-アリル；2'-フルオロ-；2'-ハロまたは2'-アジド-リボース；炭素環式糖類似体；α-アノマー糖；およびエピマー糖、たとえばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖およびセドヘプツロースを含み得る。
修飾ヌクレオチドは当該技術分野において公知であり、かつ、アルキル化プリンおよび／またはピリミジン；アシル化プリンおよび／またはピリミジン；または他の複素環を含むが、これらに限定されない。これらのクラスのピリミジンおよびプリンは当技術分野において公知であり、かつ、擬イソシトシン；N4,N4-エタノシトシン；8-ヒドロキシ-N6-メチルアデニン；4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル；5-フルオロウラシル；5-ブロモウラシル；5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル；5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル、イノシン；N6-イソペンチル-アデニン；1-メチルアデニン；1-メチル擬ウラシル；1-メチルグアニン；2,2-ジメチルグアニン；2-メチルアデニン；2-メチルグアニン；3-メチルシトシン；5-メチルシトシン；N6-メチルアデニン；7-メチルグアニン；5-メチルアミノメチルウラシル；5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル;β-D-マンノシルケオシン；5-メトキシカルボニルメチルウラシル；5-メトキシウラシル；2メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン；ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル；擬ウラシル；2-チオシトシン；5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル；4-チオウラシル；5-メチルウラシル；N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル5-オキシ酢酸；ケオシン；2-チオシトシン；5-プロピルウラシル；5-プロピルシトシン；5-エチルウラシル；5-エチルシトシン；5-ブチルウラシル；5-ペンチルウラシル；5-ペンチルシトシン；および2,6-ジアミノプリン；メチル擬ウラシル；1-メチルグアニンおよび1-メチルシトシンを含む。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、1つまたは複数のホスホジエステル結合を代替の連結基で置換することによって修飾されることができる。代替の連結基は、P（O）OがP（O）S、P（S）S、P（O）NR2、P（O）R、P（O）OR'、COまたはCH2によって置換されている態様を含むが、それらに限定されない（ここで、各RまたはR'は、独立して、Hまたは置換または非置換のC1〜C20アルキルである）。P（O）NR2基のR置換の好ましいセットは水素およびメトキシエチルである。連結基は、一般的には、―O―結合を介して各隣接するヌクレオチドに結合されるが、―N―または―S―結合を含むように修飾されてもよい。オリゴマー中のすべての結合が同一である必要はない。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、動物に投与されたとき、たとえば排泄速度を低下させるために、ポリマーへのコンジュゲーションによって修飾されることができる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、「PEG化される」、すなわちポリエチレングリコール（「PEG」）にコンジュゲートされることができる。1つの態様において、PEGは、約20kD〜80kDの範囲である平均分子量を有する。オリゴヌクレオチドをポリマー、たとえばPEGとコンジュゲートさせる方法は当業者に公知である（たとえば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1966を参照すること）。
本発明のオリゴヌクレオチド、たとえばマルチパータイト構築物、抗C1Qオリゴヌクレオチド、上記のような10.36オリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせは、本明細書において開示される、または当技術分野において公知である薬学的組成物において使用することができる。
1つの態様において、薬学的組成物はさらに溶媒を含む。
1つの態様において、溶媒は水を含む。
1つの態様において、溶媒は薬学的に許容される有機溶媒を含む。任意の有用な薬学的に許容される有機溶媒を本発明の組成物に使用することができる。
1つの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される有機溶媒中、塩の溶液である。
1つの態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される有機溶媒を含み、さらに、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンを含む。理論によって拘束されることを望まないが、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物が水に注入されたとき析出物の形成を促進し、かつ得られる析出物からのオリゴヌクレオチドの徐放を促進することができると考えられる。一般的に、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物の0重量％超〜10重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物の約0.1〜10重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物の約1〜7.5重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物の約1.5〜5重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、リン脂質、スフィンゴミエリンまたはホスファチジルコリンは、薬学的組成物の約2〜4重量％の範囲である量で存在する。
薬学的組成物は、任意で、動物への投与に適した剤形を提供するために、1つまたは複数のさらなる賦形剤または添加物を含むことができる。動物に投与されるとき、オリゴヌクレオチド含有薬学的組成物は一般的に、動物への適当な投与のための剤形を提供するために、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物の成分として投与される。適当な薬学的賦形剤は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676（Alfonso R. Gennaro ed., 19th ed. 1995）に記載されている。薬学的組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液剤を含有するカプセル剤、粉剤、坐剤、乳剤、エアロゾル剤、スプレー剤、懸濁剤または使用に適した他の形態を取ることができる。
1つの態様において、薬学的組成物は、静脈内または非経口投与のために製剤化される。一般的に、静脈内または非経口投与のための組成物は、等張水性バッファまたは薬学的に許容される有機溶媒であり得る適当な滅菌溶媒を含む。必要ならば、組成物はまた、可溶化剤を含むことができる。静脈内投与のための組成物は、任意で、注射部位における痛みを減らすための、リドカインのような局所麻酔薬を含むことができる。一般に、成分は、別々に供給される、または、単位剤形において、たとえば活性物質の量を示すアンプルまたはサシェのような密閉容器中に乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として混合されるいずれかである。オリゴヌクレオチド含有薬学的組成物が注入によって投与される場合、それらは、たとえば、たとえば薬学的グレードの滅菌水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて投薬されることができる。薬学的組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるよう、注射のための滅菌水、生理食塩水または他の溶媒、たとえば薬学的に許容される有機溶媒のアンプルを提供することができる。
もう1つの態様において、薬学的組成物は、慣例的な手順にしたがって、経口投与に適合した組成物として製剤化される。経口送達のための組成物は、たとえば錠剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤、顆粒剤、粉剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることができる。経口組成物は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような標準的な賦形剤を含むことができる。一般的に、賦形剤は薬学的グレードの賦形剤である。経口投与される組成物はまた、薬学的に美味な製剤を提供するために、1つまたは複数の作用物質、たとえばフルクトース、アスパルテームまたはサッカリンのような甘味料；ペパーミント、ウィンターグリーン油またはチェリーのような着香料；着色料；および保存料を含有する。そのうえ、錠剤または丸剤の形態である場合、組成物は、胃腸管中での分解および吸収を遅らせ、それにより、長期間にわたって持続的作用を提供するために、コーティングされることもできる。また、浸透圧的活性の駆動性化合物を包み込む選択的に透過性の膜が経口投与組成物に適している。グリセロールモノステアレートまたはグリセロールステアレートのような時間遅延物質を使用することもできる。
溶媒をさらに含む薬学的組成物は、任意で、微生物増殖に対するさらなる防護を提供するために、望むならば、適量の薬学的に許容される保存料を含むことができる。本発明の薬学的組成物に有用な保存料の例は、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸およびその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、たとえばブチルパラベン、アルコール、たとえばエチルまたはベンジルアルコール、フェノール系化合物、たとえばフェノールまたは第四級化合物、たとえば塩化ベンザルコニウム（たとえば塩化ベンゼトニウム）を含むが、これらに限定されない。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、任意で、適量の薬学的に許容されるポリマーを含有する。ポリマーは薬学的組成物の粘度を高めることができる。本発明の組成物および方法における使用に適したポリマーは、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、キトサン、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸を含むが、これらに限定されない。
一般的に、ポリマーは、薬学的組成物の0重量％超〜10重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、ポリマーは、薬学的組成物の約0.1〜10重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、ポリマーは、薬学的組成物の約1〜7.5重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、ポリマーは、薬学的組成物の約1.5〜5重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、ポリマーは、薬学的組成物の約2〜4重量％の範囲である量で存在する。1つの態様において、本発明の薬学的組成物はポリマーを実質的に含まない。
1つの態様において、本発明の薬学的組成物に加えられる任意のさらなる成分は、動物による使用または消費のためにFDAによってGRASと指定されている。1つの態様において、本発明の薬学的組成物に加えられる任意のさらなる成分は、ヒトによる使用または消費のためにFDAによってGRASと指定されている。
薬学的組成物の成分（溶媒および任意の他の任意の成分）は、好ましくは、生体適合性かつ非毒性であり、時間とともに体によって簡単に吸収および／または代謝される。
上記のように、本発明の薬学的組成物はさらに溶媒を含むことができる。
1つの態様において、溶媒は水を含む。
1つの態様において、溶媒は薬学的に許容される有機溶媒を含む。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、たとえばマルチパータイト構築物、抗C1Qオリゴヌクレオチド、上記のような10.36オリゴヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせは、金属カチオンの塩、たとえばカリウムまたはナトリウム塩として利用可能である。しかし、これらの塩は、水性溶媒および／または有機溶媒中に低い溶解度、一般的には約25mg/mL未満の溶解度しか有し得ない。しかし、（i）アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドおよび（ii）プロトン化オリゴヌクレオチドを含む本発明の薬学的組成物は、水性溶媒および／または有機溶媒中に有意により可溶性であり得る。理論によって拘束されることを望まないが、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドおよびプロトン化オリゴヌクレオチドは、先に説明したような塩を形成し、その塩が水性および／または有機溶媒中に可溶性であると考えられる。
同様に、理論によって拘束されることを望まないが、（i）本発明のオリゴヌクレオチド、（ii）二価金属カチオン；および（iii）任意で、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンを含む薬学的組成物は、先に説明したような塩を形成し、その塩が水性および／または有機溶媒中に可溶性であると考えられる。
1つの態様において、溶媒中の本発明のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中の本発明のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約5重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約7.5重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約10重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約12重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約15重量％よりも高い。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜5重量％の範囲である。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜7.5重量％の範囲である。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜10重量％の範囲である。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜12重量％の範囲である。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜15重量％の範囲である。1つの態様において、溶媒中のオリゴヌクレオチドの濃度は薬学的組成物の約2重量％〜20重量％の範囲である。
任意の薬学的に許容される有機溶媒を本発明の薬学的組成物に使用することができる。代表的な薬学的に許容される有機溶媒は、ピロリドン、N-メチル-2-ピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（すなわち1,3-プロピレングリコール）、グリセロールホルマール、イソソルビドジメチルエーテル、エタノール、ジメチルスルホキシド、テトラグリコール、テトラヒドロフルフリルアルコール、トリアセチン、プロピレンカーボネート、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水溶性溶媒である。代表的な薬学的に許容される水溶性有機溶媒はトリアセチンである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水混和性溶媒である。代表的な薬学的に許容される水混和性有機溶媒は、グリセロールホルマール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はピロリドンを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないピロリドンである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はN-メチル-2-ピロリドンを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないN-メチル-2-ピロリドンである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はポリエチレングリコールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないポリエチレングリコールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はプロピレングリコールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないプロピレングリコールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はグリセロールホルマールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないグリセロールホルマールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はイソソルビドジメチルエーテルを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないイソソルビドジメチルエーテルである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はエタノールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないエタノールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はジメチルスルホキシドを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないジメチルスルホキシドである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はテトラグリコールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないテトラグリコールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はテトラヒドロフルフリルアルコールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないテトラヒドロフルフリルアルコールである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はトリアセチンを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないトリアセチンである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はプロピレンカーボネートを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないプロピレンカーボネートである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はジメチルアセトアミドを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないジメチルアセトアミドである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はジメチルホルムアミドを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、別の有機溶媒を実質的に含まないジメチルホルムアミドである。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は少なくとも2つの薬学的に許容される有機溶媒を含む。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はN-メチル-2-ピロリドンおよびグリセロールホルマールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はN-メチル-2-ピロリドンおよびグリセロールホルマールである。1つの態様において、N-メチル-2-ピロリドンとグリセロールホルマールとの比は約90：10〜10：90の範囲である。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はプロピレングリコールおよびグリセロールホルマールを含む。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒はプロピレングリコールおよびグリセロールホルマールである。1つの態様において、プロピレングリコールとグリセロールホルマールとの比は約90：10〜10：90の範囲である。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、動物による投与または消費のためにFDAによってGRASと承認されている溶媒である。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は、ヒトによる投与または消費のためにFDAによってGRASと承認されている溶媒である。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水を実質的に含まない。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水を約1重量％未満しか含有しない。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水を約0.5重量％未満しか含有しない。1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒は水を約0.2重量％未満しか含有しない。水を実質的に含まない薬学的に許容される有機溶媒が、細菌増殖を助長しないため、好都合である。したがって、一般的に、水を実質的に含まない薬学的組成物に保存料を含める必要はない。好ましくは水を実質的に含まない薬学的に許容される有機溶媒を溶媒として使用する薬学的組成物のもう1つの利点は、オリゴヌクレオチドの加水分解が最小限になることである。一般的に、溶媒中に存在する水が多ければ多いほど、オリゴヌクレオチドはより容易に加水分解されてしまう。したがって、薬学的に許容される有機溶媒を溶媒として使用するオリゴヌクレオチド含有薬学的組成物は、水を溶媒として使用するオリゴヌクレオチド含有薬学的組成物よりも安定であることができる。
薬学的に許容される有機溶媒を含む1つの態様において、薬学的組成物は注射可能である。
1つの態様において、注射可能な薬学的組成物は、20ゲージ針に容易に引き込み、次いでその20ゲージ針から容易に押し出すことができるような十分に低い粘度を有する。一般的に、注射可能な薬学的組成物の粘度は約1,200cP未満である。1つの態様において、注射可能な薬学的組成物の粘度は約1,000cP未満である。1つの態様において、注射可能な薬学的組成物の粘度は約800cP未満である。1つの態様において、注射可能な薬学的組成物の粘度は約500cP未満である。約1,200cPよりも高い粘度、さらには約2,000cPよりも高い粘度を有する注射可能な薬学的組成物（たとえばゲル）もまた、18〜24ゲージ針に通して押し出すことができるならば、本発明の範囲内である。
薬学的に許容される有機溶媒を含む1つの態様において、薬学的組成物は注射可能であり、水に注入されたとき析出物を形成しない。
薬学的に許容される有機溶媒を含む1つの態様において、薬学的組成物は注射可能であり、水に注入されたとき析出物を形成する。理論によって拘束されることを望まないが、プロトン化オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸エステルまたはアミドを含む薬学的組成物の場合、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドのαアミノ基がオリゴヌクレオチドによってプロトン化されて、先に説明したような塩を形成し、その塩が、薬学的に許容される有機溶媒には可溶性であるが、水には不溶性であると考えられる。同様に、薬学的組成物が（i）オリゴヌクレオチド；（ii）二価金属カチオン；および（iii）任意で、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンを含むとき、組成物の成分が、先に説明したような塩を形成し、その塩が、薬学的に許容される有機溶媒には可溶性であるが、水には不溶性であると考えられる。したがって、薬学的組成物が動物に注入されると、薬学的組成物の少なくとも一部が注射部位で析出して薬物デポを提供する。理論によって拘束されることを望まないが、薬学的組成物が動物に注入されると、薬学的に許容される有機溶媒が注射部位から拡散し、水性体液が注射部位に向かって拡散し、その結果、注射部位における水の濃度を増大させ、それが、組成物の少なくとも一部分を析出させ、薬物デポを形成させると考えられる。析出物は、固体、結晶、ガム質またはゲルの形態を取ることができる。しかし、析出物は、時間とともにオリゴヌクレオチドを放出する、オリゴヌクレオチドのデポを注射部位に提供する。薬学的組成物の成分、すなわちアミノ酸エステルまたはアミノ酸アミド、薬学的に許容される有機溶媒および任意の他の成分は、生体適合性かつ非毒性であり、時間とともに体によって簡単に吸収および／または代謝される。
薬学的に許容される有機溶媒を含む1つの態様において、薬学的組成物は注射可能であり、水に注入されたとき（一般的に、約500μLが約4mLの水に注入される）リポソームまたはミセル構造を形成する。リポソームまたはミセル構造の形成は、薬学的組成物がリン脂質を含む場合、もっとも頻繁に形成される。理論によって拘束されることを望まないが、塩（アミノ酸エステルまたはアミドとで形成される塩であることもできるし、二価金属カチオンおよび任意で、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンとの塩であることもできる）の形態にあるオリゴヌクレオチドがリポソームまたはミセル構造内に捕らえられると考えられる。理論によって拘束されることを望まないが、これらの薬学的組成物が動物に注射されると、リポソームまたはミセル構造が時間とともにオリゴヌクレオチドを放出すると考えられる。
1つの態様において、薬学的に許容される有機溶媒をさらに含む薬学的組成物は、薬学的に許容される有機溶媒中、固体粒子の懸濁液である。理論によって拘束されることを望まないが、固体粒子は、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドとプロトン化オリゴヌクレオチドとの間で形成された塩を含み、オリゴヌクレオチドの酸性リン酸基が、先に説明したように、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドのアミノ基をプロトン化する、または先に説明したように、オリゴヌクレオチド；二価金属カチオン；および任意のカルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンとの間で形成された塩を含むと考えられる。懸濁液である薬学的組成物はまた、動物に注入されたとき薬物デポを形成することができる。
アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性および／または分子量を変えることにより、これらの成分を含み、かつさらに有機溶媒を含む薬学的組成物の性質を変化させることが可能である。アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性および／または分子量は、アミノ酸エステル（またはアミノ酸アミド）を形成するために使用されるアミノ酸および／またはアルコール（またはアミン）を変えることによって変化させることができる。たとえば、アミノ酸エステルの親水性および／または分子量は、アミノ酸エステルのR1炭化水素基を変えることによって変化させることができる。一般的に、R1の分子量を増加させると、アミノ酸エステルの親油性は高まる。同様に、アミノ酸アミドの親油性および／または分子量は、アミノ酸アミドのR3またはR4基を変えることによって変化させることができる。
たとえば、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性および／または分子量を変えることにより、本発明のオリゴヌクレオチドの水への溶解度を変化させ、オリゴヌクレオチドの有機溶媒への溶解度を変化させ、溶媒を含む薬学的組成物の粘度を変化させ、薬学的組成物を20ゲージ針に引き込み、次いでその20ゲージ針から放出するときの容易さを変化させることが可能である。
さらに、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性および／または分子量を変えることにより（すなわち、アミノ酸エステルのR1またはアミノ酸アミドのR3およびR4を変えることにより）、有機溶媒をさらに含む薬学的組成物が水に注入されたとき析出物を形成するかどうかを制御することが可能である。異なるオリゴヌクレオチドは異なる溶解度および挙動を示すが、一般に、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの分子量が高ければ高いほど、プロトン化オリゴヌクレオチドとアミドのアミノ酸エステルとの塩が水に注入されたとき析出物を形成する可能性は高くなる。一般的に、アミノ酸エステルのR1が約C16以上の炭化水素である場合、薬学的組成物は水に注入されたとき析出物を形成し、アミノ酸エステルのR1が約C12以下の炭化水素である場合、薬学的組成物は水に注入されたとき析出物を形成しない。実際、R1が約C12以下の炭化水素であるアミノ酸エステルの場合、プロトン化オリゴヌクレオチドとアミノ酸エステルとの塩は、多くの場合、水溶性である。同様に、アミノ酸アミドの場合、R3とR4との合計炭素数が16以上であるならば、薬学的組成物は一般的に水に注入されたとき析出物を形成し、R3とR4との合計炭素数が12以下であるならば、薬学的組成物は水に注入されたとき析出物を形成しない。薬学的に許容される有機溶媒をさらに含む薬学的組成物が水に注入されたとき析出物を形成するかどうかは、薬学的組成物約0.05mLを約98°Fの水約4mLに注入し、組成物を水と混合し、ろ過したのち、0.22μmフィルタ上にどれだけの物質が保持されるかを測定することにより、容易に決定することができる。一般的に、製剤の10％以下しかフィルタ上に保持されないとき、製剤または組成物は注射可能であるとみなされる。1つの態様においては、製剤の5％以下しかフィルタ上に保持されない。1つの態様においては、製剤の2％以下しかフィルタ上に保持されない。1つの態様においては、製剤の1％以下しかフィルタ上に保持されない。
同様に、プロトン化オリゴヌクレオチドおよびアスパラギン酸またはグルタミン酸のジエステルまたはジアミドを含む薬学的組成物においては、アスパラギン酸またはグルタミン酸のジエステルまたはジアミドの量および／または親油性および／または分子量を変えることにより、薬学的組成物の性質を変化させることが可能である。同様に、オリゴヌクレオチド；二価の金属カチオン；およびカルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンを含む薬学的組成物においては、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンの量および／または親油性および／または分子量を変えることにより、薬学的組成物の性質を変化させることが可能である。
さらに、有機溶媒をさらに含む薬学的組成物が動物に投与されたときデポを形成する場合、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性および／または分子量を変えることにより、オリゴヌクレオチドが薬物デポから放出される速度を変化させることが可能である。一般に、アミノ酸エステルまたはアミノ酸アミドの親油性が高ければ高いほど、オリゴヌクレオチドがデポから放出される速度は遅くなる。同様に、有機溶媒をさらに含み、かつまた、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のジエステルもしくはジアミドをさらに含む薬学的組成物が動物に投与されたときデポを形成する場合、カルボキシレート、リン脂質、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンまたはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸のジエステルもしくはジアミドの量および／または親油性および／または分子量を変えることにより、オリゴヌクレオチドが薬物デポから放出される速度を変化させることが可能である。
析出物からの放出速度は、遠心管中、薬学的組成物約50μLを脱イオン水約4mLに注入することによって計測することができる。薬学的組成物を水に注入したときの時間をT＝0と記録する。指定された時間Tののち、試料を約-9℃に冷却し、遠心分離機上、約13,000rpmで約20分間スピニングする。得られる上清をHPLCによって分析して、水溶液中に存在するオリゴヌクレオチドの量を測定する。また、遠心分離から得られたペレット中のオリゴヌクレオチドの量を、ペレットを捕集し、ペレットをメタノール約10μLに溶解し、メタノール溶液をHPLCによって分析して析出物中のオリゴヌクレオチドの量を測定することにより、測定することもできる。水溶液中のオリゴヌクレオチドの量および析出物中のオリゴヌクレオチドの量は、オリゴヌクレオチドに対応するHPLCピークのピーク面積をオリゴヌクレオチドの濃度に対するオリゴヌクレオチドピーク面積の標準曲線に対して比較することによって測定される。適当なHPLC条件は当業者によって容易に決定されることができる。
治療法
本発明の薬学的組成物はヒト医学および獣医学において有用である。したがって、本発明はさらに、有効量の本発明の薬学的組成物を動物に投与する工程を含む、動物における状態を治療または予防する方法に関する。
1つの態様において、本発明は、動物における状態を治療する方法であって、有効量の本発明の薬学的組成物を、その必要がある動物に投与する工程を含む方法に関する。
1つの態様において、本発明は、動物における状態を予防する方法であって、有効量の本発明の薬学的組成物を、その必要がある動物に投与する工程を含む方法に関する。
投与の方法は、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入または局所投与法を含むが、これらに限定されない。投与の形態は施術者の裁量に委ねられる。いくつかの態様において、投与は、本発明のオリゴヌクレオチド、たとえばアプタマー、薬物標的化アプタマー、マルチパータイト構築物またはそれらの任意の組み合わせの、血流中への放出を生じさせる。
1つの態様において、動物における状態を治療または予防する方法は、本発明の薬学的組成物を非経口投与することにより、有効量のオリゴヌクレオチドを、その必要がある動物に投与する工程を含む。1つの態様において、薬学的組成物は注入またはボーラス注入によって投与される。1つの態様において、薬学的組成物は皮下投与される。
1つの態様において、動物における状態を治療または予防する方法は、本発明の薬学的組成物を経口投与することにより、有効量のオリゴヌクレオチドを、その必要がある動物に投与する工程を含む。1つの態様において、組成物はカプセル剤または錠剤の形態にある。
薬学的組成物はまた、任意の他の好都合な経路によって、たとえば局所的に、上皮または粘膜皮膚ライニング（たとえば経口、直腸および腸粘膜など）を通す吸収によって投与することもできる。
薬学的組成物は、全身投与することもできるし、局所投与することもできる。
薬学的組成物は、別の生物活性物質とともに投与することができる。
1つの態様において、動物は哺乳動物である。
1つの態様において、動物はヒトである。
1つの態様において、動物は非ヒト動物である。
1つの態様において、動物はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジまたはブタである。
動物に投与される有効量は、治療される動物のタイプ、治療される状態、状態の重篤度および投与される具体的なマルチパータイト構築物を非限定的に含む多様な要因に依存する。治療を実施する医師が、動物における状態を治療するための薬学的組成物の有効量を決定することができる。
1つの態様において、マルチパータイト構築物は血管形成を阻害することができる。1つの態様において、マルチパータイト構築物は血管形成を阻害することができ、治療される疾患は癌である。1つの態様において、アプタマーは血管形成を阻害することができ、治療される疾患は固形腫瘍である。
マルチパータイト構築物は、新生物増殖または癌を阻害するマルチパータイト構築物であることができる。態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹部神経膠腫；脳腫瘍（脳幹部神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮細胞癌；頸部扁平上皮細胞癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽頭癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。本発明の組成物および方法は、これらおよび他の癌を治療するために使用することができる。
オリゴヌクレオチドプローブ法
核酸配列は、二次および三次モチーフ、特にそれらのヌクレオチド配列へとフォールディングする。これらのモチーフは、配列が、タンパク質および他のアミノ酸配列を非限定的に含む標的分子上の特定の位置に結合することを可能にする位置において核酸配列に正および負の電荷を配置する。これらの結合配列は当技術分野においてアプタマーとして知られている。相対的に短いヌクレオチドの伸長（たとえば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39または40個のヌクレオチド）においてさえ何兆もの特有のヌクレオチド配列が可能であるせいで、多様なモチーフを生成して、ほぼいかなる所望のタンパク質または他の標的のためのアプタマーも得ることができる。
上記したように、アプタマーは、特定の長さ、一般には20〜80塩基対長、たとえば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80塩基対長のオリゴヌクレオチドをランダムに生成することによって創製されることができる。そして、これらのランダムなヌクレオチドを関心対象の標的（たとえば、組織、細胞、微小胞、タンパク質など）と共にインキュベートする。いくつかの洗浄工程ののち、標的に結合するオリゴヌクレオチドを捕集し、増幅する。そして、増幅されたアプタマーを反復的に標的に加え、プロセスを多くの場合15〜20回繰り返す。このプロセスの一般的なバージョンが当業者にSELEX法として知られている。
最終結果は、標的に対して高い親和性を有する1種または複数種のオリゴヌクレオチドプローブ/アプタマーを含む。本発明は、所望の特徴を提供するために使用することができる、そのような得られたアプタマーのさらなる処理：1）所望のエピトープに対するアプタマーを同定するための競合的結合アッセイ；2）高親和性結合アプタマーをインシリコで同定するためのモチーフ分析；および3）特定の疾患を検出するために使用することができるアプタマーを同定するための、アプタマー選択アッセイ、を提供する。方法は、以下、実施例においてさらに詳細に説明される。
本発明はさらに、本発明の方法によって発見される配列と相同性が高いアプタマー配列を考慮する。「高い相同性」とは、一般に、ポリヌクレオチド配列と参照配列との間で40％以上、好ましくは60％以上、70％以上、より好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高い相同性をいう。ある態様において、参照配列は、本明細書に提供される1種または複数種のアプタマーの配列を含む。相同率（同一率とも呼ばれる）は一般に、二つの最適に整列させた配列の間で実施される。比較のために配列を整列させる方法は当技術分野において周知である。配列の最適な整列および比較は、たとえば"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"中のアルゴリズムを使用して実施することができる。また、相同性算出は、BLASTを使用して実施することができる。BLASTは、NCBIサーバ：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/（Altschul S F, et al, Nucleic Acids Res. 1997; 25(17):3389-402；Altschul S F, et al, J Mol. Biol. 1990; 215(3):403-10）で見いだすことができる。参照配列、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば本明細書の方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
本発明はさらに、本発明の方法によって見いだされる配列の機能性フラグメントであるアプタマー配列を考慮する。アプタマー配列に関連して、アプタマー配列の「機能性フラグメント」は、完全長配列と同じ標的に結合する配列を含み得る。いくつかの場合、候補アプタマー配列は、5'リーダー配列および／または3'テール配列を含むライブラリーのメンバーからの配列である。そのようなリーダー配列またはテール配列は、増幅または捕捉などのためのプライマー結合を容易にするように働き得る。これらの態様において、完全長配列の機能性フラグメントは、リーダーおよび／またはテール配列を有しない、候補アプタマー配列の部分配列を含み得る。
競合的抗体付加
公知のアプタマー製造法は、結合したすべてのアプタマーを標的配列から溶離させる工程を含み得る。いくつかの場合、これは、所望のアプタマー配列を容易には同定しないかもしれない。たとえば、アッセイ中に抗体を交換しようとするとき、交換される抗体の特定のエピトープに結合するアプタマーだけを捕集することが望ましい場合もある。本発明は、抗体エピトープに結合するアプタマーの選択的捕集を可能にするために、交換される抗体をアプタマー／標的反応に付加する工程を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物を関心対象の標的と共にインキュベートする工程、標的に結合しない非結合アプタマーを反応混合物から除去する工程、関心対象のエピトープに結合する抗体を反応混合物に加える工程、および抗体によって置換されるアプタマーを捕集する工程を含む。標的は本明細書に開示されるものなどの生物学的実体、たとえばタンパク質であることができる。
モチーフ分析
アプタマー実験においては、所与の標的に結合する複数のアプタマー配列を同定することができる。これらのアプタマーは様々な結合親和性を有する。これら多くのアプタマーをそれぞれの親和性を評価するのに十分な量で生成するには時間と労力を要する。大きなサブセットを物理的にスクリーニングすることなく最高の親和性を有する多数のアプタマーを同定するために、本発明は、関心対象の標的に対する一つまたは複数の高親和性アプタマーの二次元構造の分析を含む方法を提供する。ある態様において、方法は、類似した二次元構造、すなわちモチーフを有するが、必ずしも類似した一次配列を有するわけではないアプタマーを求めてデータベースをスクリーニングする工程を含む。ある態様において、方法は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような従来の方法（たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法）を使用して高親和性アプタマーを同定する工程、高親和性アプタマーの二次元構造を近似する工程、および高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程を含む。これにより、方法は、関心対象の標的にも結合する候補のプールを提供する。オリゴの二次元構造は、当技術分野において公知の方法を使用して、たとえば、内容が参照により全体として本明細書に組み入れられるMathews, D., Sabina, J., Zucker, M. & Turner, H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters provides robust prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999)；Hofacker et al., Monatshefte f. Chemie 125: 167-188 (1994)；およびHofacker, I. L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids Res. 31, 3429-3431 (2003)に記載されているように、市販のソフトウェアプログラム、たとえばViennaまたはmFoldを使用して実施される自由エネルギー（ΔG）算出によって予測することができる。図2A〜2Bを参照すること。配列のプールは、ランダムに生成されたアプタマー候補のプールから、ハイスループット配列決定プラットフォーム、たとえば Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)のイオントレントプラットフォームまたはIllumina, Inc (San Diego, CA) のHiSeq/NextSeq/MiSeqプラットフォームを使用して配列決定することができる。高親和性アプタマーに類似した二次元構造を有すると予測されるアプタマーを配列のプールから同定する工程は、得られた配列を好みのソフトウェアプログラムにロードして、高親和性アプタマーと同様な二次元構造を有する配列プールのメンバーを同定する工程を含み得る。そして、配列のプールの親和性をインサイチューで、たとえば表面プラズモン共鳴結合アッセイ法などで測定することができる。
アプタマーサブトラクション法
疾患、たとえば癌を検出するためのアッセイ法を開発するためには、一般に、正常および罹患患者由来の既知のバイオマーカーの大きな集団をスクリーニングして、疾患と相関するマーカーを同定する。このプロセスは、弁別マーカーがすでに記載されている場合にはうまくいく。この問題に対処するために、本発明は、はじめに非標的組織、微小胞、細胞、または他の関心対象の標的と共にインキュベートすることにより、大きなアプタマープールから非弁別アプタマーを取り除く工程を含む方法を提供する。非標的実体は、正常/健常/非罹患試料に由来することができる。そして、正常な非標的実体に結合しなかったアプタマーを罹患実体と共にインキュベートする。そして、罹患実体に結合するが、正常な実体には結合しなかったアプタマーが、疾患を検出するためのアッセイ法にとって可能な候補である。このプロセスは、罹患試料中の特定のマーカーの存在を知ることからは独立している。
サブトラクション法は、所望の標的集団を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用することができる。ある態様において、サブトラクション法は、対照（たとえば正常または非罹患）集団由来の標的よりも罹患標的集団由来の標的を優先的に認識するアプタマーを同定するために使用される。罹患標的集団は、罹患個体由来の組織または細胞もしくは微小胞の集団であり得、一方で、対照集団は非罹患個体由来の対応する組織、細胞、または微小胞を含む。疾患は、癌または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の疾患であることができる。したがって、方法は、対照標的よりも罹患標的を優先的に同定するアプタマーを提供する。
対照試料、たとえば、関心対象の疾患を有しない、たとえば癌を有しない「正常」個体由来の血漿から、循環微小胞を単離することができる。試料中の微小胞を、本明細書に開示される、または当技術分野において公知である方法を使用して単離する。たとえば、小胞は、以下の方法：ろ過法、限外ろ過法、ナノメンブレン限外ろ過法、ExoQuick試薬(System Biosciences, Inc., Mountain View, CA)、遠心分離法、分子クラウディング試薬（たとえばLife TechnologiesのTEXIS）を使用する超遠心分離、ポリマー沈降法（たとえばポリエチレングリコール(PEG))、アフィニティー単離法、アフィニティー選択法、免疫沈降法、クロマトグラフィー、サイズ排除、またはこれらの方法のいずれかの組み合わせの一つにより、血漿から単離することができる。各場合に単離された微小胞は、微小胞タイプの混合物であり、様々なサイズを有すると考えられるが、超遠心分離法では、エキソソームサイズの小胞を生成する傾向がより大きい。ランダムに生成されたオリゴヌクレオチドライブラリー（たとえば、本明細書の実施例に記載されるように製造される）を、単離した正常な小胞と共にインキュベートする。これらの小胞に結合しないアプタマーは、たとえば小胞を（たとえばPEGにより）沈降させ、非結合アプタマーを含む上清を捕集することによって単離する。そして、これらの非結合アプタマーを、罹患患者から単離された小胞と接触させて（たとえば上記と同じ方法を使用して）、アプタマーに罹患小胞を認識させる。次に、疾患小胞に結合したアプタマーを捕集する。ある態様において、小胞は、単離したのち、カオトロピック剤（たとえばSDSまたは類似した洗浄剤）を使用して溶解させ、その後、溶解混合物をアフィニティーカラムに通すことによってアプタマーを捕捉する。アフィニティーカラムは、ビオチンにコンジュゲートしたアプタマープールの場合には、ストレプトアビジンビーズを含み得る。その後、単離したアプタマーを増幅する。そして、このプロセスを、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20回またはそれ以上繰り返して、標的に対する所望の選択性を有するアプタマーを得ることができる。
本発明の一つの局面においては、関心対象の生物学的試料を特徴決定するために使用することができるアプタマープロフィールを同定する。ある態様においては、ランダムに生成されたオリゴヌクレオチド、たとえば少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドのプールを、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しないオリゴヌクレオチドを単離したのち、試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させる。試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合するオリゴヌクレオチドを保持する。保持されたオリゴヌクレオチドを使用して、保持されたオリゴヌクレオチドを対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と接触させ、対照集団由来の関心対象の生物学的成分または標的に結合しない保持されたオリゴヌクレオチドを単離し、それらの単離されたオリゴヌクレオチドを試験集団由来の関心対象の生物学的成分または標的と再び接触させ、結合するオリゴヌクレオチドを単離することにより、プロセスを繰り返すことができる。「成分」または「標的」は、オリゴヌクレオチドが結合することができる、試料中に存在する任意のもの（たとえば組織、細胞、微小胞、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）であることができる。プロセスは、任意の望ましい反復回数、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20回またはより多くの回数、繰り返すことができる。得られるオリゴヌクレオチドは、対照集団に対して試験集団を示差的に検出することができるアプタマーを含む。これらのアプタマーはアプタマープロフィールを提供し、アプタマープロフィールは、1種または複数種のアプタマーを使用して判定されるバイオシグネチャー、たとえば、1種または複数種のアプタマーを使用して検出される成分または標的の存在またはレベルを含むバイオシグネチャーを含む。
例示的なプロセスが図3に示されており、これは対照としての正常（非癌）個体由来のエキソソームを使用して、癌エキソソームを優先的に認識するアプタマーを同定する方法を実証する。図中、エキソソームが例示されているが、当業者は、他の微小胞を同じやり方で使用することができることを理解するであろう。得られるアプタマーは、正常なエキソソームから癌エキソソームを示差的に検出することができるプロフィールを提供することができる。当業者は、同じ工程を使用して、関心対象の任意の疾患または病状を特徴決定するためのアプタマープロフィールを導出することができることを理解するであろう。組織、細胞、または関心対象の他の標的を用いてプロセスを適用することもできる。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片を提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長を用いて実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、アプタマープロフィールを使用して生物学的表現型を特徴決定する方法を提供する。アプタマープロフィールは、上記方法を使用して決定することができる。アプタマープロフィールは、試験試料に関して決定し、対照アプタマープロフィールと比較することができる。表現型は、癌のような疾患または障害であり得る。表現型の特徴決定は、非限定的に、診断、予後判定またはセラノーシスを提供することを含むことができる。したがって、アプタマープロフィールは、試料が採取された対象に関する診断、予後判定および／またはセラノーシス読み出しを提供することができる。
もう一つの態様において、アプタマープロフィールは、アプタマー分子のプールを試験試料と接触させ、同じアプタマープールを対照試料と接触させ、試験試料中の成分または標的に示差的に結合するが、対照試料中の成分または標的には示差的に結合しない（またはその反対）1種または複数種のアプタマー分子を同定することにより、試験試料に関して決定される。生物学的試験試料または対照試料に関して使用される「成分」または「標的」は、アプタマーが結合することができる、試料中に存在する任意のものであることができる（たとえば組織、細胞、微小胞、ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、糖質、脂質など）。たとえば、試料が血漿または血清試料であるならば、アプタマー分子は、非罹患対象に比べて疾患状態においてのみ発現する、または示差的に発現（過剰または過少発現）するポリペプチドバイオマーカーに結合し得る。試験試料中のアプタマープロフィールと対照試料中のアプタマープロフィールとの比較は、アプタマー結合の定性的および定量的尺度に基づき得る（たとえば、結合と非結合または試験試料中の結合レベルと参照対照試料中の異なる結合レベル）。
ある局面において、本発明は、生物学的試験試料をアプタマー分子のプールと接触させる工程、プールを対照生物学的試料と接触させる工程、前記試験試料中の成分に結合するが、対照試料には結合しない1種または複数種のアプタマーを同定し、それにより、前記生物学的試験試料のアプタマープロフィールを同定する工程を含む、標的特異的アプタマープロフィールを同定する方法を提供する。ある態様において、アプタマーのプールは、疾患試料に対して選択され、参照試料と比較され、疾患試料中の成分に結合するが、参照試料中の成分には結合しないサブセット中のアプタマーを従来の配列決定技術によって配列決定して、結合するサブセットを同定し、それにより、特定の疾患試料のアプタマープロフィールを同定することができる。このようにして、アプタマープロフィールは、スクリーニングされる他の試料中の疾患を検出するための個別化プラットフォームを提供する。さらには、適切な参照または対照試料を選択することにより、アプタマープロフィールは、試験試料が採取された対象に関する診断、予後判定および／またはセラノーシス読み出しを提供することができる。
関連の局面において、本発明は、（a）生物学的対照試料をオリゴヌクレオチドのプールと接触させる工程；（b）生物学的対照試料に結合しない、オリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットを単離する工程；（c）生物学的試験試料をオリゴヌクレオチドのプールの第一のサブセットと接触させる工程；および（d）生物学的試験試料に結合するオリゴヌクレオチドのプールの第二のサブセットを単離し、それにより、アプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーのプールを選択する方法を提供する。オリゴヌクレオチドのプールは任意の数の所望の配列を含み得、たとえば、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019個または少なくとも1020個のオリゴヌクレオチドが出発プール中に存在し得る。工程（a）〜（d）は、アプタマーのプールをさらに磨くために繰り返されてもよい。ある態様において、これらの工程は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。
