BR102020004436A2 - Dispositivo microfluídico - Google Patents

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Abstract

A presente invenção materializa-se em um dispositivo microfluídico inovador capaz de melhorar a seleção de ligantes de maior especificidade de bibliotecas de biomoléculas contra culturas de células ou tecidos humanos, especialmente durante a seleção de aptâmeros por SELEX.

Description

DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO Campo Técnico da Invenção
[001] A invenção aqui descrita refere-se a um dispositivo microfluídico e a seu método de uso para seleção de especificidade aumentada de ligantes de uma biblioteca de moléculas bioquímicas contra culturas de explantes alvo de tecidos animais. Mais particularmente, o dispositivo e o método podem ser usados na seleção de aptâmeros por SELEX por meio de uma etapa otimizada de exposição do ligante ao alvo, em alternativa aos métodos anteriores de períodos sequenciais de incubação da biblioteca com alvos e não alvos.
Arte de fundo da invenção
[002] Aptâmeros derivados de ácidos nucleicos são oligonucleotídeos de fita simples que se dobram em estruturas tridimensionais e através delas interagem especificamente com moléculas alvo. Através da afinidade pelos seus alvos, os aptâmeros são tradicionalmente identificados por um processo de triagem in vitro denominado SELEX (sigla do inglês para Evolução Sistemática de Ligantes por enriquecimento EXponencial). O método é baseado em etapas consecutivas e progressivas de seleção positiva de espécies contra um alvo específico . A seleção se dá a partir de um conjunto de moléculas bioquímicas compostas por sequências aleatórias de ácidos nucleicos submetido à seleção e amplificação das espécies ligantes. Estrategicamente, a técnica também permite seleções negativas, que envolvem a amplificação das espécies não ligantes contra o alvo negativo de interesse.
[003] Os aptâmeros interagem com entidades químicas específicas e, em combinação com uma diversidade de agentes químicos, podem marcar, guiar, localizar, posicionar, isolar e/ou atingir tais entidades químicas. Por tais características, aptâmeros têm sido desenvolvidos para diversas aplicações, por exemplo, na biossensibilidade para a detecção de moléculas ligantes de interesse. Recentemente, dadas as vantagens estratégicas no desenvolvimento, especificidade e escalonamento, o desenvolvimento de aptâmeros com aplicações diagnósticas e terapêuticas tem aumentado. Em particular, os conjugados de drogas e aptâmeros podem ser usados para oncologia.
[004] O câncer contempla um grupo de doenças que resultam na divisão celular descontrolada com potencial de se espalhar para outras partes do corpo.Devido à singularidade dos indivíduos e do desenvolvimento da patologia em cada organismo, os pacientes diagnosticados com um tipo semelhante de câncer geralmente apresentam respostas diferentes a tratamentos semelhantes. Nesse sentido, terapias de precisão personalizadas estão pavimentando a nova era dos tratamentos contra o câncer com abordagens de vanguarda nos protocolos de tratamento oncológico como anticorpos monoclonais, conjugados anticorpo-droga, terapias imunológicas e genéticas. No entanto, para além das radioterapias e quimioterapias convencionais, os ensaios clínicos atuais ou os protocolos estabelecidos divergem em relação aos desafios, resultados e restrições industriais biotecnológicas dessas novas abordagens. Enquanto isso, pacientes de todo o mundo lutam para lidar com o câncer, com terapias que apresentam desde interações fora do alvo até altos custos de implementação,. Nesse sentido, os aptâmeros representam uma alternativa promissora, principalmente devido a sua precisão no direcionamento de células cancerígenas e a sua viabilidade para o processo de escalonamento industrial.
[005] No entanto, o resultado da seleção de aptâmeros depende das limitações do método de triagem SELEX. Experimentalmente, mesmo ao executar ciclos negativos de seleção durante o procedimento, os aptâmeros podem interagir com esses alvos negativos. Por outro lado, foi encontrado experimentalmente que quando o SELEX in vivo é realizado, a especificidade dos aptâmeros é aprimorada. Entretanto, nesse procedimento in vivo, os aptâmeros são selecionados com base em xeno-modelos, o que significa que eles interagem com os alvos moleculares das células cancerígenas já modificadas em um ambiente não humano, além de terem sido selecionadas negativamente para não interagir com as células não alvo especificamente do mesmo ambiente não humano. De modo geral, as evidências indicam que o desempenho dos aptâmeros está intimamente relacionado às variáveis envolvidas durante o processo de triagem. Ou seja, espera-se que os aptâmeros desenvolvidos in vitro ou in vivo tenham desempenho diferente no ambiente do paciente na fase clínica.
[006] Nesse sentido, a demanda por personalização humana é obrigatória para melhorar o resultado da terapêutica oncológica. Para aumentar diretamente a precisão em humanos, a presente invenção fornece um dispositivo que replica modelos de pacientes fora de seus corpos e, assim, melhora o desempenho na seleção de aptâmeros específicos em um ambiente de múltiplos tecidos por um método de incubação e circulação simultâneas de bibliotecas de ligantes em certas etapas do processo tradicional SELEX. O equilíbrio químico cinético da ligação e desassociação de alvo e não-alvo mimetiza o cenário de um SELEX in vivo. Além de uma especificidade mais alta, o dispositivo pode ser combinado com outras cópias semelhantes de si mesmo para aplicações mais abrangentes e também pode ser automatizado quando acoplado a equipamento analítico. Além disso, a presente invenção permite evitar o uso de animais em pesquisa e ensaios pré-clínicos e simplifica as questões éticas envolvidas.
Sumário da invenção
[007] A presente invenção materializa-se em um dispositivo microfluídico inovador capaz de melhorar a seleção de ligantes de maior especificidade de bibliotecas de biomoléculas contra culturas de células ou tecidos humanos, especialmente durante a seleção de aptâmeros por SELEX.
