CN109694806B - 一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法 - Google Patents

一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速获取核酸适体的微流体装置，它包括微流体通道，所述微流体通道设有输入口和输出口，所述微流体通道内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室。本发明还公开了基于上述微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法，该方法能高效获得特异性识别靶细胞的核酸适体。

Description

一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛 选方法
技术领域
本发明涉及一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法。
背景技术
核酸适体是上世纪90年代发展起来的，是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从含大量寡聚核苷酸的核酸文库中筛选得到能高亲和性高特异性识别靶标的DNA/RNA分子。核酸适体具有可与抗体相媲美的识别功能，目前已成为化学与生物医学研究的重要工具。传统的核酸适体筛选技术只能针对纯物质(如提纯的蛋白质)来进行筛选，难以实现对细胞和复杂生命体系的有效识别。这是因为：1)许多疾病标志物尚未发现；2)可作为标志物的膜蛋白难以纯化；3)纯化后的蛋白与活细胞生理环境中蛋白的构象存在差异，导致纯蛋白为靶标的核酸适体不能识别细胞。我们课题组针对这一难题，提出了针对活细胞这一复杂体系进行核酸适体筛选的新概念，创建了以疾病相关阳性细胞为靶细胞、以阴性细胞为参比的细胞筛选法。细胞筛选方法的发展，解决了如何在标志物未知的情况下获得研究细胞及其它复杂生命体系所必需的分子探针的关键科学问题，为病变细胞膜蛋白标志物的高效发现和鉴定提供了基础。该方法先后被国际上40多个实验室采用，得到了同行的普遍认可，已广泛用于白血病、肺癌、肝癌、胰腺癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤的研究，推动了分子诊疗学的发展。
细胞筛选法能产生区分正常细胞和疾病细胞之间的分子差异的核酸适体。但是细胞筛选法还存在以下一些缺陷：筛选周期长，通常需要12轮以上的筛选才能获取结合靶细胞的进化核酸文库；筛选效率较低，最终产生的进化核酸文库往往含有大量不能结合靶细胞的核酸序列，阻碍了核酸适体的发现；筛选需要大量细胞，不能针对稀有细胞样品进行筛选；筛选成本较高。这些缺陷严重制约了细胞筛选法在不同实验室和临床上的应用。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种微流体装置及基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述微流体装置包括微流体通道(1)，所述微流体通道(1)设有输入口(2)和输出口(3)，所述微流体通道(1)内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室(4)。
其中，所述微流体通道(1)呈U型折流布置。
所述微流体通道(1)的长、宽、高均为20±0.5微米，优选为20微米；所述微室(4)的直径为20±0.5微米，优选为20微米；微室(4)的深度为20±0.5微米，优选为20微米；彼此相邻的微室(4)之间的间距为2200—2400微米，优选为2300微米。
基于上述微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法包括如下步骤：
(1)将靶细胞样品注射进入微流体装置，控制流体速度为50-100微升/分钟，使细胞分散于微流体装置的微室中；
(2)将设计和合成的核酸适体文库与参比细胞孵育，然后离心，弃去与参比细胞结合的核酸适体，将未与参比细胞结合的核酸适体注射进入微流体装置，控制流速为50-100微升/分钟，使核酸适体与微室中的靶细胞结合；
(3)将洗涤缓冲液注射进入微流体装置，通过改变洗涤时间和洗涤缓冲液流速来控制筛选压力，收集洗脱液，将洗脱液中的核酸适体即为筛选后所得的核酸适体；其中，改变洗涤时间的范围为3-10分钟，控制洗涤缓冲液的流速为50-100微升/分钟。
优选地，设计和合成的核酸适体文库序列如SEQ ID NO.1所示，筛选后所得的核酸适体的序列如SEQ ID NO.2，和SEQ ID NO.3所示。设计和合成的核酸适体文库序列如SEQID NO.4所示，筛选后所得的核酸适体序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
核酸适体的衍生物是在上述核酸适体的基础上删除或增加部分核苷酸而得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物；或者，所述所述核酸适体的衍生物是在上述核酸适体的基础上连接荧光、放射性和治疗性物质后得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物；或者，所述核酸适体的衍生物是在上述核酸适体的基础上将骨架改造为硫代磷酸酯骨架后得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物；或者，所述核酸适体的衍生物是在上述核酸适体的基础上进行部分核苷酸取代或修饰得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物。
下面，对本发明作进一步说明：
本发明的一方面是有关微流体装置，它包括具有一个或多个输入口和一个输出口之间延伸的流体通道的基底，以及位于微流体通道中用于分配单个细胞的微室。
本发明的第二个方面是有关以单个细胞为靶标，通过单轮筛选获得核酸适体的方法。该方法包括提供上述微流体装置，以及在单个细胞与核酸分子有效结合的条件下，向微流体装置中导入已优化的核酸文库。本方法进一步包括从该微流体装置中移除所有与靶细胞非特异性结合的核酸分子，然后通过洗脱缓冲液回收与靶细胞结合的核酸分子。这些回收得到的核酸分子进一步通过单分子测序技术确定其核酸序列。
本发明的第三个方面涉及文中四个核酸适体，及其通过修饰或改造获得的衍生物。衍生物可为：
a)将所述核酸适体删除或增加部分核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物。
b)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物。
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物。
d)将所述核酸适体进行部分核苷酸取代或修饰，得到的与所述核酸适体具有相同识别能力的核酸适体衍生物。
附图说明
图1：图1A是微流体芯片的直观结构示意图，所示微流体通道长宽高分别为10微米；图1B是单细胞筛选微流体芯片输送液体的系统示意图；
图2：CCRF-CEM细胞核酸适体(T1和T2)特异性分析图；
图3：A431细胞核酸适体(T2和T3)特异性分析。
图中：1、微流体通道；2、输入口；3、输出口；4、微室。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
CCRF-CEM和Ramos细胞系来自ATCC。A431和HBE细胞系来自中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学院细胞中心。结合缓冲液是含5mM MgCl2、4mM葡萄糖和1mg/mL酵母转移RNA的Dulbecco's Phosphate Buffered Saline。洗涤缓冲液是5mMMgCl2和4mM葡萄糖的Dulbecco's Phosphate Buffered Saline。洗脱液为超纯水。
实施例1
所述微流体装置包括微流体通道1，所述微流体通道1设有输入口2和输出口3，所述微流体通道1内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室4。
其中，所述微流体通道1呈U型折流布置。
所述微流体通道1的长、宽、高均为20±0.5微米；所述微室4的直径为20±0.5微米，微室4的深度为20±0.5微米；彼此相邻的微室4之间的间距为2200—2400微米。