本明細書に記載されるように、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、関心対象の組織、細胞、微小胞、またはバイオマーカーを含み得る。ある態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は体液を含む。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液、尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液、腹膜液、悪性流体、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液または他の洗浄液を含み得る。生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照はまた、腫瘍試料、たとえば腫瘍または腫瘍組織由来の細胞を含み得る。他の態様において、生物学的試験試料および場合によっては生物学的対照試料は細胞培地を含む。諸態様において、生物学的試験試料は疾患試料を含み、生物学的対照試料は非疾患試料を含む。したがって、アプタマーのプールを使用して、疾患の診断、予後判定および／またはセラノーシス読み出しを提供し得る。
前記のように、本発明は、微小胞を評価するために使用することができる。微小胞は、複数の情報を含む一つの生物学的実体を提供するため、強力なバイオマーカーである。記載したような例の場合、小胞は、それぞれが相補的な情報を提供する複数の表面抗原を有することができる。癌マーカーおよび組織特異的マーカーを考えてみる。両マーカーが試料中に個々に存在するならば、たとえば両方が循環タンパク質または核酸であるならば、癌マーカーおよび組織特異的マーカーが同じ解剖学的部位に由来するかどうかを確かめることができない場合がある。しかし、癌マーカーおよび組織特異的マーカーの両方が一つの微小胞上の表面抗原であるならば、小胞そのものが二つのマーカーを連結し、かつ疾患（癌マーカーによって）および疾患の起源（組織特異的マーカーによって）の指示を提供する。さらに、小胞は、評価することができる任意の数の表面抗原およびペイロードを有することができる。したがって、本発明は、複数の細胞外微小胞を、ランダムに生成された結合物質のライブラリーと接触させる工程、細胞外微小胞の一つまたは複数の成分に対して親和性を有する結合物質のライブラリーのサブセットを同定する工程を含む、結合物質を同定する方法を提供する。結合物質は、アプタマー、抗体および／または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の他の有用なタイプの結合物質を含み得る。
関連の局面において、本発明は、（a）参照微小胞集団を、1種または複数種の微小胞表面マーカーに結合することができる複数のリガンドと接触させる工程、（b）複数の参照リガンドを単離する工程であって、複数の参照リガンドが、参照微小胞集団に対して親和性を有しない複数のリガンドのサブセットを含む、工程；（c）1種または複数種の試験微小胞を複数の参照リガンドと接触させる工程；および（d）複数の参照リガンドから、1種または複数種の試験微小胞上の表面マーカーと一緒に複合体を形成するリガンドのサブセットを同定し、それにより、複数の標的リガンドを同定する工程を含む、複数の標的リガンドを同定する方法を提供する。語「リガンド」は、別の化学的実体に結合してより大きな複合体を形成する分子または分子群を指すことができる。したがって、結合物質はリガンドを含む。複数のリガンドが、アプタマー、抗体および／または本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質を含み得る。本プロセスは、組織試料に対して適用することもできる。たとえば、本明細書に記載の実施例19〜31を参照されたい。
本発明はさらに、上記方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。ある態様において、1種または複数種の試薬は、アプタマー、抗体および本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用な結合物質の一つまたは複数を含む潜在的結合物質のライブラリーを含む。
ネガティブおよびポジティブアプタマー選択
アプタマーは、結合物質に依存する数多くのタイプのアッセイを含む様々な生物学的アッセイにおいて使用することができる。たとえば、アプタマーは、様々なイムノアッセイ形式、たとえばサンドイッチアッセイ、フローサイトメトリー、およびIHCにおいて、抗体の代わりにまたは抗体と共に使用することができる。本発明は、アッセイ工程を通じていかなる面（基体、チューブ、フィルタ、ビーズ、他の抗原など）にも結合せず、関心対象の抗原に特異的に結合するアプタマーを同定するアプタマースクリーニング法を提供する。アッセイは、ネガティブ選択に依存して、最終アッセイの非標的抗原成分に結合するアプタマーを除去する。ネガティブ選択に続きポジティブ選択を実施して、所望の抗原に結合するアプタマーを同定する。
ある局面において、本発明は、（a）候補アプタマーのプールを一つまたは複数のアッセイ成分と接触させる工程であって、アッセイ成分が関心対象の標的を含まない、工程；（b）（a）において一つまたは複数のアッセイ成分に結合しない、候補アプタマーのプールのメンバーを回収する工程；（c）（b）において回収された候補アプタマーのプールのメンバーを、1種または複数種の交絡する標的の存在下、関心対象の標的と接触させる工程；および（d）工程（c）において関心対象の標的に結合する候補アプタマーを回収し、それにより、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する工程を含む、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する方法を提供する。本方法において、工程（a）および（b）は、非標的実体に結合するアプタマーを除去するためのネガティブ選択を提供する。逆に、工程（c）および（d）は、関心対象の標的に結合するが、他の交絡する標的、たとえば関心対象の標的を含む生物学的試料中に存在し得る他の抗原には結合しないアプタマーを同定することによるポジティブ選択を提供する。候補アプタマーのプールは、少なくとも10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019または少なくとも1020の核酸配列を含み得る。
いくつかの態様において、工程（a）〜（b）は任意選択である。他の態様において、工程（a）〜（b）は、工程（c）におけるポジティブ選択が実施される前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返される。ポジティブ選択もまた、複数のラウンドで実施することができる。工程（c)〜(d）は、関心対象の標的に特異的なアプタマーを同定する前に、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19回または少なくとも20回繰り返すことができる。複数のラウンドが改善された選択のストリンジェンシーを提供し得る。
いくつかの態様において、ネガティブ選択中にアプタマープールと接触させる一つまたは複数のアッセイ成分は、基体、ビーズ、平面アレイ、カラム、チューブ、ウェルまたはフィルタの一つまたは複数を含む。当業者は、アッセイ成分が、所望の生物学的アッセイの一部であり得る任意の物質を含むことができることを理解するであろう。
関心対象の標的は、アプタマーによって認識されたとき検出することができる任意の適切な実体であることができる。ある態様において、関心対象の標的はタンパク質またはポリペプチドを含む。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、別段述べられない限り、互換可能に使用される。関心対象の標的は、DNA、RNAおよび本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるようなそれらのいずれかの様々な亜種を含む核酸であることができる。関心対象の標的は脂質を含むことができる。関心対象の標的は糖質を含むことができる。関心対象の標的はまた、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体であることができる。いくつかの態様において、関心対象の標的は組織、細胞、または微小胞を含む。そのような場合、アプタマーは、表面抗原または疾患抗原への結合物質であり得る。
表面抗原は、疾患または障害のバイオマーカーであることができる。そのような場合、アプタマーを使用して、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る。たとえば、一つまたは複数のタンパク質は、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、ADAM-10、BCNP、EGFR、IL1B、KLK2、MMP7、p53、PBP、SERPINB3、SPDEF、SSX2およびSSX4の一つまたは複数を含み得る。これらのマーカーは、前立腺癌を検出するために使用することができる。さらなる表面抗原および疾患抗原が本明細書の表3〜4に提供されている。
1種または複数種の交絡する標的は、関心対象の標的以外の抗原であることができる。たとえば、交絡する標的は、アッセイされる試料中に存在し得る別の実体であることができる。非限定的な例として、評価される試料が個体由来の組織試料または血液試料であることを考慮されたい。関心対象の標的は、試料中に存在するタンパク質、たとえば表面抗原であり得る。この場合、交絡する標的は、試料中に存在する可能性が高い任意の他の抗原から選択することもできる。したがって、ポジティブ選択は、関心対象の標的を認識するが交絡する標的とはするとしても最小限しか相互作用しない、候補アプタマーを提供するであろう。いくつかの態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、同じタイプの生物学的実体、たとえばすべてのタンパク質、すべての核酸、すべての糖質またはすべて脂質を含む。非限定的な例として、関心対象の標的は、SSX4、SSX2、PBP、KLK2、SPDEFおよびEpCAMからなる群より選択されるタンパク質であることができ、1種または複数種の交絡する標的はこの群の他のメンバーを含む。他の態様において、関心対象の標的および1種または複数種の交絡する標的は、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含む。1種または複数種の交絡する標的もまた、様々なタイプの生物学的実体、たとえばタンパク質、核酸、糖質および脂質の任意の組み合わせを含み得る。
ある態様において、本発明は、上記方法によって同定された単離されたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本発明はさらに、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、アプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブとも称される。より好ましくは、単離された核酸分子は、上記方法によって同定されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより多く同一である。参照配列、たとえば上記方法によって同定された配列よりも長い、または長さがそれに等しい単離されたポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長とで実施される。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い、たとえば上記方法によって同定された配列よりも短い場合、比較は、参照配列のうち同じ長さのセグメント（相同性算出によって求められる任意のループは除外する）に対して実施される。
関連の局面において、本発明は、（a）アプタマーのプールを、第一の試料由来の微小胞の集団と接触させる工程；（b）第一の試料由来の微小胞の集団に対して親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；（c）サブプールを、第二の試料由来の微小胞の第二の集団と接触させる工程；および（d）第二の試料由来の微小胞の第二の集団に対して親和性を示すアプタマーの第二のサブプールを枯渇させ、それにより、第一の試料由来の微小胞の集団に対して優先的親和性を有するアプタマーの群を選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。第一の試料および／または第二の試料は、本明細書に開示されるような生物学的流体を含み得る。たとえば、生物学的流体は、非限定的に、血液、血液由来物、血漿、血清または尿を含み得る。第一の試料および／または第二の試料はまた、細胞培養物由来であってもよい。
別の関連の局面において、本発明は、（a）アプタマーのプールを第一の試料由来の組織と接触させる工程；（b）第一の試料由来の組織に対して親和性を示すアプタマーのサブプールを富化する工程；（c）サブプールを第二の試料由来の第二の組織と接触させる工程；および（d）第二の試料由来の第二の組織に対して親和性を示すアプタマーの第二のサブプールを枯渇させ、それにより、第二の試料と比べ第一の試料由来の組織に対して優先的な親和性を有するアプタマーのプールを選択する工程を含む、アプタマーの群を選択する方法を提供する。
第一の試料および／または第二の試料は、本明細書に開示されるものなどの固定組織を含み得る。たとえば、固定組織は、FFPE組織を含み得る。第一の試料および／または第二の試料は、腫瘍試料を含み得る。
ある態様において、第一の試料は癌試料を含み、第二の試料は対照試料、たとえば非癌試料を含む。第一の試料および／または第二の試料はそれぞれプールされた試料を含み得る。たとえば、第一の試料および／または第二の試料は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100人、または100人より多くの個体由来の体液を含むことができる。そのような場合、プールのメンバーは、所望の表現型を代表するように選択され得る。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。組織試料では、第一の試料は、様々な個体由来の、たとえば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100人、または100人より多くの個体由来の組織を含み得る。非限定的な例として、第一の試料は、各個体由来の固定組織を含み得る。
工程（a）〜（d）は、第一の試料由来の標的に対して優先的親和性を有するアプタマーでプールをさらに富化するために所望の回数、繰り返すことができる。たとえば、工程（a）〜（d）は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、または20回より多く繰り返すことができる。工程（d）からの産出物を、繰り返される工程（a）への投入物として使用することができる。態様において、工程（a）〜（d）を繰り返す前に、第一の試料および／または第二の試料を異なる試料と交換する。非限定的な例において、第一の試料プールのメンバーは癌患者由来であり得、第二の試料プールのメンバーは非癌対照由来であり得る。工程（a）〜（d）の後続の反復中、第一の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる癌患者由来の試料を含み得る。同様に、第二の試料プールは、それ以前のラウンドとは異なる対照由来の試料を含み得る。
さらに別の関連する局面において、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドを富化する方法であって、（a）第一の試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（b）工程（a）において接触させた第一の試料を分画し、第一の試料で分画された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収する工程；（c）工程（b）からの複数のオリゴヌクレオチドの回収メンバーを第二の試料と接触させる工程；（d）工程（c）において接触させた第二の試料を分画し、第二の試料で分画されなかった複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収する工程；（e）工程（d）からの複数のオリゴヌクレオチドの回収メンバーを第三の試料と接触させる工程；および（f）工程（a）において接触させた第三の試料を分画し、第三の試料で分画した複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収する工程を含み；それにより、複数のオリゴヌクレオチドを富化する方法を提供する。試料は、本明細書において記載される任意の適切な形態、たとえば組織、細胞、微小胞などであることができる。第一および第三の試料は第一の表現型を有し、第二の試料は第二の表現型を有する。したがって、第一の表現型と関連する試料の場合にポジティブ選択が生じ、第二の表現型と関連する試料の場合にネガティブ選択が生じる。そのような選択スキームの1つの非限定的な例において、第一の表現型は生検陽性乳癌を含み、第二の表現型は非乳癌（生検陰性または健康）を含む。
いくつかの態様において、第一の表現型は医学的状態、疾患または障害を含み、第二の表現型は健康な状態または医学的状態、疾患もしくは障害の異なる状態を含む。第一の表現型は健康な状態であることができ、第二の表現型は医学的状態、疾患または障害を含む。医学的状態、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を非限定的に含む任意の検出可能な医学的状態、疾患または障害であることができる。様々なタイプのそのような状態が本明細書において開示されている。たとえば本明細書の「表現型」セクションを参照すること。
試料を適切に分画するためには、微小胞を全体的または部分的に単離するための任意の有用な方法を使用することができる。いくつかの有用な技術が本明細書において記載されている。ある態様において、分画する工程は、工程（b）における超遠心分離ならびに工程（d）および（f）におけるポリマー析出を含む。他の態様において、ポリマー析出がすべての工程において使用される。ポリマーはポリエチレングリコール（PEG）であることができる。任意の適切な形態のPEGを使用し得る。たとえば、PEGはPEG 8000であり得る。PEGは任意の適切な濃度で使用され得る。たとえば、微小胞を単離するためには、PEGは、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％または15％の濃度で使用することができる。いくつかの態様において、PEGは6％の濃度で使用される。
試料がFFPE組織試料を含む場合、試料は、富化プロセスの前に、抗原賦活化とも知られているエピトープ賦活化に供されることができる。組織固定が組織形態の保存に有用であるが、このプロセスはまた、免疫検出法にマイナスの影響を及ぼすことができる。たとえば、固定は、関心対象のエピトープがマスキングされ、もはや一次抗体に結合することができないよう、タンパク質生化学を変化させることができる。エピトープのマスキングは、エピトープ内のアミノ酸の架橋、エピトープまたはその近くの無関係なペプチドの架橋、エピトープのコンフォメーションの変化または抗原の静電荷の変化によって生じさせることができる。エピトープ賦活化とは、エピトープのマスキングを逆転させ、エピトープ認識を回復させる任意の技術を指す。エピトープ賦活化のための技術は当技術分野において公知である。たとえば、プロテイナーゼK、トリプシンおよびペプシンを含む酵素が、エピトープ結合を回復させるために首尾よく使用されている。理論によって拘束されることなく、作用機序は、エピトープをマスキングすることであり得るペプチドの開裂であり得る。また、試料の加熱が、いくつかの架橋を逆転させ得、エピトープの二次または三次構造の回復を可能にする。pHまたはカチオン濃度の変化もまた、エピトープ利用可能性に影響し得る。
接触させる工程は、非特異的結合イベントを減らし得る競合物質の存在下で実施することができる。任意の有用な競合物質を使用することができる。ある態様において、競合物質は、サケ精子DNA、tRNA、硫酸デキストランおよびカルボキシメチルデキストランの少なくとも1つを含む。所望により、様々な競合物質または競合物質濃度を異なる接触工程において使用することができる。
方法は、所望の富化を達成するために繰り返されることができる。ある態様において、工程（a）〜（f）は少なくとも一度繰り返される。これらの工程は、所望により、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回または20回よりも多く繰り返されることができる。同時に、所望により、各接触工程が繰り返されることもできる。いくつかの態様において、方法はさらに、（i）工程（c）の前に工程（a）〜（b）を少なくとも一度繰り返す、工程（b）において第一の試料で分画された複数のオリゴヌクレオチドの回収メンバーが工程（a）の繰り返しのための複数の投入オリゴヌクレオチドとして使用される、工程；（ii）工程（e）の前に工程（c）〜（d）を少なくとも一度繰り返す、工程（d）において第二の試料で分画されなかった複数のオリゴヌクレオチドの回収メンバーが工程（c）の繰り返しのための複数の投入オリゴヌクレオチドとして使用される、工程；および／または（iii）工程（e）〜（f）を少なくとも一度繰り返す、工程（f）において第三の試料で分画された複数のオリゴヌクレオチドの回収メンバーが工程（e）の繰り返しのための複数の投入オリゴヌクレオチドとして使用される、工程を含む。繰り返し工程（i）〜（iii）は、任意の所望の回数繰り返されることができ、たとえば工程（i）〜（iii）は、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回または20回よりも多く繰り返されることができる。ある態様において、（i）〜（iii）はそれぞれ3回の繰り返しを含む。
方法は、たとえばDNA配列決定によってアプタマーまたはオリゴヌクレオチドの選択された群のメンバーを同定する工程をさらに含み得る。配列決定は、所望により、方法中の任意の所望の工程の後または前で、次世代配列決定によって実施され得る。
方法はまた、アプタマー／オリゴヌクレオチドの選択された群の標的を同定する工程を含み得る。そのような標的を同定するのに有用な方法が本明細書において開示されている。非限定的な例においては、富化されたオリゴヌクレオチドライブラリーを適切な試料（たとえば第一または第三の試料）と接触させ、ライブラリーを試料に架橋させ、ライブラリーを回収する。回収されたライブラリーと架橋したタンパク質をたとえば質量分析法によって同定する。
オリゴヌクレオチドプローブ標的同定
上記方法およびキットは、二つの標的集団を区別する結合物質を同定するために使用することができる。本発明はさらに、そのような結合物質の標的を同定する方法を提供する。たとえば、方法はさらに、結合物質によって認識される細胞または微小胞の表面マーカーを同定する工程を含み得る。
ある態様において、本発明は、（a）結合物質を標的と接触させて標的を結合物質と結合させる工程であって、標的が細胞または微小胞の表面抗原を含む、工程；（b）標的と結合物質との結合を分断しない条件下で、細胞または微小胞を分断する工程；（c）標的と結合物質との複合体を単離する工程；および（d）結合物質によって結合した標的を同定する工程を含む、結合物質の標的を同定する方法を提供する。結合物質は、上記方法によって同定された結合物質、たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ、リガンド、抗体、または、二つの標的集団をたとえばそれらのバイオマーカーを区別することによって区別することができる他の有用な結合物質であることができる。
方法を実施するための例示的模式図が図4に示されている。図は、基体401につながれた結合物質402、ここでは例としてオリゴヌクレオチドプローブまたはアプタマーを示す。結合物質402は基体401に共有結合していることができる。結合物質402はまた、非共有結合的に結合していてもよい。たとえば、結合物質402は、基体に引き寄せることができる標識、たとえば基体に共有結合しているアビジン／ストレプトアビジン分子と一緒に複合体を形成することができるビオチン基を含むことができる。これにより、溶液中にある間にアプタマーと微小胞との間で複合体を形成させることができ、その後、ビオチン標識を使用してアプタマーが捕捉される。結合物質402は細胞または微小胞404の表面抗原403に結合する。矢印（i）によって示される工程において、細胞または微小胞405は分断されるが、一方で、結合物質402と表面抗原403との複合体は無傷のまま残る。分断された細胞または微小胞405は、矢印（ii）によって示される工程において、たとえば洗浄またはバッファ交換によって除去される。矢印（iii）によって示される工程において、表面抗原403が結合物質402から解放される。本明細書に開示される、および／または当技術分野において公知である方法を使用して表面抗原403を分析してその正体を決定することができる。方法の標的は、細胞または微小胞と結合した任意の有用な生物学的実体であることができる。たとえば、標的は、タンパク質、核酸、脂質もしくは糖質または本明細書に開示される、または当技術分野において公知である他の生物学的実体を含み得る。
方法のいくつかの態様において、細胞または微小胞を分断する前に、標的を結合物質と架橋させる。理論によって拘束されることなく、この工程は、分断プロセスの間に、結合物質と標的との複合体を維持することを支援し得る。本明細書に開示される、または当技術分野において公知である任意の有用な架橋法を使用することができる。諸態様において、架橋は、光架橋、イミドエステル架橋剤、ジメチルスベリミデート、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤、ビススルホスクシンイミジルスベレート（BS3）、アルデヒド、アクロレイン、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイミド架橋剤、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DDC）、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）、スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート（スルホ-SBED）、2-[N2-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニル]エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford IL.から市販）、2-{N2-[N6-(4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロベンゾイル-6-アミノカプロイル)-N6-(6-ビオチンアミドカプロイル)-L-リジニルアミド]}エチルメタンチオスルホネート（Mts-Atf-LC-ビオチン；Thermo Fisher Scientific Incから市販）、光反応性アミノ酸（たとえばL-フォトロイシンおよびL-フォトメチオニン、たとえば、Suchanek, M., et al. (2005). Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions. Nat. Methods 2:261-267を参照）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）架橋剤、NHS-アジド試薬（たとえばNHS-アジド、NHS-PEG4-アジド、NHS-PEG12-アジド；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）、NHS-ホスフィン試薬（たとえばNHS-ホスフィン、スルホ-NHS-ホスフィン；いずれもThermo Fisher Scientific, Inc.から市販）またはそれらの任意の組み合わせもしくは変形を含む。
細胞または微小胞を分断するために多様な方法を使用することができる。たとえば、細胞膜または微小胞膜は、機械的力、化学物質またはそれらの組み合わせを使用して分断することができる。諸態様において、細胞または微小胞の分断は、洗浄剤、界面活性剤、溶媒、酵素またはそれらの任意の有用な組み合わせの一つ又は複数の使用を含む。酵素は、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ、セルラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンナーゼの一つまたは複数を含み得る。洗浄剤または界面活性剤は、オクチルチオグルコシド（OTG）、オクチルβ-グルコシド（OG）、非イオン洗浄剤、トリトンX、Tween 20、脂肪アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（Brij）、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシド、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、ノノキシノール-9、グリセロールアルキルエステル、グリセリルラウレート、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリソルベート、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA、コカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー、ポロキサマー、ポリエトキシ化獣脂アミン（POEA）、両性イオン洗浄剤、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート（CHAPS）、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、アルキルフェノールエトキシレート（APE）、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ベタイン、コカミドプロピルベタイン、レシチン、イオン洗浄剤、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、臭化セトリモニウム（CTAB）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（CTAC）、オクテニジン二塩酸塩、塩化セチルピリジニウム（CPC）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルジメチルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（DODAB）、デオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（TergitolタイプNP-40；NP-40）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（SLES））、ミレス硫酸ナトリウム、アルキルカルボキシレート、ステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、カルボキシレート系フッ素系界面活性剤、ペルフルオロノナノエート、ペルフルオロオクタノエート（PFOAまたはPFO）およびバイオサーファクタントの一つまたは複数を含み得る。使用することができる機械的分断法は、非限定的に、機械的剪断、ビーズミリング、ホモジネーション、マイクロ流体化、音波処理、フレンチプレス、衝突、コロイドミル、減圧、浸透圧性ショック、加熱分解、凍結融解、乾燥またはそれらの任意の組み合わせを含む。
図4に示すように、結合物質は基体につながれてもよい。結合物質は、結合物質と標的との複合体が形成される前または形成された後でつなぐことができる。基体は、本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような任意の有用な基体であることができる。ある態様において、基体はミクロスフェアを含む。もう一つの態様において、基体は平面基体を含む。もう一つの態様において、基体はカラム材料を含む。結合物質はまた、標識されることもできる。標的と結合物質との複合体を単離する工程は、標識を介して結合物質を捕捉する工程を含み得る。非限定的な例として、標識はビオチン標識であることができる。そのような場合、結合物質は、ビオチン-アビジン/ストレプトアビジン結合イベントによって基体に取り付けることができる。
結合物質からの解放ののち標的を同定する方法は関心対象の標的のタイプに依存する。たとえば、標的がタンパク質を含む場合、標的を同定する工程は、質量分析法（MS）、ペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF；タンパク質フィンガープリンティング法）、配列決定法、N末端アミノ酸分析法、C末端アミノ酸分析法、エドマン分解法、クロマトグラフィー法、電気泳動法、二次元ゲル電気泳動法（2Dゲル）、抗体アレイおよびイムノアッセイ法の使用を含み得る。核酸は、増幅、ハイブリダイゼーション、または配列決定法によって同定することができる。
当業者は、この方法を使用して、膜と結合していないものを含む任意の適切な標的を同定することができることを理解するであろう。たとえば、図4に関連して、矢印（i）によって示される工程（すなわち、細胞または微小胞405を分断する工程）を除くすべての工程は、組織溶解産物、または循環標的、たとえばタンパク質、核酸、脂質、糖質もしくはそれらの組み合わせに関して実施することもできる。標的は、組織、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、ウイルス、膜フラグメント、小分子、重金属、毒素、薬物、核酸、mRNA、マイクロRNA、タンパク質-核酸複合体ならびにこれらのいずれかの様々な組み合わせ、フラグメントおよび／または複合体を非限定的に含む任意の有用な標的であることができる。
ある局面において、本発明は、生物学的試料中の少なくとも1つの細胞または微小胞と会合した少なくとも1つのタンパク質を同定する方法であって、a）少なくとも1つの細胞または微小胞をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程、b）工程a）においてオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの少なくとも1つのメンバーと結合した少なくとも1つのタンパク質を単離する工程；およびc）工程b）において単離された少なくとも1つのタンパク質を同定する工程を含む、方法を提供する。単離する工程は、本明細書において開示されるような任意の有用な方法、たとえば免疫沈降または基体への捕捉を使用して実施することができる。同様に、同定する工程は、本明細書において開示されるような任意の有用な方法、たとえば非限定的に、質量分析法の使用、2Dゲル電気泳動または抗体アレイを使用して実施することができる。そのような方法の例が本明細書において実施例9〜11に提示されている。
本発明の方法によって同定される標的は、所望の様々な目的のために、たとえば本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出することができる。たとえば、同定された表面抗原を使用して、そのような抗原を表示する細胞または微小胞を検出することができる。ある局面において、本発明は、生物学的試料中の少なくとも1つの細胞または微小胞を検出する方法であって、生物学的試料を、少なくとも1つの表面抗原への少なくとも1つの結合物質と接触させる工程および少なくとも1つのタンパク質への結合物質によって認識された少なくとも1つの細胞または微小胞を検出する工程を含む方法を提供する。ある態様において、少なくとも1つの表面抗原は本明細書において表3〜4より選択される。少なくとも1つの表面抗原は、以下の国際特許出願：2009年10月30日出願のPCT/US2009/62880；2009年11月12日出願のPCT/US2009/006095；2011年3月1日出願のPCT/US2011/26750；2011年4月6日出願のPCT/US2011/031479；2011年8月18日出願のPCT/US11/48327；2008年7月25日出願のPCT/US2008/71235；2010年11月30日出願のPCT/US10/58461；2011年1月13日出願のPCT/US2011/21160；2013年3月11日出願のPCT/US2013/030302；2012年2月17日出願のPCT/US12/25741；2008年9月12日出願のPCT/2008/76109；2012年6月14日出願のPCT/US12/42519；2012年8月8日出願のPCT/US12/50030；2012年8月3日出願のPCT/US12/49615；2012年6月7日出願のPCT/US12/41387；2013年11月26日出願のPCT/US2013/072019；2013年5月28日出願のPCT/US2014/039858；2013年10月23日出願のPCT/IB2013/003092；2013年12月19日出願のPCT/US13/76611；2014年8月28日出願のPCT/US14/53306；および2015年11月23日出願のPCT/US15/62184；2016年6月29日出願のPCT/US16/40157；2016年7月28日出願のPCT/US16/44595；および2016年3月9日出願のPCT/US16/21632に開示されているものより選択することができる。これらの出願それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。少なくとも1つの表面抗原は本明細書において表10〜17のいずれか中のタンパク質であることができる。実施例9を参照すること。少なくとも1つの結合物質は、核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプトイド、zDNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、レクチン、ペプチド、デンドリマー、膜タンパク質標識物質、化学物質またはそれらの組み合わせを非限定的に含む任意の有用な結合物質を含み得る。いくつかの態様において、少なくとも1つの結合物質は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、たとえば本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドプローブを含む。細胞は組織の一部であることができる。
少なくとも1つの結合物質を使用して、循環細胞または微小胞、たとえば非限定的に、体液中に放出される微小胞であることができる少なくとも1つの細胞または微小胞を捕捉および／または検出することができる。結合物質を使用して可溶性バイオマーカーおよび循環細胞または微小胞を検出する方法は本明細書において提供されている。たとえば、サンドイッチアッセイフォーマットを記載する図2A〜Bを参照すること。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または微小胞を捕捉するために使用される少なくとも1つの結合物質は基体に結合している。平面アレイ、カラムマトリックスまたはマイクロビーズを非限定的に含む任意の有用な基体を使用することができる。たとえば図2A〜Bを参照すること。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または微小胞を検出するために使用される少なくとも1つの結合物質は標識されている。磁性標識、蛍光部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、ポリマー色素粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的活性種、半導体ナノ結晶、ナノ粒子、量子ドット、金粒子、蛍光体または放射性標識を非限定的に含む様々な有用な標識が本明細書において提供されている、または当技術分野において公知である。
ある態様においては、検出する工程を使用して表現型を特徴決定する。表現型は、任意の適切な関心対象の表現型であることができる。いくつかの態様において、表現型は疾患または障害である。特徴決定は、疾患または障害のための診断、予後判定および／またはセラノーシス情報を提供する工程を含み得る。特徴決定は、少なくとも1つの細胞または微小胞の存在またはレベルを参照と比較することによって実施され得る。参照は、実施される特徴決定工程ごとに選択することができる。たとえば、表現型が疾患または障害を含む場合、参照は、その疾患または障害を有しない個体または個体群からの試料中の少なくとも1つの微小胞の存在またはレベルを含み得る。比較する工程は、細胞または微小胞の存在またはレベルが参照のそれと異なるかどうかを決定する工程であることができる。いくつかの態様において、検出される細胞または微小胞は、罹患試料に比べ、健康な試料中でより高いレベルで見いだされる。もう1つの態様において、検出される細胞または微小胞は、健康な試料に比べ、罹患試料中でより高いレベルで見いだされる。たとえば異なるバイオマーカーへの複数の結合物質を使用して多重アッセイが実施される場合、いくつかの抗原が、参照に比べ、生物学的試料中でより高いレベルで観測され得、一方で、他の抗原が、参照に比べ、生物学的試料中でより低いレベルで観測され得る。
方法は、任意の適切な生物学的試料中の少なくとも1つの細胞または微小胞を検出するために使用することができる。たとえば、生物学的試料は、体液、組織試料または細胞培養物を含み得る。体液または組織試料は、医学的状態、疾患または障害を有する、または有することが疑われる対象からの体液または組織試料であることができる。したがって、方法を使用して、対象に関する診断、予後判定またはセラノーシス読み出しを提供することができる。末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪油、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血を非限定的に含む任意の適切な体液を使用することができる。
本発明の方法は、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱の移行上皮癌、巨細胞骨芽腫、脳腫瘍、大腸癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部の扁平上皮細胞癌、急性心筋梗塞（AMI）／急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭の扁平上皮細胞癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚の扁平上皮細胞癌、胃の腺癌、甲状腺の癌腫、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を非限定的に含む、任意の適切な関心対象の疾患または障害を検出または特徴決定するために使用することができる。
いくつかの態様において、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む。癌は、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹部神経膠腫；脳腫瘍（脳幹部神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、上衣細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；上衣細胞腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜胚芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮細胞癌；頸部扁平上皮細胞癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽頭癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂および尿管の移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍の1つを含むことができる。前癌状態は非限定的にバレット食道を含むことができる。自己免疫疾患は、非限定的に、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症性筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症の1つを含むことができる。心血管疾患は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性事象の1つを含むことができる。神経学的疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血性再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群の1つを含むことができる。疼痛は、非限定的に、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛の1つを含むことができる。感染症は、非限定的に、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核またはインフルエンザの1つを含むことができる。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは方法を使用して、任意の数のこれらまたは他の関連する疾患および障害を評価することができることを理解するであろう。
関連する局面において、本発明は、本明細書において方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。さらに別の関連する局面において、本発明は、方法を実施するための試薬の使用を考慮する。試薬は、少なくとも1つのタンパク質への少なくとも1つの結合物質を含み得る。結合物質は、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドプローブであり得る。
試料特徴決定
本発明のオリゴヌクレオチドプローブ／アプタマーは、生物学的試料を特徴決定するために使用することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用して、試料のバイオシグネチャーを提供することができる。バイオシグネチャーは、試料の特徴、たとえば試料と関連する疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを示すことができる。いくつかの態様において、バイオシグネチャーは、試料中の1つまたは複数のバイオマーカーの存在またはレベルを含む。いくつかの態様において、バイオシグネチャーは、試料と会合した（たとえば試料とで複合体を形成することによって）オリゴヌクレオチドプローブライブラリーのオリゴヌクレオチドプローブまたはメンバーの存在またはレベルを含む。
ある局面において、本発明は、SEQ ID NO. 1〜206506のいずれか1つに対して少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列；または任意の前記配列の機能的変種またはフラグメントを含むアプタマーを提供する。機能的変種またはフラグメントは、なおも標的分子に結合することができる修飾を含む配列を含み、修飾は、非限定的に、欠失、挿入、点変異、切断または化学的修飾の少なくとも1つを含む。関連する局面において、本発明は、（a）生物学的試験試料を本発明の1種または複数種のアプタマー、たとえば本段落内のいずれかまたはその変形と接触させる工程；（b）工程（a）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的試験試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；（c）生物学的対照試料を1種または複数種のアプタマーと接触させる工程；（d）工程（c）において形成された、1種または複数種のアプタマーと、生物学的対照試料中の1種または複数種のアプタマーと結合した標的との複合体の存在またはレベルを検出する工程；および（e）工程（b）および（d）において検出された存在またはレベルを比較し、それにより、疾患または障害を特徴決定する工程を含む、疾患または障害を特徴決定する方法を提供する。
生物学的試験試料および生物学的対照試料はそれぞれ組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含むことができる。いくつかの態様において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は同じ試料タイプを含み、たとえば、試験試料および対照試料はいずれも組織試料である、またはいずれも流体試料である。他の態様においては、異なる試料タイプが試験試料および対照試料に使用されてもよい。たとえば、対照試料は、作り変えられた、または他のやり方で人造的な試料を含み得る。いくつかの態様において、組織試料は固定試料を含む。
生物学的流体は体液を含み得る。体液は、非限定的に、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胞胚腔液または臍帯血の一つまたは複数を含み得る。いくつかの態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。
生物学的流体は微小胞を含み得る。たとえば、生物学的流体は、組織、細胞培養物または試料中の細胞から放出された微小胞を含む体液であることができる。微小胞は循環微小胞であることができる。生物学的流体は細胞を含み得る。たとえば、生物学的流体は、組織、細胞培養物、または試料中で循環している細胞を含む体液であることができる。
1種または複数種のアプタマーは標的バイオマーカー、たとえば試料を特徴決定するのに有用なバイオマーカーに結合することができる。バイオマーカーは、ポリペプチドもしくはそのフラグメントまたは本明細書に記載される、または当技術分野において公知である他の有用なバイオマーカー（脂質、糖質、複合体、核酸など）を含み得る。諸態様において、ポリペプチドまたはそのフラグメントは可溶性または膜結合状態である。膜結合状態のポリペプチドは細胞表面抗原または微小胞表面抗原を含み得る。バイオマーカーは、表3または表4から選択されるバイオマーカーであることができる。バイオマーカーは、その全文がそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる、2009年10月30日に出願された国際特許出願PCT/US2009/62880、2009年11月12日に出願されたPCT/US2009/006095、2011年3月1日に出願されたPCT/US2011/26750、2011年4月6日に出願されたPCT/US2011/031479、2011年8月18日に出願されたPCT/US11/48327、2008年7月25日に出願されたPCT/US2008/71235、2010年11月30日に出願されたPCT/US10/58461、2011年1月13日に出願されたPCT/US2011/21160、2013年3月11日に出願されたPCT/US2013/030302、2012年2月17日に出願されたPCT/US12/25741、2008年9月12日に出願されたPCT/2008/76109、2012年6月14日に出願されたPCT/US12/42519、2012年8月8日に出願されたPCT/US12/50030、2012年8月3日に出願されたPCT/US12/49615、2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41387、2013年11月26日に出願されたPCT/US2013/072019、2013年5月28日に出願されたPCT/US2014/039858、2013年10月23日に出願されたPCT/IB2013/003092、2013年12月19日に出願されたPCT/US13/76611、2014年8月28日に出願されたPCT/US14/53306、2015年11月23日に出願されたPCT/US15/62184、2016年6月29日に出願されたPCT/US16/40157、2016年7月28日に出願されたPCT/US16/44595、および2016年3月9日に出願されたPCT/US16/21632のうちの1つより選択することができる。
特徴決定は、疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、たとえば、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。いくつかの態様において、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫、膵臓癌、腎臓癌、または脳癌を含む。
図10Aは、本発明の1種または複数種のオリゴヌクレオチドプローブを使用して関心対象の標的を検出および／または定量するために使用することができるアッセイ構成を示す模式図1000である。捕捉アプタマー1002が基体1001に取り付けられている。基体は、平面基体、ウェル、マイクロビーズまたは本明細書に開示される、または当技術分野において公知であるような他の有用な基体であることができる。関心対象の標的1003が捕捉アプタマー1002と結合している。関心対象の標的は、アプタマーまたは他の結合物質によって認識されたとき検出されることができる任意の適切な実体であることができる。関心対象の標的はタンパク質もしくはポリペプチド、DNA、RNAおよびそれらの様々な亜種を含む核酸、脂質、糖質、複合体、たとえばタンパク質、核酸、脂質および／または糖質を含む複合体を含み得る。いくつかの態様において、関心対象の標的は組織、細胞、または微小胞を含む。関心対象の標的は細胞表面抗原または微小胞表面抗原であることができる。関心対象の標的は、たとえば本明細書に記載のようなバイオマーカーであり得る。関心対象の標的は、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）および／またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。また、検出アプタマー1004が関心対象の標的1003に結合している。検出アプタマー1004は標識1005を有し、この標識を検出すると、捕捉アプタマー1002を介して基体1001に捕捉された標的を同定することができる。標識は、蛍光、放射性標識、酵素または本明細書に開示されるような他の検出可能な標識であることができる。捕捉アプタマー1002または検出アプタマー1004のいずれかが別の検出物質、たとえば抗体で置換されることができる。たとえば、標的は、抗体で捕捉され、アプタマーで検出されてもよいし、その逆であってもよい。関心対象の標的が複合体を含む場合、捕捉および検出物質（アプタマー、抗体など）は同じまたは異なる標的を認識することができる。たとえば、標的が細胞または微小胞であるとき、捕捉物質が一つの表面抗原を認識し得、一方で、検出物質が微小胞表面抗原を認識する。あるいはまた、捕捉物質および検出物質が同じ表面抗原を認識することもできる。
本発明のアプタマーは、本明細書において、DNAまたはRNAの形態で特定され得かつ/または様々な目的のために使用され得る。特記しない限り、当業者は、アプタマーは一般的に核酸の様々な形態で合成され得る事を認識するであろう。アプタマーはまた、様々な化学修飾を有してもよく、かつ依然として本発明の範囲内であり得る。
一部の態様において、本発明のアプタマーは、少なくとも1つの化学修飾を含むように改変されている。修飾は、限定するわけではないが、核酸の、糖位置での化学的置換；リン酸位置での化学的置換；および塩基位置での化学的置換を含み得る。一部の態様において、修飾は、ビオチン化、蛍光標識の取り込み、修飾ヌクレオチドの取り込み、2'-修飾ピリミジン、3'キャッピング、アミンリンカーへの結合、高分子量の非免疫原性化合物への結合、親油性化合物への結合、薬物への結合、細胞傷害性部分への結合、および放射性同位体を用いた標識、または本明細書に開示される他の修飾からなる群より選択される。修飾の位置は、所望に応じ変化し得る。例えば、ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分が、アプタマーの5'末端に結合し得る。ビオチン化、蛍光標識、または細胞傷害性部分はまた、アプタマーの3'末端にも結合し得る。
一部の態様において、細胞傷害性部分は、ナノ粒子中に封入されている。ナノ粒子は、リポソーム、デンドリマー、および櫛形ポリマーからなる群より選択され得る。他の態様において、細胞傷害性部分は、小分子の細胞傷害性部分を含む。小分子の細胞傷害性部分は、限定するわけではないが、ビンブラスチンヒドラジド、カリチアマイシン、ビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ツブリシン、ドラスタチン-10、ドラスタチン-15、アウリスタチンE、リゾキシン、エポチロンB、エポチロンD、タキソイド、メイタンシノイド、ならびにそれらの任意のバリアントおよび誘導体を含み得る。さらに別の態様において、細胞傷害性部分は、タンパク毒素を含む。例えば、タンパク毒素は、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ゲロニン、およびシュードモナス外毒素Aからなる群より選択され得る。本発明と共に使用するための非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコールを含む。適切な放射性同位体は、イットリウム-90、インジウム-111、ヨウ素-131、ルテチウム-177、銅-67、レニウム-186、レニウム-188、ビスマス-212、ビスマス-213、アスタチン-211、およびアクチニウム-225を含む。アプタマーは、γ線放出放射性同位体によって標識されていてもよい。