[008] Um outro aspecto que constitui o objeto desta invenção é um novo método associado à operação do dispositivo acima mencionado, que consiste em incubação e ciclagem de bibliotecas mais eficientes em um cenário de múltiplos alvo negativos de controle.
[009] Para realizar esses objetivos, esta invenção estipula um dispositivo microfluídico que abrange:
  • I. um substrato que forma canais conectando uma abertura de entrada e outra de saída;
  • II. uma multiplicidade de câmaras de incubação formadas ao longo do dispositivo e conectadas através dos canais de conexão e onde o suporte plástico permeável para o cultivo de células ou explantes pode ser firmemente fixado;
  • III. um padrão de conexão de câmaras de incubação para culturas de células ou explantes não alvo e alvo, de modo a simular o fluxo de circulação sistêmica do sangue de um organismo humano em um tumor local.
[010] O dispositivo microfluídico também abrange padrões de conexões específicas de maneira personalizada, cobrindo aplicações específicas para satisfazer o descrito acima.
[011] Como as culturas de células ou tecidos podem ser depositadas em câmaras específicas de acordo com as necessidades do usuário da invenção, diferentes padrões de conexão ideais podem ser alcançados simplesmente conectando dois ou mais dispositivos possíveis da presente invenção. Essas combinações são compostas por esta invenção também.
[012] A invenção aqui descrita estipula um método para a seleção de ligantes de bibliotecas de biomoléculas a alvos específicos com baixa afinidade a não alvos, o que abrange o procedimento de:
  • 1. encher os canais e câmaras do dispositivo com meios de cultura adequados;
  • 2. fixar suportes de plástico permeáveis que contenham células ou explantes pré- cultivados em posições apropriadas, de acordo com o dispositivo acima mencionado com padrão personalizado;
  • 3. inserir uma biblioteca de biomoléculas com a apropriada diversidade tridimensional aleatória de seus componentes na abertura de entrada acima descrita;
  • 4. circular o fluido do dispositivo por um período de tempo adequado, em configuração onde a abertura de saída se conecta com a abertura de entrada por um tubo colocado em uma bomba peristáltica;
  • 5. coletar os ligantes ligados às células alvo ou cultura de explante no suporte plástico;
  • 6. repetir as etapas do procedimento de a) a e), mas introduzindo uma nova biblioteca de cópias moleculares dos ligantes coletados na etapa e), até que a diferença entre as bibliotecas biomoleculares em cada repetição se torne não significativa.
[013] A invenção aqui descrita também estipula um kit para seleção de ligantes de alta especificidade e baixa afinidade a alvos negativos de uma biblioteca de biomoléculas ligantes, compreendida pelo dispositivo microfluídico acima.
[014] Aspectos e modalidades mais claros da invenção aqui apresentados são especificados nas descrições nas seções a seguir e nos anexos.
Breve descrição dos desenhos
[015] A FIG 1. ilustra a estrutura geral do dispositivo de acordo com a presente invenção (também mostra detalhes da "curva de acionamento" que projeta o fluido na câmara de incubação).
[016] A FIG 2. representa a protuberância da conexão do tubo na abertura de entrada e na abertura de saída.
[017] A FIG. 3. ilustra exemplos de conexões de câmaras de incubação particulares que simulam a circulação sistêmica do corpo humano em relação a diferentes tumores específicos.
[018] A FIG. 4. mostra a operação do dispositivo usando uma bomba peristáltica durante o procedimento de ciclagem.
[019] A FIG. 5 representa combinações dos dispositivos microfluídicos descritos nesta invenção e ilustrados na FIG. 3.
Descrição detalhada
[020] Ácido nucleico e oligonucleotídeos
[021] Sempre que usados neste documento, os termos "ácidos nucleicos" ou "oligonucleotídeos" significam DNA, RNA em uma forma de fita simples ou dupla. Também significam qualquer “XNA”, entendido como qualquer oligonucleotídeo com modificação química que não impede sua cópia por métodos bioquímicos, por exemplo, mas não limitado a, PCR ou síntese química sequencial. As ilustrações dessas modificações são, mas não se limitam a, a substituição de grupos hidroxila de nucleotídeos por halogênios ou grupos metil-éter, uso de nucleotídeos quirais, uso de ácidos xeno nucleicos (ácidos nucléicos que possuem uma espinha dorsal de açúcar diferente em comparação com ácidos nucleicos normais) e similares.
[022] Aptâmero
[023] Nesta invenção, o termo "aptâmero" refere-se a uma molécula ligante composta por um oligonucleotídeo que se dobra em estruturas tridimensionais e que interage com alta afinidade e não por hibridação com moléculas alvo específicas, que podem ou não residir, por exemplo, na superfície ou no interior de uma célula específica.
[024] Tumor, câncer
[025] Por "tumor" ou "câncer", a presente invenção, especialmente em seu escopo de aplicação, refere-se a células ou tecidos neoplásicos que naturalmente ou por causa artificial ambiental são gerados em pacientes humanos. Na extensão de pesquisa e desenvolvimento, também se refere a qualquer outra célula ou tecido animal com características neoplásicas, ou mesmo linhagens celulares comumente usadas em pesquisas oncológicas, quando usadas como alvo ou controle negativo para o ligante.
[026] Células
[027] Conforme usado neste documento, "células" se referem especialmente, mas não exclusivamente, a células de mamíferos cultivadas em laboratório, que podem ou não se originar de um paciente em particular cuja invenção poderia ser útil na geração de aptâmeros para o tratamento de câncer. Também se refere a linhas celulares normalmente usadas em pesquisa biomédica e bem conhecidas pelos especialistas na técnica.