实施例2单细胞筛选法用于悬浮细胞CCRF-CEM细胞系核酸适体的筛选
一、随机文库的设计和合成
设计合成两端包含18个核苷酸、中间包括52个核苷酸的寡聚核苷酸序列文库如下：
5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNNNNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’(SEQ ID NO.1)。
其中文库两端已知序列为引物序列，N代表四种随机碱基序列。
二、核酸适体的筛选
1、单细胞样品制备
悬浮细胞处理：20万个CCRF-CEM细胞(靶细胞)或Ramos细胞(参比细胞)经离心洗涤后，分别分散于结合缓冲液中，细胞密度分别为2千个/毫升(CCRF-CEM)和30万个/毫升(Ramos)。
单细胞样品制备：将100微升靶细胞样品注射进入U型微流体管道中(U型微流体管道底部有20x10微米(直径x深度)微室，微室间距为2300微米)，控制细胞流速，使靶细胞尽可能单个分散于微流体管道底部微室中。
2、单细胞细胞筛选
参比细胞筛选：核酸文库(1OD)与30万个参比细胞孵育后，经1000rpm离心5分钟后，弃去与细胞结合的核酸序列，保留上清液中DNA。
单细胞单轮筛选法：将不与参比细胞结合的核酸序列注射进入分配有靶细胞的U型微流体管道中。控制流速，使核酸序列充分与靶细胞细胞结合。然后将洗涤缓冲液缓慢注射进入U型微流体管道中。通过改变洗涤时间和洗涤缓冲液体积，控制筛选压力。洗涤后，将洗脱缓冲液缓慢注射进入U型微流体管道。收集洗脱液，将洗脱液中DNA进行单分子测序。通过序列分析，我们选择丰度最大的前两组核酸序列(T1和T2)作为研究对象，进一步考察其与靶细胞和参比细胞结合能力和特异性。
T1：5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT GAG TGA AGC AAG GAT GCA ACC TCG GCT CCAACC CGT GAG AGT CGC GAA ACT C AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’(SEQ ID NO.2)
T2：5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT AGG GGG AGC TTG CGC GCA TCA AGG TGC TAAACG AAA GCC TCA TGG CTT CTAT AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’(SEQ ID NO.3)。
三、核酸适体结合能力分析
50万个CCRF-CEM细胞和Ramos细胞经结合缓冲液洗涤两次后，分散于200微升结合缓冲液中，分别与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体T1和T2(终浓度为200nM)孵育1小时。经300微升洗涤缓冲液离心洗涤两次后，CCRF-CEM细胞和Ramos细胞分散于500微升洗涤缓冲液，用于流式细胞仪检测。实验结果表明通过单细胞筛选法获得的核酸适体T1和T2能有效区分靶细胞和参比细胞。
实验结果如图2所示，筛选获得核酸适体T1和T2具有很好结合能力和特异性，表明通过单细胞筛选法能高效获得特异性识别靶细胞的核酸适体。
实施例3单细胞筛选法用于贴壁细胞核酸适体的筛选
一、随机文库的设计和合成
设计合成两端包含20个核苷酸、中间包括30个核苷酸的寡聚核苷酸序列文库如下：5’-CTC ATG GAC AGG CTG CAG AC NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-3’(SEQ ID NO.4)。其中文库两端已知序列为引物序列，N代表四种随机碱基序列。
二、核酸适体的筛选
1、单细胞样品制备
贴壁细胞处理：20万个A431细胞(靶细胞)或HBE细胞(参比细胞)接种于直径为35毫米的培养皿中，培养24小时。A431细胞或HBE细胞经2毫升D-PBS洗涤2次后，然后与1毫升0.2％EDTA孵育5分钟。用D-PBS小心洗涤移走残留EDTA后，将A431细胞或HBE细胞分别分散于结合缓冲液中，细胞密度分别为2千个/毫升(A431细胞)和30万个/毫升(HBE细胞)。
单细胞样品制备：将100微升靶细胞样品注射进入U型微流体管道中(U型微流体管道底部有20x20微米(直径x深度)微室，微室间距为2300微米)，控制细胞流速，使其分别分散于微流体管道底部微室中。
2、单细胞细胞筛选
参比细胞筛选：将核酸文库(1OD)与30万个参比细胞孵育后，经1000rpm离心5分钟后，弃去与细胞结合的核酸序列，保留上清液中DNA。
单细胞单轮筛选法：将不与参比细胞结合的核酸序列注射进入分配有靶细胞的U型微流体管道中。控制流速，使核酸序列充分与靶细胞细胞结合。然后将洗涤缓冲液缓慢注射进入U型微流体管道中。通过改变洗涤时间和洗涤缓冲液体积，控制筛选压力。洗涤后，将洗脱缓冲液缓慢注射进入U型微流体管道。收集洗脱液，将洗脱液中DNA进行单分子测序。通过序列分析，我们选择丰度最大的一组核酸序列(T3和T4)作为研究对象，进一步考察其与靶细胞和参比细胞结合能力和特异性。
T3：5’-GAGG GGTAGGG AAT GGGTACGGT TAC GGGG-3’(SEQ ID NO.5)
T4：5’-GGC GGTAGGG GAC GGGTACGGT GAAA GGGG-3’(SEQ ID NO.6)
三、核酸适体结合能力分析
50万个A431细胞和HBE细胞经结合缓冲液洗涤两次后，分散于200微升结合缓冲液中，分别与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的核酸适体T3和T4(终浓度为200nM)孵育1小时。经300微升洗涤缓冲液离心洗涤两次后，A431细胞和HBE细胞分别分散于500微升洗涤缓冲液，用于流式细胞仪检测。
实验结果如图3所示，筛选获得核酸适体T3和T4具有很好的结合能力和特异性，表明通过单细胞筛选法能高效获得特异性识别靶细胞的核酸适体。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南大学
<120> 一种微流体装及置基于微流体装置的单细胞核酸适体单轮筛选方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(76)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
ataccagctt attcaattnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnagat agtaagtgca atct 94
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ataccagctt attcaattga gtgaagcaag gatgcaacct cggctccaac ccgtgagagt 60
cgcgaaactc agatagtaag tgcaatct 88
<210> 3
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ataccagctt attcaattag ggggagcttg cgcgcatcaa ggtgctaaac gaaagcctca 60
tggcttctat agatagtaag tgcaatct 88
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(50)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
ctcatggaca ggctgcagac nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn acgctcggat 60
gccactacag 70
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gaggggtagg gaatgggtac ggttacgggg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggcggtaggg gacgggtacg gtgaaagggg 30