本発明の一部の態様において、活性物質がアプタマーに結合している。例えば、活性物質は、治療物質または診断物質であり得る。治療物質は、チロシンキナーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、生物学的活性物質、生物学的分子、放射性核種、アドリアマイシン、アンサマイシン系抗生物質、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、カルムスチン、カペシタビン、クロラムブチル、シタラビン、シクロホスファミド、カンプトセシン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、エポチロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メルファラン、メトトレキサート、ラパマイシン（シロリムス）、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、パクリタキセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、タキサン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、タキソール、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、トランスプラチナ（transplatinum）、抗血管内皮成長因子化合物（「抗VEGF」）、抗上皮細胞成長因子受容体化合物（「抗EGFR」）、5-フルオロウラシルおよび誘導体、放射性核種、ポリペプチド毒素、アポトーシス誘導物質、治療増感物質、酵素またはその活性断片、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。
試料を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプール
生物学に存在する複雑性および不均一さは、生物学的システムおよび疾患の知識を必要とする。様々なレベルで、たとえば細胞、組織、個体および疾患状態の中および間で多様性が存在する。たとえば図11Aを参照すること。図11Bは、そのような試料を特徴決定するために評価することができる様々な生物学的実体を概観する。図11Bに示すように、評価がDNAからRNA、タンパク質、そして最後にタンパク質複合体へと移るにつれ、多様性および複雑性の量は劇的に増す。本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー方法は、複雑な生物学的ソース、たとえば組織試料、細胞、循環腫瘍細胞、微小胞および複合体、たとえばタンパク質およびタンパク脂質複合体を特徴決定するために使用することができる。
生物学的試料を特徴決定するための現在の方法は、そのような複雑性および多様性に十分に対処し得ない。図11Cに示すように、そのような現在の方法は、多くの場合、多様性の計測と複雑性の計測との間で妥協を強いられる。一例として、ハイスループット配列決定技術を考えてみる。次世代手法は、一つのアッセイで幾千もの分子標的を調べる場合もある。しかし、そのような手法は、個々のDNAおよび/またはRNA分子をプロービングするだけであり、したがって、タンパク質および生物学的複合体の大きな多様性を見逃してしまう。他方、フローサイトメトリーは生物学的複合体をプロービングすることができるが、小数の既定のリガンドに限られる。たとえば、一つのアッセイは、既定の標的に対する一握りの示差的に標識された抗体しかプロービングすることができない。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、上記難題に対処する。出発ライブラリーのサイズは、ライブラリーメンバーと同じ数の様々な実体を計測するように調節することができる。たとえば、初期のトレーニングされていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、1012またはより多くの生物学的特徴を計測する能力を有する。所望により、より大きい、および/または異なるライブラリーを構築することができる。この技術は、何が「異なるはずである」という仮定なしで、試料間の違いを見いだすように適合されている。たとえば、プローブライブラリーは、個々のタンパク質、タンパク質修飾、タンパク質複合体、脂質、核酸、様々なフォールドまたはコンフォメーションまたは関心対象の試料を区別するそのものに基づいて区別し得る。したがって、方法は、様々な関心対象集団を同定するために使用することができる生物学的試料中の差を同定するための不偏の手法を提供する。
本明細書に関連して、試料を評価するためのオリゴヌクレオチドライブラリープローブの使用は、適応動的人工ポリリガンド標的化（Adaptive Dynamic Artificial Poly-ligand Targeting）、またはADAPT（商標）と呼ばれる（代替的にトポロジカルオリゴヌクレオチドプロファイリング：TOP（商標）と呼ばれる）場合がある。前記のように、アプタマーおよびオリゴヌクレオチドという用語は本明細書において典型的には互換可能に使用され、「古典的な」個々のアプタマーとADAPTプローブとの間のいくつかの違いは以下のとおりである。個々のアプタマーは、抗体様「キー・イン・ロック」結合モードで公知の特異標的に結合するように選択された個々のオリゴヌクレオチドを含み得る。個々のアプタマーは、所期の標的への特異性および結合アフィニティーに基づいて個々に評価され得る。しかし、ADAPTプローブは、マルチプローブシグネチャーを生成することを意図したオリゴヌクレオチドのライブラリーを含み得る。ADAPTプローブは数多くの可能性のある結合様式（静電気、疎水性、ワトソン-クリック型、マルチオリゴ複合体など）を含む。ADAPTプローブシグネチャーは、不均一な患者亜集団を同定する能力を有する。たとえば、一つのADAPTライブラリーをアセンブルして複数の生物学的状態を区別することができる。古典的なシングルアプタマーとは違って、結合標的は、単離または同定されてもよいし、またはされなくてもよい。個々のアプタマーを同定するスクリーニング法、たとえばSELEXを使用して、オリゴヌクレオチドのナイーブライブラリーを富化してADAPTプローブライブラリーを同定することもできることが理解されよう。
本発明の概略的な方法が図11Dに概説されている。方法への一つの投入物は、1012またはより多くの生物学的特徴を計測する能力を有するランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーを含む。この図に概説されるように、方法は、二つの投入試料タイプの間で異なる所望の数（たとえば約105〜106）を同定する。ランダム化オリゴヌクレオチドライブラリーを第一および第二の試料タイプと接触させ、各試料に結合するオリゴヌクレオチドを同定する。結合したオリゴヌクレオチド集団を比較し、一方または他方の生物学的投入試料に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプローブライブラリーのために保持し、一方で、両方の生物学的投入試料に結合するオリゴヌクレオチドを捨てる。次いで、このトレーニングされたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを新たな試験試料と接触させることができ、試験試料に結合するオリゴヌクレオチドの正体を決定する。結合したオリゴヌクレオチドのプロファイルに基づいて試験試料を特徴決定する。たとえば図11Hを参照すること。
細胞外小胞が、多くの相関するソースによって駆動される生物学的複雑性および多様性をプロファイリングするための魅力的な手段を提供する。患者微小胞集団の間には、または様々な条件下（たとえばストレス、食事、運動、休息、疾患など）の一人の患者由来の微小胞集団の中でさえ、多大な不均一性があることができる。様々な疾患状態における微小胞集団内の分子表現型の多様性は、小胞バイオマーカーによる微小胞単離および分別の後でさえ、表面結合リガンドを同定する難題を呈することができる。この状況は、小胞表面-膜タンパク質複合体によってさらに複雑化する。オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用してそのような難題に対処し、生物学的表現型の特徴決定を可能にすることができる。手法は、多様なオリゴヌクレオチドライブラリーの力とハイスループット（次世代）配列決定技術とを組み合わせて、細胞外微小胞の複雑性をプロービングする。11Eを参照すること。
ADAPT（商標）プロファイリングは、試料中の様々なバイオマーカーの有無の検出に加えて、動的イベントの定量的計測を提供し得る。たとえば、結合プローブは、タンパク質複合体または他の翻訳後修飾を検出して、同じタンパク質を有するが生物学的構成が異なる試料の区別を可能にし得る。そのような構成が図11F〜Gに示されている。図11Fには、例示的微小胞試料集団：試料集団Aからの様々な表面マーカーを有する微小胞が示されている。図示される結合プロービングオリゴヌクレオチド1101を所与の特別な関係で二つの表面マーカー1102および1103と接触させる。ここで、これらの機能性複合体および空間的関係に特有のプローブを保持し得る。対照的に、図11Fに示された微小胞試料集団Bにおいては、二つの表面マーカー1102および1103が異なる空間的関係において見られる。ここでは、相互作用成分1102および1103の空間的関係の非存在により、プローブ1101は結合していない。
ADAPTプロファイリングを使用して試料を評価するための例示的手法（1110）が図11Hに示されている。プロービングライブラリー（1111）を試料（1112）と混合する。試料は、本明細書に記載されるようなもの、たとえば、疾患を有する、または疾患を有することが疑われる対象からの体液であることができる。プローブを試料に結合させ（1120）、微小胞をペレット化する（1115）。非結合オリゴヌクレオチドを含む上清（1114）を捨てる。ペレット（1115）に結合したオリゴヌクレオチドプローブを溶出させ（1116）、配列決定する（1117）。配列決定（1117）によって決定された、結合したオリゴヌクレオチドプローブによって生成されたプロファイル（1118）を使用して試料（1112）を特徴決定する。たとえば、プロファイル（1118）を参照と比較して、たとえば、プロファイルが、疾患または健康な状態もしくは関心対象の他の表現型特徴決定を示す参照プロファイルと類似しているか、異なるかを決定することができる。比較は、疾患の存在を示し得、診断、予後判定またはセラノーシスを提供し得る、あるいは試料（1112）と関連する表現型を他のやり方で特徴決定し得る。図11Iは、ADAPTプロファイリングを使用して表現型を特徴決定するためのもう一つの模式図を示す。患者試料、たとえば本明細書に開示される体液を捕集する（1121）。試料をADAPTライブラリープールと接触させる（1122）。接触させた試料から、たとえば超遠心分離、ろ過、ポリマー沈殿または本明細書に開示される他の適切な技術もしくは技術の組み合わせを使用して、微小胞（MV）を単離する（1123）。単離された微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを捕集し、その正体を決定する（1124）。結合したオリゴヌクレオチドの正体は、任意の有用な技術、たとえば配列決定、ハイスループット配列決定（たとえばNGS）、増幅、たとえば非限定的にqPCRまたは平面もしくは粒子ベースのアレイへのハイブリダイゼーションによって決定することができる。結合したオリゴヌクレオチドの正体を使用して、試料を、たとえば疾患関連の微小胞を含有するものとして特徴決定する。
図11に概要を示した手法を、任意の所望の試料型、たとえば組織、細胞、微小胞、循環バイオマーカー、およびこれらのうちの任意の構成物に適応させることができる。
ある局面において、本発明は、試料を様々なオリゴヌクレオチドのプール（アプタマープールまたはオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと称され得る）と接触させ、プール中の様々なオリゴヌクレオチドが試料に結合する頻度を測定することによって、試料を特徴決定する方法を提供する。たとえば、非癌患者由来の微小胞に比べて癌患者由来の組織、細胞、または微小胞に優先的に結合するオリゴヌクレオチドのプールを同定する。たとえば癌を有することが疑われる患者由来の試験試料を捕集し、オリゴヌクレオチドのプールと接触させる。試験試料に結合するオリゴヌクレオチドを試験試料から溶離させ、捕集し、同定し、結合したオリゴヌクレオチドの組成を、癌試料に結合することが知られているものと比較する。溶離したオリゴヌクレオチドを同定するために、様々な配列決定、増幅およびハイブリダイゼーション技術を使用することができる。たとえば、大きなオリゴヌクレオチドプールが使用される場合、オリゴヌクレオチド同定は、次世代配列決定などのハイスループット法またはハイブリダイゼーションによって実施することができる。試験試料がオリゴヌクレオチドプールによって同様なやり方で癌患者由来の試料に結合しているならば（たとえばバイオインフォマティックス分類法によって判定）、試料は同じく癌を示す。この方法を使用すると、オリゴヌクレオチドプールの各メンバーの正確な標的を必ずしも知ることなく、1種または複数種の抗原に結合するオリゴヌクレオチドプールを使用して試料を特徴決定することができる。このように、オリゴヌクレオチドのプールはバイオシグネチャーを提供する。本明細書の実施例5〜7および9〜31およびその他は本発明の態様を示す。
ある局面において、本発明は、試料を、前記試料中に存在する1種または複数種の標的に結合することができる複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程であって、ここで、該セットが、試料の状態を特徴決定することが事前に確認されており、それにより試料の状態を特徴決定する、工程を含む、試験試料の状態を特徴決定する方法を提供する。試料は、本明細書に開示されるものなどの任意の有用な試料、たとえば、組織、細胞、微小胞、もしくはバイオマーカー試料、または、それらの任意の有用な組み合わせであることができる。
関連の局面において、本発明は、（a）試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させて、試料と一緒に複合体を形成するオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程、（b）オリゴヌクレオチドそれぞれの配列および／またはコピー数を決定し、それにより、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する工程を含む、試験試料と結合したオリゴヌクレオチドのセットを同定する方法を提供する。試料は、本明細書に開示されるものなどの任意の有用な試料、たとえば、組織、細胞、微小胞、もしくはバイオマーカー試料、または、それらの任意の有用な組み合わせであることができる。
さらに別の関連の局面において、本発明は、試料を、非癌試料に比べて癌試料と一緒に優先的に複合体を形成することが事前に確認されている複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含む、試料を癌性試料または癌の素因を有する試料として診断する方法を提供する。試料は、本明細書に開示されるものなどの任意の有用な試料、たとえば、組織、細胞、微小胞、もしくはバイオマーカー試料、または、それらの任意の有用な組み合わせであることができる。
オリゴヌクレオチドは、配列決定法、たとえばダイターミネーター（Sanger）配列決定法またはハイスループット法によって同定することができる。ハイスループット法は、次世代技術、たとえばMPSS（Massively parallel signature sequencing）法；Polony配列決定法；454パイロシーケンシング；Illumina（Solexa; MiSeq/HiSeq/NextSeqなど）配列決定法；SOLiD配列決定法；イオントレント半導体配列決定法；DNAナノボール配列決定法；Heliscope単分子配列決定法；単分子リアルタイム（SMRT）配列決定法または他の方法、たとえばナノポアDNA配列決定法；トンネル電流DNA配列決定法；ハイブリダイゼーションによる配列決定法；質量分析による配列決定法；マイクロ流体Sanger配列決定法；顕微鏡ベースの技術；RNAP配列決定法；インビトロウイルスハイスループット配列決定法を含む、多数の核酸を高速で配列決定するための技術を含むことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ハイブリダイゼーション技術によって同定され得る。たとえば、プールの様々なメンバーとハイブリダイズし、それにより、プールの様々なメンバーを検出するためのアドレス指定可能な場所を有するマイクロアレイを使用することができる。あるいは、検出は、オリゴヌクレオチドプールの様々なメンバーとハイブリダイズする一つまたは複数の示差的に標識されたオリゴヌクレオチドに基づくことができる。標識の検出可能なシグナルは、様々なオリゴヌクレオチドに存在する核酸のストレッチとハイブリダイズする核酸分子と関連することができる。ストレッチは、ライブラリー中の1つまたは複数のオリゴヌクレオチドと同じまたは異なることができる。検出可能なシグナルは、米国特許出願公開第20140371088号、同第2013017837号、および同第20120258870号などから公知の色分けされたバーコードを含む蛍光剤を含むことができる。他の検出可能な標識（金属、放射性同位体など）を所望により使用することができる。
複数またはプールのオリゴヌクレオチドは、試料の特徴決定を可能にするための任意の所望の数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。様々な態様において、プールは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000または少なくとも10000の異なるオリゴヌクレオチドメンバーを含む。
複数のオリゴヌクレオチドは、一段階または複数段階のポジティブ選択またはネガティブ選択を通して事前に選択することができ、ここで、ポジティブ選択は、試験試料に比べて実質的に類似した特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含み、およびネガティブ選択は、試験試料に比べて実質的に異なる特徴を有する試料に対するオリゴヌクレオチドの選択を含む。実質的に類似した特徴とは、ポジティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の特徴において試験試料に典型的であることをいう。たとえば、ポジティブ選択に使用される試料は癌患者または細胞系由来であることができ、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。実質的に異なる特徴とは、ネガティブ選択に使用される試料が関心対象の一つまたは複数の表現型/特徴において試料とは異なることをいう。たとえば、ネガティブ選択に使用される試料は、癌を有しない個体または細胞系由来であることができ（たとえば「正常」、「健常」、またはそうでなければ「対照」試料）、試験試料は、癌を有する、または癌を有することが疑われる患者由来の試料であることができる。癌は、本明細書に開示されたものなどの乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、黒色腫、脳癌、膵臓癌、腎臓癌または他の癌であることができる。
検出および／または区別する所望の表現型に典型的な試料を選択することにより、特徴決定は、任意の数の疾患または障害の診断、予後判定またはセラノーシスを含むことができる。本発明の組成物および方法を使用して、非限定的に癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症および／または疼痛を含む様々な疾患および障害を特徴決定することができる。さらなる詳細に関しては、たとえば、本明細書の「表現型」の項を参照すること。諸態様において、疾患または障害は増殖性または新生物性疾患または障害を含む。たとえば、疾患または障害は癌であることができる。
図10Bは、上記のような、試料の表現型を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を示す模式図1010である。関心対象の標的に対するオリゴヌクレオチドのプールを提供する（1011）。たとえば、オリゴヌクレオチドのプールは、組織、細胞、微小胞バイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせを標的とするために富化されることができる。プールのメンバーは、様々な標的（たとえば様々なタンパク質）または同じ標的の様々なエピトープ（たとえば、単一タンパク質の様々なエピトープ）に結合し得る。プールを、特徴決定する試験試料と接触させる（1012）。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去する。残るオリゴヌクレオチドを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1013）。捕集したオリゴヌクレオチドを、たとえば配列決定またはハイブリダイゼーションによって同定する（1014）。同定されたものの存在および／またはコピー数を使用して表現型を特徴決定する（1015）。
図10Cは、図10Bの方法の具現化を示す模式図1020である。微小胞集団に結合するものと同定されたオリゴヌクレオチドのプールを提供する（1019）。投入試料は、微小胞を含む試験試料を含む（1022）。たとえば、試験試料は、所与の疾患または障害を有する、または有することが疑われる個体由来の生物学的試料であり得る。プールを、特徴決定する、単離された微小胞と接触させる（1023）。微小胞集団は、接触させる工程1023の前または後に、本明細書に記載される様々な技術、たとえばクロマトグラフィー法、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離法、超遠心分離法、フローサイトメトリー法、アフィニティー捕捉法（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈降法、および／またはマイクロ流体工学を使用して試料から単離することができる。混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、残るオリゴヌクレオチドを試料から溶離させる、または他のやり方で分離させ、捕集する（1024）。捕集したオリゴヌクレオチドを同定し（1025）、保持されたオリゴヌクレオチドの存在および／またはコピー数を使用して、上記のように表現型を特徴決定する（1026）。
上記したように、図10Cの態様においては、オリゴヌクレオチドのプール1019を、微小胞を含む、または含むことが予想される生物学的試料と直接接触させる。その後、微小胞を試料から単離し、混合物を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、残るオリゴヌクレオチドを分離させ、捕集する（1024）。以後の工程は上記のように実施される。この代替構成の例として、生物学的試料、たとえば血液、血清または血漿試料をオリゴヌクレオチドのプールと直接接触させる。そして、非限定的に超遠心分離法、限外ろ過法、フローサイトメトリー法、アフィニティー単離法、ポリマー沈降法、クロマトグラフィー、それらの様々な組み合わせなどを含む、本明細書に開示される様々な技術によって微小胞を単離する。そして、残るオリゴヌクレオチドを、たとえば配列決定、ハイブリダイゼーションまたは増幅によって同定する。
他の態様において、オリゴヌクレオチドプローブの富化されたライブラリーが、組織試料を評価するために使用される。いくつかの態様において、IHCに類似の方法で試料を染色するためにプールが使用される。そのような方法は、本明細書においてPHC、またはポリリガンド組織化学と呼ばれる場合がある。図10Dに、そのような方法の概略1030を提供する。関心対象の組織に対して富化されているアプタマープールが、提供される（1031）。プールを、組織試料と接触させる（1032）。組織試料は、本明細書記載のような形式であることができる。非限定的な例として、組織試料は、固定された腫瘍試料であることができる。試料は、ガラススライドまたは膜に固定されたFFPE試料であり得る。試料を洗浄して、アプタマープールの未結合のメンバーを除去し、残りのアプタマーを可視化する（1033）。アプタマーを可視化するための任意の適切な方法を使用することができる。例において、アプタマープールがビオチン化され、結合したアプタマーがストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（SA-HRP）を使用して可視化される。本明細書記載のように、代替標識を含む他の有用な可視化方法が、当技術分野において公知である。可視化された試料をスコア化して、染色の量を決定する（1034）。たとえば、病理学者は、IHCのようにスライドをスコア化することができる。スコアを使用して、本明細書記載の試料1035を特徴決定することができる。たとえば、+1以上のスコアは、試料が癌試料である、または所与のバイオマーカーを発現している癌試料であることを示し得る。本明細書における実施例19〜31を参照されたい。
関連する局面において、本発明は、表現型を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を含む方法を実施するために使用することができる、複数のオリゴヌクレオチドを含む物質の組成物を提供する。複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれかを含むことができる。
ある局面において、本発明は、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定するための方法を提供する。方法は、（a）試料について複数のオリゴヌクレオチドを富化して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されているオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程；（b）オリゴヌクレオチドと試験試料との複合体の形成を可能にするために、（a）における複数を試験試料と接触させる工程；（c）（b）において複合体を形成したオリゴヌクレオチドを回収して、回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットを提供する工程；および（d）回収されたオリゴヌクレオチドのサブセットをハイスループット配列決定、増幅またはハイブリダイゼーションによりプロファイリングし、それにより、試験試料に特異的なオリゴヌクレオチドを同定する工程を含む。試験試料は、組織、細胞、微小胞、バイオマーカー、または関心対象の他の生物学的実体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、RNA、DNAまたはその両方を含み得る。いくつかの態様において、方法は、インフォマティクス解析を実施して、標的試料と一緒に複合体を形成することが事前に確認されて入れるオリゴヌクレオチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも99％の配列同一性を含むオリゴヌクレオチドのサブセットを同定する工程をさらに含む。
当業者は、該方法を使用して、任意の適切な標的を同定することができることを認識しているであろう。標的は、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、炭水化物、微小胞、ウイルス、膜フラグメント、小分子、重金属、毒素、薬物、核酸（マイクロRNA（miR）およびメッセンジャーRNA（mRNA）を非限定的に含む）、タンパク質-核酸複合体、ならびにこれらのうちのいずれかの様々な組み合わせ、フラグメントおよび／または複合体を非限定的に含む、任意の有用な標的であることができる。標的は、たとえば、そのような生物学的実体の混合物を含むことができる。
ある局面において、本発明はまた、1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを試料と接触させる工程、および試料中の標的への該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの結合の存在またはレベルを検出する工程を含む、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが上記発明によって提供されるものであることができる方法を提供する。試料は、生物学的試料、有機試料、無機試料、組織、細胞培養物、体液、血液、血清、細胞、微小胞、タンパク質複合体、脂質複合体、糖質またはそれらの任意の組み合わせ、部分もしくは変種を含み得る。標的は、細胞、オルガネラ、タンパク質複合体、リポタンパク質、糖質、微小胞、膜断片、小分子、重金属、毒素または薬物を含み得る。
もう一つの局面において、本発明は、a）溶解状態の混合物を形成するために、試料を、少なくとも106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させる工程であって、オリゴヌクレオチドが、試料中の複数の実体と結合して複合体を形成することができ、任意で、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーが、上記発明によって提供される1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、工程；b）工程（a）で形成された複合体を混合物から分割する工程；およびc）試料に関するオリゴヌクレオチドプロファイルを同定するために、工程（b）で分割された複合体中に存在するオリゴヌクレオチドを回収する工程を含む、方法を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成する方法であって、a）第一のオリゴヌクレオチドライブラリーを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、第一のオリゴヌクレオチドライブラリー中に存在する複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成される、工程；b）生物学的試験試料および生物学的対照試料それぞれに関してオリゴヌクレオチドのサブセットを生成するために、工程（a）で形成された複合体を分割して、複合体中のオリゴヌクレオチドを単離する工程；c）（b）におけるオリゴヌクレオチドのサブセットを生物学的試験試料および生物学的対照試料と接触させる工程であって、生物学的試料中に存在する生物学的実体と、オリゴヌクレオチドのサブセット中に存在する第二の複数のオリゴヌクレオチドとの間に複合体が形成されて、オリゴヌクレオチドの第二のサブセット群を生成する、工程；およびd）オリゴヌクレオチドのそれぞれ第三、第四、第五またはそれ以降のサブセット群を生成するために、任意で、工程b）〜c）を一回、二回、三回またはそれより多く繰り返すことによって富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを産生する工程を含む、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000または500000個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドであって、本段落における方法から得られ、ライブラリーが第一の表現型を第二の表現型と区別することができる、複数のオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は健康な状態を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害を含み、第二の表現型は異なる疾患もしくは障害を含む；または第一の表現型は疾患もしくは障害のある病期もしくは進行を含み、第二の表現型は同じ疾患もしくは障害の異なる病期もしくは進行を含む；または第一の表現型は治療に対する正の応答を含み、第二の表現型は同じ治療に対する負の応答を含む。
さらに別の関連する局面において、本発明は、疾患または障害を特徴決定する方法であって、a）生物学的試験試料を、本発明によって提供される該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；b）工程（a）で本発明によって提供される該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと生物学的試験試料中の標的との間に形成された複合体の存在またはレベルを検出する工程；およびc）工程（b）で検出された存在またはレベルを、生物学的対照試料からの参照レベルと比較することによって疾患または障害を特徴決定する工程を含む、方法を提供する。検出する工程は、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの配列決定、複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの増幅、および/または複合体中のすべてもしくはいくつかのオリゴヌクレオチドの、アレイへのハイブリダイゼーションを実施する工程を含み得る。配列決定はハイスループットまたは次世代配列決定であり得る。いくつかの態様において、検出する工程は、生物学的試験試料と関連して該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを可視化することを含む。たとえば、本発明により提供されるようなポリリガンド組織化学（PHC）が、使用され得る。
本発明の方法において、生物学的試験試料および生物学的対照試料は、それぞれ、組織試料、細胞培養物または生物学的流体を含み得る。いくつかの態様において、生物学的流体は体液を含む。本発明の方法の中で有用な体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、洞腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液または臍帯血を含む。いくつかの好ましい態様において、体液は血液、血清または血漿を含む。生物学的流体は微小胞を含み得る。そのような場合、複合体は、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと少なくとも1つの微小胞との間で形成され得る。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、単離された微小胞をさらに含み得、任意で、微小胞は、クロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉（たとえば平面、カラムまたはビーズへの）、ポリマー沈殿の少なくとも1つを使用し、かつマイクロ流体工学を使用して単離される。小胞はまた、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとの接触の後で単離することもできる。
生物学的試験試料および生物学的対照試料は、組織を含み得る。組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織であることができる。いくつかの態様において、FFPE組織は、固定組織、未染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性液および微細針吸引液（FNA）のうちの少なくとも1つを含む。FFPE組織を、基体、たとえばガラススライドまたは膜に固定することができる。
本発明の方法の様々な態様において、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドまたはそのフラグメントに結合する。ポリペプチドまたはそのフラグメントは、可溶性または膜結合型であることができ、任意で膜は、細胞膜または微小胞膜を含む。膜は、細胞、オルガネラまたは微小胞の断片由来であることもできる。いくつかの態様において、ポリペプチドまたはそのフラグメントは、表3、表4または表10〜17のうちの任意の一つにおけるバイオマーカーを含む。たとえば、ポリペプチドまたはそのフラグメントは、表3にあるような一般的な小胞マーカーまたは表4にあるような組織関連マーカーもしくは疾患関連マーカー、または表10〜17のうちの任意の一つに提供される小胞関連バイオマーカーであることもできる。該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、生物学的試料中の微小胞表面抗原と結合し得る。たとえば、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを、微小胞に対してナイーブライブラリーから富化することができる。
上述のように、微小胞は、ポリマー沈殿を使用して全体的または部分的に単離され得る。態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）を含む。任意の適切な形のPEGが使用され得る。たとえば、PEGは、PEG8000であり得る。PEGは、任意の適切な濃度で使用され得る。たとえば、PEGを濃度1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％または15％で使用して、微小胞を単離することができる。いくつかの態様において、PEGは、濃度6％で使用される。
本明細書に提供される該1つのオリゴヌクレオチド、複数のオリゴヌクレオチドまたは方法によって検出される疾患または障害は、関心対象の任意の適切な疾患または障害、たとえば非限定的に、乳癌、アルツハイマー病、気管支喘息、膀胱移行上皮癌、巨細胞オステオブラストクラストーマ、脳腫瘍、結腸直腸腺癌、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、子宮頸部扁平上皮癌、急性心筋梗塞（AMI）/急性心不全、クローン病、II型糖尿病、食道癌、喉頭扁平上皮癌、急性および慢性骨髄白血病、肺癌、悪性リンパ腫、多発性硬化症、卵巣癌、パーキンソン病、前立腺腺癌、乾癬、関節リウマチ、腎細胞癌、皮膚有棘細胞癌、胃腺癌、甲状腺癌、精巣癌、潰瘍性大腸炎または子宮腺癌を含み得る。
いくつかの態様において、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛を含む。癌は、非限定的に、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍の一つを含むことができる。前癌状態は非限定的にバレット食道を含むことができる。自己免疫疾患は、非限定的に、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎または敗血症の一つを含むことができる。心血管疾患は、非限定的に、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性事象の一つを含むことができる。神経学的疾患は、非限定的に、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群の一つを含むことができる。疼痛は、非限定的に、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛または末梢神経因性疼痛の一つを含むことができる。感染症は、非限定的に、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核またはインフルエンザの一つを含むことができる。当業者は、本発明の該1つのオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは方法を使用して、任意の数のこれらまたは他の関連する疾患および障害を評価することができることを理解するであろう。
本発明のいくつかの態様において、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドおよびその使用方法は、特定の疾患または疾患状態を特徴決定するのに有用である。所望により、様々な疾患を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールをアセンブルしてマスタープールを創製し、マスタープールを、様々な疾患を特徴決定するのに有用なプローブとして使用することができる。当業者はまた、特定の疾患または障害を特徴決定するのに有用なオリゴヌクレオチドのプールを創製することもできることを理解するであろう。機能的局面（たとえば、様々な標的への結合性または表現型を特徴決定する能力）が依然として維持されるかぎり、本明細書において提供される配列を所望により改変することもできる。たとえば、オリゴヌクレオチドは、DNAもしくはRNAを含む、様々な非天然ヌクレオチドを組み入れる、他の化学修飾を組み入れる、または様々な欠失もしくは挿入を含み得る。そのような改変は、合成、安定性、送達、標識などを容易し得る、または実際に影響をほとんど〜全く有し得ない。一部の場合には、オリゴヌクレオチドの機能的局面は維持されながらオリゴヌクレオチド中のいくつかのヌクレオチドが置換され得る。同様に、5'および3'隣接領域が置換され得る。なお他の場合には、オリゴヌクレオチドの一部分だけがその機能性を方向づけると決定され得、それにより、他の部分を欠失または置換することができる。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成および改変するための数多くの技術が本明細書において開示されている、または当技術分野において公知である。
ある局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。類似の局面において、本発明は、本明細書に提供される発明の方法を実施するための試薬の使用を考慮する。諸態様において、試薬は1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるものであることができる。試薬は、マイクロRNA（miR）およびメッセンジャーRNA（mRNA））、タンパク質-核酸複合体、ならびにこれらのうちの任意の様々な組み合わせ、断片および／または複合体を非限定的に含む、様々な他の有用な成分を含み得る。一つまたは複数の試薬は、a）微小胞を単離するように構成された試薬（任意で、微小胞を単離するように構成された少なくとも1つの試薬は、微小胞抗原への結合物質、カラム、基体、ろ過ユニット、ポリマー、ポリエチレングリコール、PEG4000、PEG8000、粒子またはビーズを含む）；b）該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを増幅、配列決定、ハイブリダイズまたは検出するためにプライマーまたはプローブとして働くように構成された少なくとも1つのオリゴヌクレオチド；c）試料から1種または複数種の豊富なタンパク質を除去するように構成された試薬（任意で、1種または複数種の豊富なタンパク質は、アルブミン、免疫グロブリン、フィブリノーゲンおよびフィブリンのうち少なくとも1種を含む）；d）エピトープ賦活化（epitope retrieval）のための試薬；ならびにe）PHCの可視化のための試薬の、一つまたは複数であることができる。
オリゴヌクレオチドプローブを用いたワトソン-クリック型塩基対形成の検出
本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、非ワトソン-クリック型塩基対形成により結合することができる。しかし、ある場合には、本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプローブは、ワトソン-クリック型塩基対形成により結合することができる。本発明の、たとえば上記のようなオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、両方の種類の結合イベントを同時に調べることができる。たとえば、古典的なアプタマーの意味でタンパク質抗原に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブがある一方で、組織、細胞、微小胞または他の標的と、そのような標的に関連する核酸、たとえば標的の表面の核酸（非限定的にマイクロRNAおよびmRNAを含む）を介して結合し得るオリゴヌクレオチドプローブもある。そのような表面に結合した核酸は、タンパク質と関連することができる。たとえば、核酸は、アルゴノート-マイクロRNA複合体を含み得る。アルゴノートタンパク質は、Ago1、Ago2、Ago3および／またはAgo4であることができる。
オリゴヌクレオチドの配列（たとえば配列決定、ハイブリダイゼーションまたは増幅により）を決定することに依存する本明細書記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリー手法に加えて、ワトソン-クリック型塩基対形成を検出するようにアッセイを設計することもできる。いくつかの態様において、これらの手法は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出するためにAgo2-マイクロRNA複合体を使用することができるAgo2介在性切断に依存する。さらなる詳細については、その出願がその全体として参照により本明細書に組み入れられる、2015年11月23日に出願されたPCT/US15/62184を参照されたい。
組織ADAPT
本明細書に述べたように、本発明は、組織試料を含む様々な生物学的試料に対してオリゴヌクレオチドライブラリーを富化する方法を提供する。組織試料は、固定されている場合がある。固定は、生物学的組織を崩壊から防ぎ、それにより、自己溶解または腐敗を防止する組織切片の調製に使用され得る。細胞内部の主な高分子は、タンパク質および核酸である。固定は、任意の進行中の生化学反応を終止させ、かつ処理された組織の機械的強度または安定性も上げ得る。したがって、細胞および組織成分を保存し、かつ染色した薄切片の調製を可能にする方法でこれを行うために、組織固定を使用することができる。そのような試料は、多数の生物学的標本、たとえば腫瘍試料に利用可能である。したがって、固定された組織は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの様々な適用のための望ましい試料源を提供する。このプロセスは、「組織ADAPT」と呼ばれ得る。
本発明による組織ADAPTは、様々なオリゴヌクレオチドプローブを提供するために使用されている。ある局面において、本発明は、a）実施例19〜31のうちのいずれか一つに記載の可変配列；b）表20〜23、25、27、38〜40、もしくは45のうちのいずれか一つに記載の可変配列；またはc）SEQ ID NO. 1〜206506のうちのいずれか一つに記載の配列に、対応する領域を含むオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、配列
Figure 2019516393
を有する5'領域、配列
Figure 2019516393
を有する3'領域、またはその両方をさらに含む。本発明は、そのようなオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である核酸配列またはその部分を含む、オリゴヌクレオチドをさらに提供する。関連する局面において、本発明は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、または少なくとも100000個の異なる上記のオリゴヌクレオチド配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを提供する。
本明細書記載のように、核酸分子に多数の有用な改変を行うことができる。ある態様において、本発明の該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、2'-O-メチルもしくはホスホロチオエート主鎖、またはその任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNA、LNA、UNA、およびその任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを含む。該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのメンバーは、DNA、RNA、ビオチン化、非天然ヌクレオチド、欠失、挿入、付加、および化学修飾からなる群より選択される少なくとも1つの機能的修飾を有することができる。いくつかの態様において、化学修飾は、C18、ポリエチレングリコール（PEG）、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12およびジゴキシゲニンのうちの少なくとも1つを含む。
本発明の該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを、本明細書記載の標識のような任意の有用な標識を使用して標識することができる。たとえば、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドをナノ粒子、リポソーム、金、磁気標識、蛍光標識、発光粒子、ビオチン部分、または放射性標識に取り付けることができる。
組織ADAPTは、関心対象の試料に対するオリゴヌクレオチドライブラリーの富化を提供する。ある局面において、本発明は、複数のラウンドのポジティブ選択およびネガティブ選択を使用してオリゴヌクレオチドライブラリーを富化する方法を提供する。複数のオリゴヌクレオチドを富化する方法は、(a）少なくとも1ラウンドのポジティブ選択を行う工程であって、ポジティブ選択が、(i）少なくとも1つの試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること（その際、少なくとも1つの試料は、組織を含む）；および(ii）少なくとも1つの試料と関連する複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む、工程；(b）任意で、少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を行う工程であって、ネガティブ選択が、(i）少なくとも1つの追加的な試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること（その際、少なくとも1つの追加的な試料は、組織を含む）；(ii）少なくとも1つの追加的な試料と関連しなかった複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収することを含む、工程；および(c）工程（a）（ii）および工程（b）（ii）のうちの少なくとも1つにおいて回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを増幅させ、それにより、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程を、含み得る。富化のラウンドを変動させること、ならびにポジティブ選択工程およびネガティブ選択工程の性能を変動させることのような、これらのプロセスの様々な代替が有用であり、本明細書において記載されている。ある態様において、工程（a）（ii）における複数のオリゴヌクレオチドの回収されたメンバーは、工程（a）（i）の次の反復のための投入物として使用される。ある態様において、工程（b）（ii）における複数のオリゴヌクレオチドの回収されたメンバーは、工程（a）（i）の次の反復のための投入物として使用される。富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、大きな多様性を有し得る。たとえば、富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーは、本明細書記載のナイーブF-Trinライブラリーを含む。
本発明の富化方法の態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つの追加的な試料は、組織を含む。所望により、そのような組織は、本明細書記載または当技術分野において公知の方法を使用して固定され得る。固定された組織は、保管され得る。固定された組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を含み得る。ある態様において、FFPE組織は、固定組織、未染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性液、および微細針吸引液（FNA）のうちの少なくとも1つを含む。FFPE組織を、基体に固定することができる。たとえば、基体は、ガラススライド、膜、または任意の他の有用な材料であることができる。
いくつかの態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つの追加的な試料が、異なる基体に固定される。非限定的な例として、少なくとも1つの試料が、一つのガラススライドに固定されるのに対して、少なくとも1つの追加的な試料が、異なるガラススライドに固定される。所望により、そのようなスライドは、異なる患者、異なる腫瘍、異なる時点の同じ腫瘍、同じ腫瘍の複数のスライスなどの由来であり得る。あるいは、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つの追加的な試料は、単一の基体に固定される。非限定的な例として、腫瘍試料および腫瘍に隣接する正常組織のような、少なくとも1つの試料および少なくとも1つの追加的な試料が、同じガラススライドに固定される。いくつかの態様において、少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つの追加的な試料は、溶解される（たとえば実施例29を参照されたい）、基体から掻き取られる（たとえば実施例30を参照されたい）、またはマイクロダイセクションに供される（たとえば実施例31を参照されたい）。溶解した試料を基体上にアレイ化することができる。本発明は、任意の有用な基体を考慮する。いくつかの態様において、基体は、膜を含む。たとえば、膜は、ニトロセルロース膜であることができる。
本発明の富化方法の様々な態様において、少なくとも1つの試料および少なくとも1つの追加的な試料は、関心対象となる表現型の点で異なる。少なくとも1つの試料および少なくとも1つの追加的な試料は、同じ基体の異なる区分由来であることができる。非限定的な例として、試料は、固定された組織試料由来の癌組織および正常な隣接組織を含み得る。そのような場合、少なくとも1つの試料および少なくとも1つの追加的な試料は、富化を容易にするために同じ基体から掻き取られるまたはマイクロダイセクションされてもよい。
オリゴヌクレオチドライブラリーを、任意の所望の表現型の分析のために富化することができる。態様において、表現型は、組織、解剖学的起源、医学的状態、疾患、障害、またはその任意の組み合わせを含む。たとえば、組織は、筋肉、上皮、結合組織および神経組織、またはその任意の組み合わせであることができる。たとえば、解剖学的起源は、胃、肝臓、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、鼻、気管支、腎臓、膀胱、尿道、下垂体、松果体、副腎、甲状腺、膵臓、副甲状腺、前立腺、心臓、血管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、皮膚、舌、鼻、眼、耳、歯、子宮、膣、精巣、陰茎、卵巣、乳房、乳腺、脳、脊髄、神経、骨、靱帯、腱、またはその任意の組み合わせであることができる。下にさらに記載するように、表現型は、診断、予後判定、セラノーシス、医学的状態、疾患または障害のうちの少なくとも1つに関係することができる。
本発明の富化方法の様々な態様において、方法は、オリゴヌクレオチドライブラリーの富化されたメンバーの標的を決定する工程をさらに含む。そのような決定工程のための技術は、本明細書において提供される。たとえば、実施例9〜10、17および19を参照されたい。
組織ADAPTは、生物学的試料の分析をさらに含む。ある局面において、本発明は、試料における表現型を特徴決定する方法であって、a）試料を少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；およびb）少なくとも1つオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと試料との間に形成された複合体の存在またはレベルを同定する工程であって、存在またはレベルが表現型を特徴決定するために使用される工程を含む、方法を提供する。関連する局面において、本発明は、試料を可視化する方法であって、a）試料を少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；b）試料に結合しない少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを除去する工程；およびc）試料に結合した少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを可視化する工程を含む、方法を提供する。可視化は、表現型を特徴決定するために使用することができる。
特徴決定されるべき試料は、組織試料、体液、細胞、細胞培養物、微小胞、またはそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、任意の有用な試料であることができる。いくつかの態様において、組織試料は、固定された組織を含む。組織は、当技術分野において公知の任意の有用な固定技術を使用して固定され得る。固定方法の例には、熱固定、浸漬、灌流、化学固定、架橋（たとえば、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドのようなアルデヒドを用いる）、沈殿（たとえば、メタノール、エタノールのようなアルコール、アセトン、および酢酸を使用する）、酸化（たとえば、四酸化オスミウム、重クロム酸カリウム、クロム酸、および過マンガン酸カリウムを使用する）、水銀、ピクリン酸塩、ブアン固定液、ヘペス-グルタミン酸バッファ介在性有機溶媒保護効果（HOPE）、および凍結が含まれる。好ましい態様において、固定された組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織である。様々な態様において、FFPE試料は、固定された組織、未染色のスライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科的試料、コア針生検、悪性体液、および細針吸引液（FNA）のうちの少なくとも1つを含む。
存在またはレベルを同定するための任意の有用な技術を、核酸配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、または可視化を非限定的に含む組織ADAPTの適用のために使用することができる。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションは、試料を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された少なくとも1つの標識化プローブと接触させる工程を含む。少なくとも1つの標識化プローブを標識に直接または間接的に取り付けることができる。標識は、たとえば、蛍光標識、放射性標識または磁気標識であることができる。間接標識は、たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニンであることができる。たとえば、実施例28を参照されたい。いくつかの態様において、配列決定は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの次世代配列決定である、ダイターミネーター配列決定および／またはパイロシーケンシングを含む。可視化は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと直接または間接的に連結されるシグナルの可視化であり得る。シグナルは、任意の有用なシグナル、たとえば蛍光シグナルまたは酵素シグナルであることができる。いくつかの態様において、酵素シグナルは、ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、およびミクロペルオキシダーゼのうちの少なくとも1つによって産生される。可視化は、光学顕微鏡法または蛍光顕微鏡法の使用を含み得る。ポリリガンド組織化学（PHC）を使用する可視化の様々な例が、本明細書において提供される。実施例19〜31を参照されたい。