[028] Explantes
[029] Como também aqui utilizado neste documento, "explantes" se referem, mas não exclusivamente, a tecidos de mamíferos cultivados em laboratório, que podem ou não se originar por extração cirúrgica de um paciente em particular, para quem a presente invenção poderia ser útil na geração de aptâmeros para o tratamento do câncer. Também se refere a qualquer outro tecido animal cultivado em laboratório ou extraído por cirurgia.
[030] Microfluídicos
[031] "Microfluídica" e seus derivados gramaticais, quando usados para descrever a presente invenção, referem-se à técnica bem conhecida dos especialistas na área que utiliza dispositivos e ferramentas para controlar com precisão, de maneira orquestrada e planejada, os caminhos de fluxo, proporções de soluções e suas combinações em associação ou não com qualquer processo ou análise física ou química, e nas escalas pico, nano, micro ou de mililitro.
[032] Alvo
[033] Como usado aqui, o termo "Alvo" refere-se a qualquer entidade química à qual uma biblioteca de ligantes de biomoléculas está exposta, com o objetivo de selecionar um membro específico ou um conjunto estrito de membros da biblioteca que se liga com alta afinidade ao mencionado "Alvo". Para ilustrar, mas sem limitar o escopo das possibilidades, um alvo pode ser uma molécula orgânica ou inorgânica, mas especialmente proteína, lipoproteína ou glicoproteína que pode ou não estar ligada a uma superfície celular ou a suas estruturas internas.
[034] Fora do alvo ou controle negativo
[035] Como aqui utilizado também, o termo "não alvo" ou "Controle negativo" (Controle de ligação negativa) refere-se à mesma descrição acima de "Alvo", mas sem o objetivo de ser usado como parâmetro de seleção para ligação de alta afinidade de elementos da biblioteca de biomoléculas; em vez disso, um controle negativo é usado para capturar possíveis ligantes que tenham afinidade tanto com o alvo e com o não alvo.
[036] Ligante
[037] "Ligante" é usado nesta presente invenção como qualquer entidade química com uma estrutura tridimensional específica capaz de se ligar a outras entidades químicas. Exemplos de ligantes no contexto desta invenção são, mas não estão limitados a, oligonucleotídeos, peptídeos e proteínas.
[038] Substrato
[039] Por "Substrato", este documento refere-se ao material que constitui o dispositivo microfluídico, que pode ser, mas não está limitado a, polímeros "LCD Liquid Crystal", Polidimetilsiloxano (PDMS), Poliestireno (PS) e Cerâmica co-queimada a baixa temperatura (LTCC), todos aqueles bem conhecidos pelos especialistas na técnica.
[040] Câmara, canal, abertura de entrada e abertura de saída.
[041] Como usado aqui nesta presente invenção, os termos relacionados à arquitetura do dispositivo microfluídico, como "câmara", "canal", "entrada de abertura" e "abertura de saída" e semelhantes são indicados na FIG. 1 e FIG. 2 e podem representar um escopo mais amplo de circunstâncias, como também sugerido na FIG. 3. Em outras palavras, respectivamente, esses termos se referem ao espaço para receber o suporte de plástico, as cavidades internas do substrato pelas quais o fluido flui, o orifício onde o fluxo entra no dispositivo e o orifício onde o fluido flui para fora do dispositivo.
[042] Suporte de plástico
[043] Por "Suporte de plástico", esta invenção refere-se a qualquer acessório comercial de cultura de células disponíveis, conhecido popularmente como "transwell", que geralmente é anexado a placas de poços de vários tamanhos de poço e onde uma cultura de células pode ser confinada em seu lado côncavo, sem limitar a comunicação do fluido, geralmente meio de cultura, de um lado para outro por uma membrana permeável construída no suporte de plástico, que pode ter vários tamanhos porosos.
[044] Biblioteca de Biomoléculas
[045] Uma “Biblioteca de Biomoléculas” mencionada por todo este documento refere-se a qualquer solução química que contenha quantidades diversas de diferentes ligantes. Esta biblioteca pode ter vários graus de diversidade, como por exemplo, mas não limitado a, bibliotecas de oligonucleotídeos que podem ter a ordem de 109 a 1015 diferentes ligantes. A biblioteca de biomoléculas também tem a propriedade da aleatoriedade, no sentido de que, em geral, quase todas as possibilidades de configurações tridimensionais dadas pelos graus de liberdade das biomoléculas são alcançadas pelos ligantes da biblioteca. Esta biblioteca pode ser sintetizada de várias maneiras, como é conhecido pelos especialistas na área, ou adquirida comercialmente de terceiros.
[046] Período de tempo adequado
[047] Conforme usado neste documento, a expressão "período de tempo adequado" e suas variações linguísticas se referem a qualquer tempo específico necessário para atingir um objetivo mensurável de um processo. Esses períodos de tempo já podem ser conhecidos, como será descrito adiante neste documento, ou podem ser outros períodos específicos que podem ser necessários para alcançar um resultado adequado de acordo com uma situação específica de aplicação no escopo desta invenção.
[048] A invenção aqui apresentada é um dispositivo, usado com o objetivo de aprimorar a seleção de ligantes com alta especificidade de uma biblioteca de biomoléculas, especialmente, mas não limitado a, em um processo iterativo de triagem de ligantes com afinidade para um alvo específico, como, por exemplo, no método SELEX da seleção do aptâmero.
[049] De acordo com a invenção aqui apresentada, para cumprir o objetivo anterior, é estipulado um dispositivo microfluídico que engloba:
  • 1.1 um substrato que forma canais conectando uma abertura de entrada e uma abertura de saída;
  • 1.2 uma multiplicidade de câmaras de incubação formadas ao longo do dispositivo e conectadas através dos canais de conexão e onde o suporte plástico permeável para o cultivo de células ou explantes possa ser firmemente fixado;
  • 1.3 um padrão de conexão de câmaras de incubação para culturas de células ou explantes não alvo e alvo, de modo a simular o fluxo de circulação sistêmica do sangue de organismo humano em um tumor local.