Claims (7)

1.一种单细胞核酸适体单轮筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将靶细胞样品注射进入微流体装置，控制流体速度为50-100微升/分钟，使细胞分散于微流体装置的微室中；
S2、将设计和合成的核酸适体文库与参比细胞孵育，然后离心，弃去与参比细胞结合的核酸适体，将未与参比细胞结合的核酸适体注射进入微流体装置，控制流速为50-100微升/分钟，使核酸适体与微室中的靶细胞结合；
S3、将洗涤缓冲液注射进入微流体装置，通过改变洗涤时间和洗涤缓冲液流速来控制筛选压力，收集洗脱液，将洗脱液中的核酸适体即为筛选后所得的核酸适体；其中，改变洗涤时间的范围为3-10分钟，控制洗涤缓冲液的流速为50-100微升/分钟;
所述微流体装置包括微流体通道(1)，所述微流体通道(1)设有输入口(2)和输出口(3)，所述微流体通道(1)内腔底部设有若干个用于分配单个细胞的微室(4)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计和合成的核酸适体文库序列如SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选后所得的核酸适体的序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，设计和合成的核酸适体文库序列如SEQ IDNO.4所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，筛选后所得的核酸适体序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流体通道(1)呈U型折流布置。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流体通道(1)的长、宽、高均为20±0.5微米；所述微室(4)的直径为20±0.5微米，微室(4)的深度为20±0.5微米；彼此相邻的微室(4)之间的间距为2200-2400微米。
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SELEX筛选核酸适配体富集水平理论分析;禹新良;《中国科学:化学》;20170704;第47卷(第7期);第891-895页 *

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CN109694806A (zh) 2019-04-30

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