試料の特徴決定または可視化に傾注する本発明の方法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つの標的は、公知であり得る。たとえば、オリゴヌクレオチドは、公知のタンパク質標的に結合し得る。いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つの標的は、不明である。たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、それ自体、オリゴヌクレオチドのいくつかまたはすべてによって結合される抗原が分かっていることを必ずしも必要としない、バイオシグネチャーまたは他の有用な結果を提供し得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの一部分の標的が、公知であるのに対し、オリゴヌクレオチドの別の部分の標的は、同定されていない。
試料を特徴決定または可視化する方法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書において提供されるとおりであることができる。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書において提供される本発明の富化方法、たとえば組織ADAPTによる富化を使用して決定されている場合がある。たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 1〜206506のうちの少なくとも1つによるオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有し得る核酸を含み得る。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有し得る核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば肺癌または前立腺癌であり得る。実施例14を参照されたい。
別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2953〜2961および2971〜2979のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば前立腺癌であり得る。実施例17を参照されたい。
なお別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえばHER2状態（+/-）であり得る。実施例19を参照されたい。
さらに別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3062〜103061および103062〜203061のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば抗HER2療法に対する応答であり得、任意で抗HER2療法は、トラスツズマブを含む。実施例20〜22を参照されたい。
例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 203064〜203067および203076〜206478のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば、フォルフォックスおよびベバシズマブのうちの少なくとも1つに対する応答であり得る。実施例24を参照されたい。
別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 206491〜206506のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば組織が乳房、結腸、腎臓、肺または膵臓組織を含むかどうかを非限定的に含む組織同一性であり得る。実施例29を参照されたい。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、表現型は、バイオマーカーの状態であることができる。いくつかの態様において、バイオマーカーは、表4または図26A〜Bより選択される。いくつかの態様において、バイオマーカーの状態は、HER2ポジティブ、HER2ネガティブ、EGFRポジティブ、EGFRネガティブ、TUBB3ポジティブ、またはTUBB3ネガティブのうちの少なくとも1つを含む。たとえば、実施例19〜23、24、26を参照されたい。いくつかの態様において、バイオマーカーの状態は、ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1（22c3）、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TS、およびTUBB3のうちの少なくとも1つの発現、コピー数、変異、挿入、欠失または他の変更を含む。様々な態様において、バイオマーカーの状態は、EGFR vIIIまたはMETエクソン14のスキッピングのうちの少なくとも1つの存在または非存在を含む。態様において、バイオマーカーの状態は、ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1、およびRSPO3のうちの少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変更を含む。態様において、バイオマーカーの状態は、
Figure 2019516393
Figure 2019516393
のうちの少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変更を含む。バイオマーカーの状態は、
Figure 2019516393
のうちの少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変更を含み得る。バイオマーカーの状態は、そのそれぞれがその全体として参照により本明細書に組み入れられる、2007年5月18日に出願されたPCT/US2007/69286；2009年10月14日に出願されたPCT/US2009/60630；2010年2月11日に出願されたPCT/2010/000407；2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41393；2013年12月4日に出願されたPCT/US2013/073184；2010年10月27日に出願されたPCT/US2010/54366；2011年12月28日に出願されたPCT/US11/67527；2015年1月29日に出願されたPCT/US15/13618；および2016年3月3日に出願されたPCT/US16/20657のうちの任意の一つにおけるバイオマーカーについてのものであることができる。本発明の方法および組成物に組み入れることができる追加的なバイオマーカーの例は、その出願のそれぞれが、その全体として参照により本明細書に組み入れられる、2009年10月30日に出願された国際特許出願番号PCT/US2009/62880；2009年11月12日に出願されたPCT/US2009/006095；2011年3月1日に出願されたPCT/US2011/26750；2011年4月6日に出願されたPCT/US2011/031479；2011年8月18日に出願されたPCT/US11/48327；2008年7月25日に出願されたPCT/US2008/71235；2010年11月30日に出願されたPCT/US10/58461；2011年1月13日に出願されたPCT/US2011/21160；2013年3月11日に出願されたPCT/US2013/030302；2012年2月17日に出願されたPCT/US12/25741；2008年9月12日に出願されたPCT/2008/76109；2012年6月14日に出願されたPCT/US12/42519；2012年8月8日に出願されたPCT/US12/50030；2012年8月3日に出願されたPCT/US12/49615；2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41387；2013年11月26日に出願されたPCT/US2013/072019；2013年5月28日に出願されたPCT/US2014/039858；2013年10月23日に出願されたPCT/IB2013/003092；2013年12月19日に出願されたPCT/US13/76611；2014年8月28日に出願されたPCT/US14/53306；および2015年11月23日に出願されたPCT/US15/62184；2016年6月29日に出願されたPCT/US16/40157；2016年7月28日に出願されたPCT/US16/44595；および2016年3月9日に出願されたPCT/US16/21632に開示されたものを非限定的に含む。本発明の方法を使用して、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化し、適切な試料が入手可能な任意の所望のバイオマーカーの状態を与えられた試料を分析することができる。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む、本発明の方法において、表現型は、疾患または障害を含む表現型であることができる。方法を採用して、疾患または障害についての診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供することを助けることができる。たとえば、富化されたライブラリーを使用して、疾患または障害についての診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供することを助けることができるように、試料を使用して富化する工程が行われ得る。同様に、特徴決定する工程は、疾患または障害についての診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供することを助けることを含み得る。可視化する工程はまた、疾患または障害についての診断、予後判定および／またはセラノーシスを提供することを助けることを含み得る。いくつかの態様において、セラノーシスは、治療効能もしくはその欠如を予測すること、患者を処置に対する応答者もしくは非応答者として分類すること、または治療効能をモニタリングすることを含む。セラノーシスは、任意の適切な処置に傾注されることができ、たとえば処置は、化学療法、免疫療法、標的化癌療法、モノクローナル抗体、抗HER2抗体、トラスツズマブ、抗VEGF抗体、ベバシズマブ、および／または白金／タキサン療法のうちの少なくとも1つを含み得る。いくつかの態様において、処置は、アファチニブ、アファチニブ + セツキシマブ、アレクチニブ、アスピリン、アテゾリズマブ、ビカルタミド、カルボザンチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、セリチニブ、セツキシマブ、シスプラチン、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン + エベロリムス、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ホルモン療法、イリノテカン、ラパチニブ、リポソーム-ドキソルビシン、イマチニブ（matinib）、ミノマイシン-c、nab-パクリタキセル、ニボルマブ、オラパリブ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、カルボシクリブ併用療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、スニチニブ、T-DM1、テモゾロミドドセタキセル、テムシロリムス、トポテカン、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、およびベムラフェニブのうちの少なくとも1つを含む。ホルモン療法は、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、酢酸メゲストロール、ロイプロリド、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、アビラテロン、エンザルタミド、トリプトレリン、アバレリックス、およびデガレリクスのうちの一つまたは複数であることができる。
セラノーシスは、図26A〜B、またはその出願のそれぞれがその全体として参照により本明細書に組み入れられる、2007年5月18日に出願されたPCT/US2007/69286；2009年10月14日に出願されたPCT/US2009/60630；2010年2月11日に出願されたPCT/2010/000407；2012年6月7日に出願されたPCT/US12/41393；2013年12月4日に出願されたPCT/US2013/073184；2010年10月27日に出願されたPCT/US2010/54366；2011年12月28日に出願されたPCT/US11/67527；2015年1月29日に出願されたPCT/US15/13618；および2016年3月3日に出願されたPCT/US16/20657のうちの任意の一つに記載された治療法のためであることができる。様々な癌を処置するためのこれらの治療法の利益または利益の欠如の可能性は、バイオマーカーの状態と関係することができる。たとえば、抗HER2処置は、腫瘍がHER2を発現する患者にとってもっとも有益であり得、逆もまた同じである。富化に適切な試料（たとえば、公知の応答者または非応答者）を使用して、従来のコンパニオン診断と比較して改善されたセラノーシスを提供するために組織ADAPTが使用され得る。たとえば実施例20〜22を参照されたい；実施例24、27も参照されたい。
試料を特徴決定することに傾注する本発明の方法において、特徴決定は、存在またはレベルを参照と比較することを含み得る。いくつかの態様において、参照は、疾患もしくは障害を有さない個体、または異なる状態の疾患もしくは障害を有する個体由来の試料において決定された存在またはレベルを含む。存在またはレベルは、可視化により決定されるIHCスコアのような視覚レベルの存在またはレベルであることができる。非限定的な例として、本発明により提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの参照との比較は、試料が癌試料または非癌／正常試料を含むことを示す。
本発明の方法のいくつかの態様において、一つまたは複数の試料は、体液を含む。体液は、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、毛髪油、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、腟分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、洞腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を非限定的に含む、任意の有用な体液であることができる。
試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、試料は、医学的状態、疾患、または障害を有する疑いがあるまたはその素因がある対象由来であることができる。
オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む本発明の方法において、医学的状態、疾患または障害は、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症または疼痛であり得る。いくつかの態様において、癌は、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮腫；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む。いくつかの態様において、前癌状態は、バレット食道を含む。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、強直性脊椎炎、シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む。いくつかの態様において、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞または血栓性事象を含む。いくつかの態様において、神経学的疾患は、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（たとえば脳卒中）、脳損傷、微生物感染または慢性疲労症候群を含む。いくつかの態様において、疼痛は、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢神経因性疼痛を含む。いくつかの態様において、感染症は、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む。
ある局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む、本発明により提供される方法を実施するための少なくとも1つの試薬を含むキットを提供する。関連する局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程、試料を特徴決定する工程または試料を可視化する工程を含む、本発明により提供される方法を実施するための少なくとも1つの試薬の使用を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つの試薬は、本明細書において提供される1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。追加的な、有用な試薬も本明細書において提供される。たとえば、実施例に提供されるプロトコルを参照されたい。
組織ADAPTにより提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを、様々な目的のために使用することができる。上記のように、そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、試料を特徴決定および／または可視化することができる。オリゴヌクレオチドはまた、関心対象の組織と関連するように選択されるので、そのような関連を他の目的のために使用することができる。ある局面において、本発明は、少なくとも1つの細胞または組織を画像化する方法であって、少なくとも1つの細胞または組織を、本明細書において提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、および少なくとも1つの細胞または組織と接触している少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。非限定的な例では、そのような方法を患者における腫瘍または組織の医学的画像化のために使用することができる。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有し得る核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば肺または前立腺組織に向けられ得る。実施例14を参照されたい。
別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2953〜2961および2971〜2979のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、表現型は、たとえば前立腺癌であり得る。実施例17を参照されたい。
なお別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3039〜3061のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば、細胞または組織のHER2状態に傾注され得る。実施例19を参照されたい。
さらに別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3062〜103061および103062〜203061のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば細胞または組織のHER2状態に傾注され得る。実施例20〜22を参照されたい。
ある例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 203064〜203067および203076〜206478のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同な配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば結腸直腸細胞または組織に傾注され得る。実施例24を参照されたい。
別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 206491〜206506のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような場合、画像化は、たとえば乳房、結腸、腎臓、肺または膵臓組織を非限定的に含む組織に傾注され得る。実施例29を参照されたい。
本発明により提供される画像化方法において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、本明細書記載のような様々で有用な化学構造または改変を有することができる。結合性、安定性を高めるため、検出を可能にするため、または他の有用な目的のために、そのような改変を行うことができる。
本発明により提供される画像化方法において、検出する工程の前に、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを対象に投与することができる。そのような方法は、対象における少なくとも1つの細胞または組織の画像化を可能にし得る。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または組織は、新生物細胞、悪性細胞、腫瘍細胞、過形成細胞、または異形成細胞を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの細胞または組織は、リンパ腫、白血病、腎臓癌、肉腫、血管外皮腫、黒色腫、腹部癌、胃癌、結腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、または非小細胞肺癌細胞のうちの少なくとも1つを含む。少なくとも1つの細胞または組織は、任意の所望の組織由来である、または本明細書記載のもののような所望の任意の医学的状態、疾患もしくは障害に関係することができる。
組織ADAPTにより提供されるオリゴヌクレオチドは、関心対象の組織と関連するように選択されるので、そのような関連を標的化薬物送達のような治療適用にも使用することができる。オリゴヌクレオチドは、単独で、または免疫調節薬、薬物などの標的化送達を提供することにより治療上の利益を提供し得る。ある局面において、本発明は、本明細書において提供される少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む構築物またはその塩の治療有効量、および薬学的に許容される担体、希釈剤、またはその両方を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、表28に記載された一つまたは複数のタンパク質と関連する。
たとえば、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、肺癌または前立腺癌を含む。実施例14を参照されたい。
別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 2953〜2961および2971〜2979のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、前立腺癌を含む。実施例17を参照されたい。
さらに別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3039〜3061のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、乳癌を含む。実施例19を参照されたい。
なお別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 3062〜103061および103062〜203061のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、乳癌を含む。実施例20〜22を参照されたい。
ある例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 203064〜203067および203076〜206478のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、結腸直腸癌を含む。実施例24を参照されたい。
なお別の例では、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO 206491〜206506のうちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100パーセント相同である配列またはその部分を有する核酸を含み得る。そのような薬学的組成物は、癌と関係する治療法に有用であり得、任意で癌は、乳房、結腸、腎臓、肺または膵臓の癌を含む。実施例29を参照されたい。
薬学的組成物内の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、任意の有用な所望の化学的改変を有することができる。ある態様において、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、毒素または化学療法剤に取り付けられる。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、多分割構築物内に含まれ得る。少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドをリポソームまたはナノ粒子に取り付けることができる。いくつかの態様において、リポソームまたはナノ粒子は、毒素または化学療法剤を含む。そのような場合、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを使用して、所望の細胞、組織、器官などに治療剤を標的化することができる。
関連する局面において、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患または障害を処置するまたは寛解させる方法を提供する。別の関連する局面において、本発明は、本発明の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、対象における細胞傷害性を誘導する方法を提供する。皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、局所投与、またはその任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを非限定的に含む、任意の有用な投与手段を使用することができる。
組織ADAPTにより提供される該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを、本明細書記載（上記参照）のもののような任意の所望の医学的状態、疾患または障害の画像化または治療適用のために使用することができる。非限定的な例として、該1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを、様々な解剖学的局所からの腫瘍の画像化、または様々な組織由来の癌の処置のために使用することができる。
キット
本発明はまた、本発明の方法を実施するための1種または複数種の試薬を含むキットを提供する。たとえば、1種または複数種の試薬は、1種または複数種のアプタマー、バッファ、ブロッカー、酵素またはそれらの組み合わせであることができる。1種または複数種の試薬は、アプタマーライブラリー、基体、たとえばマイクロビーズまたは平面アレイもしくはウェル、バイオマーカーおよび／または微小胞単離のための試薬［たとえば、クロマトグラフィー、ろ過法、限外ろ過法、遠心分離、超遠心分離、フローサイトメトリー、アフィニティー捕捉法（たとえば、平面、カラム、またはビーズに対する）、ポリマー沈殿による、および／またはマイクロ流体工学を用いる］、特定の標的に対するアプタマー、組織／細胞／微小胞／バイオマーカー集団の検出を容易にするアプタマープール、核酸配列決定または増幅のためのプライマーのような試薬、核酸ハイブリダイゼーションのためのアレイ、検出可能な標識、溶媒またはバッファなど、様々なリンカー、様々なアッセイ成分、ブロッカーなどを非限定的に含む、主題の方法を実施するための任意の有用な試薬を含み得る。1種または複数種の試薬はまた、本発明によって提供される様々な組成物を含み得る。ある態様において、1種または複数種の試薬は本発明の1種または複数種のアプタマーを含む。1種または複数種の試薬は、基体、たとえば平面基体、カラムまたはビーズを含むことができる。キットは、1種または複数種の試薬を使用して様々なアッセイを実施するための取り扱い説明を含むことができる。1種または複数種の試薬は、組織試料の染色に有用な酵素検出システムの成分およびその基体を含む、PHCアッセイを行うための試薬を含み得る。
ある態様において、キットは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドプローブまたは組成物を含む。キットは、本明細書に提供される方法を実施するように構成されることができる。たとえば、キットは、本発明のアプタマー、基体または本発明のアプタマーおよび基体の両方を含むことができる。
ある態様において、キットは、アッセイを実施するように構成されている。たとえば、キットは、1種または複数種の試薬および生物学的試料中の生物学的実体の存在またはレベルを検出するための取り扱い説明を含むことができる。そのような場合、キットは、関心対象の生物学的実体への1種または複数種の結合物質を含むことができる。1種または複数種の結合物質は基体に結合していることができる。1種または複数種の結合物質を改変して、捕捉、検出または可視化を可能にすることができる。たとえば、1種または複数種の結合物質をビオチン化することまたはジゴキシゲニンにコンジュゲートさせることができる。
ある態様において、キットは、生物学的試料の特定のオリゴヌクレオチドプロフィールを提供するオリゴヌクレオチドのセットを含む。オリゴヌクレオチドプロフィールは、非限定的に、特定の疾患または障害を特徴決定するために使用することができるプロフィールを含むことができる。たとえば、疾患または障害は、非限定的に癌を含む増殖性疾患または障害であることができる。いくつかの態様において、癌は乳癌を含む。
実施例1：アプタマー標的の特定
本実施例においては、ミクロスフェアに結合させたアプタマーを、上述のようなライブラリースクリーニング法により特定された2個のアプタマーの標的を決定することを手助けするために用いる。全般的なアプローチを、図9に示す。アプローチを、EpCAMを認識するライブラリースクリーニングにより特定されるアプタマーであるCAR003の標的を検証するために使用する。CAR003は、上記の方法論を用いて特定されるアプタマー候補である。RNAアプタマーとして、代替的なテール配列を伴うCAR003は、以下のRNA配列（SEQ ID NO: 3）を有する。
Figure 2019516393
本アプローチにおいては、CAR003の配列を、ミクロスフェアへの連結の前にランダムに再配列させる。ミクロスフェアを、意図される標的分子に類似しているが同一ではない標的に結合する対照として、使用する。
使用したプロトコルは以下である。
1）候補アプタマー（ここでは、CAR003）および陰性対照アプタマー（ここでは、ランダムに配列したCAR003）を、捕捉を可能にする修飾（ここでは、アプタマーをビオチン化する）および架橋を可能にする修飾（ここでは、光架橋を可能にするために、Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL由来のSulfo-SBED Biotin Label Transfer Reagent and Kit、カタログ番号33073を用いる）を伴って合成する。
2）アプタマーの各々を、関心対象の標的を有する微小胞（ここでは、BrCa細胞株微小胞）と個々に混合する。
3）アプタマーを標的に結合させるために、インキュベーション後に、アプタマーと微小胞標的との架橋を引き起こすように、紫外線を混合物に適用する。
4）微小胞を溶解させ、それにより架橋されたアプタマー-標的複合体を溶液中に放出する。
5）架橋されたアプタマー-標的複合体を、ストレプトアビジンコーティング基体を用いて溶液から捕捉する。
6）各アプタマーについて架橋されたアプタマー-標的複合体を、SDS-PAGEゲル電気泳動上で個々に流す。捕捉されたタンパク質標的を、クマシーブルー染色で可視化する。
7）架橋工程および結合工程は無差別の可能性があるため、意図される標的を含むが、ランダムなタンパク質もまた含む複数のバンドが、ゲルの各々上に現れるであろう。意図される標的は、候補アプタマー（ここでは、CAR003）を有するゲル上には現れるが、関連する陰性対照アプタマー（ここでは、ランダムに配列したCAR003）を有するゲル上には現れないバンド中に見出されるであろう。標的に対応するバンドを、ゲルから切り出す。
8）質量分析（MS）を用いて、切り出されたバンドからアプタマーの標的を特定する。
実施例2：疾患の診断
本実施例は、増殖性疾患を診断するための本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用を例証する。
実施例12または以下の様々な実施例において特定されるような、BrCa由来の微小胞集団に結合する適当な量のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのプールを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。オリゴヌクレオチドを、当技術分野において公知である結合法を用いて、蛍光部分などの、検出に適した診断物質に結合させる。
組成物を、微小胞の過剰発現と関連する増殖性疾患、例えば乳癌を患う患者の試験コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に適用する。組成物を、増殖性疾患を患っていない陰性対照コホートより採取された血液試料から単離された微小胞に、同様に適用する。
試験コホート試料に対する適切な検出技術（例えば、マイクロビーズアッセイまたはフローサイトメトリー）の使用により、疾患が存在することが示され、他方、対照コホート試料に適用された同じ技術により、疾患が存在しないことが示される。
結果により、本発明のオリゴヌクレオチドが増殖性疾患を診断するのに有用であることが示される。
実施例3：セラノーシス
本実施例は、増殖性疾患を処置するための薬物についてのセラノーシスを提供するための本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用を示す。
実施例19〜21または下の様々な実施例において同定されたような、乳癌組織と結合する適切な量のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプールを、当技術分野において公知の化学的手段により合成する。プローブを、検出に適切な薬剤、たとえばビオチン部分とコンジュゲートさせ、次にそれを、免疫組織化学（IHC）技法を用いストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼのようなストレプトアビジン構築物を使用して検出することができる。オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブのパネルは、バッファ溶液などの適切な組成物内にある。
処置の選択。ある特定の処置、たとえばトラスツズマブに応答した、増殖性疾患、たとえば乳癌を患う患者の試験コホートから採取した腫瘍組織試料に、プローブを適用する。同様に、処置に応答しなかった、同じ増殖性疾患を患う患者からなる対照コホートから採取した腫瘍組織に、該プローブを適用する。試験コホート試料に対する適切な検出技法（たとえばIHC）の使用は、試料と結合するプローブが、処置に応答する患者を同定するために有用であることを示し、一方で、対照コホート試料に適用された同じ技法は、処置に応答しない患者を同定するために有用なプローブを同定する。
処置のモニタリング。別の設定では、外科手術、放射線療法および／または化学療法のような処置クールの前または途中の、増殖性疾患、たとえば乳癌を患う患者の試験コホート由来の腫瘍組織試料にプローブを適用する。次に、時間経過にわたり患者由来の腫瘍組織試料にプローブを適用する。試験コホート試料に対する適切な検出技法（たとえばIHC）の使用は、検出された疾患関連細胞集団の濃度が、処置クールの間に経時的に増加する、減少する、または定常を維持するかどうかを示す。処置後の疾患関連細胞集団の増加は、処置があまり有効でないことを示し得るのに対し、処置後の疾患関連細胞集団の減少は、処置が有益な効果を有することを示し得る。
これらの結果は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが増殖性疾患のセラノーシスに有用であることを示している。
実施例4：治療用オリゴヌクレオチドプローブ
本実施例は、増殖性疾患を治療するための本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用を例証する。
実施例19〜21または以下の様々な実施例において特定されるような、乳癌腫瘍組織に結合する適当な量のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのプールを、当技術分野において公知である化学的手段を介して合成する。オリゴヌクレオチドを、当技術分野において公知である結合法を用いて、ドキシルなどの化学療法剤に結合させる。結合体を、水性組成物において製剤化する。
組成物を、乳癌を患う対象の試験コホートに、1つまたは複数の用量で、静脈内投与する。乳癌を患う対照コホートに、対応する投薬レジメンに従ってプラセボを静脈内投与する。
腫瘍試料の病理解析および／または生存により、死亡率および／または罹患率が、対照コホートを上回って試験コホートにおいて改善されることが示される。
結果により、本発明のオリゴヌクレオチドが増殖性疾患を治療するのに有用であることが示される。
実施例5：オリゴヌクレオチド-配列決定検出法
本実施例は、関心対象の表現型を示す微小胞を検出するためのオリゴヌクレオチドプールの使用を例証する。方法は、関心対象の表現型を示す関心対象の標的に対して富化されているオリゴヌクレオチドのプールを使用する。本実施例における方法により、標的実体を優先的に認識するためのオリゴヌクレオチドのライブラリーの効率的な使用が可能になる。
例証の目的で、方法を、体液試料由来の微小胞標的を用いて、実施例において記載する。当業者は、所望の投入試料に対するアプタマーライブラリーを富化することにより、方法を、他のタイプの標的実体（例えば、細胞、タンパク質、種々の他の生物学的複合体）、試料（例えば、組織、細胞培養、生検、他の体液）、および他の表現型（他の癌、他の疾患など）に拡大できることを、理解するであろう。
全般的なワークフロー：
1）未知の医学的語源を有する患者の試料（血漿、血清、尿、または任意の他の生物学的試料）を取得し、関心対象の標的の利用可能性を確実にするために、それに応じて前処理する（下記を参照されたい）。関心対象の標的が微小胞集団である場合は、微小胞を単離し、任意で、マイクロビーズなどの固体支持体につなげることができる。
2）前処理した試料を、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するオリゴヌクレオチドプールに曝露する。本明細書に記載されているように、関心対象の標的に対してある特定の特異性を保有するオリゴヌクレオチドプールは、種々の選択スキームを用いて、例えば、上述のようなネガティブ選択のための非癌微小胞およびポジティブ選択のための癌微小胞を用いて、富化することができる。DNAオリゴヌクレオチドまたはRNAオリゴヌクレオチドを、望ましいように使用することができる。
3）オリゴヌクレオチドライブラリーを試料と接触させる。
4）標的に結合した任意のオリゴヌクレオチドを溶出する。
5）溶出されたオリゴヌクレオチドを配列決定する。次世代配列決定法を使用することができる。
6）配列決定由来のオリゴヌクレオチドプロファイルを解析する。関心対象の標的に結合することが公知のオリゴヌクレオチドのプロファイルにより、投入試料内に標的が存在することが示される。プロファイルを、例えば、癌または非癌として、試料を特徴決定するために使用することができる。
プロトコルの変更：
様々な編成のアッセイを行うことができる。オリゴヌクレオチド配列決定アッセイのために、四つの例示的なプロトコルを提示する。試料は、任意の適切な生物学的試料であることができる。プロトコルを所望により改変することができる。たとえば、超遠心分離の代わりに、またはそれに加えて、代替技法を使用して微小胞を単離することができる。そのような技法、たとえばポリマー沈殿（たとえばPEG）、カラムクロマトグラフィー、および／またはアフィニティー単離は、本明細書において開示されていることができる。
プロトコル1：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料（例えば、血漿／血清／尿）の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
単離された微小胞を含有する、回収された試料の全タンパク質濃度を測定する。
単離された微小胞を、磁気ビーズ（例えば、MagPlexビーズ（Luminex Corp. Austin TX））に結合させる。
結合させた微小胞を、関心対象のオリゴヌクレオチドプールとインキュベーションする。
磁石を用いてビーズを保持することにより、結合していないオリゴヌクレオチドを洗浄する。
微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル2：
この代替的なプロトコルは、微小胞単離工程、ビーズへの微小胞の結合、または分離した分配工程を含まない。これは、投入試料に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を示す可能性がある。
体液試料から細胞／破片を除去し、試料を、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、オリゴヌクレオチドライブラリーとあらかじめ混合する。
オリゴヌクレオチド／試料混合物の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。沈殿した微小胞を洗浄する。
沈殿を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル3：
このプロトコルは、超遠心分離の代わりに濾過を使用し、より少ない時間および試料体積を必要とするものである。
体液試料から細胞／破片を除去し、それを、MgCl2（2mM）を含有するPBSで希釈する。
上記で調製された試料を、オリゴヌクレオチドライブラリーとあらかじめ混合する。
試料をフィルタ（すなわち、150Kもしくは300K MWCOフィルタ、または、結合していないもしくは望ましくないオリゴヌクレオチドを排除することができる任意の他のもの）中にローディングする。試料を遠心分離して濃縮する。濃縮された試料は、微小胞を含有するはずである。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定されたバッファで元の体積に希釈し、遠心分離を繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定されたバッファで元の体積に希釈し、濃縮物を新たなフィルタ単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
プロトコル4：
微小胞を単離するための、沈殿の2回の洗浄を伴う、1〜5 mlの体液試料の超遠心分離（120K×g、スクロースなし）。
微小胞をオリゴヌクレオチドプールとあらかじめ混合する。
試料を300K MWCOフィルタ単位中にローディングし、遠心分離（2000×g）する。濃縮率は、約3倍である。
濃縮物を洗浄する。バリアント1：濃縮物を上記で特定されたバッファで元の体積に希釈し、遠心分離する。2回繰り返す。バリアント2：濃縮物を上記で特定されたバッファで元の体積に希釈し、濃縮物を新たなフィルタ単位に移して、遠心分離する。2回繰り返す。
濃縮物を回収して、微小胞に結合したオリゴヌクレオチドを溶出する。
溶出されたオリゴヌクレオチドを増幅および精製する。
オリゴヌクレオチド配列決定（例えば、次世代法；Ion Torrent：融合PCR、エマルジョンPCR、配列決定）。
オリゴヌクレオチドプロファイルを評価する。
上記プロトコルの変更では、ポリマー沈殿法を使用して患者試料から微小胞を単離する。たとえば、オリゴヌクレオチドを試料に添加し、次に濃度4％または8％のPEG4000またはPEG8000を使用して、微小胞を沈殿させ、それにより微小胞を単離する。溶離、回収および配列分析を、上記のように継続する。
実施例6：オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いた血漿／血清のプロービング
オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用した血漿または血清試料のプロービングのために以下のプロトコルを使用する。
投入オリゴヌクレオチドライブラリー：
試料一つあたりオリゴヌクレオチドライブラリー2ngの投入物を用いる。
投入オリゴヌクレオチドライブラリーは、癌および非癌で富化された二つのライブラリーの混合物であり、濃度は16.3ng/ulである。
アプタマーバッファ（1×PBS中3mM MgCl2）を使用して0.2ng/ul作業原液に希釈する
作業原液から10ul（ライブラリー2ngに相当）を各optiseal管に添加する
材料：
PBS、Hyclone SH30256.01、LN：AYG165629、ボトル#8237、使用期限2015年7月
丸底遠心分離管、Beckman 326820、LN：P91207
OptiSeal遠心分離管および栓、ポリアロマーKonical、Beckman 361621、ロット#Z10804SCA
超遠心分離機ローター：50.4TI
超遠心分離機ローター：50.4TI、Beckman Caris ID#0478
プロトコル：
1 卓上遠心分離機、超遠心分離機、バケット、およびローターを4℃に予冷する。
2 血漿試料または血清試料を解凍する
3 試料1mlをアプタマーバッファ（1×PBS中3mM MgCl2）で1：2に希釈する
4 4℃で30分間、2000×gでスピン処理してデブリを除去する（卓上遠心分離機）
5 全試料について上清を丸底コニカルに移す
6 超遠心分離機中、4℃で45分間、12,000×gでスピン処理してさらなるデブリを除去する。
7 全試料について上清約1.8mlを新しいOptiSealベルトップ管（個別に印を付けた）に移す。
8 DNAプロービングライブラリー2ng（10ul中）を各optiseal管に加える
9 アプタマーバッファ適量で4.5mlにする
10 OptiSealベルトップ管にキャップを取り付ける
11 キャップの周囲にパラフィルムを巻いて漏れを防ぐ
12 血漿およびオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを室温で1時間、回転させながらインキュベートする
13 パラフィルムを剥がす（キャップは取らない）
14 栓をした各管の上部に正しいスペーサーを配置する
15 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向いていることを確かめる。
16 管を4℃で2時間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する。
17 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
18 ペレットマーカーの反対側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
19 上清を適切なバイオハザード廃棄容器に廃棄する
20 1×PBSで希釈した3mM MgCl2 1mlを加える
21 1600rpmで5秒間やさしくボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。
22 1×PBSで希釈した3mM MgCl2適量で約4.5mLにする
23 OptiSealベルトップ管にキャップを取り付ける。
24 栓をした各管の上部に正しいスペーサーを配置する。
25 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向くことを確かめる。
26 管を4℃で70分間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する
27 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
28 ペレットマーカーの反対側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
29 上清を適切なバイオハザード廃棄容器に廃棄する
30 1×PBSで希釈した3mM MgCl2 1mlを加える
31 1600rpmで5秒間やさしくボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。
32 1×PBSで希釈した3mM MgCl2適量で約4.5mLにする
33 OptiSealベルトップ管にキャップを取り付ける。
34 栓をした各管の上部に正しいスペーサーを配置する。
35 管上のペレット区域をマークし、このマークが中心から外を向くことを確かめる。
36 管を4℃で70分間、120,000×gでスピン処理して（内列は33,400rpm）、微小胞をペレット化する
37 マーキングがまだ中心から外を向いていることを確認する。
38 上清のアリコートを保存する（100ulを1.5ml管に）
39 ペレットマーカーの反対側から液体を捕集し、10mlシリンジバレルおよび21G2針を使用することにより、ペレットから上清を完全に除去する
40 RNアーゼフリーの水50ulをペレットの脇に加える
41 ベンチトップで15分間インキュベートしたままにする
42 清潔なはさみを使用して管の上部を切り取る。
43 ペレットを再懸濁させ、ペレットの脇で上下にピペッティングする
44 体積を計測し、全試料を標準化するために体積を記録する
45 オリゴヌクレオチドが結合した、計測し、再懸濁させ、溶離させた後の微小胞をRNアーゼフリーの1.5mlエッペンドルフ管に移す
46 全試料を100ulに標準化して、それを試料間および実験間で均一に維持する。
次世代配列決定試料の調製：
I）H2O 100ul中に再懸濁させた、微小胞／オリゴ複合体を含有する上記からの試料50ulをトランスポゾンPCR、14サイクルにおける鋳型として使用する。
II）トランスポゾンPCR産物をAMPureで処理し、全回収物をインデックスPCR、10サイクルのために使用する。
III）インデックスPCR産物をゲル上で確認し、バンドが見えるならばAMPureを実施する。バンドが見えないならば、3サイクルを追加し、ゲル上で確認する。精製後、産物をQuBitで定量し、HiSeqフローセル（Illumina Inc., San Diego, CA）に装填するために変性および希釈を実施する。
IV）フローセル一つあたり五つの試料が多重化される。HiSeq 1回で10試料。
実施例7：オリゴヌクレオチドプローブライブラリー
本実施例は、生物学的実体を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの開発を提示する。本実施例では、患者試料をプロービングするときに、二本鎖オリゴヌクレオチド（dsDNA）の存在を減少させるために手段を講じた。患者試料から微小胞（および潜在的に他の生物学的実体）を沈殿させるために使用した8％ PEGと6％ PEGとの効果を比較するデータも生成させた。
プロトコル：
1） 卓上遠心分離機を4℃に予冷する。
2） プロテアーゼの阻害：「cOmpleteULTRA MINI EDTA-free EASYpack」プロテアーゼ阻害剤2錠をH2O 1100ul中に溶解させる（プロテアーゼ阻害剤の20×原液）。
3） プロテアーゼ阻害剤50ulを試料（凍結血漿の上部）に添加し、解凍を開始する：それぞれ合計1ml。
4） 細胞／デブリを除去するために、試料を4℃で20分間、10,000×gでスピン処理する。上清（SN）1mlを捕集する。
5） 工程4からの上清1mlを2×PBS 6mM MgCl3 1mlと混合し、400ulを捕集して三つの管（繰り返しA、B、C）に入れ、それを工程6で使用する。
6） 表5による競合物質を加える：1×PBS、3mM MgCl2中に希釈し、十分に混合し、トラフに注ぎ入れ、マルチチャネルを使用してピペットで移す。
（表５）競合物質
Figure 2019516393
7） 室温で10分間、上下反転させながら回転させてインキュベートする
6-3Sおよび8-3Sオリゴヌクレオチドプロービングライブラリーのプールの準備が完了する：2.76ng/ul（約185ng）。プール原液および希釈液を保存する。ライブラリー6-3S（2.92ng/ul）171.2ul（500ng）をライブラリー8-3S（2.62ng/ul）190.8ul（500ng）と混合することによって新しいプールを作製することができる。プールされたライブラリーを30ulに等分し、-80Cで保存する。
結合のためにssDNAオリゴヌクレオチドプロービングライブラリーを終濃度2.5pg/ulまで加える。1×PBS、3mM MgCl2中に希釈する。
（表６）プローブライブラリーの計算
Figure 2019516393
8） 結合：室温で1時間、回転させながらインキュベートする。
9） ポリマー溶液：1× PBS 3mM MgCl2中に20％ PEG8000（6mM MgCl2を有する2×PBSで40％ PEG8000を希釈）を調製する。試料に20％ PEG8000を加えて終濃度6％にする。数回上下逆さにして混合し、4Cで15分間インキュベートする
（表７）PEGの計算
Figure 2019516393
10） 室温で5分間、10,000×gでスピン処理する。
11） SNを除去し、1×PBS、3mM MgCl2 1mlを加え、静かに上下逆さにすることによりペレットをアプタマーバッファ1mlで洗浄する。
12） バッファを除去し、H2O 100ul中に再懸濁する：900rpmのミックスメイト（Mixmate）上で、室温で10分間インキュベートして再懸濁する。
13） 工程13の後でピペッティングすることにより各試料が再懸濁していることを確認する。ほとんど再懸濁できない試料を書き留める。
14） 再懸濁した試料50ulをインデックスPCRに → 次世代配列決定（NGS）。
15） 残りを4Cで保存する
技術的検証：
微小胞を沈殿させるために8％ PEG8000を使用するプロトコルと比べて本プロトコルを試験した。本プロトコルは、オリゴヌクレオチドプロービングライブラリー中のdsDNAを減少させる工程をさらに含む。
図5Aに、結合の繰り返しの間の試料内変動（黒）および試料間変動（灰色）を示す。黒が灰色の上にあるので、任意の観察可能な灰色オリゴは、二つの患者試料の生物学的特徴における差異について情報提供的である。この変動要因の評価は、技術的変動が生物学的変動よりも有意に小さいことを示している。
図5Bに、高い量の二本鎖DNAおよび8％ PEGがあるときと比べて（灰色）、より高い比率の一本鎖DNAおよび6％ PEGの単離（白棒線）を使用する影響を示す。このデータは、本実施例におけるプロトコルが、患者間の生物学的分離を改善することを示している。
図5Cのプロットに、以前のプロトコル（PEG 8％、増加したdsDNA）と、実施例（PEG 6％、dsDNAなし）の改変プロトコルとの間の差を示す。黒は、繰り返し（独立した結合イベント）間の散布図であり、灰色は、患者間の差である。このデータは、最新のプロトコルを使用すると信号雑音比が有意に増加したことを示している。
患者の試験：
上記のプロトコルを使用して、以下の特徴を有する患者の試料を試験した。
（表８）患者の特徴
Figure 2019516393
Figure 2019516393
上に示したようなPEGを用いたポリマー沈殿を用いて、上記患者からの血液（血漿）試料中の微小胞（および潜在的に他の生物学的実体）を沈殿させた。試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーでプロービングするためにプロトコルを使用した。PEG沈殿した試料と結合した配列を、次世代配列決定（NGS）を用いて同定した。
図5Dに、前記患者40人の試験から選ばれた結果の散布図を示す。データの広がりは、多数のオリゴが検出され、オリゴが試料間で異なったことを示す。表9に示すように、見出された有意なオリゴの数は、ランダムに予期される数よりもずっと大きい。該表は、検出されたコピー数およびp値により選別されたオリゴヌクレオチドの数を示す。d-#は、その列のデータについて観察された配列のコピー数を示す。
（表９）予期された配列に対する観察された配列
Figure 2019516393
対照として、癌試料および非癌試料を2群にランダムに分けた。試料のそのようなランダム化は、試料群間を区別するオリゴの発見数を有意に減少させた。実際に、ランダムな群分けと比べた癌／非癌群分けの間で、情報提供的オリゴに50倍の増加があった。図5Eに、表9と同じデータを示し、表示の試料群間で観察された情報提供オリゴの数を表示する。