[050] Na invenção deste documento, o substrato pode ser feito de camadas de materiais diferentes, dentre aqueles definidos anteriormente como os que podem constituir o substrato. As camadas desses materiais diferentes são ligadas entre si com tratamento por plasma ou outros tratamentos químicos comuns reconhecidos pelos especialistas na técnica. Em todos os casos, a camada superior será sempre feita de polímero de cristal líquido (LCD), feito através da fabricação aditiva de fotopolimerização (“impressão 3D”), uma técnica capaz de criar elegantemente formas complexas cuja funcionalidade é uma característica desta invenção, como as protuberâncias de conexão de tubos (como representado na FIG. 2) ou a estrutura de fixação para suporte de plástico e vedação adequada.
[051] Como representado na FIG. 1, a presente invenção inclui uma interseção entre os canais e as câmaras formadas de maneira a direcionar o fluido do dispositivo para dentro da região fechada de suporte plástico através de sua membrana permeável na parte inferior, assegurando que o fluido do canal faça fluxo contínuo para as câmaras, atingindo e interagindo com o alvo ou com controles negativos, em vez de seguir um caminho paralelo pelo canal abaixo.
[052] Na presente invenção, as câmaras de incubação, como representado na FIG. 1 e FIG. 3, só funcionam quando conectadas ao suporte de plástico. Nesse sentido, as câmaras nesta invenção podem ter tamanhos e formatos diferentes, de acordo com o suporte plástico disponível. Ao operar, o dispositivo empurra continuamente o fluido para as câmaras, agitando as células-alvo ou lavando os tecidos-alvo confinados no suporte plástico por sua membrana permeável. A membrana de suporte de plástico também evita a mistura de células ou tecidos alvo, evitando a seleção incorreta de ligantes no processo de triagem iterativa de ligantes pelo qual a invenção se destina, mas não se limita.
[053] As câmaras de dispositivo nesta invenção podem ter várias disposições ao longo da abertura de entrada e da abertura de saída e estar conectadas de várias maneiras específicas, como representado na FIG. 3. Cada disposição e padrão de conexão são personalizados e refletem a aplicação específica que esta invenção pode ter na triagem de ligantes para um tumor específico. Uma vez que cada tumor tem seu próprio contexto e localização, faz parte desta invenção a característica de simular o fluxo sanguíneo sistêmico no qual o tumor se encontra no corpo de um paciente. Essa simulação é implementada organizando as conexões dos canais das câmaras como a ordem da conexão vascular encontrada no corpo. Por exemplo, mas não limitado a este exemplo, como na FIG. 3, se o alvo for um tumor pancreático, o fluxo do dispositivo deve começar em uma célula ou cultura de tecidos pulmonares, dividir-se em tecidos ou células tumorais e peritumorais e, em seguida, prosseguir os dois fluxos para uma única câmara contendo células ou tecidos hepáticos, seguindo para uma cultura de medula e iniciando o mesmo ciclo novamente, com o tubo indo da abertura de saída até a abertura de entrada.
[054] A seleção de ligantes de uma biblioteca de biomoléculas pode ser exemplificada por uma aplicação desta invenção para seleção de aptâmero através de SELEX. Este método de seleção consiste na introdução de um alvo com uma biblioteca de cerca de 109 a 1015 oligonucleotídeos aleatórios de tamanho variável (geralmente de 70 a 100 nucleotídeos) a um alvo, lavando o alvo para remover ligantes de baixa afinidade para descartar e depois separar as moléculas ligadas ao alvo por meios físicos ou químicos. Esses ligantes destacados têm alguma afinidade com o alvo e são copiados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos que hibridam completamente dentro de uma sequência conservada na extremidade do ligante, que é ele próprio um oligonucleotídeo. Essas novas cópias de cada ligante anterior com alguma afinidade ao alvo são expostas novamente ao alvo em um novo ciclo. À medida que os ciclos são repetidos, um número maior de cópias de ligantes de maior afinidade tende a ser selecionado por competição de ligação. Após um número adequado de ciclos, resta apenas poucas unidades de diferentes oligonucleotídeos da biblioteca inicial; a sequência de consenso dentre esses oligonucleotídeos é o aptâmero selecionado para o alvo usado no método.
[055] Nesta invenção, em relação à aplicação do SELEX, ela pode ser usado para o que é chamado de "cell-SELEX", onde o alvo é uma célula inteira. A principal diferença entre um SELEX e um cell-SELEX é a necessidade de substituir as células alvo por novas células do mesmo tipo, pois as células geralmente são lisadas em cada ciclo de seleção. O mesmo não é necessário para o SELEX realizado contra moléculas ou proteínas orgânicas, por exemplo. A substituição do alvo é uma das principais demandas que esta invenção atende, facilitando o posicionamento e a remoção de culturas através do uso do suporte plástico acoplável ao dispositivo sem vazamento de fluidos durante a operação.
[056] Durante o SELEX, a biblioteca de oligonucleotídeos é introduzida no dispositivo e continuamente exposta ao alvo e não alvos por uma ação de bombeamento peristáltica em um tubo de silicone que conecta ambas as protuberâncias na superfície do dispositivo, como na FIG. 4. Depois de um tempo adequado, os suportes de plástico são removidos e o que contém o alvo tem seus ligantes destacados para PCR. O produto de PCR é introduzido novamente no dispositivo com novos suportes de plástico contendo culturas frescas de alvo e de não alvo; em seguida, um novo ciclo de SELEX ocorre repetindo a mesma descrição anterior até que o processo seja considerado concluído por heurística ou sequenciamento de produto de PCR.
[057] Os canais do dispositivo da presente invenção não devem ter mais do que 0,864 mm2 de seção circular interna. Sua dimensão média varia de cerca de 2000 mm2 a 3600 mm2 em geral, com base no padrão de câmara específico que pode ter para qualquer aplicação específica da invenção. A câmara tem um diâmetro de acordo com o diâmetro do suporte de plástico que pode ter tamanhos que seguem os tamanhos padrão de poço de placas com 96 ou 48 ou 24 ou 12 poços. Como dito, por exemplo, mas não limitando o escopo a, um diâmetro de câmara para um suporte plástico de placa de 24 poços tem um diâmetro correspondente de 9 mm na câmara do dispositivo, com uma profundidade de 3 mm, contando a partir do topo da estrutura de fixação.
[058] 1.4 No nível de funcionamento individual das bombas e válvulas
[059] O sistema microfluídico da presente invenção possui 2 bombas para sua operação: uma com movimento peristáltico, que controla os ciclos de fluxo através do dispositivo, e uma bomba de injeção, usada opcionalmente para a injeção da biblioteca de ligantes no sistema fluídico. Após a injeção da biblioteca, a bomba peristáltica é ativada e pode operar entre 0,5 mL / min e 3 mL / min, de acordo com um padrão específico que o dispositivo possa ter e pode operar continuamente por 60 a 180 minutos, também de acordo com um determinado padrão do dispositivo.
[060] 1.4.1 Automação: válvula microfluídica bidirecional, “disponível comercialmente”
[061] A conexão da bomba de injeção e o dreno de fluido em excesso, no contexto da presente invenção, podem ser semi-automatizados por qualquer válvula microfluídica bidirecional disponível no mercado, que pode ser conectada aos tubos acopláveis no dispositivo. A bomba de injeção, carregada com uma seringa de microlitro (geralmente usada em HPLC, por exemplo), é ativada simultaneamente dentro da válvula microfluídica, permitindo a inserção, pela abertura de entrada do dispositivo, de um volume de biblioteca de ligantes no circuito fluídico fechado. Ao mesmo tempo, outra válvula de duas vias é ativada no lado oposto, conectada no tubo próximo à abertura de saída, drenando o excesso de fluido do sistema. Todas as bombas e válvulas são controladas por computador através de sinalização elétrica, como representado na FIG. 4)
[062] Com intuito de otimizar a viabilidade das células e tecidos descritos na operação desta invenção, diferentes diâmetros de canal podem ser usados para atingir uma taxa de fluxo desejável e pressão local de acordo com as necessidades particulares de cada cultura de célula ou tecido possível usada no dispositivo, e também como outro esforço para simular as condições do corpo. Como um exemplo não restritivo, a pressão sanguínea normal do corpo nos pulmões pode ser de 8 a 20 mmHg, enquanto na veia porta hepática pode estar em torno de 5 a 10 mmHg, portanto o dispositivo pode acomodar adequadamente essas variações enquanto mantém o mesmo fluxo alterando localmente o calibre do canal que precede cada câmara.
[063] 1.5 No nível de interação com os sistemas periféricos ao chip - microscópio de fluorescência, controlador de temperatura, controle de CO2 e etc.
[064] O dispositivo aqui apresentado nesta invenção também utiliza de maneira adaptável quaisquer periféricos disponíveis além daqueles eventualmente mencionados ao longo desta descrição da invenção, como computadores, bombas e válvulas acima mencionados. O dispositivo microfluídico da invenção pode ser acoplado a um microscópio de fluorescência na posição vertical, posicionado logo acima de qualquer câmara, mas de preferência sobre a câmara do alvo para geração de imagens de ensaios de fluorescência de qualquer ligante quimicamente modificado com fluoróforos, através de métodos bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Para manter a temperatura e a pressão de CO2 apropriadas para o cultivo de células ou tecidos, o dispositivo deve ser inserido em uma incubadora de CO2, normalmente disponível em laboratórios de pesquisa biomédica para cultura de células ou tecidos de mamíferos. Para monitorar a temperatura local do dispositivo, um termômetro é inserido em uma cavidade na parte inferior do dispositivo, conforme representado na FIG. 1 [A, B, C ...] .
[065] Nesta presente invenção, os tubos de silicone, que também podem ser feitos sem restrições de , podem ser firmemente fixados no dispositivo através das protuberâncias em sua superfície (como representado na FIG. 3), o que garante uma fácil inserção mas mantém o tubo firmemente no lugar durante a operação do dispositivo, ajudando a evitar vazamentos.
[066] Em relação ao suporte de plástico que deve ser fixado na câmara do dispositivo da presente invenção, como descrito anteriormente, ele também deve ter preferencialmente uma membrana de PET (tereftalato de polietileno) ou outro material biologicamente inerte adequado, com tamanho de poro de cerca de 3 μm. Dentro dessa faixa de tamanho de poro, o fluxo deve atravessar adequadamente a membrana com menor impedimento (ao contrário de um poro menor) e ainda manter as células confinadas dentro do suporte plástico, evitando a mistura de culturas mencionada ao longo do dispositivo.
[067] Durante a construção do dispositivo de acordo com a descrição da presente invenção, são realizados tratamentos físico-químicos do dispositivo microfluídico para operação adequada.
[068] Em relação aos canais microfluídicos, quando impresso com material “LCD Liquid Crystal”, é feito um tratamento com etanol a 95% para um bom nivelamento da superfície. Quando construídos usando camadas LTCC, os canais são lavados com concentrações variáveis de EDTA para remover as impurezas de íons metálicos que podem estar no material de LTCC.
[069] Em outro aspecto técnico da fabricação inventiva do dispositivo, a luz no amplo espectro de Ultravioleta (UV) é usada para o endurecimento adequado do chip quando construído usando o material de polímero LCD através da técnica de impressão 3D.