図5Fに、癌試料と非癌試料とを区別する異なるオリゴ群を示す。図に、コピーが500よりも大きく、p値が0.005未満であった、選択されたオリゴを用いて試験した試料40個のヒートマップを示す。はっきりした非癌コホートが上部にある、明確な亜集団が出現している。左軸に非癌試料を四角で囲む。図5Gは、類似の図であり、追加の癌試料20個および非癌試料20個での結果を示す。示すように、試料80個を用いた分析は、より独特でより大きいクラスターの出現をもたらしている。
追加の試料80個についてのデータを使用して、異なるスクリーニング実験で同定された情報提供オリゴの一致性も比較した。第1セットの患者40人を用いて同定された情報提供オリゴ315個のうち、その86％は、独立したセットの患者40人に対して試験したときと一致した変化倍率を示した。
実施例8：バランスのとれたライブラリー設計を使用したオリゴヌクレオチドプローブの富化
本実施例では、ナイーブADAPTオリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングして、乳癌患者の血液中を循環している微小胞および健康な対照個体（すなわち、乳癌を有さない）の血液中を循環している微小胞を同定するオリゴヌクレオチドを富化した。投入ライブラリーは、5'領域
Figure 2019516393
に続いてヌクレオチド35個のランダムナイーブアプタマー配列および3'領域
Figure 2019516393
を含むナイーブF-TRin-35n-B 8-3sライブラリーであった。「バランスのとれた」設計は、全体として参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2015/031694号（2014年8月28日に出願された出願番号PCT/US2014/053306）の実施例23に記載されている。作業ライブラリーは、およそ2×1013個の合成オリゴヌクレオチド配列を含んでいた。ナイーブライブラリーは、本明細書において「L0ライブラリー」と呼ばれる場合がある。
図12Aに示すプロトコルを使用して、乳癌患者および健康な（非乳癌）対照からの分画された血漿試料に対してL0ライブラリーを富化した。工程1において、PCR増幅されたL0の配列およそ1011個のアリコートを、生検ポジティブ（図12Aに「ソースA」と表示）の乳癌患者59人からのプール血液-血漿と共にインキュベートした。平行して、配列1011個の別のアリコートを、生検でネガティブと判明した乳癌の疑いの患者30人および自ら宣言した健康な女性30人（図12Aに「ソースB」と表示）からのプール血液-血漿と共にインキュベートした。工程2において、超遠心分離（UC）を使用して両方のL0試料から微小胞（細胞外小胞、「EV」）を沈殿させた。EVと会合するオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）をそれぞれのペレットから回収した。工程3において、各富化ライブラリーを異なるコホートからの血漿とインキュベートして、各試料コホートと特異的に会合したODNの富化に向けた選択圧を提供することによって、対抗選択工程（工程3）を実施した。この工程において、EVペレット中に含有されていた配列を廃棄した。工程4において、第2のポジティブ選択を行った。この工程において、工程3からのそれぞれの上清（sn）中に含有されていた配列を、各ポジティブ対照試料集団の別のアリコートからの血漿と混合し、EVを再度単離した。癌（生検ポジティブ）患者のポジティブ富化のためのライブラリーL1、および対照患者に対するポジティブ富化のためのライブラリーL2と呼ばれる二つの単一ラウンドライブラリーに相当するEV会合ODNを回収した。最終工程において、L1およびL2をPCRにより増幅し、一本鎖DNA（ssDNA）に戻し、混合してライブラリーL3を回収した。
投入物としてL3を使用してこの富化スキームをもう2回繰り返して、ライブラリーをプロファイルする複雑さを、およそ106個の異なる配列にさらに減少させた。工程2において、微小胞の分配のためにUCを使用したが、UCは、EV画分に対する特異性を増加させ得る。工程3および4において、PEG沈殿を使用して分割を行った。この手技は、各生物学的起源に特異的なODNを富化する。ライブラリーL3は、両方の起源からのEV集団に特徴的な標的に関連するODN、すなわち各起源に優先的に発現される分子に結合するアプタマーとして作用するODNを含有する。生検ポジティブ（n=59）、生検ネガティブ（n=30）、および自ら宣言した正常（n=30）の合計を第1ラウンドのL3富化に使用し、一方で、癌試料および非癌試料のみを後続のラウンドに使用した。
次世代配列決定（NGS）を用いて富化されたライブラリーを特徴決定して、各プロファイリングライブラリー中に含有された配列のコピー数を測定した。L0のNGSは、配列の大多数が低コピー数で存在したことを示しており、それに対し、ライブラリーL1およびL2は、配列一つあたり顕著に高い平均カウント（図12B）およびそれぞれ異なる配列の減少した量を示した。富化プロセスと一致して、妥当な読み出しの合計は不変であった（図12C）。
実施例9：ADAPTで同定されたバイオマーカーの分析
本明細書のたとえば「アプタマー標的の同定」という標題のセクションに記載するように、アプタマーにより認識される未知の標的を同定することができる。本実施例では、オリゴヌクレオチドプローブライブラリー（適応動的人工ポリリガンド標的化（ADAPT；Adaptive Dynamic Artificial Poly-ligand Targeting）ライブラリーまたはトポグラフィカルオリゴヌクレオチドプローブ「TOP（Topographical Oligonucleotide Probe）」ライブラリーとも呼ばれる）を本明細書記載のように開発し、スクリーニングされたオリゴヌクレオチドの標的を決定した。本実施例は、乳癌患者および正常対照（すなわち、非癌個体）の血液から捕集した微小胞を富化することにより生成したADAPTライブラリーを使用した。富化プロトコルを、本明細書の実施例8に記載する。
材料および方法
ライブラリーのSBEDコンジュゲーション
正常女性血漿からの微小胞に対してナイーブF-TRin-35n-B 8-3sライブラリーを富化した。富化されていないナイーブライブラリーは、5'領域
Figure 2019516393
に続いて、ヌクレオチド35個のランダムナイーブアプタマー配列および3'領域
Figure 2019516393
を含んでいた。ナイーブライブラリーは、本明細書において「L0ライブラリー」と呼ばれる場合があり、富化されたライブラリーは、「L2ライブラリー」と呼ばれる場合がある。実施例8を参照されたい。C6-アミンセンスプライマー
Figure 2019516393
および5'リン酸化アンチセンスプライマー
Figure 2019516393
を用いて、スクリーニング後のライブラリーをPCR増幅し、精製産物を鎖分離し、Vinkenborgら（Angew Chem Int Ed Engl. 2012, 51:9176-80）に以下の改変を加えたものにしたがって、スルホ-SBED（Thermo Scientific）とコンジュゲートさせた：反応物を25mM HEPES-KOH、0.1M NaCl、pH8.3中にC6-アミンDNAライブラリー 5μg（8.6μM）までスケールダウンし、体積21μL中に100倍モル過剰のスルホ-SBEDまたはDMSOのいずれかと共に室温で30分間、暗条件でインキュベートした。Waters X-Bridge（商標）OST C-18カラム（4.6mm×50mm）への注入によりSBEDコンジュゲートライブラリーを未コンジュゲートライブラリーおよび遊離スルホ-SBEDから直ちに分離し、バッファA：100mM TEAA、pH7.0、0％ ACNから100mM TEAA、pH7.0、25％ ACNに直線勾配をかけてHPLC（Agilent 1260 Infinity）により0.2ml/min、65℃で分画した。そこでGlen Gel-Pak（商標）カートリッジを用いてSBEDコンジュゲート画分を水へと脱塩し、speed-vacにより濃縮した。SBEDのコンジュゲーションをLC-MSおよび／またはストレプトアビジン-HRP検出を用いたドットブロットにより確認した。
結合反応および架橋
DMSO模擬コンジュゲート対照と比べて、SBEDコンジュゲートC6アミンライブラリーを用いてADAPTアッセイを行うことにより、SBEDライブラリーの機能化を試験し、HiSeq 2500（商標）（Illumina Corp.）を用いて配列決定した。ライブラリーおよそ240ngおよび血漿9.6mlに対応する1×PBS、3mM MgCl2、0.01mM 硫酸デキストラン、40ng/μl サケ精子DNAおよび40ng/μl 酵母転移RNA、ならびにcOmplete ULTRA Mini EDTA-free（商標）プロテアーゼ阻害剤（Roche）中で、血漿200μL（4℃で20分間、10,000×gで予備スピン処理して細胞デブリを除去する）あたりSBEDコンジュゲートライブラリーを5ng投入して上下反転させながら回転させて室温で1時間インキュベートした48個のADAPT反応物に、アプタマーの沈殿を行った。DMSO対照C6-アミンライブラリーと共に48個の反応物の二つ組みのセットを調製した。6％ PEG8000中、4℃で15分間インキュベートし、次に10,000×gで5分間遠心分離してアプタマーライブラリー-タンパク質複合体を沈殿させた。やさしく反転させることによりペレットを1×PBS、3mM MgCl2 1mlで洗浄して未結合のアプタマーを除去した。洗浄後のペレットを水100μL中に再懸濁し、手持ち式3UV（254NM/302NM/365NM）ランプ、115ボルト（Thermo Scientific）を用いて、氷上で96ウェルプレートからランプの間を1〜2cm離して、365nmで10分間、光架橋に供した。
オリゴヌクレオチドの沈殿
続いて、ライブラリー毎にプールした架橋反応物（約4.8ml）または1×PBS 4.8ml（APビーズのみ対照）を調製済みDynabeads（登録商標）MyOne（商標）ストレプトアビジンC1（10mg/ml）（Life Technologies）（1×PBS、0.01％ トリトンX-100で予備洗浄したもの）10μLと共に室温で1時間振盪しながらインキュベートした。Vinkenborgら（Angew Chem Int Ed Engl. 2012, 51:9176-80）により記載されたように、ビーズをエッペンドルフ管に移し、氷上で溶解バッファ（50mM トリス-HCl、10mM MgCl2、200mM NaCl、0.5％ トリトンX-100、5％ グリセロール、pH7.5）で20分間溶解させ、洗浄バッファ1（10mM トリス-HCl、1mM EDTA、2M NaCl、1％ トリトンX-100）で3回、続いて洗浄バッファ2（10mM トリス-HCl、1mM EDTA、2M NaCl、0.01％ トリトンX-100）で2回洗浄した。還元剤を添加した1×LDS試料バッファ（Life Technologies）中で15分間煮沸することにより架橋タンパク質を溶離させ、4〜12％ SDS-PAGE勾配ゲル（Life Technology）にロードした。感度を高めバックグラウンドを減少させるために、製造業者の説明書にしたがって使用したImperial Blue Protein Stain（Thermo Scientific）に続くProt-SIL2（商標）銀染色キット（Sigma）を用いる二重染色によりタンパク質およびDNAを検出した。
タンパク質の同定
癌と正常の間で異なるように見えたタンパク質バンドを勾配ゲルから切り取り、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（LC-MS/MS）に供した。
結果
銀染色したSDS-PAGEゲルから切り取ったバンドからADAPTタンパク質標的を同定した（図6）。6％ PEG8000でアプタマー-SBEDタンパク質複合体（レーン3）またはアプタマー-DMSOタンパク質複合体（対照-レーン4）を沈殿させ、UV光架橋に供し、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いてプルダウンした。還元条件下のSDS-PAGEにより溶離物を分析し、銀染色した。ライブラリーの泳動についての対照としてアプタマーライブラリー単独（5ng）（レーン1）をロードし（下から2番目の矢印）、過酷な溶離条件下でのストレプトアビジンモノマー（最も下の矢印）の潜在的浸出について確認するために、ビーズのみの試料からの等体積の溶離物（レーン4）をストレプトアビジン対照としてロードした。上の矢印（「標的」）は、模擬DMSO処理対照C6-アミンライブラリーと比べてSBEDコンジュゲートライブラリーを用いて同定された特異的またはより優勢なバンドを示す。表示された標的タンパク質のバンドを切り出し、LC-MS/MSタンパク質同定のために送付するか、または表示のDNAライブラリーのバンドを溶離させ、再増幅し、配列決定した。同定されたタンパク質は、正常試料においてアップレギュレートされたように見えたタンパク質である。
表10〜17に、銀染色ゲルから切り取られた八つのバンドから同定されたヒトタンパク質を挙げる。すべての表では、タンパク質は、取り出された対応する対照レーンにおいて同定されたタンパク質とのオリゴ-SBEDタンパク質複合体から同定されたタンパク質である。表のバンド番号は、ゲルから切り取られた異なるバンドを示す（図6）。表のアクセッション番号は、UniProtデータベース（www.uniprot.org）からのものである。「GN=」の後に遺伝子名が続く。表10〜17に示される様々なタンパク質の分類には、核酸結合タンパク質（NAB）、腫瘍抑制因子（TS）、細胞接着／細胞骨格（CA/CK）および多数の血漿タンパク質（ABP）が含まれる。
（表１０）バンド3
Figure 2019516393
Figure 2019516393
（表１１）バンド9
Figure 2019516393
（表１２）バンド1
Figure 2019516393
（表１３）バンド5
Figure 2019516393
（表１４）バンド7
Figure 2019516393
（表１５）バンド15
Figure 2019516393
（表１６）バンド17
Figure 2019516393
（表１７）バンド19
Figure 2019516393
いくつかのタンパク質が、複数のバンドから同定された。たとえば、IGLC2は、バンド3、15および19から同定され、SHROOM3は、バンド7、15、19から同定された。これは、分解産物、アイソフォームなどが原因であり得る。これらの実験により、34個のうち7個が推定上の腫瘍抑制因子／リプレッサーである核酸結合タンパク質（NAB）34個；細胞接着／細胞骨格（CA/CK）タンパク質37個；および豊富な血漿タンパク質（ABP）14個をとりわけ含む、タンパク質108個（加えてリゾチーム対照2個）が同定された。腫瘍抑制因子／リプレッサーのすべては、DNA/RNA結合タンパク質である。他のタンパク質は、シャペロン、シグナル伝達分子などを含む。
本実施例におけるバイオマーカーを使用して、癌試料または非癌試料であることを示す微小胞を検出することができる。
実施例10：富化されたオリゴヌクレオチドライブラリーを用いたアフィニティー富化および質量分析によるバイオマーカーの同定
本実施例は、上記実施例の継続である。生物学的成分（たとえば、非限定的に血液およびその派生物を含む体液）の複合混合物を含む試料では、アフィニティー精製質量分析（AP-MS）によるタンパク質-タンパク質複合体および核酸-タンパク質複合体の同定が妨害される可能性がある。たとえば、アフィニティー樹脂と非特異的に相互作用する高い存在量のタンパク質のような、特定の結合部位と無差別に相互作用し得る多様な成分を含む複合環境において、低い存在量のタンパク質-タンパク質複合体および核酸-タンパク質複合体を検出することが望ましい場合がある。予め同定された関心対象の標的を、個別のDNAアプタマーもしくはRNAアプタマーまたは特異的核酸結合ドメインを使用して富化するために、AP-MSが以前から使用されている。本実施例において、富化されたオリゴヌクレオチドプロービングライブラリーをアフィニティー試薬として使用した。質量分析と組み合わせたこのアプローチは、関心対象の標的の事前知識に頼らずに、異なる疾患状態または細胞撹乱から差次的に発現されたバイオマーカーの同定を可能にする。そのようなバイオマーカーは、タンパク質、核酸、miRNA、mRNA、炭水化物、脂質標的、その組み合わせ、または生体システムにおける他の成分を含み得る。
方法は、本発明の方法による富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの同定に続く、結合したプロービングライブラリーのアフィニティー精製および質量分析を用いた標的同定を含む。富化されたオリゴヌクレオチドプロービングライブラリーのメンバーは、アフィニティータグを含む。オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いて生物学的試料をプロービングし、アフィニティータグによりオリゴヌクレオチドプローブライブラリーのアフィニティー精製を行い、これは、結果的にプローブライブラリーの様々なメンバーと複合体を形成した生物学的実体を精製する。また、タンパク質に対して液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）を使用し、またはオリゴヌクレオチド標的（たとえば、miRNAもしくはmRNA）に対して次世代配列決定（NGS）を用いて、プローブライブラリーのメンバーと共に精製された標的の読み出しを行う。定量質量分析（MS）を使用して、たとえばMRM/SRMまたはSWATHベースの方法を使用して、タンパク質標的の確認を行う。
実施例の方法は、様々な選択肢を与える。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ビオチン、ポリヒスチジン、FLAGオクタペプチド（すなわち、
Figure 2019516393
、配列中、Nはアミノ末端を表し、Cはカルボキシ末端を表す）、3×FLAG、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（HA）-タグ（すなわち、
Figure 2019516393
、mycタグ
Figure 2019516393
、当技術分野において公知の他のタグ、およびその組み合わせを非限定的に含む任意の適切なアフィニティータグをアフィニティーのプルダウンのために使用することができる。同様に、本明細書において例示された磁気ストレプトアビジンビーズに加えて、他のビーズシステム、アガロースビーズ、平面アレイまたはカラムクロマトグラフィー支持体を非限定的に含む任意の適切な富化支持体を使用することができる。その結果として、様々な支持体を、オリゴヌクレオチドライブラリーに適切な、ストレプトアビジン、アビジン、抗Hisタグ抗体、ニッケルなどを非限定的に含む様々なアフィニティー試薬と結合させることができる。異なるアフィニティータグおよび支持体を所望により組み合わせることができる。本実施例は、架橋を使用したが、ある特定の場合には、そのような架橋は必要なく、たとえば、高親和性複合体の形成の同定に好都合であるためには望ましくない場合さえある。架橋が望ましい場合、BS2G、DSS、ホルムアルデヒドなどを含む任意の適切な架橋剤を使用して、本発明を実施することができる。他の適切な架橋剤および方法を、本明細書に記載する。たとえば、「アプタマー標的の同定」のセクションを参照されたい。溶解バッファおよび洗浄のストリンジェンシーは、たとえば、複合体が架橋しているか否かに応じて変動する可能性がある。あまりストリンジェントでない溶解／洗浄条件は、より多様な関心対象の潜在的タンパク質複合体を産生し得るが、一方で、よりストリンジェントな溶解／洗浄条件は、より高い親和性のオリゴ-標的複合体および／または特異的タンパク質を含む標的に好都合であり得る（たとえば、オリゴに結合したより大きな複合体を解離させることによる）。当業者は、標的の検出および検証のために、定性および／または定量LC-MS/MSが使用してもよいことをさらに認識している。同様に、代謝標識アプローチおよびラベルフリーアプローチが、スペクトラルカウント、SILAC、ジメチル標識、TMT標識、SRM/MRMまたはSWATHを用いた標的化MSなどを非限定的に含む定量MSのために使用される場合がある。
参考文献：
Figure 2019516393
実施例11：オリゴヌクレオチドプロービングライブラリーを用いるアフィニティー捕捉のためのプロトコル
本実施例は、上記実施例に提示したオリゴヌクレオチドプロービングライブラリーを使用するアフィニティー捕捉法のための詳細なプロトコルを提示する。
プロトコル：
オリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、デスチオビオチン標識または未標識ライブラリーのいずれかであり、かつ正常（すなわち非癌）女性の血漿に結合性の、本明細書記載のF-TRin-35n-B-8-3sを含む。他の箇所（たとえば実施例7）に記載したように、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを血漿試料に対して富化する。血漿試料をデスチオビオチン標識オリゴヌクレオチドライブラリーまたは未標識オリゴヌクレオチドライブラリーに対して別々に処理する。全般パラメータは、以下を含んでいた。
各オリゴヌクレオチドライブラリー（デスチオビオチンまたは未標識）の富化のために正常血漿試料48個をプールする
試料一つあたり投入血漿200μl
試料を予備浄化するために超遠心分離（UC）を使用する
各試料に各アプタマーライブラリー5ngを加える
すべてのライブラリー試料についての結合競合物質は、本明細書の他の箇所に記載されたように、0.01×S1（硫酸デキストラン）、tRNA 340ngおよびサケ精子DNA 340ngを含む
試料内の微小胞の沈殿のために6％ PEG8000を使用する
C1ストレプトアビジンビーズ（MyOneストレプトアビジンビーズC1-65001、ロット2ml（10mg/ml））を用いてアフィニティー精製を行う
バッファ：
血漿の希釈：2×PBS中の6mM MgCl2
ペレット洗浄バッファ：1×PBS、3mM MgCl2
PEG Pptバッファ：1×PBS、3mM MgCl2中の20％ Peg8000
ビーズ調製バッファ：0.01％ トリトンX-100を含有する1×PBS
溶解バッファ：100mM トリス-HCl、20mM MgCl2、400mM NaCl、1％ トリトンX-100、10％ グリセロール、pH7.5からなる2×原液を調製する。使用前に水で1：1希釈して1×にする。
AP洗浄バッファ1：10mM トリス-HCl、1mM EDTA、2M NaCl、1％ トリトンX-100、pH7.5
AP洗浄バッファ2：10mM トリス-HCL、1mM EDTA、2M NaCl、0.01％ トリトンX-100、pH7.5
ビオチン溶離バッファ1：5mM ビオチン、20mM トリス、50mM NaCl、pH7.5
1×LDS、1×還元バッファ2
試薬／機器の準備：
超遠心分離機を4℃に予備冷却する。
プロテアーゼ阻害：H2O 1100μl中に「cOmplete ULTRA MINI EDTA-free EASYpack」プロテアーゼ阻害剤を2錠溶解させる（プロテアーゼ阻害剤の20×原液）
血漿の調製（デスチオビオチン標識または未標識オリゴヌクレオチドライブラリーのそれぞれについて）：
1. 室温（RT）の水浴中で試料1ml毎にプロテアーゼ阻害剤50μlを（凍結血漿の上部に）加える。プール血漿を20ml、したがって阻害剤1100μlを使用する。
2. 細胞／デブリを除去するために、試料を超遠心分離機に入れて4℃で20分間、7500×gでスピン処理する。
3. 上清を捕集し、プールし、体積を測定し、記録する。
4. 血漿に等体積の2×PBS、6mM MgCl2を加える。
5. 低残留エッペンドルフ管1〜96にラベルを貼る。
6. 適切な管の位置図に基づき、各試料400μlをエッペンドルフ管に移す
7. 電動式P200を使用し、競合物質を加える：40ng/μl サケ精子DNA 8.6μl；40ng/μl tRNA 8.6μl；0.5×S1 8.6μl。
8. 上下反転させながら回転させて室温で10分間インキュベートする。
9. 適切なオリゴライブラリー10μLを加え、よく混合する。希釈したライブラリーの残りはどれもゲル対照のために保存する（下を参照）。
10. 上下反転させながら回転させて室温で1時間インキュベートする。
11. 終濃度6％用の試料に、電動式連続P100を使用して20％ PEG8000 187μlを試料／オリゴライブラリー435.5μlに加える。2、3回反転させて混合し、4℃で15分間インキュベートする
12. 卓上遠心分離機で各試料を10,000×gで5分間スピン処理する。
13. 上清を取り除き廃棄し、1× PBS、3mM MgCl2 1mlをペレットに加える。
14. やさしく反転させることによりペレット洗浄する
15. バッファを取り除き、ペレットを1×PBS、3mM MgCl2 100μl中で再懸濁する：ミックスメイトを用いて室温で10分間、900rpmでインキュベートして再懸濁する。各試料がピペッティングにより十分に再懸濁されたことを確認する。
16. すべてのデスチオビオチンライブラリー試料を一つの50mlファルコン（falcon）管に、未標識ライブラリーを別の管にプールするが、それぞれの合計体積は4800μlでなければならない。
17. ゲル用にAP試料に投入するためにアリコート10μLを採取する（2×還元剤を有する2×LDS バッファ 10μlを加える。
アフィニティー精製：
18. 各条件につきMyOne Strep被覆磁気ビーズ 10μLを1.5mlエッペンドルフ管内に調製し、磁気ビーズラックに置く。ビーズのみの対照（n=3）も同様に用意する。
19. 上清を取り除き、ビーズバッファ500μlで1回洗浄する。
20. 上清を廃棄する
21. 等体積の1×PBS、3mM MgCl2（本来採取した体積と等しい体積=10μl）中でビーズを再懸濁する
22. ビーズ10μlを工程19からの4780μLに直接加える。ビーズのみの対照にPBSを加える。
23. 試料をストレプトアビジンビーズと共にプレート振盪機上で、室温で1時間インキュベートする（テープで留める）。
24. 大型磁気スタンドに1分間置き、上清を除去する
25. 1×溶解バッファ1.5mLを試料に加え（3×500μl、それぞれにつき50mLファルコン管を十分にすすいで、すべてのビーズを捕集する）、新しいセットのエッペンドルフ管に移す。
26. 氷上で20分間インキュベートする。
27. 管を磁気ビーズラックに置き、1分間平衡化させ、上清を取り除く。
28. ボルテックスすることによりビーズを洗浄バッファ#1で洗浄する。十分に再懸濁する。
29. 管を磁気ビーズラックに置き、1分間平衡化させ、上清を取り除く。
30. 洗浄バッファ#1で工程27〜29と同様に追加的に2回洗浄する（洗浄バッファ#1で合計3回洗浄）
31. 洗浄バッファ#2で工程27〜29を追加的に（2回）繰り返す
32. 最後の洗浄時にビーズを新しいエッペンドルフ管に移す。（非特異的結合を減少させるため）
33. 残存する洗浄バッファがすべて取り除かれたことを確認するために、空で1回スピン処理する。
34. ビオチン溶離バッファ1 10μlをビーズに加える
35. 37℃で15分間インキュベートする。
36. 磁気スタンドに1分間置き、上清を捕集して新しい管に移し、溶離した試料に2×LDS、2×還元剤 10μLを加える。溶離物#1として保存する。
37. 1×LDS 試料バッファ、1×還元バッファ10μlを磁気ビーズに加える。
38. 試料を90℃で15分間煮沸する。ビーズ上のストレプトアビジンがビオチン化アプタマー-タンパク質複合体をアンフォールディングさせ、放出することを確実にするために、煮沸時間は15分間である。
39. 氷上の磁気スタンドに試料を置き、溶離した試料を捕集する。これが溶離物#2である。ビーズを廃棄する。
40. ゲル1の配置：
レーン1：デスチオビオチンライブラリー5ng
レーン2：1×LDS
レーン3：マーカー
レーン4：デスチオビオチン溶離物#1
レーン5：未標識溶離物#1
レーン6：ビーズのみの溶離物#1
レーン7：デスチオビオチン溶離物#2
レーン8：未標識溶離物#2
レーン9：ビーズのみの溶離物#2
レーン10：AP用の投入物（工程17から保存）
還元SDSゲルの泳動：
20×MOPS SDSバッファから1×MOPS SDS泳動バッファを調製する
10または12ウェルの4〜12％ビストリスゲルを使用する
テープシールを剥がし、ゲルボックスに置く。必要ならば第2のゲルカセット用のスペーサーを挿入する。
泳動バッファMOPS（1×）および抗酸化剤500ulをチャンバー内部／上部に満たす
ウェルを乱さずにコームを慎重に取り外す
ウェルを泳動バッファですすいで、試料の泳動を妨害する可能性がある保存バッファを除去する
L-20チップを使用して試料を各ウェルに慎重にゆっくりとロードする
泳動バッファMOPS（1×）およそ600mlで外側／下側チャンバーを満たす
ユニットの上部分を取り付け、正しい電極を固定する
ゲルを泳動してタンパク質を移動させる
試料がスタックを通り抜けるために100V一定で15分間（すべての試料が並ぶまで）
泳動のために約1時間、150V一定に増加させる（視認可能な試料バッファがボトムに来るまで）
泳動の終わりに、電力供給を止め、セルからゲルカセットを取り出す
ゲルナイフでゲルカセットを分解する。
カセットケースの片側を取り外す。ゲルの最下部およびウェルを切り取る（ゲルの乾燥を避ける）。
Mili Q水を満たした容器にゲルを移し、迅速洗浄を行う。
銀染色：
材料：
ProteoSilver（商標）Silver Stain Kit、Sigmaカタログ番号PROT-SIL1、ロット番号SLBJ0252V
エタノール、Fisher Scientificカタログ番号BP2818-4、ロット番号142224
酢酸、Acros organicsカタログ番号14893-0025、ロット番号B0520036
水、Sigmaカタログ番号W4502、ロット番号RNBD1581
調製：
1. 固定液。エタノール50mlおよび酢酸10mlを超純水40mlに加える。
2. 30％エタノール溶液。エタノール30mlを超純水70mlに加える。
3. 増感剤溶液。ProteoSilver増感剤1mlを超純水99mlに加える。調製した溶液を2時間以内に使用するべきである。ProteoSilver増感剤中に沈殿が形成する場合がある。この沈殿は、溶液の性能に影響しない。沈殿を単に沈降させ、上清1mlを取り出す。
4. 銀溶液。ProteoSilver銀溶液1mlを超純水99mlに加える。調製した溶液を2時間以内に使用するべきである。
5. 顕色剤溶液。ProteoSilver顕色剤1 5mlおよびProteoSilver顕色剤2 0.1mlを、超純水95mlに加える。顕色剤溶液を使用直前（＜20分）に調製すべきである。
6. すべての工程をフード内で実施するべきであり、廃棄物を有毒物指定容器中に収集する必要がある。
手順
A. 直接銀染色
- すべての工程は、60〜70rpmの軌道振盪機上において室温で実施する。
1. 固定 - ミニポリアクリルアミドゲル中でタンパク質を電気泳動後、フード内で固定液100mlが入った清潔なトレイ中にゲルを一晩入れる。しっかりと覆う。
2. エタノール洗浄 - 固定液をデカントし、30％エタノール溶液100mlでゲルを10分間洗浄する。
3. 水で洗浄 - 30％エタノール溶液をデカントし、超純水200mlでゲルを10分間洗浄する。
4. 増感 - 水をデカントし、ゲルを増感剤溶液100mlと共に10分間インキュベートする。
5. 水で洗浄 - 増感剤溶液をデカントし、ゲルを2回、各回超純水200mlで10分間洗浄する。
7. 銀平衡化 - 水をデカントし、ゲルを銀溶液100mlで10分間平衡化する。
8. 水で洗浄 - 銀溶液をデカントし、ゲルを超純水200mlで1〜1.5分間洗浄する。
9. ゲルの顕色 - 水をデカントし、ゲルを顕色剤溶液100mlで顕色させる。大部分のゲルについて、所望の染色強度を生じるために3〜7分間の顕色時間で十分である。非常に低いタンパク質濃度（0.1ng/mm2）を有するバンドまたはスポットを検出するために、10〜12分間もの長い顕色時間が必要な場合がある。
10. 停止 - 顕色剤溶液にProteoSilver停止溶液5mlを加えて、顕色反応を停止させ、5分間インキュベートする。CO2ガスの泡が混合物中に形成する。
11. 保存 - 顕色剤／停止溶液をデカントし、ゲルを超純水200mlで15分間洗浄する。ゲルを新鮮な超純水中で保存し、資料用に写真を撮る。
タンパク質の同定
関心対象のタンパク質バンドを勾配ゲルから切り出し、上記のように液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS/MS）に供した。
実施例12：乳癌試料を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの使用
およそ2000個の異なるプローブ配列を含むオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを構築し、これを使用しておよそ500個の個別の乳癌試料および非癌試料をプロービングした。プローブ配列は、異なるスクリーニング実験から得られたものであり、これを本明細書のSEQ ID NO 10〜2921に記載する。これらの表に記載されたオリゴヌクレオチドを合成し、一緒にプールした。試料は、乳癌患者212人、生検で確認された非癌患者177人、および正常対照患者（癌でないと自己報告した）117人からの血漿試料であった。血漿試料をオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させ、PEG沈殿を使用して微小胞を単離した。微小胞と共に回収したオリゴヌクレオチドを単離した。次世代配列決定（Illumina HiSeq）を使用して、各試料について単離した配列を同定した。
有意差の解析により、癌／正常を比較したときにp値が0.01未満のアプタマーを18個、癌／非癌を比較したときにp値が0.001未満のアプタマーを15個、非癌／正常を比較したときにp値が0.001未満のアプタマーを28個同定した。
次に、交差検証アプローチを使用してマルチオリゴヌクレオチドパネルを構築した。簡潔には、試料50個をランダムに試料コホートに含ませずにおいた。ロジスティック回帰法を用いて、個別のオリゴヌクレオチドが残りの癌および非癌／正常を識別する性能を決定した。追加のオリゴヌクレオチドを反復的に加え、追加のオリゴヌクレオチドによりさらなる性能の改善がもはや得られなくなるまで、ロジスティック回帰を使用して性能を評価した。本アプローチにより、一般的に、およそ20〜100個の異なるプローブ配列のパネルに至った。次に、構築されたパネルを使用して、50個の含ませずにおいた試料を分類し、受信者動作特性曲線（ROC；Receiver Operating Curve）分析および曲線下面積（AUC；Area under the Curve）の推定を使用して、診断性能を評価した。
およそ300ラウンドの交差検証において、平均AUCは0.6であったので、このことは、平均性能がランダム（すなわち、AUCが0.5）よりも統計的に良好であったこと、およびプローブライブラリーが乳癌患者試料と非乳癌／正常患者試料とを識別できたことを示していた。特定の交差検証について0.8に達するAUC値が観察された。図7A〜Bに、交差検証のラウンドからトレーニング（図7A）およびテスト（図7B）のセットを使用して作製したモデルを示す。AUCは0.803であった。このモデルを構築するために使用した配列の可変領域を表18に示す。交差検証の他の例示的なラウンドを図7C〜Dに示す。AUCは0.678であった。
図7A〜Bのモデルに使用した配列のSEQ ID NOを表18にランク順に記載する。配列
Figure 2019516393
からなる5'領域および可変領域に隣接する配列
Figure 2019516393
からなる3'領域を有するオリゴヌクレオチドを合成した。
（表１８）オリゴヌクレオチドプローブの可変領域
Figure 2019516393
本実施例に提示されたデータは、SEQ ID NO10〜2921に記載された可変領域を有するメンバーを含むオリゴヌクレオチドプール、たとえば、表18に記載された可変領域を有するプローブのプールを使用して、非乳癌の個体由来の血漿から、乳癌を有する個体由来の血漿を同定できることを実証している。
実施例13：ライブラリーの開発のための一本鎖DNA（ssDNA）オリゴヌクレオチドライブラリーの調製
高収率および高品質のssDNAライブラリーの調製は、SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment／試験管内進化法）[1、2]だけでなく、DNAチップおよびマイクロアレイ[3]ならびに一本鎖高次構造多型分析技法（SSCP；single-stranded conformation polymorphism technique）[4]のような他の生物学的適用において重要な工程である。ssDNAライブラリーを調製するための標準的なアプローチは、最初に二本鎖（dsDNA）ライブラリーを生成するためのPCR増幅、それに続いてssDNAの分離および精製を含む。ssDNA調製のいくつかの戦略が、現在までに開発されており、それぞれが利点および欠点を有する。
ラムダエクソヌクレアーゼ消化[2、5〜7]
dsDNA標準PCR産物に、相補鎖を消化し標的ssDNAを残すためのラムダエクソヌクレアーゼが続く。次に、ssDNAの精製を行って酵素および望まれないバッファを除去する。
利点：通常のPCR増幅は、高いdsDNA生成収率を有する。
欠点：最終ssDNAの純度は、酵素消化の効率により限られる。消化前にもdsDNAを精製する必要があり、消化後の精製と合わせると精製が2回になり、このことは、投入材料の実質的な損失を招く。消化は、通常、少なくとも2時間を要する。消化速度が一貫しない場合がある。
非対称PCR[8、9]
この手順は、主産物としての標的ssDNAならびにより少ないdsDNA産物および非標的ssDNAを生成する。標的ssDNAに対応するバンドを未変性ゲルから切り出す。
利点：最終ssDNA産物は潜在的に高い純度を有する。
欠点：未変性ゲルにおいて鎖の分離は可能であるが、収率は概して低く、非標的鎖の存在を除外することができない。鎖が同じ長さを有するので、変性ゲル上で収率を上げることはできない。
ビオチン-ストレプトアビジン磁気ビーズ分離[10、11]
非標的PCRプライマーが、ビオチン化されているので、最終PCR産物は、ビオチン化-dsDNAであり、これをストレプトアビジン磁気ビーズにより捕捉し、変性させて非ビオチン標識標的ssDNAを放出させることができる。
利点：最終ssDNA産物は、相対的に高い純度を有する。
欠点：ほとんどの場合、投入ライブラリーをビオチン化する必要があるが、ストレプトアビジンビーズから捕捉された標的鎖を置換または放出させることが困難であり得る。中和のために使用されたNaOHおよび／または酸を除去するために、変性後の精製が必要である。
不等プライマー長PCR[12]
非標的PCRプライマーは、化学修飾されたスペーサーおよび後続の少数の余分なヌクレオチドを有する。PCR反応において、DNAポリメラーゼはスペーサーで停止し、長さが不等のPCR dsDNA産物を生じる。次に、標的ssDNAを変性PAGEゲルから切り出すことができる。
利点：標的ssDNAが非標的鎖と混合されていないので、最終ssDNA産物は、高い純度を有する。
欠点：ssDNAは、未変性ゲル上で見ることができない。時間のかかる変性PAGEゲルが必要である。あるdsDNAライブラリーを変性させることが困難であり得、そのことが最終収率を限定する可能性がある。
間接的精製法[13]
間接的精製戦略は、非対称PCRおよびビオチン-ストレプトアビジン磁気ビーズ分離を組み合わせたものである。要約すれば、通常のPCRを使用して十分なテンプレートを生成させ、次に過剰の標的プライマーおよびより少ないビオチン化相補プライマーを用いた非対称PCR、それに続きビオチン-ストレプトアビジン分離を行う。
利点：ssDNA産物の収率および純度を上げ得る。
欠点：ビオチン化標的ssDNAライブラリーを産生できない。プロセスは、比較的長く複雑であり、本来の配列の変異体を生成する傾向があり得る。
本発明は、関心対象の標的に対してオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを富化する方法を提供する。プローブはssDNAを含むので、プロセスは、PCR増幅を行ってから、各富化ラウンドの後にssDNAに変換し戻すことを含んでもよい。本実施例では、本発明者らは、ssDNAオリゴヌクレオチドライブラリーを調製するための戦略を開発した。目標は、効率的で迅速である一方で、高い品質／純度のssDNAを届けるプロセスを開発することであった。本発明者らは、PCRおよびssDNA調製を一工程に組み合わせても、選択バッファ、標的分子、他の試料成分（たとえば、血漿試料について極めて大量のタンパク質）および他のアッセイ成分（たとえば、微小胞を沈殿させるために使用される場合があるPEG沈殿溶液）の存在下で効率的なままであることを目指した。加えて、本発明者らは、非限定的にビオチンを含む任意の修飾を有するssDNAライブラリーを生成させることができる方法を望んだ。
本発明者らは、ssDNAオリゴヌクレオチドライブラリーを調製するために最適化されたバージョンのラムダエクソヌクレアーゼ消化プロトコルを使用した。しかし、消化の収率が全体的な回収率を制限し、異なるライブラリー調製物の間で一致していない。一部の例では、ssDNAのバンドは、消化後にゲル上でほとんど視認できない。本発明者らは、ssDNA産物中のdsDNAの不完全な消化も観察した。本実施例において、本発明者らは、不等長プライマー非対称PCR（Unequal length PRimer Asymmetric PCR）によるssDNA」またはSUPRAと名付けた代替プロトコルを開発した。本プロトコルは、上記の公知の方法からの欠点がなく、かつ、以前の方法と比較して高品質およびssDNAオリゴヌクレオチドライブラリーの最大10倍高い収率を提供する。本プロトコルは、ゲル上で標的ssDNAを非標的DNAと識別することができることから、比較的迅速で技術的に好都合である。
標準PCR 900および不等長PCR 910を比較する図を図9Aに示す。通常のPCR 900では、フォワードプライマー901およびリバースプライマー903をアプタマーライブラリー902のリバース鎖とハイブリダイズさせる。PCR反応を行い、それにより、等長のフォワード鎖904およびリバース鎖902を創出する。鎖を等長一本鎖905の状態に変性させる。不等長PCR 901では、延長因子（lengthener）セグメントおよび終結因子セグメントを有するフォワードプライマー911ならびにリバースプライマー913をアプタマーライブラリー912のリバース鎖とハイブリダイズさせる。PCR反応を行い、それにより、不等長のフォワード鎖914およびリバース鎖912を創出する。鎖を不等長の一本鎖914および912に変性させ、それらをたとえば変性ゲル上でサイズにより分離することができる。
SUPRAの工程は、（i）終結因子としての二つのIsp9（内側スペーサー9；トリエチレングリコールスペーサー）および延長因子としての32個の余分なヌクレオチド（たとえば、ポリA）により通常の非標的プライマーを修飾すること（これは、不等フォワードダブルisp9プライマー（UF-D9）と呼ばれる）；（ii）DNAテンプレート、UF-D9および通常の標的（リバース）プライマーを、リバースプライマーに好都合な比、たとえば1：37.5で混合することにより、非対称PCRを行うこと（PCRプログラムは、線形増幅モード（指数関数的の代わりに）が原因で、より時間のかかる伸長工程（たとえば、標準的な1分の代わりに3分）およびより多くのサイクルを有する。PCR産物は、大部分の標的ssDNAおよびごく一部のdsDNAを含有する）、（iii）PCR反応産物を変性バッファ（たとえば、180mM NaOHおよび6mM EDTA）と1：1混合し、加熱（たとえば、70℃で10分）および冷却（たとえば、氷上で3分間インキュベーション）することにより試料を変性させること；（iv）変性バッファ中においてSybrGoldで染色されたアガロースゲル上で変性産物を泳動させること（延長因子のせいでより長い非標的鎖は、上側のバンド（視認可能ならば）として出現するので、標的鎖（強い下側のバンド）を切り出して精製する）を含む。本プロセスは、（v）ゲル片を秤量し、ゲル片からssDNAを精製する（たとえば、ssDNA Nucleospinキットなどを使用して）工程；（vi）収量および未変性ゲルの定量化を用いて最終産物の純度および収率をチェックすることができる（たとえば、ssDNA Qubitキットなどを使用する）工程を非限定的に含む、任意の工程を含むことができる。
第1の工程は、（i）不等長の非標的鎖を創出する、効率的な終結因子および延長因子を有するフォワードプライマーの特定の設計を使用する。標的鎖を構築するために使用されたDNAポリメラーゼは、終結因子に到達した後で重合を停止し、延長因子は、標的鎖と非標的鎖との区別を容易にする。第2の工程（ii）では、二つのプライマーの間の比がリバースプライマーの方向に傾き、大部分の標的ssDNAを産生する。しかし、反応を続けるために、該比が二本鎖テンプレートの産生を限定すべきではない。図9Bは、非対称PCRにおけるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの投入物の滴定を示すゲルである。標的鎖がはっきりと視認可能な最適条件は、1：20〜1：50のF：Rプライマー比の範囲である。図に示すように、非対称PCRにおける二つのプライマーの比は、最終産物中のdsDNAおよびssDNAの量に影響する可能性がある。非対称PCRに効率のよさをもたらすためにPCRサーモサイクラープログラムも調整する。第3の工程（iii）では、信頼できる変性法を使用して標的ssDNAを分離して、最終的な収率および高純度を保証する。
所望により、最終工程（vi）は、たとえば、ssDNA Qubitキットを使用して残留dsDNAの比を推定する。収率が重要でない場合、変性工程（iiiおよびiv）を省略することができ、PCR産物を未変性ゲル上で直接泳動させることができる。dsDNAのバンドがあるが、より低いMWの標的ssDNAのバンドを同定し、ゲルから精製することができる。これは、PCR後に変性させずに品質チェックまたは精製するために、直接標的バンドを視覚化する方法でもある。最終産物の純度は、同じであるが、収率はより低い。
未変性ゲルと変性ゲルとの精製の比較を図9Cに示す。1：38（フォワード／リバース）の比で混合した不等長プライマーを使用して、プロービング後のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーをPCR処理した。図では、各ゲルの左レーンは、50bp分子量ラダーであり、下側のバンドはリバースプライマーである。dsDNAおよびssDNAの位置を示す。未変性ゲルは、dsDNAおよびssDNA（標的鎖）の両方の存在を示した（図9C、A欄）。ここで、標的リバース鎖の一部は、dsDNAとして移動している。したがって、未変性ゲルを使用して、標的ssDNAを中等度の回収率で精製することができる。より高い収率が望まれる場合、上記のように変性アガロースゲル上でPCR産物を泳動させることができる。このアプローチは、最大の回収率を与え、その際、標的鎖のみが視認可能であり、ゲルから切り出して精製することができる（図9C、B欄）。この場合、未変性ゲル上のdsDNAの一部であるリバース鎖ssDNA（図9C、A欄）が変性しており、かつ標的ssDNA鎖の他の遊離分子と一緒に移動するが、一方で、フォワード鎖は増幅が限られているせいで視認不能になる。
比較的低い収率を有し、かつ変性ゲル上で標的鎖と非標的鎖とを識別できない標準的な非対称PCRと比較して、SUPRAは、異なる長さの標的および非標的を提供し、それらを未変性ゲルおよび変性ゲルの両方で精製することができる。非常に長い尿素-PAGEプロトコルを使用し、かつdsDNAのみを産生する不等プライマー長PCRと比較して、SUPRAは、より少ないdsDNAを有し、また、収率が重要でないならば、未変性ゲルからであっても遊離標的ssDNAを切り出すことができる。
SUPRAは、本発明により提供されるオリゴヌクレオチドプローブライブラリー富化方法に使用されている。本方法は、頑健である。富化バッファ、標的／非標的分子、タンパク質、エキソソーム／微小胞、PEGおよび他の成分の存在下で、SUPRAは、高品質で大量のssDNAオリゴヌクレオチドライブラリーを提供する。
参考文献：
Figure 2019516393
実施例14：細胞系を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプール
本実施例では、癌特異的プールを創出するために異なる癌細胞系からの細胞の組み合わせを使用して、非癌細胞のプールに対してオリゴヌクレオチドライブラリーを富化した。富化を行って、癌特異的オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプールを同定し、それらを、診断アッセイ、薬物として、または薬物送達を非限定的に含む、様々な適用に使用することができる。
スクリーニングされていないライブラリーは、ランダムに生成したヌクレオチドの領域を挟むF-Trin-Bプライマー（すなわち、上に示すような
Figure 2019516393
）を含んでいた。本明細書提示の方法論を使用して富化を行った。上記実施例を参照されたい。詳細なプロトコルを下の実施例15および16に示す。1ラウンドの富化は、富化されたオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅前の一連のポジティブ、ネガティブおよびポジティブ選択からなった。1ラウンドの富化の略図を示す図13を参照されたい。増幅されたライブラリー（PCR）を次のラウンドまたは富化への投入物として使用する。使用した細胞系は、表19に記載するような九つの肺癌系、五つの前立腺癌系、および九つの非癌系からなった。
（表１９）細胞系
Figure 2019516393
肺癌試料プールに対して9ラウンドの富化を行った。最も富化された上位五つの配列の可変領域を表20に示す。富化されたライブラリーは、上に示された隣接配列の間に
Figure 2019516393
として挿入された、表に示す可変領域からなる。これらの配列も5'ビオチン化した。出発ライブラリー25ngを富化に使用した。対照配列として、表20に示すような逆相補鎖を合成した。これらは、隣接領域を含むオリゴヌクレオチド全体の逆相補鎖である。S1LCa25-R9S1RC-5'ビオチンおよびS1LCa25-R9S3RC-5'ビオチンは、それぞれS1LCa25-R9S1-5'ビオチンおよびS1LCa25-R9S3-5'ビオチンの逆相補鎖である。逆相補鎖は、富化された配列の標的と特異的に結合しないはずであるので、逆相補鎖をネガティブ対照として使用することができる。
（表２０）肺癌で富化されたオリゴヌクレオチド
Figure 2019516393
前立腺癌試料プールに対しても9ラウンドの富化を行った。様々な富化された配列の可変領域を表21に示す。富化に使用した出発ライブラリーの量を表に示す。ライブラリーは、表に示す可変領域を、上に示す隣接配列（SEQ ID NO4〜5）の間に挿入したものからなった。富化の後、ライブラリーを使用して細胞プールをプロービングし、NGSを使用して、結合した配列の同一性およびカウントを決定した。表21に、前立腺癌（PCA）または非PCAにおける配列のカウントおよびPCAと非PCAとの間の変化倍率を示す。プロービングを三つ組で行った。表30における配列は、3回のプロービング繰り返しについて標準化されたカウントにわたり変動係数（％CV）≦20％および≦0.6または≧1.4の癌／非癌変化倍率を有した。変動率（％CV）の平均は、PCAプールについて約11％および非PCAプールについて約12％であった。
（表２１）前立腺癌で富化されたオリゴヌクレオチド
Figure 2019516393
上記配列を捕捉のために5'ビオチン化した。対照配列として、表22に示すような逆相補鎖を合成した。これらは、隣接領域を含むオリゴヌクレオチド全体の逆相補鎖である。S1PCa5-R9S1RC-5'ビオチンおよびS1PCa25-R9S1RC-5'ビオチンは、それぞれ隣接領域を有する完全S1PCa5-R9S1-5'ビオチン配列およびS1PCa25-R9S1-5'ビオチン配列の逆相補鎖である。逆相補鎖は、富化された配列の標的と特異的に結合しないはずであるので、ネガティブ対照として使用することができる。
（表２２）前立腺癌で富化されたオリゴヌクレオチド
Figure 2019516393
表21の追加の配列を表23に示す。表23は、表示のように＞20％の％CVを有する配列を含む。
（表２３）前立腺癌で富化された追加のオリゴヌクレオチド
Figure 2019516393
qPCR、細胞酵素結合アッセイ（ELA）、共焦点顕微鏡法および細胞生存率判定アッセイのようなアッセイを行って、細胞に対するオリゴヌクレオチドの結合性を検証し、かつある特定のオリゴヌクレオチドの潜在的細胞殺滅特性を同定する。
実施例15：富化プロトコル
本来のF-TRin-35n-Bオリゴヌクレオチドライブラリーの再増幅。
1ラウンドの富化のための試料
前立腺／肺細胞系のプールからの細胞900,000個（それぞれ300,000個に三分割する）
正常細胞系のプールからの細胞900,000個（それぞれ細胞300,000個に三分割する）
調製
卓上遠心分離機を4℃に予備冷却する。
3mM MgCl2を有する1×PBS（PBS 138.6ul + 300mM MgCl2 1.4ul）で前立腺／肺細胞300,000個を140ulにし、下に記載した競合物質を加え、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。
2個の競合物質の混合物：サケDNA+tRNA。
競合物質サケDNA：サケDNA 800ngを加える（原液10ug/ul → 1×PBS + 3mM MgCl2で1：250希釈[40ng/ul] → 20ulを投入）。
競合物質tRNA：tRNA 800ngを加える（原液10ug/ul → 1×PBS + 3mM MgCl2で1：250希釈[40ng/ul] → 20ulを投入）。
ライブラリー／試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
第1ラウンドのオリゴヌクレオチドライブラリーについて5、25、50ngおよび以下のラウンドについて同量を、3mM MgCl2を有する1×PBS 20ul中に調製する。DNAを95Cで3分間加熱後、DNAを直ちに氷上に5分間置く。ブロッキングされた細胞にDNAを加え、上下反転させながら回転させて細胞を室温で30分間インキュベートする
細胞のスピン処理
工程IIからの細胞を500×gで5分間スピン処理し（4Cでスピン処理し）、ピペットで吸い上げることにより上清を廃棄する。
ペレットを1×PBS + 3mM MgCl2 1ml中に再懸濁する；ボルテックス／混合し、500×gで5分間再度遠心分離する（4Cでスピン処理）
洗浄をもう1回繰り返す。
ペレットを水50ul中に再懸濁する。
ペレットを工程IVに使用する。
オリゴヌクレオチドの溶離
0.1N NaOH 25ulをIIIからの細胞に加え、50Cで10分間インキュベートし、550rpmで10秒間ミックスメイト処理および撹拌する → 0.1N HCL 25ulを加える→ 4Cで10分間、12000×gでスピン処理する → NucleoSpin ssDNA精製に進む。ssDNAと結合させるために正しいバッファ（NTC）を使用すること（同定されるべきカラムの数） → 各カラムを水20ulで溶離する（溶離前のインキュベーション時間は5分である）。5×PBS + 15mM MgCl2溶液4ulを加え、その後、次の富化に進む。
ライブラリー／試料のインキュベーション（ネガティブ選択）
正常細胞300,000個（工程数に応じて）を、3mM MgCl2を有する1×PBSで140ulにし（PBS 138.6ul + 300mM MgCl2 1.4ul）、上記の工程I.cのように競合物質混合物（合計40ul）と混合し、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。次に、工程IVから溶離したオリゴヌクレオチドライブラリー（約20ul）を加え（95Cで3分熱処理する、直ちに氷上に5分間置く）、室温で30分間インキュベートする。
細胞のスピン処理
工程Vからの細胞を500×gで5分間スピン処理し（4Cでスピン処理）、上清を捕集する。
NucleoSpin、ssDNA精製を用いた上清の処理。ssDNAと結合させるために正しいバッファ（NTC）を使用すること（同定されるべきカラムの数） → 各カラムを水20ulで溶離（溶離前のインキュベーション時間は5分である）。
5×PBS + 15mM MgCl2溶液4ulを添加し、その後、次の富化に進む。
ライブラリー／試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
前立腺／肺細胞300,000個を、3mM MgCl2を有する1×PBS（PBS 138.6ul + 300mM MgCl2 1.4ul）で140ulにし、上記の工程I.cのように競合物質の混合物（合計40ul）と混合し、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。工程VIからのライブラリーと混合し（95Cで3分間熱処理し、直ちに氷上に5分間置く）、上下反転させながら回転させて室温で30分間インキュベートする。
細胞のスピン処理
工程VIIからの細胞を500×gで5分間スピン処理し（4Cでスピン処理）、ピペットで吸い上げることにより上清を廃棄する。
ペレットを1×PBS + 3mM MgCl2 1ml中に再懸濁し；ボルテックス／混合し、500×gで5分間再度遠心分離する（4Cでスピン処理）。
洗浄をあと1回繰り返す。
ペレットを水50ul中に再懸濁する。
オリゴヌクレオチド溶離（IV）に続き、次にnucleospinで精製して、ssDNAを水20ul中に得る。
水（20ul）中のssDNAをPCR増幅のために全部使用する。
実施例16：富化プロトコル
1ラウンドの富化のための試料
前立腺／肺細胞系のプールからの細胞900,000個（それぞれ細胞300,000個に三分割する）。
正常細胞系のプールからの細胞900,000個（それぞれ細胞300,000個に三分割する）
ライブラリーの投入毎に細胞は富化しない
（表２４）バッファ
Figure 2019516393
またはF-127およびHSAを用いたバッファの滴定量- 0.5％、1％および2％のF-127
細胞は1×PBS + 3mM MgCl2バッファ中で入手可能であり、移し替える必要がある。
I. 調製
卓上遠心分離機を4℃に予備冷却する。
癌細胞300,000個 - 140ulを三つの新しい管に移す。500×gで5分間スピン処理する。上清バッファを取り除き、バッファB2 70ulを加える。
下に記載する競合物質を加え、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。
二つの競合物質の混合物：
a.競合物質サケDNA：サケDNA 800ngを加える（原液10ug/ul → B2で1：125に希釈[80ng/ul] → 10ul投入）.