[070] O dispositivo, de acordo com a presente invenção, pode ou não ser constituído por diferentes materiais como substratos. Quando materiais distintos como, mas não limitados a, Vidro, PDMS, LCD, LTCC ou PS são usados, eles são combinados pela junção das camadas de cada material diferente através da exposição a plasma, seguida imediatamente de contato adequado, pressionando cada camada uma contra a outra por um período apropriadode tempo, de maneira semelhante aos métodos utilizados na fabricação microfluídica de chips PDMS, bem conhecidos pelos especialistas na técnica.
[071] Para o funcionamento adequado, o dispositivo descrito nesta invenção também pode ter seus canais revestidos em soluções hidrofóbicas de qualquer composição disponível comercialmente, especialmente, mas não restrita a, situação quando o dispositivo é produzido por impressão 3D usando polímeros de LCD.
[072] Além disso, esta invenção apresenta outro aprimoramento técnico para o funcionamento adequado do dispositivo microfluídico descrito. Para evitar ou minimizar o vazamento de fluidos durante sua operação, especialmente nas conexões entre o suporte plástico das membranas e o dispositivo, um anel de borracha ou de polímero de silicone ("O-Ring") de 10 mm de diâmetro e 1,7 mm de espessura (altura) é inserido apropriadamente na fenda do suporte de plástico, como representado na FIG. 1. O tamanho do O-Ring não se limita ao descrito anteriormente, mas pode variar de acordo com as possibilidades dentro do escopo da invenção aqui descrita, principalmente dependendo da especificação do suporte plástico, que pode variar. O slot de suporte de plástico é feito exclusivamente de polímero LCD impresso em 3D e compreende um nicho que acomoda o O-Ring de maneira que o dispositivo e o suporte de plástico estejam firmemente conectados quando conectados, sem que nenhum líquido vaze entre o O-Ring e as conexões.
[073] Em uma materialização da invenção aqui descrita, a espessura do substrato foi controlada em favor do ajuste do tamanho do canal para compor diferentes designs possíveis. Especificamente, a espessura total do dispositivo, sem contar a protuberância, pode ter 3-5 mm, de acordo com uma variação do diâmetro do canal de 0,4 a 1 mm de diâmetro.
[074] Em outra materialização da presente invenção, um sensor de temperatura, por exemplo, mas não limitado a, um termistor NTC 100k, é inserido em uma cavidade sob o dispositivo e acoplada a uma unidade de computação - a mesma usada para controlar as bombas mencionadas anteriormente nesta descrição detalhada da invenção. A cavidade pode ter qualquer tamanho apropriado para acomodar o sensor e pode ser formada por qualquer material mencionado de acordo com as técnicas de fabricação relacionadas a cada material, como impressão 3D, moldagem térmica, corte a laser, etc., de maneira que o sensor de temperatura se encaixe com precisão dentro da cavidade, minimizando qualquer espaço possível entre a superfície do sensor e o dispositivo ao seu redor.
[075] O dispositivo microfluídico também pode ser usado em combinação com outros dispositivos compostos por esta mesma invenção ou como uma unidade (um componente), como representado na FIG. 5. Essa combinação pode ser usada para simular diferentes modelos de exposição in vivo da biblioteca de ligantes usando dispositivos disponíveis preexistentes da presente invenção, que conectados de determinada maneira podem desempenhar o papel de um novo dispositivo sem a necessidade de fabricação de um novo dispositivo específico. As combinações podem compreender, por exemplo, mas sem se limitar a, dispositivos conectados em série, em paralelo, etc.
[076] Nesta invenção, o alvo da biblioteca de ligantes é colocado dentro do suporte plástico da membrana, que é fixado na câmara de incubação. Quando o alvo é um grupo de células, não há fixação dessas células na membrana PET além da restrição que a própria membrana produz, fixando a localização dessas células dentro do volume definido pela região interna da membrana e do suporte plástico. Quando o alvo é uma molécula, ele é fixado dentro da câmara de incubação por força magnética aplicada a uma microesferas magnéticas (com diâmetro maior que o tamanho do poro da membrana) funcionalizado com essas moléculas, um método bem conhecido pelos especialistas na técnica . Para obter uma corrente eficiente de fluido através da câmara de incubação, uma curva de acionamento no final do canal interno do dispositivo impulsiona o fluido dentro da câmara, evitando o fluxo abaixo dela, como mostrado na FIG 1. Além disso, a membrana e a extremidade da curva de acionamento tem uma proximidade tão grande que o espaço entre eles é quase insignificante, minimizando o fluxo que pode passar para fora da câmara de incubação. Outra vantagem é também a otimização da exposição da biblioteca de ligantes ao alvo, eventualmente misturando-se à turbulência do fluido que entra e sai da câmara.
[077] Após a exposição adequada dos ligantes e do alvo, o suporte plástico com membrana é destacado do dispositivo e os ligantes aderidos podem ser destacados por diversos métodos. Como ilustração não restritiva, qualquer procedimento que altere temporariamente a estrutura tridimensional do ligante pode ser usado, por exemplo, temperatura (70-95°C), “salgando” com altas concentrações de sais (como KCl, NaCl, MgCl2, etc.), alterações no pH pelo tratamento com solução ácida ou básica, agentes desnaturantes (como uréia ou brometo de etídio) ou pela competição de ligação química (com altas concentrações de imidazol ou glutationa, por exemplo). De acordo com esta invenção, o fluido que flui ao longo do chip microfluídico pode ser, mas não restrito a, um soro sangüíneo de um paciente cujas outras amostras biológicas podem ser obtidas para visar fluidos simuladores de sangue (BMFs) sem proteína, tampão de bicarbonato (com pH em torno de 7 e força iônica em torno de 0,15 mol / L usando KCl e NaCl como sais), meio de cultura para células de mamíferos como DMEM, DMEM/F-12, RPMI, MEM ou alphaMEM. A utilização particular do meio depende da configuração específica da biblioteca de alvos e ligantes usada na invenção.
[078] Ainda em outro aspecto da invenção aqui descrita, é estipulado um método para seleção de ligantes de baixa ligação a não alvos em bibliotecas de biomoléculas com ligantes a alvos específicos, o que abrange o procedimento de:
  • I. encher os canais e câmaras do dispositivo com meios de cultura adequados;
  • II. fixar suportes de plástico permeáveis que contenham células ou explantes pré- cultivados em posições apropriadas, de acordo com o dispositivo acima mencionado em padrão personalizado;
  • III. inserir uma biblioteca de biomoléculas com a apropriada diversidade tridimensional aleatória apropriada de suas entidades na abertura de entrada acima descrita;
  • IV. circular o fluido do dispositivo por um período de tempo adequado, em configuração onde a abertura de saída se conecta com a abertura de entrada por um tubo colocado em uma bomba peristáltica;
  • V. coletar o suporte plástico da cultura celular alvo do ligante ou da cultura de explantes com seus ligantes aderidos a ele;
  • VI. repetir as etapas do procedimento de a) a e), mas introduzindo uma nova biblioteca de cópias moleculares dos ligantes coletados na etapa e), até que a diferença entre as bibliotecas biomoleculares em cada repetição se tornasse não significativa.
[079] Inicialmente, alvos positivos e negativos devem ser organizados fisicamente separados nas câmaras de incubação do dispositivo. Além disso, eles devem ser conectados pela troca de moléculas de sinalização através de um fluido (o plasma sanguíneo do paciente ou o meio de cultura descrito anteriormente são exemplos não restritivos). Ou seja, o fluido que interage com o alvo positivo também deve interagir temporalmente com o alvo negativo. Em um sentido amplo, o método inventivo consiste em modelar o corpo do paciente como um sistema, para realizar a seleção de ligantes (especialmente aptâmeros) contra tecidos positivos e negativos ao mesmo tempo. Ou seja, em uma aplicação clínica, os tecidos dos pacientes serão determinados como alvos positivos (explante do tumor) e negativos (não tumorais, por exemplo, explantes de medula óssea e células pulmonares), sendo esses alvos fisicamente separados, mas conectados pela troca de sinalização moléculas.
[080] Após algum tempo de interação fluida contínua (a "etapa de equilíbrio") entre alvos positivos e negativos, os ligantes, como aptâmeros, serão selecionados dentro do dispositivo. O desenvolvimento posterior do ligante será realizado de maneira semelhante à técnica conhecida Cell-SELEX. Ou seja, o pool de moléculas aleatórias de ligantes deve ser misturado e introduzido no fluido e, em seguida, as moléculas que interagem com o alvo positivo, mas não com o negativo, devem ser usadas na próxima etapa da seleção.
[081] Por todas as maneiras pelas quais o dispositivo pode ser projetado para organizar alvos positivos e negativos, sua câmara de cultivo deve ser fisicamente separada, mas permitindo a conexão e a comunicação biológica alcançada pelo fluido. O novo efeito técnico é que, no caso especial de ligantes oligonucleotídicos, o SELEX realizado no procedimento acima mencionado fornece aos aptâmeros uma especificidade melhorada e distinta em relação ao alvo de interesse. Ou seja, o nível de interação dos aptâmeros contra o alvo positivo é significativamente maior quando comparado aos negativos. Pelo contrário, se o SELEX for realizado com alvos positivos e negativos desconectados, ou apenas dispostos serial ou paralelamente, esse nível de especificidade não será atingido. Todo o procedimento deve realizar 7 a 10 voltas (7 a 10 ciclos) para a obtenção de moléculas enriquecidas contra o alvo positivo.
[082] Em relação a uma modalidade especial desta invenção relacionada a ligantes de oligonucleotídeos, as bibliotecas aleatórias podem ter de 109 a 1015 oligonucleotídeos, com tamanhos variando de alguns nucleotídeos, como 10 nucleotídeos, a cadeias mais longas em torno de 180 nucleotídeos. Esses nucleotídeos podem estar na forma de ribonucleotídeos (monômeros de RNA) ou desoxirribonucleotídeos (monômeros de DNA) e também ser substituídos por análogos sintéticos de nucleotídeos, os xeno nucleotídeos. Esses análogos podem ter variações estruturais diferentes dos nucleotídeos, como ter uma espinha dorsal de açúcar diferente (como treose, glicol, ciclo-hexeno etc.) ou ter um ou mais grupos de substituição (como grupos 2'-hidroxi dos anéis ribofuranosil sendo substituídos por 2'- Grupos O-2-metoxietil ou as ligações fosfato sendo substituídas por ligações fosforotioato, por exemplo). As alterações químicas descritas aqui como "xeno nucleotídeos" são apenas exemplos não restritivos que podem variar de acordo com as possibilidades técnicas de síntese química.
[083] A biblioteca de ligantes oligonucleotídicos pode ser produzida por síntese química sequencial ou por reações enzimáticas. Esses métodos podem adicionar diferentes vieses desconhecidos à diversidade da população de moléculas da biblioteca. Nesse sentido, a natureza aleatória da biblioteca é entendida em uma concepção mais ampla do objetivo funcional desta invenção, em vez de uma constituição aleatória literal das sequências nucleotídicas, em que cada possibilidade de constituição de sequência consta igualmente no conjunto da biblioteca de ligantes.
[084] Outra característica metodológica desta invenção em relação à biblioteca de ligantes com foco especial na seleção de ligação a oligonucleotídeo são as regiões de flanqueamento conservadas. Todo oligonucleotídeo aleatório na mistura da biblioteca possui uma sequência de flanqueamento (isto é, sequências no início e no final dos oligonucleotídeo) que podem variar em comprimento conforme o design (de 10 a 24 bases), mas conservam uma sequência conhecida. Isso é utilizado para hibridação com primers para a realização de PCR de todas as sequências indistintamente durante os ciclos de SELEX. A sequência específica dessas regiões conservadas pode ser escolhida de acordo com a estratégia de amplificação empregada para a PCR, como uma maneira de controlar as temperaturas de hibridação. Nesse sentido, o termo "amplificação" significa o aumento do número de cópias de uma molécula por um processo ou combinação de processos.