b.競合物質t-RNA：tRNA 800ngを加える（原液10ug/ul → B2で1：125に希釈[80ng/ul] → 10ul投入）。
ブロッキング用にバッファB2 90ulで体積を180ulにする。
II. ライブラリー／試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
第1ラウンドのためにバッファB2 20ul中にF-TRin-35n-B出発ライブラリー 5/25/50ngを調製する。DNAを95Cで3分間加熱後、直ちに氷上に5分間置く。ブロッキングされた細胞にDNAを加え、これらを上下反転させながら回転させて室温で30分間インキュベートする。
III. 細胞のスピン処理
工程IIからの細胞を4Cで5分間、500×gでスピン処理し、ピペットで吸い上げることにより上清を廃棄する。
ペレットをB2 1ml中に再懸濁する；ボルテックスし、4Cで5分間、500×gで再度遠心分離する。
洗浄をもう1回繰り返す。（追加洗浄）
ペレットをバッファB2 30ul中に再懸濁する。
ペレットを工程IVに使用する。
IV. オリゴヌクレオチドの溶離
IIIからの細胞に0.25N NaOH 10ulを加え、50Cで10分間インキュベートし、550rpmで5〜10秒間ミックスメイト処理および撹拌する → 0.25N HCL 10ulを加える→ 4Cで10分間、16000×gでスピン処理する。上清を捕集する、これを次の工程用のライブラリーとして使用する。
V. ライブラリー／試料のインキュベーション（ネガティブ選択）
正常細胞300,000個 - 140ulを三つの新しい管に移す。500×gで5分間スピン処理する。上清バッファを取り除き、バッファB2 70ulを加える。
競合物質の混合物（80ng/ul サケ精子DNA 10ul + 80ng/ul 酵母t-RNA 10ul）と混合し、バッファB2で体積を150ulにし（60ul加える）、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。次に、工程IVから溶離したオリゴヌクレオチドライブラリー（約50ul）（95Cで3分間熱処理し、直ちに氷上に5分間置く）を加え、室温で30分間インキュベートする。
VI. 細胞のスピン処理
工程Vからの細胞を4Cで5分間、500×gでスピン処理し、次の工程用のライブラリーとして上清（200ul）を捕集する。
VII. ライブラリー/試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
癌細胞300,000個 - 140ulを三つの新しい管に移す。500×gで5分間スピン処理する。上清バッファを取り除き、バッファB2 70ulを加える。
競合物質混合物（80ng/ul サケ精子DNA 10ul + 80ng/ul 酵母t-RNA 10ul）と混合し、上下反転させながら回転させて20分間インキュベートする。工程VIからのライブラリーと混合し（95Cで3分間熱処理し、直ちに氷上に5分間置く）、上下反転させながら回転させて室温で30分間インキュベートする（合計290ul）。
VIII. 細胞のスピン処理
工程VIIからの細胞を4Cで5分間、500×gでスピン処理し、ピペットで吸い上げることにより上清を廃棄する。
ペレットをB2 1ml中に再懸濁し；ボルテックスし、4Cで5分間、500×gで再度遠心分離する。
洗浄をもう1回繰り返す。（追加洗浄）
ペレットを水50ul中に再懸濁し、これをPCR増幅のために全部使用する。
実施例17：細胞系の微小胞を特徴決定するためのオリゴヌクレオチドプール
本実施例では、様々な癌細胞系から流出した微小胞を使用してオリゴヌクレオチドライブラリーを富化した。試料が、細胞に対して微小胞を含んでいたことを除き、上記実施例14と同様に富化を行う。本方法を行って、疾患特異的オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプールを同定することができ、それらを、非限定的に診断アッセイ、薬物として、または薬物送達を非限定的に含む、様々な適用に使用することができる。
スクリーニングされていないライブラリーは、ランダム可変領域に隣接するF-Trin-Bプライマー
Figure 2019516393
を含んでいた。下の実施例18にさらに記載される細胞系からの微小胞に関して富化を行った。図14Aに、図に示すようなVCaP細胞およびLNCaP細胞からのエキソソームに関する5ラウンドの富化の種あたりのコピーを示す。VCAP細胞から流出したVCAP微小胞にポジティブ選択を行い、LNCaP細胞から流出したLNCaP微小胞にネガティブ選択を行った。図に、様々なオリゴヌクレオチドプローブ種のコピー数がラウンド毎に増加したことを示すが、これは、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーにそれらの種が富化されつつあることを示している。いくつかの富化されたオリゴヌクレオチドプローブの可変領域を表25に示す。プローブは、5'ビオチン化されている。これらのプローブは、VCaP細胞およびLnCaP細胞からのエキソソームに対してライブラリー 5ngを用いて行われた富化から得られたものである。表25に、LNCaPと比べてVCaPにおいて少なくとも4.0倍増加した変化倍率を有する九つの配列を示す。各配列は、VCaPエキソソームに対するプロービングに関して少なくとも500という平均標準化カウントも有した。変化倍率を表に示す。図14Bに、表中の九つのオリゴヌクレオチドプローブを用いたプロービング（プロトコルについては下の実施例を参照されたい）の後に回収されたコピーを示す。表にも示すように、全プローブ配列（すなわち、上に示すF-Trin-Bプライマーを含む）の逆相補鎖を対照として使用する。
（表２５）オリゴヌクレオチドプローブの可変領域
Figure 2019516393
図14Cに、表25における九つの個別のDNA配列のライブラリーを用いたプロービングにより見られるように、LNCaP細胞からのエキソソームと比較して、単離されたVCaPエキソソームの七つのバッチ中六つの方が高い回収率であることを示す。本図に、逆相補鎖対照を用いたプロービングも示す。予想どおり、これらの配列は、可変領域SEQ ID NO 2953〜2961を有するオリゴヌクレオチドプローブ配列と比較して低いエキソソーム回収率を示した。
可変領域
Figure 2019516393
（すなわち、SEQ ID NO 2959）を有するアプタマーを用いたVCaP細胞からのエキソソームのプロービング、それに続くプルダウンおよび質量分析による分析によって、いくつかのタンパク質が同定されている。方法論については実施例9を参照されたい。例示的な結果を表26に示す。これらの実験により、癌に過剰発現される、エキソソーム新生の調節における鍵となるタンパク質（ESCRT、シンテニン）およびエンドサイトーシス輸送における鍵となるタンパク質（ケモカインCXCL11）が同定された。ESCRT機構（ESCRT-0、I、IIおよびIII）は、エキソソーム新生に関与し、該タンパク質は、ヒトの癌において過剰発現されることが観察されている。たとえば、そのタンパク質のすべてが全体として参照により本明細書に組み入れられる、Kowal et al., Biogenesis and secrection of exosomes, Current Opinion in Cell Biology, 2014, 29:116-125; Hurley and Hanson, Membrane budding and scission by the ESCRT machinery: it's all in the neck, Nat Rev Mol Cell Biol, 2010 11:556-566; Raiborg and Stenmark, The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins, Nature 2009 458: 45-52を参照されたい。本実験により、そのmiRNAの抑制が細胞を化学療法剤に感受性にする低温ショックタンパク質がさらに同定された。
（表２６）配列7を用いてプルダウンされたVCaPエキソソームからのタンパク質
Figure 2019516393
VCaP細胞およびLnCaP細胞からのエキソソームに対するライブラリー5ngを用いた上記富化からのネガティブ対照も同定した。いくつかを表27に示す。表に、LNCaPエキソソームに対して少なくとも4.0高い変化倍率を有する三つの配列および変化倍率1（VCaPエキソソームとLNCaPエキソソームとの間で変化なしを示す）を有する二つの配列を示す。可変領域を表27に示す。表にも示すように、全プローブ配列の逆相補鎖（すなわち、上に示すF-Trin-Bプライマーを含む）を対照として使用する。
（表２７）オリゴヌクレオチドプローブの可変領域
Figure 2019516393
qPCR、細胞酵素結合アッセイ（ELA）、共焦点顕微鏡法および細胞生存率判定アッセイなどのアッセイを行って、細胞に対するオリゴヌクレオチドの結合性を検証し、かつある特定のオリゴヌクレオチドの潜在的細胞殺滅特性を同定する。
実施例18：微小胞のための富化プロトコル
試料：
実験1：（F98細胞：生物：ドブネズミ（Rattus norvegicus）；細胞の種類：神経膠芽腫；組織：脳；疾患：未分化悪性神経膠腫）
各ポジティブ工程のために、トランスフェクトされたF98細胞（EGFR+）からの微小胞25ug
各ネガティブ工程のために、親F98細胞からの微小胞25ug
実験2：（前立腺癌細胞系）
各ポジティブ工程のために、VCaP細胞からの微小胞25ug
各ネガティブ工程のために、LnCaP細胞からの微小胞25ug
対照：
各ポジティブ工程およびネガティブ工程のために、微小胞を有さない反応バッファ
反応バッファ：1×PBS + 3mM MgCl2 + 0.5％ F127 + 1mg/ml HSA
試料の調製：1×PBS 35ul中の微小胞 25ugを調製し、1×PBS + 6mM MgCl2 + 1％ F127 + 2mg/ml HSA 35ulを添加して、1×PBS + 3mM MgCl2 + 0.5％ F127 + 1mg/ml HSA 70ul中に微小胞 25ugを得る。
富化スキーム：
第1ラウンド：ポジティブ工程のみ
第2ラウンド：ポジティブ工程→ ネガティブ工程→ ポジティブ工程
第3ラウンド：ポジティブ工程→ ネガティブ工程→ ポジティブ工程
第4ラウンド：ポジティブ工程→ ネガティブ工程→ ポジティブ工程
各ラウンドはPCRで終わり、続いてゲル電気泳動後にssDNAの精製を行う
I. 調製
a）卓上遠心分離機を4℃に予備冷却する。
b）反応バッファ70ul中のトランスフェクトされたF98微小胞またはVCaP微小胞各25ugに下記の競合物質を加え、ミックスメイトを用いて500rpmで振盪しながら20分間インキュベートする。
c）二つの競合物質の混合物：
競合物質サケDNA：サケDNA 800ngを加える（原液10ug/ul → 反応バッファで1：125希釈[80ng/ul] → 10ul投入）。
競合物質t-RNA：tRNA 800ngを加える（原液10ug/ul → 反応バッファで1：125希釈[80ng/ul] → 10ul投入）。
d）ブロッキングのために反応バッファ90ulで体積を180ulにする。
II. ライブラリー／試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
第1ラウンドのために反応バッファ20ul中にF-TRin-35n-B出発ライブラリー5ngおよび50ngを調製。DNAを95Cで3分間加熱後、これを直ちに氷上に5分間置く。ブロッキングされた細胞にDNAを加え、それらを上下反転させながら回転させて室温で30分間インキュベートする。
III. 6％ PEG8000を用いた沈殿プロトコル
a）試料として工程IIからの微小胞を使用する。
b）試料200ulに12％ PEG8000 200ulを加える。
c）試料を氷上に30分間放置する。
d）16000×gで10分間スピン処理し、上清を廃棄する。
e）反応バッファ200ul中にペレットを再懸濁し、16000×gで10分間再度遠心分離する
f）ペレットを反応バッファ30ul中に再懸濁する。
g）第1ラウンド：PCRに直行する。その後のラウンド：IVに進む。
IV. オリゴヌクレオチドプローブの溶離
IIIからの細胞に0.25N NaOH 10ulを加え、50Cで10分間インキュベートし、550rpmで5〜10秒間ミックスメイト処理および撹拌する → 0.25N HCL 10ulを加える→ 4Cで10分間、16000×gでスピン処理。上清を捕集する；これを次の工程のためのライブラリーとして使用する。
V. ライブラリー／試料のインキュベーション（ネガティブ選択）
反応バッファ70ul中の親F98エキソソームまたはLnCaPエキソソーム各25ugに競合物質の混合物（80ng/ul サケ精子DNA 10ul + 80ng/ul 酵母t-RNA 10ul）を加え、反応バッファ60ulの添加により体積を150ulにし、ミックスメイトを用いて500rpmで振盪しながら20分間インキュベートする。次に、工程IVから溶離したオリゴヌクレオチドプローブライブラリー（約50ul）を加え（95Cで3分間熱処理し、直ちに氷上で5分間インキュベートする）、室温（RT）で30分間インキュベートする。
VI. 6％ PEG8000を用いた沈殿プロトコル（IIIからの試料を使用）
a）工程Vからの微小胞／DNA混合物を使用する。
b）試料200ulに12％ PEG8000 200ulを加える。
c）試料を氷上に30分間放置する。
d）16000×gで10分間スピン処理し、上清を捕集する。
VII. ライブラリー／試料のインキュベーション（ポジティブ選択）
反応バッファ70ul中のトランスフェクトされたF98エキソソームまたはVCaPエキソソーム各25ugに競合物質の混合物（80ng/ul サケ精子DNA 10ul + 80ng/ul 酵母t-RNA 10ul）を加え、ミックスメイトを用いて500rpmで振盪しながら20分間インキュベートする。次に、工程IVからのオリゴヌクレオチドプローブライブラリー（約400ul）を加え（95Cで3分間熱処理し、直ちに氷上に5分間置く）、室温で30分間インキュベートする（合計体積490ul）。
VIII. 6％ PEG8000を用いた沈殿プロトコル
a）試料として工程VIIからの微小胞を使用する。
b）試料490ulに12％ PEG8000 490ulを加える。
c）試料を氷上に30分間放置する。
d）16000×gで10分間スピン処理し、上清を廃棄する。
e）ペレットを反応バッファ200ul中に再懸濁し、16000×gで10分間再度遠心分離する
f）ペレットを反応バッファ30ul中に再懸濁する。
g）PCRに進む。
プロービング
富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いてエキソソームをプロービングすることができる。これらの実験について、エキソソームを、富化されたssDNAオリゴヌクレオチドプローブライブラリーと接触させ、6％ PEG8000を用いて沈殿させ、共沈したオリゴヌクレオチドプローブをqPCRにより増幅させる。
実施例19：HER2+組織試料に対するオリゴヌクレオチドの富化
受容体型チロシンタンパク質キナーゼerbB-2（ERBB2）は、HER2（ヒト上皮成長因子受容体2）またはHER2/neuと呼ばれることも多い、ERBB2遺伝子によってコードされるタンパク質である。乳癌の約20％はHER2遺伝子を過剰発現し、それが、細胞に成長および分裂する不適切なシグナルを受信させる。HER2+癌は、侵攻性で急速成長性の傾向がある。HER2+乳癌を有する個体について、抗HER2モノクローナル抗体トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン（Herceptin））は、再発リスクを劇的に低下させることが示されている。
本実施例では、本発明者らは、HER2ポジティブ（HER2+）固定組織試料に対してナイーブF-Trin-Bオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを富化した。該プローブライブラリーは、本明細書に記載されているとおりであり、すなわち、各メンバーは、可変領域を挟む
Figure 2019516393
を有する。HER2+侵食性乳癌を有する患者5人（HER2+コホート）およびHER2-侵食性乳癌を有する患者6人（HER2-コホート）からのFFPE（新鮮凍結パラフィン包埋）組織に対して本明細書記載のように6ラウンドの選択を用いた富化を行った。IHCアッセイによりHER2の状態を決定した。選択中に使用したブロッキングバッファは、サケ精子DNA、tRNA、F127ポリマー、およびBSAタンパク質を含んでいた。富化スキームを図15Aに詳述する。図に示すように、ラウンド1〜3を、ポジティブ選択（すなわち、HER2+試料に対する結合物質を富化するため）のみを用いて行った。ラウンド4〜6は、HER2+試料に対するポジティブ選択とHER2-試料に対するネガティブ選択との両方を使用した。ラウンド6の終わりに富化されたライブラリーを、富化されたプロービングライブラリーとしてさらなる研究に使用した。富化されたプロービングライブラリーの特質を図15Bに示し、図中、独特な妥当な配列の数をNGSによって決定された各配列のコピー数に対してプロットする。富化されたプロービングライブラリーは、3.6×107個の独特な配列を含んでいた。50個の最も優勢な配列の可変領域を、SEQ ID NO 2989〜3038に最も優勢なものからより低い優勢な順に記載する。
富化されたプロービングライブラリーを使用してHER2+乳癌組織およびHER2-乳癌組織を染色した。図15Cに、富化なしの後（ラウンド0、図の「R0」、左欄）または6ラウンドの富化後（ラウンド6の後、図の「R6」、右欄）のHER2+腫瘍試料の代表的な染色を示す。図から分かるように、ナイーブR0ライブラリーと比較して、富化されたR6プローブライブラリーを用いた方がはるかに高い量の染色が観察された。同様に、図15Dに富化なしの後（R0、左欄）または6ラウンドの富化後（R6、右欄）のHER2-腫瘍試料の代表的な染色を示す。図から分かるように、富化されたR6プローブライブラリーまたはナイーブR0ライブラリーのいずれを用いたときも、染色がほとんど〜全く観察されなかった。
HER2と結合する、富化されたプロービングライブラリーの特異的メンバーを同定するために、図15Eに概略を記載した実験計画を実行した。ヒスチジン（histadine）タグ（「recHer2 Hisタグ」）を有する組み換えHER2を磁気ビーズ（「Ni磁気ビーズ」）とコンジュゲートさせた。ビーズを、富化されたプロービングライブラリー（「オリゴヌクレオチドライブラリー」）と混合し、インキュベートさせて、プローブをHER2ビーズと結合させた。結合したビーズを洗浄し、プローブ結合剤を回収し、次世代配列決定（NGS）により同定した。ネガティブ対照を用いて類似の実験を行って、非タンパク質ビーズおよび富化されていないライブラリーを含む、アッセイ成分と結合するプローブをフィルタ除去した。公知のHER2アプタマーをポジティブ対照として使用した。実験を2回行い、結合実験の両方のセットに出現し、タンパク質ビーズと結合しなかった配列のようないくつかのフィルタを適用した。すべての対照をフィルタ除去して、404個の配列が残った。優勢度により順位付けした最も優勢な配列の可変領域をSEQ ID NO 3039〜3061として記載する。これらの配列を個別に順位付けし、イムノアッセイ形式に使用して、HER2結合物質を同定した。
本発明者らは、次に、R6ライブラリーの標的を探究した。R6ライブラリーおよび富化されていないR0ライブラリーを、ビオチン-C3-C6-アミンプライマーを用いて増幅させた。ライブラリーをTBEゲルで精製し、アミン反応性ジアジリン架橋剤、スルホ-NHS-SS-ジアジリン（スルホ-SDAD）（スルホスクシンイミジル2-[(4,4'-アジペンタンアミド)エチル]-1,3'-ジチオプロピオネート）（Thermo Scientific）とコンジュゲートさせ、かつHPLCにより精製して、未コンジュゲートのオリゴヌクレオチドを除去した。次に、上に詳記したように富化のために使用したビオチン化ライブラリーと比べて、SDADとコンジュゲートしたライブラリーは、HER2+またはHER2- FFPE組織スライドを染色するのに適切であった。
HER2+またはHER2-組織に対する選択のために使用したのと類似の条件で、コンジュゲートしたライブラリーの結合を、Ventana Discovery Ultra機器（Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）を用いて行った。組織（HER2+またはHER2）毎に1セットのスライドを、R6ライブラリーもしくはR0ライブラリーと共に、またはライブラリーなしで染色して、特異的結合レベルを評価した。平行して、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Strept-HRP）を用いた検出の前に一条件あたり九つのスライドを取り出し、スライドの2cm上で手持ち式UVライトを用いて氷上で10分間、365nmで光架橋に供した。次にスライドをベータ-メルカプトエタノール無添加QProteomeバッファ（Qiagen）中にこすり入れ、製造業者の説明書にしたがって抽出した。HiPPR洗剤除去カラム（Thermo Fisher Scientific）を用いて洗剤を除去し、次に、タンパク質濃度をBCAアッセイで決定した。次に、架橋タンパク質-アプタマー複合体を、Dynabeads（登録商標） MyOne（商標）ストレプトアビジンC1（Thermo Scientific）10μLと共に室温で30分間インキュベートすることによりFFPE組織溶解物200μgからアフィニティー精製し、1×TBSで2回洗浄し、高ストリンジェンシー洗浄バッファ（10mM トリス、2M NaCl、1mM EDTA、1％ トリトンX-100）で2回洗浄し、続いて低ストリンジェンシー洗浄バッファで2回洗浄してNaClを除去し、1×PBS中に再懸濁し、還元剤を有する1×ラウリルドデシルスルフェート（LDS）中で煮沸することにより溶離させた。試料を還元することで架橋剤をアプタマーからタンパク質標的に運んだ。還元された試料を還元条件の4〜12％ SDS-PAGEゲル中、150ボルトで15分間泳動させた。全レーンを切り出し、ゲル内トリプシン消化に供した。ヨードアセトアミドを用いたアルキル化をIodoacetyl Tandem Mass Tag（商標）（iodoTMT; Thermo Fisher Scientific）により置き換えて、LC-MS/MSによる架橋された標的の同定を促した。
HER2+の一例についての結果を表28に示す。これらの結果をフィルタリングして、富化されていないR0ライブラリーとも架橋したタンパク質を除去した。R0ライブラリーとのバックグラウンドの結合は、核で最も優勢であるように見えた。表に、同定されたタンパク質がHER2もしくは乳癌（BrCa）もしくは臨床試験（任意の適応症に関する）と関連して報告されているかどうか、または任意の適応症についての薬物標的として使用もしくは示唆されているかどうかを示す。カッコ内に参考文献を記す。
（表２８）一つのHER2+組織試料について同定されたR6の標的
Figure 2019516393
Figure 2019516393
表28における参考文献：
Figure 2019516393
本実施例は、組織試料の投入物を用いてオリゴヌクレオチドプローブを同定することができるアプローチを提示する。結果として生じたオリゴヌクレオチドを使用して、HER2+組織試料を同定し、HER2-組織を同定することができる。本アプローチの一般的な適用は、予測バイオマーカーを同定することおよび薬物標的を同定することを非限定的に含む。この特定の例では、侵攻性の表現型（すなわち、侵攻性であることが知られているHER2+腫瘍）であるものの、抗HER2処置により標的化することができる表現型であることを示すオリゴヌクレオチドプローブが同定される。本発明者らは、HER2+乳癌試料におけるR6ライブラリーのある特定の標的も同定し、いくつかの薬物標的を特異的に同定した。そのうえ、オリゴヌクレオチド自体を使用してこれらのタンパク質を標的化することができ、したがって、オリゴヌクレオチドは、薬物候補を含むと同時に、薬物標的を同定する。
本実施例におけるこのアプローチを、任意の他の適切なバイオマーカーのために使用することができる。
実施例20：薬物応答者を同定するための組織試料に対するオリゴヌクレオチドの富化
本実施例は、上記の実施例19に提示した作業に続くものである。課題は、トラスツズマブ処置に応答する乳癌（BCa）患者を応答しない患者と識別することができるオリゴヌクレオチドライブラリーを開発することであった。様々な化学療法剤と一緒に投与されることが多いが、トラスツズマブは、IHCアッセイによりHER2を過剰発現すると決定された一部の患者（＜20％）に単独で有効性を示す。本実施例のために、応答者および非応答者は、応答の代用としての各患者の次の治療処置開始までの期間（「TNT」または「TTNT」）に基づいている。図16Aに、BCaのための処置スキームを、応答者と非応答者とを区別するスケジュールと共に示す。図のように、非応答者は、トラスツズマブ処置の開始から6ヶ月以内に別の化学療法処置で処置される。結果として得られるオリゴヌクレオチドを使用して、応答を予測し、妥当な患者集団に治療を指示することができる。
方法論は、上記の実施例19に記載されたものと類似していた。ナイーブF-trin-35ライブラリーの富化のための全般的スキームを図16Bに示す（AL=アプタマーライブラリー）。図中、応答者を選択用のポジティブ試料として示すが、非応答者の場合も、富化用ポジティブ試料と同様に富化を行った。6ラウンドの富化を行った。富化されたオリゴヌクレオチドライブラリー17個が得られたが、その中で八つのライブラリーを非応答者に対してトレーニングされ、九つのライブラリーが応答者に対してトレーニングされた。17個のライブラリーをライブラリーA〜Sと呼ぶ。
ライブラリーを、非応答者20人および応答者20人のセットに関してトレーニングした。この患者コホートを考慮して、応答者を、トラスツズマブで212日以上処置された患者として定義し、非応答者を、トラスツズマブで8〜119日間処置された患者として定義した。図16Cに、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーAを使用した非応答者および応答者の試料の染色を、染色強度により並び替えたものを示す。図から確認できるように、染色は非応答者試料の方が優勢であった。トレーニング試料の染色結果の概要である、非応答者で選択したライブラリーAおよび応答者で選択したライブラリーMを図16Dに示す。ライブラリーAにおける100000個の最も優勢な配列の可変領域を、優勢度により並び替えて本明細書においてSEQ ID NO 3062〜103061として含める。ライブラリーMにおける100000個の最も優勢な配列の可変領域を、同様に優勢度順に本明細書においてSEQ ID NO 103062〜203061に含める。各ライブラリーについて別々に作製したROC曲線ならびにAおよびMライブラリーを組み合わせて作製したROC曲線を図16Eに示す。ロジスティック回帰を用いて同時性能（joint performance）を決定した。十分なスライドを有さない数個の非応答者試料をこれらのデータから除いた。図16Eに示すように、トレーニングしたライブラリーAおよびライブラリーMは、応答者試料と非応答者試料とを識別する優れた性能を有した。対照として、ライブラリーAを使用して、トラスツズマブで処置されなかった乳癌例からのスライドを染色した。差次的染色パターンは、観察されなかった（データは示さず）。図16Fに、トレーニングされたライブラリーを使用して二つの小さな試験セットを分類し、表示のように有意なAUC値が得られた結果を示す。併用のAUCは0.78であったが、これは、臨床的有用性を示している。
したがって、現在利用可能なコンパニオン診断によるHER2+組織のみの代わりに、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用してトラスツズマブ応答者の組織を同定することができる。
上記の実施例19のように、トラスツズマブに対する応答性（またはその非存在）の原因となる標的が同定され、それを、より効率的な処置を開発するために使用することができる。
実施例21：ポリリガンドプロファイリングはその処置の利益にしたがって癌患者を区別する
特定の癌の処置に対する患者の応答は、アクセスが困難な可能性がある腫瘍システムの状況における微妙な差異に依存する。高度に多重化された測定技法が、これらの撹乱を評価するために有利であることができる。本実施例において、本発明者らは、本明細書記載のオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いたポリリガンドプロファイリングを使用してそのような分析を行った。本発明者らは、トラスツズマブベースのレジメンから利益を得た乳癌患者または得なかった乳癌患者のいずれか由来の腫瘍組織を識別する、二つの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドプローブライブラリーを作製した。独立した試料セットの試験により、標準的なHER2の免疫組織化学スコアリングと比較してROC曲線からAUC値を計算することによって評価される、ライブラリーが患者を区別する能力を検証した。カプラン-マイヤープロットにより、転帰が試験結果に基づいたことが確認された。すなわち、試験ポジティブの患者は、トラスツズマブ処置期間の中央値が604日であったのに対し、試験ネガティブの患者は、トラスツズマブ処置期間の中央値が129日であった。したがって、本実施例は、別個の臨床転帰を分類するためのポリリガンドプロファイリングの使用を実証している。
精密腫瘍学（precision oncology）は、個別の癌患者の処置を各腫瘍の特異的変異および独特な分子相互作用ネットワークに適応させようと努力している。ゲノムの複雑性および根底にある分子シグネチャーの不均一性は莫大であり、同じ患者内であっても各腫瘍がそれぞれに独特なプロファイルを有する可能性がある（1〜3）。特定の処置レジメンから利益を得る患者は、単一または少数のバイオマーカーの単なる発現状況以外の特徴において、利益を得ない患者と異なることが多い。結果として、精密腫瘍学についての現在のパラダイムは、以下の三つの主要な柱に依存する。第1に、DNA／RNA配列決定による患者の腫瘍における変異の同定；第2に、腫瘍組織における公知のバイオマーカーの定量；第3に、新しいバイオマーカーおよびマスターレギュレーター遺伝子の同定。しかし、いくつかの最近の臨床試験の成功が限定的であったことに基づき、精密腫瘍学の可能性および潜在性が近年問題となっている（4、5）。すなわち、限界が明らかになったので、癌の特定の処置から利益を得るまたは利益を得ないであろう患者の同定を促すためのパラダイムシフト（6〜8）および改良されたコンパニオン診断テスト（CDx）の開発が求められる（9）。単一または少数のバイオマーカーは、処置の利益を必ずしも十分に予測し得ないので、これらの場合、より有効なCDxであれば、極めて複雑で現在ほとんど予測不可能な薬物応答表現型の根底にある数多くの込み入った分子的特徴に同時にアクセスするであろう。腫瘍の不均一性によって付与される表現型の多様性および腫瘍細胞により誘導される腫瘍の微小環境の変化にアクセスすることは、根底にある分子相互作用ネットワーク、すなわちインタラクトームにおけるわずかな変動の同定を必要とし得、インタラクトームの複雑さは、数十万個、または数百万個でさえある多分子複合体からなると推定されている（10）。そのような同定は、情報提供的で高度に複雑な分子特徴にアクセスするための不偏で無仮説のアプローチから利益を得る場合があり、そのアプローチは、それ以上の数の潜在的検出分子を必要とする可能性もある難題である。
本明細書において本発明者らは、この包括的目標を達成するための一アプローチであるポリリガンドプロファイリングを報告する。本実施例において、本発明者らは、ポリリガンドプロファイリングが、それぞれ応答者または非応答者とも呼ばれ得る、癌の特定の処置から利益を得る患者と利益を得ない患者とを区別する能力を評価する。次に、本発明者らは、ポリリガンドプロファイリングを、最も成功し広く適用されているCDxの一つである、HER2の免疫組織化学（IHC）分析と比較する。Her2は、ヒト乳癌の15〜30パーセントに過剰発現されている（11、12）。HER2の増幅は、腫瘍細胞増殖の増加および予後不良と関連するので、HER2ポジティブ（HER2+）乳癌を有する患者は、トラスツズマブを用いた処置の候補である。しかし、HER2+乳癌患者の30％だけがトラスツズマブ単剤療法から利益を得る（13）。トラスツズマブ（ハーセプチン）は、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2、ErbB2）と結合し、その機能を阻害するモノクローナル抗体である（14〜16）。
本実施例に記載された実験についての材料および方法を、下の実施例22に提供する。本実施例に含まれる患者についての臨床情報を表29〜32に提供する。表中、「CPP」は、シクロホスファミドを意味する。すべての試料は、乳癌であった。
（表２９）患者の情報：利益非享受者（NB）に向けてのトレーニング
Figure 2019516393
Figure 2019516393
Figure 2019516393
（表３０）患者の情報：利益享受者（B）に向けてのトレーニング
Figure 2019516393
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（表３１）患者の情報：ハーセプチンのTTNTの試験
Figure 2019516393
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（表３２）患者の情報：白金／タキサンのTTNTの試験
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本実施例では、本発明者らは、1013個の独特な一本鎖DNAオリゴデオキシヌクレオチド（ssODN；本明細書においてアプタマーまたはオリゴヌクレオチドプローブと呼ばれる場合もある）のライブラリー（17、18）を、トラスツズマブを含有するレジメンから利益を得た乳癌患者または得なかった乳癌患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）腫瘍組織切片と優先的に結合する配列のサブセットについて、数ラウンドのポジティブ選択およびネガティブ選択にインサイチューで供した。本発明者らは、本プロセスをライブラリートレーニングと呼ぶ。各患者の次の治療開始までの期間（TTNT）、すなわちトラスツズマブベースの処置が変わるまでに経過した時間は、患者が、トラスツズマブ含有処置から利益を得た群（B）に属するか、それとも利益を得なかった群（NB）に属するかを定義した（19）。TTNTによる処置の利益（B）および非利益（NB）の定義は、最近公表されたFDAガイダンスと一致する（20）。ライブラリートレーニングのために、TTNTが180日を超える症例をBと考え、TTNTが180日未満の症例をNBと考えた。全体で、NBの症例八つ（表29参照）およびBの症例九つ（表30参照）を、17個の異なるライブラリーのトレーニングのために使用した。それらの中に、最も性能のよい二つのトレーニング後ライブラリー、TL-BおよびTL-NBがあり（表29〜30における「富化症例ID」を参照されたい）、それを採用して、本発明者らは、NB患者からB患者を区別するポリリガンドプロファイリングベースの予測アッセイを作製した。
図17A〜Bに、患者の選択についての理論的根拠（図17A）ならびに各工程に使用される症例数を含む、ssODNライブラリーのトレーニングおよび試験手順のワークフロー（図17B）を示す。腫瘍の解剖学的部位、処置、ホルモン状態などの、このプロセスに含まれる患者それぞれについての臨床情報を表29〜32に提供する。出発ライブラリーを、一つのNB症例を使用するポジティブ選択（ラウンド1〜6）および二つのB症例を使用するネガティブ選択（ラウンド4〜6）に供して、TL-NBを生成させ、TL-Bを生成させるために逆も行った。表29〜30に、症例を三つ組で群分けした。たとえば、NB症例を使用してポジティブ選択を行って、TL-NB+とし、同じ富化においてTL-NB-およびTL-NB-として同定されるすぐ下の二つのB例を使用してネガティブ選択を行った。選択スキームおよびプロトコルのさらなる詳細については、図17Cおよび実施例22を参照されたい。読み出しの試験は、トレーニングに使用した症例と独立した症例からのFFPEスライドのポリリガンド-組織化学（「PHC」）染色に基づく。ライブラリーのトレーニングが、処置の結果として起こる腫瘍組織における分子的変化と独立していることを保証するために、トレーニングおよび試験のために使用したすべての組織試料を、処置の前に捕集した。
図17CにssODNライブラリーのトレーニングのための手順の概要を提供する。図17Ciに、非利益（NB）症例を同定するライブラリーに向けたポジティブトレーニング工程の概略：（i）NB組織と一緒のssODNライブラリーのインキュベーション；（ii）未結合の配列の除去、（iii）腫瘍組織の解剖およびNB癌組織に特異的な配列のサブセットの回収を記載する。SN：上清。回収されたssODNをPCRにより増幅し、ssODNに変換し、次のトレーニングラウンドのために使用した。左側のスライド画像は、組織の様子を示している。スライド1）NB組織のヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色（腫瘍領域の輪郭を緑色で示す）；スライド2）解剖前に分割した後にヌクレアファストレッド（NFR）で染色した組織；スライド3）ssODNが結合した癌組織の解剖後の残りの正常組織。図17Ciiに、利益（B）症例に対するトレーニング工程の概略を追加の対抗選択工程と共に記載する：（i）第1のB組織と一緒のssODNライブラリーのインキュベーション；（ii）第2のB症例と一緒の（i）からの上清のインキュベーション；（iii）AからのNB症例と一緒の（ii）からの上清のインキュベーション；（iv）および（v）は、Aにおける工程（ii）および（iii）に対応する。左側のスライド画像は、組織の様子を示す。スライド4）第1のB組織のヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色（腫瘍領域の輪郭を緑色で示す）；スライド5）第2のB組織のヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色（腫瘍領域の輪郭を緑色で示す）；スライド2および3は、図17Ciと同様である。図17Ciiiに、図17Ciに示すような三つのトレーニングラウンド（「i）」と表示）；続いて図17Ciiに示すような三つのトレーニングラウンドラウンド（「ii）」と表示）から構成される、ssODNライブラリーのトレーニング全体を概要する。図17Diに、トレーニングされたTL-NBライブラリー（ラウンド6；上欄：4×、下欄：20×）と比較して、トレーニングされていないライブラリー（ラウンド0）を用いた選択プロセスの間に使用されたNB症例からの組織の染色を示す。図17Diiに、トレーニングされたライブラリーTL-NB（ラウンド6；上欄：4×、下欄：20×）と比較して、トレーニングされていないライブラリー（ラウンド0）を用いた、選択プロセスの間に使用されなかったNB症例からの組織染色を示す。図17Diiiに、ラウンド5からの出力ssODN（右）と比較したラウンド3からの出力ssODN（左）を使用した、TL-NBのトレーニングにおける対抗選択のために採用された応答者症例からの組織染色を示す。
より詳細には、出発ライブラリーをトラスツズマブNB患者からのFFPE固定乳房腫瘍組織と共に直接インキュベートすることによって、非利益患者についてのトレーニングライブラリーTL-NBを得た。1時間インキュベーション（工程i）後に、非結合性ssODNを洗浄によって除去し（工程ii）、続いて正常隣接組織から離れた腫瘍組織の解剖を行い（工程iii）、解剖した腫瘍組織に結合したssODNの非対称PCR増幅を行った。図17Ciおよび実施例22を参照されたい。同じ症例の連続組織切片に関してこれらのポジティブ選択工程を合計3回行った（ラウンド1〜3；図17Ci、iii）。次に、第3ラウンドの富化からのssODNライブラリーを2人のトラスツズマブB患者からのFFPE組織と共にインキュベートすることによって、2回の連続する対抗選択工程に供した。2回目の対抗選択工程からの上清、すなわち、B腫瘍組織との結合に関連するssODNが枯渇したライブラリーを、上記のように1回の最終ポジティブ選択工程のために本来のNB患者の腫瘍から新しい組織切片に移し、結合したssODNのサブセットをPCR増幅した（図17Cii）。このネガティブ-ネガティブ-ポジティブ工程を合計3回行った（SELEXラウンド4〜6；図17Ciii）。未選択のライブラリーの染色強度と、選択のために使用したNB症例に関するラウンド6のTL-NBライブラリーの染色強度との比較により、富化されたライブラリーについて有意な染色増加が示され（図17Di、ラウンド6）、一方で、未選択のライブラリーについては、染色が全く見られないまたは弱く見られた（図17Di、ラウンド0）。ライブラリーのトレーニングに使用されなかった別のNB症例に対して類似の染色が観察された（図17Dii）。予想外ではなく、ラウンド3からのライブラリーをPCR増幅したもの（対抗選択の前に富化されたライブラリー）をB症例に適用した場合も、染色強度が高かった（図17Diii、左欄）。しかし、ラウンド5の後に、同じB症例に適用されたTL-NBについて染色強度の顕著な減少が観察され、これは、対抗選択工程が有効であったことを示している（図17Diii、右欄）。したがって、TL-NBは、NB組織に対して高い染色強度を示し、一方で、対抗選択のために使用したB症例をかなり、より弱い強度で染色する。したがって、TL-NBは、独立した試験セットに対するPHC染色に適切であった。
本発明者らがB症例を優先的に染色するssODNのセットについてもランダムライブラリーをトレーニングできるかどうか試験するために、本発明者らは、ポジティブ選択についてB症例を、対抗選択についてNB症例を使用して逆方向に別の富化プロセスを実施した。結果として生じた、トレーニングされたライブラリーTL-Bは、NB症例またはトレーニングされていない出発ライブラリーと比較してB症例の優先的染色を示した。図17Eに、B組織およびNB組織に対するライブラリーTL-Bの染色を示す。図17Eiに、トレーニングされたライブラリーTL-B（ラウンド6；上欄：4×、下欄：20×）と比較した、トレーニングされていないライブラリー（ラウンド0）を用いた、選択プロセスの間に使用されなかったB症例からの組織染色を示す。図17Eiiに、利益を得た症例（B）に対して富化されたラウンド4のライブラリーをラウンド6の後のTL-Bと比較して使用して、トラスツズマブベースのレジメンから利益を得なかった患者（NB）の組織のポリリガンド組織化学法（PHC）による染色を示す。
まとめると、TL-NBおよびTL-Bで観察されたPHC染色の特徴は、それらが標的化する表現型に向けて選択圧が十分で、富化が成功したことを示している。NBで選択された富化において最も優勢な100000個の配列（ライブラリーTL-NB）の可変領域を、本明細書にSEQ ID NO3062〜103061として優勢度順に含める。Bで選択された富化において最も優勢な100000個の配列（ライブラリーTL-B）の可変領域を、本明細書にSEQ ID NO 103062〜203061として、これも優勢度順に含める。
トレーニングのために使用された症例から独立した症例に対するTL-NBおよびTL-Bの性能を評価するために、本発明者らは、IHC関する標準的な病理診療と同様に、トレーニングされたライブラリーを用いて得られた組織染色強度の組織学的Hスコア化を、症例の定量比較のために採用することができることを検証した（21）。細胞質および核の両方の染色のスコア化を、患者の転帰について盲検化された有資格の病理学者が行った。プロトコルは、図17F〜Hおよび実施例22に示し、スコア化の結果を表33〜36に示す。乳癌FFPE組織の細胞質および核における0から3の範囲のPHC染色強度レベルの例を図17Fに示す。富化されていない出発ライブラリー（R0）と、トラスツズマブ含有処置から利益を得なかった患者（NB）および利益を得た患者（B）に対して富化されたライブラリーTL-NBおよびTL-Bとのポリリガンド組織化学（PHC）染色プロファイルの比較を示す図17I〜Jも参照されたい。各欄内のライブラリーの間で列毎に視野をマッチさせている。ライブラリーR0は、通常、ほとんど〜全く染色を示さないのに対し、富化されたライブラリーは、1+〜3+にスコア化することができる。トラスツズマブから利益を得なかった症例に向けて富化されたライブラリーTL-NBは、NB-15を除くNB症例に対して、より強い強度を示している。トラスツズマブ応答症例に向けて富化されたライブラリーTL-Bは、B症例に対して、より強い強度を示している。図17I〜Jにおける倍率は20×である。組織全体に対する細胞のパーセンテージを、細胞質および核において各PHC強度レベル内に入るように分類して決定することによって、組織学的スコアを標準方法により計算した。図17Gおよび実施例22を参照されたい。染色およびスコア化の再現性を評価するために、本発明者らは、TL-NBを用いて弱い染色および強い染色を示した症例を選択し、次に、技術的繰り返し間（図17H、第1の欄「アッセイ内」）、異なる操作者間（図17H、第2の欄「操作者間」）、異なるバッチのライブラリー間（図17H、第3の欄「バッチ間」）、および異なる機器間（図17H、第4の欄「機器間」）で核染色をスコア化した（22）。四つの強染色症例および弱染色症例の分類は一貫しており、これらの変数と独立していたので、染色およびスコア化に再現性があることを示している。PCR増幅されたバージョンのTL-NBおよびTL-Bの技術的再現性をさらに評価するために、両方のライブラリーを最大10世代までPCR増幅した。異なるPCR世代1〜5（図17K）、および6〜10（図17L）から生じたライブラリーTL-NBおよびTL-Bを用いた染色の技術的再現性を示す図17K〜Lを参照されたい。二つの異なる症例（Her2+およびHer2-/low）からの例を倍率20×で示す。各PCR世代について、先行する各ライブラリー世代のアリコート（0.4ng）を10 PCRサイクル増幅した。次に、TL-NBおよびTL-Bの各PCR世代を、TL-NBについて同じNB患者からおよびTL-Bについて同じB患者からの連続する組織切片の染色のために使用した。TL-NBおよびTL-Bの各PCR世代を、TL-NBについて同じNB患者からおよびTL-Bについて同じB患者からの連続する組織切片の染色のために使用した。世代間で染色に有意差は観察されなかったが、これは、過度なPCR増幅後に両方のライブラリーが高度に頑健な性能であったことを示している。
（表３３）組織学的スコア化、TL-NB、トラスツズマブのTTNT
Figure 2019516393
（表３４）組織学的スコア化、TL-NB、白金／タキサンのTTNT
Figure 2019516393
（表３５）組織学的スコア化、TL-B、トラスツズマブのTTNT
Figure 2019516393
（表３６）組織学的スコア化、TL-B、白金／タキサンのTTNT
Figure 2019516393
BまたはNB症例のいずれかについて相互に優先的染色を示す二つのライブラリーを手にして、本発明者らは、独立した45人の試験症例におけるトラスツズマブベースのレジメンに対する応答者および非応答者の区別および予測のためのPHCスコアの使用を試験した。図17Aを参照されたい。本発明者らは、受信者動作特性曲線（ROC）によりTL-BおよびTL-NBのPHCスコアを評価し、かつ曲線下面積（AUC）の値を計算した（図17Mi〜ii）。TL-NBについて、核のスコア化に基づきAUC値0.703が得られたのに対し（22）（図17Mi）、TL-Bは、核および細胞質の両方のスコア化に基づきAUC値0.688をもたらした（図17Mii）。個別のライブラリーからのこれらのAUC値は、TL-NBおよびTL-Bが、NB表現型およびB表現型を同定する、信頼できる情報を与えることを示している。TL-NB染色およびTL-B染色の両方からのPHCスコアを使用する多変量方法を用いて、トラスツズマブベースのレジメンに対する患者の応答を予測するために、ロジスティック回帰モデルを開発した。具体的には、利益状態または非利益状態の2成分の転帰を従属変数として使用し、それぞれのTL-NBおよびTL-Bの染色スコアを独立変数として処理した。次に、本発明者らは、モデルの性能をROC曲線分析により評価した。結果として、二つのライブラリーからのデータを組み合わせることにより、AUC値は0.804に増加したが、これは、トレーニングスキームの相互性質が原因で性能が向上したことを示している（図17Miii、AUC=0.804により表示）。AUC値0.760を生じた10分割交差検証（CV）によりこの解析の統計的信頼性をさらに検証した（図17Miii、AUC=0.760で表示）。次に、本発明者らは、これらのPHCベースのNBおよびB分類を、同じ45症例試験セットのHER2免疫組織化学スコア化により予測された分類と比較した（図17Miii、AUC=0.410で表示）。HER2のIHCの結果は、AUC値0.410をもたらしたが、これは、このコホートにおいてTL-NBおよびTL-Bが、従来のHER2のIHCよりもトラスツズマブB症例およびNB症例の分類に優れていたことを示している。
TL-NBおよびTL-Bは、低レベルのHER2発現を有するB患者およびNB患者を、IHCによりAUC値0.8で効果的に分類することができた。図17Nに、45症例の試験セットにおいて、ライブラリーTL NBおよびTL Bのポリリガンド組織化学（PHC）染色からの複合組織学的スコアを使用して、トラスツズマブベースのレジメンから利益を得る患者と利益を得ない患者との間を区別するための受信者動作特性曲線（ROC: receiver operating characteristic）を示し、HER2+症例群（A）およびHER2-/low症例群（B）に別々に分けて示している。これをもとに、ライブラリーがNB症例をB症例と区別する能力は、HER2の状態だけに依存するわけではない。