[085] O ligante de composição aleatória da biblioteca também possui estrutura tridimensional aleatória e um ligante determinado ou um conjunto deles podem formar estruturas estáveis que se ligam de forma eficiente e com alta afinidade às moléculas alvo por ligações intermoleculares (isto é, dipolo-dipolo (dipolo induzido por dipolo, iônico, dipolo induzido, dipolo induzido por íons etc.), que podem ou não ser auxiliados por moléculas de solvente como água ou outros componentes da solução, como íons ou moléculas de gás dissolvido, como gás carbônico ou oxigênio, por exemplo.
[086] A molécula alvo usada no método inventivo pode ser, mas não se restringe a, um polipeptídeo, uma proteína, um lipídio, um carboidrato, uma entidade química de baixo peso molecular, um agente farmacêutico orgânico, um agente farmacêutico não orgânico ou mesmo um complexo macromolecular em uma superfície celular, que pode compreender simultaneamente muitas das categorias de alvos mencionadas acima.
[087] Após a adesão dos ligantes e a remoção do suporte de plástico que contém a membrana que sustenta o alvo, é realizado um procedimento de lavagem, lavando suavemente a membrana de suporte de plástico com água ultrafiltrada destilada e subsequentemente submetida à centrifugação de 10000 rpm com a ajuda de adaptadores de centrífuga apropriados. Este procedimento é repetido três vezes para garantir a remoção completa dos ligantes que não aderiram. Os ligantes aderidos são então removidos por adição de alíquota de água destilada ultra filtrada e aquecida ou outra "solução de desadesão" descrita anteriormente. A nova centrifugação desta solução elui os ligantes de ligação que são então analisados e / ou amplificados para os próximos ciclos de ensaios de ligação.
[088] Além disso, o método descrito pode compreender o uso de dispositivos analíticos de alto rendimento logo após a eluição ou amplificação dos ligantes aderidos, como, mas não restrito a, tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS), citometria de fluxo, PCR em tempo real ou mesmo testes de afinidade colorimétrica ou interferometria.
[089] Como representado na FIG. 4 e FIG. 5, o método inventivo pode ser executado em paralelo dentro de uma infinidade de dispositivos de maneira semi-automática. Isso é possível devido ao tamanho pequeno do dispositivo e à capacidade de controle de uma pluralidade de fluxos por uma única bomba peristáltica. A escalabilidade também é compatível com a capacidade de amostra das técnicas de alto rendimento mencionadas acima.
[090] Simultaneamente, de acordo com a presente invenção, o procedimento aqui descrito pode estar em uma forma portátil, como um kit. Em outras palavras, a presente invenção também é conduzida como um kit para seleção personalizada de alta especificidade de aptâmeros, que abrange o dispositivo microfluídico acima descrito. O kit também pode incluir reagentes para as etapas dos testes de eluição, amplificação e afinidade. Este kit pode incorporar garrafas, tubos, saquetas, envelopes, ampolas e similares; composto em qualquer parte ou completamente em vidro, plástico, papel, cera, metal, etc. O kit pode ter peças destacáveis completas ou parciais, anexadas por meios adesivos, mecânicos, elétricos ou outros. O armazenamento de reagentes pode ter uma tampa para conceder acesso ao seu conteúdo por ferramentas de manipulação de líquidos, por exemplo, mas não se limitando a seringas, micropipetas, pipetas, agulhas, tubos, etc. Pode ser fornecido pelo kit uma embalagem externa contendo instruções sobre o uso de seus componentes.
Aplicabilidade Industrial
[091] Como descrito anteriormente, esta invenção compreende um dispositivo microfluídico para selecionar ligantes, especialmente aptâmeros, e um método para selecionar os mesmos com especificidade aprimorada e de maneira personalizada, utilizando explantes de alvos específicos.
[092] O dispositivo microfluídico, de acordo com a invenção apresentada, pode aumentar significativamente a especificidade do ligante selecionado simulando a exposição da biblioteca de ligantes em um SELEX in vivo, minimizando alvos externos que podem dificultar o uso do ligante selecionado para aplicações terapêuticas. Notavelmente, em uma aplicação clínica, quando usado com amostras de explantes de qualquer paciente oncológico específico com alvo e não alvos, o dispositivo e o método podem reunir todas as particularidades que eventualmente o alvo possa ter e, consequentemente, selecionar ligantes personalizados para esse paciente. Portanto, a utilidade deste dispositivo e deste método da invenção é vasta.
[093] Apesar da invenção possuir características específicas descritas anteriormente, para os especialistas na técnica será evidente que essa descrição da invenção favorece uma realização específica, sem limitar o escopo da mesma. Portanto, um escopo considerável da presente invenção será especificado pelas reivindicações e equivalentes anexadas.

Claims (3)

  1. Dispositivo microfluídico caracterizado pelo fato de que simula a ordem de exposição de uma biblioteca de ligantes em um organismo.
  2. Dispositivo microfluídico caracterizado pelo fato de que compreende culturas de explantes de um organismo em particular que compreende um alvo desejado e seus não alvos.
  3. Dispositivo microfluídico caracterizado pelo fato de que abrange:
    • I. um substrato que forma canais conectando uma abertura de entrada e outra de saída;
    • II. uma multiplicidade de câmaras de incubação formadas ao longo do dispositivo e conectadas através dos canais de conexão e onde o suporte plástico permeável para o cultivo de células ou explantes pode ser firmemente fixado; e
    • III. um padrão de conexão de câmaras de incubação para culturas de células ou explantes não alvo e alvo, de modo a simular o fluxo de circulação sistêmica do sangue de um organismo humano em um tumor local.
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