トラスツズマブ処置にかかわらず予後良好な患者を単に分類するだけでなく、TL-NBおよびTL-Bがトラスツズマブベースのレジメンに対する応答についての情報を明らかにしているかどうかを判定するために、本発明者らはトラスツズマブなしの白金／タキサン併用で処置された患者33人の独立したコホートからのFFPE腫瘍組織を染色した。本研究におけるすべての他の試料のように、この非トラスツズマブコホートからの試料を処置の前に捕集した。トラスツズマブの代わりに白金／タキサン併用療法を受けた試験セットと独立したHER2-症例33人に関する複合ライブラリーのAUCは、0.302であり（図17Miii、AUC=0.302で表示）、これは、TL-NBおよびTL-Bの性能が、処置レジメン中のトラスツズマブの存在に対する応答を決定する分子プロファイルに関係することを示している。そのうえ、トラスツズマブは、エストロゲン受容体（ER）ポジティブ乳癌において、実質的に有効性が低いと報告されている（23、24）が、本発明者らは、本発明者らの研究に登録されたすべての症例のER状態が、トラスツズマブベースの治療からの利益と相関関係を示さなかったことを見出した。試験集団においてトラスツズマブからの利益がホルモン状態と相関しないことを示す図17Oを参照されたい。本実施例における患者についてのER状態を表31〜32に示す。まとめると、これらのデータは、45症例の試験セットへのこれらのライブラリーの適用が、トラスツズマブ含有処置から利益を得なかった患者から、利益を得た患者を、HER2状態にかかわらず高い正確さで分類することを示している。
本発明者らは、次に、トラスツズマブベースのレジメンから180日よりも長く利益を得た一部分の患者を選択するPHCの能力を評価しようと努めた。図17Pi〜iiに、ポリリガンドプロファイリングにより層別化されたトラスツズマブ処置乳癌患者のカプラン-マイヤー曲線を示す。図17Piに、ROC曲線から点（特異度および感度=100％）までの最短距離は、試験ポジティブおよび試験ネガティブのカットオフを決定し、かつ図17MiiiにAUC=0.804で表示される線上のドットとして表わされる（感度：66.6％；特異度：86.7％）。患者が癌で死亡するか、またはトラスツズマブベースの処置が変更される時点（日）として「イベント」を定義した。利益の時間の中央値は、試験ポジティブの患者について604日（（図17Pi、上の曲線）、n=22、イベント=11）であり、試験ネガティブの患者について129日であった（（図17Pi、下の曲線）、n=23、イベント=18）。HR=0.320、95％ CI：0.146-0.703；ログランクp=0.003。短い垂直線は、処置の経過観察データがないために中断された症例に印を付けたものである。表32を参照されたい。図17Piiに、腫瘍のHER2状態により層別化されたトラスツズマブ処置乳癌患者のカプラン-マイヤー曲線を示す。HER2 IHCおよびHER2 ISHの両方の試験結果を有する患者のHER2状態を、以下の規則にしたがって決定した。1. 任意の試験がポジティブな結果を示すならばHER2ポジティブであり；さもなければ、2、任意の試験がネガティブな結果を示すならばHER2-/lowであり；さもなければ、3、両方の試験が同等の結果を示すならばNAである。利益の時間の中央値は、HER2ポジティブ症例について250日であり（（図17Pii、下の曲線、n=25、イベント=16）、HER2-/low症例について369日であった（（図17Pii、上の曲線；n=18、イベント=12）。HR=1.39、95％CI：0.62-3.13；ログランクp=0.418。したがって、結果として得られたカプラン-マイヤー曲線は、試験ネガティブの症例（図17Pi、下の曲線）よりも試験ポジティブの症例の方が有意に長いTTNTを見せたことを示している（図17Pi、上の曲線）。無イベント期間中央値、すなわち処置レジメンが変更される前に経過した時間は、試験ネガティブの症例について129日から試験ポジティブの症例について604日に増加した。比較のために、本発明者らは、IHCにより決定されたような腫瘍のHER2状態に基づき予後的価値を解析した。この場合、KM曲線は、HER2+またはHer2-/lowであった患者の間でTTNTのいかなる有意差も明らかにならなかった（図17Pii）。これらのデータは、ある特定の処置レジメンから利益を得る患者と利益を得ない患者とを区別する予測アッセイを作製するために、ポリリガンドプロファイリングを採用することができることを示している。
本実施例において、本発明者らは、プロトタイプのポリリガンドプロファイリングアプローチが、癌治療のための患者の層別化を改善する潜在性を有することを実証した。該アプローチを適用して、トラスツズマブの応答をTTNTにより分類するためにライブラリーTL-BおよびTL-NBをトレーニングした。ポリリガンドプロファイリングは、この条件に限定されるものではなく、手近な疑問および適切な試料の入手性に応じて多種多様な表現型を区別するために適用可能であろう。以前の研究は、新しいバイオマーカーを同定するために、癌組織に対するssODNライブラリーの形態ベースの富化を使用していた（本明細書の参考文献25、26を参照されたい）。本研究において、本明細書に導入されたようなライブラリートレーニングがリガンドの複合多様性を富化することは、腫瘍内および腫瘍間変動性を反映する分子組成の不均一性および複合インタラクトームを説明するために合理的である。
最適化なしで、本実施例において開発されたPHC試験は、このコホート中のトラスツズマブベースの処置から利益を得る患者を利益を得ない患者と区別する能力が、標準的なHER2のIHCよりも優れていた。図17M、Pおよび上記の関係する考察を参照されたい。これらのデータは、PHC試験が、CDx、この場合はトラスツズマブから利益を得ないであろう50〜70％のHER2+患者を同定することを目標としたCDxを提供することができることを示している。逆に、低レベルのHer2を発現する16〜45％の乳癌患者が、併用化学療法において補助的トラスツズマブから利益を得たと報告されている（27〜29）。図17M、Pに示すデータは、ポリリガンドプロファイリングに基づくCDxも、低レベルのHer2を発現している群から、トラスツズマブ含有レジメンから利益を得る患者を同定する潜在性も有することを示している。
ポリリガンドプロファイリングは、腫瘍内または腫瘍間の細胞インタラクトームを構成する極めて多様な生物学的複合体内における撹乱により反映される分子情報へのアクセスを可能にする。所与の薬物処置レジメンから利益を得る患者または利益を得ない患者を予測することに加えて、PHCアプローチは、追加の方法で精密腫瘍学を進歩させることができる。たとえば、既存の治療法および臨床試験における新しい化合物に適用されたとき、ポリリガンドプロファイリングは、無効な有毒療法の投与を減らすこともでき、それにより、新薬の成功率を上げることもできる。
すべてが全体として参照により本明細書に組み入れられる、本実施例において引用される参考文献。
Figure 2019516393
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実施例22：ポリリガンドプロファイリングの材料および方法
本実施例は、上記実施例21に使用した材料および方法を提供する。
FFPE組織例
本研究は、45 CFR 46.101(b)(4)によるWestern Institutional Review Boardの承認を得て行われた。
本研究は、組織を捕集後に、適切なやり方で固定および包埋された十分な数のスライドが利用可能であった、第1選択のトラスツズマブベースの処置を受けた侵食性乳癌の女性からの症例を含んでいた。インサイチュー癌の症例、不適切なやり方で固定されたまたは潰れた組織切片は、本試験に含めなかった。不完全な染色（すなわち、結合溶液による組織のカバーが不十分）およびアッセイ性能に関する他の技術的問題を有する例を分析から除外した。
トラスツズマブ療法から次の処置開始までの期間（TTNT）のデータを有する乳癌患者51人の連続組織切片を、ssODNライブラリーのトレーニングならびにTL-NBおよびTL-Bの試験に使用した。白金-タキサン処置からのTTNTデータを有する別の群の33症例を対照セットとして使用して、トラスツズマブベースのTTNTに向けたTL-NBおよびTL-Bの特異性を評価した。腫瘍部分および正常部分の両方を含有する切除された組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、連続切片にした（4μm）。各症例のスライド1〜2枚についてヘマトキシリン-エオシン（H&E）染色を行い、最初の病理診断に役立てた。富化前のFFPE組織スライドの前処理は、スライドを60℃で1.5時間インキュベートし、続いて自動的に脱パラフィン処理し、Ventana UltraView Autostainer（Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ）を用いてエピトープ賦活化することを含んでいた。具体的には、72℃で24分間の脱パラフィン処理、エタノールによる脱水、90℃で36分および100℃で4分（pH8）のエピトープ賦活化、続いてペルオキシダーゼ阻害（H2O2、1％≦x＜5％）および残った液体カバースリップを除去するための洗剤（Dawn 1-00; P&G Professional, The Procter & Gamble Company, Cincinnati, OH）を用いたスライド洗浄であった。富化されたライブラリーの試験のために、脱パラフィン処理を、60℃で1.5時間インキュベートすることにより手作業で行い、続いてPT-Linker（Dako, Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を用いて97℃で20分間、pH9でエピトープを賦活化した。
84症例についての処置レジメンおよび病理診断は、表29〜32に見出すことができる。非利益（NB）乳癌症例3例および利益（B）乳癌症例3例のサブセットを富化のために選択した。最初に処方されたトラスツズマブ療法を少なくとも181日間続けた患者をBと分類し；処置が180日以内に変更された患者をNBと分類した。トレーニング症例についての臨床情報は、表29〜30に見出すことができる。富化目的のために、乳癌を有する組織領域をポジティブ選択標的として利用し、一方で、隣接する非悪性組織および別の応答を有する患者からの癌組織を対抗選択標的として使用した。
ssDNAライブラリーの設計および不等長プライマー非対称PCRを用いた再生産
ランダムssDNAライブラリー（ナイーブF-TRin-35n-B 8-3sライブラリー）は、定常領域に隣接したランダムヌクレオチド35個を含有する。具体的には、ナイーブライブラリーは、5'領域
Figure 2019516393
に続き、ヌクレオチド35個のランダムなナイーブオリゴヌクレオチド配列および3'領域
Figure 2019516393
を含む。このライブラリーをIntegrated DNA Technologies（IDT, Coralville, Iowa, USA）で合成し、等モル量としてプールし、PCR増幅して5'末端にビオチンを付加した。ライブラリーの定常領域は、プライマー：
Figure 2019516393
と相補的であり、これらのプライマーを非対称PCRに使用して、大部分の標的鎖を生成させた。フォワードプライマーの内側スペーサーiSp9（内側トリエチレングリコールスペーサー、IDT）は、相補鎖の伸長を防止し、一方で、ポリA尾部の付加は、より長いフォワード鎖長を招き、4％変性アガロースEゲルからのサイズ分離およびゲル抽出カラム（Nucleospin, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Dueren, DE）による最終精製を用いたゲル切除後の標的鎖ssDNAの回収を可能にした。ビオチン化アンチセンスライブラリーを富化のために使用した。非対称PCR混合物（100μl）は、5×Q5 PCRバッファ、0.2mM dNTP、0.08μM フォワードプライマー、30μM リバースプライマー、0.01pmol テンプレート（純粋なライブラリーの）またはライブラリー／組織を含有する解剖後の溶液57μl（富化後）およびQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Ipswich, MA）2Uを含有していた。PCRプログラムは、最初の変性98℃で30秒に続いて、変性、アニーリング（60℃、30秒）および伸長（72℃、3分）のサイクルを含み、最終の伸長は、72℃で5分であった。純粋なライブラリーについて15サイクルの増幅を行い、富化の間のライブラリーについて、サイクル数は、回収率に応じて15〜30の間で変動する。非対称PCR産物を変性バッファ（180mM NaOH、6mM EDTA）と混合し、70℃で10分間加熱し、氷上で3分間冷却し、約20μlを4％ アガロースSYBRGoldゲル（E-GEL EX Gels, G401004, Life Technologies）にロードし、15分間分離した。一本鎖リバース鎖を切断し、ゲル片をNTCバッファ（Nucleospin, Macherey-Nagel）と混ぜ、すべての片が融解するまで50℃で5〜10分間融解させた。融解したアガロース700μlをNucleospinカラムにロードし、次にssDNA精製のための標準手技にしたがった。精製DNAをNEバッファ30μlで溶離させた。
FFPE組織スライドベースのSELEX法
トラスツズマブ応答に向けたssODNライブラリーの富化を、図17Cのスキームにしたがって行った。富化症例についての処置レジメンを表29〜30に見出すことができる。各ライブラリーの富化において、最初の3ラウンドはポジティブ症例のみに対して行い、続いて追加の3ラウンドを、二つの対抗選択症例および一つのポジティブ症例で行った。ポジティブ選択のために、Agilentガスケットスライド（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）の上部で、ブロッキングバッファ400μl（1×PBS中に0.8ng/ul サケDNA（Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA）、0.8ng/μl tRNA（Life Technologies）、1μg/μl HSA（Sigma）、0.5％ F127（Thermo Fisher）および3mM MgCl2）をssODNライブラリー溶液90μl（ラウンド1について1×PBS、3mM MgCl2中に7pmol、その後のラウンドについて3.5pmol）と混合した。脱パラフィン処理およびエピトープ賦活化後のFFPE組織スライドを、結合カクテルを含有するガスケットスライドの上部にマウントし、Agilentマイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバー中で回転させながら室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、二つの750ml洗浄バッファ（1×PBS、3mM MgCl2）中に、容器毎に3回ずつ浸漬することによりスライドを洗浄した。次に、3mM MgCl2を補充したヌクレアファストレッド（NFR）490μlをスライドに45秒間加え、洗浄バッファ750ml中に6回浸漬することにより洗浄した。対応するH&Eスライドからの最初の病理診断に基づき、癌の領域を解剖し、水180μl中に移し、不等長プライマーを用いた非対称PCR用のテンプレートとしてこれを役立てて、次のラウンドのための一本鎖ライブラリーを生成させた（上記のプロトコル参照）。残りの正常組織は、内部対抗選択のために役立てた。このプロトコルを3ラウンド繰り返した。ネガティブ選択のために、結合カクテルを対抗選択スライドの組織に直接加え、加湿チャンバー内で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、最大体積の上清を捕集した。追加的に、ブロッキングバッファ50μlを適用して、未結合のssODNを捕集した。合わせた上清を第2の対抗選択スライドに加え、1時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を前と同じ方法で捕集し、さらに1時間インキュベーションするためにポジティブ症例からのスライドに適用し、今度はインキュベーションをAgilentマイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバー中で行った。後続の工程、洗浄、染色およびPCRは、上記と同様であった。
富化されたライブラリーのポリリガンド-組織化学（PHC）スクリーニング
富化されたライブラリーを用いたFFPE組織スライドの染色をDako自動染色装置により行った。スライドを60℃で1.5時間加熱乾燥（bake）した後、Dako PT-Linkerを用いてpH9において98℃で22分間エピトープ賦活化を行った。Dako自動染色装置による染色は、オルトリン酸水素二ナトリウム 5％≦x＜7％、H2O2 3％≦x＜5％、リン酸一ナトリウム塩一水和物 1％≦x＜2％を含有する溶液450μlを用いたペルオキシダーゼ阻害5分、結合カクテル（富化されたライブラリー3.5pmol、0.65ng/μl サケDNA、0.65ng/μl tRNA、10％ BlockAid（Life Technologies）450ulと一緒のインキュベーション1時間、3mM MgCl2を補充したストレプトアビジンポリHRP 450μlと一緒のインキュベーション30分、3mM MgCl2を補充したDAB溶液を用いた染色10分、続いてヘマトキシリン450μl（終濃度2ng/μl）と一緒のインキュベーション5分を含む。各工程の間で1×PBS、3mM MgCl2バッファを用いたすすぎを行った。最終的に、染色されたスライドをエタノール、キシレンで脱水し、長期保管用にカバースリップで覆った。Olympus BX41（Olympus Corporation of the Americas, Center Valley, PA, USA）で顕微鏡観察を行った。
強度レベル（1、2および3）に、この特定の強度を有する細胞のパーセンテージをかけた値の合計として、核および細胞質の両方の染色についての組織スコアを計算した。
統計解析
最初に、各単一のライブラリーがトラスツズマブ応答者および非応答者を分類する能力をROC曲線およびAUCにより評価した。たとえば、図17J〜Kを参照されたい。トラスツズマブ療法に対する患者の応答を、TL-NBおよびTL-Bの両方のライブラリーの染色からのPHCスコアを使用した多変量法により予測するために、ロジスティック回帰モデルを開発した。具体的には、応答者／非応答者の2成分の転帰を応答変数として使用し、ライブラリーTL-NBおよびTL-Bの染色スコアを独立変数として処理した（図17J（C）、AUC=0.804と表示した実線）。データセットをランダムに10個の等しい部分のみに分割した10分割交差検証を行って、モデルの予測性能の汎化能力（generalizability）を評価した。ロジスティック回帰モデルを九つの部分で構築し、続いて一つの保留部分で検定した。このプロセスを10個の部分にわたり繰り返し、予測された確率だけをさらなる評価のために収集した（図17J（C）、AUC=0.760と表示した破線）。
次の処置開始までの期間（TTNT）の終点を次の非トラスツズマブ処置または死亡のいずれかの時間と定義した。次の非トラスツズマブ処置または死亡の情報のない患者を、最終接触日に打ち切った（カプラン-マイヤー曲線の垂直マークを参照されたい（図17M）。独立変数として腫瘍のHER2状態またはPHC試験結果のいずれかを使用してCox-PHモデルにあてはめた。カプラン-マイヤー推定量から生存期間の中央値を計算した。ログランク検定を行って、群間でTTNT生存期間の有意性を評価した。すべての分析を、「survival」rパッケージを使用して行った。
実施例23：代替オリゴヌクレオチドプローブアッセイは、トラスツズマブベースの治療で処置された乳癌患者の転帰を分類する
背景：トラスツズマブは、高度に有効な標的化療法であるものの、HER2+乳癌を有する患者のおよそ50％は、トラスツズマブベースのレジメンから利益を得ない。本発明者らは、トラスツズマブから利益を得る可能性がある患者を分類するその能力が、伝統的なHER2試験よりも優れている、ポリリガンドアプタマーベースのアプローチを開発した。
方法：次の処置までの期間に基づきトラスツズマブベースの治療から利益を得たか（B）、または利益を得なかった（NB）、いずれかの患者のFFPE組織スライド上で、1013個のビオチン化ssDNAオリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）のライブラリーをインキュベートした。未結合のssODNを捨て、結合したssODNを、後続の2ラウンドのポジティブ選択の間に保持した。ラウンド4から開始して、部分富化されたライブラリーをネガティブ選択のために別の表現型を表す症例（Bの場合NB、およびその逆）に適用し、未結合ssODNを含有する上清を捕集して保持した。さらに2ラウンドのネガティブ選択の後に得られたライブラリーをプローブとして使用して、30人のBおよび15人のNBの独立した症例をポリリガンド組織化学法（PHC）により染色およびスコア化した。トレーニングされたライブラリーが、トラスツズマブベースの処置から利益を得た患者を分類する能力を、ROC曲線からのAUC値を計算することにより評価した。カプラン-マイヤー（KM）プロットを使用して、転帰を試験結果と比較した。
結果：二つのライブラリーは、B群およびNB群を効果的に分類した（ROCのAUCは0.8）。対照的に、標準的なHER2のIHCは、0.4というAUCをもたらした。トラスツズマブ処置の持続期間の中央値は、試験ポジティブ患者について604日であり、試験ネガティブ患者について129日であった（HR=0.320、95％ CI：0.146-0.703；ログランクp=0.003）が、これは、PHCのスコア化が、別個の臨床転帰を分類するために高度に有効であったことを示している。HER2状態単独（IHC）によると、トラスツズマブ処置期間の中央値は、HER2+例について250日であり、HER2-/low例について369日であった（HR=1.39、95％ CI： 0.62-3.13；ログランク p=0.418）。
結論：これらの結果は、ポリリガンドプロファイリングが、トラスツズマブのような標的化療法から利益を得る可能性が高いまたは低い患者を同定するために使用することができる予測アッセイを作製するための、高性能のシステム生物学的アプローチを提供することを示している。
実施例24：結腸直腸癌と診断され、フォルフォックスおよびベバシズマブで処置された個体由来のFFPE組織に対するアプタマーの選択
ベバシズマブは、血管内皮成長因子A（VEGF-A）を阻害することにより血管新生を遮断する組み換えヒト化モノクローナル抗体である。VEGF-Aは、多様な疾患、特に癌において血管新生を刺激する化学シグナルである。アバスチンの商品名で販売されているベバシズマブは、標準的な化学療法処置との併用時の転移性結腸直腸癌（CRC）における使用のために（第1選択処置として）、および第2選択転移性結腸癌用5-フルオロウラシルベース療法との併用のために、2004年2月にFDAにより承認された。フォルフォックスは、三つの薬物：1）FOL - フォリン酸（ロイコボリン）；2）F - フルオロウラシル（5-FU）；および3）OX - オキサリプラチン（エロキサチン）から構成される、結腸直腸癌の処置のための化学療法レジメンである。フォルフォックスおよびベバシズマブは、転移性CRCのための第1選択処置として使用され得る。
現在、癌療法における処置としてのベバシズマブとの併用におけるフォルフォックスの有効性を予測する、よい方法はない。本実施例の目標は、結腸直腸癌と診断された個体におけるフォルフォックス／ベバシズマブを用いた併用療法に対する応答を予測するアッセイに使用することができるオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの開発であった。採用されるアプローチは、上記の実施例19〜20と類似である。簡潔には、オリゴヌクレオチドプローブの選択をFFPE CRC組織試料に対して行った。患者がフォルフォックスを継続した期間（TNT；次の処置までの期間）に基づき、患者を二つのコホート、すなわち応答者および非応答者に分けた。非応答者は、フォルフォックスを最大124日間継続し、一方で、応答者は、この処置を少なくとも241日間受けていた。ベバシズマブ処置は、患者毎に変動した。ベバシズマブ処置は、フォルフォックスと同時もしくその後に開始した場合もあろうし、またフォルフォックスと同時、その前もしくは後に終了した場合もあろう。富化スキームの概要を図18Aに示し、ポジティブ選択工程およびネガティブ選択工程をそれぞれ図18Bおよび図18Cに図示する。
応答者について七つの富化物および非応答者について四つの富化物の6ラウンドのポジティブ選択を行い、富化されたオリゴヌクレオチドプローブの11個のプールを創出した。応答者症例について非応答者試料に対する対抗選択を行い、逆も行った。スライドの例示的なセットを図18D〜Eに示し、図に、H&Eで染色した（図18D）またはプローブライブラリーMで染色した（図18E）富化物「M」におけるポジティブ選択のために使用したFFPE試料の染色を示す。図に、癌組織；腫瘍部位：結腸；標本：結腸についての染色を示す。スライドを倍率20×で示す。表37に、表示のプローブライブラリーを用いた表示の組織試料の染色強度の結果を示す。
（表３７）富化されたオリゴヌクレオチドプローブ
Figure 2019516393
富化されたライブラリーを試験するために、富化物の一部ではなかった非応答者症例1例および応答者症例5例を全部で11個のライブラリーで染色した。加えて、ポジティブ選択のために使用した症例を、対応するライブラリーで染色した。一つの試験試料である試料2の染色についての例示的な結果を図18F〜Gに示す。試料の特徴は、応答者；腫瘍部位：下行結腸；標本：下行結腸を含む。図18Fに、試料2のスライドからの癌試料の染色を示す。ライブラリー（A〜M）を、各スライドにわたり図示する。示すように、スライドH〜Mに他のスライドと比較してわずかに色の濃い染色が観察された。図18Gに、試料2のスライドからの非癌組織の染色を示す。この設定で染色は、すべての試料にわたり、より色が薄く、類似の強度であった。
ベバシズマブに対する応答者であると考えられる個体由来の腫瘍組織を含む固定試料に対して、他のセットの富化実験を行った。ポジティブ選択のために、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーをスライド上の組織全体に結合させたが、癌組織だけをスライドから掻き取り、次に、掻き取った組織からライブラリーを回収し、増幅させた。3回のそのようなラウンドの後、ネガティブ選択の2工程の3ラウンド（アバスチンに応答性でない個体2人からの組織）および前と同様の1回のポジティブ選択を行った。ラウンド7は、もう一つのポジティブ選択を含んでいた。ラウンド8について、富化戦略を変更した。スライドに固定した組織の富化を行う代わりに、癌組織および非癌組織を掻き取り、異なる管に分けた。管の中で富化を行うために、本発明者らは、未結合のライブラリーから組織を分離するために100,000×gでの遠心分離を使用した。掻き取った非癌組織に対する対抗選択と共に、掻き取った癌組織に対して4ラウンドの富化を行った。12ラウンド後のライブラリーを、プロービングのため、および非癌組織と比べて癌により強く結合したアプタマーの選択のために使用した。富化から回収された四つの配列を表38に示す。表に、可変領域を挟む
Figure 2019516393
を有する完全長配列と一緒に、同定された配列の可変領域を示す。これらの配列を使用して、ベバシズマブに対する応答者からの癌組織を、たとえば染色により同定することができる。表中、「RC」を含む名称の配列は、非結合対照として使用した逆相補鎖配列である。
（表３８）ベバシズマブ応答者の癌組織と結合するオリゴヌクレオチドプローブ
Figure 2019516393
上記のラウンド9の後に追加の配列を決定した。応答者の癌由来の組織（すなわち、応答者患者由来の癌組織）、応答者の非癌由来の組織（すなわち、応答者患者由来の非癌組織）、非応答者の癌（すなわち、非応答者患者由来の癌組織）および非応答者の非癌由来の組織（すなわち、非応答者患者由来の非癌組織）を掻き取り、結合したオリゴヌクレオチドを配列決定した。非応答者の癌と他の組織との間の変化倍率を、配列決定からの読み出しカウントを組織サイズに対して標準化後に計算した。表39に、表示のようにその他の三つの組織型と比べた非応答者の癌の変化倍率を示す。表に、同定された配列の可変領域を示す。全長配列は、可変領域を挟む
Figure 2019516393
を含んでいた。任意の適切な隣接配列を使用することができる。表40に、表39における最初の六つの可変領域についての完全配列を、隣接領域を有する完全配列と一緒に示す。これらの配列を使用して、ベバシズマブに対する応答者由来の癌組織を、たとえば染色により、同定することができる。一つの比較で少なくとも100％の変化倍率を有する追加の配列の可変領域をSEQ ID NO 203114〜206478に記載する。表40に、「RC」を含む名称の配列は逆相補鎖配列であり、これを非結合対照として使用することができる。表40に、ジゴキシゲニン（DIG）標識された配列をさらに示す。高い親和性および特異性を有する抗ジゴキシゲニン抗体を、多様な生物学的イムノアッセイに使用して、たとえば、本明細書記載のオリゴヌクレオチド染色を視覚化することができる。任意の他のそのような有用な標識システムに加えて、ビオチン標識およびジゴキシゲニン標識の両方をそのような適用に使用することができる。表39における配列の任意の所望の数または組み合わせを使用して、表40のようなオリゴヌクレオチドプローブを創出することができる。
（表３９）配列およびベバシズマブ非応答者と応答者との間の変化倍率の差
Figure 2019516393
（表４０）ベバシズマブ応答者の癌組織と結合するオリゴヌクレオチドプローブ
Figure 2019516393
実施例25：バックグラウンドの最適化および自動化
本実施例において、本発明者らは、上記の実施例に記載された実験と同様に、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いた固定組織の染色を最適化した。たとえば、そのような最適化を行って、ポリリガンド組織化学（PHC）を使用した場合の富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いた非特異的バックグラウンド染色を減少させた。ある特定の条件が、非特異的バックグラウンド染色に対処することが見出された。染色プロトコルへのある特定の変更を表41に示す。「新」および「新+」改訂プロトコルは、Ventana Discoveryプラットフォームを使用して最適化および自動化されたものである。表中、BAは、BlockAidブロッキング溶液（Thermo Fisher Scientific）を表し、PBSは、リン酸緩衝食塩水を表す。表から分かるように、ブロッキング条件は、新および新+プロトコルよりもストリンジェントである。
（表４１）バックグラウンドの最適化条件
Figure 2019516393
完成したプロトコルは、以下のとおりである。様々な組織を染色する例が、それに続く。試薬を表42に示す。機器は、Ventana Discovery自動染色装置である。
（表４２）原材料
Figure 2019516393
試薬の調製
工程1：エピトープ賦活化の直前にすべてのスライドを透過処理する。1×PBS中0.1％ トリトンX100の中にスライドを完全に浸漬し、室温（RT）で10分間インキュベートする。
工程2：スライドを1×PBS 750mL中に10回くぐらせて洗浄する（1リットルのコプリンジャー）。
工程3：競合物質／ブロック／アプタマーライブラリーのカクテルを調製する。表43に、SA-ポリHRPカクテルを示す。SA-ポリHRPは、ストレプトアビジンポリHRPコンジュゲートを表し、これは、IHCおよび他の方法のためのシグナル増幅およびビオチン化結合剤（たとえば抗体またはアプタマー）の検出を可能にするホースラディッシュペルオキシダーゼのポリマーとコンジュゲートしたビオチン結合タンパク質である。
（表４３）SA-ポリHRPカクテル
Figure 2019516393
表44に示す競合物質／ブロックマスターミックスの添加前に、ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブライブラリーをMgCl2と混合する。
（表４４）ブロック／アプタマーマスターミックス
Figure 2019516393
染色
工程4：Ventana Discovery自動染色装置を用いたアプト組織化学（Aptohistochemistry）
脱パラフィン処理およびエピトープ賦活化
すべてのスライド：対応するブロック／アプタマー溶液150μlを適用し（表44）、室温で1時間インキュベートする（泳動バッファ300μlが自動的に添加される）
すべてのスライド：SA-HRP +MgCl2 + 19％ BA SA-ポリHRPカクテル100μlを適用する（表43）
DABバッファを適用する
ヘマトキシリンを適用する
染色後
工程5：液体カバースリップを流し去り、紙タオルを使用してガラスの角から残りのオイルを吸い取る。
工程6：標準的なカバースリップ配置。
工程7：スライド染色をスコア化する。
組織染色
上記プロトコルを使用して、卵巣、乳房、膵臓、膀胱、黒色腫、頭頸部、腎臓、非小細胞肺癌（NSCLC）、神経膠芽腫（GBM）、肝細胞癌（HCC）および結腸起源からの腫瘍試料を含む、様々な解剖学的場所からの固定された組織を染色した。使用したオリゴヌクレオチドプローブライブラリーは、実施例19で富化されたHER2+乳房組織からのR6ライブラリーであった。富化されていないライブラリー（R0）を対照として使用した。したがって、プローブライブラリーを各組織について最適化したわけでないが、それでもなお、プローブライブラリーは、図19A〜Kに示すように様々な組織において同定可能な染色を提供した。図に、本来のプロトコルおよび本実施例に提示した最適化プロトコルを用いたH&E染色スライドを示す。図19Aに、卵巣癌試料についての結果を示す。本来のプロトコルで、すべての試料の最も濃い染色が観察されたが、いかなるオリゴヌクレオチドプローブも非存在であったライブラリーなしの試料で同定可能な褐色の染色が観察された。最適化されたライブラリーを用いたとき、染色は、R6で最も明瞭であり、ライブラリーなしの試料で褐色の染色は観察されなかった。理論によって拘束されることなく、プローブライブラリーの非存在下で本来のプロトコルを用いて観察された染色は、SA-HRPの非特異的結合に由来する、または一部の例では内因性ビオチンのせいであり得る。質的に類似の結果が、乳癌組織（図19B）、膵臓癌組織（図19C）、膀胱癌組織（図19D）、黒色腫組織（図19E）、頭頸部癌組織（図19F）、腎臓癌の癌組織（図19G）、NSCLC組織（図19H）、GBM組織（図19I）、HCC組織（図19J）、および結腸癌組織（図19K）で観察された。黒色腫およびGBM組織に関して、最適化されたライブラリーなしの試料でわずかな染色が観察されたが、それにもかかわらず、この染色は、本来のライブラリーなしの試料と比較して著しく減少していた。NCSLC組織および結腸組織に関して、どちらの条件セットでも染色は、ライブラリーなしの試料においてほとんど観察されなかった。
実施例26：TUBB3+膵臓癌組織に対するオリゴヌクレオチドプローブの富化
本実施例において、本発明者らは、上記実施例（たとえば、実施例21〜22および25を参照されたい）で開発されたFFPE組織富化プロトコルを使用して、TUBB3+膵臓癌組織試料に対してナイーブオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを富化した。
ランダムssDNAライブラリー（ナイーブF-TRin-35n-B 8-3sライブラリー）は、定常領域に隣接する35個のランダムヌクレオチドを含む。具体的には、ナイーブライブラリーは、5'領域
Figure 2019516393
、それに続くヌクレオチド35個のランダムなナイーブオリゴヌクレオチド配列および3'領域
Figure 2019516393
を含む。試料は、従来のIHCにより確認されたTUBB3状態を有する膵臓FFPE組織試料であった。7ラウンドの富化を行った。本発明者らは、最初に、実施例25からの全プロトコルを用いて富化を行ったが、富化は観察されなかった。理論によって拘束されることなく、実施例25における最適化されたプロトコルは、富化ではなくプロービングのために最適化されたので、ストリンジェントすぎる可能性がある。したがって、最適化されたプロトコルを、図20Aに示される富化プロセスのために適応させた。本スキームにおいて、P→P→P→（N→P）→（N→P）→（N→P）→P（ここで、「P」（図20Aの「Pos」）は、TUBB3+試料に対するポジティブ選択を表し、「N」（図20Aの「Neg」）は、TUBB3-試料に対するネガティブ選択を表す）の順序で富化を行った。図20Aに示す条件を使用して初期ラウンドに低ストリンジェンシーで富化を行った。たとえば、図に、洗剤（トリトンX100）およびブロッキング剤（BlockAid）の濃度が富化の後期ラウンドで増加されたことを示す。図にさらに示されるように、実施例25記載の染色は、富化プロセスを観察するために富化の後期ラウンド後に行った。例を図20Bに示すが、図20Bでは、ネガティブ試料と比較してポジティブ試料でずっとより高いレベルの褐色染色が観察される。
7ラウンドの富化の後の最終的な富化されたライブラリーを、TUBB3-R7ライブラリーと呼ぶ。TUBB3-R7ライブラリーを使用して、富化プロセスに使用しなかった（すなわち、非富化症例の）九つのTUBB3+および九つのTUBB3-膵臓癌組織スライドをプロービングした。盲検化された病理学者が染色強度を判定した。全体的なスライド染色および核染色の両方について染色強度に基づきHスコア（すなわち、[1×(1+の細胞％)+2×(2+の細胞％)+3×(3+の細胞％)]）を計算した。表示の試料群（すなわち、TUBB3+またはTUBB3-）について総（i）Hスコアまたは核（ii）Hスコアをプロットした結果を図20Cに示す。群間差についてのp値を各プロットの下に表示する。図20Dに示すように、Hスコアを使用して、ROCプロットも作製し、ROCのAUC値を計算した。この図に、総（i）ROC曲線または核（ii）ROC曲線についてのプロットを提供する。総（i）についてのAUC値は0.843であり、核（ii）についてのAUC値は、0.889であった。したがって、両方の場合で、TUBB3-R7ライブラリーは、TUBB3+およびTUBB3-膵臓癌組織標本の同定に非常に高い性能を有した。
実施例19において、本発明者らは、HER2+およびHER2-乳癌試料を識別することができたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを提示した。同様に、本実施例において、本発明者らは、TUBB3+およびTUBB3-膵臓癌試料を識別することができるオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを開発した。
実施例27：卵巣癌における白金／タキサン処置についてのTTNT
本実施例において、本発明者らは、実施例26と同様にFFPE組織富化プロトコルを使用して、白金／タキサン処置に対する応答者または非応答者とみなされた卵巣癌組織試料に対してナイーブオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを富化した。応答者（利益）／非応答者（非利益）状態を、実施例20〜22に記載したように、無投薬期間（DFI）としても知られている白金／タキサン処置後の次治療開始までの期間（TTNT）を使用して決定した。この実施例について、非応答者は、DFI＜6ヶ月の患者であり、応答者はDFI＞6ヶ月の患者であった。
方法論は、実施例26に類似であったが、本実施例に記載する改変を行った。富化プロセスの概要を図21Aに示す。P→P→P→（2N*→P）→（2N*→P）→（2N*→P、［ここで、「P」（図21Aの「Pos」）は、応答者組織試料に対するポジティブ選択を表し、「N」（図21Aの「Neg」）は、非応答者組織試料に対するネガティブ選択を表し、*は、二つのネガティブスライドが平行して使用され、上清がプールされ、PCRの前にプローブがストレプトアビジンビーズを用いて精製されたことを示す］の順で富化を行った。ポジティブ選択が非応答者の組織試料に対するものであり、かつネガティブ選択が応答者の組織試料に対するものである、逆のプロセスも行った。実施例26と同様に、富化の後期ラウンドに、よりストリンジェントな条件を使用した。富化条件については図21Aを参照されたい。図21Bに、表示のように、非応答者に向けてトレーニングされた三つのライブラリーおよび応答者に向けてトレーニングされた三つのライブラリーである、六つの富化されたライブラリーを用いた染色の例を示す。図21Bにおけるライブラリーは、予想される染色パターンをポジティブ富化症例（この場合は応答者）においてより濃い染色で示した。このライブラリーは、上記の白金／タキサン処置から利益を得る／応答するまたは利益を得ない／応答しない非富化卵巣癌試料をプロービングするために使用されるであろう。
実施例28：組織試料へのオリゴヌクレオチドプローブの結合の検出
上記の実施例と類似のプロトコルを使用して、FFPE腎臓組織スライドに対してナイーブF-TRin-35n-B 8-3sライブラリーを富化した。6ラウンドの富化後のビオチン化ライブラリーを使用して、実施例25と類似の固定された腎臓組織をプロービングした。対照として、富化されていないビオチン化F-TRin-35n-B 8-3sライブラリーでもスライドをプロービングした。ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（SA-HRP）（Life Technologies, cat# 11207733910）を使用して、オリゴヌクレオチドプローブの結合を上記のように視覚化した。ストリンジェントなプロービング条件にもかかわらず、富化されていないライブラリー対照で、著しいレベルのバックグラウンド染色が見られた。本実施例において、本発明者らは、代替染色プロトコルを使用して、腎臓試料へのオリゴヌクレオチドプローブの結合を視覚化した。
理論によって拘束されることなく、本発明者らは、試料へのSA-HRPの非特異的結合が原因の可能性があるかどうかを調査し、代替的な視覚化方法を開発した。ビオチン-アビジン／ストレプトアビジン生物学的アッセイは、周知の方法および試薬のように多数の望ましい特徴を有し、強力で特異的なビオチン-アビジン結合のせいで抗体を必要とせず、ストレプトアビジンビーズは、プルダウン実験／免疫沈降のために利用可能である。しかし、一部の例では、組織中の内因性ビオチンが、問題のあるバックグラウンド結合につながる可能性もある。本実施例において、本発明者らは、抗ジゴキシゲニン（DIG）-HRP抗体検出を用いてDIG修飾オリゴヌクレオチドライブラリーを試験した。ビオチンとは異なり、ジゴキシゲニンは、ある特定の植物の花および葉だけに見出されるステロイドである。
図22Aに、表示のDIG修飾オリゴヌクレオチドライブラリーおよび抗DIG-HRP抗体の検出を使用した腎臓FFPEスライドの染色を示す。図22Aiにライブラリーなしの対照を示し、図22Aiiに、富化されていない（R0）ライブラリー5ngを用いた染色を示し、図22Aiiiに、ラウンド（R6）のライブラリー5ngを用いた染色を示し、図22Aivに、富化されていない（R0）ライブラリー50ngを用いた染色を示し、図22Avに、ラウンド6（R6）のライブラリー50ngを用いた染色を示す。すべての画像を倍率20×で取得した。図中、ライブラリーなしの対照（図22Ai）およびR0試料5ng（図22Aii）で褐色の染色は観察されなかった。R0試料50ngでわずかな染色だけが観察された（図22Aiv）。R6試料5ngでより濃い染色が観察され（図22Aiii）、R6ライブラリー50ngを使用したときに強い染色が観察された（図22Av）。これらのデータは、DIG修飾オリゴヌクレオチドライブラリーが、本研究に使用した固定腎臓組織試料からビオチン修飾オリゴヌクレオチドライブラリーを用いて観察されたバックグラウンド染色を除去するのに有効であったことを示している。
本発明者らは、富化の間のインキュベーション時間が富化プロセスに影響するかどうかも検討した。富化の間のライブラリーのインキュベーション時間が30分、1時間、2時間、および3時間で変動した4種の異なる富化を、腎臓組織に対して行った。次に、本発明者らは、各インキュベーション条件で6ラウンドの富化からのライブラリー50ngを用いて抗DIG染色を行った。本発明者らは、インキュベーション時間が染色強度と相関したことを見出し、インキュベーション時間が長ければ長いほど染色がより強くなることを見出した。インキュベーション時間30分（図22Bi）、1時間（図22Bii）、2時間（図22Biii）、および3時間（図22Biv）での6ラウンドの富化からのスライドを示す図22Bを参照されたい。
実施例29：FFPE組織溶解物に対するスライド上でのオリゴヌクレオチドプローブの富化
上記実施例19〜28の実験のようなある特定の場合では、腫瘍試料を含むパラフィンブロック、またはそのようなブロックからの切片を含む複数のスライドが利用可能である。そのような場合、腫瘍からの複数の切片を非限定的に含む、単一の試料からの複数のスライドを、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーの富化および／またはプロービングのために使用することができる。本実施例において、本発明者らは、FFPE組織溶解物に対するスライド上のオリゴヌクレオチドプローブの富化のための方法を開発した。FFPE組織スライドからの溶解物を、富化および分析のためにニトロセルロースフィルムスライド上にアレイ化した。そのような代替的な方法は、たとえば患者または腫瘍試料あたりただ一つのFFPE組織スライドのように、利用可能な試料が限られている、ある特定の場合に有益であることが判明し得る。
方法論2300の概要を図23Aに示す。示すように、2.5μg/μl FFPE溶解物 1μlをニトロセルロースフィルムスライド（AVIDフィルムスライド + 64ウェルProPlate; Grace Bio-Labs, Bend, Oregon）上にアレイ化する（2301）。スライドを4℃で一晩（O/N）風乾する（2302）。1×PBS、3mM MgCl2 50μlを含む洗浄バッファ中でスライドを6回洗浄する（2303）。本明細書記載のナイーブF-Trinライブラリーを、1×PBS （pH7.4）、3mM MgCl2、1％ HSA、0.5％ F127、8ng/μl サケ精子DNAおよび8ng/μl酵母tRNAを含むブロッキングバッファ20μl中、様々な濃度（0.1/0.5/2.5ng）である特定のウェルに加える（2304）。ライブラリーを、フィルムスライド上で、100rpmで振盪しながら室温（RT）で1時間インキュベートする。インキュベーション後、フィルムスライドを洗浄バッファで5回洗浄する（2305）。フィルムスライドのウェルをピペットの先で掻き取り、H2O 30μlに移す（2306）。掻き取ったものから回収したオリゴヌクレオチドを、本明細書記載の非対称PCRにより増幅し、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ（ssDNA）を精製する（2307）。所望の数の富化ラウンドのために、ブロッキング溶液中の以前のラウンドの富化されたライブラリー0.1/0.5/2.5ngを、新しいフィルムスライドに加える（2308）。インキュベーション後、試料に結合したオリゴヌクレオチドプローブを回収し、ラウンド1と同様に増幅する（2309）。回収したライブラリーを、ラウンド3の後に次世代配列決定を用いて配列決定した（2310）。
ヒト対象からの、乳房、結腸、腎臓、肺および膵臓を含む様々な解剖学的起源のFFPE組織のスライドからの溶解物をアレイ化したフィルムスライド上で上記手順を行った。三つの富化ラウンド後に、上記のように「Rd3」ライブラリーを配列決定した（2310）。すべての場合で、オリゴヌクレオチドライブラリー0.1ngと共にインキュベートした試料中に最大数の配列が観察された。
乳房および膵臓のFFPE溶解物を用いて、さらなる3ラウンドの富化を上記のように行った。1セットの富化における方法論（2300）は、上記のとおりであった。乳房組織からの溶解物に対する6ラウンドのポジティブ選択から生じたライブラリーをBr_Rd6_Libと呼ぶ。次のセットの富化で、方法論（2300）は上記のとおりであったが、インキュベーションの間に競合物質である組織溶解物を添加した（2304）。ラウンド4〜6のこの工程について、本発明者らは、ブロッキングバッファ80μl中に異なる組織の富化からのRd3ライブラリー 0.1ngの0.1/0.5/2.5ngを添加した。たとえば、乳房溶解物の富化からのRd3ライブラリーを、乳房溶解物および膵臓溶解物と共に同時にインキュベートした。乳房溶解物に結合した配列を保持し、一方で、膵臓溶解物に結合した配列を廃棄した。乳房組織からの溶解物に対する6ラウンドのポジティブ選択から生じたライブラリーであって、最後の3ラウンドの富化が膵臓組織からの溶解物との競合を含んでいたライブラリーをBr_Rd6+_Libと呼ぶ。
富化後、本発明者らは、Br_Rd6_LibおよびBr_Rd6+_Libならびに出発ナイーブF-TRinライブラリー（すなわちRd0）を使用して、正常な乳房、結腸、腎臓および肺の組織スライドを染色した。スライドを、一般的に上記の実施例40のように、スライド一つあたりライブラリー50ngを使用してSA-HRPシステムを用いて染色した。本発明者らは、Rd0ナイーブ対照よりもBr_Rd6_LibおよびBr_Rd6+_Libオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを用いて乳房組織をプロービングしたときの方が高レベルの染色を認めた。代表的な結果を図23Bに示す。Rd0スライドでいくつかのバックグラウンドの染色が観察されたが（図23Bi）、Br_Rd6+_Lib（図23Bii）およびBr_Rd6_Libスライド（図23Biii）ではるかに高いレベルの染色が観察された。
上記結果により、フィルムスライドに結合したFFPE組織溶解物に対する選択を用いたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの富化が実証された。本発明者らは、さらに、富化されたアプタマーがFFPE組織スライドを染色できることを示した。たとえば、図23Bを参照されたい。このアプローチは、作業材料の量が限られている場合に有用であり、同じライブラリーを複数の標的に対して使用して競合選択を行う能力を有する。
本発明者らは、次に、正常乳房組織のスライド上染色に使用するために、Rd6_LibおよびBr_Rd6+_Libオリゴヌクレオチドプローブライブラリーからある高い存在量および高い変化倍率のオリゴヌクレオチドアプタマーを選択した。染色実験のための対照として、本発明者らは、可変領域中に相補配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。選択された配列を、5'-ビオチンを用いて合成した。各群の配列を終濃度10ng/μLでプールした。たとえば、Br_Rd6_LibおよびBr_Rd6+_Libライブラリーから選択された高い存在量の配列を有する八つのプローブを単一の管の中で組み合わせ、八つの対応する逆相補鎖オリゴヌクレオチドを別の管の中にプールした。本発明者らは、各オリゴヌクレオチドプール25ng、50ngまたは100ngを染色用組織スライドに適用した。溶解物の調製に使用したものと同じブロックからの正常乳房組織スライドを染色のために使用した。スライドを0.1％ トリトンX-100中で10分間前処理し、蒸留H2O中ですすいだ。96℃で45分間エピトープ賦活化を行った。染色プロトコルは、ストレプトアビジン-HRPシステムを用いて、上記本実施例記載のとおりである。選択された配列を表45に示す。表に同定された配列の可変領域を示す。全長配列は、可変領域を挟む
Figure 2019516393
を含んでいた。
（表４５）染色用に選択した配列
Figure 2019516393
本発明者らは、プローブの投入が大きければ大きいほど染色がより強いことを認めた。したがって、オリゴヌクレオチドプローブ100ngを用いたプロービングは、最高レベルのバックグラウンド染色をもたらしたにもかかわらず、最高レベルの染色をもたらした。代表的な結果を図23Cおよび図23Dに示す（両方とも倍率20×）。図23Cに、最大の染色強度を示す、存在量により選択された八つの配列の100ngプールを用いたプロービングの結果を示す（すなわち、表45の上から八つの配列）。図23Dに、高い変化倍率（すなわち、表45の下から八つの配列）により選択された八つの配列のプール25ngを用いたプロービングについての結果を示し、それは、より低い染色強度を示すが、ネガティブ対照で減少したバックグラウンドも示す。両方の図において、最も左の欄（i）は、これらのオリゴヌクレオチドで染色されたスライドを示し、その際、右欄（ii）は、それらの逆相補鎖を用いた染色を示す。
実施例30：掻き取られた組織に対するオリゴヌクレオチドプローブ富化
別の代替的な富化スキームとして、本実施例において本発明者らは、FFPEスライドから掻き取られた組織に対してエッペンドルフ管内でオリゴヌクレオチドプローブライブラリーの富化を行った。実施例29と同様に、本アプローチは、FFPEスライドが一つだけのように、利用可能な組織が限られている場合を非限定的に含む、ある特定のシナリオで有益な場合がある。
本発明者らは、本明細書記載のナイーブF-Trinライブラリーを用いて開始した。結腸癌組織試料にポジティブ選択を行い、同じスライドからの非癌組織に対してネガティブ選択を行った。癌および非癌組織の領域を病理学者が判定した。選択された領域をスライドから掻き取り、次に、エッペンドルフ管に入れた。癌組織に対するポジティブ選択で3ラウンドの富化を行った。癌組織に対するポジティブ選択および非癌組織に対するネガティブ選択でさらなる5ラウンドの富化を行った。これらの実験において、未結合ライブラリーの分離を超遠心分離により行った。たとえば、オリゴヌクレオチドプローブを腫瘍組織と共にインキュベートし、組織と共に共沈したオリゴヌクレオチドを超遠心分離の間に捕集することによってポジティブ選択を行った。同様に、オリゴヌクレオチドプローブを非癌組織と共にインキュベートし、次に超遠心分離後に上清を捕集することによってネガティブ選択を行った。
本発明者らは、8ラウンド後の富化されたライブラリー（「R8」ライブラリー）を使用して、富化プロセスに使用した結腸癌の4症例からの固定組織を染色した。本発明者らは、富化されていないライブラリー（「R0」）を対照として使用した。スライド一つあたりライブラリー 50ngをSA-HRPシステムと共に使用して、実施例25のようにVentana Discoveryシステムで染色を行った。本発明者らは、単一のスライドから癌領域および非癌領域の染色強度を比較した。図24Aを参照されたい。図に、R0対照ライブラリーを癌組織に対して（i）、富化されたR8ライブラリーを癌組織に対して（ii）、R0対照ライブラリーを非癌組織に対して（iii）、および富化されたR8ライブラリーを非癌組織に対して（iv）用いた染色を示す。図に示すように、富化された（ラウンド8）ライブラリーを癌組織に対して用いたときに最も強い染色が観察された。富化された（ラウンド8）ライブラリーを非癌組織に対して用いたときに最小の染色が観察された。最終的に、富化されていない（ラウンド0）ライブラリーを用いたときにいかなる組織にも染色は観察されなかった。これらの結果は、富化プロセスが、結腸癌組織を同定することができるオリゴヌクレオチドプローブライブラリーを生成させるのに有効であったことを示している。
本発明者らは、R8ライブラリーを使用して、富化プロセスに使用されなかった結腸癌の4症例からの固定組織も染色した。代表的な結果を図24Bに示す。図に、R0対照ライブラリーを癌組織に対して（i）、富化されたR8ライブラリーを癌組織に対して（ii）、R0の対照ライブラリーを非癌組織に対して（iii）、および富化されたR8ライブラリーを非癌組織に対して（iv）用いた染色を示す。図に示すように、富化された（ラウンド8）ライブラリーを癌組織に対して用いたときに最も強い染色が観察された。三つの症例について、本発明者らは、富化された（ラウンド8）ライブラリーを非癌組織に対して用いたときに染色を認めなかったのに対し、1症例はわずかな染色を示した。加えて、本発明者らは、富化されていない（ラウンド0）ライブラリーを用いたときにいかなる組織にも染色を認めなかったが、ところが、R8ライブラリーを用いたときに非癌組織にわずかな染色を示したまさにその症例が、R0ライブラリーを用いたときにも同様にわずかな染色を示した。本発明者らがこの試料セットで偽陰性を認めず、潜在的な偽陽性1例を認めたので、これらの結果は、富化されたオリゴヌクレオチドプローブライブラリーが結腸癌組織を高い正確度で見分けられることを示している。
実施例31：マイクロダイセクションを使用したオリゴヌクレオチドプローブの富化
マイクロダイセクション、レーザマイクロダイセクション（LMD）、またはレーザー介助マイクロダイセクション（LMDもしくはLAM）とも呼ばれるレーザー捕捉マイクロダイセクション（LCM）は、組織／細胞／器官の顕微鏡的領域から関心対象の特定細胞を単離するための方法である。本実施例において、本発明者らは、本明細書記載のオリゴヌクレオチドプローブの富化のために組織を抽出する方法としてLCMを使用した。本方法は、レーザーの助けを借りた顕微鏡的スケールの解剖を含む。LCM技法は、関心対象の細胞を直接採集することができる、または不要な細胞を切除して組織学的に純粋な富化された細胞集団を与えることによって特定の細胞を単離することができる。レーザーを顕微鏡と結合させ、スライド上の組織に焦点を合わせる。レーザーの動きにより、エレメントが切り出され、隣接組織から分離される。
抽出プロセスが切断プロセスに続く。そのような一方法では、粘着性表面を試料に押し付け、次にそれを剥がし取る。これは所望の領域を抽出するが、表面の粒子または望まれない組織も取り出す可能性がある。別の方法では、プラスチックメンブランを試料上で融解させ、次にそれを剥がし取る。メンブランをレーザーで加熱して試料に融解させる。本方法も、望まれないデブリを抽出する場合がある。抽出は、接触せずに起こることもできる。そのような一アプローチにおいて、試料は、レーザー圧（laser pressure）および重力（重力介助マイクロダイセクション）により運搬される。別のアプローチでは、接着剤で被覆されたキャップを組織の薄切片に直接置き、切片自体は薄いメンブラン（たとえば、ポリエチレンナフタレン）上に載せる。レーザーがキャップ上の接着剤をゆっくりと加熱し、キャップを下にある組織と融着させ、別のレーザーが組織および下にあるメンブランを切断する。メンブラン-組織実体は、その時キャップに接着しており、キャップ上の細胞を下流の適用（DNA、RNA、タンパク質の分析）に使用することができる。
FFPE試料は、通例、ガラススライドに固定される。本発明者らは、すべてのLCM法がそのような試料を用いたオリゴヌクレオチドプローブの富化に適切なわけではないことを見出した。たとえば、エピトープ賦活化の後に試料を脱水すべきでないので、エピトープ賦活化の後であるが、オリゴヌクレオチドプローブライブラリーの添加前のLCMには問題がある。標準的な熱エピトープ賦活化に転写フィルムが耐えられないならば、熱誘導エピトープ賦活化の場合にエピトープ賦活化前のLCMが問題となる可能性がある。たとえば、本発明者らは、ThermoFisher Scientific（Waltham, MA）製のCapSure（登録商標）Macro LCMキャップおよびArcturusXT Microdissection Systemを使用した試料抽出を試験し、標準的な加熱エピトープ賦活化条件（95℃）が捕捉フィルムを融解させるか破壊するかのいずれかであり得ることを見出した。
そのような問題に対処するために、本発明者らは、LCM SureCapに付着した乳房組織を75℃でエピトープ賦活化したものに対して、本明細書記載のナイーブF-Trinライブラリーを用いて開始する4ラウンドの富化を行った。本発明者らは、結果として生じたR4オリゴヌクレオチドプローブライブラリーを使用して、実施例19と同様にDakoプラットフォームを用いて固定乳房組織を染色し、ライブラリーの添加後に1〜3回の間の洗浄工程を行って、75℃または97℃でエピトープを賦活化した。75℃でのエピトープ賦活化および1回の洗浄工程（すなわち、最も低ストリンジェントな洗浄条件）で、染色は観察されなかった。97℃でのエピトープ賦活化および1回の洗浄工程は、富化されたライブラリー（R4）を用いたときに最も強い染色を生じた。これらの条件で、本発明者らは、R0ライブラリーを用いたときにわずかに弱い染色を得、DNAなしの対照で最小のバックグラウンドを得た。97℃でのエピトープ賦活化および3回のストリンジェントな洗浄工程を含む条件は、富化されたライブラリー（R4）を用いたときに最も強い染色を招き、R0ライブラリーを用いたときにわずかに弱い染色を招いた。DNAなしの対照で、1回洗浄工程よりも明らかに小さい最小のバックグラウンドが見出された。次に、本発明者らは、固定乳房組織の染色のためにDakoおよびVentanaの両方のIHCシステムを試験した。それぞれ実施例19および25を参照されたい。本発明者らは、ライブラリー中に25％ BlockAid、SA-HRP中に19％ BlockAid、0.01％ トリトン X-100を含むストリンジェントな染色プロトコルおよびライブラリーの添加後の4回の洗浄と組み合わせて、ライブラリー投入量の滴定（Dako：50ng、25ngおよび12ng；Ventana：50ngおよび25ng）を行った。Dakoシステムを使用した場合、本発明者らは、すべてのライブラリー投入量（すなわち、50ng、25ngおよび12ng）で、富化されていないR0ライブラリーよりもR4ライブラリーで強い染色を認めた。代表的な結果を図25Aに示すが、本図は、R4ライブラリー（図25Ai）またはR0対照（図25Aii）50ngを用いて染色された試料を示している。Ventanaシステムを使用したときも、本発明者らは、両方のライブラリー投入量（すなわち50ngおよび25ng）で、富化されていないR0ライブラリーよりもR4ライブラリーを用いて強い染色を認めた。代表的な結果を図25Bに示すが、図は、R4ライブラリー（図25Bi）またはR0対照（図25Bii）25ngで染色された試料を示している。これらの条件で、バックグラウンド染色は、R0対照の場合に最小であった。
これらの結果は、マイクロダイセクションされたFFPE組織試料を使用してオリゴヌクレオチドプローブライブラリーが富化されることを実証している。実施例30と同様に、このアプローチは、たとえば分析用に純粋な癌細胞を解剖することによって、より純粋な試料を提供し得る。実施例30〜31と同様に、利用可能な試料が限られている場合などの一部の条件においてアプローチが有益であることが判明する場合もある。実施例30のように、癌試料および非癌試料を単一のスライドから抽出することができる。
本明細書において本発明の好ましい態様を示し、説明してきたが、そのような態様は、例としてのみ提供されていることが当業者に明白であろう。本発明から逸脱せずに、数多くの変形、変更、および置換が、今や当業者に思い浮かぶであろう。本明細書記載の本発明の態様に代わり得る様々な態様が、本発明の実施に採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、ならびにこの特許請求の範囲およびその等価物の範囲内の方法および構造が、それにより包含されることが意図される。

Claims (138)

  1. (a）実施例19〜31のいずれか1つに記載される可変配列；
    (b）表20〜23、25、27、38〜40もしくは45のいずれか1つに記載される可変配列；または
    (c）SEQ ID NO. 1〜206506のいずれか1つに列挙された配列
    に対応する領域を含む、オリゴヌクレオチド。
  2. 請求項1記載の可変配列に対応する領域を含み、かつ、
    配列
    Figure 2019516393
    を有する5'領域、配列
    Figure 2019516393
    を有する3'領域、または両方をさらに有する、オリゴヌクレオチド。
  3. 前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である核酸配列またはその一部分を含む、オリゴヌクレオチド。
  4. 請求項3記載の異なるオリゴヌクレオチド配列を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000または少なくとも100000個含む、複数のオリゴヌクレオチド。
  5. DNA、RNA、2'-O-メチルまたはホスホロチオエート主鎖またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  6. DNA、RNA、PNA、LNA、UNAおよびそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む、前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  7. 前記オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのメンバーが、DNA、RNA、ビオチン化、非天然由来ヌクレオチド、欠失、挿入、付加および化学的修飾からなる群より選択される少なくとも1つの機能的修飾を含む、前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  8. 化学的修飾が、C18、ポリエチレングリコール（PEG）、PEG4、PEG6、PEG8、PEG12およびジゴキシゲニンの少なくとも1つを含む、請求項7記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  9. 標識されている、前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  10. ナノ粒子、リポソーム、金、磁性標識、蛍光標識、発光粒子または放射性標識に結合している、前記請求項のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチド。
  11. 複数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリーを富化する方法であって、
    （a）少なくとも1ラウンドのポジティブ選択を実施する工程であって、該ポジティブ選択が、
    （i）組織を含む少なくとも1つの試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；および
    （ii）該少なくとも1つの試料と会合した複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収すること
    を含む、工程；
    （b）任意で、少なくとも1ラウンドのネガティブ選択を実施する工程であって、該ネガティブ選択が、
    （i）組織を含む少なくとも1つのさらなる試料を複数のオリゴヌクレオチドと接触させること；および
    （ii）該少なくとも1つのさらなる試料と会合しなかった複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを回収すること
    を含む、工程；および
    （c）工程（a）（ii）および工程（b）（ii）の少なくとも1つにおいて回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを増幅し、それにより、該オリゴヌクレオチドライブラリーを富化する工程
    を含む、方法。
  12. 工程（a）（ii）において回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーが工程（a）（i）の次の繰り返しのための投入物として使用される、請求項11記載の方法。
  13. 工程（b）（ii）において回収された複数のオリゴヌクレオチドのメンバーが工程（a）（i）の次の繰り返しのための投入物として使用される、請求項11または12記載の方法。
  14. 富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーが、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017または少なくとも1018個の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 富化されていないオリゴヌクレオチドライブラリーがナイーブなF-Trinライブラリーを含む、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
  16. 少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料が固定組織を含む、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. 固定組織がホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を含む、請求項16記載の方法。
  18. FFPE組織が、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性流体および微細針吸引液（FNA）の少なくとも1つを含む、請求項17記載の方法。
  19. FFPE組織が基体上に固定される、請求項18記載の方法。
  20. 基体がガラススライドまたは膜である、請求項19記載の方法。
  21. 少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料が様々な基体上に固定される、請求項19または20記載の方法。
  22. 少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料が単一の基体上に固定される、請求項19または20記載の方法。
  23. 少なくとも1つの試料および／または少なくとも1つのさらなる試料が、溶解される、基体から掻き取られる、またはマイクロダイセクションに供される、請求項11〜22のいずれか一項記載の方法。
  24. 溶解した試料が基体上に配列され、任意で、該基体が膜を含む、請求項23記載の方法。
  25. 少なくとも1つの試料および少なくとも1つのさらなる試料が関心対象の表現型の点で異なる、請求項11〜23のいずれか一項記載の方法。
  26. 少なくとも1つの試料および少なくとも1つのさらなる試料が、同じ基体の異なる区分に由来する、請求項25記載の方法。
  27. 少なくとも1つの試料および少なくとも1つのさらなる試料が、同じ基体から掻き取られる、またはマイクロダイセクションされる、請求項26記載の方法。
  28. 表現型が、組織、解剖学的起源、医学的状態、疾患、障害またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項25〜27のいずれか一項記載の方法。
  29. 組織が、筋、上皮、結合組織および神経組織、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項28記載の方法。
  30. 解剖学的起源が、胃、肝臓、小腸、大腸、直腸、肛門、肺、鼻、気管支、腎臓、膀胱、尿道、下垂体、松果体、副腎、甲状腺、膵臓、副甲状腺、前立腺、心臓、血管、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、皮膚、舌、鼻、目、耳、歯、子宮、膣、精巣、陰茎、卵巣、乳房、乳腺、脳、脊髄、神経、骨、靭帯、腱またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項28記載の方法。
  31. オリゴヌクレオチドライブラリーの富化されたメンバーの標的を決定する工程をさらに含む、請求項11〜30のいずれか一項記載の方法。
  32. 試料中の表現型を特徴決定する方法であって、
    （a）試料を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；および
    （b）該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと該試料との間で形成された複合体の存在またはレベルを同定する工程
    を含み、該存在またはレベルを使用して表現型を特徴決定する、方法。
  33. 試料を可視化する方法であって、
    （a）試料を少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
    （b）該試料に結合しない該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドのメンバーを取り除く工程；および
    （c）該試料に結合した該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを可視化する工程
    を含み、任意で、表現型を特徴決定するために該可視化を使用する、方法。
  34. 試料が、組織試料、体液、細胞、細胞培養物、微小胞またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項32または33記載の方法。
  35. 組織試料が固定組織を含む、請求項34記載の方法。
  36. 固定組織がホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織を含む、請求項35記載の方法。
  37. FFPE試料が、固定組織、非染色スライド、骨髄コアまたはクロット、生検試料、外科試料、コア針生検材料、悪性流体および微細針吸引液（FNA）の少なくとも1つを含む、請求項36記載の方法。
  38. 同定する工程が、配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、クロマトグラフィーまたは可視化を含む、請求項32または34〜37のいずれか一項記載の方法。
  39. ハイブリダイゼーションが、試料を、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように構成されている少なくとも1つの標識されたプローブと接触させる工程を含む、請求項38記載の方法。
  40. 少なくとも1つの標識されたプローブが標識に直接的または間接的に結合する、請求項39記載の方法。
  41. 標識が蛍光、放射性または磁性標識を含む、請求項40記載の方法。
  42. 配列決定が、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの次世代配列決定である、ダイターミネーション配列決定および／またはパイロシーケンシングを含む、請求項38記載の方法。
  43. 可視化が、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドに直接的または間接的に結合したシグナルを可視化する工程を含む、請求項33または38記載の方法。
  44. シグナルが蛍光シグナルまたは酵素シグナルを含む、請求項43記載の方法。
  45. 酵素シグナルが、ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよびミクロペルオキシダーゼの少なくとも1つによって生成される、請求項44記載の方法。
  46. 可視化が光学顕微鏡検査または蛍光顕微鏡検査の使用を含む、請求項33、38または43〜45のいずれか一項記載の方法。
  47. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの標的が既知である、請求項32〜46のいずれか一項記載の方法。
  48. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの標的が未知である、請求項32〜46のいずれか一項記載の方法。
  49. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、請求項1〜10のいずれか一項記載のものである、請求項32〜48のいずれか一項記載の方法。
  50. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  51. 表現型が肺癌または前立腺癌を含む、請求項50記載の方法。
  52. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  53. 表現型が前立腺癌を含む、請求項52記載の方法。
  54. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  55. 表現型がHER2状態（+/-）を含む、請求項54記載の方法。
  56. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  57. 表現型が、抗HER2療法に対する応答を含み、任意で、該抗HER2療法がトラスツズマブを含む、請求項56記載の方法。
  58. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  59. 表現型が、FOLFOXおよびベバシズマブの少なくとも1つに対する応答を含む、請求項58記載の方法。
  60. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項32〜49のいずれか一項記載の方法。
  61. 表現型が組織起源を含み、任意で、組織が乳房、結腸、腎、肺または膵組織を含む、請求項60記載の方法。
  62. 表現型がバイオマーカー状態を含む、請求項25〜49のいずれか一項記載の方法。
  63. バイオマーカーが表4より選択される、請求項62記載の方法。
  64. バイオマーカー状態が、HER2陽性、HER2陰性、EGFR陽性、EGFR陰性、TUBB3陽性またはTUBB3陰性の少なくとも1つを含む、請求項62記載の方法。
  65. バイオマーカー状態が、ALK、AR、ER、ERCC1、Her2/Neu、MGMT、MLH1、MSH2、MSH6、PD-1、PD-L1、PD-L1（22c3）、PMS2、PR、PTEN、RRM1、TLE3、TOP2A、TOPO1、TrkA、TrkB、TrkC、TSおよびTUBB3の少なくとも1つの発現、コピー数、変異、挿入、欠失または他の変化を含む、請求項62記載の方法。
  66. バイオマーカー状態が、EGFR vIIIまたはMET Exon 14スキッピング変異の少なくとも1つの存在または非存在を含む、請求項62記載の方法。
  67. バイオマーカー状態が、ALK、BRAF、NTRK1、NTRK2、NTRK3、RET、ROS1およびRSPO3の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含む、請求項62記載の方法。
  68. バイオマーカー状態が、
    Figure 2019516393
    Figure 2019516393
    の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含む、請求項62記載の方法。
  69. バイオマーカー状態が、
    Figure 2019516393
    の少なくとも1つの発現、コピー数、融合、変異、挿入、欠失または他の変化を含む、請求項62記載の方法。
  70. 表現型が疾患または障害を含む、請求項32〜69のいずれか一項記載の方法。
  71. 特徴決定が、疾患または障害の診断、予後判定および／またはセラノーシスを含む、請求項70記載の方法。
  72. セラノーシスが、治療効能もしくはその欠如を予測すること、患者を、治療に対する応答者もしくは非応答者として分類すること、または治療効能をモニタリングすることを含む、請求項71記載の方法。
  73. 治療が、化学療法、免疫療法、標的化癌療法、モノクローナル抗体、抗HER2抗体、トラスツズマブ、抗VEGF抗体、ベバシズマブおよび／または白金／タキサン療法の少なくとも1つを含む、請求項72記載の方法。
  74. 治療が、アファチニブ、アファチニブ＋セツキシマブ、アレクチニブ、アスピリン、アテゾリズマブ、ビカルタミド、カボザンチニブ、カペシタビン、カルボプラチン、セリチニブ、セツキシマブ、シスプラチン、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ドキソルビシン、エンザルタミド、エピルビシン、エルロチニブ、エベロリムス、エキセメスタン＋エベロリムス、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ホルモン療法、イリノテカン、ラパチニブ、リポソーム化ドキソルビシン、マチニブ、マイトマイシン-c、ナブパクリタキセル、ニボルマブ、オラパリブ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パルボシクリブ併用療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペルツズマブ、スニチニブ、T-DM1、テモゾロミドドセタキセル、テムシロリムス、トポテカン、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブおよびベムラフェニブの少なくとも1つを含む、請求項72記載の方法。
  75. ホルモン療法が、タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、酢酸メゲストロール、ロイプロリド、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、アビラテロン、エンザルタミド、トリプトレリン、アバレリクスおよびデガレリクスの1つまたは複数を含む、請求項74記載の方法。
  76. 特徴決定が、存在もしくはレベルまたは目視分析を参照と比較する工程を含む、請求項32〜75のいずれか一項記載の方法。
  77. 参照が、疾患もしくは障害を有しない個体または疾患もしくは障害の異なる状態を有する個体由来の試料中で決定された存在またはレベルを含む、請求項76記載の方法。
  78. 請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの参照との比較が、試料が癌試料または非癌／正常試料を含むことを示す、請求項76または77記載の方法。
  79. 体液が、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（CSF）、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー腺液もしくは尿道球腺液、女性射精液、汗、糞便、体毛、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹膜液、心膜液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌液、粘膜分泌液、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔液、または臍帯血を含む、請求項34記載の方法。
  80. 試料が、医学的状態、疾患もしくは障害を有するとまたはその素因を有すると疑われる対象に由来する、請求項32〜79のいずれか一項記載の方法。
  81. 医学的状態、疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項28または70〜80のいずれか一項記載の方法。
  82. 癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、請求項81記載の方法。
  83. 前癌状態がバレット食道を含む、請求項81記載の方法。
  84. 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項81記載の方法。
  85. 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、請求項81記載の方法。
  86. 神経学的疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー-シャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項81記載の方法。
  87. 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項81記載の方法。
  88. 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項81記載の方法。
  89. 請求項11〜88のいずれか一項記載の方法を実施するための少なくとも1つの試薬を含む、キット。
  90. 請求項11〜88のいずれか一項記載の方法を実施するための少なくとも1つの試薬の使用。
  91. 少なくとも1つの試薬が、請求項1〜10のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項89記載のキットまたは請求項90記載の使用。
  92. 少なくとも1つの細胞または組織を、請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、および少なくとも1つの細胞または組織と接触した該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは該複数のオリゴヌクレオチドを検出する工程を含む、少なくとも1つの細胞または組織を画像化する方法。
  93. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  94. 少なくとも1つの細胞または組織が肺または前立腺細胞を含む、請求項93記載の方法。
  95. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  96. 少なくとも1つの細胞または組織が前立腺細胞を含む、請求項95記載の方法。
  97. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  98. 少なくとも1つの細胞または組織が乳房細胞を含む、請求項97記載の方法。
  99. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  100. 少なくとも1つの細胞または組織が乳房細胞を含む、請求項99記載の方法。
  101. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  102. 少なくとも1つの細胞または組織が結腸直腸細胞を含む、請求項101記載の方法。
  103. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項92記載の方法。
  104. 少なくとも1つの細胞または組織が乳房、結腸、腎、肺または膵細胞を含む、請求項103記載の方法。
  105. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが請求項5記載のものである、請求項92〜104のいずれか一項記載の方法。
  106. 検出する工程の前に、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが対象に投与される、請求項92〜105のいずれか一項記載の方法。
  107. 少なくとも1つの細胞または組織が新生物性、悪性、腫瘍、過形成または異形成細胞を含む、請求項92〜106のいずれか一項記載の方法。
  108. 少なくとも1つの細胞または組織が、リンパ腫、白血病、腎癌、肉腫、血管周囲細胞腫、黒色腫、腹部癌、胃癌、結腸癌、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌または非小細胞肺癌細胞の少なくとも1つを含む、請求項92〜107のいずれか一項記載の方法。
  109. 少なくとも1つの細胞または組織が医学的状態、疾患または障害を含む、請求項92〜107のいずれか一項記載の方法。
  110. 治療有効量の、請求項1〜10のいずれか一項記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはその塩を含む構築物と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または両方とを含む、薬学的組成物。
  111. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、表28に列挙された1つまたは複数のタンパク質と会合する、請求項110記載の薬学的組成物。
  112. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2922〜2926、2929〜2947および2950〜2952の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  113. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 2953〜2961および2971〜2979の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  114. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3039〜3061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  115. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 3062〜103061および103062〜203061の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、150,000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  116. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 203064〜203067および203076〜206478の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  117. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO. 206491〜206506の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15個またはすべてのオリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99または100％相同である配列またはその一部分を有する核酸を含む、請求項110記載の薬学的組成物。
  118. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドが毒素または化学療法剤に結合している、請求項110〜117のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  119. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドがマルチパータイト構築物内に含まれる、請求項110〜117のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  120. 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドがリポソームまたはナノ粒子に結合している、請求項110〜117のいずれか一項記載の薬学的組成物。
  121. リポソームまたはナノ粒子が毒素または化学療法剤を含む、請求項120記載の薬学的組成物。
  122. その必要がある対象における医学的状態、疾患または障害を治療するまたは寛解させる方法であって、請求項110〜121のいずれか一項記載の薬学的組成物を該対象に投与する工程を含む方法。
  123. 請求項110〜121のいずれか一項記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、対象において細胞傷害性を誘導する方法。
  124. 投与する工程が、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、局所投与またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも1つを含む、請求項122または123記載の方法。
  125. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が肺癌または前立腺癌を含む、請求項111に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  126. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が前立腺癌を含む、請求項113に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  127. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が乳癌を含む、請求項114に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  128. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が乳癌を含む、請求項115に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  129. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が結腸直腸癌を含む、請求項116に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  130. 疾患または障害が癌を含み、任意で、該癌が乳房、結腸、腎臓、肺または膵臓の癌を含む、請求項117に従属する請求項122〜124のいずれか一項記載の方法。
  131. 医学的状態、疾患または障害が、癌、前癌状態、炎症性疾患、免疫疾患、自己免疫疾患もしくは障害、心血管疾患もしくは障害、神経学的疾患もしくは障害、感染症、または疼痛を含む、請求項109または122記載の方法。
  132. 癌が、急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；AIDS関連癌；AIDS関連リンパ腫；肛門癌；虫垂癌；星状細胞腫；非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；基底細胞癌；膀胱癌；脳幹神経膠腫；脳腫瘍（脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮種、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および松果体芽腫を含む）；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；原発不明癌；カルチノイド腫瘍；原発不明癌腫；中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；子宮頸癌；小児癌；脊索腫；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚T細胞リンパ腫；内分泌膵島細胞腫瘍；子宮内膜癌；上衣芽腫；上衣腫；食道癌；鼻腔神経芽細胞腫；ユーイング肉腫；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；胆嚢癌；胃癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質細胞腫瘍；消化管間質腫瘍（GIST）；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；毛様細胞性白血病；頭頸部癌；心臓癌；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；眼内黒色腫；膵島腫瘍；カポジ肉腫；腎臓癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；口唇癌；肝臓癌；肺癌；悪性線維性組織球腫；骨癌；髄芽腫；髄上皮種；黒色腫；メルケル細胞癌；メルケル細胞皮膚癌；中皮腫；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔癌；多発性内分泌腫瘍症候群；多発性骨髄腫；多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非黒色腫皮膚癌；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌；口腔咽頭癌；骨肉腫；その他の脳および脊髄の腫瘍；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；乳頭腫症；副鼻腔癌；副甲状腺癌；骨盤癌；陰茎癌；咽頭癌；中間型松果体実質腫瘍；松果体芽腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性肝細胞肝癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞癌；気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；セザリー症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌；頸部扁平上皮癌；胃癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；T細胞リンパ腫；精巣癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌；移行上皮癌；腎盂尿管移行上皮癌；絨毛性腫瘍；尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍を含む、請求項131記載の方法。
  133. 前癌状態がバレット食道を含む、請求項131記載の方法。
  134. 自己免疫疾患が、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、骨盤炎症、血管炎、乾癬、糖尿病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、全身性エリテマトーデス（SLE）、橋本甲状腺炎、グレーヴズ病、強直性脊椎炎 シェーグレン病、CREST症候群、強皮症、リウマチ性疾患、臓器拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、または敗血症を含む、請求項131記載の方法。
  135. 心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、うっ血性心不全、不安定プラーク、脳卒中、虚血、高血圧症、狭窄症、血管閉塞、または血栓性事象を含む、請求項131記載の方法。
  136. 神経学的疾患が、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病（AD）、統合失調症、双極性障害、うつ病、自閉症、プリオン病、ピック病、認知症、ハンチントン病（HD）、ダウン症候群、脳血管疾患、ラズムッセン脳炎、ウイルス性髄膜炎、神経精神全身性エリテマトーデス（NPSLE）、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラーシャインカー病、伝染性海綿状脳症、虚血再灌流傷害（例えば脳卒中）、脳損傷、微生物感染、または慢性疲労症候群を含む、請求項131記載の方法。
  137. 疼痛が、線維筋痛症、慢性神経因性疼痛、または末梢性神経因性疼痛を含む、請求項131記載の方法。
  138. 感染症が、細菌感染、ウイルス感染、酵母菌感染、ウィップル病、プリオン病、肝硬変、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、HIV、HCV、肝炎、梅毒、髄膜炎、マラリア、結核、インフルエンザを含む、請求項131記載の方法。
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